CN105348371A - 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 - Google Patents
用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105348371A CN105348371A CN201510823063.1A CN201510823063A CN105348371A CN 105348371 A CN105348371 A CN 105348371A CN 201510823063 A CN201510823063 A CN 201510823063A CN 105348371 A CN105348371 A CN 105348371A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- contraversa
- add
- polyclonal antibody
- rabbit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000031845 Tilletia laevis Species 0.000 title claims abstract description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 241000722096 Tilletia controversa Species 0.000 title abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 31
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- 230000002303 anti-venom Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 208000010513 Stupor Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 231100000567 intoxicating Toxicity 0.000 description 1
- 230000002673 intoxicating effect Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联后作为免疫原，免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体。该抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体，属于植物病害防治领域。
背景技术
由小麦光腥黑粉菌(Tilletiafoetida(Wallr.)Liro,TFL)引起的小麦光腥黑粉病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植物检疫性有害生物。此病菌孢子含量超过0.6％即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状(Goats,1999；Hoffman,1982)，严重影响小麦品质及商业价值。
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。
小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌的田间侵染症状以及孢子形态和颜色十分相似，在田间观察时很难区分。目前，常用的鉴别方法是PCR反应或显微镜检测，但这两种方法都需要用到仪器，只能在实验室内进行，并且PCR反应耗时长，工序复杂。因此，需要研发一种简便、快速、准确的方法来鉴别小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌，从而采取相应的防治措施，控制病害的进一步发展。
发明内容
为满足上述领域的需求，本发明提供一种抗体，该抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，从而将小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌区别开来。
本发明请求保护的技术方案如下：
一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原6mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取15mgEDC和NHS，用0.2mLPH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8mLPH7.2的0.1MPBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
一种用于免疫方法鉴别小麦矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，具体步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原4mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL0.1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑的多克隆抗体，其采用以下步骤制备而得：
(1)以权利要求2所述的免疫原免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；
(2)对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体；
所述免疫包括多次，初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
筛选产生高效价全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，进行竞争抑制检测试验。
用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、包板：将待测样品的孢子用抗原稀释液稀释200倍，混匀并加入酶标板，每孔各100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：每孔加入150ul封闭液进行封闭，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将权利要求4所述的多克隆抗体稀释9000倍，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体，每孔100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取OD值；
若OD值大小为1.8～2.0，则待测样品为小麦矮腥黑粉菌。
本发明提供的抗原蛋白，其氨基酸序列来自小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的共有蛋白序列。采用所述抗原蛋白免疫实验动物，获得的抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，操作十分简便，能够快速、准确地判断待测样品是小麦矮腥黑粉菌。只需取疑似小麦矮腥黑粉菌的孢子与本发明抗体在适当的反应条件下进行反应，如果出现抗原抗体反应，则该样品是小麦矮腥黑粉菌，如果不能发生抗原抗体反应，则该样品是小麦光腥黑粉菌。整个过程无需仪器，技术人员可以携带相关试剂和耗材，在野外就能完成两种黑粉菌的鉴别。
附图说明
图1.多克隆抗体的制备流程图，
免疫时间安排：如表1所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第三次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行第五次免疫，7天后第三次采血检测，以此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。其中，E004组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表2所示。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何形式限制本发明的保护范围。
小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn)：本发明所有的小麦矮腥黑粉菌菌株为现有文献L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKühn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionandDiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu¨hn.JPhytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的DrBlairGoates所提供的TCK菌株。
小麦光腥黑粉菌：本发明所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999，03期(3):110-112所记载的菌株。
上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
以下实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1.用于鉴别TCK和TFL的多克隆抗体制备
试剂与溶液：
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(北京勤邦生物技术有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M，pH7.2)，包被液(磷酸盐缓冲液，0.05M，pH7.4)，反应稀释液(PBS1，0.03M，pH7.4+0.05％吐温20)，洗涤工作液(用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释)；封闭液(在0.02mol/LPBS1中加入0.05％BSA)，底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化氢，B液为四甲基联苯胺；终止液(2mol/LH2SO4)，酶标二抗(北京勤邦生物技术有限公司)。
小麦矮腥黑粉菌悬液1*105孢子/ml
主要仪器设备：
真空冷冻干燥机，电热恒温培养箱，ProteinA/G柱，电泳槽、电泳仪，酶标板，酶标仪，低温高速离心机，ProteinA层析柱等。
实验动物：新西兰大耳兔，购自中国军事医学科学院。
1、多肽合成
利用ITRAQ分析小麦矮腥黑粉菌(TCK)和小麦光腥黑粉菌(TFL)的蛋白质，得到TCK和TFL的共有蛋白序列(SEQIDNO：2)，其氨基酸序列为：
APGHRDFIKNMITGTSQADCAILIIAGGTGEFEAGISKDGQTREHALLAFTLGVRQLIVAVNKMDTTKYSEERFHEIVKETSNFIKKVGFNPKSVAFVPISGWHGDNMIEPTANMPWYKGWEKETKAGKSSGKTLLDAIDAIEPPSRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGIIKAGMVVTFAPSNVTTEVKSVEMHHEQLVEGNPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCSDSKNDPAMEAASFIAQVIVMNHPGQIGAGYAPVLDCHTAHIACKFAELVEKIDRRSGKSIEDAPKFIKSGDAAMVKMIPTKPMCVEAFNVYPPLGRFAVRDM
根据上述共有蛋白序列设计获得多条多肽，筛选获得能够区分小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原蛋白(SEQIDNO：1)，其多肽序列为：EPPSRPTDKPLRLC。由北京勤邦生物技术有限公司对上述抗原蛋白进行化学合成，获得半抗原。
2、多抗制备
半抗原偶联：取步骤1合成的的半抗原6mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取15mgEDC和NHS，用0.2mLPH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8mLPH7.2的0.1MPBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
将上述偶联后的半抗原作为免疫原，与弗氏完全佐剂按1:1体积比混匀后对实验兔子进行初次免疫，以后每次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫原按1:1体积比混匀后进行。共制备了4个免疫原，分别进行免疫。
免疫剂量：初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
免疫方式：皮下多点注射。
免疫动物：新西兰大耳兔，每组2只，4组，共使用8只。免疫时间安排：如表1所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第三次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行第五次免疫，7天后第三次采血检测，以此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。其中，E001组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表2所示。
表1免疫时间安排进程表
表2优选组免疫时间进程表
注M：免疫，1M：第一次免疫，以此类推；C:采血，1C:第一次采血，以此类推。
采血检测项目：每次采血检测的项目主要是多抗纯化前后的效价及其与天然抗原的反应情况。
检测方法：间接竞争法
1)主要试剂
酶标二抗(北京勤邦生物技术有限公司)，洗涤液，抗体稀释液(磷酸盐缓冲液)，抗原稀释液(CB液)，底物A/B液，封闭液；
2)主要耗材
96孔酶标板(厦门怡佳美)
3)实验操作步骤
a、包板：多肽包被原
(制备方法：取步骤1获得的半抗原4mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL0.1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。)
用抗原稀释液稀释至质量体积比1:1000倍，小麦矮腥黑粉菌悬液用抗原稀释液稀释200倍，分别加入酶标板，每孔100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：加入封闭液进行封闭，每孔150ul，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将步骤2获得的多克隆抗体稀释一定倍数(多肽包被原：按照10万倍稀释，黑粉菌：按照9K倍稀释)，分别加入酶标板，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：每孔加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm。
采血检测结果：
本实验严格按照免疫流程进行免疫，并完成抗体效价及其与天然抗原结合情况等指标的检测，表3列出了优选组兔子(E001组)的血清检测结果。
表3优选组血清检测结果
注：K表示“千”，W表示“万”，E001表示取自优选组兔子的抗体，E005表示包被原，黑粉菌表示小麦矮腥黑粉菌。E001-1W表示优选组抗体稀释1万倍，黑粉菌-200×表示小麦矮腥黑粉菌稀释200倍。
E001组在第七次采血之后对抗体效价进行检测，检测结果显示，血清效价较高，对多肽包被原的效价为10万，OD值2.6，对小麦矮腥黑粉菌的效价为9K，OD值为2.7，对小麦光腥黑粉菌不显色(表1、表2)。血清检测验证后，可以达到后期实验要求，因此采集了该组的全血并进行抗体纯化。采全血后直接进行抗体效价及抑制检测，纯化多抗后再次进行效价及抑制检测，对比纯化前后的抗体效价及抑制检测数据，结果显示，纯化后抗体效价较高，达到1.2W，OD值显色1.8左右，抑制效果显著(表3)。
表1血清对多肽包被原的检测结果
表2血清对小麦矮腥黑粉菌的检测结果
实施例2.采用本发明抗体鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌
以实验室保存的小麦矮腥黑粉菌孢子和小麦光腥黑粉菌孢子作为抗原，分别与实施例1获得的纯化抗体进行反应，以抗体封闭液作为阴性对照，步骤如下：
a、包板：将实施例1中的多肽包被原用抗原稀释液稀释质量体积比1:1000倍，小麦矮腥黑粉菌用抗原稀释液稀释200倍，分别加入酶标板，每孔100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：加入封闭液进行封闭，每孔150ul，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将实施例1制备的多抗稀释一定浓度(多肽包被原：按照质量体积比1:10万倍稀释，黑粉菌悬液：按照9K倍稀释)，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：每孔加入HRP标记的羊抗兔抗体100ul、37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取的OD值如果在1.8～2.0之间，则发生了抗原抗体反应。
结果如表3所示，纯化后抗体对多肽包被原和小麦矮腥黑粉菌均反应，其中与多肽包被原的反应较强，抗体效价10万，OD值1.9左右；与小麦矮腥黑粉菌反应效价1.2万，OD值1.8左右，与小麦光腥黑粉菌和阴性对照不反应。因此，该抗体可以区分作为小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌特异性抗体。
表3E001多抗纯化后检测结果
Claims (7)
1.一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原6mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取15mgEDC和NHS，用0.2mLPH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3.8mLPH7.2的0.1MPBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
3.一种用于免疫方法鉴别小麦矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，具体步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原4mg，用1mLDMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL0.1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
4.用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑的多克隆抗体，其采用以下步骤制备而得：
(1)以权利要求2所述的免疫原免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；
(2)对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，所述免疫包括多次，初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
6.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，筛选产生高效价全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，进行竞争抑制检测试验。
7.用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、包板：将待测样品的孢子用抗原稀释液稀释200倍，混匀并加入酶标板，每孔各100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：每孔加入150ul封闭液进行封闭，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将权利要求4所述的多克隆抗体稀释9000倍，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体，每孔100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取OD值；
若OD值大小为1.8～2.0，则待测样品为小麦矮腥黑粉菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510823063.1A CN105348371B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510823063.1A CN105348371B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105348371A true CN105348371A (zh) | 2016-02-24 |
| CN105348371B CN105348371B (zh) | 2018-07-06 |
Family
ID=55324452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510823063.1A Active CN105348371B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105348371B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105367638A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-03-02 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 用于鉴别小麦叶锈菌和杆锈菌的抗原及多克隆抗体 |
| CN116773802A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院) | 一种利用胶体金免疫层析法检测小麦光腥黑穗病的试纸条 |
| CN116773809A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院) | 一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1837364A (zh) * | 2006-02-21 | 2006-09-27 | 重庆大学 | 小麦矮腥黑穗病菌实时荧光pcr固相化试剂盒及其检测方法 |
| CN102154278A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记 |
| CN102399753A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-04-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法 |
| CN104593332A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-05-06 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法 |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510823063.1A patent/CN105348371B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1837364A (zh) * | 2006-02-21 | 2006-09-27 | 重庆大学 | 小麦矮腥黑穗病菌实时荧光pcr固相化试剂盒及其检测方法 |
| CN102154278A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记 |
| CN102399753A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-04-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法 |
| CN104593332A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-05-06 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GAO L等: "Detection of Tilletia controversa using immunofluorescent monoclonal antibodies", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 * |
| MK GUPTA等: "Characterisation of potential antigen(s) of Tilletia indica teliospore walls to develop a specific immunoassay for Karnal bunt detection", 《FOOD & AGRICULTURAL IMMUNOLOGY》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105367638A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-03-02 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 用于鉴别小麦叶锈菌和杆锈菌的抗原及多克隆抗体 |
| CN105367638B (zh) * | 2015-11-24 | 2018-11-23 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 用于鉴别小麦叶锈菌和杆锈菌的抗原及多克隆抗体 |
| CN116773802A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院) | 一种利用胶体金免疫层析法检测小麦光腥黑穗病的试纸条 |
| CN116773809A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院) | 一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105348371B (zh) | 2018-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104086652B (zh) | 抗o型口蹄疫病毒特异性单域抗体及其重组表达载体 | |
| CN114230660B (zh) | 抗大口黑鲈虹彩病毒lmbv的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114957454B (zh) | 一种抗csfv e2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN108614121A (zh) | 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用 | |
| CN105348371A (zh) | 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 | |
| CN114031679A (zh) | 检测用隐孢子虫卵囊壁外壁标记蛋白质及其应用 | |
| CN109374886A (zh) | 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN109239341A (zh) | 一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接elisa试剂盒及其应用 | |
| CN106596934B (zh) | 一种检测o型口蹄疫病毒的试剂盒 | |
| CN103059117A (zh) | 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用 | |
| CN108948188B (zh) | 一株分泌噻虫胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株j6及其应用 | |
| CN109856396B (zh) | 检测口蹄疫病毒感染抗体的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN114807178B (zh) | 非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用 | |
| CN111978410A (zh) | 一种布鲁氏菌外膜蛋白omp25与周质蛋白bp26的融合蛋白及其表达和应用 | |
| CN105907770A (zh) | 重组基因、其编码的重组蛋白、其应用及牛副结核杆菌的检测试剂盒和检测方法 | |
| CN109799342A (zh) | 一种o型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒 | |
| CN105543177A (zh) | 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN114280306B (zh) | 牛筋草epsps蛋白elisa检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104965087B (zh) | 一种高效检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白 | |
| CN111208302B (zh) | 利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫o型抗体的化学发光检测试剂盒 | |
| CN109897828B (zh) | 分泌抗李痘病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106198974A (zh) | 一种快速检测虹鳟鱼血清中ihnv抗体的elisa检测试剂盒 | |
| Foster et al. | Clover yellow vein virus in white clover (Trifolium repens) and sweet pea (Lathyrus odoratus) in the North Island of New Zealand | |
| CN104897834B (zh) | 一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白 | |
| CN104558173B (zh) | 一种检测传染性脾肾坏死病毒的抗体及其制备和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |