CN105061596B - 人b淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物，属于基因工程抗体技术领域。本发明的抗Blys抗体的重链可变区含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述抗体的轻链可变区含有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸序列。本发明的抗Blys单克隆抗体的抑制Blys与受体结合活性，与现有技术产物Belimumab的活性相似，但与BLYS的亲和力优于现有技术产物Belimumab，对Blys有更强的抑制作用，极具临床应用和市场前景。

Description

人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物，属于基因工程抗体技术领域。

背景技术

Blys(B淋巴细胞刺激因子)，又称BAFF，属于肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)，是1999年发现的一种新的细胞因子。人BAFF基因定位于染色体13q32-q34，由6个外显子和5个内含子组成。其全长蛋白分子由285个氨基酸组成，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，单体成楔形样的“三明治”结构，缺少N-糖基化位点，跨膜区在47-73位氨基酸，133-285位氨基酸为其发挥功能的主要区域。可溶型Blys(soluble Blys，s Blys)是由膜型Blys在第132或133位氨基酸残基发生酶解脱落而形成，两者的生物学活性基本一致。Blys以同源三聚体的形式发挥生物学作用。Blys的受体共有三种，即TACI、BCMA和BR3，通过与受体结合调节着机体免疫平衡。

BLyS作为一种B淋巴细胞的共刺激因子，主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌产生，在活化的T细胞和树突状细胞中也有少量表达。Blys在B细胞发育、功能调节和自身免疫性疾病的发病中发挥重要作用，其缺陷或过量表达均可引起机体免疫失衡，从而诱发多种疾病，可能与某些自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)的发生有关。在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjsngren syndrome，SS)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等疾病患者血清中Blys水平明显升高，进一步证实BAFF过表达参与了这些疾病的发生和发展。

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)是一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病。常见的全身性自身免疫性疾病有系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjsngren syndrome，SS)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等。目前，对AD的治疗手段仍处于研究和探索中，主要是依赖免疫抑制剂等药物治疗，但疗程较长，发生药物不良反应较多见。结合基因工程和蛋白质工程技术的靶向抗体药物治疗正成为新兴的研究领域，有望为AD治疗提供新的策略。抗体与其靶点的结合是特异性的，能够起到介导免疫效应机制的作用，并且在血清中具有较长的半衰期。这些特性使抗体具有很强的治疗应用。

目前，FDA于2011年3月9日批准美国人类基因组公司开发的抗Blys单克隆抗体Belimumab上市，用于治疗SLE，成为50年来首个获准的用于治疗SLE的药物。Belimumab只针对BLyS刺激的B细胞，与化疗药物相比，大大降低了治疗过程中的副作用，因此为系统性红斑狼疮患者提供了一个安全有效的治疗方法。由于独家生产，病人需要花费高额的费用，目前一个病人用药一年的费用约在3万美元左右。所以，研发新的抗Blys单克隆抗体，从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种对Blys抑制活性更高的单克隆抗体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗Blys抗体的重链和轻链可变区，所述重链可变区的3个互补决定区氨基酸序列分别为，

CDR-H1：TFGMN(SEQ ID NO.1)；

CDR-H2：YISX₁GSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO.2)；

CDR-H3：LGDPLLRPKGNAMD(SEQ ID NO.3)；

所述轻链可变区的3个互补决定区氨基酸序列分别为，

CDR-L1：LASQTIG X₂X₃LA(SEQ ID NO.4)；

CDR-L2：AAT X₄X₅AD(SEQ ID NO.5)；

CDR-L3：QQLYSSPWT(SEQ ID NO.6)；

其中，X₁是S或P；X₂是T或K；X₃是W或N；X₄是S、K或R；X₅是L、F、K或P。

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、分别对应序列表中的Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、Xaa₅。

进一步，所述抗Blys抗体的重链和轻链可变区，还包含如(HC-FR1)-(CDR-H1)-(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3)-(HC-FR4)式所示在重链的互补决定区之间并置的可变重链框架区HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3，和HC-FR4；以及如(LC-FR1)-(CDR-L1)-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDR-L3)-(LC-FR4)式所示在轻链的互补决定区之间并置的可变轻链框架区LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3，和LC-FR4。

优选的，所述可变重链框架区和可变轻链框架区来自于人胚系(germline)基因。

更优选的，至少一个所述可变重链框架区和/或至少一个所述可变轻链框架区的氨基酸序列如下所示：

HC-FR1：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO.7)；

HC-FR2：WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO.8)；

HC-FR3：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO.9)；

HC-FR4：YWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.10)；

LC-FR1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO.11)；

LC-FR2：WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO.12)；

LC-FR3：GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO.13)；

LC-FR4：FGGGTKVEIK(SEQ ID NO.14)。

本发明第二方面公开了一种抗Blys抗体，包含重链和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别与前述重链和轻链可变区具有至少90％的整体序列同一性。

优选的，所述至少90％的整体序列同一性是指序列同一性为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

进一步，所述抗体的重链可变区的3个互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3其氨基酸序列分别与TFGMN(SEQ ID NO.1)、YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO.15)和LGDPLLRPKGNAMD(SEQ ID NO.3)具有至少90％的整体序列同一性；所述轻链可变区的3个互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3其氨基酸序列分别与LASQTIGTWLA(SEQ ID NO.16)、AATRKAD(SEQ ID NO.17)和QQLYSSPWT(SEQ ID NO.6)具有至少90％的整体序列同一性。

优选的，所述抗Blys抗体包含如下氨基酸序列所示的重链和轻链可变区片段：

重链可变区：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGDPLLRPKGNAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.18)；轻链可变区：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATRKADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.19)。

进一步，所述抗Blys抗体还包括免疫球蛋白的恒定区。

更优选的，所述抗Blys抗体，包含(a)一条重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；(b)一条轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。

进一步，所述抗BLYS抗体为单克隆抗体。

进一步，所述抗BLYS抗体为IgG。

优选的，所述抗BLYS抗体为人IgG。

更优选的，所述抗BLYS抗体为IgG1。

本发明第三方面公开了前述抗Blys抗体的重链和轻链，以及前述抗Blys抗体在制备治疗Blys相关性疾病的药物中的用途。

进一步，所述Blys相关性疾病为自身免疫性疾病(例如全身性自身免疫性疾病有人类系统性红斑狼疮SLE、干燥综合征SS和类风湿关节炎RA)，感染性疾病(例如AIDS)，或增殖性疾病(例如白血病，癌症和淋巴瘤)。

本发明抗Blys抗体的重链和轻链，以及抗Blys抗体还可以用于与Blys相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、全身性自身免疫性疾病有SLE、类风湿关节炎等医学和药学的应用研究。

本发明最后一方面公开了一种药用组合物，含有有效量的前述抗Blys抗体。

本发明所述抗Blys抗体可以为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及前述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

进一步，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体和/或稀释剂。

本发明还可以是一种试剂、试剂盒或芯片，包含前述的抗Blys单克隆抗体。

本发明还公开了采用抗Blys抗体来抑制Blys活性的方法，以及该抗体用于治疗Blys相关性疾病或使用含有该抗体的试剂盒进行Blys相关诊断与检测。

本发明的抗体可用基因工程技术制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。

一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A亲和色谱和其它柱色谱)、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。

本发明的有益效果是：本发明所提供的抗Blys单克隆抗体的抑制Blys与受体结合活性(见实施例2)，与现有技术产物Belimumab的活性相似，但是所述的抗Blys单克隆抗体与BLYS的亲和力优于现有技术产物Belimumab，是Belimumab的2倍，所述的抗Blys单克隆抗体抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖的活性优于现有技术产物Belimumab，本发明的单克隆抗体NMB04的IC50值为0.0062μg/ml，Belimumab的IC50值为0.0082μg/ml，表明本发明对Blys有更强的抑制作用。另外，本发明所提供的抗Blys单克隆抗体能显著抑制小鼠和食蟹猴体内B细胞的增殖。

附图说明

图1为scfv的抗体库的扩增方案；

图2为亲和力成熟克隆的噬菌体上清竞争性抑制Blys与IM9细胞表面受体结合的活性(其中，图2A为CDR-L1-LIB的筛选结果；图2B为CDR-L2-LIB的筛选结果；图2C为CDR-H2-LIB的筛选结果)；

图3为单克隆抗体与重组人BLYS的直接结合活性(所筛选的单克隆抗体NMB01的EC50＝0.02919nM，NMB04的EC50＝0.02291nM)；

图4为单克隆抗体竞争性抑制Blys与IM9细胞表面受体结合的活性(结果表明所筛选的单克隆抗体可以阻断Blys与IM9细胞的结合)；

图5为单克隆抗体的抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖的活性(NMB04的IC50＝0.006219μg/ml，Belimumab的IC50＝0.008249μg/ml)；

图6为单克隆抗体的亲和力常数测定(所筛选的单克隆抗体NMB04的亲合常数KD为7.38E-10M，Belimumab的亲合常数KD为1.37E-09M)；

图7为抗Blys抗体抑制重组人Blys诱导的小鼠体内脾脏B细胞增殖结果；

图8为抗Blys抗体减少食蟹猴体内血液，脾脏和肠系膜淋巴结中CD20+及CD21+细胞的百分率结果(其中，图8A为脾淋巴细胞结果，图8B为肠淋巴结细胞结果，图8C为血液淋巴细胞结果)。

具体实施方式

以下结合附图1-8对本发明的原理和特征进行描述。在进一步阐述本发明之前,我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。

本发明中提到的参考著作、专利、专利申请及科学文献，构成本领域技术人员的已有知识，作为整体在此引入作为参考，与这些文献专门单个引入作为参考时的范围相同。在本申请所引入文献与本说明书特定含义之间如有任何抵触，都应该以后者为准。另外，本领域对词汇和短语定义的已有理解与本说明书中对该词汇或短语的专门解释而下的定义之间如有抵触，都以后者为准。

氨基酸残基的缩写是本领域中所使用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母或1字母代码。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd，或者双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。

抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A-184187、GB2188638A或EP.A-239400。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明所述抗体、单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区(也称为互补决定区)CDR1、CDR2和CDR3外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。

术语“单克隆抗体(MAbs)”和“单抗”在本文中可以互换使用，是指对于特定抗原的抗体的同类群体并且该抗体仅包含一种类型的抗原结合位点并且只结合抗原决定簇上的一个表位。通过本领域技术人员所公知的方法可以获得对于特定抗原的单克隆抗体。例如单克隆抗体可以通过杂交瘤法，或重组DNA法制备。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。

目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。

抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂合抗体(例如，Lanzavecchia等,Eur.J.Immunol.，1987；17,105)，以及以单链形式(例如，Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；85,5879和Bird等,Science,1988；242,423,在此引用作为参考)存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区(也称为“互补决定区”或CDR)组成，这些超变区被框架区(FR)间隔。框架区和互补决定区的范围已被精确定义(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"E.Kabat等,U.S.Departmentof Health and Human Services,1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat系统。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。

“嵌合抗体”是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如γ1和γ3。当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。

在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用KD(解离常数)来表征，它低于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或者约10^-12M或更低。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按Kabat系统。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，它们都是指任何长度的聚合形式的氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、通过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列，带有或不带有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；带有免疫标签的蛋白；带有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶、荧光素等等作为融合伴侣的融合蛋白等等。多肽可以具有任何大小，术语“肽”是指长度为8-50个残基(如8-20个残基)的多肽。

“亲本”抗体是指作为氨基酸取代的靶抗体。在某些实施方案中，抗体会将氨基酸“赠捐”给亲本抗体以生成改变的抗体。

术语“抗Blys抗体”是与Blys以足够的亲和力以及特异性结合的抗体。

术语“药学上可接受的载体”指一种或多种有机或无机成分，它可以是天然的或合成的，与抗体组合后可促进其应用。可接受的载体包括无菌的生理盐水或是其它药学上可获得的且为本领域所熟知的水或非水的等渗溶液或灭菌混悬剂。

实施例1制备表达抗人Blys单抗的杂交瘤细胞及其基因克隆

通过杂交瘤细胞技术制备鼠源单克隆抗体。有关实验方案参见文献(Ed Harlow,David Lane.Antibody:A laboratory manual.1988)。

首先通过重组技术制备Blys-His(含6×His标签)融合蛋白。将Blys-His的DNA序列克隆入PCDNA3.1(Invitrogen),转染该质粒进入CHO-K1(ATCC No.CCL-60)细胞株，经过G418(GIBCO)加压筛选，获得Blys-His稳定表达细胞株，无血清培养基培养细胞，收集培养上清液，用NI柱(QIAGEN)纯化表达的Blys-His融合蛋白。

用纯化的Blys-His(作为抗原组分)与完全弗氏佐剂(Sigma)混合进行腹腔注射，对BALB/c小鼠进行首次免疫，此后，分别在第14d和第35d，用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后腹腔注射对小鼠进行加强免疫，第56d用纯化的Blys-His(PBS稀释)对BALB/c小鼠静脉注射进行最终免疫，4天后取脾脏进行融合。

将鼠脾细胞与SP2/0细胞(ATCC No.CRL-1581)按5：1比例融合，在96孔板(Corning)中以HAT(GBICO)培养基培养，然后进行杂交瘤细胞筛选，所得细胞克隆进行结合筛选。

鉴定筛选过程分为两个步骤：①将Blys-His固定化于96孔酶联免疫吸附板(Costar)上，加入克隆表达上清孵育1h后，用PBST洗涤3次，使用羊抗鼠IgG抗体-HRP(Jackson Immuno)鉴定具有Blys结合活性细胞克隆上清，从而获得可与Blys直接结合的阳性克隆。②随后将步骤①中的阳性克隆转移入24孔板(购自康宁公司)培养，以获得更多的表达产物。将IM9细胞(ATCC No.CCL-159，其Blys受体过表达)固定于Poly-lysine 96孔板(NUNC)上，加入生物素化的Blys和克隆表达产物共同孵育1h，再用PBS洗涤3次，使用EU标记的链亲和素(购自Perkin Elmer公司)检测生物素化的Blys的含量，以鉴定克隆对Blys受体结合活性的抑制作用，从而鉴别出能够阻断Blys与其受体结合的阳性克隆。

将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解，提取mRNA后逆转录得cDNA。以此cDNA为模板，采用PCR方法分别扩增出鼠IgG抗体的轻链和重链可变区核酸序列，对重链可变区、轻链可变区进行分析，其编码的重链可变区含有SEQ ID NO.1的亲本序列(TFGMN)、SEQ IDNO.15的亲本序列(YISSGSSTIYYADTVKG)和SEQ ID NO.3的亲本序列(LGDPLLRPKGNAMD)、轻链可变区含有SEQ ID NO.16的亲本序列(LASQTIGTWLA)、SEQ ID NO.22的亲本序列(AATSLAD)和SEQ ID NO.6的亲本序列(QQLYSSPWT)。

然后，通过序列末端互补的方法，拼接重链可变区或轻链可变区与其对应的人源抗体的恒定区序列，将全长的嵌合抗体的重链和轻链片段，均包含信号肽，分别克隆入PCDNA3.1(购自Invitrogen公司)质粒。共转染轻、重链质粒至293C18细胞株(ATCC No.CRL-10852)，培养7天后，用Protein A(GE)纯化上清，最终获得重组表达的抗人Blys的嵌合抗体，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的重链和SEQ ID NO.24所示的轻链。

实施例2抗体人源化

分析鼠源抗体序列，与IMGT的人胚系(germ line)基因比对，确定X59315为轻链人源化框架序列，M99675为重链人源化框架序列。通过CDR-grafting，将重链和轻链的CDR并置到构架序列，构建人源化抗体，编号为NMB01,其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。

通过序列末端互补的方法，将重链可变区或轻链可变区拼接至其对应的人源抗体的恒定区序列。扩增的抗体重链和轻链全长片段(包含信号肽)分别克隆入PCDNA3.1(Invitrogen)质粒。共转染轻、重链质粒至293C18细胞株(ATCC No.CRL-10852)，培养7天后，用Protein A(GE)纯化上清，最终获得重组表达的NMB01抗体。

实施例3抗体亲和力成熟

采用PCR方法，将NMB01抗体的重链可变区和轻链可变区，通过LINKER连接在一起，构建scfv，并将scfv连接到噬菌体质粒中。分析鼠源抗体CDR的DNA序列，确定可变区CDR中的突变位点。设计引物序列，将突变位点所在的引物位置设计为NNS(引物序列如下表1所示)，使之编码任意的氨基酸。以NMB01抗体scfv为模板，PCR扩增scfv抗体库，方案如图1所示，将scfv的抗体库，通过sfiI酶切位点，构建到噬菌体质粒中，共构建三个二级抗体库，分别为CDR-L1-LIB,CDR-L2-LIB和CDR-H2-LIB。

表1引物序列

注释：S表示C或G；N表示A、C、G或T。

然后通过噬菌体展示进行高亲和力抗体筛选，具体操作如下：

a.通过电转化，将含scfv的抗体库的噬菌体质粒转化到大肠杆菌TG1中，经过37度，220rpm，1h的恢复后，将辅助噬菌体(helper phage，购自NEB公司)加入到剩余的菌液中，另加入氨苄西林(Ampicillin)，37度，220rpm，1h。2500rpm×5min离心去上清，用2×YT-AK培养基吹悬菌泥，37度，220rpm过夜培养。

b.包被抗原：用包被缓冲液稀释BLYS-His，混匀加入到免疫管中，4度包被过夜。

c.重组噬菌体收集：上述过夜培养菌液，2500rpm×5min离心，收集上清10ml，加入2ml PEG/NaCl，混匀放置冰上30-60min，10000g×20min离心，去上清，用2×YT培养基溶解噬菌体库。

d.封闭：免疫管用PBS洗两次，加入封闭液，室温1h。另外，取等体积封闭液与噬菌体库混合，室温封闭10-15min。

e.孵育噬菌体库：免疫管用PBS洗2次，加入封闭好的噬菌体库，37度培养箱2-3h。

f.洗脱：取100ul TG1菌液(前一天接种)到10ml 2×YT中，37度，220rpm培养到A600值0.4-0.5。用PBST洗涤免疫管8次，再用PBS洗2次,加入5ml对数期生长的菌液，37度,220rpm,1h。

g.OUTPUT:稀释上述菌液10^-1,10^-2，分别取100ul涂平板。

h.INPUT:取稀释10^-2,10^-4,10^-6的重组噬菌体库各1μl，加入到100μl对数期生长的菌液中，37度,220rpm,1h，然后将感染的菌液涂平板。

i.下一轮筛选：取200μl helper phage加入到5ml洗脱后的菌液中，同时加入5μl氨苄西林(Ampicillin)，37度，220rpm，1h。2500rpm×5min离心去上清，用10ml 2×YT-AK吹悬菌泥，37度，220rpm过夜培养。重复步骤b-h。

经过三轮筛选，挑选单克隆，制备重组噬菌体，通过IM9细胞结合抑制方法，检测重组噬菌体活性，具体如下：

a.IM9细胞在完全培养基中培养到对数生长期，然后，接1×10⁵个细胞/孔到poly-lysine 96孔板，3000rpm离心5min使细胞固定到孔板，然后室温10min。

b.用PBS洗涤细胞，每孔加入250μl 1％BSA(PBS稀释)，室温封闭1小时。

c.50μl phage上清与50μl生物素化BLYS(100ng/ml)预混合，加入到IM9包被的孔板中，室温1小时。

d.先用PBST洗三次，然后用PBS洗一次。

e.加入100ng/ml铕标记的链霉亲和素(Europium-labeled streptavidin)，室温1小时。PBST洗3次，加入100μl增强溶液(enhancement solution)，轻微振荡5分钟。

f.检测:337nm(激发光)/620nm(发射光)检测荧光。

挑选阳性克隆，送测序，通过PCR，重链可变区或轻链可变区拼接至其对应的人源抗体的恒定区序列，扩增的抗体重链和轻链全长片段(包含信号肽)分别克隆入PCDNA3.1(Invitrogen)质粒。共转染轻、重链质粒至293C18细胞株(ATCC No.CRL-10852)，培养7天后，用Protein A(GE)纯化上清，最终获得亲和力成熟抗体。

结果显示，通过IM9细胞结合抑制方法，筛选阳性克隆(图2A-C)，并进行测序，共鉴定出7株序列不同的亲和力成熟克隆，克隆的重链和轻链可变区序列如下表2所示，其中，CDR-L1-LIB筛选到1个克隆,CDR-L2-LIB筛选到5个克隆，CDR-H2-LIB筛选到1个克隆。另外，构建NMB02，NMB04，NMB05，NMB08的全长抗体表达质粒，通过瞬转293C18细胞，制备纯化抗体。为制备用于体内实验的抗体，将NMB04全长抗体表达质粒，共转染入中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1)，通过G418加压筛选，获得稳定细胞池。细胞经过摇瓶发酵7天后，用Protein A(GE)纯化上清，获得亲和力成熟抗体。

表2亲和力成熟克隆氨基酸序列

实施例4单克隆抗体的体外活性测定

抗Blys抗体通过结合Blys从而阻断其与受体的结合，来抑制Blys信号通路。体外活性包括，抗体直接结合BLYS的活性，抗体抑制Blys与受体结合和抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖。

一、抗体结合活性

将Blys-His包被于96孔酶联免疫吸附板(购自Costar公司)上，然后将1:4系列稀释单克隆抗体加入包被Blys-His板的孔中，加入鼠抗人IgG抗体-HRP(购自JacksonImmuno)，显色进行检测。结果显示所筛选的单克隆抗体直接结合EC50达10-100pM水平(试验结果见图3)。

二、抗体抑制Blys与受体结合活性

将IM9细胞(ATCC No.CCL-159，其Blys受体过表达)固定于Poly-lysine96孔板(购自NUNC)上，1:3系列稀释的抗体和生物素化的Blys共同孵育1h，再用PBS洗涤3次，使用荧光标记的链亲和素(Perkin Elmer)检测(参考Kevin P.Baker,Bryan M.Edwards.Generationand Characterization of LymphoStat-B,a Human Monoclonal Antibody ThatAntagonizes the Bioactivities of B Lymphocyte Stimulator.ARTHRITIS&RHEUMATISM.Vol.48,No.11,November 2003,pp 3253–3265)。结果显示所筛选的单克隆抗体可以阻断Blys与IM9细胞的结合(见图4)。

参照上述实验方法，测定单克隆抗体和Belimumab(商品名Benlysta)的IC50值即半数抑制浓度，结果表明(见图4下表)，NMB04和NMB05，与Belimumab有相似的竞争抑制活力。

三、抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖

将1:2系列稀释的不同抗体和Blys(终浓度3ng/ml)共同孵育2.5h，加入到含5000个鼠脾细胞的96孔板(购自corning)中，加入LPS(购自sigma，终浓度5μg/ml)进行刺激，在培养箱培养72小时，用CellTiter-Glo(购自promega)检测细胞活性。采用Graph pad进行四参数非线性回归拟合，计算IC50。结果显示所筛选的单克隆抗体可以抑制Blys刺激的鼠脾细胞增殖(见图5)，而且单克隆抗体NMB04的抑制活性优于Belimumab的活性，NMB04的IC50值即半数抑制浓度为0.0062μg/ml，Belimumab的IC50值为0.0082μg/ml。

实施例5单克隆抗体的亲和力测定

采用BIAcore T200测定单克隆抗体与Blys的亲合常数KD,首先，将羊抗人IgG固定在CM5芯片上，以10μl/min加入10μg/ml的单克隆抗体，持续100秒，然后，以30μl/min流速加入300nM的BLYS，持续300秒，观察解离情况，持续600秒。Biacore T200分析软件，分析抗体的亲合常数KD，KD为kd/ka。结果显示(试验结果见图6)，NMB04的亲合常数KD为7.38E-10M，为Belimumab的两倍。

实施例6单克隆抗体的体内活性测定

抗Blys抗体通过结合Blys从而阻断其与受体的结合，来抑制Blys刺激的B细胞增殖。体内活性包括，小鼠体内活性实验与食蟹猴体内药效的研究。

一、小鼠体内活性实验

通过注射重组人Blys蛋白(购自义翘神州)，刺激BALB/c小鼠脾B细胞的激活和增殖，考察Blys抗体抑制脾B细胞的激活和增殖。第1天，给予BALB/c小鼠静脉注射5mg/kg的抗体，1小时后，腹腔注射0.3mg/Kg重组人BLYS蛋白，第3天，重复第1天操作，第4-7天，每天腹腔注射0.3mg/Kg重组人BLYS蛋白，第8天，分离小鼠脾细胞，利用BD FACSCalibur流式细胞仪检测成熟B细胞(B220+/ThB+)比例。

结果如图7所示，与对照组相比，NMB04抗体显著抑制人BLYS诱导的体内脾B细胞的激活和增殖。

二、食蟹猴体内药效的研究

选择检疫合格、体重相近的雄性食蟹猴6只，使用计算机系统，随机分成3组，分别为对照组，Belimumab组和NMB04组，每组2只。缓慢静脉推注给药，0.5-2mL/min，每只动物恒定给药时间10min。给药频率及期限：每周给药一次，共给药4次，即D1、D8、D15和D22各给药一次。给药方式如下表3所示。

表3试验方法

末次给药后7天(D29)，所有动物非注射给药肢静脉取血，每只取血量约1mL。EDTA-K2抗凝，利用BD FACSCalibur流式细胞仪测定血液中CD3+、CD3+/CD4+、CD20+及CD21+占总淋巴细胞数的百分率。

末次药后7天(D29)，所有动物安乐死后，取脾脏及肠系膜淋巴结，用眼科剪将脾组织剪成0.2～0.3cm左右的小块，分离肠系膜淋巴结，分别置入尼龙筛网，用5mL注射器活塞的橡胶头积压组织，使组织细胞通过筛网，台盼蓝拒染法测定细胞活力和细胞数。4℃、800g、10min离心细胞并用PBS洗涤2～3次，重悬细胞至1.0×10⁶个/mL左右。收集的单细胞悬液在24h内测定。

利用BD FACSCalibur流式细胞仪测定脾脏细胞悬液、肠系膜淋巴结淋巴细胞悬液中CD3+、CD3+/CD4+、CD20+及CD21+占总淋巴细胞数的百分率。

试验结果见图8，动物给予相同剂量的NMB04和Belimumab，脾脏中CD3+及CD3+/CD4+百分率未见明显变化，CD20+及CD21+的百分率略有下降。血液中CD3+及CD3+/CD4+百分率未见明显变化，CD20+及CD21+的百分率有明显下降。肠系膜淋巴结中CD3+及CD3+/CD4+百分率未见明显变化，CD20+及CD21+的百分率有明显下降。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异性结合Blys的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有如下任意一组重链可变区和轻链可变区中的全部互补决定区：

(1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.25所示；

(2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.26所示；

(3)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.19所示；

(4)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.28所示；

(5)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.25所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区，还包含如(HC-FR1)-(CDR-H1)-(HC-FR2)-(CDR-H2)-(HC-FR3)-(CDR-H3)-(HC-FR4)式所示在重链的互补决定区之间并置的可变重链框架区HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3，和HC-FR4；以及如(LC-FR1)-(CDR-L1)-(LC-FR2)-(CDR-L2)-(LC-FR3)-(CDR-L3)-(LC-FR4)式所示在轻链的互补决定区之间并置的可变轻链框架区LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3，和LC-FR4。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述可变重链框架区和可变轻链框架区来自于人胚系基因。

4.根据权利要求2-3任一权利要求所述的单克隆抗体，其特征在于，至少一个所述可变重链框架区和/或至少一个所述可变轻链框架区的氨基酸序列如下所示：

HC-FR1：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO.7)；

HC-FR2：WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO.8)；

HC-FR3：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO.9)；

HC-FR4：YWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.10)；

LC-FR1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO.11)；

LC-FR2：WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO.12)；

LC-FR3：GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO.13)；

LC-FR4：FGGGTKVEIK(SEQ ID NO.14)。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含:

(a)一条重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；

(b)一条轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。

6.权利要求1-5任一权利要求所述单克隆抗体在制备治疗Blys相关性疾病的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述Blys相关性疾病选自系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿关节炎、白血病或淋巴瘤。

8.一种药用组合物，含有有效量的权利要求1-5任一权利要求所述单克隆抗体。