CN102798723B

CN102798723B - 一种化学发光检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN102798723B
Application number: CN201210274507.7A
Authority: CN
Inventors: 邹检平
Original assignee: Beijing Jianpingjiuxing Biological Medical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jianping Jinxing Medical Instrument Co.,Ltd.; BEIJING JIANPINGJIUXING BIOLOG
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102798723A

Abstract

一种检测人血管内皮生长因子（VEGF）的发光检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF单克隆抗体包被的固体反应板、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、VEGF标准品、样品稀释液、PBST浓缩洗液、鲁米诺配置的发光底物、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。

Description

一种化学发光检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的化学发光检测试剂盒。

背景技术

肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管内皮细胞生长因子（VEGF）在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用（Ferrara et al. Endocr. Rev.1997,18:4-25）。

VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。

VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力（Kendall et al. PNAS USA, 1993, 90: 10705-9）。

VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤（即癌症）疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

化学发光免疫测定(chemiluminesent immunoassay，CLEIA)是免疫测定技术继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴测定技术。其基本原理是将化学发光系统与免疫反应相结合，以检测样本中的抗原或抗体，由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位，广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快捷、标记物稳定、无污染、仪器简单经济等有点。

目前，用过氧化氢和辣根过氧化物酶（HRP）联合催化鲁米诺类化合物发光的化学发光免疫测定效果比较好，应用比较广泛。

发明内容

本发明的目的是提供一种化学发光免疫检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的检测试剂盒。该试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。

本发明的另一目的是提供上述发光检测试剂盒的生产制备及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为：

1. 反应板；2. 酶结合物；3. 标准品；4. 样品稀释液；5. 浓缩洗涤液；6. 发光底物A、B；7. 封板胶纸。

本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下：

（a）以发光反应板为固体支持物，将VEGF单克隆抗体包被于固体支持物上；

（b）用封闭液封闭；

（c）将生物标本与固定于发光板上的VEGF单克隆抗体接触和保温，生物标本中的VEGF特异地与VEGF单克隆抗体结合；

（d）从VEGF单克隆抗体上分离生物标本；

（e）用辣根过氧化物酶（HRP）标记的VEGF多克隆抗体检测VEGF，所用的发光底物为鲁米诺溶液。

本发明试剂盒的独特性在于，它使用VEGF单克隆抗体包被发光板，能够确保VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。

本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。

具体实施方式

下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。

实施例1：

本发明的试剂盒举例可以是下列物质：

（1）VEGF单克隆抗体包被固体发光板；

（2）酶结合物：辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体， 1瓶；

（3）VEGF标准品，2支；

（4）样品稀释液：0.05%吐温-20, 1%牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，1瓶 ;

（5）浓缩洗涤液为：137mM NaCl，2.7 mM KCl, 10mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄, 0.05%吐温-20, Ph7.4， 1瓶；

（6）发光底物A、B，其中A液为H₂O₂溶液，B液为鲁米诺溶液，各1瓶；

（7）封板胶纸 2张。

本例所述的各种物质量均以发光板为96孔（12条8孔或8条12孔）的例子计算的，如果发光板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也相应或多或少。

其制备方法：

（1）VEGF基因的克隆

以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件：94℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃保温10分钟，

反应体系：ddH₂O 20.0μl

10×Buffer 2.5μl

dNTP(10mM) 0.5μl

3^＇primer(100ng/μl) 0.5μl

5^＇primer(100ng/μl) 0.5μl

Taq酶（5U/μl） 0.5μl

模板NDA 0.5μl

总体积 25μl

凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体pMT18-T中，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为pMT18-1。DNA序列分析由上海博亚生物工程有限公司完成。

（2）昆虫表达载体的构建

用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pMT18-1，回收VEGF基因片段。同时用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pFastBac-HT , 回收4.7kb片段。将VEGF基因片段与4.7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1。用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确。

将载体pFastBac-1转化DH10Bac感受态细胞。采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑。将菌落挑到2ml LB培养基中，37℃ , 250rpm振荡培养12小时。

提取培养的菌液中的质粒方法如下：

（a）将1.5ml 菌液转入离心管中，10,000rpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；

（b）加300μl溶液Ⅰ（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl , 10mM EDTA , pH8.0）, 在震荡器上振荡混匀；

（c）加300μl现配的溶液Ⅱ（0.2N NaOH，1%SDS）,混匀，室温放置5分钟；

（d）加300μl预冷的溶液Ⅲ（5M KAc，pH5.5），冰浴5分钟；

（e）12,000rpm离心15分钟；

（f）转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；

（g）10,000-12,000rpm离心10分钟；

（h）用70%和无水乙醇洗涤沉淀；

（i）吹干，溶于50μl加RNase的TE（10mM Tris-HCl ; 1mM EDTA,pH8.0）中，于37℃放置一小时，置于-20℃备用。

对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法。

（3）转染昆虫细胞（以sf9细胞为例，但不仅限于sf9细胞，采用sf21、sf158、c127细胞株都可以得到相同的效果，在此不一一叙述）。

sf9细胞培养于Grace培养液中，添加15%胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50ug/ml，转染方法如下：

（a）转染前一天将细胞分到24孔板；

（b）转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500μl培养液；

（c）在50μl无血清、无双抗培养液中分别加入2μl脂质体、5μl前述的重组质粒，室温放置5分钟，将质粒加入到脂质体中，室温放置20分钟；

（e）将上一步骤的混合物加到细胞中，27℃培养；

（f）转染4小时后，吸掉培养液，加入1ml新鲜有血清、有双抗Grace培养液，27℃培养72小时；

（g）转染72小时后，观察是否有出毒迹象；

（h）将有杆状病毒上清感染新sf9细胞。

（4）昆虫表达蛋白的纯化（Ni柱吸附法）

（a）Ni柱的制备

（Ⅰ）取1ml Ni-NTA到一离心管中，1500g离心5分钟；

（Ⅱ）去掉上清，将Ni-NTA用1倍体积的洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl , 500mM KCl , 20mM咪唑，2mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8.5）重悬；

（Ⅲ）将重悬液到入柱中，用5-10倍体积的wash buffer平衡；

（b）细胞抽提物的准备

（Ⅰ）500g离心5分钟收集50ml细胞；

（Ⅱ）用裂解缓冲液（50mM Tris-HCl , 100mM KCl , 20mM咪唑，5mM 巯基乙醇，1 mM 苯甲基磺酰氟，pH8.5）重悬细胞；

（Ⅲ）10,000g离心10分钟，将上清液转移到一新管中；

（c）蛋白纯化

（Ⅰ）将上一步骤的上清液加到平衡好的Ni柱中；

（Ⅱ）用10倍体积的buffer A （20mM Tris-HCl , 500mM KCl , 20mM咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8.5）洗柱；

（Ⅲ）用2倍体积的buffer B （20mM Tris-HCl , 1M KCl , 20mM咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8.5）洗柱；

（Ⅳ）用2倍体积的buffer A洗柱；

（Ⅴ）用5-10倍buffer C （20mM Tris-HCl , 100mM KCl , 100mM咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8.5）洗脱，收集洗脱液；

（Ⅵ）用SDS-PAGE 胶检测所纯化蛋白的浓度与纯度。

（5）VEGF单克隆抗体的制备及纯化

以小鼠为免疫动物，重组VEGF为抗原进行免疫。根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此一个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开。待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，可认为克隆完成。由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体。正辛酸—硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95%以上。

（6）VEGF多克隆抗体的制备、纯化及标记

用家兔作为免疫动物，先用5-10mg卡介苗注射刺激动物。一周后，将VEGF蛋白制成弗氏完全佐剂，采用皮下多点注射进行第一次免疫。2周后，进行第二次免疫。2周后，试血并测效价。如效价偏低，则进行加强免疫。

采集家兔全血，离心取血清。向血清中加入饱和硫酸铵，血清与硫酸铵的体积比为2:1，使抗体沉淀，离心分离，抗体纯度达98%以上。

采用戊二醛法将辣根过氧化物酶（HRP）标记到VEGF多克隆抗体上。

（7）试剂盒的制备

发光板的包被采用以下步骤：抗体用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加100μl。37℃水浴或温箱中包被2小时，然后放在室温过夜。每孔加满PBST洗涤液，放置30秒左右，甩干。每孔加120 μl封闭液，室温放置2小时。封闭液配方主要含有BSA、一些盐类等。甩掉封闭液，拍打除去残余封闭液。超净台上吹干。或超净台上吹数小时，然后室温放置过夜。用真空包装机进行包装。

实施例2：试剂盒使用方法

1. 从以平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4℃ ；

2. 留一孔为空白孔，其他各孔加入样品稀释液100μl（或2滴）；

3. 除空白孔外，加入标准品稀释液（用标准品稀释8个梯度）、血清标本各100μl至相应孔中，轻弹混匀。用封板胶纸封住反应孔，37℃60分钟；

4. 洗板3次：（1）自动洗板机：甩尽孔内液体，要求注入的洗涤液为350μl，注入与吸出间隔15-30秒，洗板3次。（2）手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗3次；

5. 除空白孔外，每孔加酶结合物200μl（或4滴），封住板孔，37℃ 60分钟；

6. 洗板3次；

7. 发光反应：将发光底物A、B液各100μl（或2滴）加到反应孔（包括空白孔）内；

8. 轻微振荡30秒，室温(18—25℃)避光反应5分钟后，用化学发光仪测定各孔发光值；

9.以标准品浓度值为横坐标（X轴），以标准品发光强度值为纵坐标（Y轴），建立标准曲线，计算测定结果。

本发明具有的优点：

1. 结果特异性强。本发明采用VEGF单克隆抗体为包被物包被固体发光板，因此，检测VEGF的特异性高；

2. 灵敏度高。检测灵敏度能打到 ng/L水平；

4. 稳定。本发明于4℃保存，有效期达9-12个月；

5. 方便。本发明操作简便，所需检测仪器（化学发光仪）在各大医院和检测中心普遍使用。

Claims

1.一种发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述发光检测试剂盒的组成为：

反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A、B和封板胶纸；

其中：

反应板为血管内皮细胞生长因子单克隆抗体包被的固体反应板；

酶结合物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体，

标准品为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；

样品稀释液为0.05％吐温-20，1％牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05％硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5；

浓缩洗涤液为137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，0.05％吐温-20，pH7.4；

发光底物A、B，其中发光底物A为H₂O₂溶液，发光底物B为鲁米诺溶液；所述封板胶纸的数量为2张；

各物质的量以发光板的孔数为标准；

所述发光板为96孔；

VEGF单克隆抗体包被固体发光板；

所述制备方法包括步骤如下：

步骤一、VEGF基因的克隆，以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应即PCR；依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件：94℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30 个循环后72℃保温10分钟，

反应体系为，

凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体pMT18-T中，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒进行酶切鉴定；VEGF基因的重组质粒命名为pMT18-1；

步骤二、昆虫表达载体的构建，用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pMT18-1，回收VEGF基因片段；同时用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pFastBac-HT，回收4.7kb片段；将VEGF基因片段与4.7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1；用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确；

将载体pFastBac-1转化DH10Bac感受态细胞；采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑；将菌落挑到2ml LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养12小时；

提取培养的菌液中的质粒方法如下：

步骤a、将1.5ml菌液转入离心管中，10,000rpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；

步骤b、加300μl溶液Ⅰ，所述溶液I为50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH为8.0，在震荡器上振荡混匀；

步骤c、加300μl现配的溶液Ⅱ，所述溶液Ⅱ为0.2N的NaOH，1％SDS，混匀，室温放置5分钟；

步骤d、加300μl预冷的溶液Ⅲ，所述溶液Ⅲ为5M KAc，pH5.5，冰浴5分钟；

步骤e、12,000rpm离心15分钟；

步骤f、转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；

步骤g、12,000rpm离心10分钟；

步骤h、用70％和无水乙醇洗涤沉淀；

步骤i、吹干，溶于50μl加RNase的TE中，所述TE为10mM Tris-HCl；1mM EDTA，pH为8.0，于37℃放置一小时，置于-20℃备用；

对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法；

转染昆虫细胞，sf9细胞培养于Grace培养液中，添加15％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50ug/ml，

所述转染的方法如下：

转染前一天将细胞分到24孔板；

转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500μl培养液；

在50μl无血清、无双抗培养液中分别加入2μl脂质体、5μl前述的重组质粒，室温放置5分钟，将质粒加入到脂质体中，室温放置20分钟；

将上一步骤的混合物加到细胞中，27℃培养；

转染4小时后，吸掉培养液，加入1ml新鲜有血清、有双抗Grace培养液，27℃培养72小时；

转染72小时后，观察是否有出毒迹象；

将有杆状病毒上清感染新sf9细胞；

昆虫表达蛋白的纯化，即Ni柱吸附法；

Ni柱的制备；

Ⅰ)取1ml Ni-NTA到一离心管中，1500g离心5分钟；

Ⅱ)去掉上清，将Ni-NTA用1倍体积的洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液为20mM Tris-HCl,500mM KCl，20mM咪唑，2mM巯基乙醇，10％甘油，pH8.5；

Ⅲ)将重悬液倒入柱中，用10倍体积的wash buffer平衡；

细胞抽提物的准备

500g离心5分钟收集50ml细胞；

用裂解缓冲液重悬细胞，所述裂解缓冲液为50mM Tris-HCl，100mM KCl，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，pH8.5；

10,000g离心10分钟，将上清液转移到一新管中；

蛋白纯化；

将上一步骤的上清液加到平衡好的Ni柱中；

用10倍体积的buffer A洗柱，所述buffer A为20mM Tris-HCl，500mM KCl，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH8.5；

用2倍体积的buffer B洗柱，所述buffer B为20mM Tris-HCl，1M KCl，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH8.5；

用2倍体积的buffer A洗柱；

用10倍buffer C洗脱，收集洗脱液，所述buffer C为20mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH8.5；

用SDS-PAGE胶检测所纯化蛋白的浓度与纯度；

VEGF单克隆抗体的制备及纯化，以小鼠为免疫动物，重组VEGF为抗原进行免疫；根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此一个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开；待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，认为克隆完成；由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体；正辛酸—硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95％以上；

VEGF多克隆抗体的制备、纯化及标记，用家兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物；一周后，将VEGF蛋白制成弗氏完全佐剂，采用皮下多点注射进行第一次免疫；2周后，进行第二次免疫；2周后，试血并测效价；如效价偏低，则进行加强免疫；

采集家兔全血，离心取血清；向血清中加入饱和硫酸铵，血清与硫酸铵的体积比为2:1，使抗体沉淀，离心分离，抗体纯度达98％以上；

采用戊二醛法将辣根过氧化物酶HRP标记到VEGF多克隆抗体上；

试剂盒的制备；

发光板的包被采用以下步骤：抗体用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加100μl；37℃水浴或温箱中包被2小时，然后放在室温过夜；每孔加满PBST洗涤液，放置30秒左右，甩干；每孔加120μl封闭液，室温放置2小时；封闭液配方主要含有BSA、一些盐类；甩掉封闭液，拍打除去残余封闭液；超净台上吹干；或超净台上吹数小时，然后室温放置过夜；用真空包装机进行包装；

试剂盒使用方法，

从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4℃；

留一孔为空白孔，其他各孔加入样品稀释液100μl；

除空白孔外，加入标准品稀释液，用标准品稀释8个梯度、血清标本各100μl至相应孔中，轻弹混匀，用封板胶纸封住反应孔，37℃，60分钟；

洗板3次，自动洗板机：甩尽孔内液体，要求注入的洗涤液为350μl，注入与吸出间隔30秒，洗板3次；手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗3次；

除空白孔外，每孔加酶结合物200μl，封住板孔，37℃，60分钟；

洗板3次；

发光反应：将发光底物A、B液各100μl加到反应孔，包括空白孔内；

轻微振荡30秒，室温避光反应5分钟后，用化学发光仪测定各孔发光值；

以标准品浓度值为横坐标，以标准品发光强度值为纵坐标，建立标准曲线，计算测定结果。