CN102101887B - 检测小麦三种锈菌的单克隆抗体、免疫荧光方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明“检测小麦三种锈菌的单克隆抗体、免疫荧光方法及试剂盒”，属于农业生物技术领域。本发明主要提供用于检测小麦三种锈菌的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No..4414的杂交瘤细胞株分泌，能够同时鉴别检测小麦叶锈菌、秆锈菌、条锈菌。还提供了基于该单克隆抗体与免疫荧光技术相结合的检测方法及试剂盒。具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

Description

检测小麦三种锈菌的单克隆抗体、免疫荧光方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及农业生物技术，特别是涉及检测小麦三种锈菌的单克隆抗体、免疫荧光方法及试剂盒。

背景技术

小麦锈病包括致病菌包括小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina f.sp.tritic)和小麦秆锈菌(Puccicinia graminis f.sp.tritici)，是一类世界性禾谷类作物的重要病害。小麦锈病具有发生区域广、暴发性强、流行频率高、危害损失重等特点，严重威胁着我国小麦的生产安全，而在我国以小麦条锈病的发生最为广泛，是影响我国小麦生产安全的首要病害，主要发生在西北、西南、长江中下游和华北等有关省(市、自治区)，每年发生面积约6000万亩，经大力防治后仍年均减产小麦10亿公斤左右；其次是小麦叶锈病，在西南和长江流域一带发生最重，华北和东北地区每年也有较重危害，而小麦叶锈病中，小麦叶锈菌生理小种或致病类型以PHT、THT两个小种为主(四川农业大学，蒲志刚，硕士论文“小麦叶锈菌群体毒性与DNA多态性关系分析及生理小种分子鉴定研究”2004)；小麦秆锈病过去主要分布在东南沿海、长江流域和福建、广东、广西的冬麦区及东北、内蒙古等春麦区发生流行(李振岐和曾士迈，2000)，通过沿海地区病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系统抗病品种的广泛种植，近30年来基本控制了该病害的流行危害，但在西南、淮北和东北等局部地区每年仍有不同程度的发生。

病害的早期诊断检测是准确测报和有效防控的基础和前提。长期以来，锈病的诊断主要基于病原菌的生物学及病害症状的特征，其预测预报主要基于定期、大规模的田间病叶调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。而条锈病和叶锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植保人员常常将二者混淆；在小麦锈病潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和规模。这些用于锈病诊断及病情测报的传统方法不仅耗时费工，且其准确性和可靠度在很大程度上取决于调查测报人员的经验积累与技术水平，难以满足病害的快速、高通量诊断检测实际需求。因此，有必要研发简单易行、灵敏准确的小麦锈病快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预测预报的准确度均具有重要的理论意义和实际应用价值。

目前，中国农业科学院植物保护研究所麦类病害实验室已经针对这一生产中面临的实际问题，建立了小麦条锈菌和叶锈菌种的特异性分子诊断检测技术(Cao et al.，2007；曹丽华等，2007)。然而，该类基于PCR扩增的病菌核酸检测技术不但需要配置一些特殊仪器如PCR仪、凝胶电泳装置等，且对操作人员的技术水平要求较高，难以在众多基层植保科技工作者和技术人员中推广应用。

单克隆抗体技术，是由单细胞系列产生的同一种抗体蛋白，其仅与抗原分子中的一个抗原决定簇结合，故与抗原性物质反应时相对专一，不受其它物质干扰，能区别物种间的细微差异。利用该方法检测病原菌具有诸多优点，如易于大量生产、可高通量检测、免用标记物，较易实现病菌的快速、实时、实地检测(Ward et al.，2004；Werres & Steffens，1994)，促使其迅速在农学、医学和食品学中得到广泛应用。同时，该方法涉及的仪器化程度较低、操作简便，特别是对样本前处理要求简单易于推广，国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。因而，单克隆抗体技术是实现田间快速检测病原菌的好方法(Danks & Barker，2000；Dewey et al.，1990；Ward et al.，2004)。自上世纪80年代以来，单克隆抗体技术已广泛应用于一些卵菌病原菌的生物学、分类学及致病性方面的研究，诸如Phytophthora cinnamomi(Hardhamet al.，1986；Gabor et al.，1993)，Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al.，1989)，及Aphanomyces invadans(Miles et al.，2003)，且成功研发了水生真菌Salmonella sp.，Escherichiacoli、Listeria monocytoenes(Bokken et al.，2003；Fratamico et al.，1998；Kouboves et al.，2001；Leonard et al.，2004)及几种细菌病原菌单克隆抗体检测技术(Ipbal et al.，2000)。丹麦农科院作为我们的合作伙伴，目前已经在小麦条锈菌的单克隆抗体研究方面取得了一些进展(Skottrup et al.，2007)，我们实验室最近已经获得多株小麦叶锈菌的单克隆抗体。

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、种类。

发明内容

本发明提供一种可检测小麦锈菌的单克隆抗体，并结合免疫荧光技术提供能同时区分小麦叶锈菌、秆锈菌、条锈菌的检测方法和试剂盒，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

检测小麦三种锈菌的单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CGMCC No.4414的杂交瘤细胞分泌。

上述单克隆抗体在检测小麦锈病中的应用。

检测小麦三种锈菌的免疫荧光方法，步骤如下：

(1)制备待测底片：在待测植株或组织的水浸泡液中按质量体积比0.02g∶100ml的比例加入多聚赖氨酸，将所得溶液涂于载玻片上，晾干；

(2)用PBS洗上述载玻片；

(3)在载玻片上加上述单克隆抗体，4℃孵育过夜；

(4)常温复温10分钟后用PBS洗玻片，然后在载玻片加荧光标记的二抗进行孵育；

(5)用甘油缓冲液封片，所述甘油缓冲液的配方为0.05M碳酸钠盐缓冲液，pH8.0，50％(W/V)甘油；

(6)镜检；

步骤(4)中，所述荧光标记的二抗为PE-Cy3标记的羊抗鼠IgG，所述孵育的条件为：37℃，90分钟。

检测小麦三种锈菌的试剂盒，特征在于包括免疫荧光检测板和荧光标记检测抗体，所述免疫荧光检测板上包被保藏号为CGMC No.3464的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为包被抗体，所述荧光标记检测抗体为上述单克隆抗体。

所述荧光为PE-Cy3。

本发明采用小麦叶锈菌生理小种PHT和/或THT的夏孢子作为抗原得到一系列杂交瘤细胞株，其中保藏号CGMCC No.4414的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能够用于特异地检测小麦三种锈菌。如图1-5所示：

本发明基于上述单克隆的特性，结合免疫荧光检测技术，提供了检测小麦锈菌的免疫荧光方法，实现在荧光显微镜下对三种锈菌的区分。

本发明为了使小麦锈菌检测途径更为便捷，基于上述单克隆抗体及荧光免疫方法还提供了试剂盒。试剂盒的原理为Elisa反应，采用保藏号为CGMCC No.3464的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为包被抗体包被在检测板上，本发明的单克隆抗体为检测抗体，并被荧光标记称荧光标记检测抗体，检测时，在检测板上滴加待测菌悬液，然后加入试剂盒所带的荧光检测抗体进行孵育反应。只需在荧光显微镜下观察即可得出检测结论。非常便捷、高效、低成本。

杂交瘤细胞株LPT-2。

分类命名：对小麦叶锈菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

保藏号：CGMCC No.4414。

保藏日期：2010年12月6日。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1，叶锈菌由于被其特异性单克隆抗体所捕获在载破片上，经过PE-Cy3标记的二抗孵育后镜检显示明黄色，400倍放大。

图2-3分别为秆锈菌和条锈菌，由于均未与叶锈菌的单克隆抗体相结合，与二抗孵育显示信号分别为暗黄色及绿色，400倍放大。

图4为三种锈菌的混合检测，可利用这三种颜色差异可直观分辨出叶锈菌和其他锈菌，200倍放大。

图5为检测灵敏度实验，该单克隆抗体的检测灵敏度可达2ng/ml，200倍放大。

具体实施方式

实验材料：小麦叶锈菌小种PHT、THT及其夏孢子，本实验室有保存，可向公众发放。

小麦品种郑麦5389，本实验室有保存，可向公众发放

试剂：PBS：0.01M，pH7.4(配方：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO4、0.24g KH₂PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)

PBS-T：(含有0.05％的吐温20的PBS)

甘油缓冲液：0.05M碳酸盐缓冲液pH8.0、50％(W/V)甘油

实施例1：小麦叶锈菌的扩繁

本发明根据目前中国小麦锈菌发生流行状况，选择小麦叶锈菌的主要流行小种PHT、THT为实验材料，在中国农业科学院植物保护研究所的高温室进行鉴定与大量扩繁。

具体步骤如下：

1.种植小麦叶锈菌的感病品种郑麦5389，等到第2片新叶长出的时候，进行PHT、THT的接种。

2.接种前用装有清水的小型喷壶把小麦叶片喷湿，操作人员的双手经酒精消毒后，蘸取清水轻轻抹去叶面的蜡纸层，手蘸叶锈菌夏孢子，涂抹在小麦叶片上，来回多抹几次抹匀。

3.抹过锈菌后，实验员的双手先用70％的酒精冲洗，再用流动的自来水冲洗干净。

4.然后轻轻的把接种好的小麦苗子放入接种用的预先冲洗干净的铝质圆桶里，均匀的喷上水雾，看见有叶片表面有细雾即可，切忌喷水过多。

5.加盖塑料薄膜，黑暗条件下16℃下培养24小时。

6.取出接种的小麦苗，室温培养(20～25℃)，待接种后的小麦叶锈菌出现褪绿斑时，要剪去新叶，罩上已经高温灭菌的干净玻璃罩。

7.采集菌种时，把花盆放在台子上，用手平托玻璃罩，用细的铁条轻轻敲击，使夏孢子落入罩内，再敲击罩子，使孢子粉在罩子内呈一条线，倾倒入写好标签的小试管里。

实施例2：小麦叶锈菌免疫小鼠

1.收集新鲜扩繁的2种小麦叶锈菌孢子，经显微镜计数后，称量小麦叶锈菌PHT与THT夏孢子各0.15mg(5×10⁵个孢子/mg)，加入675μl生理盐水与675μl弗氏完全佐剂(美国sigma公司，货号F5881)，放入注射筒中，将2个注射筒接起来，来回推动混匀得到乳化抗原。

2.取4～8周龄雌性Balb/C小鼠，取200μl乳化抗原以皮下多点注射的方式进行免疫。3周后，夏孢子悬液与弗氏不完全佐剂混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐剂(美国sigma公司，货号F5506)代替弗氏完全佐剂与菌液混合乳化，按照相同剂量及方式进行免疫，后续免疫均按照此方案进行。第3次加强免疫后，每次免疫后的第10天进行小鼠眼下部位采血，采用间接ELISA法测定血清的效价与特异性。

3.测定血清效价时，须预先准备预包被有PHT、THT夏孢子的酶标板孔，具体操作如下：

(1)将步骤1中的夏孢子悬液，以100μl每孔加入酶标板孔，放置于37℃恒温箱中孵育16h，取出后以PBS-T(含有0.05％的吐温20)洗板3次，再向每孔加入200μl含有1％的脱脂奶粉的PBS于37℃封闭2h后储存备用。

(2)将梯度稀释的抗血清100μl加入酶标板孔，放置于37℃孵育1h，而后加入用PBS稀释1000倍的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1h后取出洗板。

(3)加入100μl的单组份显色底物(丹麦Kem-en-tec司，货号4800H)，37℃孵育10min。

(4)以0.2M的硫酸溶液中止反应，用酶标仪测定450nm吸光度值。表1为其中一次的测定数据。

表1血清效价测定结果示例

实施例3：小麦叶锈菌杂交瘤细胞株的筛选及单克隆抗体的制备

取实施例2中血清效价较高的小鼠，以实施例2中的夏孢子悬液150μl加强免疫，于5天后取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，“二步筛选法”筛选阳性克隆，同时对于检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时地转种并进行克隆化。采用“有限稀释法”进行杂交瘤细胞的克隆化，将细胞悬浮液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，接种至培养板，就可由此单个细胞繁殖形成同源性的细胞克隆，有多孔阳性时，尽可能取单克隆孔进行再次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，直至所有细胞孔的培养上清液均为阳性。阳性细胞株的筛选方法与实施例2中所述血清效价测定方法基本相同。唯一不同之处在于将实施例2中梯度稀释的抗血清用阳性细胞株的培养液上清进行替换。将最终选得的阳性细胞株(保藏号：CGMCC No.4414)，扩大培养后，以体内诱生法制备腹水。

将制备的腹水中单克隆抗体经盐析沉淀后以蛋白A亲和柱层析纯化后备用。取与叶锈菌夏孢子同类的条锈菌夏孢子、秆锈菌夏孢子等，分别制备按照实施2的方法包被酶标板，用于包被的夏孢子的浓度为0.5mg/ml，将纯化的单克隆抗体稀释后加入酶标板孔，进行ELISA测定。根据吸光度值结果判定所筛选的单克隆抗体对这几种孢子的交叉反应。由表2可知，所制抗体对于PHT、THT两种叶绣孢子OD值较高(OD＞0.5)，其余均较低(OD＜0.5)。说明本发明制备的单克隆抗体是对PHT，THT的特异性抗体。

表2所制备的单克隆抗体交叉反应测定结果

注：包被浓度为0.5mg/ml，其余条件同实施例2步骤3。

实施例4：免疫荧光方法在检测三种锈菌检测中的应用

将实施例3制备得到的小麦叶锈菌特异性单克隆抗体纯化后按照以下步骤进行操作：

(1)制备待测底片：将经过生物检测方法确定分别为秆锈菌、条锈菌、叶锈菌的孢子悬浮液中按质量体积比0.02g∶100ml加入多聚赖氨酸，将所得溶液分别涂于载玻片上，得到秆锈菌、条锈菌、叶锈菌分别处理以及三种锈菌混合处理的待测底片，晾干；

(2)用PBS洗上述载玻片2次，每次5分钟；

(3)在载玻片上加实施例3所得的单克隆抗体，浓度为1ug/ml，100ul，4℃过夜孵育；

(4)复温10分钟后用PBS洗3次，每次5分钟，然后在载玻片加100ul 10ug/ml的PE-Cy3标记的羊抗鼠IgG进行孵育，37℃，90分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

(5)用甘油缓冲液)封片；

(6)镜检；

结果见图1～图4

图1中，叶锈菌由于被其特异性单克隆抗体所捕获在载破片上，经过PE-Cy3标记的二抗孵育后镜检显示明黄色(400倍放大)；

图2-3分别为秆锈菌和条锈菌，均未与叶锈菌的单克隆抗体相结合，与二抗孵育显示信号分别为暗黄色及绿色(400倍放大)；

图4为三种锈菌的混合检测，通过三种锈菌反映出来的三种颜色差异，可直观分辨出叶锈菌和其他锈菌(200倍放大)。

·实施例5灵敏度检测试验。

(1)制备待测底片：将三种锈菌混合处理的待测底片，晾干；

(2)用PBS洗上述载玻片2次，每次5分钟；

(3)在载玻片上加单克隆抗体(浓度为1000ng/ml，500ng/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2ng/ml，1ng/ml)，4℃过夜孵育；

(4)复温10分钟后用PBS洗3次，每次5分钟，然后在载玻片加100ul 10ug/ml的PE-Cy3标记的羊抗鼠IgG进行孵育，37℃，90分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

(5)用甘油缓冲液封片；

(6)镜检；

结果显示，该单克隆抗体的检测灵敏度可达2ng/ml。即采用抗体浓度最低为2ng/ml时能检测出锈菌。如图5，明亮的黄绿色为小麦叶锈菌，纯粹的绿色为小麦条锈菌，暗绿色为小麦秆锈菌(200倍放大)。

Claims (6)

1.检测小麦三种锈菌的单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CGMCC No.4414的杂交瘤细胞分泌。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在检测小麦锈病中的应用。

3.检测小麦三种锈菌的免疫荧光方法，步骤如下：

（1）制备待测底片：在待测植株或组织的水浸泡液中按质量体积比为0.02g：100ml的比例加入多聚赖氨酸，将所得溶液涂于载玻片上，晾干；

（2）用PBS洗上述载玻片；

（3）在载玻片上加权利要求1所述的单克隆抗体，4℃孵育过夜；

（4）常温复温10分钟后用PBS洗玻片，然后在载玻片加荧光标记的二抗进行孵育；

（5）用甘油缓冲液封片，所述甘油缓冲液的配方为0.05M碳酸钠盐缓冲液，pH8.0，50%（W/V）甘油；

（6）镜检。

4.根据权利要求3所述的免疫荧光方法，步骤（4）中，所述荧光标记的二抗为PE-Cy3标记的羊抗鼠IgG，所述孵育的条件为：37℃，90分钟。

5.检测小麦三种锈菌的试剂盒，特征在于包括免疫荧光检测板和荧光标记检测抗体，所述免疫荧光检测板上包被保藏号为CGMCC No.3464的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为包被抗体，所述荧光标记检测抗体为权利要求1所述的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述荧光为PE-Cy3。

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