CN113495145A - 白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心elisa检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12‑24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，本发明通过利用针对白念珠菌重组Eno的单抗和多抗建立双抗体夹心ELISA法，可以识别白念珠菌增殖过程中产生的天然Eno抗原，通过对性能指标的评价，该方法的特异性、精密度均能满足临床应用的要求，检测灵敏度较高。

Description

白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法
技术领域
本发明属于白念珠菌的检测技术领域，具体涉及白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法。
背景技术
白念珠菌是一种腐物寄生菌，平时生存于人体的皮肤、粘膜、消化道及其他脏器中，当机体抵抗力降低时，白色念珠菌就会繁殖，达到一定量时，人体就会发病，所以白念珠菌是一种条件致病菌。白色念珠菌还可以通过公共浴池、浴盆、浴巾、游泳衣、衣服、医疗器械和敷料等传播。
酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann于70年代开发的一种免疫分析方法。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一，在医学实验，临床诊断，生物制药方面的运用也极为广泛。很多厂家都开发了针对各种蛋白质、生物标记物、病毒和细菌的酶联免疫吸附分析检测试剂盒。
目前临床上用于辅助诊断IC的抗原检测项目为G试验，这种检测方法检测的是真菌细胞壁上共有的1，3-β-D-葡聚糖，其阳性结果不能区分丝状真菌与酵母样真菌感染，更不能区分感染念珠菌属内的具体种别。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，以解决上述背景技术中提出的目前临床上用于辅助诊断IC的抗原检测项目为G试验，这种检测方法检测的是真菌细胞壁上共有的1，3-β-D-葡聚糖，其阳性结果不能区分丝状真菌与酵母样真菌感染，更不能区分感染念珠菌属内的具体种别的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度分别为2.1-16.8ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
优选的，所述步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
优选的，所述步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
优选的，所述步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
优选的，所述步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
优选的，所述步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
优选的，步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
优选的，所述标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
优选的，所述Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
优选的，所述步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
与现有技术相比，本发明提供了白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，具备以下有益效果：
本发明通过利用针对白念珠菌重组Eno的单抗和多抗建立双抗体夹心ELISA法，可以识别白念珠菌增殖过程中产生的天然Eno抗原，通过对性能指标的评价，该方法的特异性、精密度均能满足临床应用的要求，检测灵敏度较高，且本发明具有白念珠菌特异性，有望用于特异诊断白念珠菌引发的IC，为临床正确选择抗真菌药物提供有力依据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度分别为2.1-16.8ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
实施例一
白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度为2.1ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
实施例二
白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度为4.2ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
实施例三
白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度为8.4ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
实施例四
白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度为16.8ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1 000。
Figure BDA0003131311970000121
综上所述，混合液中Eno的A值随抗体浓度增加,测得的Eno的A值不断下降，当加入的羊抗Eno抗体为8.4ug/mL时,A值为0.277,阻断率为91.09％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：准备足量的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母；
步骤二：准备主要实验仪器和真菌培养上清液；
步骤三：采用血细胞计数板计算混合液的浓度；
步骤四：取5×106个孢子加入10ml的含有20％小牛血清的培养液中，以37℃、200r/min进行震荡培养，并每隔12-24小时取出培养液0.5ml，8000个/g、4℃离心5min，分离上清液后，将上清液置于零下20℃进行保存；
步骤五：采用改良过碘酸钠法对HRP标价羊抗Eno；
步骤六：采用上述步骤五中标记的羊抗Eno作为检测抗体，选择最佳的反应条件，Eno单抗用0.05mol/L碳酸盐缓冲液进行稀释，每孔100uL包被微孔板，4℃，过夜后次日用0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min；每孔加入封闭液含5.0g/L脱脂奶粉的0.01mol/L，200uL，37℃温育2h；用PBST洗板5次，每次3min；微孔板放置于4℃进行保存，检测时每孔加入待测样本100uL，37℃温育1h，0.01mol/L PBST洗板5次，每次3min，加入HRP标记羊抗Eno抗体100uL，37℃温育1h，0.01mol/LPBST洗板5次，每次3min，加入底物液TMB-H，O，100uL，37℃温育15min，加入1mol/LH，SO，50uL终止反应，于酶联仪上用测试波长450nm、参比波长630nm读取吸光度值；
步骤七：将羊抗Eno抗体加入50ng/mL的重组Eno抗原溶液，使羊抗Eno终浓度分别为2.1-16.8ug/mL，置37℃温育1h后，检测混合液中Eno的A值。
2.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤一中，白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均为微生物科室临床分离的菌株，且经过细菌检定仪进行鉴定。
3.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤二中，将白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母从零下80℃中取出后，放置在培养基上28℃培养1-2天后获得单个菌落，将单个菌落混合于无菌生理盐水中进行混合。
4.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤四中，白念珠菌除了37℃、200r/min进行震荡培养外，还需要同时置于25℃、200r/min进行震荡培养。
5.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤六中，采用方阵滴定法选择最佳的反应条件，即选定抗Eno单抗浓度为2.1ug/mL，HRP标记羊抗Eno抗体浓度为1：1000。
6.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤六中，对上清液进行检测时，每份培养上清液检测两次。
7.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤六中，读取吸光度值后，标准品稀释液和空白对照为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。
8.根据权利要求7所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述标准品为纯化的白色念珠菌Eno重组蛋白，浓度分别设置为：50.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0ng/ml(空白对照)。
9.根据权利要求8所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述Eno重组蛋白经过BCA法测定的浓度为1.394mg/ml。
10.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤六中，方阵滴定法选定单克隆抗体浓度为2.1ug/ml,HRP标记Eno多抗稀释度为1：1000。
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