CN112964885B - 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒，采用双抗体夹心法检测氨基末端脑尿钠肽的含量；采用本发明的氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒，可以有效提高检出率。

Description

一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域。具体而言，本发明涉及氨基末端脑尿钠肽的检测方法和试剂盒。
背景技术
心力衰竭(心衰)是各种心脏疾病的严重和终末阶段，临床上主要表现为呼吸困难、乏力以及液体潴留等。据统计，我国目前心衰患病估计已达1.3％左右，现症患者约1000万，中国已成为世界上拥有最大心衰病患群体的国家。由于心血管疾病的可预防控制性，早期诊断至关重要。
血清标志物检测是临床上心衰早期诊断和预后判断的重要手段之一。其中包括脑尿钠肽(BNP)和氨基末端脑尿钠肽(NT-proBNP)，是国内外(ECS/ACC/AHA/HFSA/CSC)心力衰竭指南均推荐的心力衰竭首选血清标志物。
相比于BNP，NT-proBNP的半衰期更长、稳定性更好，因此NT-proBNP在检测早期或轻度心衰时的敏感度更高，更适用于临床应用。
发明内容
发明人经过大量理论研究和实验摸索，充分考虑氨基末端脑尿钠肽的结构特性，对各种待测NT-proBNP抗原区间和检测抗体进行分析研究，获得了能够用于氨基末端脑尿钠肽检测的氨基末端脑尿钠肽抗原区域组合。
在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
1.一种氨基末端脑尿钠肽检测试剂盒，其包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一组抗体和第二组抗体，
其中第一组抗体包括第一抗体至第四抗体之中的至少一种，第二组抗体包括第一抗体至第四抗体中除了第一组抗体之外的抗体，其中：
第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段；
第二抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；
第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第38-44位氨基酸片段；
第四抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第62-76位氨基酸片段。
2.项目1所述的试剂盒，第一组抗体为标记抗体时第二组抗体为包被抗体；或第二组抗体为标记抗体时第一组抗体为包被抗体。
3.项目1所述的试剂盒，所述第一组抗体和第二组抗体选自下组：
1)第一组抗体包括第一抗体，并且第二组抗体包括第二抗体、第三抗体和第四抗体；
2)第一组抗体包括第二抗体，并且第二组抗体包括第一抗体、第三抗体和第四抗体；
3)第一组抗体包括第三抗体，并且第二组抗体包括第一抗体、第二抗体和第四抗体；
4)第一组抗体包括第四抗体，并且第二组抗体包括第一抗体、第二抗体和第三抗体；
5)第一组抗体包括第一抗体和第二抗体，并且第二组抗体包括第三抗体和第四抗体；
6)第一组抗体包括第一抗体和第三抗体，并且第二组抗体包括第二抗体和第四抗体；
7)第一组抗体包括第一抗体和第四抗体，并且第二组抗体包括第二抗体和第三抗体。
4.项目1-3任一项所述的试剂盒，其中所述抗体的反应性为ELISA评价OD405≥0.5。
5.项目1-4任一项所述的试剂盒，其中所述标记抗体用可检测标记物和/或结合配偶体标记，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记；例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
6.项目1-5任一项所述的试剂盒，其中所述包被抗体连接至固相和/或结合配偶体，固相例如是磁性颗粒，胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
7.检测氨基末端脑尿钠肽的抗体组合，包括第一组抗体和第二组抗体，其中，第一组抗体和第二组抗体根据项目1-6中任一项所定义。
8.项目7所述的抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。
9.项目8所述的用途，其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括例如急性心力衰竭。
10.一种制备项目7所述的抗体组合的方法，所述方法包括：
1)使用包含选自下述片段1-片段4作为抗原或半抗原免疫动物：
片段1：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段13-27；
片段2：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段27-31；
片段3：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段38-44；
片段3：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段62-76；和
2)从所述动物获得分别结合所述片段1-片段4的抗体。
具体实施方式
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一组抗体和第二组抗体，其中第一组抗体包括第一抗体至第四抗体之中的至少一种，第二组抗体包括第一抗体至第四抗体中除了第一组抗体之外的抗体，其中，第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段；第二抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第38-44位氨基酸片段；第四抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第62-76位氨基酸片段。结合以上氨基酸片段的抗体配对检测氨基末端脑尿钠肽可以提高检测检出率。例如第一组抗体为标记抗体时第二组抗体为包被抗体；或第二组抗体为标记抗体时第一组抗体为包被抗体。
本发明的试剂盒包括氨基末端脑尿钠肽检测试剂卡(试纸条)。在一些实施方案中，可以利用免疫荧光技术，将抗体标记在可检测标记如荧光微球上，利用双抗体夹心法原理检测样品中的NT-proBNP。在一些实施方案中，本发明能够利用不同氨基酸片段的抗体识别抗原上的多个位置，本发明的方法和试剂盒能提高检出率和/或提高灵敏度。
在一些实施方案中，本发明可以通过荧光免疫层析进行或包括进行荧光免疫层析的试剂。在一些实施方案中，免疫层析可以通过试纸条由双抗体夹心法实现。在一些实施方案中，进行双抗体夹心法的试剂和装置没有特别限制，可以采用任何适当的试剂和/或装置。例如，荧光免疫层析试纸条可以包括样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫。在一些实施方案中，结合垫上固定有至少一个荧光基团标记的抗体；在一些实施方案中，NC膜上可以包被两条线，例如分别是T线和C线；T线上可以包被至少一个抗体；能捕捉来自结合垫上的荧光基团标记抗体与样品中抗原形成复合物，从而形成双抗体夹心。在一些实施方案中，待测样本加入到检测试剂卡的加样口中，在侧向毛细管作用下，待检样本先经过结合垫，与结合垫上的荧光基团标记抗体发生特异的免疫结合，各自结合形成抗原-抗体荧光复合物，从而被固定在T线中。C线上包被有与游离的荧光基团标记抗体发生反应的物质，当游离的荧光基团标记抗体经过C线时，能够与C线上的物质发生特异的免疫结合，从而被固定在C线中。对照带(C)与测试带(T)的荧光强度成反比，从而可以校正样本个体差异。荧光免疫分析仪检测出的两条带的荧光强度以峰面积体现，并通过仪器自身的计算软件计算T/C值(T峰面积/C峰面积)，拟合至已设定的标准曲线，荧光免疫分析仪自动换算出相应待检样本中NT-proBNP的浓度值。
在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体、结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体、结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体、结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体、结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体作为第二组抗体。
在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的62-76aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的38-44aa片段的抗体作为第二组抗体。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用。在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，可以采用本领域已知的方法制备本发明的抗体。在一些实施方案中，可以以包含本文描述的氨基酸片段的抗原免疫动物制备本发明的抗体。为了增加免疫原性，可以将载体蛋白(包括但不限于BSA、卵清蛋白、KLH等)与免疫反应性物质(例如表位肽)偶联。载体蛋白可以包括蛋白质或多肽，其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白和/或其片段。在一些实施方案中，免疫反应性物质(例如氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段，但不限于此)可以用于产生具有对NT-proBNP亲和力的抗体。
在一些实施方案中，抗体结合氨基末端脑尿钠肽对应的氨基酸片段结合可以指抗体能够结合所述氨基酸片段，但该氨基酸片段不一定是最小结合片段。
在一些实施方案中，可以使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定、动物模型等检测本发明抗体的效果如结合活性和/或交叉反应性。在一些实施方案中，所述测定可以包括例如ELISA，FACS结合测定，Biacore，竞争性结合测定等。在一些实施方案中，例如在ELISA中表征本发明的抗体与抗原(抗原肽)结合的反应性，例如通过过氧化物酶标记的ELISA法读取405nm处的反应值≥0.5确定为有较好反应性，可用于免疫测定。
在一些实施方案中，试剂盒中包括第一组抗体和第二组抗体；在一些实施方案中，还可以使用其它抗体作为包被抗体或标记抗体。
在一些实施方案中，所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中，所述包被抗体结合至固相的方式可以是直接或间接。在一些实施方案中，所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中，固相支持物没有特别限制，其可以是例如磁性颗粒，胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。在一些实施方案中，所述包被抗体结合至结合配偶体，结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；在一些实施方案中，包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
在一些实施方案中，所述标记抗体用可检测标记物标记。在一些实施方案中，所述标记抗体与可检测标记物可以是直接或间接结合。在一些实施方案中，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记；在一些实施方案中，可检测标记物例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记。在一些实施方案中，所述标记抗体与结合配偶体连接，结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括适合进行免疫测定的试剂。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以用于进行免疫测定，例如ELISA，间接免疫荧光测定IFA，放射免疫测定RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在一些实施方案中，本发明提供抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括例如急性心力衰竭。
本文中的术语“诊断”在最广义上使用。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是健康状态的鉴别。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是阴性样本的排除。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是辅助诊断。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是危险分层。
在一些实施方案中，本发明提供制备检测氨基末端脑尿钠肽的抗体的方法，所述方法包括将包含本文描述的氨基酸片段的免疫反应性多肽作为抗原或半抗原分别免疫动物，从而制备检测氨基末端脑尿钠肽的抗体如单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体可以通过本领域已知的方法进行。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文描述的氨基酸片段的免疫反应性多肽在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂或试剂盒中的用途。
在本文中，待检NT-proBNP的样品可以包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液，例如血液样品，例如血浆、血清、血制品。
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。提供以下实施例以说明本发明的实施方案，并非意在限制本发明。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。
一、氨基末端脑尿钠肽单克隆抗体的制备
1.免疫动物：取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的NT-proBNP抗原与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的NT-proBNP抗原与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)，滴度在1:2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2.饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3.免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4.细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2-5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5.杂交瘤细胞的选择培养
免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经PEG处理后，形成多种细胞成分的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞，骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体，以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的导核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此，在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体，并选择出真正的杂交细胞。因此，在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养。
6.抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含NT-proBNP的抗体的培养孔。采用有限稀释法使杂交瘤细胞克隆化。经过培养后单个细胞可增殖为同源性细胞克隆；经通过反应性筛选得到反应性较好且稳定分泌抗NT-proBNP单克隆抗体的细胞株。
反应性筛选的方法：在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)用100μL/孔含2.5μg/mL人NT-proBNP(作为抗原)的包被缓冲液包被1小时。包被后处理在PBS缓冲液和1％单克隆抗体中进行孵育30分钟。随后，用洗涤缓冲液进行洗涤。在室温下，在搅拌时将100μL/孔抗体样品孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下，在搅拌时再与100μL/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用ELISA读板器读取405nm处的反应值)，得到OD405≥0.5(有较好反应性)的抗体。
二、抗体结合片段的鉴定
采用不同NT-proBNP抗原肽分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释单抗为一抗浓度到1μg/mL，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，依据各单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗的结合片段。实施方式中所用的细胞株的结合片段鉴定结果如下表：
结合片段 细胞株
1-12aa 1NT-9；7NT-3
13-27aa 3NT-12-1；5NT-6；5NT-8
27-31aa 6NT-1；8NT-7
31-39aa 2NT-17；3NT-16
38-44aa 2NT-9-1；8NT-5
42-46aa 1NT-3-14；3NT-22
62-76aa 7NT-1-5；32NT-1
三、配对筛选
选取不同结合片段的抗体分别用于包被以及标记，进行交叉配对实验，筛选过程如下：
1.标记
(1)取荧光微球100uL，离心15000rpm/8min/4℃，离心完后去上清，重悬至100uL，超声2-3次；
(2)配置10mg/mL的EDC和NHS；
(3)活化：使用EDC和NHS活化荧光微球至终体积200uL，避光混匀18min，后离心15000rpm/10min/4℃，去上清；
(4)洗涤：重悬至100uL，超声2-3次，15000rpm/8min/4℃，去上清，重复2次；
(5)偶联：重悬至200uL，超声2-3次，将抗体加入荧光微球中，至终体积300uL，避光混匀，37℃反应2h；
(6)封闭：加入封闭剂100uL，避光混匀，37℃反应1h；
(7)洗涤：封闭完后离心15000rpm/12min/4℃，去上清。重悬至100uL，超声2-3次。再离心15000rpm/8min/4℃，去上清；
(8)保存：重悬至100uL，超声2-3次，4℃保存备用。
2.包被
(1)将硝酸纤维素膜与荧光PVC底板组装好备用；
(2)将抗体稀释至1.0-2.0mg/mL,用喷金画膜仪，在NC膜上均匀的画线，然后放入37℃恒温箱中进行干燥，至少干燥45min以上。组装切条，加样检测。
3.检测
(1)质控品：NT-proBNP抗原，使用PBS稀释至35000，10000，1000，500pg/mL；
(2)检测方法：使用荧光仪检测。仪器读值T/C表示T峰面积与C峰面积比值，反应配对活性，在质控以及阳性标本下T/C越高代表活性越高。
表1、第一轮筛选
Figure BDA0002945795690000101
Figure BDA0002945795690000111
交叉配对第一轮筛选中检测96份阳性样本评价检出率，结果如表1所示：以上抗体配对漏检率均不太理想。
下一步考虑在漏检率较低的配对中，进行表位补充，并对2+1模式及2+2模式的组合评估。结果如表2所示：将1+1模式中得到的漏检率较低的配对进行组合，发现在结合27-31的NT-proBNP抗体和结合62-76aa的NT-proBNP抗体基础上，引入结合13-27aa的NT-proBNP抗体、结合38-44aa的NT-proBNP抗体，检出率得到大幅提升。继续将上述四个结合片段对应的抗体组合进行1+3模式及3+1模式的评估，结果如表3所示：检出率均为100％。
表2、2+1模式及2+2模式评估
Figure BDA0002945795690000112
Figure BDA0002945795690000121
表3、1+3模式及3+1模式评估
标记 包被 漏检率
3NT-12-1 6NT-1+2NT-9-1+7NT-1-5 0/96
6NT-1 3NT-12-1+2NT-9-1+7NT-1-5 0/96
2NT-9-1 3NT-12-1+6NT-1+7NT-1-5 0/96
7NT-1-5 3NT-12-1+6NT-1+2NT-9-1 0/96
3NT-12-1+6NT-1+2NT-9-1 7NT-1-5 0/96
3NT-12-1+6NT-1+7NT-1-5 2NT-9-1 0/96
3NT-12-1+7NT-1-5+2NT-9-1 6NT-1 0/96
为进一步验证所述结合片段组合的高特异性及低漏检率并非由特定抗体带来，将同一结合片段的不同株抗体进行替换，其中，5NT-6、3NT-12-1为结合13-27aa片段的抗体，8NT-7、6NT-1为结合27-31aa片段的抗体，8NT-5、2NT-9-1为结合38-44aa的抗体，32NT-1、7NT-1-5为结合62-76aa的抗体，结果如表4所示。
表4、替换验证
Figure BDA0002945795690000122
Figure BDA0002945795690000131
本发明还通过以上所述的抗体制备方案，以NT-proBNP氨基酸片段13-27偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合13-27aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT32A-9等，以NT-proBNP氨基酸片段27-31偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合27-31aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT30C-3等，以NT-proBNP氨基酸片段38-44偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合38-44aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT13F-5等，以NT-proBNP氨基酸片段62-76偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合62-76aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT41E-2等，任意配对(即2+2配对/1+3配对/3+1配对)漏检率均不超过0。
四、胶体金平台测试
将2+2模式中得到的优势组合，即结合13-27aa的NT-proBNP抗体、结合27-31aa的NT-proBNP抗体、结合38-44aa的NT-proBNP抗体及结合62-76aa的NT-proBNP抗体，以3NT-12-1和6NT-1作为标记抗体进行混标、7NT-1-5和2NT-9-1作为包被抗体进行混包为例应用于胶体金平台，测试其最低检测限及临床特异性。操作步骤如下：
1.标记
(1)胶体金制备：采用传统柠檬酸钠还原法，首先将氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入一定比例的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，待溶液颜色变为酒红色且不再变化时停止加热，冷却至室温，得到浓度为4/万的胶体金溶液；
(2)标记：向胶体金溶液中加入0.2M K2CO3溶液调节pH至7.0-10.0；
(3)离心：向调节pH后的胶体金溶液中加入标记抗体并混匀，后加入封闭剂，终止标记，离心10000rpm/7min/4℃，去上清；
(4)复溶：重悬至100uL，超声2-3次；
(5)铺金：将重悬得到的浓缩金稀释并铺于玻璃纤维素膜，然后放入冻干机冻干(1-2h)或者放入37℃干燥房干燥过夜。
2.包被
(1)将硝酸纤维素膜与胶体金PVC底板组装好备用；
(2)将抗体稀释至1.0-2.0mg/mL,用喷金画膜仪，在NC膜上均匀的画线，然后放入37℃恒温箱中进行干燥，至少干燥45min以上。组装切条，加样检测。
检测结果如下：
1)最低检测限(胶体金平台)：
表5、NT-proBNP抗体组合对质控品a不同稀释比例的显色强度b
稀释比例 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
显色强度 C1 C2 C4 C6 C7 C8
a：BIO-RAD LiquichekTM Cardiac Markers Plus Control 183
b：显色强度由强到弱依次为“C1-C9”
从表5可以看出，该抗体组合制备的半成品条具有较好的检测梯度，参考检测限可以达到约80pg/mL。
2)特异性(胶体金平台)：
检测326份阴性标本，仅2份显色B+，特异性为99.4％。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种氨基末端脑尿钠肽检测试剂盒，其特征在于，其包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一组抗体和第二组抗体，
其中第一组抗体是第一抗体至第四抗体之中的至少一种，第二组抗体是第一抗体至第四抗体中除了第一组抗体之外的抗体，其中：
第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段；
第二抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；
第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第38-44位氨基酸片段；
第四抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第62-76位氨基酸片段，
第一组抗体为标记抗体时第二组抗体为包被抗体；或第二组抗体为标记抗体时第一组抗体为包被抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组抗体和第二组抗体选自下组：
1)第一组抗体是第一抗体，并且第二组抗体是第二抗体、第三抗体和第四抗体；
2)第一组抗体是第二抗体，并且第二组抗体是第一抗体、第三抗体和第四抗体；
3)第一组抗体是第三抗体，并且第二组抗体是第一抗体、第二抗体和第四抗体；
4)第一组抗体是第四抗体，并且第二组抗体是第一抗体、第二抗体和第三抗体；
5)第一组抗体是第一抗体和第二抗体，并且第二组抗体是第三抗体和第四抗体；
6)第一组抗体是第一抗体和第三抗体，并且第二组抗体是第二抗体和第四抗体；
7)第一组抗体是第一抗体和第四抗体，并且第二组抗体是第二抗体和第三抗体。
3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述抗体的反应性为ELISA评价OD405≥0.5。
4.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述标记抗体用可检测标记物和/或结合配偶体标记。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物是金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶标记。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物
是罗丹明、荧光素、荧光微球、胶体金、吖啶酯、荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述结合配偶体是生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白；而标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
8.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述包被抗体连接至固相和/或结合配偶体。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述固相是磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述结合配偶体是生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白，而包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
11.检测氨基末端脑尿钠肽的抗体组合，其特征在于，由第一组抗体和第二组抗体组成，其中，第一组抗体和第二组抗体根据权利要求1-5中任一项所定义。
12.如权利要求11所述的抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括急性心力衰竭。
14.一种制备权利要求11所述的抗体组合的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)使用包含选自下述片段1-片段4作为抗原或半抗原免疫动物：
片段1：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段13-27；
片段2：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段27-31；
片段3：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段38-44；
片段4：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段62-76；和
2)从所述动物获得分别结合所述片段1-片段4的抗体。
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