CN112851815B

CN112851815B - 抗bcma抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112851815B
Application number: CN202110269968.4A
Authority: CN
Inventors: 龙飞; 封金云
Original assignee: Xi'an Yufan Biotechnologies Co ltd
Current assignee: Xi'an Yufan Biotechnologies Co ltd
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN112851815A

Abstract

本发明提供了一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段、包含抗BCMA抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体、免疫细胞及药物。本发明还提供了一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段的制备方法及应用。本发明制备的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为全人源单链抗体，特异性更强，免疫原性更低，且可以特异性识别和结合BCMA阳性靶细胞，可为治疗与BCMA表达相关的疾病提供理论基础，从而应用于与BCMA表达相关的疾病的治疗与诊断。

Description

抗BCMA抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为靶向BCMA的高亲和力全人源单链抗体。

背景技术

BCMA(B cell maturation antigen，B细胞成熟抗原)是肿瘤坏死因子受体(TNF-receptor)超家族成员，又名CD269，它是由TNFRSF17基因编辑的一种B淋巴细胞成熟的标志蛋白。BCMA由184个氨基酸组成，其胞内区可与TRAF1，2，3相互作用并激活TRAF依赖的TNF-KB，JNK和P38 MAPK途径，胞外区富含半胱氨酸结构域，并能通过蛋白-蛋白的相互作用来传导细胞刺激信号。

BCMA主要表达于B淋巴细胞及浆细胞表面，在其他的组织细胞中几乎不表达。但是在恶性增殖的B淋巴细胞(如骨髓瘤细胞)中高度表达，同时它通过介导下游信号通路，在细胞的存活、增殖、转移和耐药中起关键性作用。这些特性使得它成为免疫治疗的一个靶点，特别是对于多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的治疗。

多发性骨髓瘤是一种常见的血液系统恶性肿瘤，据统计，MM约占所有人类恶性肿瘤的1％，占血液系统恶性肿瘤的10％。其病理状态体现为骨髓内成熟浆细胞恶性增殖，导致骨骼破坏、骨髓衰竭和肾脏损伤。由于BCMA特异性地表达在成熟B细胞表面，且它的过表达和激活状态与MM明确相关，因此可将BCMA视为MM药物开发的理想靶标。

近年来，针对MM的发病机制研究获得了很大的进展，但现有的化疗和造血干细胞移植等方法仍存在无进展生存率低、缺乏供体、复发率高等问题。因此MM依然被认为是不可治愈的疾病。本申请利用全人源抗体库对BCMA蛋白胞外区进行特异性抗体序列筛选，并进行功能验证从而确定能够治疗MM的特异性抗体，达到治愈疾病的目的。

全人源噬菌体展示技术是将人类的抗体基因扩增出来，再融合至噬菌体衣壳蛋白中，经噬菌体表达后形成抗体库。噬菌体抗体库的抗体丰富度高，通过配体的特异性亲和力，可最终筛选出高亲和力的特异性抗体。这相对于传统的筛选技术，在时间周期、抗体类型、筛选范围、经济成本等方面有着突出的优势。通过噬菌体展示技术获得的抗体，不仅去除了鼠源抗体的免疫原性，而且免去了人源化操作，筛选过程简单高效，能在较短时间内获取亲和力较强的全人源抗体。

抗体作为靶向治疗药物在治疗肿瘤及自身免疫系统疾病中已被证明是一种可靠及有效的选择。而做为小分子抗体的代表，单链抗体(scFv)因其具有抗原亲和活性、分子量小、穿透力强、易清除及免疫原性低等优点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。但目前，应用传统方法制备的单链抗体或人源化抗体进行诊断或治疗，在一定程度上会引起人抗鼠抗体反应(HAMA)。因此，本申请通过噬菌体展示技术筛选制备的全人源单链抗体，可以很好地解决该问题，其免疫原性更低，更加安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全人源的靶向BCMA的单链抗体，其包含重链可变区(VH)、柔性连接肽、轻链可变区(VL)。该单链抗体采用噬菌体展示技术筛选制备，经ELISA、免疫荧光分析验证，能够与BCMA抗原相结合，并可特异性结合或识别BCMA阳性靶细胞。

为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1～CDR-H3和/或轻链可变区的CDR-L1～CDR-L3，所述CDR-H1～CDR-H3为SEQ ID NO：9-11或与SEQ ID NO：9-11具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述的CDR-L1～CDR-L3为SEQ ID NO：12-14或与SEQ ID NO：12-14具有至少80％同一性的氨基酸序列。

优选的，所述的重链可变区为SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的氨基酸序列。

优选的，所述的轻链可变区为SEQ ID NO：16或与SEQ ID NO：16具有至少80％同一性的氨基酸序列。

优选的，所述的重链可变区和/或轻链可变区来源于人。

优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段还包含柔性连接肽，所述的重链可变区与轻链可变区通过柔性连接肽连接。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段结构为依次按照重链可变区、柔性连接肽和轻链可变区的顺序进行连接。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段结构为依次按照轻链可变区、柔性连接肽和重链可变区的顺序进行连接。

优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为单链。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：20，或者与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20具有至少80％同一性的氨基酸序列。

优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为全人源的。

优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段还包含如Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、(Fab’)₂、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体的片段。

本发明的第二方面，提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的胞外结构域包含本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的嵌合抗原受体还包含信号肽区、铰链区和跨膜区和/或胞内区。进一步优选为人的CD8α信号肽区、铰链区和跨膜区、人的4-1BB胞内区和人的CD3ζ胞内区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合抗原受体结构为按照信号肽、BCMAscFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区序列进行连接获得。

本发明的第三方面，提供了一种编码本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段或者本发明所述的嵌合抗原受体的核酸。

优选的，所述的编码抗BCMA抗体或其抗原结合片段的核酸为SEQ ID NO：17或SEQID NO：18，或者与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少80％同一性的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种编码本发明所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3氨基酸序列的核酸。

优选的，所述编码CDR-L1～CDR-L3的核酸序列为SEQ ID NO：6-8，或者与SEQ IDNO：6-8具有至少80％同一性的核苷酸序列。

优选的，所述的编码CDR-H1～CDR-H3的核酸序列为SEQ ID NO：3-5，或者与SEQ IDNO：3-5具有至少80％同一性的核苷酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种编码本发明所述轻链可变区或重链可变区的核酸。

优选的，编码所述轻链可变区的核酸为SEQ ID NO：2，或与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的核苷酸序列。

优选的，编码所述重链可变区的核酸为SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列。

本发明的第六方面，提供了一种包含本发明所述核酸的表达载体。

优选的，所述的核酸选自编码所述轻链可变区的核酸、编码所述重链可变区的核酸、编码本发明所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3氨基酸序列的核酸、编码抗BCMA抗体或其抗原结合片段，或者编码嵌合抗原受体的核酸。

优选的，所述的表达载体为原核表达载体。进一步优选的，所述的原核表达载体为大肠杆菌系列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达载体为pET-26b。

本发明的第七方面，提供了一种包含本发明所述核酸和/或所述表达载体的宿主细胞或重组慢病毒。

优选的，所述的宿主细胞可以是真核的或原核的。更优选的，所述的宿主细胞为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的宿主细胞为BL21。

本发明的第八方面，提供了一种免疫细胞，将编码本发明所述嵌合抗原受体的核酸序列转染至免疫细胞中表达获得。

优选的，所述的免疫细胞包括但不限于淋巴细胞(包括T细胞、B细胞)、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞。

本发明的第九方面，提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或诊断试剂缀合的本发明上述抗体或其抗原结合片段。

本发明的第十方面，提供了一种本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体、核酸、免疫细胞、表达载体、宿主细胞在制备抗体药偶联物或多功能抗体中的应用。

本发明的第十一方面，提供了一种药物，所述的药物包含本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、所述的嵌合抗原受体、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞或所述的免疫细胞中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的药物特异性靶向BCMA的肿瘤细胞。

优选的，所述的药物还包含药学上可接受的辅料。

优选的，所述的药物可以与其他治疗剂共同使用。进一步优选的，所述的其他治疗剂选自LAG-3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体或PD-L2抗体。

本发明的第十二方面，提供了一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：

(a)筛选重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列；

(b)采用编码柔性连接肽的核苷酸序列连接所述筛选的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，获得抗BCMA抗体或其抗原结合片段的全长核苷酸序列；

(c)将所述的全长核苷酸序列连接至载体骨架，获得表达载体；

(d)将所述的表达载体转化至宿主细胞，然后诱导其表达；

(e)获得抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列。

优选的，所述的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，或与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的核苷酸序列。

优选的，所述的编码柔性连接肽的核苷酸序列连接重链可变区和轻链可变区的顺序可以为重链可变区核苷酸序列、编码柔性连接肽的核苷酸序列、轻链可变区的核苷酸序列，或者，轻链可变区核苷酸序列、编码柔性连接肽的核苷酸序列、重链可变区的核苷酸序列。

优选的，所述的全长核苷酸序列为SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18，或与SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：18具有至少80％同一性的核苷酸序列。

优选的，全长核苷酸序列连接至载体骨架需要经过酶切的步骤。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的宿主细胞为BL21。

优选的，所述的重链可变区和轻链可变区的序列来源于人。

优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段来源于全人源的天然的噬菌体展示平台的抗体库中筛选的单克隆抗体。进一步优选的，以BCMA为固相，经3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，从全人源噬菌体抗体库中筛选到与抗原BCMA特异性结合的单链抗体

优选的，所述的制备方法还包括纯化和/或浓缩等步骤。

本发明的第十三方面，提供了本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞、免疫细胞、所述的嵌合抗原受体或所述的药物在制备诊断、预防和/或治疗与BCMA表达相关的疾病的产品中的应用。

优选的，所述的与BCMA表达相关的疾病为肿瘤。进一步优选的，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。

优选的，所述的产品包括试剂盒、芯片、抗体药偶联物或多功能抗体。

本发明的第十四方面，提供了一种检测样品中BCMA的方法，所述的方法包括将样品与本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段接触，然后检测BCMA与抗BCMA抗体或其抗原结合片段形成的复合物。优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记物。

本发明的第十五方面，提供了一种诊断肿瘤的方法，所述的方法包括取样，将样品与本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段接触，然后检测BCMA与抗BCMA抗体或其抗原结合片段形成的复合物。优选的，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记物。

本发明的第十六方面，提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，所述的方法包括向所述受试者施加有效量的本发明所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的T细胞或者药物。

与现有技术相比，本发明所述的抗BCMA全人源单链抗体具有以下有益效果：

(1)本发明所述的单链抗体为从构建的全人源Fab抗体文库中，淘选得到的靶向BCMA的全人源单克隆抗体，其相对于鼠源、人源化抗体，特异性更强，免疫原性更低。

(2)本发明所述的抗BCMA单链抗体具有高亲和力，与其他抗原(BSA)不能结合，其对BCMA具有良好的特异性。

(3)本发明所述的抗BCMA单链抗体能够有效结合BCMA阳性靶细胞，对于治疗与BCMA表达相关的疾病提供理论基础，尤其是适用于多发性骨髓瘤的治疗。

(4)通过构建原核表达载体，本发明所用表达载体及表达方案适合表达单链抗体，且相较于其他表达系统，操作简单且表达量高，也适用于表达多种可溶性蛋白。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“预防”是指通过施用本发明所述的产品来抑制症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明所述的产品的量或剂量。

本发明所述的肿瘤包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。

本发明所述的“同一性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以在不改变原序列结构或活性的前提下，根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与本发明所述的具体序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％、100％的同一性。例如，本发明所述的“与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的氨基酸序列”即为在不改变CDR区结构或活性的前提下，可以根据实际工作需要对SEQ ID NO：9进行调整，例如取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸等。其中，所述的至少80％包括但不限于80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％或100％。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：RNA提取电泳检测图，其中M为Marker；

图2：噬菌体库筛选多克隆噬菌体ELISA示意图；

图3：抗BCMA单链抗体B36 SDS-PAGE示意图；

图4：抗BCMA单链抗体B36与BCMA的结合能力示意图；

图5：动物模型体内肿瘤抑制检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道采购获得的常规产品。

实施例1：利用全人源噬菌体展示文库筛选靶向BMCA的特异性抗体

一、全人源噬菌体抗体文库构建

(1)采集60份健康人的外周血(约2500mL)，按照淋巴细胞分离液使用说明分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用血液总RNA提取试剂盒提取PBMC总RNA。取1μg RNA电泳，检测RNA纯度，结果表明RNA纯度良好(参见图1)。使用First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒进行逆转录，获得噬菌体展示库构建所需的cDNA模板。随后，使用设计合成的特异性引物，PCR扩增得到轻链全长片段VL，通过两轮巢式PCR得到特异性VHH片段，并通过Overlap PCR扩增得到VH全长片段，最终获得Fab形式的全长目的片段。

(2)将载体与全长目的片段分别用SfiI进行酶切，50℃过夜酶切，使用胶回收试剂盒回收目的片段与载体。随后，按照摩尔比例为载体：目的片段＝1:3进行连接反应。共进行了多次电转化，电转后立即加入预热的SOC培养基复苏，并将复苏液进行梯度稀释涂布平板测定库容量。通过计数平板上生长的单克隆个数，计算出发明人构建的全人源Fab噬菌体文库，其库容量为1E+11集落形成单位(cfu)，其库容足以进行抗体的筛选。随后，从涂布平板上随机挑取多个单克隆进行测序鉴定与分析，结果表明文库的目的片段插入率可到95％，文库多样性良好，可用于后续抗体的筛选。

二、抗BCMA全人源抗体的淘选

本发明使用的噬菌体展示文库为发明人构建的全人源的天然的Fab噬菌体抗体文库，其库容约为1E+11cfu，多样性良好，足以进行多种抗体的筛选。

噬菌体库淘选步骤如下：

1)抗原包被：将BCMA蛋白使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，共包被8孔，4℃包被过夜；

2)封闭：弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)，37℃封闭1h；

3)噬菌体文库孵育：弃封闭液，PBST洗涤3次，每孔中加入适量的原始文库，37℃孵育1h；

4)洗涤：吸出未与抗原BCMA结合的噬菌体，PBST洗涤5次，PBS洗涤5次。

5)洗脱：每孔加入100μL Gly-HCl洗脱液，室温静置10min；

6)中和：吸出洗脱液，迅速加入适量的Tris-HCl中和缓冲液中和洗脱液；

7)取20μL进行梯度稀释，涂布氨苄平板测定滴度，计算淘选回收率；

8)侵染：将中和后剩余的洗脱液侵染4mL处于对数期的E.coli TG1，混合均匀，37℃静置30min，加入10mL 2×YT培养基(含氨苄抗性及终浓度为2％葡萄糖)培养至对数期；

9)救援：按照20MOI(cell:phage＝1:20)加入辅助噬菌体M13KO7，37℃静置30min，5000rpm室温离心20min，将离心沉淀用40mL 2×YT(含氨苄抗性、卡那抗性)培养基重悬，放置37℃，220rpm培养14-16h；

10)沉淀及浓缩：将培养过夜的菌液5000rpm，4℃离心30min，将上清转移至新的离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后冰浴2h；5000g，4℃离心30min弃去上清，将沉淀用1mL PBS重悬，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或分析。

第二轮及以后每轮淘选，按照相同的量包被抗原。每轮均加入前一轮淘选浓缩的噬菌体，淘选条件为PBST洗15次(每轮多洗5次，以此类推)，PBS洗5次(共筛选4轮)。

实施例2：抗BMCA的特异性抗体鉴定与序列分析

一、阳性克隆筛选鉴定

(1)多克隆噬菌体ELISA(Polyclonal Phage ELISA)

经过四轮淘选，将每轮沉淀浓缩的噬菌体进行多克隆噬菌体ELISA，具体步骤如下：

1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为4μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；

2)封闭：弃去包被液，用PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)37℃封闭1h；

3)噬菌体孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，将每轮浓缩后的噬菌体使用封闭液按照1:10稀释，按照100μL/孔加入，37℃孵育2h；

4)二抗孵育：弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤3次，向每孔加入100μL用封闭液(1:3000)稀释的HRP-anti-M13，37℃孵育1h；

5)显色：弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min。

6)终止读数：每孔加入50μL 1M H₂SO₄终止显色，使用酶标仪读取OD450的吸光值。

结果：以OD450数值绘制柱状图，分析噬菌体的富集现象，如图2所示。

(2)单克隆噬菌体ELISA(Monoclonal Phage ELISA)

噬菌粒的救援：

1)从第四轮淘选滴度的平板上，随机挑取96个单克隆接种于1mL 2×YT中(含氨苄抗性)中，置于37℃，220rpm培养过夜；

2)将过夜培养的单克隆菌液按照1:100转接至1mL2×YT培养基中(含氨苄抗性)，37℃，220rpm培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)；

3)每个单克隆菌液中按照20MOI(cell:phage＝20)加入M13KO7辅助噬菌体，37℃静置30min，5000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用1mL 2×YT培养基(含氨苄，卡那抗性)重悬，置于30℃、220rpm培养过夜；

4)第二天8000rpm离心8min，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。

单克隆噬菌体ELISA：

1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；

2)封闭：弃包被液，用PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)37℃封闭1h；

3)噬菌体孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，每孔加入190μL经离心后的含重组噬菌体的上清，37℃孵育2h；

4)二抗孵育：弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用封闭液(1:3000)稀释的HRP-anti-M13，置于37℃孵育1h；

5)显色：弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min；

6)终止读数：每孔加入50μL 1M H₂SO₄终止显色，酶标仪读取OD450的吸光值。

结果：选择OD450(BCMA)/OD450(BSA)大于2.5的单克隆，挑选出初步的阳性克隆，并测序鉴定，将经测序鉴定正确的阳性克隆用于后续抗体制备。

二、BCMA特异性抗体的序列分析

根据测序结果，对抗体序列进行序列比对与分析。结果表明，经四轮淘选，共有5条抗体序列出现明显富集。随后，利用IMGT数据库，分别对上述5条序列的重链可变区与轻链可变区进行CDR区划分并比对分析，发现BCMA淘选得到的抗体序列同源性较高，差异较小。

实施例3：抗BCMA抗体的原核表达载体构建与可溶性表达

(1)抗BCMA抗体的序列来源与分析

根据实施例2中对抗BCMA抗体的序列分析结果，选取其中1条序列进行下一步抗体表达，并将抗体形式确定为单链抗体形式。通过IMGT对选取的序列重链可变区与轻链可变区进行分析，发现其重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；重链可变区CDR-H1核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；重链可变区CDR-H2核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；重链可变区CDR-H3核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。其轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；轻链可变区CDR-L1核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；轻链可变区CDR-L2核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区CDR-L3核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

(2)构建抗BCMA抗体的原核表达载体

通过PCR扩增出抗体的重链可变区与轻链可变区片段，同时引入柔性连接肽并在抗体序列C末端引入HA标签。随后，通过Overlap PCR扩增出全部的目的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，氨基酸序列SEQ ID NO：19所示。选择pET-26b作为表达载体，在其多克隆位点处，插入扩增的目的基因片段。由于pET-26b N端具有pel-B信号肽，C端具有His标签，进而诱导表达的抗体可分泌至周质空间进行可溶表达，同时具有HA和6×His标签，将此抗BCMA单链抗体命名为B36。

(3)抗BCMA抗体的诱导表达

1)将构建成功的重组质粒pET-26b-BCMA转化至BL21表达菌株中；

2)挑取单克隆接种至含氨苄抗性(终浓度为100μg/mL)LB培养基，37℃，220rpm培养；

3)待菌液培养至对数期，其OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，于16℃，220rpm的条件下进行过夜诱导表达；

(4)抗BCMA抗体的纯化

1)收集菌体：12000rpm离心10min收集菌体，弃去上清液；

2)弃离心上清，将细菌沉淀使用适量的PBS(pH 8.0)缓冲液重悬，进行超声破碎。待超声破碎结束后，12000rpm，4℃离心20min，收集离心上清；

3)将收集的上清使用0.22μm滤器进行过滤，使用Ni亲和填料进行上样，分别用20mM，50mM，100mM，200mM，500mM咪唑溶液进行梯度洗脱，经SDS-PAGE验证其纯度；

4)使用截留分子量为10kD的超滤离心管超滤浓缩抗体，并将其分装液氮速冻保存于-80℃。所得到的抗体BCMA C末端含HA标签与6×His标签。纯化得到的抗BCMA抗体经SDS-PAGE鉴定，检测结果如图3所示。

实施例4：ELISA测定抗BCMA抗体与抗原BCMA的亲和力

1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按照100μL/孔包被ELISA板，4℃包被过夜；

3)一抗孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)进行梯度稀释的抗体，37℃孵育2h；其中，抗体梯度稀释度如表1所示：

表1抗体梯度稀释度

4)二抗孵育：弃一抗孵育液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)按照1:3000稀释的鼠源anti-HA tag单克隆抗体，37℃孵育1h；

5)二抗(HRP标记)孵育：其二抗孵育液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)按照1:3000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；

6)显色：弃去二抗孵育液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min；

7)终止读数：每孔加入50μL 1M H₂SO₄终止显色，酶标仪读取OD450的吸光值。

检测结果如图4所示，本发明所述的抗BCMA抗体与抗原BCMA的EC₅₀为0.5nM，与BSA无非特异性结合，表明本发明所述的抗BCMA抗体可特异性结合BCMA，且结合力较强。

实施例5：免疫荧光鉴定抗BCMA抗体与BCMA阳性靶细胞的特异性结合

选取稳定表达BCMA的阳性细胞K562-BCMA用于实验组，其次鉴定了不表达BMCA的HT29细胞作为阴性对照组。为了检测抗BCMA抗体是否能结合阳性靶细胞。具体操作步骤如下：

1)选取稳定表达BCMA的阳性细胞K562-BCMA和阴性细胞HT29。前一天接种两种细胞，第二天待细胞汇合度达到80％后，弃掉孔中的培养液，用PBS溶液润洗细胞2次，弃除PBS溶液；

2)向细胞中加入3％PBSA(PBS+3％BSA)溶液室温封闭40min，用PBS漂洗细胞3次；

3)加入4％预冷的多聚甲醛，室温固定细胞10min，用PBS漂洗3次；

4)加入用封闭液稀释的抗体，放置4℃冰箱，孵育过夜；

5)第二天用PBS润洗细胞3次，10min/次，加入稀释的二抗(封闭液稀释，PE标记的anti-His)，稀释浓度为1:200，放置37℃避光孵育1h，用PBS润洗3次，15min/次；

6)将DAPI染色液按照1:2000稀释，染色细胞核，37℃孵育5min，用PBS润洗1次，于荧光显微镜下观察。

结果显示，抗BCMA抗体可以稳定的与BCMA阳性靶细胞结合。

实施例6：anti-BCMA-CD8α-41BB-CD3ζ基因序列的确定

抗人BCMA单链抗体的基因序列为实施例3所确定的人源单克隆抗体序列，bb02为阳性对照鼠源靶向人BCMA嵌合抗原受体(参考专利：WO2016094304 A2)。从NCBI网站数据库搜索到人的CD8α信号肽区、铰链区和跨膜区、人的4-1BB胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息。将上述序列在网站http://www.jcat.de/进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类基因表达。在信号肽基因序列氨基端引入Kozak序列和酶切位点，各段核苷酸序列送上海生工生物技术有限公司分别进行合成。

实施例7：慢病毒载体的构建

采用重叠PCR将上述合成的序列依次按信号肽、BCMAscFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区序列进行连接，形成完整的BCMA-CAR基因序列信息，获得CAR分子(下文称为“B36-BCMA-CAR、bb02-BCMA-CAR”)。

用EcoR I和BamH I双酶切BCMA-CAR的核苷酸序列，经T4 DNA连接酶连接插入改造后的慢病毒载体pLVX-EF1α-GFP-N1(Addgene)的EcoR I和BamH I酶切位点，转化到感受态DH5α大肠杆菌。将所获得的重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的BCMA-CAR序列比对验证序列是否正确。

实施例8：含anti-BCMA-CAR慢病毒的包装和滴度测定

用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取慢病毒包装载体共转染到293T细胞中，转染后收集细胞上清，经浓缩纯化，分装冻存于-80℃中保存，半年内有效。

按照预期的病毒滴度(MOI)，将病毒浓缩液梯度稀释后感染293T细胞，流式细胞仪统计阳性率，计算慢病毒滴度，供后期使用。

实施例9：慢病毒感染人的T细胞

用Ficoll分离液(天津灏洋)分离PBMC，CD3磁珠分选CD3+T细胞，用CD3/CD28磁珠激活(thermofisher)激活，用含5％AB血清和100IU/mL的X-VIVO(LONZA)培养基培养细胞，激活24h后用制备实施例8得到的病毒感染T细胞。

细胞感染后，每天观察细胞密度，适时补加含IL-2 300IU/mL的T细胞培养液，使T细胞扩增。感染72h后，荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况。由此获得感染了实施例8所述慢病毒的CAR-T细胞，命名为B36-CAR-T、bb02-CAR-T细胞，即BCMA特异性CAR-T细胞。

实施例10：动物模型体内肿瘤抑制检测

实验中利用PDX小鼠模型来验证CAR序列对肿瘤组织抑制作用。采用免疫缺陷型NSG小鼠，建立背部肿瘤模型。待肿瘤体积生长至100～200mm³时，将小鼠分成3组每组8只，分别注射B36-CAR-T细胞、bb02-CAR-T细胞和对照T细胞。从注射后的第3天开始，每隔4天测量小鼠体内肿瘤体积。小鼠体内肿瘤体积的变化趋势如图5所示，图5表明，B36-CAR-T和bb02-CAR-T对于肿瘤的抑制较为明显，本发明的B36-CAR-T可作为治疗靶向BCMA的相关疾病的候选药物。

最后说明的是，以上的具体实施例仅用于详细描述本发明的技术方案，但其只作为范例，本发明并不限于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何根据本发明原理进行修改和替代也可以达到同样效果。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 西安宇繁生物科技有限责任公司

<120> 抗BCMA抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 363

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggt 300

tatgatagaa gtggttacta cttccagcac tggggccagg gcaccctggt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 2

<211> 327

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgctgactc agccaccttc agtgtctggg acccccgggc agagggtcac catctcttgt 60

tctggaagca gctccaacat cggaagtaat attgtcaact ggtaccagca ggtccccgga 120

acggccccca aactcctcat ctatagtaat aatcagcggc cctcaggggt ccctggccga 180

ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc tccctggcca tccgcgggct ccagtctgac 240

gatgaggctg attattactg tgcagcatgg gatggcggcc cgcgtggcca ctatgtcttc 300

ggaactggga ccaaggtcag cgtccta 327

<210> 3

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaggcacct tcagcagcta tgct 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcatcccta tccttggtat agca 24

<210> 5

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgagagcgg gttatgatag aagtggttac tacttccagc ac 42

<210> 6

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agctccaaca tcggaagtaa tatt 24

<210> 7

<211> 9

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtaataat 9

<210> 8

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagcatggg atggcggccc gcgtggccac tatgtc 36

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Arg Ala Gly Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Phe Gln His

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile

1 5

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ser Asn Asn

1

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Ala Trp Asp Gly Gly Pro Arg Gly His Tyr Val

1 5 10

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Gly Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Phe Gln His Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln Ser Asp

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Gly Pro Arg Gly

85 90 95

His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Ser Val Leu

100 105

<210> 17

<211> 735

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggt 300

tatgatagaa gtggttacta cttccagcac tggggccagg gcaccctggt cactgtctcc 360

tcaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcggggggag gaggtagcgt gctgactcag 420

ccaccttcag tgtctgggac ccccgggcag agggtcacca tctcttgttc tggaagcagc 480

tccaacatcg gaagtaatat tgtcaactgg taccagcagg tccccggaac ggcccccaaa 540

ctcctcatct atagtaataa tcagcggccc tcaggggtcc ctggccgatt ctctggctcc 600

aagtctggca cctcagcctc cctggccatc cgcgggctcc agtctgacga tgaggctgat 660

tattactgtg cagcatggga tggcggcccg cgtggccact atgtcttcgg aactgggacc 720

aaggtcagcg tccta 735

<210> 18

<211> 735

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgctgactc agccaccttc agtgtctggg acccccgggc agagggtcac catctcttgt 60

tctggaagca gctccaacat cggaagtaat attgtcaact ggtaccagca ggtccccgga 120

acggccccca aactcctcat ctatagtaat aatcagcggc cctcaggggt ccctggccga 180

ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc tccctggcca tccgcgggct ccagtctgac 240

gatgaggctg attattactg tgcagcatgg gatggcggcc cgcgtggcca ctatgtcttc 300

ggaactggga ccaaggtcag cgtcctaggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggg 360

ggaggaggta gccaggtgca gctggtgcag tctggggctg aggtgaagaa gcctgggtcc 420

tcggtgaagg tctcctgcaa ggcttctgga ggcaccttca gcagctatgc tatcagctgg 480

gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag tggatgggaa ggatcatccc tatccttggt 540

atagcaaact acgcacagaa gttccagggc agagtcacga ttaccgcgga cgaatccacg 600

agcacagcct acatggagct gagcagcctg agatctgacg acacggccgt gtattactgt 660

gcgagagcgg gttatgatag aagtggttac tacttccagc actggggcca gggcaccctg 720

gtcactgtct cctca 735

<210> 19

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Gly Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Phe Gln His Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val

130 135 140

Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser

145 150 155 160

Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly

165 170 175

Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly

180 185 190

Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

195 200 205

Ala Ile Arg Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Ala Trp Asp Gly Gly Pro Arg Gly His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr

225 230 235 240

Lys Val Ser Val Leu

245

<210> 20

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ile Val

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln Ser Asp

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Gly Pro Arg Gly

85 90 95

His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Ser Val Leu Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

115 120 125

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val

180 185 190

Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly

210 215 220

Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

Claims

1.一种抗BCMA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1～CDR-H3和轻链可变区的CDR-L1～CDR-L3，所述CDR-H1～CDR-H3为SEQ ID NO：9-11所示氨基酸序列，所述的CDR-L1～CDR-L3为SEQ ID NO：12-14所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的重链可变区为SEQ ID NO：15所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的轻链可变区为SEQ ID NO：16所示氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段还包含柔性连接肽，所述的重链可变区与轻链可变区通过柔性连接肽连接。

5.根据权利要求1所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段为SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示氨基酸序列。

6.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外结构域包含权利要求1-5任一所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

7.一种编码权利要求1-5任一所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段或者权利要求6所述的嵌合抗原受体的核酸。

8.一种包含权利要求7所述核酸的表达载体。

9.一种包含权利要求7所述核酸和/或权利要求8所述表达载体的宿主细胞。

10.一种免疫细胞，其特征在于，将编码权利要求6所述嵌合抗原受体的核酸序列转染至免疫细胞中表达获得。

11.一种药物，其特征在于，所述的药物包含权利要求1-5任一所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求10所述的免疫细胞中的一种或两种以上的组合。

12.一种权利要求1所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，包括：

(a)筛选重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列；

(d)将所述的表达载体转化至宿主细胞，然后诱导其表达；

(e)获得抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

13.权利要求1-5任一所述的抗BCMA抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求10所述的免疫细胞或权利要求11所述的药物在制备诊断、预防和/或治疗与BCMA表达相关的疾病的产品中的应用；所述的与BCMA表达相关的疾病为肿瘤。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。