CN101709087A - 一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明“一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用”，属于生物技术领域。本发明的单克隆抗体的制备方法包括抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。用于检测小麦叶锈菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

Description

一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是涉及一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

小麦锈病包括致病菌包括小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina f.sp.tritic)和小麦秆锈菌(Puccicinia graminis f.sp.tritici)，是一类世界性禾谷类作物的重要病害。小麦锈病具有发生区域广、暴发性强、流行频率高、危害损失重等特点，严重威胁着我国小麦的生产安全，而在我国以小麦条锈病的发生最为广泛，是影响我国小麦生产安全的首要病害，主要发生在西北、西南、长江中下游和华北等有关省(市、自治区)，每年发生面积约6000万亩，经大力防治后仍年均减产小麦10亿公斤左右；其次是小麦叶锈病，在西南和长江流域一带发生最重，华北和东北地区每年也有较重危害，而小麦叶锈病中，小麦叶锈菌生理小种或致病类型以PHT、THT两个小种为主(四川农业大学，蒲志刚，硕士论文“小麦叶锈菌群体毒性与DNA多态性关系分析及生理小种分子鉴定研究”2004)，；小麦秆锈病过去主要分布在东南沿海、长江流域和福建、广东、广西的冬麦区及东北、内蒙古等春麦区发生流行(李振岐和曾士迈，2000)，通过沿海地区病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系统抗病品种的广泛种植，近30年来基本控制了该病害的流行危害，但在西南、淮北和东北等局部地区每年仍有不同程度的发生。

病害的早期诊断检测是准确测报和有效防控的基础和前提。长期以来，锈病的诊断主要基于病原菌的生物学及病害症状的特征，其预测预报主要基于定期、大规模的田间病叶调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。而条锈病和叶锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植保人员常常将二者混淆；在小麦锈病潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和规模。这些用于锈病诊断及病情测报的传统方法不仅耗时费工，且其准确性和可靠度在很大程度上取决于调查测报人员的经验积累与技术水平，难以满足病害的快速、高通量诊断检测实际需求。因此，有必要研发简单易行、灵敏准确的小麦锈病快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预测预报的准确度均具有重要的理论意义和实际应用价值。

目前，中国农业科学院植物保护研究所麦类病害实验室已经针对这一生产中面临的实际问题，建立了小麦条锈菌和叶锈菌种的特异性分子诊断检测技术(Cao et al.，2007；曹丽华等，2007)。然而，该类基于PCR扩增的病菌核酸检测技术不但需要配置一些特殊仪器如PCR仪、凝胶电泳装置等，且对操作人员的技术水平要求较高，难以在众多基层植保科技工作者和技术人员中推广应用。

单克隆抗体技术，是由单细胞系列产生的同一种抗体蛋白，其仅与抗原分子中的一个抗原决定簇结合，故与抗原性物质反应时相对专一，不受其它物质干扰，能区别物种间的细微差异。利用该方法检测病原菌具有诸多优点，如易于大量生产、可高通量检测、免用标记物，较易实现病菌的快速、实时、实地检测(Ward et al.，2004；Werres&Steffens，1994)，促使其迅速在农学、医学和食品学中得到广泛应用。同时，该方法涉及的仪器化程度较低、操作简便，特别是对样本前处理要求简单易于推广，国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。因而，单克隆抗体技术是实现田间快速检测病原菌的好方法(Danks&Barker，2000；Dewey et al.，1990；Ward et al.，2004)。自上世纪80年代以来，单克隆抗体技术已广泛应用于一些卵菌病原菌的生物学、分类学及致病性方面的研究，诸如Phytophthora cinnamomi(Hardhamet al.，1986；Gabor et al.，1993)，Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al.，1989)，及Aphanomyces invadans(Miles et al.，2003)，且成功研发了水生真菌Salmonella sp.，Escherichiacoli、Listeria monocytoenes(Bokken et al.，2003；Fratamico et al.，1998；Kouboves et al.，2001；Leonard et al.，2004)及几种细菌病原菌单克隆抗体检测技术(Ipbal et al.，2000)。丹麦农科院作为我们的合作伙伴，目前已经在小麦条锈菌的单克隆抗体研究方面取得了一些进展(Skottrup et al.，2007)，但其尚未对小麦叶锈菌的单克隆抗体制备方法进行报道。

发明内容

本发明针对小麦叶锈菌单克隆抗体检测的空白现状，提供一种小麦叶锈菌单克隆抗体及其制备方法与应用，用于检测小麦叶锈菌，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

一种小麦叶锈菌(Puccinia triticina f.sp.tritic)的单克隆抗体，其制备方法包括抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。

所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的夏孢子。

所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT的夏孢子和THT的夏孢子的等量混合物。

所述抗原免疫动物之前，先以弗氏佐剂乳化所述抗原。

所述动物为4～8周龄的Balb/C小鼠。

上述单克隆抗体在检测小麦叶锈病中的应用。

上述单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

(1)以小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子为抗原免疫小鼠，筛选出能分泌出对小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子特异性反应的血清的小鼠，

(2)取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞，

(3)从阳性杂交瘤细胞的培养液上清中或阳性杂交瘤细胞免疫小鼠制取的腹水中分离单克隆抗体。

抗小麦叶锈菌PHT、THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为：CGMCC No.3464。

本发明目的是为检测小麦叶锈病提供一种小麦叶锈菌单克隆抗体，其特点在于以完全的小麦叶锈菌夏孢子为抗原对动物进行免疫、制备杂交瘤细胞、从杂交瘤细胞培养液上清液中或杂交瘤细胞免疫小鼠抽取的腹水中分离纯化而得到单克隆抗体。以叶锈菌夏孢子为抗原制得的该单克隆抗体专一识别小麦叶锈菌夏孢子(即幼苗期小麦携带的叶锈菌)，能够鉴别小麦幼苗期麦苗的感染情况，使植保工作人员针对致病菌进行提早防治。获得该单克隆抗体后，植保工作人员通过目前常规的ELISA方法就可预测和鉴定小麦是否感染小麦叶锈菌，与其他种类致病菌的鉴定方法结合使用达到鉴别诊断的目的。根据本发明单克隆抗体的技术方案，本领域技术人员可以采用不同的单一的或者混合的小麦叶锈菌生理小种的夏孢子作为抗原，制备得到专一针对某些生理小种的单克隆抗体。

根据近些年来的文献报道，大多数年份中，我国小麦叶锈菌中致病类型以PHT、THT两个生理小种为主，因此本发明具体提供一种采用小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的夏孢子作为抗原制备得到的单克隆抗体，为鉴定检测小麦叶锈病提供一种适应性较广泛的单克隆抗体。更进一步地，本发明采用PHT和THT两个生理小种夏孢子的等量混合物为抗原，制备的单克隆抗体能够识别两种专门识别两种这两种生理小种的感染情况，进一步扩大了单克隆抗体的鉴别检测范围。

本发明中优先采用弗氏佐剂对作为抗原的夏孢子或者夏孢子混合物进行乳化，弗氏佐剂分为完全佐剂和不完全佐剂，可以增强夏孢子的免疫原性，提高制备抗体的效价。

本发明还提供了一株杂交瘤细胞：抗小麦叶锈菌PHT、THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株LPT-1(保藏号为CGMCC No.3464)。能够产生高效价的本发明的单克隆抗体。

本发明还提供了上述单克隆抗体的制备方法，操作步骤为制备单克隆抗体的常规技术，其特点在于采用小麦叶锈菌夏孢子为抗原，本可以技术人员可以根据本发明的制备方法制备得到本发明的单克隆抗体。

抗小麦叶锈菌PHT、THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株LPT-1。

分类命名：抗小麦叶锈菌PHT、THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

保藏号：CGMCC No.3464。

保藏日期：2009年11月23日。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

实验材料：

小麦叶锈菌小种PHT、THT及其夏孢子，本实验室有保存，可向公众发放。

小麦品种郑麦5389，本实验室有保存，可向公众发放

实施例1：小麦叶锈菌的扩繁

本发明根据目前中国小麦锈菌发生流行状况，选择小麦叶锈菌的主要流行小种PHT、THT为实验材料，在中国农业科学院植物保护研究所的高温室进行鉴定与大量扩繁。

具体步骤如下：

1.种植小麦叶锈菌的感病品种郑麦5389，等到第2片新叶长出的时候，进行PHT、THT的接种。

2.接种前用装有清水的小型喷壶把小麦叶片喷湿，操作人员的双手经酒精消毒后，蘸取清水轻轻抹去叶面的蜡纸层，手蘸叶锈菌夏孢子，涂抹在小麦叶片上，来回多抹几次抹匀。

3.抹过锈菌后，实验员的双手先用70％的酒精冲洗，再用流动的自来水冲洗干净。

4.然后轻轻的把接种好的小麦苗子放入接种用的预先冲洗干净的铝质圆桶里，均匀的喷上水雾，看见有叶片表面有细雾即可，切忌喷水过多。

5.加盖塑料薄膜，黑暗条件下16℃下培养24小时。

6.取出接种的小麦苗，室温培养(20～25℃)，待接种后的小麦叶锈菌出现褪绿斑时，要剪去新叶，罩上已经高温灭菌的干净玻璃罩。

7.采集菌种时，把花盆放在台子上，用手平托玻璃罩，用细的铁条轻轻敲击，使夏孢子落入罩内，再敲击罩子，使孢子粉在罩子内呈一条线，倾倒入写好标签的小试管里。

实施例2：小麦叶锈菌免疫小鼠

1.收集新鲜扩繁的2种小麦叶锈菌孢子，经显微镜计数后，称量小麦叶锈菌PHT与THT夏孢子各0.15mg(5×10⁵个孢子/ml)，加入675μl生理盐水与675μl弗氏完全佐剂(美国sigma公司，货号F5881)，放入注射筒中，将2个注射筒接起来，来回推动混匀得到乳化抗原。

2.取4～8周龄雌性Balb/C小鼠，取200μl乳化抗原以皮下多点注射的方式进行免疫。3周后，夏孢子悬液与弗氏不完全佐剂混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐剂(美国sigma公司，货号F5506)代替弗氏完全佐剂与菌液混合乳化，按照相同剂量及方式进行免疫，后续免疫均按照此方案进行。第3次加强免疫后，每次免疫后的第10天进行小鼠眼下部位采血，采用间接ELISA法测定血清的效价与特异性。

3.测定血清效价时，须预先准备预包被有PHT、THT夏孢子的酶标板孔，具体操作如下：

(1)将步骤1中的夏孢子悬液，以100μl每孔加入酶标板孔，放置于37℃恒温箱中孵育16h，取出后以PBS-T(含有0.05％的吐温20)洗板3次，再向每孔加入200μl含有1％的脱脂奶粉的PBS于37℃封闭2h后储存备用。

(2)将梯度稀释的抗血清100μl加入酶标板孔，放置于37℃孵育1h，而后加入用PBS稀释1000倍的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1h后取出洗板。

(3)加入100μl的单组份显色底物(丹麦Kem-en-tec司，货号4800H)，37℃孵育10min。

(4)以0.2M的硫酸溶液中止反应，用酶标仪测定450nm吸光度值。表1为其中一次的测定数据。

表1血清效价测定结果示例

实施例3：小麦叶锈菌杂交瘤细胞株的筛选及单克隆抗体的制备

取实施例2中血清效价较高的小鼠，以实施例2中的夏孢子悬液150μl加强免疫，于5天后取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，“二步筛选法”筛选阳性克隆，同时对于检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时地转种并进行克隆化。采用“有限稀释法”进行杂交瘤细胞的克隆化，将细胞悬浮液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，接种至培养板，就可由此单个细胞繁殖形成同源性的细胞克隆，有多孔阳性时，尽可能取单克隆孔进行再次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，直至所有细胞孔的培养上清液均为阳性。阳性细胞株的筛选方法与实施例2中所述血清效价测定方法基本相同。唯一不同之处在于将实施例2中梯度稀释的抗血清用阳性细胞株的培养液上清进行替换。将最终选得的阳性细胞株(保藏号：CGMCCNo.3464)，扩大培养后，以体内诱生法制备腹水。

将制备的腹水中单克隆抗体经盐析沉淀后以蛋白A亲和柱层析纯化后备用。取与叶锈菌夏孢子同类的条锈菌夏孢子、秆锈菌夏孢子等，分别制备按照实施2的方法包被酶标板，用于包被的夏孢子的浓度为0.5mg/ml，将纯化的单克隆抗体稀释后加入酶标板孔，进行ELISA测定。根据吸光度值结果判定所筛选的单克隆抗体对这几种孢子的交叉反应。由表2可知，所制抗体对于PHT、THT两种叶绣孢子OD值较高(OD＞0.5)，其余均较低(OD＜0.5)。说明本发明制备的单克隆抗体是对PHT，THT的特异性抗体，可用于鉴别诊断小麦感染的是否是叶锈菌。

表2所制备的单克隆抗体交叉反应测定结果

注：包被浓度为0.5mg/ml，其余条件同实施例2步骤3。

实施例4：小麦叶锈菌特异性单克隆抗体在叶锈菌检测中的应用

将实施例3中纯化的单克隆抗体与包被好的酶标板进行ELISA测定，具体操作方法如下：

(1)称取叶锈菌孢子和待测的锈菌孢子样品各0.3mg以实施例2的方法包被酶标板，分别作为标准孔和对照孔。

(2)在酶标板孔中加入按最适合稀释倍数稀释好的单克隆抗体100μl，37℃避光反应30min，PBS-T洗板4次，每次间隔30s，拍干；

(3)加入用PBS稀释1000倍的羊抗鼠酶标二抗，37℃避光反应30min，PBS-T洗板4次，每次间隔30s，拍干；

(4)加入单组份显色液(丹麦Kem-en-tec司，货号4800H)100μl，37℃避光反应30min；

(5)加入0.2M的硫酸溶液100μl终止反应，酶标仪置450nm读数。

所有酶标板加样方式及反应时间均一致。

根据标准孔和对照孔的吸光度值确定未知样品是否是叶锈菌孢子。检测结果见表3.

表3应用单克隆抗体酶联免疫检测锈菌孢子结果示例

检测样品	检测结果(以OD450nm值计算)	结果分析
			PHT(标样1)	0.769	-
THT(标样2)	0.932	-
			待测样品1	0.303	否
待测样品2	0.893	叶锈菌夏孢子
			待测样品3	0.201	否
待测样品4	0.113	否

Claims (8)

1.一种小麦叶锈菌(Puccinia triticina f.sp.tritic)的单克隆抗体，按以下步骤制得：抗原免疫动物、细胞融合制备杂交瘤细胞、杂交瘤细胞分泌单克隆抗体三个步骤，其特征在于所述抗原为小麦叶锈菌的夏孢子。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的夏孢子。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述抗原为小麦叶锈菌生理小种PHT的夏孢子和THT的夏孢子等量混合物。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述抗原免疫动物之前，先以弗氏佐剂乳化所述抗原。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述动物为4～8周龄的Balb/C小鼠。

6.权利要求1～5任一所述单克隆抗体在检测小麦叶锈病中的应用。

7.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

(1)以小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子为抗原免疫小鼠，筛选出能分泌出对小麦叶锈菌小种PHT和/或THT的夏孢子特异性反应的血清的小鼠，

(2)取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞，

(3)从阳性杂交瘤细胞的培养液上清中或阳性杂交瘤细胞免疫小鼠制取的腹水中分离单克隆抗体。

8.抗小麦叶锈菌PHT、THT的单克隆抗体杂交瘤细胞株LPT-1，其保藏号为：CGMCC No.3464。