CN116773802A - 一种利用胶体金免疫层析法检测小麦光腥黑穗病的试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用胶体金免疫层析法检测小麦光腥黑穗病的试纸条，所述试纸条所述试纸条包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在底板上；所述胶体金垫载有小麦光腥黑穗病多克隆抗体和胶体金颗粒偶联的复合物；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有小麦光腥黑穗病多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgG抗体。本发明的试纸条可在小麦收储过程中对光腥黑穗病小麦进行筛查检测分析，为小麦的安全监管提供简单有效的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用胶体金免疫层析法鉴定检测小麦光腥黑穗病的试纸条、制备方法及其应用。
背景技术
小麦光腥黑穗病是由小麦光腥黑粉菌（Tilletia foetida (Wallr.)Liro）引起的，是世界上最具破环性的小麦病害之一。小麦光腥黑穗病的发生造成小麦减产、面粉品质下降等严重危害。据文献资料，此病菌孢子具有毒性，人畜食用后可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状。
小麦光腥黑穗病的传播依靠冬孢子，冬孢子在土壤中可存活2年以上，室内干燥情况下可存活20年之久。冬孢子遇到适合的条件就会萌发，进而感染小麦，形成下一个感染循环。
目前，小麦光腥黑穗病的检测方法主要有感官检测、PCR检测、电子鼻检测、图像识别检测。常规形态学检测技术虽然成熟，但工作量巨大、耗时费力，特别是检测结果缺少定量数据支持，检测结果公信力不足；基于PCR方法的分子生物学检测结果虽然准确，但是前处理过程复杂，无法适应现场快速检测要求；相关国标方法检测对象过于注重进口输入性腥黑穗病菌，对于国内流行普通型腥黑穗病检测方法仍不够完善。因此，提供一种高效、准确、快速的检测小麦光腥黑穗病的检测方法具有重要的现实意义。
发明内容
针对上述检测技术的不足，本发明提供一种利用胶体金免疫层析法检测光腥黑穗病小麦的检测试纸条，可在小麦收储过程中对光腥黑穗病小麦进行筛查检测分析，为小麦的安全监管提供简单有效的技术支撑。
本发明采用的技术方案如下：
一种检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在底板上；
所述胶体金垫载有小麦光腥黑穗病多克隆抗体和胶体金颗粒偶联的复合物；
所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有小麦光腥黑穗病多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
进一步地，所述小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备过程为：
从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒，划开病瘿，释放出里面的黑色粉末，用0.5%次氯酸钠溶液进行杀菌处理，用无菌纯水清洗后离心得到孢子，取105个/mL浓度的孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，以13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，每只兔的免疫体积为1mL，免疫后第2周和第6周进行加强免疫，最后一次免疫2周后颈动脉取血，对兔血清进行亲和纯化，得到小麦光腥黑粉菌孢子的多克隆抗体。
优选地，所述试纸条的检测线上包被的完全抗原青霉素-BSA的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
优选地，所述底板为PVC板。
优选地，所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
进一步地，检测线上包被的小麦光腥黑穗病多克隆抗体的终浓度为1mg/mL，质控线上包被的羊抗兔IgG抗体的终浓度为1mg/mL。
上述试纸条在检测光腥黑穗病小麦中的应用。
本发明从感染光腥黑穗病小麦中提取得到光腥黑粉菌孢子，制备了光腥黑粉菌孢子的多抗，可特异性的识别小麦光腥黑穗病。本发明制备的检测试纸条可快速筛查检测感染光腥黑穗病的小麦，这种快速检测方法具有灵敏、准确、快速等优势，而且携带方便，可在小麦收储过程中推广应用，提高小麦在收购、流通环节的安全监管，同时溯源小麦感染光腥黑穗病染病地区，有利于光腥黑穗病的防治和管理。
附图说明
图1中a为正常小麦籽粒、b为感染光腥黑粉菌小麦完整籽粒、c为感染籽粒里面的黑色粉末、d为显微镜下光腥黑粉菌孢子、e为血清的WB检测结果图。
图2中a为多克隆抗体的线性验证结果、b为多克隆抗体的特异性验证结果。
图3为胶体金免疫检测试纸条的结构示意图。
图4为胶体金免疫检测试纸条的检测原理示意图。
图5为胶体金免疫试纸条检测光腥黑穗病小麦样品结果判定示意图，其中A为阴性结果，B为阳性结果，C为无效。
实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，以下实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
一、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备及验证
1、抗原准备：从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒（图1中b所示），取微量籽粒里面的黑色粉末（图1中c所示）至显微镜下观察，鉴定为光腥黑粉菌孢子（图1中d所示）；黑色粉末移入装有无菌纯水的离心管中，混匀，用双层医用纱布过滤，加入0.5%次氯酸钠溶液杀菌，涡旋仪上涡旋2min，5000rpm，4min条件下离心，次氯酸钠溶液处理重复3次后，用无菌纯水清洗多次；
抗原计数：离心后下层沉淀物（孢子）用0.1mol/L PBS溶液（pH=7.5）稀释，使用血细胞计数板计数，计算孢子的浓度，待用；
2、免疫制备多抗：取105个/mL浓度的光腥黑粉菌孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化用多聚乙烯管连接两个一次性注射器反复推动进行，当1滴乳化液在水面上呈现球形而不散开时，乳化完成；选择13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，免疫前采血0.5mL作为样本对照，每只兔的免疫体积为1mL，采用后颈部皮下注射。免疫后第2周和第6周进行加强免疫，免疫剂量相同。最后一次免疫2周后颈动脉取血，37℃静置1h后，3500rpm收集血清，血清经protein A柱纯化，0.01M PBS（pH=7.5）透析，再浓缩至1-2mg/mL，即可得小麦光腥黑粉菌多克隆抗体，分装，于-20℃保存。
对制备的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体进行WB验证：验证实验中使用三种不同的裂解方式提取孢子的总蛋白，分别是SD Sloading buffer 煮沸裂解20min、超声破碎后离心上清、超声破碎后沉淀用8M尿素溶解离心上清，图1中e中1-5对应第一种蛋白提取方式，7-10对应第二种蛋白提取方式，12-15对应第三种蛋白提取方式。使用5%奶粉作为封闭液，制得的孢子多克隆抗体作为一抗，稀释倍数为1000倍，孵化时间为1h，选用羊抗兔作为二抗，稀释倍数为8000倍，孵化时间45min。
如图1中e所示，WB验证结果说明光腥黑粉菌多克隆抗体对孢子本身确定有识别。
表1 孢子壁蛋白的不同提取方式及稀释倍数进行Western Blot验证光腥黑粉菌多抗
注：对应的膜号是指图1中e的照片中的数字。
3、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的线性验证
（1）包板：0.1mol/L Na2CO3溶液配制光腥黑粉菌孢子溶液，血细胞计数板计数，计算孢子浓度，并稀释至（0、600、3000、6000、60000个/mL），各取100μL至96孔板，室温孵育2h，4℃冰箱过夜；
（2）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（3）封闭：96孔板用5%BSA-PBS溶液200μL封闭，37℃孵育2h；
（4）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（5）偶联多抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释制备的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体至100倍、200倍，分别移取100μL至96孔板，37℃孵育2h；
（6）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（7）结合二抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释HRP-小鼠抗兔IgG至（生工生物工程(上海)股份有限公司，货号D110065-0001）5000倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（8）清洗：96孔板用PBS溶液清洗5次，每次200μL；
（9）检测：加入化学发光底物溶液100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，用酶标仪进行化学发光检测。
以孢子浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，绘制标准曲线，分析线性。如图2中a所示，制备的多克隆抗体在两种稀释倍数（1：100、1：200）条件下，在验证的孢子浓度范围内，线性关系良好，多克隆抗体稀释倍数为100时线性关系优于稀释倍数200的。
4、小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的特异性验证
（1）包板：培养黑曲霉孢子和黄曲霉孢子，并收集计数，并稀释至105个/mL的浓度，将光腥黑粉菌孢子分别与其他两种孢子等浓度混匀，然后分别取光腥黑粉菌孢子、黑曲霉孢子、黄曲霉孢子、光腥黑粉菌孢子+黑曲霉孢子、光腥黑粉菌孢子+黄曲霉孢子溶液100μL至96孔板，室温孵育2h，4℃冰箱过夜；
（2）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（3）封闭：96孔板用5%BSA-PBS溶液200μL封闭，37℃孵育2h；
（4）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（5）偶联多抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释制备的小麦光腥黑粉菌多克隆抗体100倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（6）清洗：96孔板用PBST溶液清洗4次，每次200μL；
（7）结合二抗：用0.5%BSA-PBS溶液稀释HRP-小鼠抗兔IgG至（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号D110065-0001）5000倍，移取100μL，37℃孵育2h；
（8）清洗：96孔板用PBS溶液清洗5次，每次200μL；
（9）检测：加入化学发光底物溶液100μL（湖州英创生物科技有限公司，A液货号：CL-A-001，B液货号：CL-B-001，A液：B液=1:1），混匀，用酶标仪进行化学发光检测；
根据各组的化学发光强度绘图，本发明中所制备的小麦光腥黑穗病多克隆抗体具有较好的特异性，见图2中b所示。
二、胶体金试纸条的制备和组装
1. 胶体金颗粒的制备：1mL 2%氯金酸溶液加入到200mL纯水中，混合均匀后置140℃油浴中加热至沸腾；在剧烈搅拌条件下，一次性加入3mL 1%柠檬酸三钠，待氯金酸水溶液变为酒红色，继续搅拌反应15min；反应结束后，转移至室温，缓慢搅拌至凉，用纯水将溶液体积补至200mL，20nm粒径的胶体金制备完成，4℃避光保存；
2. 多克隆抗体标记胶体金：移取10mL粒径20nm的金溶胶溶液于离心管中，加入42μL 0.2M K2CO3溶液，30μL（1mg/mL) 小麦光腥黑穗病多克隆抗体，混匀，避光反应2h；加入100μL 10% BSA溶液，封闭，置于4℃冰箱过夜；过夜后，将上述溶液在4℃条件下以12000rpm转速离心20min，弃去上清液，加入2mL的复溶溶液（0.01M 磷酸盐缓冲溶液（pH=8.0）+1%BSA+5%蔗糖），即可得小麦光腥黑穗病多克隆抗体-胶体金标记物；
3. 将制备好的胶体金标记物按照3μL/cm均匀铺在玻璃纤维上，37℃烘箱干燥16h，制成胶体金垫；
4. 检测线（T线）和质控线（C线）的制备：用微量进样器分别取浓度为1mg/mL的小麦光腥黑穗病多克隆抗体和羊抗兔IgG抗体，利用划膜仪在硝酸纤维膜上涂覆小麦光腥黑穗病多克隆抗体作为T线、羊抗兔IgG抗体作为C线，划线后在37℃的烘箱中干燥2h，后置于具有干燥剂的密封盒内密封保存；
5. 样品垫的处理：将玻璃纤维浸泡在Tris-HCl 缓冲液中（0.25%Triton X-100，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl，调节pH 至8.0），浸泡30min，置于37℃烘箱烘干，保存，备用；用切条机将样品垫切成宽度为3mm的长条，备用；
6. 胶体金试纸条的组装：将所述的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸一次黏贴在PVC背板上，再装入胶体金试纸条的卡壳，则试纸条制备和组装完成，如图3所示。
实施例2
利用胶体金试纸条检测光腥黑穗病小麦的方法
本实施例提供了基于胶体金-多克隆抗体免疫检测光腥黑穗病小麦的快速检测方法，所述方法以光腥黑粉菌孢子特异性结合多克隆抗体作为胶体金试纸条的识别分子，以胶体金作为介质，采用免疫层析原理检测样品中是否含有光腥黑粉菌孢子。
1. 称取10g小麦样品，粉碎机粉碎，称取0.5g的粉碎样品，然后加入10mL 0.1mol/L PBS溶液（pH=7.5），混匀，备用；
2. 用滴管滴加上述样品溶液3-4滴（约100uL）至试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果，超过30min显色无效。检测原理示意图见图4。
3. 结果判定：见图5。
阴性反应：T线不显色，C线显色；
阳性反应：T线、C线都显色；
失效反应：C线不显色，T线显色；或者C线、T线都不显色，则检测失败或者试纸条失效。
Claims (7)
1.一种检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在底板上；
所述胶体金垫载有小麦光腥黑穗病多克隆抗体和胶体金颗粒偶联的复合物；
所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有小麦光腥黑穗病多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，所述小麦光腥黑粉菌多克隆抗体的制备过程为：
从感染小麦光腥黑穗病的阳性样品中挑选完整的染病籽粒，划开病瘿，释放出里面的黑色粉末，用0.5%次氯酸钠溶液进行杀菌处理，用无菌纯水清洗后离心得到孢子，取105个/mL浓度的孢子溶液与弗氏完全佐剂等体积混合、乳化，以13周龄雄性新西兰大白兔作为免疫动物，每只兔的免疫体积为1mL，免疫后第2周和第6周进行加强免疫，最后一次免疫2周后颈动脉取血，对兔血清进行亲和纯化，得到小麦光腥黑粉菌孢子的多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的检测线上包被的完全抗原青霉素-BSA的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
4.根据权利要求1所述的检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为PVC板。
5.根据权利要求1所述的检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
6.根据权利要求1所述的检测小麦光腥黑穗病免疫层析试纸条，其特征在于，检测线上包被的小麦光腥黑穗病多克隆抗体的终浓度为1mg/mL，质控线上包被的羊抗兔IgG抗体的终浓度为1mg/mL。
7.权利要求1-6任一项所述的试纸条在检测光腥黑穗病小麦中的应用。
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