CN116773809A - 一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁免疫‑化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法。本发明首次制备了小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体，以小麦光腥黑粉菌孢子作为抗原免疫新西兰大白兔，取血后离心得血清，再经过亲和柱分离纯化，制得多克隆抗体，基于多克隆抗体建立了磁免疫化学发光的检测方法，可用于小麦、面粉、土壤等样本中光腥黑粉菌孢子的检测。该方法具有高灵敏度、高准确度、高通量等优势，在小麦收储过程中应用于小麦样品的检测，提高粮食在收购、流通环节的安全监管，根据定量分析数据对感染小麦进行分级管理。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法。
背景技术
小麦光腥黑穗病也称普通腥黑穗病，是由小麦光腥黑粉菌引起的，是一种全球性的麦类黑穗病，小麦光腥黑穗病的发生会造成小麦减产甚至绝收、产品品质下降等严重危害。
小麦光腥黑穗病的传播依靠冬孢子，冬孢子在土壤中可存活2年以上，室内干燥情况下可存活20年之久。冬孢子遇到适合的条件就会萌发，进而感染小麦，形成下一个感染循环。现有的小麦光腥黑穗病检测方法虽然有一些，但是各有弊端：常规形态学检测技术虽然经典、成熟，但工作量巨大、耗时费力，镜检的结果无法定量分析，检测结果无法判断感染程度；基于PCR方法的分子生物学检测结果虽然准确，但是前处理过程复杂、耗时，无法适应现场快速检测要求；相关国标方法检测对象过于注重进口输入性腥黑穗病真菌，对于国内流行的普通型腥黑穗病检测标准不够完善；而其他检测方法如电子鼻研究等大多停留在实验室方法开发阶段，离实际应用仍有较远的距离。
因此，本发明提供了一种快速、灵敏、准确、高效的检测小麦光腥黑穗病的方法，不但可以对小麦及其制品样品进行筛查检测，同时可应用于土壤样本的检测，可对染病小麦的种植区域进行溯源，确定感染种植区，从而进行有效的靶向治理，从根本上阻断感染发生。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法，包括以下步骤：
步骤1，将生物素溶液与小麦光腥黑粉菌多克隆抗体反应，得到生物素标记多抗；
步骤2，采用HRP偶联试剂盒制备HRP偶联的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体；
步骤3，将链霉亲和素磁珠用PBST溶液清洗，然后加入生物素标记多抗，孵育后用PBST溶液清洗，磁分离后加入待测光腥黑粉菌孢子溶液，孵育后用PBST溶液清洗，磁分离后加入HRP偶联的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体，孵育后用PBST溶液清洗，然后加入化学发光试剂，用酶标仪检测化学发光强度，带入标准曲线后计算得到光腥黑粉菌孢子浓度；
所述小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备过程为：
从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒，划开病瘿，释放出里面的黑色粉末，用0.5%次氯酸钠溶液进行杀菌处理，用无菌纯水清洗后离心得到孢子，取105个/mL浓度的孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，以13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，每只兔的免疫体积为1mL，免疫后第2周和第6周进行加强免疫，最后一次免疫2周后颈动脉取血，对兔血清进行亲和纯化，得到小麦光腥黑粉菌孢子的多克隆抗体。
进一步地，步骤1中，生物素溶液的用量为10μL、浓度为2mg/mL，小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的用量为300μL、浓度为1.1mg/mL。
进一步地，步骤3中，取10mg/mL的链霉亲和素磁珠0.1mL，用PBST溶液清洗后加入100μL稀释500倍的生物素标记多抗，然后加入200μL稀释500倍的HRP偶联小麦光腥黑粉菌多克隆抗体，最后加入化学发光试剂100μL。
进一步地，所述化学发光试剂由A液和B液组成。
进一步地，所述待测光腥黑粉菌孢子溶液取自小麦样本、面粉样本或土壤样本。
本发明首次制备了小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体，以小麦光腥黑粉菌孢子作为抗原免疫新西兰大白兔，取血后离心得血清，再经过亲和柱分离纯化，制得多克隆抗体，并对抗体进行多方面的验证。基于多克隆抗体建立了磁免疫化学发光的检测方法，可用于小麦、面粉、土壤等样本中光腥黑粉菌孢子的检测。该方法具有高灵敏度、高准确度、高通量等优势，在小麦收储过程中应用于小麦样品的检测，提高粮食在收购、流通环节的安全监管，根据定量分析数据对感染小麦进行分级管理，避免巨大的经济损失，同时可将该发明的检测技术应用于土壤检测，以便溯源小麦光腥黑穗病的种植区域，更好进行靶向治理，阻断感染发生。
附图说明
图1为本发明基于磁免疫化学发光检测光腥黑粉菌孢子的原理示意图。
图2中a为正常小麦籽粒、b为感染光腥黑粉菌小麦完整籽粒、c为感染籽粒里面的黑色粉末、d为显微镜下光腥黑粉菌孢子、e为血清的WB检测结果图。
图3为多克隆抗体的线性验证结果。
图4为多克隆抗体的特异性验证结果。
图5为基于磁免疫化学发光检测光腥黑粉菌孢子的标准曲线，其中a为线性测试、b为最佳的线性范围。
实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，以下实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备及验证
1、用于制备小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的抗原，包括以下步骤：
（1）抗原准备：从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒（图2中b所示），用解剖针划开病瘿，释放出里面的黑色粉末（图2中c所示），取微量显微镜下观察为光腥黑粉菌孢子（图2中d所示）。
（2）抗原制备：黑色粉末移入装有无菌纯水的离心管中，混匀，用双层医用纱布过滤，加入0.5%次氯酸钠溶液杀菌，涡旋仪上涡旋2min，5000rpm，4min条件下离心。0.5%次氯酸钠溶液重复处理3次后，用无菌纯水清洗多次后离心，去除上清液。
（3）抗原的计数：离心后下层沉淀物（孢子）用PBS溶液稀释，使用血细胞计数板计数，计算孢子的浓度，待用。
2、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体制备，包括以下步骤：
（1）乳化：取105个/mL浓度的孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化。乳化用多聚乙烯管连接两个一次性注射器反复推动进行，当1滴乳化液在水面上呈现球形而不散开时，乳化完成。
（2）动物免疫：选择13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，免疫前采血0.5mL作为样本对照，每只兔的免疫体积为1mL，免疫方式为后颈部皮下注射。免疫后第2周和第6周进行加强免疫，免疫剂量相同。
（3）分离纯化：最后一次免疫2周后颈动脉取血，37℃静置1h后，3500rpm收集血清，对兔血清进行亲和纯化，从而获得小麦光腥黑粉菌孢子的多克隆抗体。
（4）抗体验证：用WB检测验证抗体，具体步骤如下：WB验证实验中使用三种不同的裂解方式提取孢子的总蛋白，分别是SD Sloading buffer 煮沸裂解20min、超声破碎后离心上清、超声破碎后沉淀用8M尿素溶解离心上清，图2中e中1-5对应第一种蛋白提取方式，7-10对应第二种蛋白提取方式，12-15对应第三种蛋白提取方式。使用5%奶粉作为封闭液，制得的孢子多克隆抗体作为一抗，稀释倍数为1000倍，孵化时间为1h，选用羊抗兔作为二抗，稀释倍数为8000倍，孵化时间45min，最后的验证结果见图2中e。
表1 孢子壁蛋白的不同提取方式及稀释倍数进行Western Blot验证光腥黑粉菌多抗
注：对应的膜号是指图2中e的照片中的数字。
WB验证结果说明光腥黑粉菌多克隆抗体对孢子本身确定有识别。
3、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的线性验证，包括以下步骤：
（1）包板：0.1mol/L Na2CO3溶液配制光腥黑粉菌孢子溶液，血细胞计数板计数，计算孢子浓度，并稀释至系列梯度浓度（0、600、3000、6000、60000个/mL），各取100μL至96孔板，室温孵育2h，4℃冰箱过夜；
（2）清洗：96孔板用0.05%吐温缓冲液（PBST）溶液清洗4次，每次200μL；
（3）封闭：移入5%牛血清蛋白缓冲溶液（5%BSA-PBS）溶液200μL，37℃孵育2h；
（4）清洗：用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（5）偶联多抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释制得的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体至100倍和200倍，分别移取100μL至96孔板，37℃孵育2h；
（6）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（7）结合二抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释HRP标记小鼠抗兔IgG（生工生物工程(上海)股份有限公司，货号D110065-0001）5000倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（8）清洗：96孔板用PBS溶液清洗5次，每次200μL；
（9）检测：加入化学发光底物溶液100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，用酶标仪进行化学发光检测。
以孢子浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，绘制标准曲线，分析线性。如图3所示，制备的多克隆抗体在两种稀释倍数（1：100、1：200）条件下，在验证的孢子浓度范围内，线性关系良好，多克隆抗体稀释倍数为100时线性关系优于稀释倍数200的。
4、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的特异性鉴定
（1）包板：培养黑曲霉孢子和黄曲霉真菌，用PBS溶液收集孢子，血细胞计数板计数，并稀释至105个/mL的浓度，将光腥黑粉菌孢子分别与其他两种孢子等浓度混匀，然后分别取光腥黑粉菌孢子、黑曲霉孢子、黄曲霉孢子、光腥黑粉菌孢子+黑曲霉孢子、光腥黑粉菌孢子+黄曲霉孢子溶液100μL至96孔板，室温孵育2h，4℃冰箱过夜；
（2）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（3）封闭：96孔板用5%BSA-PBS溶液200μL封闭，37℃孵育2h；
（4）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（5）偶联多抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释制备的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体100倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（6）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（7）结合二抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释HRP标记小鼠抗兔IgG（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号D110065-0001）5000倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（8）清洗：96孔板用PBS溶液清洗5次，每次200μL；
（9）检测：加入化学发光底物溶液100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，用酶标仪进行化学发光检测。
如图4所示，根据各组的化学发光强度绘图，本发明中所制备的小麦光腥黑穗病多克隆抗体具有较好的特异性。
实施例2
磁免疫化学发光检测光腥黑粉菌孢子定量分析方法的建立
1、生物素标记多抗：用DMSO配制浓度为2mg/mL的生物素溶液，移取制备的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体300μL（1.1mg/mL）与10μL生物素溶液常温下振荡反应30min，转移至透析膜（10K），用PBS缓冲液透析24h，转子慢速转动，每6h换一次缓冲液，透析结束后收集、分装，-20℃保存，待用；
2、HRP偶联多抗：采用HRP偶联试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司，货号D601047-0001）偶联多抗。基本原理是：以过碘酸盐活化辣根过氧化物酶（HRP)，活化的过氧化物酶通过席夫碱与抗体或蛋白上的伯胺交联，再还原席夫碱产生稳定的偶联产物。其操作步骤如下：取500μLHRP溶液于5mL离心管，加入200μLHRP活化缓冲液，在旋转混悬仪上，室温缓慢反应30min；计入200μLHRP偶联试剂，静置30min，溶液缓慢变回棕色；加入1mg需要偶联的母的蛋白（抗体），体积控制在1mL左右，用移液器轻轻混匀后，将液体转移至透析袋中，先用透析夹固定透析袋的一端，装入液体后再固定另一端，最后将透析袋置于2L偶联透析液中，将装有透析液的容器置于磁力搅拌器上室温透析2h，或者4℃透析过夜。透析袋保存液中含有防腐剂，使用前用蒸馏水里外冲洗30秒左右，再置于蒸馏水中浸泡30min；透析后，将透析袋中液体转移至5mL离心管，加入100μL还原剂，室温静置2h，间隔半小时用移液器轻轻混匀2-3次。至此，偶联实验已完成。
3、检测步骤：10mg/mL的链霉亲和素磁珠（南京东纳生物科技有限公司，货号：MB1003）取0.1mL，用PBST清洗3遍，磁分离，弃去上清液；取生物素标记多抗10μL，用0.5%BSA-PBST稀释500倍，移取100μL至清洗后的磁珠中，37℃振荡孵育30min，然后用PBST清洗，磁分离，重复3次，得到纳米免疫磁珠加入孢子溶液中（孢子稀释使用0.5%BSA-PBST溶液），37℃条件下振荡孵育30min，用PBST清洗3遍，磁分离，加入用0.5%BSA-PBST溶液稀释制备的HRP偶联多抗（移取制备的HRP偶联多抗10μL，稀释500倍，取200μL至磁珠中），37℃振荡孵育30min，用PBST清洗3遍后，加入化学发光试剂100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀后立即用酶标仪检测化学发光强度，带入标准曲线后，可计算光腥黑粉菌孢子浓度。
实施例3
磁免疫化学发光检测光腥黑粉菌孢子方法的线性范围和灵敏度测试
免疫磁珠捕获富集孢子：根据磁免疫化学发光检测光腥黑粉菌孢子的定量分析方法中制备的纳米免疫磁珠，取纳米免疫磁珠100μL，分别加入100、250、500、1000、2500、10000、25000、50000、100000、250000、500000cfu/mL浓度的光腥黑粉菌孢子200μL，置于混匀仪上37℃孵育30min，PBST清洗3次，磁分离，弃去上清液，加入用0.5%BSA-PBST溶液稀释制备的HRP偶联多抗（移取制备的HRP偶联多抗10μL，稀释500倍，分别取200μL至磁珠中），置于混匀仪上37℃孵育30min，用PBST清洗3次，磁分离，弃去上清液，加入化学发光试剂（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，酶标仪检测化学发光。
方法线性结果：根据检测结果，以孢子浓度为横坐标，化学发光响应强度为纵坐标，绘制标准曲线，见图5，基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子方法的线性范围在1.0×102-1.0×105cfu/mL，线性相关性R2=0.9831。
方法检测灵敏度测试：分别用10、20、50、100cfu/mL低浓度的孢子浓度测试，最后得出的检测结果是最低检测限为100cfu/mL。
实施例4
检测实际样品中的光腥黑粉菌孢子
1. 纳米磁珠与抗体的偶联：分别用生物素、HRP与制备的光腥黑粉菌多克隆抗体结合，形成生物素标记多抗和HRP偶联多抗。选取粒径为1000nm的链霉亲和素磁珠与生物素标记多抗结合，置于混匀仪上37℃孵育30min，用PBST清洗3次，磁分离，弃去上清液。
2. 小麦样品的预处理：分别称取20g的10批次小麦样品，粉碎机粉碎后过20目筛网，称取筛下物0.5g，加入5mL PBST溶液混匀，待用；面粉样品的预处理：分别称取0.1g的10批次面粉样品，加入5mL PBST溶液混匀；土壤样品的预处理：分别称取1g的10批次土壤样本，加入10mL PBST溶液混匀，待用。
3. 免疫磁珠捕获富集孢子：移取纳米磁珠与抗体偶联后的纳米免疫磁珠100μL，分别加入200μL上述样品的预处理溶液，置于混匀仪上37℃孵育30min，PBST清洗3次，磁分离，弃去上清液，加入用0.5%BSA-PBST溶液稀释制备的HRP偶联多抗（移取制备的HRP偶联多抗10μL，稀释500倍，分别取200μL至磁珠中），置于混匀仪上37℃孵育30min，用PBST清洗3次，磁分离，弃去上清液，加入化学发光试剂100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，酶标仪检测化学发光。将样品检测结果带入标准曲线，计算样品中的光腥黑粉菌孢子浓度。结果如下表所示。
由以上结果可知，本发明的方法可用于小麦、面粉、土壤等样本中光腥黑粉菌孢子的检测，达到筛查检测染病小麦及其产品、溯源感染区域，从而对感染小麦等进行分级管理、对感染区域进行靶向治理。
Claims (5)
1.一种基于磁免疫-化学发光检测光腥黑粉菌孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将生物素溶液与小麦光腥黑粉菌多克隆抗体反应，得到生物素标记多抗；
步骤2，采用HRP偶联试剂盒制备HRP偶联小麦光腥黑粉菌多克隆抗体；
步骤3，将链霉亲和素磁珠用PBST溶液清洗，然后加入生物素标记多抗，孵育后用PBST溶液清洗，磁分离后加入待测光腥黑粉菌孢子溶液，孵育后用PBST溶液清洗，磁分离后加入HRP偶联小麦光腥黑粉菌多克隆抗体，孵育后用PBST溶液清洗，然后加入化学发光试剂，用酶标仪检测化学发光强度，带入标准曲线后计算得到光腥黑粉菌孢子浓度；
所述小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备过程为：
从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒，划开病瘿，释放出里面的黑色粉末，用0.5%次氯酸钠溶液进行杀菌处理，用无菌纯水清洗后离心得到孢子，取105个/mL浓度的孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，以13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，每只兔的免疫体积为1mL，免疫后第2周和第6周进行加强免疫，最后一次免疫2周后颈动脉取血，对兔血清进行亲和纯化，得到小麦光腥黑粉菌孢子的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，生物素溶液的用量为10μL、浓度为2mg/mL，小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的用量为300μL、浓度为1.1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，取10mg/mL的链霉亲和素磁珠0.1mL，用PBST溶液清洗后加入100μL稀释500倍的生物素标记多抗，然后加入200μL稀释500倍的HRP偶联小麦光腥黑粉菌多克隆抗体，最后加入化学发光试剂100μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学发光试剂由A液和B液组成。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测光腥黑粉菌孢子溶液取自小麦样本、面粉样本或土壤样本。
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