CN108699146B - 抗pd-l1抗体及其用途 - Google Patents

抗pd-l1抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108699146B
CN108699146B CN201680076656.9A CN201680076656A CN108699146B CN 108699146 B CN108699146 B CN 108699146B CN 201680076656 A CN201680076656 A CN 201680076656A CN 108699146 B CN108699146 B CN 108699146B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
antigen
antibody
binding fragment
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680076656.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108699146A (zh
Inventor
刘礼乐
杨欣秀
罗海山
帅正蓉
刘虎
胡少平
孙晓岚
顾红专
段清
杨达志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbour Biomed Ltd
Original Assignee
Harbour Biomed Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbour Biomed Ltd filed Critical Harbour Biomed Ltd
Publication of CN108699146A publication Critical patent/CN108699146A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108699146B publication Critical patent/CN108699146B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明描述抗PD‑L1抗体和其抗原结合片段。本发明还描述编码该抗体的核酸、包含该抗体的组合物、制备该抗体的方法以及使用该抗体治疗或预防疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的方法。

Description

抗PD-L1抗体及其用途
交叉引用相关申请
本申请要求2016年1月4日提交的中国专利申请号为201610003723.6的优先权，该申请的公开内容通过引用方式整体并入本文。
关于电子方式提交的序列表
本申请包含序列表，其通过EFS-Web以电子方式提交，作为ASCII格式的序列表，文件名为“序列表文件”，创建日期为2016年12月12日，大小约为39.1kB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及单克隆抗PD-L1抗体，编码该抗体的核酸和表达载体，含有该载体的重组细胞，和包括该抗体的组合物。还提供了制备抗体的方法，以及使用所述抗体来治疗疾病(包括癌症和自身免疫性疾病)的方法。
发明背景
肿瘤细胞能够在肿瘤微环境中以各种方式通过“编辑”宿主免疫逃避免疫系统。肿瘤进行这种所谓的“癌症免疫逃逸”的一种方式是通过上调作为免疫系统的关键调节剂的免疫检查点蛋白的表达，从而抑制免疫应答。一种这样的免疫抑制共信号由PD-1受体及其配体PD-L1所介导。
PD-1(程序性细胞死亡蛋白1或CD279)是I型跨膜蛋白，其是主要的免疫检查点分子之一(Blank等人，2005，肿瘤免疫治疗“Cancer Immunotherapy”，54：307-314)。PD-1主要是表达于活化T细胞上，并且其与配体PD-L1(B7-H1或CD274)和PD-L2(B7-DC或CD273)相互作用从而诱导抑制性信号，其导致T细胞增殖减少，细胞因子产生和毒性活性(Freeman等人.,2000,J.Exp.Med.,192:1027-34)。
PD-L1(程序性细胞死亡1配体)是I型跨膜蛋白，其包含胞外Ig-V样结构域，Ig-C样结构域，跨膜结构域和胞内C-末端结构域。PD-L1表达于许多细胞类型上，包括T细胞、B细胞、内皮细胞、上皮细胞以及抗原呈递细胞，表达于肺、肝脏和心脏组织的细胞上以及多种类型的肿瘤细胞上。与此相反，PD-L2仅在专职抗原呈递细胞，如树突状细胞和巨噬细胞上表达。(Dong H,Zhu G,Tamada K,Chen L.Nature Med.1999；5:1365–1369.)
PD-1和PD-L1之间相互作用对调节免疫应答至关重要，它是表达PD-L1的肿瘤细胞借此逃避免疫监视的主要机制(Zippelius等人,2015,Cancer Immunol Res.,3(3):236-44)。通过效应子功能的降低注意到，T细胞持续表达PD-1高度指示耗尽表型。这种表型已在不同类型的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中观察到并与不良预后和肿瘤复发相关联(Wherry,2011,Nat.Immunol.,12:492-99；Sheng Yao 2013Nat Rev Drug Discov.2013 12(2):130–146).
阻断PD-1/PD-L1的相互作用能激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫应答，并且已经证明，在多个同基因小鼠肿瘤模型中，阻断PD-L1或与其受体PD-1促进抗肿瘤活性(Hirano等人,2005,Cancer Res.,65:1089-96)。因此，PD-1和PD-L1之间相互作用是癌症免疫治疗有吸引力的靶标。
另外，在慢性病毒感染如HIV中，HIV特异性CD8+T细胞功能受损，细胞因子和效应分子的表达减少，且T细胞的增殖能力降低。研究表明在感染HIV的个体中HIV特异性CD8+T细胞PD-1表达高度上调，提示阻断PD-1/PD-L1通路为慢性病毒感染和艾滋病治疗提供了潜在的治疗方法。(Bowers NL,Helton ES,Huijbregts RPH等人.PLoS Pathog.2014年3月；10(3):e1003993)
因此，阻断PD-1/PD-L1通路的治疗剂可以提供用于各种癌症、病毒感染，例如HIV感染、T细胞耗竭相关的病症和其它免疫疾病的新疗法。
PD-1还与在肺和肾脏中表达的PD-L2相互作用，提供一种防止自身免疫反应的唯一负信号。因此，使用抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1通路，这也可能会破坏PD-1/PD-L2相互作用，可能会阻止基于PD-1/PD-L2自身免疫反应的抑制。因此，使用抗PD-1抗体可能导致自身免疫有关的肺炎或肾炎。然而，抗PD-L1抗体不影响PD-1/PD-L2相互作用，因此，它们的使用可以减少免疫相关的不良事件。
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗最近的一次突破，其采用患者自身的免疫系统攻击肿瘤细胞。免疫检查点蛋白的抑制剂具有治疗多种肿瘤类型，如转移性黑色素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌等的潜力。使用癌症免疫治疗方法的最近研究示出有希望的结果，尤其是在转移癌的情况下(Weinstock和McDermott,2015,Ther Adv Urol.,7(6):365-77)。此外，癌症免疫疗法在血液癌症，包括霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、非霍奇金淋巴瘤等的治疗中显示出巨大的潜力(Zou和Chen L,2008,Nat Rev Immunol.,8(6):467-77)。免疫检查点抑制剂引起的副作用是可以忽略不计的、可逆的和可处理的，有效的免疫检查点抑制剂可以显著改善癌症患者的总体存活。免疫检查点抑制剂可以与靶向治疗或常规放疗和化疗联合，并且这样的联合疗法在许多类型的癌症的治疗中是有效的。抗PD-L1单克隆抗体的临床试验已经由基因技术/罗氏、辉瑞/默克、雪兰诺和医学免疫公司发起。
罗氏/基因技术的人源化抗PD-L1mAb
Figure BDA0001710072070000021
已被批准用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在经新辅助或辅助含铂治疗后患有晚期或转移性尿路上皮癌疾病恶化的患者的临床研究中，TECENTRIQTM使22％的人中的肿瘤缩小(客观反应率，ORR)。然而，超过2％患者出现3-4级的不良反应，3例患者经历或者败血症、肺炎或肠梗阻，其导致死亡。因在3.2％患者中不良反应TECENTRIQTM被中止。
因此，尽管有进展，本领域仍需要包含抗PD-L1抗体的更有效的治疗剂，其有效抑制PD-1/PD-L1信号活动，同时在人体中导致最小的不良副作用。
发明内容
本发明通过提供单克隆抗体满足这种需求，该单克隆抗体以高亲和力特异性结合PD-L1并诱导免疫细胞分泌IFN-γ和IL-2，如在混合淋巴细胞反应和T淋巴细胞刺激试验中测量的。具体而言，本发明的完全人抗PD-L1抗体对PD-L1具有与阿特朱单抗(
Figure BDA0001710072070000031
罗氏-基因技术)(一种人源化IgG1抗PD-L1单抗)相当的亲和力。此外，该抗体表现出与阿特朱单抗相当的特性，但预计在人中的免疫原性不良副作用比阿特朱单抗少，因为这样的事实：它们是完全的人单抗、而不是简单的人源化单抗。
在一总体方面，本发明涉及结合PD-L1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
根据一具体方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)分别为SEQ ID NO：30、31、32、26、27和28；
(2)分别为SEQ ID NO：6、7、8、2、3和4；
(3)分别为SEQ ID NO：14、15、16、10、11和12；
(4)分别为SEQ ID NO：22、23、24、18、19和20；
(5)分别为SEQ ID NO：38、39、40、34、35和36；
(6)分别为SEQ ID NO：46、47、48、42、43和44；或
(7)分别为SEQ ID NO：54、55、56、50、51、和52；
其中，抗体或其抗原结合片段结合PD-L1，优选特异性结合人PD-L1。
根据另一具体方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49有至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53有至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列。
根据一实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人/大鼠嵌合的。
根据另一实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的。
根据又一实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含恒定区，优选人重链IgG4恒定区，更优选具有一个或多个突变的人重链IgG4恒定区，例如S228P突变，和人抗体轻链κ恒定区。
在另一总体方面，本发明涉及编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在另一总体方面，本发明涉及载体，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在另一总体方面，本发明涉及宿主细胞，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
在另一总体方面，本发明涉及药物组合物，包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中阻断PD-L1与PD-1和/或B7.1结合的方法，或增加IFN-γ和IL-2分泌的方法，包括给对象施用本发明的药物组合物。
在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中治疗疾病，紊乱或病症，优选感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主疾病的方法，包括给对象施用本发明的药物组合物。
在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中治疗过度增殖性疾病的方法，包括向对象施用本发明的药物组合物的方法。过度增殖性疾病可以是非恶性疾病，包括但不限于，动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大。过度增殖性疾病也可以是肿瘤或恶性疾病。肿瘤可以选自下组：实体瘤、血液癌症、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌。
在另一总体方面，本发明涉及产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在一定条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，从而产生单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
在另一总体方面，本发明涉及产生包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，其包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合从而获得所述药物组合物。
从以下公开内容，包括本发明的具体实施方式、及其优选实施方式以及所附权利要求，本发明的其它方面、特征和优点将是显而易见的。
附图简述
结合附图阅读时将更好地理解本发明前面的概述以及后续详细描述。应当理解，本发明并不限于在附图中所示的精确的实施方式。
在图中：
图1示出生物素标记的PD-L1-hFc蛋白与其受体PD-1-hFc的结合活性；
图2示出稳定转染PD-L1蛋白的HEK293细胞的流式细胞仪检测图；
图3示出用PD-L1蛋白免疫后H2L2转基因小鼠的血清抗体滴度的ELISA测定结果，其中1681至1685代表鼠ID号；
图4A和图4B示出通过ELISA测量的本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体与人PD-L1-hFc蛋白的结合活性；
图5示出通过ELISA测量的本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体与猴PD-L1-hFc蛋白的结合活性；
图6示出通过ELISA测量的本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体与PD-L1或PD-L2的结合活性；
图7A和图7B示出通过流式细胞术测量的本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体与CHO-K1-hPD-L1的基于细胞的结合活性；
图8A和图8B示出通过流式细胞术测量的本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体与CHO-K1-cPD-L1的基于细胞的结合活性；
图9A和图9B示出通过基于蛋白质的受体配体阻断测试测量的通过本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体抑制PD-L1蛋白结合至其受体PD-1；
图10A和图10B示出通过基于蛋白质的受体配体阻断测试测量的通过本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体抑制PD-L1蛋白结合至其受体B7.1；
图11示出在使用PBMC的T细胞刺激测试中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图12示出在使用PBMC的T细胞刺激测试中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图13示出在使用供体1的PBMC的混合淋巴细胞反应中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图14示出在使用供体1的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图15示出在使用供体2的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图16示出在使用供体3的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图17示出在使用供体4的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图18示出在使用供体5的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图19示出在使用供体6的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图20示出在使用供体7的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图21示出在使用供体6的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图22示出在使用供体7的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图23示出在使用供体8的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图24示出在使用供体9的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图25示出在使用供体8的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图26示出在使用供体9的PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的嵌合抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图27A和图27B示出ELISA测定的通过本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体结合人PD-L1蛋白；
图28A和图28B示出ELISA测定的通过本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体结合猴(cyno)PD-L1蛋白；
图29示出流式细胞术测量的本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体与CHO-K1-hPD-L1的基于细胞的结合活性；
图30示出流式细胞术测量的本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体与CHO-K1-cPD-L1的基于细胞的结合活性；
图31A和图31B示出基于蛋白质的受体配体阻断测试测量的通过本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对PD-L1蛋白与其受体PD-1结合的抑制；
图32A和图32B示出基于蛋白质的受体配体阻断测试测量的通过本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对PD-L1蛋白与其受体B7.1结合的抑制；
图33示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图34示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图35示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图36示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图37示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图38示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IL-2分泌的影响；
图39示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图40示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图41示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图42示出在使用PBMC的混合淋巴细胞反应试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图43示出在使用PBMC的T细胞刺激试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图44示出在使用PBMC的T细胞刺激试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图45示出在使用PBMC的T细胞刺激试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图46示出在使用PBMC的T细胞刺激试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图47示出在使用PBMC的T细胞刺激试验中本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对IFN-γ分泌的影响；
图48示出本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的影响；
图49示出本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体对补体依赖性细胞毒性的影响；
图50示出通过差示扫描量热法(DSC)测得的本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体的热稳定性；
图51示出本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体的冻/融稳定性；以及
图52示出本发明实施方式的完全人抗PD-L1抗体的溶解度。
具体实施方式
在背景和整个说明书中，引用或描述了多种出版物、文章和专利，这些参考文献各自在此通过引用以其整体并入。本说明书中包含的文件、法案、材料、装置、制品等的讨论用于提供本发明上下文的目的。对于本发明所公开或要求保护的任何内容，这样的讨论并不是承认任何或全部这些事项构成现有技术的一部分。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的具有相同含义。另外，本文所用的具体术语具有说明书中定义的含义。本文引用的所有专利，公开的专利申请和出版物通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。需要注意的是，除非上下文另有明确指示，如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式。
除非另有说明，在所有情况下，本文所述的任何数值(例如本文所述的浓度或浓度范围)应当理解为均被术语“约”修饰。因此，某一数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，如本文所用，所用数值范围特别地包括所有可能的子范围，在该范围内的所有单个数值，包括在这样的范围内的整数以及该值的分数。
本发明总体上涉及分离的抗PD-L1抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，含有该载体的重组细胞，和包括抗体的组合物。还提供了制备抗体的方法，以及使用所述抗体来治疗疾病，包括癌症和自身免疫性疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种所需的功能性质，包括但不限于高亲和力地结合到PD-L1，对PD-L1高特异性，阻止PD-L1结合至它的结合伴侣PD-1和B7.1的能力，以及刺激细胞因子IFN-γ和IL-2分泌的能力。
在一个总的方面，本发明涉及结合PD-L1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”以广义使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，包括单克隆或多克隆的人、人源化、复合和嵌合抗体，以及抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白或肽链。抗体的结构是众所周知的。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类型(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五个主要类型或相应亚类中的任何一个。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据其恒定区的氨基酸序列，可以将脊椎动物物种的抗体轻链归类为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据具体的实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个区含有三个结构域(即CDR1，CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域也称为LCDR1，LCDR2和LCRD3，重链可变区结构域也称为HCDR1，HCRD2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-L1的分离的抗体基本上不含不结合PD-L1的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然的突变以外，构成所述抗体群的单个抗体是同一的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单一淋巴细胞基因克隆技术，或通过重组DNA方法制备。例如，可以通过杂交瘤产生单克隆抗体，所述杂交瘤包含从非人转基因动物(例如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定性双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、包含一个或多个CDR的部分抗体形成的多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够和与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合。根据具体实施方式，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区、和重链恒定区的Fd区段。根据其他具体实施方式，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指人生产的抗体，或利用本领域已知的任何技术制备的具有对应于人生产的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指为增强其与人抗体的序列同源性而进行修饰的非人抗体，以保留抗体的抗原结合特性，并降低其在人体中的抗原性。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两种或更多种物种的抗体。通常，轻链和重链可变区都对应于衍生自一种哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔等)的具有期望的特异性、亲和力、和性能的抗体的可变区，而恒定区对应于衍生自另一种哺乳动物(例如人)的抗体的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
如本文所用，术语“PD-L1”是指程序性细胞死亡1配体蛋白，I型跨膜受体，其在许多细胞类型，包括T细胞、B细胞、内皮细胞、上皮细胞和抗原递呈细胞上表达，并且在肺、肝脏和心脏组织的细胞上表达，且其表达在若干类型的肿瘤细胞上是高度上调的。人PD-L1的氨基酸序列在GenBank登录号NP_054862.1中示出。PD-L1的两个结合伴侣已经确定，PD-1和B7.1。
如本文所用，“特异性结合PD-L1”的抗体指结合到PD-L1，优选人PD-L1的抗体，具有的KD为1×10-7M或更低、优选为1×10-8M或更低、更优选为1×10-9M或更低或1×10-10M或更低。术语“KD”指由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得的解离常数，并表示为摩尔浓度(M)。基于本发明，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，诸如通过使用生物传感器系统，例如
Figure BDA0001710072070000091
系统，或通过使用生物膜层干涉测量技术，例如Octet RED96系统。
抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
根据一个特定方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，具有以下多肽序列：
(1)分别为SEQ ID NO：30、31、32、26、27和28；
(2)分别为SEQ ID NO：6、7、8、2、3和4；
(3)分别为SEQ ID NO：14、15、16、10、11和12；
(4)分别为SEQ ID NO：22、23、24、18、19和20；
(5)分别为SEQ ID NO：38、39、40、34、35和36；
(6)分别为SEQ ID NO：46、47、48、42、43和44；或
(7)分别为SEQ ID NO：54、55、56、50、51和52；
其中抗体或其抗原结合片段结合PD-L1，优选特异性结合人PD-L1。
根据另一具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区各自具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区各自具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列。
根据另一具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
a.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：13的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：21的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：45的多肽序列的轻链可变区；或
g.具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：53的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：6、7、8、2、3和4的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：1至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：5至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：14、15、16、10、11和12的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：9至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：13至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：13的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：22、23、24、18、19和20的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：17至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：21至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：21的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：30、31、32、26、27和28的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：25至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：29至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：38、39、40、34、35和26的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：33至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：37至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：46、47、48、42、43和44的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：41至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：45至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：45的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO：54、55、56、50、51和52的多肽序列。在另一实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：49至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：53至少80％，优选至少85％或90％，或更优选至少95％相同的多肽序列。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：53的多肽序列的轻链可变区。
根据另一具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
根据另一具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人的。
根据另一具体方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含恒定区，优选人重链IgG4恒定区，更优选具有S228P突变的人重链IgG4恒定区(SEQID NO：75)，和人抗体轻链恒定区，优选人轻链κ恒定区(SEQ ID NO：77)。
在另一总体方面，本发明涉及一种编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域技术人员可以理解，蛋白质的编码序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被改变(例如替换，删除，插入等)。因此，本领域技术人员能够理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在另一总体方面，本发明涉及载体，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒，粘粒，噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是重组表达载体，如质粒。所述载体可以包括用于构建常规功能的表达载体的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、筛选标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。能够将核酸递送至细胞的许多表达载体是本领域已知的，可以在本发明中使用，用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方式，可以利用常规克隆技术或人工基因合成生产重组表达载体。
在另一总体方面，本发明涉及宿主细胞，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达，例如，scFv或Fab抗体)或CHO-K1细胞(用于表达，例如，全长IgG抗体)。根据具体的实施方式，通过常规方法例如化学转染，热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。
在另一总体方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物(如从上清液)中回收抗体或其抗原结合片段。可以根据本领域已知和本文所述的常规技术从细胞收获表达的抗体或其抗原结合片段，并进行纯化。
在另一总体方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含囊泡的脂质、微球体、脂质体包封(liposomal encapsulation)、或本领域已知的用于药物制剂的其它物质。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于具体应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明所述组合物的有效性或本发明所述组合物的生物活性的无毒物质。根据具体实施方式，鉴于本公开内容，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中阻断PD-L1与PD-1或B7.1结合、或增强IFN-γ和IL-2分泌的方法，包括给对象施用本发明的药物组合物。
结合PD-L1的抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域中已知的方法来表征，并如本文中所描述。用于表征结合PD-L1的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于，亲和力和特异性测定，包括Biacore、ELISA和FACS分析；受体配体结合测定，检测PD-L1与PD-1和/或B7.1结合的阻断；检测阻断PD-L1与PD-1和/或B7.1结合诱导淋巴细胞细胞因子生成的测试；细胞毒性测定，检测抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；检测小鼠肿瘤模型中肿瘤生长抑制的实验等。根据具体实施方式，表征结合PD-L1的抗体及其抗原结合片段的方法包括在以下实施例2-12中描述的那些。
在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中治疗感染性疾病或移植物抗宿主疾病的方法，包括向对象施用本发明的药物组合物。在另一总体方面，本发明涉及在有此需要的对象中治疗肿瘤的方法，包括向所述对象施用本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“对象”是指动物，优选哺乳动物。根据具体的实施方式，对象是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人)。在具体的实施方式中，所述对象是人。
根据本发明的实施方式，药物组合物包含治疗有效量的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”指的是在对象中引起期望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。根据所述目的，可以以经验和常规方式确定治疗有效量。
对于抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，本文中使用的治疗有效量指的是在有此需要的对象中刺激免疫应答的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的量。对于抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，本文所用的治疗有效量也是指导致治疗疾病、病症或病况，防止或减缓疾病、病症或病况进展，或降低或完全减轻与免疫疾病、病症或病况相关症状的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的量。
根据特定实施方式中，待治疗的疾病、病症或病况为过度增殖性疾病、感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病、或移植物抗宿主病。根据更具体的实施方式中，待治疗的疾病、病症或病况是感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病、或移植物抗宿主病。根据更具体的实施方式中，待治疗的疾病、病症或病况是非恶性过度增殖性疾病，包括但不限于，动脉粥样硬化、良性增生、良性前列腺肥大。根据其它具体实施方式中，待治疗的疾病，病症或病况是肿瘤或恶性过度增殖性疾病，优选选自下组的肿瘤：实体瘤、血液学癌症、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌。
根据具体实施方式中，治疗有效量是指足以实现以下一个、两个、三个、四个或更多的效果的治疗量：(i)减轻或改善待治疗疾病、病症或病况的严重程度或与其相关的症状；(ii)减少待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状的持续时间；(iii)防止待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状进展；(iv)引起待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状复原；(v)防止待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状发展或发作；(vi)防止待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状复发；(vii)减少患有待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状的对象的住院治疗；(viii)减少患有待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状的对象的住院时长；(ix)增加患有待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状的对象的存活；(xi)抑制或减少待治疗疾病、病症或病况或与其相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种治疗的一个或多个预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素改变，如待治疗疾病、病症或病况、给药的方式、靶点、对象的生理状态(包括，例如，年龄、体重、健康)，对象是人还是动物，施用的其它药物，治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量适宜滴定测量从而优化安全性和有效性。
根据具体实施方式，本文描述的组合物被配制成适合于给药至对象的预期途径。例如，可以将本文所述组合物配制成适合于静脉内，皮下，或肌内给药。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗的和“疗法”都意在指代改善或逆转癌症，炎性疾病、病症或病况，免疫疾病、病症或病况或感染性疾病、病症或病况相关的至少一种可测量物理参数，其在对象中未必可辨别，但可以在对象中辨别。术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”还可指使得疾病、病症或病况消退，阻碍其进展或至少减缓其进展。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指减轻、预防与疾病、病症或病况相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少其持续时间，所述的疾病、病症或病况为肿瘤，更优选为癌症。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指预防疾病，病症或病况的复发。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指增加患有疾病，病症或病况的对象的存活率。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指消除对象的疾病、障碍或病症。
根据具体实施方式，在癌症，炎性疾病、病症或病况，免疫疾病、病症或病况，自身免疫性疾病、病症或病况或感染性疾病、病症或病况的治疗中使用的组合物可与另一种治疗联用，包括但不限于，化疗、抗CD20mAb、抗CTLA-4抗体、抗血管生成剂、放射治疗、其它免疫肿瘤药物、靶向疗法、抗PD-L1抗体或其它抗癌药物。
如本文所使用，上下文中向对象施用两种或多种疗法的术语“联合”是指使用多于一种的疗法。使用术语“联合”不限制向对象施用治疗的顺序。例如，向对象施用第一种疗法(例如，本文所述的组合物)可以在施用第二种疗法之前(例如，提前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，同时，或之后(例如，延后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)。
在另一总体方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施方式
本发明还提供以下非限制性实施例。
实施方式1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(1)分别为SEQ ID NO：30、31、32、26、27和28；
(2)分别为SEQ ID NO：6、7、8、2、3和4；
(3)分别为SEQ ID NO：14、15、16、10、11和12；
(4)分别为SEQ ID NO：22、23、24、18、19和20；
(5)分别为SEQ ID NO：38、39、40、34、35和36；
(6)分别为SEQ ID NO：46、47、48、42、43和44；或
(7)分别为SEQ ID NO：54、55、56、50、51和52；
其中所述抗体或其抗原结合片段结合PD-L1。
实施方式2是实施方式1的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列。
实施方式3是实施方式2的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列，所述轻链可变区具有分别与SEQID NO：29、5、13、21、37、45或53至少80％、优选至少85％或90％、或更优选至少95％相同的多肽序列。
实施方式4是实施方式3的分离的单克隆抗体或原结合片段，包含：
(a)具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区：
(c)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：13的多肽序列的轻链可变区；
(d)具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：21的多肽序列的轻链可变区；
(e)具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区；
(f)具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：45的多肽序列的轻链可变区；或
(g)具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：53的多肽序列的轻链可变区。
实施方式5是实施方式1～4任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
实施方式6是实施方式1～4任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人的。
实施方式7是实施方式5或6的分离的抗体或抗原结合片段，其包含具有S228P突变的人重链IgG4恒定区，和人抗体轻链κ恒定区。
实施方式8是实施方式1～7任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人PD-L1的KD为5×10-9M或更低，优选1×10-9M或更低，或1×10-10M或更低，其中，KD通过表面等离子体共振分析(如使用Biacore系统)或通过生物层干涉测量技术(如使用Octet RED96系统)进行测量。
实施方式9是编码实施方式1至8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的分离的核酸。
实施方式10是包含实施方式9的分离的核酸的载体。
实施方式11是包含实施方式10的核酸的宿主细胞。
实施方式12为药物组合物，其包含实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
实施方式13为在有此需要的对象中阻断PD-L1与PD-1和/或B7.1结合的方法，或增强IFN-γ和IL-2分泌的方法，包括向所述对象施用实施方式12的药物组合物。
实施方式14为在有此需要的对象中治疗感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的方法，包括向所述对象施用实施方式12的药物组合物。
实施方式15为实施方式14的方法，还包括向所述对象施用另外的用于治疗感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的药剂。
实施方式16为在有此需要的对象中治疗过度增殖性疾病的方法，包括向所述对象施用实施方式12的药物组合物。
实施方式17为实施方式16的方法，其中所述过度增殖性疾病是非恶性疾病，优选选自下组：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大。
实施方式18为实施方式16的方法，其中所述过度增殖性疾病是肿瘤，或恶性疾病，优选地，所述肿瘤选自下组：实体瘤、血液学癌症、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌。
实施方式19是实施方式16-18任一项的方法，还包括在有此需要的对象中向所述对象施用另外的用于治疗治疗过度增殖性疾病的药剂。
实施方式20为产生实施方式1至8任一项单克隆抗体或抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生所述单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物回收抗体或抗原结合片段。
实施方式21为制备包含实施方式1至8任一项单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以得到药物组合物。
实施方式22为实施方式1至8任一项分离的单克隆抗体或抗原结合片段在有此需要的对象中用于治疗感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。
实施方式23为实施方式1至8任一项分离的单克隆抗体或抗原结合片段在有此需要的对象中用于治疗过度增殖性疾病，如选自下组的非恶性疾病：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大，或选自下组的肿瘤：实体瘤、血液学癌症、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌。
实施方式24是实施方式1至8任一项分离的单克隆抗体或抗原结合片段的应用，用于制备在有此需要的对象中治疗感染性疾病、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的药物组合物。
实施方式25是实施方式1至8任一项分离的单克隆抗体或抗原结合片段的应用，用于制备在有此需要的对象中治疗过度增殖性疾病的药物组合物，如选自下组的非恶性疾病：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大，或选自下组的肿瘤：实体瘤、血液学癌症、膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌。
实施例
本发明的以下实施例用于进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围是由所附的权利要求来确定。
实施例1-抗PD-L1抗体制备
人PD-L1蛋白用作免疫原以产生抗PD-L1抗体。人免疫球蛋白转基因小鼠技术用于开发和制备完全人抗体首先由安根尼克斯(xeno小鼠和Medarex(HuMab“鼠”)、Lonberg等人,1994,Nature 368:856-859、Lonberg和Huszar,1995,Internal Rev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546描述。
与PD-L1具有高亲和力(KD<1×10-9M)的抗体通过进行初步抗体生产、纯化和验证获得。PD-L1特异性的且和诸如PD-L2等其它免疫检查点不交叉反应的抗体能够阻断PD-L1结合PD-1和B7.1。使用标准分子生物学方法测定所产生的抗PD-L1抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列并总结于表1中。
表1本发明的嵌合抗PD-L1抗体的重链可变区、HCDR、轻链可变区和LCDR的氨基酸序列的SEQ ID NO
Figure BDA0001710072070000181
在表1中列出的抗PD-L1抗体的重链和轻链可变区通过在表2中总结的核酸序列编码。
表2本发明的嵌合抗PD-L1抗体的重链和轻链可变区的核酸序列的SEQ ID NO
Figure BDA0001710072070000182
Figure BDA0001710072070000191
制备完全人型抗PD-L1抗体。完全人抗PD-L1抗体以高亲和力(KD<1×10-9M)结合人PD-L1的胞外域，并阻止PD-L1结合其结合伴侣，PD-1和B7.1。抗PD-L1抗体不表现出非特异性结合人PD-L2。抗PD-L1抗体的生物学活性通过混合淋巴细胞和T细胞刺激试验进行评价，其中它们增加IFN-γ和IL-2细胞因子的分泌。不希望受理论的束缚，相信抗PD-L1抗体可用于抑制PD-1介导的信号传导通路，其负调节免疫应答，并因此增强肿瘤特异性免疫应答，或者作为单一疗法或联合抗PD-1单克隆抗体或其它抗癌药，诸如癌症免疫治疗，特别是对于患有PD-L1阳性肿瘤的患者。抗PD-L1抗体可用于癌症和自身免疫性疾病的治疗。
实施例2-抗PD-L1抗体的制备
(步骤1)制备免疫原A，PD-L1ECD-hFc蛋白(本文中也被称作PD-L1-hFc)
使用标准分子生物学克隆技术(Sambrook和Russell,1989,分子克隆：实验室手册，纽约：冷泉港实验室出版社，第二版)将人PD-L1的细胞外结构域的编码序列(PD-L1ECD；SEQ ID NO：71和78)，对应于SEQ ID NO：72的氨基酸Phe19-Thr239，连同人IgG Fc片段(hFc)的编码序列一起克隆进pCpC载体(英杰公司，#V044-50)。使用聚乙烯亚胺(PEI，聚合科学公司)和质粒瞬时转染HEK293细胞(英杰公司)，并在37℃于FreeStyle 293表达培养基(英杰公司)中进行扩增。扩增4天后，收集培养基并离心除去细胞成分。含有重组PD-L1ECD-hFc的培养物上清液进行A蛋白色谱法(Mabselect,GE医疗保健)上。用UV检测器监测紫外线(UV)吸收(A280nm)，用PBS(pH7.2)洗涤样品直到UV A280nm吸光度回到基线水平，在该点采用0.1M甘氨酸盐酸盐(pH2.5)将PD-L1ECD-hFc融合蛋白从蛋白A亲和柱洗脱。4℃下用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.2)透析样品过夜。透析后，将纯化的PD-L1免疫原通过0.22微米无菌过滤器，等分并储存在-80℃。
与以上制备PD-L1ECD-hFc重组蛋白相同的方式制备与hFc融合的重组人PD-1细胞外结构域(PD-1ECD)(对应于Uniprot数据库蛋白Q15116的氨基酸Leu25-Glu167)。
通过将蛋白与生物素(西格玛S3295)混合并孵育来生物素化纯化的PD-L1ECD-hFc(本文也被称为PD-L1-hFc)。
为了表征PD-L1ECD-hFc免疫原，测定样品的蛋白浓度和纯度，并测定免疫原的分子量和生物活性。
该PD-L1ECD-hFc免疫原的生物活性通过ELISA测定。重组PD-1ECD-hFc蛋白在PBS中稀释至1μg/mL的浓度，并且ELISA微孔板中每孔加入100μL稀释的PD-1ECD-hFc蛋白样品，其在4℃下孵育过夜从而用重组蛋白包被平板。然后在37℃用ELISA阻断溶液(含有1％BSA，pH7.4的PBS缓冲液中，w/v)封闭板2小时，然后在37℃用生物素化的PD-L1ECD-hFc蛋白的连续稀释液或对照蛋白(生物素化的非PD-L1ECD-hFc)孵育1小时。加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素(西格玛B2438)，并将板在室温下孵育30分钟。加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，并将板在室温下孵育15分钟。加入1N盐酸50μL以终止反应，通过ELISA酶标仪检测OD450nm。
图1和表3示出生物素化的PD-L1ECD-hFc与纯化的PD-1ECD-hFc融合蛋白的浓度依赖性结合。用生物素化的PD-L1ECD-hFc观察到结合PD-1ECD-hFc，但不结合不含PD-1ECD序列的对照蛋白。
表3生物素化的PD-L1ECD-hFc与其受体PD-1ECD-hFc的结合活性
Figure BDA0001710072070000201
(步骤2)制备免疫原B，过表达hPD-L1的HEK293细胞
编码人PD-L1的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)被亚克隆到pIRES载体(Clontech)，并制备质粒。采用X-treme GENE HP DNA转染试剂(罗氏,Cat#06 366 236 001)用质粒瞬时转染HEK293和CHO-K1细胞(英杰公司)，并在含有0.5g/mL的抗生素和10％(w/w)的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中选择转化体，持续2周。进行有限的稀释到96孔培养板，并且将板在37℃，5％(v/v)CO2下孵育大约2周。选择之后，在6孔板中扩增单克隆，通过流式细胞术使用市售抗PD-L1抗体(R&D系统)筛选扩增的克隆。通过FACS测量表现出更高的生长速率和更高的荧光强度的克隆进一步扩增并在液氮中冻存。
图2示出用重组hPD-L1蛋白稳定转染的HEK293细胞的流式细胞检测结果图。FACS阳性细胞的百分比示于表4中，作为hPD-L1蛋白表达水平的指示。
表4通过FACS测定重组HEK293克隆的hPD-L1表达水平
Figure BDA0001710072070000211
(步骤3)制备免疫原C，hPD-L1表达构建体
全长人PD-L1蛋白的编码序列(SEQ ID NO：73)亚克隆到pcDNA3.1载体(英杰公司)中，并将所得的质粒包被到1.0um胶体金弹(BIO-RAD)，随后按照Helios基因枪数据表的说明使用Helios基因枪(BIO-RAD号165-2431)进行后续免疫。
(步骤4)杂交瘤细胞融合和抗体筛选
人Ig Fc不与小鼠Fc受体相互作用，因此含有hFc的免疫原在小鼠中引发的免疫应答较弱，导致单克隆抗体制备效率低。通过在小鼠基因组引入编码人免疫球蛋白(Ig)可变区的基因和编码大鼠Ig恒定区的基因制备Harbour H2L2转基因小鼠，使得小鼠含有包含hV-rC的嵌合Ig，但不能表达小鼠Ig(WO2010/070263A1)。Harbour H2L2转基因小鼠能够产生与野生型小鼠(例如Balb/c)相当的免疫应答和抗体效价。
(部分4A)采用免疫原A免疫6-8周龄Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，小鼠保持无特定病原(SPF)的条件下。在第一次免疫中，将50μg免疫原A连同0.25毫升完全弗氏佐剂(CFA)一起注射到每只小鼠的腹腔。为了增强免疫反应，在第一次免疫后两周将50μg免疫原A连同0.25不完全弗氏佐剂(IFA)注射到每只小鼠的腹腔内，后续加强间隔3周给予。免疫后一周收集血样。通过ELISA和FACS分析测定血清中的抗体效价和特异性，结果显示在图3和表5。表5示出来自用PD-L1ECD-hFc免疫的小鼠的血清表现出与免疫原A不同级别的结合。最高血清稀释度为约一百万。空白对照为1％(w/w)BSA。在表5所示的OD450nm值是通过ELISA测定的第三次加强后7天的血清效价值。
表5通过ELISA测定的用hPD-L1ECD-hFc融合蛋白免疫的Harbour H2L2转基因小鼠的血清效价
Figure BDA0001710072070000212
Figure BDA0001710072070000221
(部分4B)采用免疫原B免疫6-8周龄Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，小鼠保持在SPF条件下。使用X-treme基因HP DNA转染试剂(罗氏，#06 366 236 001)用编码全长hPD-L1的pIRES质粒(参见实施例2，步骤2)稳定转染HEK293细胞。在T-75培养瓶中培养细胞。当细胞达到90％汇合时，将培养基吸出，且用DMEM培养基(英杰公司)洗涤两次，并在37℃下用非酶细胞解离缓冲液(英杰公司)处理，直到细胞从培养瓶分离。收集细胞，并用DMEM培养基洗涤两次，并检测细胞数，使用PBS缓冲液(pH7.2)调整至2x107细胞/毫升。每次免疫，给小鼠注射0.5mL细胞悬浮液。在第一次免疫后两周，给予加强免疫，并且间隔3周进行后续加强。免疫后一周收集血样。通过流式细胞术测定血清中抗体效价和特异性。第二加强后，通过流式细胞术测试血清滴度超过1：1000。
(部分4C)用免疫原C免疫6-8周龄Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，将小鼠保持在SPF条件下。所有小鼠均用Helios基因枪免疫4次，每次免疫4枪。每枪含有1微克cDNA。在第一次免疫后两周，给予加强免疫，并且间隔3周进行后续加强。免疫后一周收集血样，通过ELISA和FACS测定血清滴度。第二次加强后通过流式细胞术检测血清滴度为1：1000，通过ELISA检测超过1：10000。
在第三次加强后通过FACS检测用免疫原A-C免疫的小鼠的血清滴度通常可能达到1：1000。
在完成上述步骤4A-C之前，选择对hPD-L1特异性免疫应答的小鼠用于融合，并通过腹膜内注射100μg纯化的PD-L1ECD-hFc(用于免疫原A或免疫原C免疫的小鼠)或用hPD-L1稳定转染的HEK293细胞(用于免疫原B免疫的小鼠)进行最后一次加强。五天后，将小鼠处死，并收集其脾细胞。将NH4OH加入到该脾细胞样品至1％(w/w)的最终浓度，以裂解样品中红血细胞。将样品在1000rpm下离心，并用DMEM培养基洗涤三次。测定脾细胞的生存能力，然后通过高效电融合方法(参见酶学方法“Methods in Enzymology”，220卷)将存活的脾细胞以5:1的比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)融合。
融合的细胞重悬于含有20％(w/w)FBS和1x次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基的DMEM培养基中，将浓度调节至105细胞/200微升。200μL融合细胞加入到96孔板的各孔中，将其在37℃、5％CO2条件下孵育。细胞融合后14天，收集杂交瘤上清液并通过ELISA和Acumen(微孔板细胞测试)筛选。37℃、5％CO2条件下，ELISA试验中OD450nm大于1.0且经Acumen试验MFI值大于100的克隆在载有含10％(w/w)热灭活FBS的DMEM的24孔板中扩增。培养3天后收集上清液。测试抗体同种型并通过ELISA和流式细胞术(参见实施例3)检测它们结合重组PD-L1ECD蛋白和表达PD-L1细胞的能力。进行受体配体结合试验来确定杂交瘤上清液的阻断活性(参见实施例4-5)。
基于24孔板筛选结果，选择和亚克隆ELISA结合试验中OD450nm大于1.0，FACS结合试验中MFI值大于50且受体配体结合试验中抑制率大于60％的克隆。在37℃、5％CO2条件下，通过在96孔板中用含10％(v/v)FBS的DMEM培养基有限稀释进行亚克隆。培养10天后，收集上清液并通过ELISA和Acumen初步筛选。阳性克隆在24孔板进行扩增，并培养3天。收集上清液，进行ELISA和FACS结合试验，以测定结合活性，并且进行受体配体结合试验来评估生物活性。选择标准如下：经ELISA OD450nm>1.0，经FACS MFI值>50且受体配体结合试验测得抑制率>60％。在37℃、5％CO2条件下，符合选择标准的克隆在含有10％(w/w)FBS的DMEM培养基进行扩增，并在液氮中冷冻，以使杂交瘤细胞可被用于随后的抗体产生和纯化。
(步骤5)先导候选抗体的产生和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度低，大约仅1-10μg/毫升，抗体浓度变化大。此外，培养基中成分和FBS对分析有干扰。因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产和纯化。
在T-75细胞培养瓶中用杂交瘤无血清培养基(英杰公司)培养实施例2(部分4)所得的杂交瘤细胞并传3代。待杂交瘤细胞生长状态良好，接种细胞至2升培养瓶。每个2升的培养瓶中加入500毫升生产培养基，将细胞密度调整至105细胞/毫升。将培养瓶置于37℃旋转培养箱中，转速3转/分钟。培养杂交瘤细胞14天后，收集上清液，去除细胞。然后用0.45微米的滤膜过滤上清液。随后培养上清液可进行纯化或-30℃储存。
将杂交瘤培养上清液通过2mL的G蛋白柱(GE医疗保健)纯化单克隆抗体。首先用PBS缓冲液(pH7.2)平衡G蛋白柱，然后将杂交瘤培养上清以3毫升/分钟的恒定流速加载到已平衡的G蛋白柱。然后用4倍体积的PBS缓冲液洗涤柱。然后用洗脱缓冲液(0.1M乙酸盐缓冲液，PH2.5)洗脱嵌合抗PD-L1抗体，使用UV检测器监测洗脱液的UV吸光度(A280UV吸收峰)。10％的1.0M Tris-HCl缓冲液加入到洗出液中以中和pH值，并且通过将样品通过0.22微米过滤器无菌过滤样品。获得无菌过滤的纯化的嵌合抗PD-L1抗体。
通过UV吸光度(A280/1.4)测量纯化的嵌合抗PD-L1抗体的浓度，并检测纯度和内毒素水平(Lonza试剂盒)。分析结果示于表6。纯化的嵌合抗PD-L1抗体具有的内毒素浓度小于1.0EU/毫克。
表6来自杂交瘤的纯化的嵌合PD-L1单克隆抗体的质量控制分析
Figure BDA0001710072070000231
实施例3–先导候选抗体的表征
(部分A)ELISA检测抗PD-L1抗体与重组PD-L1ECD-hFc蛋白的结合
通过ELISA分析实施例2纯化的抗PD-L1抗体与重组人PD-L1ECD-hFc蛋白、猴PD-L1ECD-hFc蛋白和其它PD-L1家族相关的免疫检查点蛋白PD-L2的结合，以确定抗体的特异性。
将实施例2纯化的免疫原A(hPD-L1ECD-hFc蛋白)、猴PD-L1ECD-hFc蛋白(使用制备免疫原A的方法制备；参见实施例2，步骤1)，包括猴PD-L1的胞外域的氨基酸序列，其对应Uniprot数据库蛋白G7PSE7的氨基酸Phe19-Thr239，以及其它免疫检查点蛋白(PD-L2和NC-Fc)(R&D系统)在PBS中稀释至1微克/毫升。100μL稀释的重组蛋白加入到96孔板的每个孔中。将板用塑料膜密封并在4℃孵育过夜。将板用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)吐温20)洗涤两次，并在室温下用封闭缓冲液(PBS+0.01％(v/v)吐温20+1％(w/w)BSA)孵育2小时。吸出封闭缓冲液，并将100μL纯化的抗PD-L1抗体添加到各孔中并在37℃孵育2小时。将板用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)吐温20)洗涤三次。将HRP缀合的第二抗体(西格玛)加入到每个孔中，并在37℃下孵育2小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次后，将100μL TMB底物加至每个孔中，并将板在室温下孵育30分钟。将100μL终止溶液(0.1N HCl)加入到每个孔中以使反应停止。用ELISA读板机(384plus SpectraMax，Molecular Devices)测量在450nm处的吸光度。结果示于图4-6和表7-9。IgG对照是人IgG。
表7 ELISA测量的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与人PD-L1ECD-hFc的结合活性
Figure BDA0001710072070000241
Figure BDA0001710072070000242
表8ELISA测量的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与猴PD-L1ECD-hFc的结合活性
Figure BDA0001710072070000251
表9ELISA测量的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与PD-L1和PD-L2的结合活性
Figure BDA0001710072070000252
(部分B)流式细胞术检测抗PD-L1抗体与表达PD-L1的细胞结合
用含有编码全长人PD-L1的核苷酸序列(参见实施例2，步骤2)的pIRES质粒稳转CHO-K1细胞，从而获得稳定表达人PD-L1的CHO-K1细胞(此处称为CHO-K1-hPD-L1细胞)。采用含有编码全长猴PD-L1的核苷酸序列的pIRES质粒稳转其它CHO-K1细胞，从而获得稳定表达猴PD-L1的CHO-K1细胞(此处称为CHO-K1-cPD-L1细胞)。将CHO-K1-hPD-L1和CHO-K1-cPD-L1细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度。吸尽培养基，用HBSS(汉克斯平衡盐溶液，购自英杰公司)洗涤细胞2次。用无酶细胞解离液(Versene溶液，购自英杰公司)处理细胞并收集。用HBSS洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS稀释至2x 106细胞/毫升。在细胞悬液中加入山羊血清至终浓度为1％。在冰上封闭细胞30分钟，然后用HBSS洗涤2次。离心后收集细胞并重悬于FACS缓冲液(HBSS+1％BSA,v/v)至2x 106细胞/毫升。然后将100微升细胞悬液加入到96孔板的每个孔中。将100微升实施例2所得的纯化的PD-L1抗体加入到96孔每孔中，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液洗涤样品2次，将100微升Alexa 488标记的二抗(英杰公司)加入96孔并在冰上孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤样品3次，每孔加入100微升固定缓冲液(4％v/v多聚甲醛)并孵育10分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次并重悬于100μLFACS缓冲液。使用FACS Calibur(BD)检测平均荧光强度(MFI)，结果如图7～8和表10～11所示。IgG对照为人IgG，表中的数据为细胞群的平均荧光强度。
表10 FACS测定的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与CHO-K1-hPD-L1的结合活性
Figure BDA0001710072070000261
Figure BDA0001710072070000262
表11 FACS测定的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与CHO-K1-cPD-L1的结合活性
Figure BDA0001710072070000263
Figure BDA0001710072070000264
(部分C)抗PD-L1抗体的的结合亲和力和解离常数
通过Octed RED 96(Fortiebio)测定解离常数。根据制造商提供的仪器说明书实施详细操作和方法。简言之，链霉亲和素传感器(SA传感器，Fortiebio)用于亲和力测定。用含有0.1％(w/w)BSA和0.02％(v/v)吐温20的PBS缓冲液(pH7.4)将PD-L1ECD-hFc(免疫原A)稀释至10μg/mL并与链霉亲和素传感器孵育。在30℃下五种不同浓度的抗PD-L1抗体与载有免疫原A的链霉亲和素传感器一起孵育3分钟。在30℃下，反应混合物在含有0.1％(w/w)BSA和0.02％(v/v)吐温20的PBS缓冲液(pH7.4)进一步孵育5分钟。使用Octet Red 96实时记录抗PD-L1抗体与免疫原A的缔合和解离信号。使用Octet用户软件测定亲和力、缔合和解离常数，结果在表12中示出。
表12 Octet Red 96测定的嵌合抗PD-L1单克隆抗体与人PD-L1ECD-hFc蛋白的结合动力学和亲和力
克隆号 K<sub>D</sub>(nM) k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s)
78B2D7 1.37E-10 8.40E+05 1.15E-04
78A11F6 1.48E-10 2.45E+05 3.64E-05
105C5D7 2.45E-10 1.50E+06 3.68E-04
73D3G2 <1.0E-12 3.98E+05 <1.0E-07
73G11B3 1.16E-10 3.41E+05 3.95E-05
127D2F3 <1.0E-12 3.68E+05 <1.0E-07
192D9E7 5.19E-11 5.06E+05 2.63E-05
实施例4–检测抗PD-L1抗体阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合的能力
实施基于蛋白质的受体配体结合试验以测定抗PD-L1抗体阻断PD-L1PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合的能力。
如实施例2中制备生物素化的重组PD-L1ECD-hFc所述的那样，制备生物素化的重组PD-1ECD和B7.1ECD蛋白。PD-1的胞外结构域对应于Uniprot数据库蛋白Q15116的氨基酸Leu25-Glu167，B7.1的胞外结构域对应于Uniprot数据库蛋白NP_005182的氨基酸Val35-Asn242。
用PBS稀释纯化的PD-L1ECD-hFc(实施例2)至1.0μg/mL的终浓度，将100μL稀释的PD-L1ECD-hFc加入到96孔板的每个孔中，然后用塑料薄膜密封并在4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)吐温20)将板洗涤两次并在室温下用封闭缓冲液(PBS+0.01％(v/v)BSA+1％吐温20(w/w))孵育2小时。吸出封闭缓冲液，并将50μL实施例2的抗PD-L1抗体加入到96孔板的每个孔中。100μL生物素化的重组PD-1ECD或B7.1ECD加入到每个孔中，混合，并在37℃下孵育2小时。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)吐温20)将板洗涤三次。然后将100微升HRP缀合的链酶亲和素(西格玛)添加到各孔中，并在37℃孵育2小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，将100μL的TMB底物加入到每个孔中。在室温下孵育30分钟后，通过加入100μL终止溶液(0.1N HCl)将反应停止。用ELISA读板器(384plus SpectraMax,Molecular Devices)测定在OD450nm的吸光度。结果，图9-10中所示，证明了抗PD-L1抗体可以阻断PD-L1与结合伴侣PD-1和B7.1结合。
实施例5-PBMC刺激试验以检测抗PD-L1抗体阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合的能力
(A)进行T细胞刺激试验检测抗PD-L1抗体通过阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合对T细胞刺激的效果
(步骤1)通过Ficoll梯度从全血分离外周血单核细胞(PBMC)
以1:1的比例用PBS稀释全血并使用无菌移液管将其轻轻加至Ficoll溶液(GE医疗保健)顶部。Ficoll与稀释全血的体积比为3：4。在20℃下将样品以400g离心30分钟。离心后形成三层溶液，上部层是血浆，中间奶白色层为单核细胞。用无菌移液管从中间层收集单核细胞并将它们转移到新的离心管中。加入三倍样品体积的PBS，将样品在室温下以100g离心10分钟。弃去上清液，将淋巴细胞重悬于用10ml PBS缓冲液中。用PBS洗涤淋巴细胞三次以除去血液中的血小板。然后将淋巴细胞悬液重悬于含10％FBS的10毫升RPMI 1640培养基(英杰公司)。
(步骤2)PBMC刺激试验
通过亚克隆PD-L1核苷酸序列到pIRES质粒产生编码全长PD-L1蛋白的构建体(pIRES-puro-PD-L1)。为将抗CD3(OKT3)(参见Kipriyanov等人,1997,Peds.10:445-453)锚定到细胞膜，OKT3scFv融合至小鼠CD8a的C-末端(NCBI登录号：NP-1074579.1的氨基酸113-220)并亚克隆到质粒pIRES-OS8(参见Sambrook和Russell,Id.)。采用实施例2的制备方法将pIRES-puro-PD-L1和pIRES-OS8共转染到CHO-K1和Hep3B细胞从而产生稳定的细胞系CHO-K1-PD-L1/OS8和Hep3B-PD-L1/OS8。将细胞用于刺激T淋巴细胞。实验前，在37℃下用10微克/毫升丝裂霉素处理CHO-K1-PD-L1/OS8和Hep3B-PD-L1/OS8三小时。
将100微升PBMC(含有5x 104细胞)加入到96孔板的孔中，然后将测试抗体溶液加入到96孔板中并在室温下孵育15分钟。将50μL的5x 103CHO-K1-PD-L1/OS8或Hep3B-PD-L1/OS8加入到每个孔中并在37℃、5％CO2条件下培养72小时。收集上清液并储存于-20℃直至分析。
(步骤3)ELISA检测干扰素γ(IFN-γ)的分泌
按照生产商提供的使用说明书和试剂盒试剂，使用人IFN-γ的Quantikine ELISA试剂盒(R&D系统SIF50)定量培养物上清液中的IFN-γ水平。简言之，将IFN-γ的多克隆抗体包被到ELISA微孔板上，并将400μL培养上清液以及标准品加入到各孔中并且在室温下孵育2小时。洗涤缓冲液将板洗涤4次，然后加入HRP缀合的抗人IFN-γ抗体，在室温下孵育2小时。洗涤后，加入显色底物并在室温下避光孵育30分钟，通过加入终止溶液终止反应。使用ELISA酶标仪测试在450nm处的吸光度，在图11-12和表13中示出的结果表明PBMC淋巴细胞刺激试验分析的抗PD-L1抗体可以增加IFN-γ的分泌。IgG对照是人IgG，列在表中的值是培养上清液中的IFN-γ浓度(皮克/毫升)。
表13嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导刺激的PBMC释放IFN-γ
Figure BDA0001710072070000281
Figure BDA0001710072070000291
Figure BDA0001710072070000292
实施例6–混合淋巴细胞试验测试抗PD-L1抗体阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合的能力
(B)进行混合淋巴细胞反应以测试抗PD-L1抗体通过阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1结合对T细胞刺激的影响
(步骤1)人CD14+细胞的树突状细胞分离和培养
按照制造商提供的说明，使用Ficoll Paque Plus(GE医疗保健)从全血中分离PBMC。该方案与实施例5A，步骤1中所述相同。
将PBMC重悬于含10％FBS的RPMI 1640完全培养基中，将细胞浓度调节至1x 105细胞/毫升。在37℃、5％(v/v)CO2条件下，在T-75培养瓶中培养细胞2小时。将培养物上清液和未贴壁细胞转移到新的T-75培养瓶中，将补充有10％FBS的新RPMI 1640完全培养基添加至原T-75培养瓶中并在37℃和5％(v/v)CO2条件下孵育2小时。去除培养物上清液和未贴壁细胞，将含有10％FBS的RPMI 1640培养基添加至贴壁细胞并在37℃和5％(v/v)CO2条件下孵育18小时。去除培养物上清液和未贴壁细胞，将补充有500U/mL重组人GM-CSF(PEPROTECH)和500U/mL重组人白介素IL-4(PEPROTECH)的RPMI 1640完全培养基添加至贴壁细胞并培养4天。4天后，用补充有GM-CSF和IL-4的RPMI 1640完全培养基换液并再培养细胞2天。然后用含1μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养基换液并孵育18小时。然后通过加入含EDTA的PBS收集树突状细胞并300g离心5分钟。吸出上清液，用PBS再洗涤细胞一次。将收集的人CD14+树突状细胞重悬于RPMI 1640完全培养基，并测定细胞计数。
(步骤2)分离和纯化人CD4+T细胞
按照制造商提供的说明书，使用MagCellectTM人CD4+T细胞分离试剂盒(R&D系统)从PBMC分离和纯化人CD4+T细胞。
(步骤3)混合淋巴细胞反应
在96孔板中共培养来自不同健康志愿者纯化的CD4+细胞和树突状细胞。细胞密度调整到每80微升105细胞。将105纯化的CD4+T细胞和2x 104树突状细胞加入到96孔-细胞板的每个孔中，将实施例2纯化的抗PD-L1抗体添加至板中的适当孔中，在37℃，5％(v/v)CO2培养箱中孵育板。第3天收集上清用于IL-2检测，第5天用于IFN检测，并测试细胞因子水平。
(步骤4)ELISA测试上清中IFN-γ和IL-2水平
按照制造商提供的使用说明书和试剂盒试剂，分别使用人IFN-γ的QuantikineELISA试剂盒(R&D系统SIF50)和人IL-2的Quantikine ELISA试剂盒D2050(R&D系统S2050)对前步骤收集的上清中的IFN-γ和IL-2水平进行定量。
IL-2的结果示于图14、21-22、25-26和表14-19中，表明IL-2水平随抗PD-L1的抗体浓度升高而增加。IgG对照是人IgG，表14-19中列出的值是培养上清液中IL-2浓度(pg/mL)。PBMC供体0、1、2等指献血者号。
表14混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体0)
Figure BDA0001710072070000301
表15混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体2)
Figure BDA0001710072070000302
表16混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体1)
Figure BDA0001710072070000303
表17混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体2)
Figure BDA0001710072070000311
表18混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体1)
Figure BDA0001710072070000312
表19混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放(PBMC供体2)
Figure BDA0001710072070000313
IFN-γ的结果示于图13、15-20、23-24和表20-27中，表明IFN-γ水平随抗PD-L1的抗体浓度升高而增加。IgG对照是人IgG，表19-26中列出的值是培养上清液中IFN-γ浓度(pg/mL)。
表20混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000314
表21混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000321
表22混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000322
表23混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000323
表24混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000324
表25混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000325
表26混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000331
表27混合淋巴细胞反应试验测试的嵌合抗PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000332
实施例7–检测抗PD-L1抗体的可变区的氨基酸序列
总RNA分离：在对实施例2获得的杂交瘤亚克隆的上清液进行表征(即，验证和测试生物活性，实施例3-5)后，通过离心收集5x107杂交瘤细胞。将1mL的Trizol入到细胞沉淀中，混合，并转移至1.5ml离心管，并在室温下孵育5分钟。将0.2毫升氯仿加入到样品并涡旋15秒。静置2分钟后，在4℃下12000g离心混合物5分钟。收集上清液并转移到新的1.5毫升离心管，加入0.5毫升的异丙醇并轻轻混合，在室温下孵育样品10分钟。在4℃下12000g离心样品15分钟。将上清液吸出，并用1mL的75％(v/v)乙醇洗涤沉淀物。在4℃下12000g离心混合物5分钟，倾出上清液并且将沉淀物风干。通过加入DEPC处理的水至沉淀物(55℃的水浴中，10分钟)得到总RNA。
逆转录和PCR：将1微克RNA和逆转录酶加入到反应混合物中至20μL的最终体积，在42℃下孵育混合物60分钟，然后在70℃下孵育10分钟以终止反应。制备50微升PCR反应混合物，含有1微升cDNA，25pmol每种引物，1微升DNA聚合酶，250微摩dNTP和缓冲系统。PCR程序设置如下：在95℃下变性3分钟，35个循环的变性(95℃，30秒)，退火(55℃，30秒)和延伸(72℃，35秒)，随后在72℃最终延伸5分钟，得到了PCR产物。所使用的市售逆转录试剂盒是PrimeScript RT Master Mix(Takara，RR036)，和市售Q5超保真聚合酶PCR试剂盒购自NEB(M0492)。
克隆和测序：通过琼脂糖凝胶电泳检测5微升PCR产物，并用NucleoSpin Gel&PCR清洁(Clean-up)试剂盒(MACHEREY-NAGEL,740609)从琼脂糖凝胶中回收样品。连接反应：向50ng样品中加入50ng T载体、0.5μL连接酶和1μL缓冲液，并补充水至10μL最终体积。使用T4DNA连接酶(NEB，M0402)在16℃下孵育反应混合物30分钟。将5μL连接产物加入到100μL感受态细胞(ECOS 101感受态细胞，Yeastern，FYE607)，并在冰上孵育1分钟，在42℃下热激1分钟，再次在冰上孵育1分钟。通过加入650μL不含抗生素的SOC培养基并在振荡培养箱中以37℃、200rpm孵育30分钟回收细胞。在37℃下200μL各细菌培养物涂布在含有抗生素的LB琼脂平板过夜。第二天，使用T载体引物M13F和M13R配置PCR反应体系。使用移液管取细菌菌落并浸入到PCR反应混合物，上下吹吸。将一半反应混合物转移到含有100nM的氨苄青霉素的LB琼脂平板上。PCR反应后，取出5微升PCR产物并通过琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品送于测序和分析(Kabat,1991,客观感兴趣的蛋白质的序列“Sequences of proteins ofobjective interest”,美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。测序结果示于表1-2。
实施例8-完全人抗PD-L1抗体转化、表达和纯化
(步骤1)质粒构建和制备：根据实施例6获得抗PD-L1抗体重链和轻链可变区的序列。抗PD-L1抗体重链可变区序列被亚克隆到含有信号肽和具有突变S228P的人重链IgG4恒定区的表达载体。抗PD-L1抗体轻链可变区序列被亚克隆到含有信号肽和人抗体轻链κ恒定区的表达载体。验证重组质粒并通过测序证实(测序方法同实施例6)。使用试剂盒(MACHEREY-NAGEL)进行碱性裂解以改善重组质粒的纯度和质量，通过0.22uM过滤器(密理博)过滤质粒。将纯化的质粒用于转染。
(步骤2)转染：在37℃，130RPM，8％CO2(v/v)条件下在FreeStyle 293培养基(英杰公司)中培养HEK293E细胞(英杰公司)。将HEK293E细胞调节至1-1.5x106/mL的细胞密度用于转染。将10％(v/v)F68(英杰公司)加入到FreeStyle 293培养基中至0.1％(v/v)的终浓度，作为培养基A。将5毫升培养基A和200微克/毫升PEI(西格玛)混合得到培养基B。将5毫升培养基A和100微克/毫升步骤1的重组质粒混合得到培养基C。孵育5分钟后，将培养基B和培养基C混合并孵育15分钟得到混合物D。在连续搅拌下，将10mL混合物D缓慢加至100毫升HEK293E细胞以避免PEI的局部积聚。振动下将HEK293E细胞孵育过夜。第二天，加入蛋白胨至0.5％的终浓度(w/v)。在第5-7天左右，测定抗体效价。在第6-7天左右，离心HEK293E培养物(30分钟，3500RPM)，收集上清液并通过0.22uM过滤器过滤纯化。
(步骤3)抗体纯化：用0.1M NaOH洗涤A蛋白柱(GE)30分钟或用5个床体积的0.5M的NaOH洗涤以去除内毒素。将长期未使用的柱在1M NaOH中浸泡至少1小时，用不含内毒素的水洗涤至中性pH，并用10个床体积的1％Triton X100洗涤。然后用5个床体积的PBS(PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2)平衡。将步骤2的过滤的上清液上样至柱，并且如果需要的话收集流出液。用5个床体积的PBS洗涤柱，然后用5个床体积的0.1M甘氨酸-HCl pH 3.0洗脱。采用0.5个床体积的1M的Tris-HCl(1.5M的NaCl)pH8.5中和含有抗PD-L1抗体的洗脱物。在1×PBS中透析人抗PD-L1抗体4小时，以避免内毒素污染。透析后，通过分光光度法或试剂盒检测抗PD-L1抗体浓度，通过HPLC-SEC检测抗体的纯度，并通过内毒素检测试剂盒(Lonza)检测内毒素含量。表征完全人抗PD-L1抗体，其结果显示在图27-52和表28-46中。图27-28和表28-29示出通过ELISA完全人抗PD-L1抗体与人和猴PD-L1-ECD的结合。图29-30和表30-31示出通过FACS完全人抗PD-L1抗体与表达人和猴PD-L1的CHOK1细胞的结合。图31-32示出完全人抗PD-L1抗体阻断PD-L1与其结合伴侣PD-1和B7.1的结合。图33-42和表32-41示出在混合淋巴细胞反应中完全人抗PD-L1抗体增加IFN-γ和IL-2释放。图43-47和表42-46示出在T细胞刺激试验中完全人抗PD-L1抗体增加IFN-γ和IL-2释放。
表28 ELISA检测的完全人抗PD-L1单克隆抗体与人PD-L1ECD-hFc的结合活性
Figure BDA0001710072070000351
Figure BDA0001710072070000352
表29 ELISA检测的完全人抗PD-L1单克隆抗体与猴PD-L1ECD-hFc的结合活性
Figure BDA0001710072070000353
Figure BDA0001710072070000354
表30 FACS检测的完全人抗PD-L1单克隆抗体与CHOK1-hPD-L1的结合活性
Figure BDA0001710072070000361
表31 FACS检测的完全人抗PD-L1单克隆抗体与CHO-K1-cPD-L1的结合活性
Figure BDA0001710072070000362
表32混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000363
表33混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000364
表34混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000371
表35混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000372
表36混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000373
表37混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IL-2释放
Figure BDA0001710072070000374
表38混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000375
表39混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000381
表40混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000382
表41混合淋巴细胞反应试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000383
表42 T细胞刺激试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000384
表43 T细胞刺激试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000385
表44 T细胞刺激试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000391
表45 T细胞刺激试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000392
表46 T细胞刺激试验检测的完全人PD-L1单克隆抗体诱导IFN-γ释放
Figure BDA0001710072070000393
实施例9-通过Biacore检测结合和解离常数
抗人Fc IgG固定于流动池1和2：HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％P20，pH 7.4)用作运行缓冲液，使用固定向导模板进行抗人Fc IgG的固定。S系列CM5传感芯片的流动池1和2用新鲜混合的50毫摩尔/升NHS和200毫摩尔/升EDC进行活化。将10mM醋酸钠(pH 4.5)中稀释的20μg/mL抗人Fc IgG注入到活化的流动池1和2。用1M乙醇胺封闭其余的有效连接位点。
将重组His-标记的hPD-L1ECD蛋白稀释至50nM，接着用HBS-EP+缓冲液进行四次2倍系列稀释。His-标记的hPD-L1ECD蛋白浓度分别为0nm、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM。采用HBS-EP+作为运行缓冲液检测KD。以10μL/min流速将每种抗体注射在CM5传感器流动池2上以达到响应230RU。然后将制备的His标记的hPD-L1ECD蛋白注射在流动池1和2上，流速30μL/min，180秒。缓冲液流保持400秒用于解离测量(30微升/分钟)。为从表面去除所测试抗体，10mM甘氨酸-HCl pH 1.5注射20秒(30微升/分钟)。流动池1用作参比流动池。对于各浓度连续稀释的His-标记的PD-L1ECD蛋白重复进行上述步骤。使用Biacore T200评估软件评估每种抗体的KD值，将数据用1：1结合模型拟合。结果示于表47。
表47Biacore检测的完全人抗PD-L1单克隆抗体与His-标记的人PD-L1ECD蛋白的结合动力学和亲和力
克隆号 K<sub>D</sub>(M) k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s)
78A11F6 6.430E-10 7.336E+5 4.717E-4
73D3G2 5.358E-10 1.414E+6 7.573E-4
实施例10–ADCC和CDC效应子功能分析
进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)试验以确定完全人抗PD-L1抗体的效应子功能的不存在推定。
对于ADCC试验，用ADCC培养基(不含酚红)将表达PD-L1的HCC827细胞样品调节至12.5×104细胞/毫升的浓度。将40μL细胞悬浮液(1×104活细胞)加入到V形底96孔板的每个孔中。在ADCC培养基(不含酚红)中连续稀释20μL抗体并加入到每个孔中，一式三份。在22-25℃下将板孵育30分钟。用ADCC培养基(不含酚红)调整稳定转染FcγRⅢ158V的NK92细胞，以致通过加入40μL稳定转染FcγRⅢ158V的NK92细胞至靶细胞，效应子与靶细胞的比例为1:1。然后将板在37℃孵育4小时。经过4小时的培养，将100μL CytoTox 96试剂盒(Promega)中的底物加入每个孔中。为了获得最大的细胞裂解对照，加入2μL裂解溶液(CytoTox-ONETM试剂盒，Promega)，10分钟后加入100μL CytoTox 96试剂盒中的底物。将板在室温下孵育10分钟，然后将50μL终止溶液加入到各孔中，混合30秒。检测560/590nm处的吸光度，并使用GraphPad Prism 5.0计算1％裂解值。图48中所示结果表明在HCC827细胞中阳性对照抗EGFR抗体诱导ADCC，但完全人抗PD-L1抗体对HCC827细胞没有ADCC效应。
对于CDC试验，用细胞培养基调节HCC827细胞至1.25×106细胞/毫升。将细胞加至平底96孔白色板，40微升/孔。40微升/孔的完全人抗PD-L1抗体，在CDC培养基连续稀释，加入到每个孔中，一式两份。将平板在通风橱中孵育30分钟。将市售纯化的人补体(Quidel，目录号042637)加至含有细胞的板中，20微升/孔，至20％的终浓度。将板在37℃孵育20小时。根据制造商提供的说明，采用Celltiter-glo发光细胞存活力试剂盒(Promega，编号G7573)测试细胞活性。在微孔板振荡器上以200的速度振摇板2分钟，然后在室温下孵育10分钟。用Envision读发光信号。对于数据分析，使用GraphPad Prism 5.0计算％细胞毒性。结果，如图49所示，表明在HCC827细胞中阳性对照抗EGFR抗体诱导CDC，但完全人抗PD-L1抗体对HCC827细胞没有CDC效应。
实施例11-差示扫描量热法(DSC)测定抗体热稳定性
用样品缓冲液将完全人抗PD-L1抗体调节至1mg/ml，终体积为约700μL。参数设置如下(VP-DSC)：起始温度30℃；最终温度100℃；扫描速度50℃/小时；重新扫描数0；扫描前恒温3分钟；扫描后恒温0分钟；循环后恒温25℃；过滤周期25秒；反馈模式/增益无；细胞补充参数35℃。通过减去相应的缓冲-缓冲扫描并随后根据痕量拟合基线来处理所得的蛋白质-缓冲热分析图。使用OriginTM7.0软件记录热分析图观测到的每个峰顶点的Tm。结果示于图50中。
实施例12-抗体冻/融稳定性
完全人抗PD-L1抗体的冻/融稳定性按如下进行表征。每种抗PD-L1抗体的冷冻储备液的100μL等份试样在室温下解冻。一旦完全解冻后将样品在-80℃冰箱中迅速冷冻并保存在-80℃下至少两小时，然后在室温下再次解冻。样品经过三次相同的冻/融循环。目视检查沉淀。在三次冻/融循环后从样品取出20μL等份试样用于尺寸排阻色谱(SEC)分析。用HPLC-SEC表征分析冷冻/解冻循环之前和之后完全人抗PD-L1抗体的稳定性。在图51中示出的结果证明了三次冻/融循环后，单体IgG占测试的每个抗PD-L1抗体的95％以上。
实施例13-抗体溶解度
4℃下，通过用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL 30K)在以14000g浓缩10毫克IgG至>100mg/mL来表征完全人抗PD-L1抗体的溶解度。将2毫升或更多的IgG加入到离心过滤器并在4℃下以14000g浓缩。离心设定时间为2分钟、3分钟、5分钟、8分钟、15分钟和20分钟，每次将20μL等份样品加至收集管以使用NanoDrop测量A280浓度。当浓度达到100毫克/毫升结束离心。对于HPLC-SEC表征，将6μL浓缩样品注射到HPLC-SEC柱，基于峰面积来确定单体和聚集体的百分比。图52中示出的结果证实测试的所有完全人抗PD-L1抗体的溶解度超过100毫克/毫升，并且对于所有测试的抗PD-L1抗体单体IgG均高于95％。
虽然已详细并参考其具体实施方式描述本发明，但在没有脱离本发明的精神和范围下作出的各种改变和修改对本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。
参考
Blank等人,2005,癌症免疫疗法“Cancer Immunotherapy”,54:307-314
Bowers NL,Helton ES,Huijbregts RPH等人,PLoS Pathog.2014年3月；10(3):e100399
Dong H,Zhu G,Tamada K,Chen L.Nature Med.1999；5:1365–1369
Freeman等人,2000,J.Exp.Med.,192:1027-34
Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546
Hirano等人,2005,Cancer Res.,65:1089-96
Kabat,1991,客观感兴趣的蛋白质序列“Sequences of proteins of objectiveinterest”,美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达
Kipriyanov等人,1997,Peds.10:445-453
Lonberg和Huszar,1995,Internal Rev.Immunol.13:65-93
Lonberg等人,1994,自然Nature 368:856-859
Sambrook和Russell,1989,分子克隆:实验室手册,纽约:冷泉港实验室出版社,第二版.
Sheng Yao 2013Nat Rev Drug Discov.2013 12(2):130–146
Weinstock和McDermott,2015,Ther Adv Urol.,7(6):365-77
Wherry,2011,Nat.Immunol.,12:492-99
Zippelius等人,2015,Cancer Immunol Res.；3(3):236-44
Zou和Chen L,2008,Nat Rev Immunol.,8(6):467-77
序列表
<110> 钜川生物医药
<120> 抗PD-L1抗体及其用途
<130> 689105.0005
<150> CN201610003723.6
<151> 2016-01-04
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Trp Phe Gly Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Ala Asp Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Asp Arg Leu Trp Phe Gly Gly Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Lys Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Arg Ala Val Pro Gly Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Lys Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Asp Arg Ala Val Pro Gly Thr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Leu Phe Thr
1 5
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ile Lys Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Asn Ile Lys Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Ser Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Arg Ser Trp Tyr Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Asp Gly Arg Ser Trp Tyr Pro Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Val Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Ser Ser
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Glu Val Ser Ile Leu Glu Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Gln Gln Tyr His Ser Phe Ser Ser
1 5
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Arg Ala Val Pro Gly Thr Gly Ala Leu Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Asp Arg Ala Val Pro Gly Thr Gly Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Phe Thr
1 5
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ile Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
Asp Pro Ile Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Gly Ile Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 48
Gln Gln Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Thr
1 5
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Lys Pro His Trp Gly Gly Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
Asp Lys Pro His Trp Gly Gly Val Met Asp Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Glu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Ser Trp Thr
1 5
<210> 57
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcga 300
ctatggttcg ggggggttat ggatgcctgg ggtcaaggag cttcagtcac tgtctcctca 360
<210> 58
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaat cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaaact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtaaagtctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagatcga 300
gcagtgcctg gtacgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt catcgtctct 360
tca 363
<210> 59
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaaatga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagaaatatt 300
aagtggggag atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 60
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat acctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggctggagtg ggtggccaac ataaaacaag atggaggtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gagagatggc 300
cgcagctggt accctgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacagtggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 61
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 62
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatgatagtt ctttgttcac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 63
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caatttactc ctgtcaacag agttacagta tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 64
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt acctggttgg cctggtatca gcagaaactg 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgag gtgtctattt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatcatagtt tttcttcttt cggcggaggg 300
accagggtgg agatcaaa 318
<210> 65
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag tctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaaact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaat ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg actcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagatcga 300
gcagtgcctg gaacgggggc tttagatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 66
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt atttgtttac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 67
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc actgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaagtactat 180
gtggactctg tgaagggccg attgaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactgtat 240
ctgcaaatga agagtctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccc 300
atatatagca gttactttga ctactggggc cagggaatcc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 68
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg cagcttacta ctgtcaacag agttacggta tcccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 69
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtac gagagataag 300
ccccactggg gaggggttat ggatgcctgg ggtcaaggaa cttcagtcac tgtctcctca 360
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgaaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatcatagtt attcgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 71
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr
210 215 220
<210> 72
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 73
<211> 873
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60
gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420
attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540
accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600
acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660
acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720
ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780
ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840
aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873
<210> 74
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 含S228P突变人IgG4恒定区
<400> 74
gctagcacca agggcccttc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 60
tccaccgccg ctctgggctg tctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt gaccgtgagc 120
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 180
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240
tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagtcc 300
aagtacggcc ctccttgccc tccctgccct gcccctgagt tcctgggcgg accctccgtg 360
ttcctgttcc ctcctaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacccc tgaggtgacc 420
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cctgaggtcc agttcaattg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cctcgggagg aacagttcaa ctccacctac 540
cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggaatacaag 600
tgcaaggtca gcaacaaggg cctgccctcc tccatcgaga aaaccatctc caaggccaag 660
ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcctccta gccaggaaga gatgaccaag 720
aatcaggtgt ccctgacatg cctggtgaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggag 780
tgggagagca acggccagcc agagaacaac tacaagacca cccctcctgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctgta ctccaggctg accgtggaca agtcccggtg gcaggaaggc 900
aacgtctttt cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 960
ctgtccctgt ctctgggcaa gtga 984
<210> 75
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 含S228P突变人IgG4恒定区
<400> 75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 76
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人抗体轻链κ恒定区
<400> 76
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttga 324
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人抗体轻链κ恒定区
<400> 77
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 78
<211> 663
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 78
tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggtagcaa tatgacaatt 60
gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctggctg cactaattgt ctattgggaa 120
atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 180
agtagctaca gacagagggc ccggctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 240
cttcagatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggtgt accgctgcat gatcagctat 300
ggtggtgccg actacaagcg aattactgtg aaagtcaatg ccccatacaa caaaatcaac 360
caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag 420
ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag 480
accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga 540
atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 600
aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 660
act 663

Claims (13)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，序列分别为SEQ ID NO：30、31、32、26、27和28；
其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PD-L1。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：25所示，所述轻链可变区的序列如SEQID No：29所示。
3.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
4.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是人的。
5.如权利要求4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含具有S228P突变的人重链IgG4恒定区，和人抗体轻链κ恒定区。
6.一种分离的核酸，编码权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.一种载体，包含权利要求6所述的分离的核酸。
8.一种宿主细胞，包含权利要求6所述的分离的核酸。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-5任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
10.一种权利要求1至5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段的用途，用于体外阻断PD-L1与PD-1和/或B7.1结合、或体外增强IFN-γ和IL-2分泌。
11.一种权利要求1至5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求9所述的药物组合物的用途，用于制备治疗肿瘤的药物，其中所述肿瘤选自下组：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和肾癌。
12.一种制备权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，从而产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述细胞或细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
13.一种制备包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合从而获得所述药物组合物。
CN201680076656.9A 2016-01-04 2016-12-27 抗pd-l1抗体及其用途 Active CN108699146B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610003723.6A CN106939047B (zh) 2016-01-04 2016-01-04 一种pd-l1抗体及其制备方法
CN2016100037236 2016-01-04
PCT/CN2016/112428 WO2017118321A1 (en) 2016-01-04 2016-12-27 Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108699146A CN108699146A (zh) 2018-10-23
CN108699146B true CN108699146B (zh) 2021-12-03

Family

ID=59273286

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610003723.6A Active CN106939047B (zh) 2016-01-04 2016-01-04 一种pd-l1抗体及其制备方法
CN201680076656.9A Active CN108699146B (zh) 2016-01-04 2016-12-27 抗pd-l1抗体及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610003723.6A Active CN106939047B (zh) 2016-01-04 2016-01-04 一种pd-l1抗体及其制备方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10889648B2 (zh)
EP (1) EP3400243A4 (zh)
JP (1) JP6779299B2 (zh)
CN (2) CN106939047B (zh)
HK (1) HK1255604A1 (zh)
WO (1) WO2017118321A1 (zh)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN107298697B (zh) * 2017-08-24 2019-05-24 张灏 一种人pd-l1蛋白y123位点磷酸化抗体及其制备方法和应用
EP3470429A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-17 Numab Innovation AG Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof
CA3074802A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Numab Therapeutics AG Antibodies targeting pdl1 and methods of use thereof
EP3694545A4 (en) * 2017-10-11 2021-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System HUMAN PD-L1 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEM
KR20200106885A (ko) 2017-11-17 2020-09-15 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Pd-l1에 대항하는 단일-도메인 항체 및 이의 변이체들
CN111344305B (zh) * 2017-11-27 2022-09-16 山东博安生物技术股份有限公司 抗pd-l1的抗体及其用途
WO2019129136A1 (zh) * 2017-12-27 2019-07-04 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-l1抗体及其用途
CN109970857B (zh) * 2017-12-27 2022-09-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-l1抗体及其用途
CN110144010B9 (zh) * 2018-02-14 2021-01-05 上海洛启生物医药技术有限公司 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途
JP7390301B2 (ja) 2018-03-23 2023-12-01 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ヒトｐｄ－ｌ２抗体およびその使用方法
KR102475106B1 (ko) 2018-03-29 2022-12-08 아이-맵 항-pd-l1 항체 및 그것의 사용
SG11202009791VA (en) * 2018-04-09 2020-11-27 Origincell Therapeutics Co Ltd Anti-pd-l1 antibody and use thereof
MX2020010913A (es) 2018-04-17 2021-01-08 Celldex Therapeutics Inc Anticuerpos anti-cd27 y anti-pd-l1 y constructos biespecíficos.
US11976123B2 (en) 2018-04-20 2024-05-07 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-CD40 antibodies and uses thereof
KR20210056288A (ko) 2018-06-01 2021-05-18 타유 후아시아 바이오테크 메디컬 그룹 컴퍼니 리미티드 질환 또는 병태를 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
CN112996910A (zh) * 2018-07-11 2021-06-18 动量制药公司 与靶向PD-L1的工程化Fc-抗原结合结构域构建体有关的组合物和方法
CN110713543B (zh) * 2018-07-11 2023-03-14 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种抑制pd-l1棕榈酰化修饰和表达的多肽及其应用
CN109374881B (zh) * 2018-07-18 2019-07-19 益善生物技术股份有限公司 Pd-l1抗体、组合物及试剂盒
WO2020029274A1 (zh) * 2018-08-10 2020-02-13 苏州奥特铭医药科技有限公司 一种减毒棒状病毒的制备方法及应用
EP3856790A4 (en) 2018-09-28 2022-09-28 Lyvgen Biopharma Holdings Limited ANTI-CD40 BINDING MOLECULES WITH MODIFIED CF DOMAINS AND THEIR THERAPEUTIC USES
CN111234017B (zh) * 2018-11-28 2022-09-09 优迈生物科技(连云港)有限公司 一种抗人pd-l1抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用
MX2021007692A (es) * 2018-12-27 2021-09-30 Gigagen Inc Proteinas de union anti-pd-1 y metodos de uso de las mismas.
EP3902563A4 (en) * 2018-12-27 2022-12-28 Gigagen, Inc. ANTI-PD-L1 BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF
EA202191929A1 (ru) * 2019-01-11 2021-09-23 Дзе Уистар Инститьют Оф Энэтоми Энд Байолоджи Днк-кодируемые моноклональные антитела, нацеленные на pd-1, для лечения и профилактики злокачественного заболевания
CN110372793B (zh) * 2019-03-21 2022-09-06 南京东极医药科技有限公司 Pd-l1的纳米抗体及其临床应用
KR102357951B1 (ko) * 2019-04-11 2022-02-07 (재) 스크립스코리아항체연구원 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
MX2021004897A (es) * 2019-04-26 2021-06-18 I Mab Biopharma Us Ltd Anticuerpos pd-l1 humano.
BR112021024820A2 (pt) * 2019-06-10 2022-01-25 Shandong Boan Biotechnology Co Ltd Proteína de fusão bifuncional contra pdl1 e tgfss e uso da mesma
CN110330566A (zh) * 2019-06-11 2019-10-15 南京华岩生物技术有限公司 一种具有双重可变结构域的双特异性结合的免疫球蛋白
CN110684844B (zh) * 2019-06-27 2023-01-24 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） RBPJL基因的p.P476S突变作为PD-1抗体用药指导标志物中的应用
GB201910138D0 (en) * 2019-07-15 2019-08-28 Capella Bioscience Ltd Anti-pd-l1 antibodies
CN112574314A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 和铂医药(苏州)有限公司 一种融合蛋白及其应用
CN113039208B (zh) * 2019-09-30 2022-11-04 和铂医药(上海)有限责任公司 一种抗pd-l1抗原结合蛋白及其应用
CN112759647B (zh) * 2019-10-21 2024-03-26 上海宏成药业有限公司 一种抗pd-l1的抗体及其制药用途
EP4032908A4 (en) * 2019-10-21 2023-11-08 HC Biopharma (Shanghai) Co., Ltd ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND ITS PHARMACEUTICAL USE
EP4056592A4 (en) * 2019-11-08 2024-03-20 Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co., Ltd. ANTIBODY AGAINST HUMAN PROGRAMMED CELL DEATH LIGAND 1 (PD-L1) AND USE THEREOF
AU2021206256A1 (en) 2020-01-10 2022-07-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for delivery of immunotherapy agents across the blood-brain barrier to treat brain cancer
CN113372449B (zh) * 2020-03-10 2022-09-27 中国科学院微生物研究所 一种非红细胞凝集的抗pd-l1/cd47双特异抗体及其在抗肿瘤治疗中的应用
WO2021205359A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Anti-phf-tau antibodies and uses thereof
CN112684182B (zh) * 2020-12-15 2022-06-28 上海大学 一种非疾病诊断的检测pd-l1的免疫传感器系统
CN117769434A (zh) * 2021-05-20 2024-03-26 黛安瑟斯医疗运营公司 与C1s结合的抗体和其用途
CN113480614B (zh) * 2021-08-13 2023-01-10 中国人民解放军总医院 一类靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途
WO2023215560A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Atoosa Corporation Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp)
CN116063526A (zh) * 2022-12-31 2023-05-05 合肥天港免疫药物有限公司 抗pdl1的抗体及其用途
US20240294651A1 (en) 2023-01-30 2024-09-05 Kymab Limited Antibodies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101248089A (zh) * 2005-07-01 2008-08-20 米德列斯公司 抗程序性死亡配体1（pd-l1）的人单克隆抗体
WO2015036499A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Medimmune Limited Anti-b7-h1 antibodies for treating tumors
CN104736168A (zh) * 2012-05-31 2015-06-24 索伦托治疗有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
CN104961829A (zh) * 2009-11-24 2015-10-07 米迪缪尼有限公司 针对b7-h1的靶向结合剂

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2284194A1 (en) * 2004-12-21 2011-02-16 AstraZeneca AB Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
MX2009003393A (es) 2006-10-02 2009-05-11 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos de alta afinidad para el receptor de il-4 humano.
US9403904B2 (en) 2008-11-07 2016-08-02 Fabrus, Inc. Anti-DLL4 antibodies and uses thereof
CN114835812A (zh) * 2008-12-09 2022-08-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
RU2607014C2 (ru) 2011-03-29 2017-01-10 Рош Гликарт Аг Fc варианты антитела
EA036814B9 (ru) * 2011-11-28 2021-12-27 Мерк Патент Гмбх Антитело против pd-l1 (варианты), композиция, содержащая это антитело, и их применение
MX370848B (es) * 2012-10-04 2020-01-08 Dana Farber Cancer Inst Inc Anticuerpos monoclonales humanos anti-pd-l1 y métodos de uso.
SG10201701380TA (en) * 2013-03-15 2017-04-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
TWI680138B (zh) * 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
CN105175544B (zh) * 2015-10-20 2021-04-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101248089A (zh) * 2005-07-01 2008-08-20 米德列斯公司 抗程序性死亡配体1（pd-l1）的人单克隆抗体
CN104961829A (zh) * 2009-11-24 2015-10-07 米迪缪尼有限公司 针对b7-h1的靶向结合剂
CN104736168A (zh) * 2012-05-31 2015-06-24 索伦托治疗有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
WO2015036499A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Medimmune Limited Anti-b7-h1 antibodies for treating tumors

Also Published As

Publication number Publication date
CN108699146A (zh) 2018-10-23
JP6779299B2 (ja) 2020-11-04
WO2017118321A1 (en) 2017-07-13
CN106939047A (zh) 2017-07-11
CN106939047B (zh) 2021-08-31
US20190010233A1 (en) 2019-01-10
EP3400243A1 (en) 2018-11-14
EP3400243A4 (en) 2019-09-25
US10889648B2 (en) 2021-01-12
JP2019503687A (ja) 2019-02-14
HK1255604A1 (zh) 2019-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108699146B (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
CN107922494B (zh) 抗pd-1抗体及其应用
CN109762066B (zh) 4-1bb抗体及其制备方法和应用
JP2022180438A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
CN110366560B (zh) 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
KR101577843B1 (ko) 인간 ｏｘ４０ 수용체에 대한 결합 분자
CN116239698A (zh) 双功能融合蛋白及其医药用途
CN113508139B (zh) 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途
WO2019141268A1 (zh) 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2021218874A1 (zh) 一种靶向人claudin和人PDL1蛋白的双特异抗体及其应用
CN108948193B (zh) 针对tim-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途
CN112513088B (zh) 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2023055904A (ja) 癌免疫療法のための併用療法での多重特異性抗体
CN113583127A (zh) 一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用
CN114829403A (zh) 抗pd-l1/抗b7-h3多特异性抗体及其用途
CN117751143A (zh) 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用
CN110343178B (zh) 抗人lag-3单克隆抗体及其应用
EP3894439A1 (en) Anti-periostin antibodies and uses thereof
CN114989304B (zh) 一种抗人Claudin18.2抗体及其应用
RU2804490C2 (ru) Новые композиции антител для иммунотерапии рака
RU2786434C2 (ru) Антитело к tigit и его использование
US20240067748A1 (en) Antibody capable of binding to trop2, and use thereof
TW202340256A (zh) 一種標靶ｃｄ４０的抗原結合蛋白及其製備和應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant