CN102207500A - 补体结合酶联免疫吸附试验 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种补体结合酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)。本发明通过利用酶标记抗豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂作为指示系统，来显示是否存在有补体参与的抗原抗体特异性反应。本发明的技术方法是以抗原或抗体包被ELISA板、加入待检测样品、加入豚鼠补体、加入酶标记抗豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂，通过显色判定是否存在抗原抗体特异性结合。与现行补体结合(CF)试验技术相比，CF-ELISA技术在保持了CF试验高特异的同时，方便了使用操作，便于技术的标准化，提高了试验点敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于补体结合的抗原抗体免疫学检测方法，属免疫学技术领域。
技术背景
任何抗原抗体复合物具有激活、固定补体的特性，以此建立的补体参与的免疫学检测技术，具有高度的特异性。而酶标记的显色系统可用于揭示抗原抗体反应，具有极高的灵敏度，已广泛应用于特异性免疫学检测。基于补体参与的补体结合(complementary fixation，CF)试验和以酶标记显色系统作为指示系统的酶联免疫吸附试验(ELISA)技术已广泛应用与抗原抗体特异性反应的免疫学检测。
CF试验是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统的抗原与抗体特异性反应的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。
该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原)；②补体系统；③指示系统，即绵羊红血球与相应抗血清(溶血素)，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原)，则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在待检的抗体(或抗原)，则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
CF试验是一种补体参与的传统免疫学技术，人和动物许多疫病的诊断采用此方法。CF试验主要应用在以下几方面：①传染病诊断。包括病原性抗原及相应抗体的检测。②其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等。③自身抗体检测。
CF试验方法的主要优点有：①特异性强。出现交叉反应的机率较小。②应用面广。可用于检测多种类型的抗原或抗体。
CF试验方法的主要缺点是技术操作繁锁、难以标准化和灵敏度不高。
ELISA也已是一种广泛使用的免疫学技术。该技术是用酶标记物参与抗原或抗体的特异性免疫反应，以酶底物显色，通过显色程度来揭示抗原抗体特异性反应的程度。
ELISA广泛用于检测一切抗原、抗体及半抗原。已成为免疫检测中的主要技术之一。
ELISA的主要优点有：①具有高灵敏度和良好特异性。②操作简便，可实现高通量检测，试剂易于标准化。③应用面广。可用于检测多种类型的抗原或抗体。
补体结合试验与ELISA的主要不同在于：补体结合试验有补体参与，抗原抗体的特异性反应程度通过有否剩余补体参与溶血系统反应导致红血球溶血而体现；ELISA无补体参与，指示系统是酶显色系统，而不是溶血系统。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明是建立一种基于补体结合的检测抗原抗体特异性反应的免疫学试验技术——补体结合酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)技术。
本发明通过利用酶标记抗补体单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂作为指示系统，来显示是否存在有补体参与的抗原抗体特异性反应，可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
本技术发明利用了CF试验和ELISA的优点，达到建立一种高特异、高敏感、便于标准化和使用方便的新型免疫学检测技术的目的。
2.解决其技术问题采用的技术方案
包被抗原或抗体制备，及用抗原或抗体包被酶联反应板；阴性和阳性血清标准品的制备；
补体和酶标补体抗体的制备；试剂的配制(包括样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗涤液)。
本发明详细描述
1.试验所需组分及其制备
(1)CF-ELISA板的包被
本发明试验中所涉及的抗原和抗体有布鲁氏菌、炭疽杆菌、鼻疽杆菌、钩端螺旋体、牛结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌、耶尔辛氏菌O:9等病原微生物及其感染动物的血清。由以上病原菌按常规方法制备的包被用抗原，以上的感染动物血清为包被用抗体。
抗原或抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6，含0.01％的硫柳汞)适当稀释(1～10μlg/ml)，加入到酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBST：0.05％Tween-20溶于PBS中)洗涤酶标板4次。弃去洗涤液，用3％鱼皮明胶(G7041，Sigma，溶于pH 7.4PBS，含0.01％的硫柳汞)或其它ELISA用封闭剂200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封。2～8℃保存。
(2)对照品制备
阴性对照血清按常规法由健康牛血清制成，用作阴性对照。
阳性对照血清采用现有技术用抗原免疫家兔、羊、猪或牛等动物获得的血清，或采集自发病动物的血清，经过标定制成。用作阳性对照(参见《兽医生物制品规程》二000年版)。
(3)豚鼠补体制备
选取健康豚鼠采血，提取血清或将血清冻干制成。
(4)酶标豚鼠补体C3、C1抗体制备
采用菊糖激活吸附豚鼠补体C3，获得菊糖-豚鼠补体C3聚合物。采用不同浓度EDTA溶液透析、离心豚鼠血清，获得豚鼠补体C1。(参见马雪云“抗鸡补体C3抗体的制备及其应用”中国兽医学报2007年5月第27卷第3期359～362和第三军医大学学报1984年第6卷第4期345～350)
经免疫兔或羊等动物，制备豚鼠补体C3、C1多克隆抗体。或用豚鼠C3、C1作为抗原免疫BALB/c小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合建立豚鼠C3、C1单克隆抗体细胞系。
以辣根过氧化物酶(HRP)标记获得酶标豚鼠补体C3、C1多克隆或单克隆抗体。
(5)样品稀释液、底物液、终止液、20倍浓缩洗涤液配制
1)样品稀释液 在pH 7.4PBS中加入最终浓度为0.1％鱼皮明胶、0.05％Tween-20和0.01％硫柳汞。
2)底物 底物液A的制备 Na2HPO4 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加纯化水定容至1000ml，调至pH值5.0～5.4，无菌分装。
底物液B的制备 TMB 20mg，无水乙醇10ml，加纯化水定容至1000ml。无菌分装。
3)终止液 终止液的制备 0.25％氢氟酸(HF)溶液或2M H2SO4制成。无菌分装。
4)20倍浓缩洗涤液 20倍浓缩洗涤液的制备 NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4·12H2O 58g、KH2PO4 4g，Tween-20 10ml加纯化水定容至1000ml，无菌分装。
(6)CF-ELISA试剂盒组装
本发明针对不同疫病需要，可以用相应的致病病原和抗体包被反应板，与相应的阴性和阳性血清、补体、HRP标记兔或羊等抗豚鼠C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及试剂组装成检测试剂盒。
表1试剂盒组份
CF-ELISA抗原包被板/CF-ELISA抗体包被板
CF-ELISA阴性对照血清
CF-ELISA阳性对照血清
豚鼠补体
HRP标记抗豚鼠C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体
样品稀释液
底物液A
底物液B
终止液
20倍浓缩洗涤液
将表1中各组分装入试剂盒内包装中，再加上外包装即组装成CF-ELISA试剂盒成品。
2.试验操作方法
(1)检测抗体
1)取抗原包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次；
2)用样品稀释液将待检血清样品1∶100稀释后加入板孔中，每孔100μl。将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1∶100稀释后各加两孔，每孔100μl。另设空白对照各两孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
3)用样品稀释液将豚鼠补体待1∶10稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
4)用样品稀释液将HRP标记抗豚鼠C3、C1抗体1∶100稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
5)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min；
6)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD450或630。
(2)检测抗原
1)取抗体包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次；
2)用样品稀释液将待检抗原样品(样品应经过适当处理，以使得被检抗原释放至溶液中)适当稀释后加入板孔中，每孔100μl。将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1∶100稀释后各加两孔，每孔100μl。另设空白对照各两孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
3)用样品稀释液将豚鼠补体待1∶10稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
4)用样品稀释液将HRP标记抗豚鼠C3、C1抗体1∶100稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
5)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min；
6)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD450值。
(3)结果判定
试验成立条件为阴性对照血清的OD450值＜0.30，强阳性对照血清的OD450值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD450值应在0.3～0.60之间。
样本(S)/C.O≥1为阳性，＜1为阴性。
C.O＝0.8×弱阳性血清OD450平均值+阴性血清OD450平均值
(参见：王蕾，许静，高锋测定乙型肝炎病毒表面抗原S/C.O值的临床应用评价上海医学检验杂志2003年第18卷第5期；岳希全，石宏，李迎ELISA法检测HBsAg影响结果的重要因素的分析中国实验诊断学2007年第11卷第02期)。
本发明的有益效果
本发明涉及一种补体结合酶联免疫吸附试验。本发明通过利用酶标记抗豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂作为指示系统，来显示是否存在有补体参与的抗原抗体特异性反应。本发明的技术方法是以抗原或抗体包被ELISA板、加入待检测样品、加入豚鼠补体、加入酶标记抗豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂，通过显色判定是否存在抗原抗体特异性结合。与现行CF试验技术相比，CF-ELISA技术在保持了补体结合试验高特异的同时，方便了使用操作，便于技术的标准化，提高了试验点敏感性。
具体实施方式(以布鲁氏菌病CF-ELISA试验技术为例)：
实施例1
布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒制备
1.布鲁氏菌病CF-ELISA抗原包被板
(1)布鲁氏菌病CF-ELISA抗原制备
将布鲁氏菌纯培养物经过80℃4小时灭活后，7000r/min离心洗涤，取50g湿菌体，以170ml蒸馏水悬浮，加热至66℃，再加入190ml 66℃的90％(V/V)苯酚溶液，连续搅拌混合15min，10,000g 4℃离心15min，以细长吸管(或长针头)吸取位于底层的酚相，用定性滤纸过滤除去细胞壁碎片至溶液清亮。
加500ml冷甲醇(含饱和醋酸钠的甲醇5ml)沉淀LPS，4℃置2小时后，10,000g离心10min弃上清，以80ml蒸馏水悬浮沉淀物，搅拌18h，10,000g离心10min，收集上清液4℃存放，沉淀用80ml蒸馏水4℃搅拌2h，如前离心，收集上清液与先前收集的上清液合并。
在上述160ml粗提的LPS中加入8g三氯乙酸。搅拌10min，离心去除沉淀，半透明上清液用0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液(CBS)透析(每次4000ml，至少3遍)，在冰浴中约6瓦特超声3次，每次1min。分装安瓶(1ml/支)冻干，室温或低温保存。
每批取至少6支冻干LPS称重，确定每瓶装量。
(2)布鲁氏菌病CF-ELISA抗原包被板
冻干布鲁氏菌病CF-ELISA抗原用灭菌蒸馏水复原至1mg/ml，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6，含0.01％的硫柳汞)稀释抗原至1∶1000，加入到酶标板(Corning，2592)，每孔100μl，2～8℃包被18h以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBST：0.05％Tween-20溶于PBS中)洗涤液清洗酶标板4次。弃去清洗液，用3％鱼皮明胶(G7041，Sigma，溶于pH 7.4PBS，含0.01％的硫柳汞)200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封。2～8℃保存。
2.布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清、阳性对照血清制备
阴性对照血清由健康无布鲁氏菌病牛血清冻干制成。
选取抗体类型为IgG的布鲁氏菌病阳性牛血清，用布鲁氏菌病阳性血清国家标准品标定效价至1000IU/ml，冻干制成布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒强阳性对照血清。将效价为1000IU/ml的布鲁氏菌病阳性血清用布鲁氏菌病阴性血清100倍稀释，冻干制成布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒弱阳性对照血清。
3.豚鼠补体制备
选取健康豚鼠采血，冻干制成。
4.酶标豚鼠补体C3、C1抗体制备
本发明人采用菊糖激活吸附豚鼠补体C3、C1，获得菊糖-豚鼠补体C3、C1聚合物。经免疫兔和羊，获得了豚鼠补体C3、C1多克隆抗体。并用豚鼠C3、C1作为抗原免疫BALB/c小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合建立豚鼠C3、C1单克隆抗体细胞系。以辣根过氧化物酶(HRP)标记获得酶标豚鼠补体C3、C1多克隆和单克隆抗体。
具体操作方法如下：
(1)豚鼠补体C3、C1提纯
菊糖经过充分洗涤，以补体结合试验确定菊糖与豚鼠血清混合比例后，与适量豚鼠补体混合，37℃作用1小时，离心去除杂蛋白，沉淀为制备好的菊糖-豚鼠补体C3、C1聚合物。
(2)制备豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体。
1)制备豚鼠补体C3、C1多克隆抗体。
用提纯豚鼠补体C3、C1多次免疫兔或羊等动物，用琼扩试验或ELISA试验检测特异性抗体，当琼扩试验抗体效价达到1∶4以上，即可采血分离血清，冷藏备用。或经冷冻干燥，制备成可长期保存的豚鼠补体C3、C1多克隆抗体。
2)制备豚鼠补体C3b单克隆抗体
用提纯的豚鼠C3、C1作为抗原免疫BALB/c小鼠，以豚鼠C3、C1包被酶标反应板，检测BALB/c小鼠血清C3、C1抗体，筛选抗C3、C1阳性BALB/c小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合并用HAT培养基作选择性培养，通过检测杂交瘤上清中分泌C3、C1单抗情况，筛选阳性杂交瘤细胞，经扩增和多次亚克隆，直至所有单个细胞形式的克隆培养上清均呈C3、C1抗体阳性，确定为单克隆抗体细胞系建立。
培养单克隆抗体细胞系，或用单克隆抗体细胞系接种大鼠腹腔，取细胞培养液或腹水制备豚鼠补体C3、C1单克隆抗体。当琼扩试验抗体效价达到1∶8以上，即可收集单抗液，冷藏备用。或经冷冻干燥，制备成可长期保存的豚鼠补体C3、C1单克隆抗体。
3)酶标记豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体
以HRP标记豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体。
5.样品稀释液、底物液、终止液、20倍浓缩洗涤液配制
(1)样品稀释液
在pH 7.4PBS中加入最终浓度为0.1％鱼皮明胶、0.05％Tween-20和0.01％硫柳汞。
(2)底物
底物液A的制备 Na2HPO4 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加纯化水定容至1000ml，调至pH值5.0～5.4，无菌分装。
底物液B的制备 TMB 20mg，无水乙醇10ml，加纯化水定容至1000ml。无菌分装。
(3)终止液
终止液的制备 0.25％氢氟酸(HF)溶液制成。无菌分装。
(4)20倍浓缩洗涤液
20倍浓缩洗涤液的制备 NaCl 160g、KCl 4g、Na2HPO4·12H2O 58g、KH2PO4 4g，Tween-20 10ml加纯化水定容至1000ml，无菌分装。
6.布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒组装
布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒的各组分如下：
表2试剂盒组份
布鲁氏菌病CF-ELISA抗原包被板
布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清
布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性对照血清
布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性对照血清
豚鼠补体
HRP标记兔或羊抗豚鼠C3、C1多克隆抗体或多克隆抗体
样品稀释液
底物液A
底物液B
终止液
20倍浓缩洗涤液
将表1中各组分装入试剂盒内包装中，再加上外包装即组装成布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒成品。
实施例2
布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒使用
1.试验方法
(1)取抗原包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次；
(2)用样品稀释液将待检血清样品1∶100稀释后加入板孔中，每孔100μl。将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1∶100稀释后各加两孔，每孔100μl。另设空白对照各两孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(3)用样品稀释液将豚鼠补体待1∶10稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(4)用样品稀释液将HRP标记抗豚鼠C3、C1抗体1∶100稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；
(5)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min；
(6)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD450或630值。
2.结果判定
试验成立条件为阴性对照血清的OD450或630值＜0.30，强阳性对照血清的OD630值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD450或630值应在0.3～0.60之间。
样本(S)/C.O≥1为阳性，＜1为阴性。
C.O＝0.8×弱阳性血清OD450或630平均值+阴性血清OD450或630平均值
实施例3
CF-ELISA试验技术的质量控制(以布鲁氏菌病CF-ELISA试验技术为例)
1.布鲁氏菌病CF-ELISA抗原包被板效价检测
(1)取抗原包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次。
(2)用样品稀释液将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1∶100稀释后每孔加入100μl，并另设空白对照孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。
(3)用样品稀释液将HRP标记抗牛IgG抗体按商品说明书稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。
(4)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min。
(5)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD630。
当阴性对照血清的OD630值＜0.30，强阳性对照血清的OD630值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD630值应在0.3～0.60之间，为质量合格的布鲁氏菌病CF-ELISA抗原包被板。
2.布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清、阳性对照血清检测
(1)布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清检测
用布鲁氏菌病试管凝集试验检测1∶10至1∶80倍数稀释布鲁氏菌病CF-ELISA阴性对照血清，结果应为阴性反应。
(2)布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性对照血清检测
用布鲁氏菌病试管凝集试验检测1∶500倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA强阳性对照血清，结果应达到50％左右凝集反应。
(3)布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性对照血清检测
用布鲁氏菌病试管凝集试验检测1∶5倍稀释布鲁氏菌病CF-ELISA弱阳性对照血清，结果应达到50％左右凝集反应。
3.豚鼠补体检测
用布鲁氏菌病补体结合试验检测1∶20倍稀释豚鼠补体，结果在阴性对照管100％溶血同时，阳性管应接近100％抑制溶血。
4.酶标豚鼠补体C3、C1抗体检测
(1)用1∶10稀释豚鼠补体包被酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。弃洗涤液，用3％鱼皮明胶200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。200μl/孔洗涤液洗涤5次。
(2)用样品稀释液将待测酶标豚鼠补体C3b抗体样品1∶1000稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。
(3)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min。
(4)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD450或630值，应≥1.00。
实施例4
CF-ELISA试验与补体结合试验和ELISA试验的比较(以布鲁氏菌病试验技术为例)
1.敏感性比较
(1)灵敏度比较试验
倍数稀释度的布鲁氏菌病阳性血清国家标准品用于CF-ELISA试验的灵敏度检测，并且与iELISA和补体结合试验(CFT)、试管凝集试验(SAT)比较。结果见下表3：
表3灵敏度比较试验
以上结果表明，CF-ELISA试验的敏感性与iELISA一致，根据试验结果显示，两者灵敏度至少可达到检测0.05IU血清抗体(S/P阳性与阴性的临界OD值＝[(0.3-0.002)×0.4]+0.002＝0.12，对应血清IU至少可检测到每毫升含0.05IU)，是CFT(可检测到每毫升血清含10IU)的200倍和SAT(可检测到每毫升血清含1IU)的20倍以上。
(2)对布鲁氏菌病阳性血清敏感性比较试验
349份确诊的布鲁氏菌病感染群牛、羊血清用于CF-ELISA试验的敏感性检测，并且与iELISA和CFT、SAT、虎红平板凝集试验(RBPT)比较。结果见下表4：
表4敏感性比较试验
2.特异性比较试验
490份确诊的无布鲁氏菌感染牛、羊血清用于CF-ELISA试验的特异性检测，并且与iELISA和CFT、SAT、RBPT比较，结果见下表5。
表5特异性比较试验
实施例5
CF-ELISA试验炭疽杆菌包被抗原的制备
开启炭疽菌种(CVCC40202、CVCC40218、CVCC2、CVCC3、CVCC5)，移植至普通琼脂斜面，36℃～37℃培养16～18小时。洗脱扁瓶培养物，121℃高压30min，冷暗处浸泡5个月后用滤纸过滤，收集滤过液加入0.02％叠氮钠防腐，高压灭菌即为炭疽CF-ELISA试验包被抗原。
实施例6
CF-ELISA试验鼻疽杆菌包被抗原的制备
开启鼻疽菌种(CVCC67001、CVCC67002)，移植至甘油琼脂斜面，36℃～37℃培养16～18小时。洗脱扁瓶培养物，121℃高压30min，冷暗处浸泡4个月后收集上清液，加入0.02％叠氮钠防腐即为鼻疽CF-ELISA试验包被抗原。
实施例7
CF-ELISA试验钩端螺旋体包被抗原的制备
开启钩端螺旋体菌种(CVCC70091、CVCC56133、CVCC56606、CVCC56609、CVCC56607)，柯托夫培养基，28℃～32℃培养5～7天。收集培养物，加入甲醛至0.3％浓度，灭活培养物。7000rpm/min离心，收集沉淀，加入含0.3％甲醛浓度的生理盐水悬浮沉淀物，即为钩端螺旋体CF-ELISA试验包被抗原。
实施例8
CF-ELISA试验副结核分枝杆菌包被抗原的制备
开启副结核分枝杆菌菌种(CVCC320)，接种W-R液体培养基，36℃～37℃培养60天。收集培养物，用氢氧化钠调pH至7.2～7.3，121℃高压30min。用蒸馏水洗涤菌体4次，干燥后按每克加丙酮50ml浸泡21天，过滤除去丙酮。菌体按1g加蒸馏水15ml的比例悬浮，加入玻璃珠用沸水水浴震荡1小时，滤纸过滤收集滤液，煮沸蒸发至原体积的1/15，除菌过滤后加入苯酚至终浓度0.3％。即为副结核CF-ELISA试验包被抗原。
实施例9
CF-ELISA试验牛结核分枝杆菌包被抗原的制备
开启牛结核分枝杆菌菌种(CVCC68001、CVCC68002)，接种苏通合成培养基，36℃～37℃培养90天。121℃高压30min后浸泡1个月。除菌过滤，滤液加入三氯乙酸至4％，2℃～8℃沉淀24小时以上，收集沉淀并离心洗涤3次。以氢氧化钠(1mol/L)溶解沉淀物后调至pH7.4加入pH7.4磷酸缓冲液，沉淀并调整蛋白含量至3.0mg/ml。即为牛结核CF-ELISA试验包被抗原。
实施例10
CF-ELISA试验耶尔辛氏菌O:9包被抗原的制备
开启耶尔辛氏菌O:9菌种(Ye O:9 M1)，移植至胰际琼脂斜面，36～37℃培养24～48小时。洗脱扁瓶培养物，121℃高压30min，超声破碎细胞，除菌过滤后收集滤液，加入终浓度为0.02％叠氮钠防腐，即为耶尔辛氏菌O:9 CF-ELISA试验包被抗原。
实施例11
CF-ELISA试验禽结核分枝杆菌包被抗原的制备
开启禽结核分枝杆菌菌种(CVCC68201、CVCC68202、CVCC68203)，接种苏通合成培养基，36℃～37℃培养90天。121℃高压30min后浸泡1个月。除菌过滤，滤液加入三氯乙酸至4％，2℃～8℃沉淀24小时以上，收集沉淀并离心洗涤3次。以氢氧化钠(1mol/L)溶解沉淀物后调至pH7.4加入pH7.4磷酸缓冲液，沉淀并调整蛋白含量至3.0mg/ml。即为禽结核CF-ELISA试验包被抗原。
实施例12
CF-ELISA试验技术应用
除上述举例中提及的用CF-ELISA检测布鲁氏菌病抗体外，还对其它一些抗体和抗原进行了检测，以验证CF-ELISA检测抗体和抗原的普遍适用性。
1.用CF-ELISA检测抗体
以上述实施例5～11的炭疽杆菌、鼻疽杆菌、钩端螺旋体、副结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、耶尔辛氏菌O:9、禽结核分枝杆菌CF-ELISA试验包被抗原作为抗原包被ELISA板，用CF-ELISA检测相应感染血清(抗体)，以S/N(样品/阴性血清)≥2.1为阳性。结果见下表6：
表6CF-ELISA检测7种病原细菌感染血清
| 血清稀释 | 1∶2 | 1∶4 | 1∶8 | 1∶16 | 1∶32 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶256 | 1∶512 | 1∶1024 | 1∶2048 | 空白 |
| 炭疽 | 1.565 | 0.693 | 0.566 | 0.363 | 0.363 | 0.366 | 0.399 | 0.348 | 0.337 | 0.323 | 0.335 | 0.036 |
| 鼻疽 | 1.870 | 1.849 | 1.776 | 1.758 | 1.789 | 1.783 | 1.785 | 1.813 | 1.875 | 1.867 | 1.862 | 0.091 |
| 钩端螺旋体 | 1.201 | 1.175 | 1.095 | 0.864 | 0.651 | 0.832 | 0.438 | 0.317 | 0.307 | 0.261 | 0.256 | 0.049 |
| 副结核 | 0.400 | 0.354 | 0.356 | 0.371 | 0.363 | 0.307 | 0.344 | 0.357 | 0.354 | 0.319 | 0.327 | 0.052 |
| 牛结核 | 0.549 | 0.503 | 0.424 | 0.415 | 0.365 | 0.307 | 0.299 | 0.278 | 0.314 | 0.265 | 0.266 | 0.049 |
| 耶尔辛氏菌O:9 | 1.844 | 2.069 | 1.931 | 1.827 | 1.812 | 1.707 | 1.396 | 1.138 | 0.951 | 0.858 | 0.858 | 0.043 |
| 禽结核 | 0.722 | 0.390 | 0.302 | 0.273 | 0.245 | 0.256 | 0.248 | 0.271 | 0.280 | 0.275 | 0.261 | 0.079 |
| 阴性血清 | 0.022 | 0.012 | 0.009 | 0.096 | 0.001 | 0.075 | 0.000 | 0.007 | 0.088 | 0.005 | 0.099 | 0.076 |
表中结果显示，试验的7种病原菌抗体检测均为阳性(S/N≥2.1)。表明CF-ELISA可普遍用于特异性抗体的检测。
2.用CF-ELISA检测抗原
以炭疽杆菌、鼻疽杆菌、钩端螺旋体、副结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、耶尔辛氏菌O:9、禽结核分枝杆菌7种特异血清(抗体)包被ELISA板，用CF-ELISA检测相应细菌(抗原)，当S/N(样品/阴性血清)≥2.1判为阳性。结果见下表7：
表7CF-ELISA检测7种病原细菌
| 抗原稀释 | 1∶2 | 1∶4 | 1∶8 | 1∶16 | 1∶32 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶256 | 1∶512 | 1∶1024 | 1∶2048 | 空白 |
| 炭疽 | 0.546 | 0.468 | 0.495 | 0.500 | 0.473 | 0.518 | 0.457 | 0.431 | 0.446 | 0.484 | 0.498 | 0.040 |
| 鼻疽 | 0.506 | 0.529 | 0.614 | 0.883 | 0.711 | 0.790 | 0.613 | 0.572 | 0.556 | 0.439 | 0.431 | 0.045 |
| 钩端螺旋体 | 0.318 | 0.815 | 0.305 | 0.306 | 0.297 | 0.333 | 0.298 | 0.314 | 0.293 | 0.281 | 0.292 | 0.041 |
| 副结核 | 0.347 | 0.356 | 0.367 | 0.364 | 0.328 | 0.346 | 0.350 | 0.350 | 0.336 | 0.331 | 0.327 | 0.045 |
| 牛结核 | 1.377 | 1.414 | 1.455 | 1.469 | 1.404 | 1.429 | 1.408 | 1.290 | 1.303 | 1.336 | 1.280 | 0.037 |
| 耶尔辛氏菌O:9 | 0.455 | 0.407 | 0.372 | 0.376 | 0.341 | 0.350 | 0.326 | 0.355 | 0.336 | 0.377 | 0.340 | 0.043 |
| 禽结核 | 0.258 | 0.246 | 0.256 | 0.238 | 0.236 | 0.271 | 0.238 | 0.240 | 0.231 | 0.226 | 0.237 | 0.043 |
| 阴性血清 | 0.061 | 0.046 | 0.054 | 0.053 | 0.038 | 0.087 | 0.092 | 0.060 | 0.075 | 0.071 | 0.077 | 0.038 |
表中结果显示，检测7种病原菌均为阳性(S/N≥2.1)。表明CF-ELISA可普遍用于特异性抗原的检测。
本发明技术方案中所涉及的微生物菌种及其阳性血清和阴性血清均取自北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；所用培养基、试剂及器材均为市售商品，由试剂公司购得。
Claims (8)
1.一种补体结合酶联免疫吸附试验，其特征在于该方法建立在补体结合试验和酶联免疫吸附试验的基础上，采用酶标记豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体及酶显色剂作为指示系统，来显示是否存在有补体参与的抗原抗体特异性反应的免疫学检测方法。
2.如权利要求1所述的一种补体结合酶联免疫吸附试验，其特征在于该方法主要包括：
1)包被抗原和抗体制备及包被酶联反应板；
2)阴性和阳性血清标准品的制备；
3)酶标豚鼠补体C3、C1单克隆抗体或多克隆抗体的制备；
4)反应用试剂样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗涤液的配制。
3.如权利要求1所述的一种补体结合酶联免疫吸附试验，其特征在于该方法反应后的结果是读取测定的OD450值。
4.如权利要求1所述的补体结合联免疫吸附试验，其特征在于该方法最后的结果判定是：试验成立条件为阴性对照血清的OD450值＜0.30，强阳性对照血清的OD450或630值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD450值应在0.3～0.60之间；
样本OD450值/C.O≥1为阳性，＜1为阴性；
C.O＝0.8×弱阳性血清OD450平均值+阴性血清OD450平均值。
5.如权利要求1所述的补体结合联免疫吸附试验，其特征在于包括补体结合酶联免疫吸附试验的检测试剂。
6.如权利要求1所述的补体结合联免疫吸附试验，其特征在于包括补体结合酶联免疫吸附试验的检测试剂盒。
7.如权利要求1所述的补体结合联免疫吸附试验，其特征在于包括补体结合酶联免疫吸附试验的检测试剂的应用。
8.如权利要求1所述的补体结合联免疫吸附试验，其特征在于包括包补体结合酶联免疫吸附试验的检测试剂盒应用。
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