CN106596958A - 布鲁氏菌病cf‑elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

布鲁氏菌病cf‑elisa抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种布鲁氏菌病补体结合酶联免疫吸附试验(CF‑ELISA)诊断试剂盒，本试剂盒将补体结合试验(CFT)中的反应系统与酶联免疫吸附试验(ELISA)中的酶标记放大系统相结合。本试剂盒较传统补体结合试验诊断试剂而言，具有敏感性高、使用简便、快速、高通量，标准化程度高的特点，而较传统ELISA诊断试剂盒而言，具有特异性高、可检测各种布病特异性抗体的特点，是一种较为理想的新型布病诊断工具。本试剂盒主要组份：脂多糖LPS抗原包被板、强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、豚鼠补体、酶标记豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4、底物显色液、终止液、洗涤液。

Description

布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测用生物制品领域，具体是涉及布鲁氏菌病补体结合试-酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)抗体检测试剂盒，是一种新型布鲁氏菌病诊断制品。
背景技术
布鲁氏菌病(布病Brucellosis)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病。布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着布病诊断技术不断发展，布病血清学的检测方法不断改进和提高。平板凝集试验(PT)、试管凝集试验(SAT)等传统的诊断技术，逐渐被敏感性高、特异性强的虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)、荧光偏振试验(FPA)等新检测技术所取代。当前，国际贸易指定的牛、羊、猪布病血清学检测方法有RBPT、CFT、iELISA、cELISA、FPA。
在布病血清学检测技术中，CFT被一致认为在特异性上优于其他方法，常被用来对虎红平板凝集试验等初筛试验检测为阳性或可疑的样品进行确诊。有研究报道称，补体结合试验的高特异性处决于其抗原抗体反应具有高特异性时，才能使得反应抗体暴露补体结合位点，引发补体结合，而凝集类试验、ELISA等在抗原抗体结合位点部分类似情况下，也可能出现结合而导致假阳性的发生。但传统布病补体结合试验中，需使用新鲜采集的绵羊红细胞，补体需在检测当天进行严格定量，因而，绵羊红细胞与补体等试剂的定量准确性对结果影响很大，而这些试剂的需在检测现场定量，对试剂的标准化产生很大影响。再加上敏感性不太高，操作繁琐，难以在临床上普遍使用。
ELISA是一种操作方便，灵敏度高，特异性也较好的布病诊断技术，并且具有高通量检测的特点。目前，用于布病检测有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种ELISA技术。其中iELISA可以作为动物群体检测的筛选试验使用，cELISA可以作为动物个体检测的确诊试验使用。牛的布病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种动物布病的ELISA检测方法也是研究的热点。但ELISA检测方法中，使用的酶标记二抗只检测IgG类布病抗体，对IgM等类型的布病抗体存在漏检。
CF-ELISA是一种在ELISA板孔中以酶显色技术显示抗原抗体特异性反应结果的补体结合类试验，CF-ELISA即具有CFT的高特异性优点，又具有ELISA高敏感性的优点，与传统补体结合试验相比，灵敏度高，操作方便，具有高通量检测的特点。
本发明采用补体结合试验原理，结合以酶标记放大技术，提供了一种新型的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。本发明用纯化的布鲁氏菌LPS作为ELISA板的包被抗原，用以捕捉血清中布鲁氏菌病抗体，再通过加入豚鼠补体构成一种抗原、抗体与补体3者相互反应结合的补体结合反应系统，通过HRP标记的豚鼠补体C1q-B 60G4单抗及酶显色底物等作为补体结合反应的指示系统，建立了一种基于补体结合类反应的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供用于一种新型的基于补体结合试验原理的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。
本发明试剂盒包含布脂多糖LPS抗原包被板、豚鼠补体、酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4，所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4是由豚鼠补体C1q-b单抗60G4细胞株制备的，所述60G4细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11186。
所述抗原包被板的抗原是由布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖LPS，所述布鲁氏菌S2菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。
所述酶标记的补体C1q-B单克隆抗体60G4中的酶为辣根过氧化物酶HRP。
所述试剂盒还包括强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、底物显色液、终止液、洗涤液。
所述底物显色液为双组份TMB，所述终止液为稀硫酸，所述洗涤液为20倍浓缩的PBS-Tween洗涤液。
所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4的腹水效价≥1:200，OD450nm值≥2.00。
所述补体效价为1:16倍稀释，OD450nm值≥1.00。
所述强阳性对照血清浓度为50IU/ml，所述弱阳性对照血清浓度为25IU/ml。
所述抗原包被板的包被方法为：
布鲁氏菌S2株LPS抗原用0.05mo1/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗涤酶标板4次。弃去洗涤液，用3％BSA或其它ELISA用封闭剂200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封；
本发明公开了该试剂盒使用方法：在抗原包被板上加入被检测的动物血清样品和对照血清，再加入豚鼠补体进行补体结合反应，然后加入酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体，再加入底物显色液进行显色，加入终止液后测定OD值。
本发明的优点
1、本发明采用补体结合试验原理，结合以酶标记放大技术，建立了一种新型的布鲁氏菌病抗体检测技术试剂盒，使得本发明既具有补体结合试验的高特异性，又具有ELISA技术的高敏感性。
较之传统布病补体结合试验诊断试剂盒而言，除保留了高特异性的特点外，大大提高了检测敏感性，并且使用更简便、可实现高通量检测、试剂易于标准化。较布病ELISA诊断试剂盒而言，除保留了高敏感性的特点外，还可检测IgG、IgM等各种类型的布病特异性抗体，提高了检测特异性及敏感性。因此，布病CF-ELISA诊断试剂盒是一种较为理想的新型布病诊断工具，是目前动物布病检测中特异性和敏感性均较为理想的检测试剂盒。对提高布病检测技术水平具有重要作用。
2、本发明的布病CF-ELISA诊断试剂盒可检测所有类型的布病抗体。本发明采用我国独有的、对猪、牛、羊均具有良好的抗原性猪种布鲁氏菌S2株提取脂多糖(LPS)作为包被抗原，使得该试剂盒能同时对猪、牛、羊布病进行高通量检测，相对于现有技术抗原采用牛种布鲁氏菌A99株只能对应检测一种动物而言，使用更方便，也更适合我国布病防控的实际需求。
3、本试剂盒所用的补体为豚鼠血清，该试剂已商品化，但与传统补体结合试验中补体使用不同的是，在本试剂盒中的补体只需过量使用即可，降低了进行定量标化的难度，有利于试剂盒的标准化。
具体实施方式
本发明中用于ELISA板的包被抗原，是从本单位研究培育的布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖(LPS)，该菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。
本发明中用于指示系统的豚鼠补体C1q-B 60G4单抗，是本单位研制的一种对豚鼠补体C1q-B具有良好亲和性的单克隆抗体，由豚鼠补体C1q-B单抗60G4细胞株制备，该细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11186。
本发明研制了布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒质控用强阳性标准血清、弱阳性标准血清、阴性标准血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清。
本发明的试剂盒中其它试剂是业已商品化的试剂。
实施例1、试剂盒的主要组份制备及组装
1.试剂盒主要组份制备
本试剂盒主要组份：抗原包被板、强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、豚鼠补体、HRP标记豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4、底物显色液、终止液、20倍浓缩PBS-Tween洗涤液。
1.1包被用LPS抗原制备
将布鲁氏菌S2菌株接种于胰眎琼脂或其它布鲁氏菌适宜生长的固体培养基上，36～38℃培养48～72小时，进行纯粹检验，并用0.5％苯酚的生理盐水洗脱培养物，此为布鲁氏菌菌液，将菌液80℃灭活2小时以上，再进行灭活检验。将灭活检验合格的菌液以10000g离心20min，收集沉淀。
取湿菌体称重，1份湿菌体以3.4份双蒸水悬浮，加热至66℃，再加入3.8份66℃的90％(V/V)苯酚溶液，连续搅拌混合15分钟，10,000g 4℃离心15分钟，以细长吸管(或长针头)吸取位于底层的酚相，如有必要，用定性滤纸(如Whatman公司No.1滤纸)过滤，除去细胞壁碎片至溶液清亮。
加入3倍体积量的预冷至-15℃含1％饱和醋酸钠的甲醇，4℃静置2小时沉淀LPS后，10,000g离心10分钟弃上清，以原酚相体积的1/2加入双蒸水悬浮沉淀物，搅拌18小时，10,000g离心10分钟，收集上清液，4℃存放。
在上述粗提的LPS中加入三氯乙酸，使其终浓度为5％(M/V)。搅拌15分钟，10,000g离心15分钟，取上清液用双蒸水透析4次(透析用双蒸水不少于4000ml)，每次3小时。透析后的LPS加入15μg/ml的蛋白酶K，55℃消化3小时后，室温消化24小时，再用去离子水透析5次，每次3小时。
在冰浴中约6瓦特超声3次，每次1分钟。121℃20分钟高压灭菌，既可得到纯化的布鲁氏菌S2LPS抗原。
1:10稀释的LPS用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，应无蛋白条带。
用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将LPS作1:100稀释后，再连续倍数稀释6次以上，包被ELISA板，对布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清进行CF-ELISA试验(方法见附注1)，OD450nm值≥2.00的LPS最高稀释度即为LPS效价，效价应不低于1:1600。
将提纯LPS分装安瓶，分装重量误差率不得超过装量的上下5％。冻干。室温或低温保存，保存期为3年。
【规格】0.50ml/瓶，1.00ml/瓶。
抗原质量标准
【性状】白色粉末或团块，加稀释液后60秒内溶解。
【装量测定】取5支冻干LPS分别称重，计算平均重量，与标示量误差不得超过±5％。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【纯度检验】1:10稀释LPS用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，应无蛋白条带。与布鲁氏菌病强阳性标准血清作琼脂扩散试验，应出现明显的单一沉淀线。
【效价检验】对布鲁氏菌病强阳性标准血清测定效价应不低于标示效价。
【特异性检验】对布鲁氏菌病阴性标准血清应为阴性反应。
1.2CF-ELISA板的包被
纯化的布鲁氏菌S2LPS抗原用0.05mo1/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6，含0.02％的proclin 300)适当稀释(1～5μg/ml)，加入到酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBST：0.05％Tween-20溶于PBS中)洗涤酶标板4次。弃去洗涤液，用3％BSA溶于pH 7.4PBS或其它ELISA用封闭剂200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封。2～8℃保存。
抗原包被板的检验包装封闭良好，孔底清洁透明，无异物。
1.3标准血清与对照血清的制备及质量控制
取布鲁氏菌自然感染或免疫接种动物血清，无菌过滤后以布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品作为抗原，以布鲁氏菌病阳性血清国家标准品作为对照，用试管凝集试验测定效价，效价不低于500IU即可作为布鲁氏菌病CF-ELISA所用的标准血清或对照血清原料。
1.3.1强阳性标准血清及质量控制
将CF-ELISA标准血清的原料按布鲁氏菌病试管凝集试验测定效价，用布鲁氏病菌阴性牛血清稀释至50IU/ml，为CF-ELISA强阳性标准血清，再分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清，再加入5％苯酚生理盐水2400μl稀释。取稀释的强阳性标准血清50μl与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品(5％苯酚生理盐水先做20倍稀释)50μl作微量(总量100μl)凝集试验，并且以稀释至2IU/ml的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品作为参照，都应出现50％凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，OD450nm值应在1.00～1.50范围内。同时，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清OD450nm值的比值(强阳性标准血清OD450nm值/弱阳性标准血清OD450nm值)在2.50～5.00范围内，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清OD450nm值的比值(强阳性标准血清OD450nm值/阴性标准血清OD450nm值)在5.00以上。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.3.2弱阳性标准血清及质量控制
将CF-ELISA标准血清的原料按布鲁氏菌病试管凝集试验测定效价，用布鲁氏病菌阴性牛血清稀释至25IU/ml，为CF-ELISA弱阳性标准血清，再分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清，再加入5％苯酚生理盐水1150μl稀释。取稀释的弱阳性标准血清50μl与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品(5％苯酚生理盐水先做20倍稀释)50μl作微量(总量100μl)凝集试验，并且以稀释至2IU/ml的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品作为参照，都应出现50％凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，OD450nm值应在0.30～0.60范围内。同时，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清OD450nm值的比值(强阳性标准血清OD450nm值/弱阳性标准血清OD450nm值)在2.50～5.00范围内，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清OD450nm值的比值(弱阳性标准血清OD450nm值/阴性标准血清OD450nm值)在2.00以上。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.3.3强阳性对照血清制备及质量控制
将CF-ELISA对照血清的原料按布鲁氏菌病试管凝集试验测定效价，用布鲁氏病菌阴性牛血清稀释至50IU/ml，为CF-ELISA强阳性对照血清，再分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性对照血清，再加入5％苯酚生理盐水2400μl稀释。取稀释的强阳性对照血清50μl与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品(5％苯酚生理盐水先做20倍稀释)50μl作微量(总量100μl)凝集试验，并且以稀释至2IU/ml的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品作为参照，都应出现50％凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性对照血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，同时以布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清作参照，OD450nm值均应在1.00～1.50范围内。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.3.4弱阳性对照血清及质量控制
将CF-ELISA对照血清的原料按布鲁氏菌病试管凝集试验测定效价，用布鲁氏病菌阴性牛血清稀释至25IU/ml，为CF-ELISA弱阳性对照血清，再分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性对照血清，再加入5％苯酚生理盐水1150μl稀释。取稀释的弱阳性对照血清50μl与5％苯酚生理盐水稀释20倍的布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品50μl作微量(总量100μl)凝集试验，并且以稀释至2IU/ml的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品作为参照，都应出现50％凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性对照血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，同时以布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清作参照，OD450nm值均应在0.30～0.60范围内。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.3.5阴性标准血清制备及质量控制
取健康牛或羊血清，用布鲁氏菌病虎红平板凝集试验、试管凝集试验和CF-ELISA测定效价，均应为阴性反应。分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清，再加入5％苯酚生理盐水900μl稀释。取阴性标准血清50μl与50μl 5％苯酚生理盐水稀释20倍的布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品作微量(总量100μl)凝集试验，不应出现凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，OD450nm值应在0.30以下。同时，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性标准血清OD450nm值的比值(强阳性标准血清OD450nm值/弱阳性标准血清OD450nm值)在5.00以上，对20倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清OD450nm值的比值(弱阳性标准血清OD450nm值/阴性标准血清OD450nm值)在2.00以上。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.3.6阴性对照血清制备及质量控制
取健康牛或羊血清，用布鲁氏菌病虎红平板凝集试验、试管凝集试验和CF-ELISA测定效价，均应为阴性反应。分装成100μl/支，冻干。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用100μl灭菌蒸馏水溶解冻干的布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清，再加入5％苯酚生理盐水900μl稀释。取阴性对照血清50μl与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原参考品(5％苯酚生理盐水先做20倍稀释)50μl作微量(总量100μl)凝集试验，不应出现凝集。
用2000μl布鲁氏菌病CF-ELISA样品稀释液溶解冻干布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清，进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，同时以布鲁氏菌病CF-ELISA阴性标准血清作参照，OD450nm值均应在0.30以下。
【规格】100μl/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.4.豚鼠补体制备及质量标准
豚鼠补体制备
取新鲜豚鼠血清冻干，即为补体，CF-ELISA中用2倍以上的补体效价。
质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用1000μl灭菌蒸馏水溶解冻干补体，再以CF-ELISA稀释液倍数稀释至1:64。对布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，OD450nm值在0.30～0.60范围内的最大补体稀释倍数即为补体效价。补体效价应不低于1:16。
【规格】1.0ml/瓶
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期120个月。
1.5.HRP标记豚鼠补体C1q-B 60G4单抗制备及质量标准
(1)HRP标记豚鼠补体C1q-B 60G4单抗制备
复苏液氮保存豚鼠补体C1q-B单抗60G4细胞株(2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为(CGMCC N0.11186))。在完全1640培养基中培养48～72h后，按1:4传代，将杂交瘤细胞扩大培养后收获细胞。计数(方法见附注2)，腹腔接种8～10周龄雌性BALB/c鼠，接种剂量为1×106杂交瘤细胞/只。约10d后用CF-ELISA检测(方法见附注1)，当腹水的OD450nm≥2.00时的腹水最大稀释倍数为其效价。效价应≥1:200时，即可用2.5mL注射器吸取小鼠腹腔内的腹水，每只小鼠可以收集几次，每次3～10mL不等，收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.02％～0.05％的ProClin300抑菌，再12000g离心2次，以除去细胞碎片和脂类，再除菌过滤。
除菌过滤的腹水，加入浓度为0.2mol/L NaCl和25mmol/L的CaCl2。滤纸过滤，加入100倍体积灭菌纯水置于4℃对滤液进行透析8～15h，换水1～2次。然后将滤液以22000g离心30min，弃上清；将沉淀溶于含有1mol/L NaCl的0.1moL/L Tris-HCl溶液中(pH8.0)，重复上述的透析与离心1次；将沉淀的蛋白浓度调至5～10mg/mL。对纯化的单抗进行SDS-PAGE应无杂带，考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度，应≥95％。
(2)HRP标记
称取5mg辣根过氧化物酶HRP溶解于1ml蒸馏水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加保护剂分装后冷藏保存。
(3)单抗质量标准
【性状】疏松团块或粉末，加稀释液后3分钟内溶解。
【无菌检验】按中华人民共和国兽药典附录19页检验，应无菌生长。
【效价检验】用1000μl灭菌蒸馏水溶解冻干补体，再以CF-ELISA稀释液倍数稀释至1:2000。对布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性标准血清进行布鲁氏菌病CF-ELISA测定(方法见附注1)，OD450nm值在0.30～0.60范围内的最大HRP标记豚鼠补体C1q-B 60G4单抗稀释倍数即为效价，效价不低于1:1000为合格。
【规格】0.1ml/瓶，
【贮藏与有效期】8℃以下保存有效期12个月。
1.6其他组份
底物显色液：双组份TMB
终止液：稀硫酸，浓度为2mol/L。
洗涤液：20倍浓缩的PBS-Tween洗涤液。
2、将试剂盒组装
将上述组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架。将封板膜、冷冻干燥的单抗和说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。
将检验合格的各试剂盒组份按下表1组装成试剂盒：
表1.试剂盒组份
(1)抗原包被板 1块；2块；5块(96孔/块)
(2)强阳性对照血清 1管；2管；5管(100μL/管)
(3)弱阳性对照血清 1管；2管；5管(100μL/管)
(4)阴性对照血清 1管；2管；5管(100μL/管)
(5)豚鼠补体 1管；2管；5管(1mL/瓶)
(6)HRP标记豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4 1管；2管；5管(1mL/瓶)
(7)底物显色液 1管；2管；5管(20mL/瓶)
(8)终止液 1管；2管；5管(20mL/瓶)
(9)PBS-Tween洗涤液(20倍浓缩) 1管；2管；5管(100mL/瓶)
(10)封板膜 3张；5张；12张
(11)说明书 1份
3、试剂盒使用方法
(1)取抗原包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次；
(2)用样品稀释液将待检血清样品1:20稀释后加入板孔中，每孔100μl。将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1:100稀释后各加两孔，每孔100μl。另设空白对照各两孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(3)用样品稀释液将豚鼠补体1:10稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(4)用样品稀释液将豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4做1:1000稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(5)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min；
(6)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD450nm值。
(7)结果判定
试验成立条件为阴性对照血清的OD450nm值＜0.20，强阳性对照血清的OD450nm值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD450nm值应在0.4～0.80之间。
样本(S)/阴性血清(N)≥2.1为阳性，＜2.1为阴性。
实施例2、试剂盒敏感性试验
1、灵敏度比较试验
倍数稀释的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品用于CF-ELISA试验的灵敏度检测，并且与iELISA、补体结合试验(CFT)和试管凝集试验(SAT)比较。结果见表2：
表2.灵敏度比较试验
结果表明，CF-ELISA试验的敏感性与iELISA基本一致，根据试验结果显示，两者灵敏度至少可达到检测0.05IU血清抗体(cutt off＝阳性血清/阴性血清＝S/N≥2.1)，是CFT(可检测到每毫升血清含50IU)和SAT(标准方法检测到每毫升血清含50IU为阳性)的100倍。
2、对布鲁氏菌病阳性血清敏感性比较试验
确诊布鲁氏菌病感染群349份牛、羊血清用于CF-ELISA试验的敏感性检测，并且与iELISA和CFT、SAT、虎红平板凝集试验(RBPT)比较。结果见表3：
表3.确诊布病感染群349份牛、羊血清敏感性比较试验
将349份布鲁氏菌阳性血清50倍稀释后，分别对实验室试制的布鲁氏菌抗体CF-ELISA检测试剂盒进行敏感性试验，并与iELISA、CFT、SAT、RBPT比较，结果显示本发明所制备的CF-ELISA试剂盒对布病感染群牛羊血清有良好的检出率。
综合灵敏度试验和对阳性群的血清样品敏感性试验结果表明，本发明所制备的CF-ELISA试剂盒具有良好的敏感性，敏感性与iELISA试剂盒相当，高于CFT、SAT、RBPT。
实施例3、试剂盒特异性试验
190份确诊的无布鲁氏菌感染群的牛、羊血清用于CF-ELISA试验的特异性试验，并且与iELISA和CFT、SAT、RBPT比较。结果下表4：
表4.特异性比较试验
将190份布鲁氏菌阳性血清50倍稀释后，分别对实验室试制的布鲁氏菌抗体CF-ELISA检测试剂盒进行特异性试验，并与iELISA、CFT、SAT、RBPT比较，结果显示本发明所制备的CF-ELISA试剂盒对感染布病畜群的牛羊血清有良好的特异性。
附注
1.CF-ELISA方法
1.1.抗原包被：将纯化的LPS抗原用0.05M的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/mL，按100μL/孔包被96孔酶标板(Corning，2592)，2℃～8℃作用18h以上。按100μL/孔加入5％明胶(Sigma)37℃封闭2h，再2℃～8℃作用18h以上，弃去包被液，加包装封闭板后2℃～8℃冷藏备用。
1.2.加入200μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。取适当稀释的被检样品50μL加入抗原包被板孔中，并将CF-ELISA强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清和稀释液(空白对照)在抗原包被板孔中各加2孔，每孔50μL。再向每孔加入适当稀释豚鼠补体50μL。室温作用45min。
1.3.弃去液体，加入200μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。每孔加适当稀释单抗100μL。室温孵育45min。
1.4.弃去液体，加入200μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。每孔加适当稀释HRP标记抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL。室温孵育45min。
1.5.弃去液体，加入200μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。加底物显色液，每孔50μL，室温避光反应5～10min。
1.6.读取OD450nm值并判定结果。当强阳性对照血清OD450nm平均值≥1.0，阴性对照血清与空白对照OD450nm平均值≤0.2，弱阳性对照血清OD450nm平均值低于于强阳性对照血清OD450nm平均值，并且弱阳性对照血清孔OD450nm平均值/阴性对照血清孔OD450nm平均值≥2.1时，结果成立。结果判定的标准为：P/N值(被检样品孔平均OD值/阴性对照血清孔平均OD值)≥2.1为阳性，＜2.1为阴性。
2.细胞计数
将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3min。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000。
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

Claims (10)

1.一种布鲁氏菌病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含布脂多糖LPS抗原包被板、豚鼠补体、酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4，所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4是由豚鼠补体C1q-b单抗60G4细胞株制备的，所述60G4细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11186。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原包被板的抗原是由布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖LPS，所述布鲁氏菌S2菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。
3.根据权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的补体C1q-B单克隆抗体60G4中的酶为辣根过氧化物酶HRP。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、底物显色液、终止液、洗涤液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为双组份TMB，所述终止液为稀硫酸，所述洗涤液为20倍浓缩的PBS-Tween洗涤液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4腹水效价≥1:200，OD450nm值≥2.00。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述豚鼠补体效价为1:15倍稀释，OD450nm值≥1.00。
8.根据权利要求4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述强阳性对照血清浓度为50IU/ml，所述弱阳性对照血清浓度为25IU/ml。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原包被板的包被方法为：
布鲁氏菌S2株LPS抗原用0.05mo1/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗涤酶标板4次。弃去洗涤液，用3％BSA或其它ELISA用封闭剂200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，在抗原包被板上加入被检测的动物血清样品和对照血清，再加入豚鼠补体进行补体结合反应，然后加入酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体，再加入底物显色液进行显色，加入终止液后测定OD值。
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