CN115627264B - 一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用，所述的杂交瘤细胞株包括抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81与抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81的保藏号为CGMCC No.45178，抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51的保藏号为CGMCC No.45179。本发明所述的杂交瘤抗Mp1p单克隆抗体效价可达1:5.12×105，与马尔尼菲甘露聚糖蛋白结合能力强，特异性高，可用于体外诊断试剂的开发，制得的荧光免疫试剂盒灵敏度高，抗干扰能力强，样本可不经预处理直接加样检测，操作更简便，检测时间更短。

Description

一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
马尔尼菲篮状菌（ Talaromyces marneffei）是一种双相青霉菌，30℃时为菌丝态，37℃为酵母态，酵母态为致病形态。马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌感染引起的一种深部真菌病，多见于免疫缺陷或免疫功能抑制者，主要流行于东南亚国家及我国南方地区，是HIV感染者最常见的一种侵袭性真菌病。马尔尼菲篮状菌侵入人体后，首先被单核-巨噬细胞吞噬并在巨噬细胞内增殖，并通过网状内皮系统播散。近年来，随着糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用、器官移植、艾滋病等所导致的免疫缺陷宿主不断增多，马尔尼菲篮状菌病也日渐增多。马尔尼菲篮状菌病没有特异性临床症状和体征，误诊率较高，且病情凶险，如果得不到早期的诊断，往往会错过治疗的最佳时机。
马尔尼菲篮状菌传统的检测方法主要是痰或者血液培养，培养阳性可以作为诊断依据。但是该方法操作步骤繁琐且培养时间较长，需数天才能得到实验结果。常见的诊断方法还有实时荧光定量PCR，该方法灵敏度高，但是专业性强，操作较为复杂。血清学荧光免疫层析检测方法在临床上也是常见的，该方法应用范围广，检测速度快，操作简便。Mp1p是存在于马尔尼菲篮状菌细胞壁的一种高度抗原性甘露聚糖蛋白，可在感染患者中引起抗体反应。荧光免疫层析间接法可检测Mp1p抗体，夹心法可检测Mp1p抗原，并且同时检测Mp1p的抗体和抗原可大大提高检测的灵敏度和特异性。
荧光免疫层析试剂盒具备操作快速、检测时间短、灵敏度高、准确性好等优点，但荧光免疫层析试剂盒在研发生产过程中受到的影响因素较多，如膜材的加热烘干、环境温湿度、缓冲液pH值等，而实现荧光免疫层析检测Mp1p的关键是具备高特异性且稳定性好的抗Mp1p抗体。
为解决上述问题，本发明提供了一种的抗Mp1p的杂交瘤细胞株，制备的单克隆抗体具有高敏感性、高特异性、高效价、稳定性好等优点，可用于免疫诊断试剂的开发。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗Mp1p的杂交瘤细胞株，制备的单克隆抗体具有高敏感性、高特异性、高效价等优点，可用于免疫诊断试剂的开发。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株，包括抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81与抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81的保藏号为CGMCC No.45178，抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51的保藏号为CGMCC No.45179。抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81的分类命名为杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.45178，保藏日期为2022年06月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51的分类命名为杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.45179，保藏日期为2022年06月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
抗Mp1p单克隆抗体，所述的抗Mp1p单克隆抗体由抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81和/或抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51分泌得到。
所述的抗Mp1p单克隆抗体的应用，所述的抗Mp1p单克隆抗体在制备马尔尼菲篮状菌抗原的检测产品中的应用。
进一步，所述的抗Mp1p单克隆抗体在制备马尔尼菲甘露聚糖蛋白的检测产品中的应用。
进一步，所述的抗Mp1p单克隆抗体在制备马尔尼菲甘露聚糖蛋白体外诊断试剂盒中的应用。
进一步，所述的体外诊断试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、微流体芯片试剂盒或荧光免疫试剂盒中的至少一种。
一种马尔尼菲篮状菌抗原的检测产品，所述的检测产品含有所述的抗Mp1p单克隆抗体。
进一步，所述的检测产品为试剂、试剂条或试剂盒中的至少一种。
一种马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的抗Mp1p单克隆抗体。
进一步，所述的试剂盒以保藏号为CGMCC No.45178的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为包被抗体，以保藏号为CGMCC No.45179的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为标记抗体或以保藏号为CGMCC No.45178的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为标记抗体，以保藏号为CGMCC No.45179的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为包被抗体。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的杂交瘤抗Mp1p单克隆抗体效价可达1:5.12×105，与马尔尼菲甘露聚糖蛋白结合能力强，特异性高，可用于体外诊断试剂的开发，制得的荧光免疫试剂盒灵敏度高，抗干扰能力强，样本可不经预处理直接加样检测，操作更简便，检测时间更短。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的抗Mp1p单克隆抗体的电泳图。
本发明提供了抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81，抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81的分类命名为杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.45178，保藏日期为2022年06月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
本发明提供了抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51，抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51的分类命名为杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.45179，保藏日期为2022年06月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 抗Mp1p单克隆抗体制备
采用我司在申请号为202210090101.7的专利中制备得到的马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白进行抗Mp1p单克隆抗体的制备。
用纯化的马尔尼菲篮状菌甘露聚糖蛋白免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备，共免疫5只小鼠，按表1的免疫方式进行免疫。免疫完成后断尾取血测定效价，选择结果最佳的小鼠进行融合。摘取融合小鼠眼球，放血，将血清作为阳性对照，脱颈处死后无菌条件下取出脾脏，制备脾细胞，与SP2/0细胞按5:1的比例进行PEG融合，将融合后的细胞悬液加入96孔板，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。次日检查有无污染，第7天换用HT培养基，继续培养2d，用间接ELISA筛选融合细胞的上清，挑选强阳性、单个克隆、细胞状态好的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，同时进行扩大培养、冻存，直至建立单一分泌抗体的单克隆细胞株。之后采用小鼠体内诱生腹水的方法，大量制备获得抗Mp1p单克隆抗体过镍柱纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测，如图1所示。
表1 免疫方式
实施例2 抗Mp1p单克隆抗体效价测定
采用间接ELISA法进行纯化后抗体效价测定，步骤如下：Mp1p由PBS稀释至0.5ug/mL，100ul/孔，4℃过夜包被，甩干，PBST洗涤3次；10% BSA，200ul/孔，37℃封闭2h；甩干，PBST洗涤3次，加入从1:1000倍开始进行倍比稀释的抗体（浓度为1000 ng/ml），共计11个梯度，100ul/孔，37℃，1h。甩干，PBST洗涤3次，加PBS 1:5000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，30min。甩干，PBST洗涤3次，加100ul TMB/孔，37℃，显色15min，终止，读值。纯化后抗体稀释至1mg/ml，效价达到了1:512000以上，具体结果如表2所示。
表2 效价测定
实施例3 马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒的制备
试剂盒在荧光垫包埋荧光微球标记的12A81，在硝酸纤维素膜检测线包被13B51，双抗体夹心法检测人血清样本中的Mp1p。
1、试剂盒制备操作过程
荧光微球表面标记应用所述的抗Mp1p单克隆抗体。
1mL 1%羧基荧光微球，加入10mLMES缓冲液，再加入30μL EDC溶液（10mg/mL）和30μL NHS溶液（10mg/mL），室温震荡反应30min，离心收集沉淀。加入HEPES复溶液，超声分散均匀后加入1mL1mg/mL的12A81，室温震荡反应120min，再加入1mL封闭液（10%BSA），室温震荡反应120min。离心收集微球，用复溶液复溶。
荧光垫包埋荧光微球，标记后的荧光微球用微球复溶液稀释，使用喷金划膜仪喷涂荧光垫，喷涂4μL/cm，喷涂间距3mm。喷涂结束后放入37℃低湿度（＜30%）烘干1-4h。
NC膜包被CT线，包被液成分为含1%蔗糖的0.01M PBS，T线使用浓度为1mg/mL的抗Mp1p单克隆抗体，C线使用浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG抗体，1μL/cm划线，结束后放入55℃低湿度（＜30%）烘干1-24h，再调整温度至37℃低湿度（＜30%）烘干1-48h。
样品垫制备：用样品垫处理液对样品垫进行处理，将处理后的样品垫烘干。样品垫处理液中主要包括碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷等缓冲盐。上述样本处理液还含有一定比例的表面活性剂，包括Tween-20、Tween-80、CHAPS、Brij35、Brij23、Triton-X100、SDS、月桂酰肌氨酸钠等中的一种或者几种混合。上述样本处理液还含有一定比例的封闭剂，包括BSA、酪蛋白、甘氨酸、鱼胶、脱脂奶粉等中的一种或者几种混合。经样品垫处理液处理后的样品放入37℃烘箱烘干。
试剂盒组装，PVC板上依次粘贴NC膜、吸水垫、荧光垫、样品垫，吸水垫和荧光垫各压NC膜1-2mm，样品垫压荧光垫1-2mm。组装后试剂盒切割成宽度4±0.4mm，装卡壳。卡壳和干燥剂一同放入铝箔袋塑封。贴签装盒即可得到成品试剂盒。
2、试剂盒检测过程
将检测卡置于干净平坦的台面上，吸取90-100μL的样本滴加于检测卡的加样端中。导入试剂盒标准曲线，20-25分钟后，使用荧光免疫分析仪扫描检测区得到荧光信号，检测后会显示抗体浓度值，结合Cutoff判定样本的阴阳性。
3、试剂盒敏感性和特异性分析
使用本试剂盒检测临床实验阳性血清样本57例，阴性血清样本98例，计算敏感性和特异性。结果如表3所示。
表3 试剂盒的敏感性和特异性
4、检测Mp1p抗原梯度
将Mp1p使用样本处理液分别稀释至1000、50、100、10、1、0pg/mL，使用本试剂盒检测，每个梯度重复检测3次，计算平均值。实验结果说明由12A81和13B51抗体对制备的试剂盒灵明度高，可检测至最低10pg/mL的Mp1p抗原，如表4所示。
表4 检测Mp1p抗原梯度
对比例1
使用实施例1中得到的其他较优抗Mp1p单克隆抗体对A和B，非12A81和13B51；使用其他不同氨基酸序列的马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白作为免疫原，制备得到的抗马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白抗体对C和D（抗体来自：专利申请号202110382535.X），应用荧光免疫层析法制备马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒。
1、试剂盒制备操作过程同实施例3，分两种加样方式检测样本：
（1）样本直接加样。
（2）样本稀释处理后加样：使用样本稀释液1:5稀释血清样本，样本稀释液具体组分如下：主要包括碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷等。上述样本处理液还含有一定比例的表面活性剂，包括Tween-20、Tween-80、CHAPS、Brij35、Brij23、Triton-X100、SDS、月桂酰肌氨酸钠等中的一种或者几种混合。
使用实施例3、对比例1制备的3种不同的马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒（荧光免疫层析法）分别检测30例阳性样本和30例阴性样本，比较不同抗体应用在荧光免疫层析试剂盒上检测样本的符合率，样本直接加样结果如表5所示，样本稀释处理结果如表6所示。
表5 样本直接加样检测结果
表6 样本稀释处理加样检测结果
由表5和表6可知，12A81和13B51抗体制备的马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒（荧光免疫层析法）两种加样方式对样本符合率没有较大影响，样本符合率大于90%。其他抗体制备的试剂盒，样本直接加样检测，阳性样本和阴性样本的符合率均较低；样本稀释处理后检测，样本符合率得到较大提高。因此，12A81和13B51抗体对抗干扰能力强，制备的马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒（荧光免疫层析法）检测样本可直接加样，不用稀释处理再加样，样本符合率更高，操作更简便，检测时间更短。
2、将12A81和13B51抗体对、A和B抗体对、C和D抗体对制备的马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒（荧光免疫层析法）放置于37℃条件下，分别于0、5、10、15、20、30、60天取出试剂盒，分别检测中阳和低阳样本，每个样本每次检测10次，计算浓度值CV。
表7 稳定性结果
由表7可知，随着试剂盒在37℃储存时间的延长，12A81和13B51抗体对制备的马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒样本的浓度值CV没有较大变化，其他两种试剂盒检测样本的浓度值CV明显升高，说明12A81和13B51抗体对制备的荧光免疫层析检测试剂盒稳定性更佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.抗Mp1p单克隆抗体，其特征在于：所述的抗Mp1p单克隆抗体由抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81或抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51分泌得到；
所述的抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81与抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，抗Mp1p杂交瘤细胞株12A81的保藏号为CGMCCNo.45178，抗Mp1p杂交瘤细胞株13B51的保藏号为CGMCC No.45179。
2.一种马尔尼菲篮状菌抗原的检测产品，其特征在于：所述的检测产品含有权利要求1所述的抗Mp1p单克隆抗体；所述的检测产品为试剂、试剂条或试剂盒中的至少一种；所述的试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、微流体芯片试剂盒或荧光免疫试剂盒中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的马尔尼菲篮状菌抗原的检测产品，其特征在于：所述的试剂盒以保藏号为CGMCC No.45178的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为包被抗体，以保藏号为CGMCC No.45179的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为标记抗体或以保藏号为CGMCC No.45178的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为标记抗体，以保藏号为CGMCC No.45179的抗Mp1p杂交瘤细胞株分泌得到的抗Mp1p单克隆抗体作为包被抗体。
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