CN115244078A - 靶向马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了特异性结合马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)Mp1p蛋白的抗体。例如，此类抗体可由专利保藏编号为PTA‑126527的杂交瘤细胞系产生。

Description

靶向马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体及其使用方法
发明背景
马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)是热二态性真菌，其主要影响被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的受试者和其他免疫受损的受试者。马尔尼菲篮状菌感染的血清学诊断是有困难的，因为没有可靠的诊断测定可用。
发明概述
在一方面，本公开提供了一种分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)Mp1p蛋白，并且包含：
包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3(重链CDR1-3)的重链可变区，和
包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3(轻链CDR1-3)的轻链可变区，
其中所述重链CDR1-3和轻链CDR1-3与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的相应CDR具有相同的序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的重链可变区具有相同的序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的轻链可变区具有相同的序列。
在一些实施方案中，所述抗体由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生。
在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，所述抗体是Fab、F(ab’)2、scFv或二价scFv。在一些实施方案中，所述抗体与检测部分缀合。
在另一方面，本公开的特征在于一种核酸分子，其编码如本文所述的分离的抗体。本公开的特征还在于包含所述核酸分子的载体。本公开的特征还在于表达如本文所述的分离的抗体的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体，其中所述核酸分子或所述载体在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，宿主细胞是杂交瘤细胞。
在另一方面，本公开的特征在于一种杂交瘤细胞系，其专利保藏编号为PTA-126527。
在另一方面，本公开的特征在于一种用于检测样品中马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)Mp1p蛋白的存在的方法，其包括使所述样品与本文所述的抗体接触，和检测所述抗体与所述样品中的马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的结合。在某些实施方案中，所述样品是生物样品，例如，从受试者分离的生物样品。
在所述方法的一些实施方案中，受试者是免疫受损的。在某些实施方案中，所述受试者已经或正在被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。在某些实施方案中，所述受试者患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
在所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括检测第二抗体与本文所述的抗体的结合。在某些实施方案中，所述第二抗体与检测部分缀合。
在所述方法的一些实施方案中，所述马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的存在指示马尔尼菲篮状菌感染。
附图说明
图1A和1B显示了纯化的rMp1p蛋白的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
图2A-2C显示了表1中的四种抗体克隆可以结合Mp1p蛋白。
图2D显示了表1中的四种抗体克隆的蛋白质印迹分析。
发明详述
I.引言
本发明涉及发现与马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)的Mp1p蛋白结合的抗体，尤其是由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体。如本文进一步描述的，所述抗体可用于检测样品中马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的存在的测定中，其指示马尔尼菲篮状菌感染。
II.定义
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“抗体”任选地包括两个或更多个这样的分子的组合等。
如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰数值或范围中指定的量时，表示该数值以及本领域技术人员已知的与该值的合理偏差，例如±20％、±10％或±5％，在所述值的预期含义内。
如本文所用，术语“抗体”是指在功能上定义为结合蛋白并且在结构上定义为包含被本领域技术人员识别为衍生自免疫球蛋白编码基因的可变区的氨基酸序列的蛋白质。该术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。如本文所用，术语“抗体”还包括保留结合特异性的抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、scFv和二价scFv。抗体可以由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一条或多条多肽组成。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其反过来又分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端限定了约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别指这些轻链和重链。
术语“可变区”是指抗体重链或轻链中衍生自种系可变(V)基因、多样性(D)基因或连接(J)基因(而不是衍生自恒定(Cμ和Cδ)基因片段)的结构域，其赋予抗体结合抗原的特异性。通常，抗体可变区包含四个保守的“框架”区，其中散布着三个高变“互补决定区”。
术语“互补决定区”或“CDR”是指每条链中中断由轻链和重链可变区建立的四个框架区的三个高变区。CDR主要负责抗体与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始顺序编号，并且通常还通过特定CDR所在的链来鉴定。因此，VH CDR3或CDR-H3位于其所存在的抗体的重链可变区中，而VL CDR1或CDR-L1是来自其所存在的抗体的轻链可变区的CDR1。
不同轻链或重链的“框架区”或“FR”在物种内相对保守。抗体的框架区，即构成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开参考文献获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在用于人和小鼠序列的“VBASE2”种系可变基因序列数据库中找到。
CDR和框架区的氨基酸序列可以使用本领域中各种众所周知的定义来确定，例如，Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)、AbM和观察到的抗原接触(“Contact”)。在一些实施方案中，根据Contact定义确定CDR。参见，MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)。在一些实施方案中，由Kabat、Chothia和Contact定义的组合确定CDR。
术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文中可互换使用，并且是指分子(例如抗体)的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白)的能力。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab')2片段(包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(dsFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、纳米抗体、双抗体(其各自通过可变区结合抗原)，以及如Spiess等人，Mol.Immun.67(2015)95-106中所描述的其他形式，其通过引用并入本文，以及能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽的这些或任何其他功能性部分的任何组合。
术语“表位”是指分子(例如抗体的CDR)特异性结合的抗原的区域或区，并且可以包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如5或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸，或那些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包括例如来自碳水化合物、核酸或脂质的非蛋白质组分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，当靶标是蛋白质时，表位可以由连续的氨基酸(例如，线性表位)或来自通过蛋白质折叠使蛋白质的不同部分接近的氨基酸(例如，不连续或构象表位)组成。
术语“单克隆抗体”是指由单个细胞克隆或单个细胞系产生的抗体，并且由或基本上由一级氨基酸序列相同的抗体分子组成。
“多克隆抗体”是指从异质抗体群体中获得的抗体库，其中群体中的不同抗体与抗原的不同表位结合。
“嵌合抗体”是指抗体分子，其中恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(即，可变区、CDR或其部分)与不同或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区连接，或者其中可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR和框架区)改变、替换或交换。在一些实施方案中，嵌合抗体是包含来自一种来源或物种(例如，小鼠)的可变区和源自第二来源或物种(例如，人)的恒定区的单克隆抗体。本领域描述了用于产生嵌合抗体的方法。
术语“人源化抗体”是指保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。这可以例如通过保留非人CDR区并用其人对应物替换抗体的剩余部分来实现。在一些情况下，必须保留特定的非人框架残基，以便一旦人源化就保留非人抗体的结合亲和力和/或特异性。
术语“人抗体”或“完全人抗体”是指通常衍生自人种系基因的具有人重链和轻链序列的抗体。在一些实施方案中，抗体由人细胞、利用人抗体库的非人动物(例如，经遗传工程改造以表达人抗体序列的转基因小鼠)或噬菌体展示平台产生。
术语“结合亲和力”在本文中用于指两个分子之间(例如，抗体(或其抗原结合部分)与抗原之间)的非共价相互作用的强度。因此，例如，除非另有说明，否则该术语可以指抗体(或其抗原结合部分)和抗原之间的1：1相互作用。结合亲和力可以通过测量平衡解离常数(KD)来定量，KD是指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1M-1)。KD可以通过测量复合物形成和解离的动力学来确定，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排阻测定例如
Figure BDA0003836619560000051
和生物膜层干涉测量法(例如，使用
Figure BDA0003836619560000052
Octet平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括正式的结合亲和力，如反映抗体(或其抗原结合部分)与抗原之间的1：1相互作用的那些，而且还包括表观亲和力，针对表观亲和力计算KD可反映亲合结合(avid binding)。
有关核酸或蛋白质(例如抗体)使用的术语“分离的”表示核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其结合的其他细胞组分。优选处于同质状态。纯度和同质性通常使用分析化学技术如电泳(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳)或色谱法(例如高效液相色谱法)测定。在一些实施方案中，分离的核酸或蛋白质(例如抗体)的纯度为至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指单链中氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L和D氨基酸的混合物。
本文所用的术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即两个)或多聚体(即三个或更多个)。蛋白质的单链多肽可以通过共价键(例如二硫键)或非共价相互作用连接。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。
本文可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、牛、猪、马和其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，受试者、个体或患者是人。
III.抗体
在一方面，提供了特异性结合马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)Mp1p蛋白的抗体和抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，本文所述的抗体由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含：包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3(重链CDR1-3)的重链可变区，和包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3(轻链CDR1-3)的轻链可变区，其中重链CDR1-3和轻链CDR1-3与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的相应CDR具有相同的序列。在具体的实施方案中，重链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的重链可变区具有相同的序列，和/或轻链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的轻链可变区具有相同的序列。
特异性结合马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体和抗体的抗原结合部分可结合Mp1p蛋白内的表位。在一些实施方案中，Mp1p蛋白内的表位可具有至少5个氨基酸(例如，至少6、7、8、9、10、12、14、16、18或20个氨基酸)。在一些实施方案中，Mp1p蛋白内的表位可具有5至20个氨基酸(例如，5至18个、5至16个、5至14个、5至12个、5至10个、5至9个、5至8个、5至7个、6至20个、7至20个、8至20个、9至20个、10至20个、12至20个、14至20个、16至20个或18至20个氨基酸)。作为糖基化的结果，Mp1p蛋白或其内的表位可以包括非蛋白组分，例如碳水化合物。
特异性结合马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体可以是单克隆抗体。抗体也可以是嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体可以与检测部分缀合。检测部分可以是能够直接或间接提供可检测信号的任何蛋白质或有机小分子。例如，检测部分可以是荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、RFP或YFP)或小分子荧光团(例如，荧光素、罗丹明、Alexa Fluor)。在其它实例中，检测部分可以是生物素分子，其随后可以使用第二结合分子检测，例如与荧光蛋白或小分子荧光团缀合的链霉亲和素分子或与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素分子。
用于分析与马尔尼菲篮状菌Mp1p结合的抗体的结合亲和力、结合动力学和交叉反应性的方法是本领域已知的。这些方法包括但不限于固相结合测定(例如，ELISA测定)、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如，BiacoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ))、动力学排阻测定(例如
Figure BDA0003836619560000081
)、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、生物膜层干涉测量(例如，OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))和蛋白质印迹分析。
抗体制备
为了制备抗体，可以使用本领域已知的许多技术。在一些实施方案中，通过用抗原或抗原混合物免疫一种或多种动物(例如小鼠、兔或大鼠)以诱导抗体应答来制备抗体。在一些实施方案中，用于产生抗体的抗原是来自马尔尼菲篮状菌Tm-1株的Mp1p蛋白(Tm-1Mp1p蛋白)或来自马尔尼菲篮状菌TM-4株的Mp1p蛋白(Tm-4 Mp1p蛋白)或其部分。在特定实施方案中，用于产生抗体的抗原是Tm-1 Mp1p蛋白。在一些实施方案中，抗原或抗原混合物与佐剂(例如，弗氏佐剂)联合施用。在初次免疫后，可以施用一种或多种抗原的一次或多次后续加强注射以改善抗体产生。免疫后，例如从脾和/或淋巴组织收获抗原特异性B细胞。
可以使用本领域可用的技术纯化产生的抗体，例如尺寸排阻色谱或亲和色谱。可以使用诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和蛋白质印迹技术评估抗体的纯度。纯化的抗体与Mp1p蛋白的结合亲和力可以通过测量平衡解离常数(KD)来定量。KD可以通过测量复合物形成和解离的动力学来确定，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排阻测定例如
Figure BDA0003836619560000082
和生物膜层干涉测量法(例如，使用
Figure BDA0003836619560000083
Octet平台)。
可以从细胞克隆编码感兴趣的抗体的重链和轻链的基因，例如，可以从杂交瘤克隆编码单克隆抗体的基因并用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。或者，噬菌体或酵母展示技术可用于鉴定与所选抗原特异性结合的抗体和Fab片段。用于产生单链抗体或重组抗体的技术也可以适用于产生抗体。抗体也可以制成双特异性的，即能够识别两种不同的抗原。抗体也可以是异源缀合物，例如两个共价连接的抗体或免疫毒素。
可以使用任何数量的表达系统产生抗体，包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，例如杂交瘤或CHO细胞表达系统。在具体实施方案中，本文所述的与马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白结合的抗体由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生。在抗体包含VH和VL区两者的实施方案中，VH和VL区可以使用单一载体，例如在双顺反子表达单元或在不同启动子的控制下表达。在其他实施方案中，可以使用单独的载体表达VH和VL区。产生和筛选杂交瘤细胞系的方法，包括选择和免疫合适的动物，分离和融合合适的细胞以产生杂交瘤，筛选分泌所需抗体的杂交瘤，以及表征抗体，是本领域普通技术人员已知的。
IV.测定和方法
本公开还提供了使用本文所述的抗体(例如，由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体)来检测马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的存在的测定。在第一个实施方案中，马尔尼菲篮状菌Tm-1株的Mp1p蛋白(Tm-1 Mp1p蛋白)由酵母巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达。巴斯德毕赤酵母表达系统提供必要的翻译后修饰，例如糖基化，以产生结构上更接近其天然形式的Tm-1 Mp1p蛋白。此外，来自马尔尼菲篮状菌Tm-1株的Mp1p蛋白(Tm-1 Mp1p蛋白)和来自马尔尼菲篮状菌Tm-4株的Mp1p蛋白(Tm-4Mp1p蛋白)在结构上是不同的。Tm-1 Mp1p蛋白和Tm-4 Mp1p蛋白的配体结合结构域1(LBD1)不同，而Tm-1 Mp1p蛋白和Tm-4 Mp1p蛋白的LBD2相似。本文所述的测定使用Tm-1 Mp1p蛋白。
产生了针对巴斯德毕赤酵母衍生的Tm-1 Mp1p蛋白的小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体。这些抗体可用作酶联免疫吸附测定(ELISA测定)中的包被抗原，以捕获并结合样品(例如，来自受试者的生物样品)中的Mp1p蛋白。第二抗体，例如抗Mp1p蛋白的生物素化抗体和与HRP缀合的亲和素可用于提供可检测的信号。
在第二个实施方案中，由巴斯德毕赤酵母表达系统产生的重组Tm-1Mp1p蛋白可用作ELISA测定中的包被抗原，其随后可捕获并结合样品(例如来自受试者的生物样品)中存在的抗Mp1p蛋白的抗体。第二抗体，如山羊抗人IgG和IgM，可用于提供可检测的信号。
本公开提供了检测样品中马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)Mp1p蛋白的存在的方法，其通过使样品与本文所述的结合马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的抗体接触，并检测抗体与样品中马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的结合。样品可以是从疑似患有马尔尼菲篮状菌感染的受试者分离的生物样品。如果生物样品含有Mp1p蛋白，则可以表明受试者曾经或正在患有马尔尼菲篮状菌感染。
本公开还提供了检测针对样品中存在的Mp1p蛋白的抗体的方法。如本文所述，Mp1p蛋白(例如，由巴斯德毕赤酵母表达系统产生的Tm-1 Mp1p蛋白)可用作ELISA测定中的包被抗原。例如，如果样品中存在抗Mp1p抗体，则固定化的Tm-1 Mp1p蛋白可以捕获抗Mp1p抗体。样品可以是从疑似患有马尔尼菲篮状菌感染的受试者分离的生物样品。如果生物样品含有抗Mp1p抗体，则可以表明受试者曾经或正在患有马尔尼菲篮状菌感染。
V.核酸和载体
在一些实施方案中，使用重组方法制备如本文所述的抗体。因此，在一些方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码如本文所述的任何抗体(例如，由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体)的核酸序列。分离的核酸还可包含编码本文所述的CDR、重链可变区或轻链可变区的核酸序列。还提供了包含此类核酸的载体。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含编码如本文所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码一个或多个氨基酸序列(例如，CDR、重链、轻链和/或框架区)的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至异源核酸，例如异源启动子。
含有编码本公开的抗体或其片段的多核苷酸的合适载体包括克隆载体和表达载体。虽然选择的克隆载体可以根据预期使用的宿主细胞而变化，但是有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有用于特定限制性核酸内切酶的单个靶标，和/或可以携带可用于选择含有载体的克隆的标记基因。实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和其他多种克隆载体是可从商业供应商处获得的。
表达载体通常是含有本公开的核酸的可复制的多核苷酸构建体。表达载体可以作为游离基因或作为染色体DNA的整合部分在宿主细胞中复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)和任何其它载体。
用于克隆或表达如本文所述的多核苷酸或载体的合适宿主细胞包括原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞，例如人胚肾(HEK)细胞。
VI.实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例1.马尔尼菲篮状菌Tm-1株重组Mp1p蛋白(Tm-1 Mp1p蛋白)的制备和表征
发明人在马尔尼菲篮状菌Tm-1株中表达了编码分泌的细胞壁甘露糖蛋白的Mp1p基因。来自马尔尼菲篮状菌Tm-1株的Mp1p蛋白(Tm-1 Mp1p蛋白)和来自马尔尼菲篮状菌TM-4株的Mp1p蛋白(Tm-4 Mp1p蛋白)在结构上是不同的Tm-1 Mp1p蛋白和Tm-4 Mp1p蛋白的配体结合结构域1(LBD1)不同，而Tm-1 Mp1p蛋白和Tm-4 Mp1p蛋白的LBD2相似。从全长Mp1p基因中除去N-末端可切割信号肽和C-末端可切割糖基磷脂酰肌醇(GPI)结构域。将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。根据制造商的说明，表达并鉴定巴斯德毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen)中的截短的Mp1p基因。对重组Mp1p蛋白(rMp1p)的大规模表达进行优化，并通过Ni-次氮基三乙酸亲和层析(Qiagen，Hilden，Germany)进行纯化。
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和蛋白质印迹评估rMp1p的纯度。简而言之，将纯化的rMp1p在12％凝胶中电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上。在用3％BSA和7％脱脂乳(Sigma-Aldrich)封闭后，将膜与来自马尔尼菲篮状菌Tm-4株的纯化rMp1p免疫的兔的抗血清和抗His单克隆抗体在37℃下孵育1小时。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP；Sigma-Aldrich)缀合的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体在37℃下孵育30分钟，并通过与Amersham ECL Advance蛋白质印迹检测试剂盒(GE Healthcare，Fair-Field，CT)孵育来显影。根据制造商的说明书，通过使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)确定纯化的rMp1p的浓度。图1A和1B显示纯化的rMp1p蛋白的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
实施例2.针对Tm-1 Mp1p蛋白的单克隆抗体的表征
发明人根据制造商的说明使用Mouse MonoAb-ID Kie(ZYMEDLaboratorise Inc,USA)对单克隆抗体进行了表征，并进行了一些修改。简而言之，微孔板在4℃下用100μl/孔的rMp1p蛋白(1μg/ml)包被过夜，然后在4℃下用封闭试剂孵育过夜。去除封闭溶液后，将100μl/孔的单克隆抗体等分试样添加到微孔中，在37℃下孵育1小时。洗板6次后，每孔加入100μl稀释的山羊抗小鼠IgGAM抗体，然后在37℃孵育30分钟。然后，将它们用PBS-Tween洗涤4次，并将100μl稀释的HRP-山羊抗兔IgG(H+L)添加到每个孔中，并在37℃下孵育30分钟。接下来，将孔用PBS-Tween洗涤4次，然后加入四甲基联苯胺(TMB)底物(100μL/孔)。通过添加0.3N硫酸在10分钟后停止反应，然后在ELISA读板器中在450nm处检查板。下表1显示了由四种不同杂交瘤细胞株产生的四种单克隆抗体的特征。图2A-2C进一步显示了表1中的四种抗体克隆可以结合Mp1p蛋白。图2D显示了表1中的四种抗体克隆的蛋白质印迹分析。
表1
Figure BDA0003836619560000121
公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能未明确公开这些化合物的每种不同的单独和集体组合和排列的具体提及，但本文具体考虑和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括在该方法中的一种或多种分子进行的许多修改，则具体考虑了该方法的每种组合和排列，以及可能的修改，除非特别指出相反的情况。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个可以用所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集是特别考虑的并且应当被视为公开。
本文引用的出版物及其引用的材料通过引用整体并入本文。

Claims (24)

1.分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei)Mp1p蛋白，并且包含：
包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3(重链CDR1-3)的重链可变区，和
包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3(轻链CDR1-3)的轻链可变区，
其中所述重链CDR1-3和轻链CDR1-3与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的相应CDR具有相同的序列。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述重链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的重链可变区具有相同的序列。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体，其中所述轻链可变区与由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生的抗体的轻链可变区具有相同的序列。
4.如权利要求1至3所述的分离的抗体，其中所述抗体由专利保藏编号为PTA-126527的杂交瘤细胞系产生。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
7.如权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
9.如权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是Fab、F(ab’)2、scFv或二价scFv。
10.如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体与检测部分缀合。
11.核酸分子，其编码如权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体。
12.载体，其包含如权利要求11所述的核酸分子。
13.宿主细胞，其表达如权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体，其中所述宿主细胞包含如权利要求11所述的核酸分子或如权利要求12所述的载体，其中所述核酸分子或载体在所述宿主细胞中表达。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是杂交瘤细胞。
15.杂交瘤细胞系，其专利保藏编号为PTA-126527。
16.用于检测样品中马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei)Mp1p蛋白的存在的方法，其包括使所述样品与权利要求1-10中任一项所述的抗体接触，和检测所述抗体与所述样品中的马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的结合。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述样品是生物样品。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品分离自受试者。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述受试者已经或正在被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其还包括检测第二抗体与权利要求1至10中任一项所述的抗体的结合。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第二抗体与检测部分缀合。
24.如权利要求16至23中任一项所述的方法，其中所述马尔尼菲篮状菌Mp1p蛋白的存在指示马尔尼菲篮状菌感染。
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