CN117343182A - 抗人tigit抗体或其功能性片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学和抗体工程技术领域;更具体的涉及抗人TIGIT抗体或其功能性片段,以及抗人TIGIT抗体或其功能性片段作为免疫偶联物、嵌合抗原受体和/或组合物的应用,具体公开了可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明筛选获得的TIGIT特异性单克隆抗体,具有高敏感性、高特异性和高亲和力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和抗体工程技术领域;更具体的涉及抗人TIGIT抗体或其功能性片段,以及抗人TIGIT抗体或其功能性片段作为免疫偶联物、嵌合抗原受体和/或组合物的应用。
背景技术
免疫治疗为肿瘤治疗提供了新途径,以程序性细胞死亡受体1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)等免疫检查点抑制剂为代表的抗体药物,已经使多种肿瘤患者受益,但多数患者表现为药物初始无反应或部分应答患者仍然出现肿瘤进展,这可能与存在其他免疫抑制分子的作用及免疫系统的不完全激活有关。筛选并联合新的免疫治疗靶标,优化治疗策略,是当前肿瘤治疗的一大发展趋势。
TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domains;T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白)也称V-set和跨膜结构域的蛋白3(V-set and transmembrane domain-containing protein 3,VSTM3)、V-set和免疫球蛋白结构域的蛋白9(V-set andimmunoglobulin domain-containing protein 9,VSIG9)和WUCAM(WashingtonUniversity cell adhesion molecule),是近年来备受瞩目的新型免疫抑制性受体之一。TIGIT由细胞外IgV结构域、Ⅰ型跨膜蛋白区和基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)、免疫球蛋白尾部酪氨酸样基序(immunoglobulin tail tyrosine,ITT)的细胞质尾部组成,表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)、调节性T细胞(Tregulatory,Treg)和CD4辅助性T细胞(T helper cell,Th)表面。TIGIT有三个配体,分别是CD155(PVR)、CD112(PVRL2,Nectin-2)和CD113(Nectin-3),其中,TIGIT和CD155亲和力最高,其已在树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及许多人类癌细胞中鉴定出,并已显示与TIGIT结合后可下调T细胞活化和细胞因子分泌。TIGIT/PVR相互作用的抑制可以介导免疫细胞有效的抗肿瘤活性。DNAM-1(CD226)是在NK细胞、单核细胞和T细胞上发现的活化受体。TIGIT和DNAM-1竞争由肿瘤细胞和抗原提成细胞表达的共享配体CD155和CD112。TIGIT与CD155或CD112的结合会导致免疫抑制,而DNAM-1与相同配体结合则介导免疫激活。因此,TIGIT也是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。TIGIT抗体抗肿瘤研究目前处于临床试验阶段,最快的处于III期临床。
现有的TIGIT单抗多通过鼠杂交瘤技术制备。抗体工程技术的进步促进了抗体的制备,并提高了其检测性能。噬菌体抗体库技术可以用于筛选任何抗原特异性的抗体。本研究利用免疫的小鼠噬菌体抗体库筛选抗人TIGIT蛋白的高性能单克隆抗体,与鼠杂交瘤抗体筛选技术相比,能够获得高亲和力抗体。
发明内容
第一方面,本发明提供可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗人TIGIT单克隆抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)互补决定区序列,所述重链可变区和轻链可变区互补决定区分别含有CDR1、CDR2和CDR3;
其中重链可变区CDR区氨基酸序列如下所示:
VHCDR1氨基酸序列为SEQ ID NO.1;
VHCDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中的一组或多组;
VHCDR3氨基酸序列为SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7;
其中轻链可变区CDR区氨基酸序列如下所示:
VLCDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11中的一组或多组;
VLCDR2氨基酸序列为SEQ ID NO.12和/或SEQ ID NO.13;
VLCDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17中的一组或多组。
其中,当VHCDR1氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2氨基酸序列选择SEQ IDNO.2、VHCDR3氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1氨基酸序列选择SEQ ID NO.8、VLCDR2氨基酸序列选择SEQ ID NO.12、VLCDR3氨基酸序列选择SEQ ID NO.14时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M001,所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M001的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示;TIGIT-M001的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示。
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ IDNO.3、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.7;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.9、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.15,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M003;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M003的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.21所示;TIGIT-M003的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示。
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ IDNO.2、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.12、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.16;所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M006;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M006的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23所示;TIGIT-M006的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示。
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ IDNO.4、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.11、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.15时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M007;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M007的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.25所示;TIGIT-M007的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示。
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ IDNO.5、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.17时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M011;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M011的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.27所示;TIGIT-M011的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示。
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ IDNO.2、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.17时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M013;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M013的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.28以及SEQ ID NO.29所示;TIGIT-M013的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示。
进一步的,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)互补决定区的序列还包括其突变序列,所述突变序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。
进一步的,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段包含抗体恒定区Fc,所述恒定区包含重链恒定区和轻链恒定区。
进一步的,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区包括κ型或λ型轻链恒定区。
进一步的,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的重链恒定区选自:IgD、IgE、IgM、IgA和IgG中任意一种抗体的重链恒定区。
进一步的,所述重链恒定区IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。
进一步的,所述抗原结合片段包括抗原结合的功能性片段。
进一步的,所述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv中的一种或多种。
进一步的,所述重链恒定区优选为IgG1,氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
进一步的,所述轻链恒定区优选为κ型,其氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
在一种实施方式中,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的重链恒定区均相同时,其重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
在另一种实施方式中,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的轻链恒定区均相同时,其轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
第二方面,本发明提供一种编码本发明第一方面所述的可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸分子。
第三方面,本发明提供一种载体,所述载体包含有编辑本发明第一方面所述的可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸分子。
第四方面,本发明提供一种宿主细胞,所述宿主细胞含有编码本发明第一方面所述的可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸分子。
第五方面,本发明提供一种免疫偶联物,其包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
第六方面,本发明提供一种嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含本发明第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
第七方面,本发明提供一种组合物,所述组合物包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞或免疫偶联物。
第八方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、免疫偶联物、嵌合抗原受体或其编码核酸分子、构建体或载体、经转化的免疫细胞和/或本发明第五方面所述的组合物在制备正向调节免疫细胞活性和/或提高免疫应答的药物中的应用。
进一步的,所述应用可包括制备预防和/或治疗肿瘤、感染或感染性疾病的药物中的应用。
第九方面,本发明提供一种检测TIGIT蛋白的试剂盒,所述试剂盒包括说明书和检测试剂,所述检测试剂为本发明涉及的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、免疫偶联物、嵌合抗原受体或其编码核酸分子、构建体或载体、经转化的免疫细胞和/或本发明第五方面所述的组合物的试剂。
有益效果
本发明最终筛选到的TIGIT特异性单克隆抗体,其具有高敏感性、高特异性和高亲和力,可与CD8+T细胞表面TIGIT蛋白结合,可特异性识别细胞膜表面TIGIT蛋白;本发明中的TIGIT抗体与市售的TIGIT单克隆抗体(A15153G)相比,明显具有更高的亲和力。
附图说明
图1为TIGIT抗体纯度的SDS-PAGE鉴定。(A:非还原条件下检测结果;B:还原条件下检测结果;M:Marker;1:TIGIT-M001;2:TIGIT-M003;3:TIGIT-M006;4:TIGIT-M007;5:TIGIT-M011;6:TIGIT-M013)。
图2为TIGIT抗体检测TIGIT蛋白特异性的ELISA鉴定。
图3为TIGIT抗体检测TIGIT蛋白特异性的Western blotting鉴定。(M:Marker;1:非还原条件下的TIGIT重组蛋白;2:还原条件下的TIGIT重组蛋白。)
图4为TIGIT抗体识别293FT细胞表面表达TIGIT蛋白的流式细胞术鉴定。
图5为TIGIT抗体识别TIGIT蛋白敏感性的ELISA鉴定。
图6为TIGIT抗体结合TIGIT蛋白亲和力鉴定(线条自上而下表示TIGIT抗体浓度分别为250nM,125nM,62.5nM和31.3nM)。
图7为TIGIT抗体识别T细胞表面TIGIT蛋白的流式细胞术鉴定。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为可通过常规的商业途径购买得到。
本文所用术语“VH”和“VL”是指抗体重链可变区和轻链可变区。可变区由离散的、定义明确的子区域组成,这些子区域称为“互补决定区”(CDR,也称为HVR(高变区))和“框架区”(FR)。CDR指的是抗体可变区内的赋予抗原特异性和/或结合亲和力的氨基酸,被FR隔开。每个抗体轻链可变区中有三个CDR(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3),每个抗体重链可变区中有三个CDR(VHCDR1、VHCR2和VHCDR3);VH和VL区的“互补决定区”(complementaritydetermining regions,CDR),与“框架区”(framework regions,FR)的更保守区域相间;每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基端到羧基端按下列顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。
如本文所用术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。
实施例1小鼠抗人TIGIT单克隆抗体制备
1.1动物免疫
选用6-8周龄BALB/c小鼠,饲养一周无异常后进行编号,经眼眶后静脉丛采血约0.1ml。室温静置1小时后4℃过夜,经1500g离心后取上层血清,-20℃保存备检。基础免疫用100μg的TIGIT-His重组蛋白(义翘神州)与等体积弗式完全佐剂乳化混匀,经腹部、背部皮下多点注射进行免疫。间隔3周进行加强免疫,等量TIGIT重组蛋白与弗式不完全佐剂乳化混匀,多点皮下注射进行免疫,加强免疫三次后,7天后经眼眶后静脉从采血检测血清效价,小鼠休息一个月,选取效价较高的小鼠腹腔注射TIGIT重组蛋白100μg进行冲击免疫,免疫后第3天处死小鼠,采集脾脏,迅速转移至液氮冻存备用。
1.2效价检测流程
TIGIT重组蛋白用包被缓冲液稀释成5μg/ml加入到96孔板酶标板中,100μl/孔,震荡混匀,保鲜膜封严,4℃过夜;洗板机洗三次,拍干酶标板,加入200μl/孔封闭液封闭非特异性结合位点,37℃,2h;洗板机洗三次,加入梯度稀释的血清100μl/孔,37℃反应2h;洗板机洗五次,加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L),100μl/孔,37℃反应1h;洗板机洗五次,以100μl/孔加入显色液37℃放置30min;加入终止液50μl/孔;用酶标仪测定OD450值。小鼠血清稀释度在1:16000,抗体检测阳性,选取OD450值较高的小鼠进行冲击免疫。
1.3scFv噬菌体抗体库构建和抗体筛选
从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,逆转录成cDNA,通过RT-PCR扩增抗体重链和轻链可变区(V)序列,采用重叠延伸拼接PCR法将编码抗体的重链和轻链可变区序列(VH和VL)拼接成编码scFv的核酸序列,将轻重链可变区通过linker进行连接,再通过限制性内切酶酶切连接到噬菌体载体中,电转化X-Blue感受态细胞,获得scFv噬菌体抗体库,库容不低于108。
ELISA法包被TIGIT重组蛋白对噬菌体库进行筛选,采用“淘洗-扩增-富集”循环方式,一般2轮以上得到阳性克隆。将ELISA检测阳性克隆PCR扩增,酶切分型后送测序,根据测序结果挑选适合的可变区序列。
1.4抗体表达载体构建
以噬菌体菌液或质粒为模板,采用PCR法获得扩增轻重链可变区片段,将可变区基因片段分别插入到带有轻重链信号肽及轻重链恒定区的表达载体中,获得完整的IgG重链(pCMV3-H)和轻链(pCMV3-L)表达载体。扩增质粒后转染HEK293细胞进行培养表达、抗体纯化等。
实施例2TIGIT抗体序列分析
通过scFv噬菌体抗体库筛选获得6个TIGIT单克隆抗体,命名为TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013。阳性克隆通过测序获得轻链和重链可变区序列。抗体可变区氨基酸序列分析通过IGBLAST软件分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/),发现scFv抗体属于VH类别和Vκ型;ABodyBuilder软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/abodybuilder/)在Kabat模式下进一步分析每个抗体VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)三个CDR区位置。
抗体重链可变区CDR(VHCDR)和轻链可变区CDR(VLCDR)氨基酸序列如下:
TIGIT-M001-VHCDR1、TIGIT-M001-VHCDR2、TIGIT-M001-VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6所示;
TIGIT-M001-VLCDR1、TIGIT-M001-VLCDR2、TIGIT-M001-VLCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14所示。
TIGIT-M003-VHCDR1、TIGIT-M003-VHCDR2、TIGIT-M003-VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.7所示;
TIGIT-M003-VLCDR1、TIGIT-M003-VLCDR2、TIGIT-M003-VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示。
TIGIT-M006-VHCDR1、TIGIT-M006-VHCDR2、TIGIT-M006-VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6所示;
TIGIT-M006-VLCDR1、TIGIT-M006-VLCDR2、TIGIT-M006-VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12以及SEQ ID NO.16所示。
TIGIT-M007-VHCDR1、TIGIT-M007-VHCDR2、TIGIT-M007-VHCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.6所示;
TIGIT-M007-VLCDR1、TIGIT-M007-VLCDR2、TIGIT-M007-VLCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15所示。
TIGIT-M011-VHCDR1、TIGIT-M011-VHCDR2、TIGIT-M011-VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示;
TIGIT-M011-VLCDR1、TIGIT-M011-VLCDR2、TIGIT-M011-VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.17所示。
TIGIT-M013-VHCDR1、TIGIT-M013-VHCDR2、TIGIT-M013-VHCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6所示;
TIGIT-M013-VLCDR1-3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13以及SEQID NO.17所示。
TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013的抗体重链和轻链可变区氨基酸序列如下:
TIGIT-M001的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示。
TIGIT-M003的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.21所示。
TIGIT-M006的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23所示。
TIGIT-M007的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.25所示。
TIGIT-M011的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.27所示。
TIGIT-M013的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.28以及SEQ ID NO.29所示。
六个抗体重链恒定区氨基酸序列均相同,其重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNO.30所示。
六个抗体轻链恒定区氨基酸序列均相同,其轻链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNO.31所示。
此外,编码抗体的核苷酸序列如下所示:
编码抗体重链可变区的核苷酸序列(下划线为信号肽编码序列):
TIGIT-M001的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示。
TIGIT-M003的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示。
TIGIT-M006的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示。
TIGIT-M007的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示。
TIGIT-M011的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示。
TIGIT-M013的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示。
六个抗体编码重链恒定区的核苷酸序列相同,重链恒定区的核苷酸序列如SEQ IDNO.44所示。
六个抗体编码轻链恒定区的核苷酸序列相同,重链恒定区核苷酸序列如SEQ IDNO.45所示。
如表1所示为本文所述的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列;
表1序列VHCDR1-3和VLCDR1-3序列表
表2TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013抗体序列表
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实施例3抗体表达及纯化鉴定
同一抗体轻链和重链表达载体同时瞬时转染HEK293细胞,转染后6-7天取培养上清,通过蛋白A纯化柱进行亲和纯化,获得纯化抗体。依据蛋白分子量计算器预测抗体分子量,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对抗体纯度和分子量进行鉴定。
SDS-PAGE电泳检测流程:分别取5μg纯化抗体,在非还原条件(蛋白电泳上样缓冲液不添加β巯基乙醇,样本不煮)和还原条件(蛋白电泳上样缓冲液添加β巯基乙醇,样本煮沸5min)下,利用10%SDS-PAGE胶进行电泳分离、染色、拍照记录。
SDS-PAGE检测结果(见图1):六个抗体重链的分子量预测约为49kDa,轻链的分子量预测约为24kDa,全IgG抗体的分子量预测约为146kDa。经SDS-PAGE电泳鉴定,蛋白分子量与预测分子量相近,抗体纯度良好,纯度在95%左右。
实施例4抗体特异性和敏感性鉴定
4.1抗体特异性鉴定
4.1.1ELISA法鉴定TIGIT抗体特异性
利用人TIGIT(Hu-TIGIT-His)、食蟹猴TIGIT(Cyn-TIGIT-hFc)、鼠TIGIT(Ms-TIGIT-hFc)、Hu-PD-1-His、Hu-PD-L1-His、Hu-CTLA4-His、Hu-CD137-His、和Hu-TIM-3-His重组蛋白鉴定TIGIT抗体的特异性。
ELISA检测流程:包被液包被Hu-TIGIT-His、Cyn-TIGIT-hFc、Ms-TIGIT-hFc、Hu-PD-1-His、Hu-PD-L1-His、Hu-CTLA4-His、Hu-CD137-His和Hu-TIM-3-His重组蛋白,1μg/ml,4℃过夜。次日,用洗板机加Wash Buffer工作液洗3次后,加入5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点,200μl/孔,37℃反应2小时。用洗板机洗3次后,加入用5%脱脂奶粉稀释为1μg/ml的TIGIT抗体(TIGIT抗体对照A15153G以及TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013),100μl/孔,于37℃反应2h。洗涤5次后,加入1:5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)37℃反应1h。洗涤5次后,加入TMB底物溶液,100μl/孔,37℃反应30min。加入终止液,50μl/孔。利用酶标仪测定OD450值。Graphpad软件分析检测结果。
其中:
包被液(BD OptEIACoating Buffer,51-2713KC)为pH9.5的0.1M碳酸钠;
洗液(BD OptEIAWash Buffer,51-9003739)20×浓缩洗液,用去离子水或者蒸馏水稀释成1×的工作液;
显色液A(BD OptEIA Substrate ReagentA,51-2606KZ)为含有过氧化氢的缓冲液;
显色液B(BD OptEIA Substrate ReagentB,51-2607KZ)含有3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)的有机溶剂;
终止液(BD OptEIA Stop Solution,51-2608KZ)1M硫酸;5%牛奶:5克牛奶加入100ml的1×PBS溶液中。
检测结果(见图2):六个TIGIT抗体均可以很好的识别人TIGIT和食蟹猴TIGIT重组蛋白,TIGIT-M001、TIGIT-M003和TIGIT-M013抗体与鼠TIGIT蛋白弱交叉结合,TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011抗体不与鼠TIGIT蛋白结合。提示TIGIT-M001/TIGIT-M003/TIGIT-M013抗体与TIGIT-M006、TIGIT007和M011抗体识别结合不同的TIGIT表位。
六个抗体不与人PD-1、PD-L1、CTLA4、CD137和TIM-3重组蛋白结合,提示TIGIT抗体识别结合TIGIT蛋白具有很好的特异性。商品化对照抗体A15153G仅结合人TIGIT蛋白,而不与食蟹猴和鼠TIGIT蛋白结合,提示该六个抗体识别结合的TIGIT表位与A15153G识别结合TIGIT表位不同。
4.1.2Westernblotting鉴定TIGIT抗体的特异性
通过western blotting方法,鉴定TIGIT抗体对非还原条件和还原条件下TIGIT重组蛋白结合特性。
Western blotting检测流程:分别取1μg的TIGIT-His重组蛋白,在非还原条件(蛋白电泳上样缓冲液不添加β巯基乙醇,样本不煮)和还原条件(蛋白电泳上样缓冲液添加β巯基乙醇,样本煮沸5min)下,利用10%SDS-PAGE胶进行电泳分离,150V,电泳约1h。电泳结束后进行转模,SDS-PAGE胶分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜,300mA,1h。转膜结束后用5%脱脂奶粉室温封闭2h。0.5μg/ml抗体(TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013)分别4℃过夜结合。PBST溶液洗膜3遍,5min/次。二抗加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L),室温反应1h。PBST洗涤去除未结合抗体。加入化学发光底物,凝胶成像仪记录检测结果。
检测结果(见图3):TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013抗体主要识别非还原条件的TIGIT重组蛋白,提示TIGIT抗体识别的主要是TIGIT蛋白构象表位;强曝光条件下还原条件TIGIT蛋白处有弱条带显现。
4.1.3流式细胞术检测细胞膜表面TIGIT蛋白
利用TIGIT-GFP重组质粒转染293FT细胞后表达于细胞膜表面的TIGIT蛋白通过流式细胞术进行鉴定。
流式细胞术检测流程:TIGIT-GFP重组质粒转染293FT细胞48h后,胰酶消化细胞制备单细胞悬液。备检细胞用PBS洗一遍,分别加入1μg/ml的小鼠抗人TIGIT抗体(TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013),室温反应30min,PBS洗1遍,加入1:1000稀释的AF647标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体,室温避光反应30min。PBS洗涤2遍,细胞重悬于200μl PBS溶液。利用BD LSRFortessaTM流式细胞仪进行检测,通过BDFACSDiva软件分析结果。
流式细胞术检测TIGIT-GFP重组质粒转染293FT细胞表面TIGIT蛋白结果(见图4):TIGIT抗体全部可与TIGIT重组质粒转染293FT细胞膜表面表达的TIGIT蛋白结合
4.2抗体敏感性鉴定。
TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013抗体检测TIGIT和GFP双阳性细胞(图4的右上象限细胞群)的比例分别为17.9%、18.2%、16.8%、19.1%、17.5%和17.0%,六个抗体检测TIGIT阳性细胞比例基本一致。
4.2.1间接ELISA检测TIGIT抗体检测TIGIT蛋白敏感性
检测流程:Hu-TIGIT-His、Hu-TIGIT-hFc重组蛋白分别以10倍梯度稀释(1000-0.001ng/ml)包被96孔酶标板,100μl/孔,4℃过夜。一抗加入1μg/ml的TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011、TIGIT-M013和对照抗体(A15153G)。其余步骤同所述ELISA检测流程。
ELISA敏感性检测结果(见图5):通过间接ELISA法,自主研制的TIGIT抗体及对照抗体A15153G检测TIGIT-His重组蛋白的敏感性为100ng/ml,检测TIGIT-hFc重组蛋白的敏感性为10ng/ml。自主研制的6个TIGIT抗体敏感性与市售的TIGIT抗体A15153G相似。
实施例5TIGIT抗体亲和力鉴定
抗体亲和力通过ForteBio Octet分子相互作用仪检测。TIGIT-hFc重组蛋白作为检测用抗原,应用FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器,并以TIGIT抗体A15153G作为对照抗体。
亲和力检测流程:FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器在平衡液中(0.1%BSA+0.02%Tween20的PBS溶液)预湿10分钟,将TIGIT-hFc重组蛋白用平衡液稀释为5μg/mL,加到避光96孔板第二列中,200μl/孔;将TIGIT抗体从250nM起始倍比稀释至31.3nM,加入避光96孔板第四列中,200μl/孔,设置抗体0nM空白对照,加入200μl平衡液。将平衡液加入第一列与第三列中,200μl/孔。ForteBio Octet分子相互作用仪检测,将传感器在第一列中平衡60s获得基础平衡曲线,然后在第二列中进行抗原固化100s。在第三列中进行洗涤120s,在第四列中结合抗体80s或180s获得结合曲线,回到第一列中解离300s,获得解离曲线。ForteBio Octet分析软件对曲线进行拟合分析,获得亲和力数值。
亲和力检测结果(见图6):通过ForteBio Octet系统对抗体亲和力进行测定,以不添加TIGIT蛋白的缓冲盐溶液作为空白对照,以市售TIGIT抗体A15153G作为检测对照。
数据分析后,抗体的亲和力KD值分别为9.28×10-12M(TIGIT-M001)、2.42×10-11M(TIGIT-M003)、1.26×10-11M(TIGIT-M006)、3.79×10-11M(TIGIT-M007)、1.40×10-11M(TIGIT-M011)、8.37×10-11M(TIGIT-M013)和3.51×10-9M(A15153G)。
曲线拟合优度R2分别为0.9720(TIGIT-M001)、0.9783(TIGIT-M003)、0.9815(TIGIT-M006)、0.8756(TIGIT-M007)和0.9368(TIGIT-M011)、0.8643(TIGIT-M013)和0.9442(A15153G)。自主研制的TIGIT抗体的亲和力显著高于市售商品化TIGIT抗体A15153G。
实施例6TIGIT抗体识别T细胞表面TIGIT蛋白的流式细胞术鉴定
取人外周血200μl,加入2ml红细胞裂解液,室温裂解10min。1500rpm,离心5min,弃上清。PBS洗涤沉淀1遍后,涡旋震荡重悬细胞沉淀。分别加入1μg的TIGIT抗体(TIGIT-M001、TIGIT-M003、TIGIT-M006、TIGIT-M007、TIGIT-M011和TIGIT-M013)室温反应30min;设置不加抗体的空白对照管。PBS洗1遍后加入1:1000稀释的AF647标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体,室温避光反应30min。PBS洗2遍后加入CD45 Percp、CD3 BV605、CD4 FITC、CD8 APC-H7抗体室温反应30min。PBS洗涤2遍,细胞重悬于200μl PBS溶液。利用BD LSRFortessaTM流式细胞仪进行检测,通过BDFACSDiva软件分析结果。
流式细胞术检测T细胞表面TIGIT蛋白结果(图7):分析选取CD45+CD3+T细胞进行进一步分析。结果显示TIGIT抗体全部可与CD8+T细胞和CD8—T细胞(主要为CD4+T细胞)表面TIGIT蛋白结合。TIGIT抗体可用于检测内源性免疫细胞膜表面的TIGIT蛋白。
Claims (10)
1.一种可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗人TIGIT单克隆抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)互补决定区序列,所述重链可变区和轻链可变区互补决定区分别含有CDR1、CDR2和CDR3;
其中重链可变区CDR区氨基酸序列如下所示:
VHCDR1氨基酸序列为SEQ ID NO.1;
VHCDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中的一组或多组;
VHCDR3氨基酸序列为SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7;
其中轻链可变区CDR区氨基酸序列如下所示:
VLCDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11中的一组或多组;
VLCDR2氨基酸序列为SEQ ID NO.12和/或SEQ ID NO.13;
VLCDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17中的一组或多组;
其中,当VHCDR1氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2氨基酸序列选择SEQ ID NO.2、VHCDR3氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1氨基酸序列选择SEQ ID NO.8、VLCDR2氨基酸序列选择SEQ ID NO.12、VLCDR3氨基酸序列选择SEQ ID NO.14时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M001,所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体为TIGIT-M001的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示;TIGIT-M001的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示;
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.3、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.7;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.9、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.15,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M003;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M003的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.21所示;TIGIT-M003的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示;
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.2、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.12、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.16;所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M006;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M006的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.23所示;TIGIT-M006的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示;
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.4、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.11、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.15时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M007;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M007的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.25所示;TIGIT-M007的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示;
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.5、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.17时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M011;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M011的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.27所示;TIGIT-M011的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示;
当VHCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.1、VHCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.2、VHCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.6;VLCDR1的氨基酸序列选择SEQ ID NO.10、VLCDR2的氨基酸序列选择SEQ ID NO.13、VLCDR3的氨基酸序列选择SEQ ID NO.17时,所述可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体为TIGIT-M013;所述可结合人TIGIT蛋白单克隆抗体TIGIT-M013的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO.28以及SEQ ID NO.29所示;TIGIT-M013的VH和VL核苷酸序列分别如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示。
2.如权利要求1所述的可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包含抗体恒定区Fc,所述恒定区包含重链恒定区和轻链恒定区;所述重链恒定区选自:IgD、IgE、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4中任意一种;所述轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区。
3.如权利要求1所述的可结合人TIGIT蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗原结合片段包括抗原结合的功能性片段,所述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv中的一种或多种。
4.一种编码如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
5.一种载体或宿主细胞,所述载体或宿主细胞包含编码如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
6.一种免疫偶联物,其包含如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.一种嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
8.一种组合物,所述组合物包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞或免疫偶联物。
9.如权利要求1-8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、免疫偶联物、嵌合抗原受体或其编码核酸分子、构建体或载体、经转化的免疫细胞和/或组合物在制备正向调节免疫细胞活性和/或提高免疫应答的药物中的应用。
10.一种检测TIGIT蛋白的试剂盒,所述试剂盒包括说明书和检测试剂,所述检测试剂包含本发明涉及的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、免疫偶联物、嵌合抗原受体或其编码核酸分子、构建体或载体、经转化的免疫细胞和/或组合物的试剂。
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