CN112851814B - 一种靶向bcma的全人源单链抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向BCMA的全人源单链抗体及其制备方法与应用。所述单链抗体是由一条柔性连接肽将重链可变区和轻链可变区连接而成，且轻链和重链的骨架区与CDR区序列均来源于人，其相对于鼠源、人源化抗体，特异性更强，免疫原性更低；对BCMA具有良好的特异性；可为治疗与BCMA表达相关的疾病提供理论基础，尤其适用于诸如多发性骨髓瘤的肿瘤的诊断和治疗。

Description

一种靶向BCMA的全人源单链抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向BCMA的全人源单链抗体及其制备方法与应用。
背景技术
BCMA(B cell maturation antigen，B细胞成熟抗原)是肿瘤坏死因子受体(TNF-receptor)超家族成员，又名CD269，它是由TNFRSF17基因编辑的一种B淋巴细胞成熟的标志蛋白。BCMA由184个氨基酸组成，其胞内区可与TRAF1、2、3相互作用并激活TRAF依赖的TNF-KB，JNK和P38 MAPK途径，胞外区富含半胱氨酸结构域，并能通过蛋白-蛋白的相互作用来传导细胞刺激信号。
BCMA主要表达于B淋巴细胞及浆细胞表面，在其他的组织细胞中几乎不表达。但是在恶性增殖的B淋巴细胞(如骨髓瘤细胞)中高度表达，同时它通过介导下游信号通路，在细胞的存活、增殖、转移和耐药中起关键性作用。这些特性使得它成为免疫治疗的一个靶点，特别是对于多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的治疗。
多发性骨髓瘤是一种常见的血液系统恶性肿瘤，据统计，MM约占所有人类恶性肿瘤的1％，占血液系统恶性肿瘤的10％。其病理状态体现为骨髓内成熟浆细胞恶性增殖，导致骨骼破坏、骨髓衰竭和肾脏损伤。由于BCMA特异性地表达在成熟B细胞表面，且它的过表达和激活状态与MM明确相关，因此可将BCMA视为MM药物开发的理想靶标。
近年来，针对MM的发病机制研究获得了很大的进展，但现有的化疗和造血干细胞移植等方法仍存在无进展生存率低、缺乏供体、复发率高等问题。因此MM依然被认为是不可治愈的疾病。全人源噬菌体展示技术是将人类的抗体基因扩增出来，再融合至噬菌体衣壳蛋白中，经噬菌体表达后形成抗体库。噬菌体抗体库的抗体丰富度高，通过配体的特异性亲和力，可最终筛选出高亲和力的特异性抗体。这相对于传统的筛选技术，在时间周期、抗体类型、筛选范围、经济成本等方面有着突出的优势。通过噬菌体展示技术获得的抗体，不仅去除了鼠源抗体的免疫原性，而且免去了人源化操作，筛选过程简单高效，能在较短时间内获取亲和力较强的全人源抗体。
抗体作为靶向治疗药物在治疗肿瘤及自身免疫系统疾病中已被证明是一种可靠及有效的选择。而作为小分子抗体的代表，单链抗体(scFv)因其具有抗原亲和活性、分子量小、穿透力强、易清除及免疫原性低等优点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。但目前，应用传统方法制备的单链抗体或人源化抗体进行诊断或治疗，在一定程度上会引起人抗鼠抗体反应(HAMA)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向BCMA的单链抗体及其制备方法和应用。此单链抗体经ELISA、免疫荧光分析验证，能够与BCMA抗原相结合，并可特异性结合或识别BCMA阳性靶细胞。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种靶向BCMA的单链抗体或其抗原结合片段，该单链抗体包括重链可变区(VH)、柔性连接肽、轻链可变区(VL)。
具体地，该单链抗体来源于全人源的天然的噬菌体展示平台筛选的单克隆抗体，其重链可变区和轻链可变区的序列均来源于人。
具体地，上述抗体具有选自如SEQ ID NO：8-10、14-16所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：8-10、14-16所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。
具体地，上述抗体的重链可变区的互补决定区具有选自如SEQ ID NO：8-10所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：8-10所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。
具体地，上述抗体的轻链可变区的互补决定区具有选自如SEQ ID NO：14-16所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：14-16所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体的重链可变区的互补性决定区CDR-H1～CDR-H3分别具有如SEQ ID NO：8-10所示的氨基酸序列，或分别与如SEQ ID NO：8-10所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体的轻链可变区的互补性决定区CDR-L1～CDR-L3分别具有如SEQ ID NO：14-16所示的氨基酸序列，或分别与如SEQ ID NO：14-16所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
在本发明另一个实施方式中，上述抗体具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上(具体如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％)同一性的氨基酸序列。
具体地，上述抗原结合片段可选自：Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、dsFv、scFv、Fd和Fd'片段等。
本发明还提供一种上述抗体的突变体或其抗原结合片段，其为将上述抗体的重链和/或轻链的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的抗体突变体。
本发明还提供一种编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸。
具体地，上述核酸具有选自如SEQ ID NO：5-7、11-13所示的核苷酸序列中的一种或多种核苷酸序列。
具体地，上述核酸包含编码上述抗体的重链可变区的互补性决定区的核酸，其具有如SEQ ID NO：5-7所示的核苷酸序列中的一种或多种核苷酸序列。
具体地，上述核酸包含编码上述抗体的轻链可变区的互补性决定区的核酸，其具有如SEQ ID NO：11-13所示的核苷酸序列中的一种或多种核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述核酸包含编码上述抗体的重链可变区的互补性决定区CDR-H1～CDR-H3的核酸，其分别具有如SEQ ID NO：5-7所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述核酸包含编码上述抗体的轻链可变区的互补性决定区CDR-L1～CDR-L3的核酸，其分别具有如SEQ ID NO：11-13所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述核酸包含编码上述抗体的重链可变区的核酸，其具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，上述核酸包含编码上述抗体的轻链可变区的核酸，其具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，上述核酸具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
在本发明另一个实施例中，上述核酸具有如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种载体，其包含本发明上述核酸。
具体地，上述载体可以为表达载体。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明上述核酸或上述载体。
具体地，上述宿主细胞可以为原核的或真核的，如，细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞等。
本发明还提供一种嵌合抗原受体，其胞外结构域包含本发明上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
优选的，所述的嵌合抗原受体还包含信号肽区、铰链区和跨膜区和/或胞内区。进一步优选为人的CD8α信号肽区、铰链区和跨膜区、人的4-1BB胞内区和人的CD3ζ胞内区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合抗原受体结构为按照信号肽、BCMAscFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区序列进行连接获得。
本发明还提供一种CAR-细胞，其包含本发明上述嵌合抗原受体。
具体地，上述CAR-细胞为免疫细胞，如T细胞、NK细胞、CTL细胞和调节性T细胞中的一种或多种。
本发明还提供一种重组慢病毒，其包含本发明上述载体。
本发明还提供一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或诊断试剂缀合的本发明上述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种上述抗体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)提供重组表达载体，该表达载体含有编码本发明上述抗体的核酸分子(例如本发明上述核酸)，以及，任选地，与该核酸分子可操作相连的表达调控序列；
(2)将所述表达载体转化宿主细胞；
(3)在适合该抗体表达的条件下培养所述宿主细胞；
(4)分离纯化获得所述抗体。
具体地，上述重组表达载体的制备包括：将编码上述抗体的核苷酸序列通过酶切连接至表达载体骨架上，获得重组表达载体。
具体地，上述表达载体为质粒载体，如pET-26b。
具体地，上述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，如BL21。
在本发明的一个实施方式中，上述编码上述抗体的核苷酸序列通过以下步骤获得：
1)从全人源噬菌体抗体库中筛选出重链可变区和轻链可变区序列；
2)依次按照编码重链可变区的核苷酸序列、编码柔性连接肽的核苷酸序列、编码轻链可变区的核苷酸序列进行连接，和/或依次按照编码轻链可变区的核苷酸序列、编码柔性连接肽的核苷酸序列、编码重链可变区的核苷酸序列进行连接，获得编码上述抗体全长片段的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，上述编码上述抗体全长片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：17或18所示。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明上述抗体或其抗原结合片段、编码核酸、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、CAR-细胞、重组慢病毒、免疫缀合物中任意一种或多种，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
具体地，上述药物组合物还可包含其他活性成分(如化疗药物)。
本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、编码核酸、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、CAR-细胞、重组慢病毒、免疫缀合物、药物组合物在制备诊断BCMA表达相关的疾病的试剂中的应用。
本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、编码核酸、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、CAR-细胞、重组慢病毒、免疫缀合物、药物组合物在制备治疗BCMA表达相关的疾病的药物中的应用。
具体地，上述BCMA表达相关的疾病为肿瘤，如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。
具体地，上述药物为靶向性药物。
具体地，上述药物可以为抗体药物偶联物或多功能抗体。
本发明还提供一种上述抗体或其抗原结合片段、编码核酸在制备本发明上述嵌合抗原受体、CAR-细胞中的应用。
本发明还提供一种治疗BCMA表达相关的疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明上述抗体或其抗原结合片段、编码核酸、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、CAR-细胞、重组慢病毒、免疫缀合物、药物组合物的步骤。
具体地，上述BCMA表达相关的疾病为肿瘤，如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。
具体地，上述受试者为待治疗的动物，特别是哺乳动物。
在本发明的一个实施方式中，上述受试者为灵长类动物。
在本发明的一个实施例中，上述受试者为人类。
上述治疗有效量将根据活性成分、疾病及其严重程度、以及受试者的年龄、体重、性别等而变化，本发明对此不做具体限定。
本发明利用全人源抗体库对BCMA蛋白胞外区进行特异性抗体序列筛选，并进行功能验证从而确定能够治疗MM的特异性抗体，达到治愈疾病的目的。
本发明通过噬菌体展示技术筛选制备的全人源单链抗体，可以很好地解决该问题，其免疫原性更低，更加安全。
与现有技术相比，本发明提供的靶向BCMA全人源单链抗体具有以下有益效果：
(1)该单链抗体为从构建的全人源Fab抗体文库中，淘选得到的靶向BCMA的全人源单克隆抗体，其相对于鼠源、人源化抗体，特异性更强，免疫原性更低；
(2)该单链抗体具有高亲和力，与其他抗原(BSA)不能结合，其对BCMA具有良好的特异性；
(3)该单链抗体能够有效结合BCMA阳性靶细胞，对于治疗与BCMA表达相关的疾病提供理论基础，尤其是适用于多发性骨髓瘤的治疗；
(4)通过构建原核表达载体，本发明所用表达载体及表达方案适合表达单链抗体，且相较于其他表达系统，操作简单且表达量高，也适用于表达多种可溶性蛋白。
附图说明
图1为本发明一实施例中RNA提取电泳检测图；
图2为本发明一实施例中噬菌体库筛选多克隆噬菌体ELISA示意图；
图3为本发明一实施例中抗BCMA单链抗体B48 SDS-PAGE示意图；
图4为本发明一实施例中抗BCMA单链抗体B48与BCMA的结合能力示意图。
图5：CAR-T细胞对靶细胞K562(图5A)、U266(图5B)、RPMI8266(图5C)的杀伤效果检测示意图；
图6：ELISA检测IFN-γ细胞因子水平示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道采购获得的常规产品。
实施例1：利用全人源噬菌体展示文库筛选靶向BMCA的特异性抗体
一、全人源噬菌体抗体文库构建
(1)采集60份健康人的外周血(约2500mL)，按照淋巴细胞分离液使用说明分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用血液总RNA提取试剂盒提取PBMC总RNA。取1μg RNA电泳，检测RNA纯度。结果如图1所示，结果表明RNA纯度良好。使用First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒进行逆转转录，获得噬菌体展示库构建所需的cDNA模板。随后，使用设计合成的特异性引物，PCR扩增得到轻链全长片段VL，通过两轮巢式PCR得到特异性VHH片段，并通过Overlap PCR扩增得到VH全长片段，最终获得Fab形式的全长目的片段。
(2)将载体与全长目的片段分别用SfiI进行酶切，50℃过夜酶切，使用胶回收试剂盒回收目的片段与载体。随后，按照摩尔比例为载体：目的片段＝1:3进行连接反应。共进行了多次电转化，电转后立即加入预热的SOC培养基复苏，并将复苏液进行梯度稀释涂布平板测定库容量。通过计数平板上生长的单克隆个数，计算出发明人构建的全人源Fab噬菌体文库库容量为1E+11集落形成单位(cfu)，其库容足以进行抗体的筛选。随后，从涂布平板上随机挑取多个单克隆进行测序鉴定与分析，结果表明文库的目的片段插入率可到95％，文库多样性良好，可用于后续抗体的筛选。
二、BCMA全人源抗体的淘选
本发明使用的噬菌体展示文库为发明人构建的全人源的天然的Fab噬菌体抗体文库，其库容约为1E+11cfu，多样性良好，足以进行多种抗体的筛选。
(1)噬菌体库淘选
1)抗原包被：将BCMA蛋白使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，共包被8孔，4℃包被过夜；
2)封闭：弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)，37℃封闭1h；
3)噬菌体文库孵育：弃封闭液，PBST洗涤3次，每孔中加入适量的原始文库，37℃孵育1h；
4)洗涤：吸出未与抗原BCMA结合的噬菌体，PBST洗涤5次，PBS洗涤5次；
5)洗脱：每孔加入100μL Gly-HCl洗脱液，室温静置10min；
6)中和：吸出洗脱液，迅速加入适量的Tris-HCl中和缓冲液中和洗脱液；
7)取20μL中和液进行梯度稀释，涂布氨苄平板测定滴度，计算淘选回收率；
8)侵染：将中和后剩余的洗脱液侵染4mL处于对数期的E.coli TG1，混合均匀，37℃静置30min，加入10mL 2×YT培养基(含氨苄抗性及终浓度为2％葡萄糖)培养至对数期；
9)救援：按照20MOI(cell:phage＝1:20)加入辅助噬菌体M13KO7，37℃静置30min，5000rpm室温离心20min，将离心沉淀用40mL 2×YT(含氨苄抗性、卡那抗性)培养基重悬，放置37℃，220rpm培养14-16h；
10)沉淀及浓缩：将培养过夜的菌液5000rpm，4℃离心30min，将上清转移至新的离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后冰浴2h；5000g，4℃离心30min弃去上清，将沉淀用1mL PBS重悬，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或分析。
第二轮及以后每轮淘选，按照相同的量包被抗原。每轮均加入前一轮淘选浓缩的噬菌体，淘选条件为PBST洗15次(每轮多洗5次，以此类推)，PBS洗5次(共筛选4轮)。
实施例2：靶向BMCA的特异性抗体鉴定与序列分析
一、阳性克隆筛选鉴定
(1)多克隆噬菌体ELISA(Polyclonal Phage ELISA)
经过四轮淘选，将每轮沉淀浓缩的噬菌体进行多克隆噬菌体ELISA，具体步骤如下：
1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为4μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；
2)封闭：弃去包被液，用PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)37℃封闭1h；
3)噬菌体孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，将每轮浓缩后的噬菌体使用封闭液按照1:10稀释，按照100μL/孔加入，37℃孵育2h；
4)二抗孵育：弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤3次，向每孔加入100μL用封闭液(1:3000)稀释的HRP-anti-M13，37℃孵育1h；
5)显色：弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min。
6)终止读数：每孔加入50μL 1M H2SO4终止显色，使用酶标仪读取OD450的吸光值。
结果：以OD450数值绘制柱状图，分析噬菌体的富集现象，如图2所示。
(2)单克隆噬菌体ELISA(Monoclonal Phage ELISA)
噬菌粒的救援：
1)从第四轮淘选滴度的平板上，随机挑取96个单克隆接种于1mL 2×YT中(含氨苄抗性)中，置于37℃，220rpm培养过夜；
2)将过夜培养的单克隆菌液按照1:100转接至1mL 2×YT培养基中(含氨苄抗性)，37℃，220rpm培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)；
3)每个单克隆菌液中按照20MOI(cell:phage＝20)加入M13KO7辅助噬菌体，37℃静置30min，5000rpm离心5min,弃去上清，沉淀用1mL 2×YT培养基(含氨苄，卡那抗性)重悬，置于30℃、220rpm培养过夜；
4)第二天8000rpm离心8min，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。
单克隆噬菌体ELISA：
1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按照100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；
2)封闭：弃包被液，用PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)37℃封闭1h；
3)噬菌体孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，每孔加入190μL经离心后的含重组噬菌体的上清，37℃孵育2h；
4)二抗孵育：弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用封闭液(1:3000)稀释的HRP-anti-M13，置于37℃孵育1h；
5)显色：弃去二抗，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min；
6)终止读数：每孔加入50μL 1M H2SO4终止显色，酶标仪读取OD450的吸光值。
结果：选择OD450(BCMA)/OD450(BSA)大于2.5的单克隆，挑选出初步的阳性克隆，并测序鉴定，用于后续抗体制备。
二、BCMA特异性抗体的序列分析
根据测序结果，对抗体序列进行序列比对与分析。结果表明，经四轮淘选，共有5条抗体序列出现明显富集。随后，利用IMGT数据库，分别对上述5条序列的重链可变区与轻链可变区进行CDR区划分并比对分析，发现BCMA淘选得到的抗体序列同源性较高，差异较小。
实施例3：抗体的原核表达载体构建与可溶性表达
(1)B48单链抗体序列来源与分析
根据实施例2中对靶向BCMA抗体的序列分析结果，选取其中1条序列进行下一步抗体表达，并将抗体形式确定为单链抗体形式。结合序列名称，将此抗BCMA单链抗体命名为B48。通过IMGT对选取的序列重链可变区与轻链可变区进行分析，发现其重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链可变区CDR-H1核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；重链可变区CDR-H2核苷酸序列如SEQID NO：6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；重链可变区CDR-H3核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。其轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；轻链可变区CDR-L1核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；轻链可变区CDR-L2核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区CDR-L3核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
(2)构建B48单链抗体的原核表达载体
通过PCR扩增出抗体的重链可变区与轻链可变区片段，同时引入柔性连接肽并在抗体序列C末端引入HA标签。随后，通过Overlap PCR扩增出全部的目的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，氨基酸序列SEQ ID NO：19所示。选择pET-26b作为表达载体，在其多克隆位点处，插入扩增的目的基因片段。由于pET-26b N端具有pel-B信号肽，C端具有His标签，进而诱导表达的抗体可分泌至周质空间进行可溶表达，同时具有HA和His标签。
(3)B48单链抗体的诱导表达
1)将构建成功的重组质粒pET-26b-B48转化至BL21表达菌株中；
2)挑取单克隆接种至含氨苄抗性(终浓度为100μg/mL)LB培养基，37℃，220rpm培养；
3)待菌液培养至对数期，其OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，于16℃，220rpm的条件下进行过夜诱导表达；
(4)B48单链抗体的纯化
1)收集菌体：12000rpm离心10min收集菌体，弃去上清液；
2)弃离心上清，将细菌沉淀使用适量的PBS(pH 8.0)缓冲液重悬，进行超声破碎；待超声破碎结束后，12000rpm，4℃离心20min，收集离心上清；
3)将收集的上清使用0.22μm滤器进行过滤，使用Ni亲和填料进行上样，分别用20mM，50mM，100mM，200mM，500mM咪唑溶液进行梯度洗脱，经SDS-PAGE验证其纯度；
4)使用截留分子量为10kD的超滤离心管超滤浓缩抗体B48，并将其分装液氮速冻保存于-80℃；所得到的抗体B48 C末端含HA标签与6×His标签；纯化得到的B48抗体经SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。
实施例4：ELISA测定单链抗体B48与抗原BCMA的亲和力
1)抗原包被：将BCMA蛋白及BSA蛋白(作为对照蛋白)使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按照100μL/孔包被ELISA板，4℃包被过夜；
2)封闭：弃包被液，用PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液PBSM(PBS+3％Milk)37℃封闭1h；
3)一抗孵育：弃封闭液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)进行梯度稀释的抗体B48，浓度梯度如表1所示，37℃孵育2h；
抗体梯度稀释度如表1所示：
表1抗体梯度稀释度
Figure BDA0002973883290000081
4)二抗孵育：弃一抗孵育液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)按照1:3000稀释的鼠源anti-HA tag单克隆抗体，37℃孵育1h；
5)二抗(HRP标记)孵育：其二抗孵育液，用用PBST洗涤3次，每孔加入100μL用1％milk(PBS+1％Milk)按照1:3000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；
6)显色：弃去二抗孵育液，用PBST洗涤3次，每孔加入100μL显色液，室温避光反应20min；
7)终止读数：每孔加入50μL 1M H2SO4终止显色，酶标仪读取OD450的吸光值。
结果如图4所示，抗体B48与BCMA的EC50为34nM，与BSA无非特异性结合，表明本发明的靶向BCMA的单链抗体可特异性结合BCMA。
实施例5：免疫荧光鉴定B48与BCMA阳性靶细胞的特异性结合
选取稳定表达BCMA的阳性细胞K562-BCMA用于实验组，其次鉴定了不表达BMCA的HT29细胞作为阴性对照组。为了检测抗体B48是否能结合阳性靶细胞。具体操作步骤如下：
1)选取稳定表达BCMA的阳性细胞K562-BCMA和阴性细胞HT29。前一天接种两种细胞，第二天待细胞汇合度达到80％后，弃掉孔中的培养液，用PBS溶液润洗细胞2次，弃除PBS溶液；
2)向细胞中加入3％PBSA(PBS+3％BSA)溶液室温封闭40min，用PBS漂洗细胞3次；
3)加入4％预冷的多聚甲醛，室温固定细胞10min，用PBS漂洗3次；
4)加入用封闭液稀释的B48抗体，放置4℃冰箱，孵育过夜；
5)第二天用PBS润洗细胞3次，10min/次，加入稀释的二抗(封闭液稀释，PE标记的anti-His)，稀释浓度为1:200，放置37℃避光孵育1h，用PBS润洗3次，15min/次；
6)将DAPI染色液按照1:2000稀释，染色细胞核，37℃孵育5min，用PBS润洗1次，于荧光显微镜下观察。
实施例6：anti-BCMA-CD8α-41BB-CD3ζ基因序列的确定
抗人BCMA单链抗体的基因序列为实施例3所确定的B48单克隆抗体序列，bb02为阳性对照鼠源靶向人BCMA嵌合抗原受体(参考专利：WO2016094304 A2)。从NCBI网站数据库搜索到人的CD8α信号肽区、铰链区和跨膜区、人的4-1BB胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息。将上述序列在网站http://www.jcat.de/进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类基因表达。在信号肽基因序列氨基端引入Kozak序列和酶切位点，各段核苷酸序列送上海生工生物技术有限公司分别进行合成。
实施例7：慢病毒载体的构建
采用重叠PCR将上述合成的序列依次按信号肽、BCMAscFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区序列进行连接，形成完整的BCMA-CAR基因序列信息，获得CAR分子(下文称为“B48-BCMA-CAR、bb02-BCMA-CAR”)。
用EcoR I和BamH I双酶切BCMA-CAR的核苷酸序列，经T4 DNA连接酶连接插入改造后的慢病毒载体pLVX-EF1α-GFP-N1(Addgene)的EcoR I和BamH I酶切位点，转化到感受态DH5α大肠杆菌。将所获得的重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的BCMA-CAR序列比对来验证序列是否正确。
实施例8：含anti-BCMA-CAR慢病毒的包装和滴度测定
用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取慢病毒包装载体共转染到293T细胞中，转染后收集细胞上清，经浓缩纯化，分装冻存于-80℃中保存，半年内有效。
按照预期的病毒滴度(MOI)，将病毒浓缩液梯度稀释后感染293T细胞，流式细胞仪统计阳性率，计算慢病毒滴度，供后期使用。
实施例9：慢病毒感染人的T细胞
用Ficoll分离液(天津灏洋)分离PBMC，CD3磁珠分选CD3+T细胞，用CD3/CD28磁珠激活(thermofisher)激活，用含5％AB血清和100IU/mL的X-VIVO(LONZA)培养基培养细胞，激活24h后用制备实施例8得到的病毒感染T细胞。
细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 300IU/mL的T细胞培养液，使T细胞扩增。感染72h后，荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况。由此获得感染了实施例8所述慢病毒的CAR-T细胞，命名为B48-CAR-T、bb02-CAR-T细胞，即BCMA特异性CAR-T细胞。
实施例10：杀伤效率检测
感染7-10天后进行细胞毒性检测实验，具体步骤如下：
利用LDH检测CAR-T细胞对K562、U266、RPMI8266的毒性；将各种细胞离心后，用无血清无酚红的X-VIVO培养基多次洗涤后计数，取5×103的K562、U266、RPMI8266细胞各100μL，铺板于96孔板内作为靶细胞，按效靶比(10:1、5:1、1:1)分别加入未转染的T细胞和CAR-T细胞，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养6h；加入裂解液作为阳性对照后250g离心5min，每孔取100μL培养上清，加入新的96孔板内，加入反应液，放于暗室中反应20-30min。
酶标仪490nm下测定，根据公式计算CAR-T细胞裂解靶细胞百分率：
Figure BDA0002973883290000091
CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率见图5；由图5可知，未转染CAR的T细胞对K562、U266、RPMI8266都无显著杀伤；CAR-T细胞对BCMA阴性细胞K562几乎没有杀伤能力，都能不同程度地杀伤BCMA的阳性靶细胞U266、RPMI8266，且B48-CAR-T的杀伤率优于bb02-CAR-T。
实施例11：IFN-γ的释放检测
分别将K562、U266和RPMI8266细胞按照5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔5×105细胞分别加入CAR-T、未转染的T细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养16h后；采用人IFN-γELISA检测试剂盒(北京义翘神州生物技术有限公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。CAR-T细胞与靶细胞共孵育后细胞因子IFN-γ的释放情况见图6。由图6可知：未转染CAR的T细胞与K562、U266和RPMI8266细胞共培养后几乎不分泌IFN-γ；CAR-T细胞与U266和RPMI8266细胞共培养后，上清中都能检测到不同浓度的IFN-γ，而与BCMA阴性细胞K562共培养后很少有细胞因子IFN-γ的释放。CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率见图6；由图6可知B48-CAR-T对靶细胞的杀伤效率优于bb02-CAR-T。
综合如图5、图6所示，BCMA CAR-T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞U266和RPMI 8226有很强的裂解效应，但对BCMA阴性细胞系K562不产生裂解。而对照T细胞对K562、U266和RPMI8226都不发生裂解，表明anti-BCMA CAR-T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞具有特异性识别和杀伤作用，且B48-CAR-T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞杀伤作用更明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
序列表
<110> 西安宇繁生物科技有限责任公司
<120> 一种靶向BCMA的全人源单链抗体及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaagatagca 300
gggggcgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ile Ala Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gacatccgga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggccagtca gaatataggt cacttcttgg cctggtatca acataaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg gaacttatta ctgccatcac tatgttactg tcccgcttac cttcggccaa 300
gggacacgag tggagattaa a 321
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly His Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Val Thr Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
attagttgga atagtggtag cata 24
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcaaagatag cagggggcgc ttttgatatc 30
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ala Lys Ile Ala Gly Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagaatatag gtcacttc 18
<210> 12
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gctgcatcc 9
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
catcactatg ttactgtccc gcttacc 27
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Gln Asn Ile Gly His Phe
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Ala Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
His His Tyr Val Thr Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaagatagca 300
gggggcgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc aggtggcggt 360
ggctcgggcg gtggtgggtc ggggggagga ggtagcgaca tccggatgac ccagtctcct 420
tccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccaggc cagtcagaat 480
ataggtcact tcttggcctg gtatcaacat aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540
tatgctgcat ccactttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 600
acagatttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttggaac ttattactgc 660
catcactatg ttactgtccc gcttaccttc ggccaaggga cacgagtgga gattaaa 717
<210> 18
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gacatccgga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggccagtca gaatataggt cacttcttgg cctggtatca acataaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg gaacttatta ctgccatcac tatgttactg tcccgcttac cttcggccaa 300
gggacacgag tggagattaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc ggggggagga 360
ggtagccagg tgcagctggt ggagtctggg ggagacttgg tacagcctgg ggggtccctg 420
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgccatgca ctgggtccgg 480
caagctccag ggaagggcct ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcata 540
ggctatgcgg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactcc 600
ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagct gaggacacgg ccttgtatta ctgtgcaaag 660
atagcagggg gcgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcctca 717
<210> 19
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ile Ala Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn
145 150 155 160
Ile Gly His Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Val
210 215 220
Thr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 20
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly His Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Val Thr Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Ala Gly Gly
210 215 220
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
225 230 235

Claims (21)

1.一种靶向BCMA的单链抗体或其抗原结合片段，所述单链抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述单链抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
2.如权利要求1所述的单链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单链抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；和/或，所述单链抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的单链抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单链抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：19或20所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段的核酸。
5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有选自如SEQ ID NO：5-7、11-13所示的核苷酸序列中的一种或多种核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
7.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
8.一种载体，其包含权利要求4-7任一项所述的核酸。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求4-7任一项所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.一种嵌合抗原受体，其胞外结构域包含权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
11.一种CAR-细胞，其包含权利要求10所述的嵌合抗原受体。
12.一种重组慢病毒，其包含权利要求8所述的载体。
13.一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或诊断试剂缀合的权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段。
14.一种权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括以下步骤：
（1）提供重组表达载体，所述表达载体含有编码所述抗体的核酸分子；
（2）将所述表达载体转化宿主细胞；
（3）在适合所述抗体表达的条件下培养所述宿主细胞；
（4）分离纯化获得所述单链抗体或其抗原结合片段。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO：17或18所示的核苷酸序列。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段、权利要求4-7任一项所述的核酸、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的CAR-细胞、权利要求12所述的重组慢病毒、权利要求13所述的免疫缀合物中的任意一种或多种，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
17.一种权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段、权利要求4-7任一项所述的核酸、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的CAR-细胞、权利要求12所述的重组慢病毒、权利要求13所述的免疫缀合物或权利要求16所述的药物组合物在制备诊断BCMA表达相关的疾病的试剂中的应用，所述BCMA表达相关的疾病为肿瘤。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。
19.一种权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段、权利要求4-7任一项所述的核酸、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求10所述的嵌合抗原受体、权利要求11所述的CAR-细胞、权利要求12所述的重组慢病毒、权利要求13所述的免疫缀合物或权利要求16所述的药物组合物在制备治疗BCMA表达相关的疾病的药物中的应用，所述BCMA表达相关的疾病为肿瘤。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。
21.一种权利要求1-3任一项所述的单链抗体或其抗原结合片段或权利要求4-7任一项所述的核酸在制备嵌合抗原受体或CAR-细胞中的应用。
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