KR102475106B1 - 항-pd-l1 항체 및 그것의 사용 - Google Patents
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Abstract
항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 면역글로불린 C 도메인에 특이적으로 결합한다. 다양한 예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 116의 VH CDR2, 서열 번호: 117의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3, 또는 이것들 각각의 변이체를 포함한다. 암 및 감염성 질환과 같은 질환을 치료하고 진단하기 위해 항체 또는 그것의 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.
Description
항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편에 관한 것이다.
분화 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)의 클러스터로도 알려져 있는, 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1)는 특정 이벤트, 예컨대 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질환 및 간염과 같은 다른 질환 상태 중에 면역 시스템을 저해하는데 있어서 주요 역할을 하는 것으로 생각되는 40kDa 1형 막관통 단백질이다. PD-1 또는 B7.1로의 PD-L1의 결합은 림프절에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전송하고 상기 PD-1에 대한 보충은 유전자 Bcl-2의 낮은 조절에 의해 더 매개되는 아폽토시스(apoptosis)를 통해 림프절에서 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 또한 제어할 수 있다.
PD-L1의 상향 조절은 암이 숙주 면역 시스템을 회피할 수 있게 하는 것으로 보인다. 신장 세포 암종에 걸린 환자의 종양 견본의 분석으로 PD-L1의 높은 종양 발현이 증가된 종양 공격성 및 증가된 사멸 위험과 관련이 있다는 것을 발견하였다. 많은 PD-L1 억제자가 면역 종양학 요법으로서 개발 중에 있으며 임상 시험에서 양호한 결과를 나타내고 있다.
암 치료 외에도, PD-L1 억제는 또한 감염성 질환을 치료하는데 대한 징후를 나타냈다. 세포 내 감염의 마우스 모델에서, 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)는 T 세포, NK 세포, 및 대식 세포에서 PD-L1 단백질 발현을 유도하였다. PD-L1 차단 (예를 들어, 차단 항체를 사용하여)은 감염된 마우스에 대한 사망률을 증가시켰다. 차단은 대식 세포에 의한 TNFα 및 산화질소 생산을 감소시키고, NK 세포에 의한 그랜자임 B 생산을 감소시키고, 리스테리아 모노사이토게네스 항원-특이적 CD8 T 세포의 증식을 감소시켰다 (CD4 T 세포는 아님). 이 증거는 PD-L1이 세포 내 감염에서 양성 동시 자극 분자의 역할을 한다는 것을 시사한다.
본 발명은 인간 PD-L1 단백질에 대하여 높은 결합 친화도를 갖고 PD-L1과 그 수용체 PD-1 간의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있는 항-PD-L1 항체를 제공한다. 또한 중요하게는, 예에서 이들 항-PD-L1 항체가 T 세포 면역 반응을 촉진하고 종양 성장을 억제한다는 것이 입증된다. PD-L1 단백질의 세포 외 부분의 면역글로불린 V 도메인에 결합하는 공지된 항-PD-L1 항체와는 달리, 이들 항체는 면역글로불린 C 도메인, 특히 아미노산 잔기 Y134, K162, 및 N183에 결합한다. 이들 항-PD-L1 항체는 다양한 유형의 암, 뿐만 아니라 감염을 치료하는 것과 같이 치료 목적으로 유용하며, 진단 및 예후의 목적으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서는 인간 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질의 면역글로불린 C (Ig C) 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, Ig C 도메인은 아미노산 잔기 133-225로 이루어진다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y134, K162, 또는 N183 중 적어도 하나에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y134, K162, 및 N183 중 적어도 하나에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 면역글로불린 V (Ig V) 도메인에 결합하지 않으며, Ig V 도메인은 아미노산 잔기 19-127로 이루어진다.
본 발명의 한 구체예에서는 인간 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 제공된다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입이다. 일부 구체예에서, 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 제한 없이, 항체 또는 그것의 단편은 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 완전한 인간 항체이다. 한 양태에서, 항체 또는 그것의 단편은 인간화된 항체이다.
돌연변이 유발(mutagenesis)을 통해, 본 발명에서는 VH CDR3 (예를 들어, 실시예 13-17에서 항체 A1, A2, C3, C4, C6, B1 및 B6 참조) 및 VL CDR3 (예를 들어, 실시예 13-17에서 항체 B3, C4 및 A3 참조)에서 돌연변이 핫스팟(hotspot) 잔기를 더 확인하였다. 그러므로, 본 발명은 또한 이들 핫스팟에서 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 구체예에서, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 117 또는 서열 번호: 117과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 117의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 (VH CDR3의 제2 아미노산 잔기는 Leu이다); (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 6과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다.
한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또한, 한 구체예에서는, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 다음을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다: (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 3과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 140 또는 서열 번호: 140과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 140의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 (여기서 적어도 (i) VL CDR3의 아미노산 잔기 4는 Ser이거나, (ii) VL CDR3의 아미노산 잔기 5는 Asp이거나, 또는 (iii) VL CDR3의 아미노산 잔기 6은 Ala이다).
한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 140의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 160의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서는 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 다음을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다: (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 3과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 6과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또한, 일부 구체예에서는, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 일부 구체예에서는, 본 발명의 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포가 제공된다.
치료 방법 및 사용이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암 또는 감염을 치료하는 방법이 제공되는데, 환자에게 본 발명의 항체 또는 그것의 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 고체 종양이다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁체부암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 간암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 결장직장암, 두경부암, 편평 세포 암, 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 방법은 또한 환자에게 제2 암 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 균류 감염 또는 기생충에 의한 감염이다.
또 다른 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암 또는 감염을 치료하는 방법이 제공되는데, (a) 시험관 내에서(in vitro) 세포를 본 발명의 항체 또는 그것의 단편으로 처리하는 단계; 및 (b) 환자에게 처리된 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은, 단계 (a) 전에, 개체로부터 세포를 단리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 환자로부터 단리된다. 일부 구체예에서, 세포는 환자와 상이한 공여 개체로부터 단리된다. 일부 구체예에서, 세포는 T 세포이며, 이것의 비-제한적 예는 종양-침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
진단 방법 및 사용이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 샘플에서 PD-L1의 발현을 검출하는 방법이 제공되는데, 항체 또는 그것의 단편이 PD-L1에 결합하는 조건 하에서 샘플을 항체 또는 그것의 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 PD-L1의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 종양 세포, 종양 조직, 감염된 조직, 또는 혈액 샘플을 포함한다.
본 발명의 항체 및 단편은 이중특이적 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 단편 및 면역 세포 상의 분자에 대한 특이성을 가진 제2 항원-결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 분자는 PD-1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA, CD47 및 CD73으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 단편 및 제2 단편은 각각 Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일-도메인 항체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 단편을 더 포함한다.
도 1은 HL1210-3이 높은 친화도로 인간 PD-L1에 결합할 수 있다는 것을 도시한다.
도 2는 HL1210-3이 인간 PD1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 3은 HL1210-3 항체가 포유류 세포에서 발현된 PD-L1 상에서 PD-1의 결합을 매우 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 4는 테스트된 항-PD-L1 항체가 인간 T 세포 반응을 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 5는 재조합 PD-L1에 대한 HL1210-3의 결합 역학을 도시한다.
도 6은 테스트된 모든 인간화된 항체가 키메라 항체에 접촉된 인간 PD-L1에 대하여 비슷한 결합 효율을 갖는다는 것을 도시한다.
도 7은 테스트된 모든 인간화된 항체가 키메라 항체와 비슷하게 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 매우 효율적으로 결합할 수 있다는 것을 도시한다.
도 8은 인간화된 항체 Hu1210-41이 낮은 친화도로 붉은 털 원숭이(rhesus) PD-L1에 결합할 수 있지만 래트 및 마우스 PD-L1에는 결합할 수 없다는 것을 도시한다.
도 9는 Hu1210-41 항체가 B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS 및 BTLA가 아니라 B7-H1 (PD-L1)에만 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 도시한다.
도 10은 Hu1210-41이 인간 PD1 및 B7-1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 11은 Hu1210-41이 인간 PD1 및 B7-1으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 12는 혼합 림프구 반응에서 Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16, Hu1210-17, Hu1210-21 및 Hu1210-36 인간화된 항체가 IFNγ 및 IL-2 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 13은 CMV 리콜(recall) 검정에서 Hu1210-40, Hu1210-41 및 Hu1210-17 인간화된 항체가 IFNγ 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 14는 HCC827-NSG-이종 이식 모델에서 Hu1210-31이 5mg/kg에서 종양 성장을 30%까지 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 15는 Hu1210-41 항체가 HCC827-NSG-이종 이식 모델에서 종양 성장을 용량-의존적으로 억제할 수 있는 한편, 종양 종량은 또한 Hu1210-41 항체에 의해 용량-의존적으로 저해된다는 것을 도시한다.
도 16은, 각각의 PD-L1 돌연변이에 대하여, 발현의 함수 (대조군 항-PD-L1 mAb 반응성)로서 평균 결합 값을 플롯팅한다.
도 17은 항-PD-L1 Hu1210-41 항체로의 결합에 수반된 잔기 (구체)인 Y134, K162, 및 N183의 위치를 예시한다.
도 18은 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 대한 결합 효율에 관하여 S60R 돌연변이를 모체 항체 Hu1210-41과 비교한다.
도 19는 유래된 항체에 대한 결합 검정 (인간 PD-L1으로의)의 결과를 도시한다.
도 20은 항체 B6이 모체 항체 및 Tecentriq™ (아테졸리쥬맙)과 비교하여 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 더 고도로 효율적으로 결합한다는 것을 도시한다.
도 21은 B6이 또한 더 높은 효능을 나타내는 Jurkat 세포에서 IL2 생산에 대한 항체의 효과를 도시한다.
도 22는 혼합된 림프구 설정에서 IFNγ 생산을 촉진하기 위한 항체의 시험관 내 활성을 도시한다.
도 23은 종양 성장을 억제하기 위한 항체의 생체 내 활성을 도시한다.
도 2는 HL1210-3이 인간 PD1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 3은 HL1210-3 항체가 포유류 세포에서 발현된 PD-L1 상에서 PD-1의 결합을 매우 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 4는 테스트된 항-PD-L1 항체가 인간 T 세포 반응을 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 5는 재조합 PD-L1에 대한 HL1210-3의 결합 역학을 도시한다.
도 6은 테스트된 모든 인간화된 항체가 키메라 항체에 접촉된 인간 PD-L1에 대하여 비슷한 결합 효율을 갖는다는 것을 도시한다.
도 7은 테스트된 모든 인간화된 항체가 키메라 항체와 비슷하게 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 매우 효율적으로 결합할 수 있다는 것을 도시한다.
도 8은 인간화된 항체 Hu1210-41이 낮은 친화도로 붉은 털 원숭이(rhesus) PD-L1에 결합할 수 있지만 래트 및 마우스 PD-L1에는 결합할 수 없다는 것을 도시한다.
도 9는 Hu1210-41 항체가 B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS 및 BTLA가 아니라 B7-H1 (PD-L1)에만 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 도시한다.
도 10은 Hu1210-41이 인간 PD1 및 B7-1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 11은 Hu1210-41이 인간 PD1 및 B7-1으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 12는 혼합 림프구 반응에서 Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16, Hu1210-17, Hu1210-21 및 Hu1210-36 인간화된 항체가 IFNγ 및 IL-2 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 13은 CMV 리콜(recall) 검정에서 Hu1210-40, Hu1210-41 및 Hu1210-17 인간화된 항체가 IFNγ 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 도시한다.
도 14는 HCC827-NSG-이종 이식 모델에서 Hu1210-31이 5mg/kg에서 종양 성장을 30%까지 억제할 수 있다는 것을 도시한다.
도 15는 Hu1210-41 항체가 HCC827-NSG-이종 이식 모델에서 종양 성장을 용량-의존적으로 억제할 수 있는 한편, 종양 종량은 또한 Hu1210-41 항체에 의해 용량-의존적으로 저해된다는 것을 도시한다.
도 16은, 각각의 PD-L1 돌연변이에 대하여, 발현의 함수 (대조군 항-PD-L1 mAb 반응성)로서 평균 결합 값을 플롯팅한다.
도 17은 항-PD-L1 Hu1210-41 항체로의 결합에 수반된 잔기 (구체)인 Y134, K162, 및 N183의 위치를 예시한다.
도 18은 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 대한 결합 효율에 관하여 S60R 돌연변이를 모체 항체 Hu1210-41과 비교한다.
도 19는 유래된 항체에 대한 결합 검정 (인간 PD-L1으로의)의 결과를 도시한다.
도 20은 항체 B6이 모체 항체 및 Tecentriq™ (아테졸리쥬맙)과 비교하여 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 더 고도로 효율적으로 결합한다는 것을 도시한다.
도 21은 B6이 또한 더 높은 효능을 나타내는 Jurkat 세포에서 IL2 생산에 대한 항체의 효과를 도시한다.
도 22는 혼합된 림프구 설정에서 IFNγ 생산을 촉진하기 위한 항체의 시험관 내 활성을 도시한다.
도 23은 종양 성장을 억제하기 위한 항체의 생체 내 활성을 도시한다.
정의
용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 지칭한다 것을 알아야 한다; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의" (또는 "하나의"), "하나 이상의", 및 "적어도 하나의"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드", 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포함하도록 의도되고, 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 결합된 모노머 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 어느 것 대신에, 또는 이것과 교체 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하도록 의도되며, 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성을 포함한, 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다.
용어 "단리된"은 본원에서 세포, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 사용된 바와 같이, 각각 거대 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 간주된다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 단리된 폴리펩타이드는 정제된 및 재조합 폴리펩타이드 모두를 포함하는 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 적용된 바와 같이 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태를 의도하며, 이것의 비-제한적 예는 정상적으로는 함께 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 조합함으로써 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 동일한 염기 또는 아미노산이 비교된 서열 내 위치를 차지할 때, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는, 일치하거나 상동성인 위치의 개수의 함수이다. "무관한" 또는 "비-상동성" 서열은 본 발명의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대하여 특정 퍼센트 (예를 들어, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 서열을 비교하는데 있어서 상기 퍼센트의 염기 (또는 아미노산)가 동일하다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 한 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 파라미터를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음 기본 파라미터를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 정렬 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 명시된 퍼센트의 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 그것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 지칭한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 그것의 보체와 어느 정도의 상동성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체에 혼성체화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 추가, 결실, 치환 및 이것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염-다리)을 가지고 있다.
혼성체화 반응은 상이한 "엄중도"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄중도 혼성체화 반응은 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃에서 수행된다. 중간 엄중도 혼성체화는 전형적으로 약 6 x SSC에서 약 50℃에서 수행되고, 높은 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 약 1 x SSC에서 약 60℃에서 수행된다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 세포에서 일반적으로 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg2+의 농도이다.
폴리뉴클레오타이드는 특정 서열의 네 개의 뉴클레오타이드 염기로 구성된다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민에 대하여 우라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표기이다. 이 알파벳 표기는 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스에 입력되어 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학적 용도로 사용될 수 있다. 용어 "다형성"은 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그 일부의 공존을 지칭한다. 적어도 두 개의 상이한 형태로 존재하는 유전자의 일부, 즉, 두 개의 상이한 뉴클레오타이드 서열은 "유전자의 다형성 영역"이라고 불린다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드일 수도 있으며, 이것의 정체는 상이한 대립유전자에 있어서 상이하다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되고, 데옥시리보뉴클레오타이드이든 리보뉴클레오타이드이든 또는 이것들의 유사체이든, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지되었든 공지되지 않았든 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후, 예컨대 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중-및 단일-가닥 분자를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 발명의 임의의 구체예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 각각의 두 개의 상보적 단일-가닥 형태를 모두 포함한다.
용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때 고유한 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 이것의 단편에 대한 mRNA를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있으면, 상기 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 이것으로부터 암호화 서열을 추정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 이것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 항체는 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 대한 결합의 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이것들의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 거울상체, 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.
"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드로 연결된다. 링커는 플렉시블 성질을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있으며, VH의 N-말단과 VL의 C-말단을 연결하거나, 그 반대도 가능하다. 이 단백질은, 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도, 원래의 면역글로불린의 특이성을 가지고 있다. ScFv 분자는 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019에 기술되어 있다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 광범위한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)로 분류되고 그것들 중 일부는 하위 분류 (예를 들어, γ1-γ4)를 갖는다는 것을 알 수 있다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것이 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위 분류 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 분류 및 아이소타입 각각의 변형된 버젼은 본 발명을 고려하여 당업자에게 쉽게 구별 가능하고, 따라서, 본 발명의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 분명하게 본 발명의 범위 내에 있으며, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류에 관한 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤(Dalton)의 분자량의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000의 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 네 개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 "Y" 구성형태로 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속해서 중쇄를 괄호로 묶는다.
본 발명의 항체, 이것의 항원-결합 폴리펩타이드, 변이체, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 항체, 이황화-결합된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 어떠한 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 분류일 수도 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 (Κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수도 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 서로 공유 이황화 결합에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마(hybridoma), B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때에는 비-공유 결합에 의해 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성형태의 갈래형(forked) 단부의 N-말단에서 각 사슬의 바닥의 C-말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 점에 있어서, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 부분 모두의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 수 있다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례상 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이며; CH3 및 CK 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타난 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이것에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 구조는 Y의 각 아암의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각 VH 및 VK 사슬 상의 세 개의 CDR (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 한정된다. 어떤 경우에는, 예를 들어, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 조작된 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 단지 중쇄로만 이루어질 수도 있으며, 경쇄는 없다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.
자연 발생한 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 구성형태를 취하기 때문에 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧고 비-인접한 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 불리는, 항원-결합 도메인 내 나머지 아미노산은 더 적은 분자 간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트(β-sheet) 입체구조를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우에는 그것의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간 비-공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 위치시키는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치한 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역 반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 항체의, 그것의 동계(cognate) 에피토프로의 비-공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 각각 정확하게 정의되어 있기 때문에 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참조).
해당 분야에서 사용 및/또는 수용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에서 사용된 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하도록 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 발견된 비-인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이 특정한 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기술되어 있다. Kabat 및 Chothia에 따르는 CDR 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 그것의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 둘 중 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 상기 나열된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같이 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교대상으로서 하기 표에서 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
Kabat, 등은 또한 어떠한 항체에도 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 그 자체를 넘어서는 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않으면서 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명료하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
상기 표에 더하여, Kabat 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1는 대략 아미노산 31에서 시작하고 (즉, 첫 번째 시스테인 잔기 다음의 대략 9개의 잔기), 대략 5-7개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1이 끝난 다음 15번째 잔기에서 시작하고, 대략 16-19개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2이 끝난 다음 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하고; 3-25개의 아미노산을 포함하고, 서열 W-G-X-G에서 끝나며, 상기 식에서 X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 10-17개의 잔기를 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1이 끝난 다음 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2이 끝난 다음 대략 33번째 잔기 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 7-11개의 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, 상기 식에서 X는 임의의 아미노산이다.
본원에서 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 어떠한 동물 기원으로부터 유래될 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 설치류, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원 (예를 들어, 상어 기원)이 콘드릭토이드(condricthoid)일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이것들의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 발명에서 사용을 위한 항원-결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용을 위한 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인 전부 또는 일부)가 없을 수도 있다. 상기 제시된 바와 같이, 당업자는 중쇄 불변 영역이 자연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgGl 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로 IgGl 분자로부터 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgGl 분자로부터 및 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인과 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 지칭한다.
이전에 나타난 바와 같이, 다양한 면역글로불린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성형태는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대하여 아미노 말단이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은, 예를 들어, 통상적인 넘버링 계획을 사용하여 항체의 약 잔기 244에서 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참조). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 대신에, 두 개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬이 온전하고 고유한 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한 CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 결합시키는는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 플렉시블(flexible)하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직이게 한다. 힌지 영역은 세 개의 별개의 도메인, 상부, 중부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 두 개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 이황화 결합 또는 다리를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고 두 개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에서 두 개의 이황화 결합에 의해 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역 반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역 (온전하거나, 부분적이거나 또는 본 발명에 따라 변형될 수도 있음)은 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미할 것이다. 특정 구체예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류)로부터 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 인간화"는 인간화된 도메인 및 생식계열 도메인 간의 프레임워크 아미노산 차이 (즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 상기 수를 뺀 다음 그것을 총 아미노산 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.
"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 그것의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는, 그것의 항원-결합 도메인을 통해, 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 한 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대하여 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방적(prophylactic) 또는 방지적(preventative) 수단을 지칭하며, 목적은 원치않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 예방하거나 늦추는 (줄이는) 것이다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 (부분적 또는 전체적), 검출 가능 여부를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 병태 또는 장애에 걸린 것들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 것들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 경작용 동물, 동물원 동물, 스포츠용 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 암소, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은, 예를 들어, 검출, 진단 과정 및/또는 치료에 사용된 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
항-PD-L1 항체
본 발명은 인간 PD-L1 단백질에 대하여 높은 친화도를 가진 항-PD-L1 항체를 제공한다. 테스트된 항체는 강력한 결합 및 억제 활성을 나타냈고 치료적 및 진단적 사용에 유용하다.
PD-L1 단백질은 40kDa 1형 막관통 단백질이다. 그것의 세포 외 부분은 N-말단 면역글로불린 V (IgV) 도메인 (아미노산 19-127) 및 C-말단 면역글로불린 C (IgC) 도메인 (아미노산 133-225)을 포함한다. PD-1과 PD-L1은, T 세포 수용체 및 항체의 IgV 도메인이 그런 것과 마찬가지로, 그것들의 IgV 도메인의 보존된 전면 및 측면을 통해 상호작용한다. 당연히, 현재의 항-PD-L1 항체는 모두 PD-1과 PD-L1 사이의 결합을 방해할 수 있는 IgV 도메인에 결합한다. 그러므로 본원에서 개시될 수 있는 많은 것들과 같이, PD-L1 단백질의 IgC 도메인에 결합하는 항체가 PD-L1을 여전히 효과적으로, 그리고 아마도 훨씬 더 억제할 수 있으며, 치료 효과를 더 개선한다는 것은 본 발명의 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
그러므로, 본 발명의 한 구체예에서는 인간 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질의 면역글로불린 C (Ig C) 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, Ig C 도메인은 아미노산 잔기 133-225로 이루어진다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y134, K162, 또는 N183 중 적어도 하나에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y134, K162, 또는 N183 중 적어도 두 개에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y134, K162, 및 N183 중 적어도 하나에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1 단백질의 면역글로불린 V (Ig V) 도메인에 결합하지 않으며, Ig V 도메인은 아미노산 잔기 19-127로 이루어진다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 서열 번호: 1-6에서 정의된 CDR 영역을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 제공된다.
실험예에서 입증된 바와 같이, 이들 CDR 영역을 함유하는 항체는, 마우스 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체에 관계없이, 강력한 PD-L1 결합 및 억제 활성을 갖는다. 추가의 컴퓨터 모델링은 CDR 내에서 특정 잔기가 항체의 성질을 가지고 있거나 또는 개선하도록 변형될 수 있다는 것을 나타냈다. 이러한 잔기는 "핫 스팟"이라고 불리며, 표 1에서 밑줄 그어져 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 표 1에서 나열된 바와 같이 VH 및 VL CDR을 포함하며, 한 개, 두 개 또는 세 개의 추가의 변형을 갖는다. 이러한 변형은 아미노산의 추가, 결실 또는 치환일 수도 있다.
일부 구체예에서, 변형은 각각의 CDR의 하나 이하의 핫 스팟 위치에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 변형은 한 개, 두 개 또는 세 개의 이러한 핫 스팟 위치에서의 치환이다. 한 구체예에서, 변형은 핫 스팟 위치 중 하나에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 해당 분야에서 정의되어 있으며, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드에서 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 파밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있다.
보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공되며, 0 또는 그 이상의 유사성 점수는 두 개의 아미노산 사이의 보존적 치환을 나타낸다.
적합한 치환을 가진 CDR의 특정 예는 실시예 11의 서열 번호: 61-111에서 제공된다. 일부 구체예에서, 그러므로, 본 발명의 항체는 서열 번호: 1 또는 61-67 중 어느 하나의 VH CDR1을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 2 또는 68-77 중 어느 하나의 VH CDR2를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 또는 78-90 중 어느 하나의 VH CDR3을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 4 또는 91-92 중 어느 하나의 VL CDR1을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 5 또는 93-105 중 어느 하나의 VL CDR2를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 6 또는 106-110 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 상기 치환 중 한 개 이하, 두 개 이하, 또는 세 개 이하를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 또는 서열 번호: 61-67 중 어느 하나의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 68-77 중 어느 하나의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 78-90 중 어느 하나의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 91-92 중 어느 하나의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 93-105 중 어느 하나의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6의 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호: 1의 VH CDR1, 서열 번호: 2의 VH CDR2, 서열 번호: 3의 VH CDR3, 서열 번호: 4의 VL CDR1, 서열 번호: 5의 VL CDR2, 및 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 106-111 중 어느 하나의 VL CDR3을 포함한다.
VH의 비-제한적 예는 서열 번호: 7-26 및 113에서 제공되며, 이것들 중에서 서열 번호: 113은 마우스 VH이고, 서열 번호: 7-26은 인간화된 것이다. 또한, 인간화된 VH 중에서, 서열 번호: 9-15, 17-21 및 23-26은 마우스 버젼으로의 하나 이상의 역돌연변이를 포함한다. 유사하게, VL (VK)의 비-제한적 예는 서열 번호: 27-33에서 제공된다. 서열 번호: 28 및 30은 예에서 나타난 바와 같이 원래의 것으로부터 유래된, CDR-이식된 인간화된 서열이다. 서열 번호: 29 및 31-33은 역돌연변이를 가진 인간화된 VL이다.
역돌연변이는 항-PD-L1 항체의 특정한 특징을 보유하는데 유용한 것으로 나타난다. 따라서, 일부 구체예에서는, 본 발명의 항-PD-L1 항체, 특히 인간 또는 인간화된 항체는 역돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, VH 역돌연변이 (즉, 명시된 위치에서 아미노산을 포함함)는, Kabat 넘버링에 따라, (a) 위치 44에서 Ser, (b) 위치 49에서 Ala, (c) 위치 53에서 Ala, (d) 위치 91에서 Ile (e) 위치 1에서 Glu, (f) 위치 37에서 Val, (g) 위치 40에서 Thr, (h) 위치 53에서 Val, (i) 위치 54에서 Glu, (j) 위치 77에서 Asn, (k) 위치 94에서 Arg, 및 (l) 위치 108에서 Thr, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 구체예에서, 역돌연변이는, Kabat 넘버링에 따라, (a) 위치 44에서 Ser, (b) 위치 49에서 Ala, (c) 위치 53에서 Ala, 및/또는 (d) 위치 91에서 Ile 및 이것들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, VL 역돌연변이는, Kabat 넘버링에 따라, (a) 위치 22에서 Ser, (b) 위치 42에서 Gln, (c) 위치 43에서 Ser, (d) 위치 60에서 Asp, 및 (e) 위치 63에서 Thr 및 이것들의 조합으로부터 선택된 하나 이상이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 서열 번호: 7-26의 VH, 서열 번호: 27-33의 VL, 또는 그것들의 각각의 생물학적 동등물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 동등물은 지정된 아미노산을 포함하는 한편 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 서열이다.
예를 들어, 서열 번호: 20의 생물학적 동등물은 서열 번호: 20에 대하여 전체적으로 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖지만, CDR (서열 번호: 1-6 또는 그것들의 변이체)을 가지고 있고, 선택적으로는 역돌연변이 중 하나 이상, 또는 전부를 가지고 있는 VH일 수 있다. 한 구체예에서, VH는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 갖는다.
추가로 개선된 PD-L1 항체
제어된 돌연변이 비율을 가진 무작위(random) 돌연변이 유발을 통해, 실시예 13-17에서는, 특히 중쇄 (예를 들어, B6, C3, C6, 및 A1) 및 경쇄 (예를 들어, A3) 가변 영역 모두의 CDR3에서 많은 핫스팟 잔기를 확인하는 것이 가능했다 (표 14 및 15 참조). 돌연변이 유발은 Hu1210-41로부터 유래된 주형 항체에서 수행되었다 (표 14의 각주에서 언급된 바와 같이, 주형 항체 WT는 중쇄 CDR2에서 S60R (Kabat 넘버링) 치환을 갖는다). 또한, 키메라 항체와 비교하여, Hu1210-41은 VH CDR2에서 G53A 치환 (서열 번호: 20 참조)을 포함하였다. 테스트된 돌연변이 항체 중에서, 항체 B6이 인간 PD-L1에 대하여 크게 개선된 결합 친화도 및 생물학적 활성을 나타냈다.
그러므로, 한 구체예에서는, 다음 CDR (S60R 돌연변이의 것) 및 그것들의 변이체를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다.
그러므로, 한 구체예에서는, 다음 CDR (B6 돌연변이의 것) 및 그것들의 변이체를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다.
한 구체예에서, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 다음을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다: (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 3과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 (VH CDR3의 제2 아미노산 잔기는 Leu이다); (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 6과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
한 구체예에서, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 다음을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다: (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 117 또는 서열 번호: 117과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 117의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 (VH CDR3의 제2 아미노산 잔기는 Leu이다); (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 6과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 6의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3.
서열 번호: 1의 예시의 변이체는, 서열 번호: 61-67과 같이, 아미노산 잔기 1, 2 및 5 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다:
서열 번호: 116의 예시의 변이체는, 서열 번호: 118-127, 2 및 68-77과 같이, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체는 서열 번호: 118-127이다.
일부 구체예에서, VH CDR3 변이체의 제3 아미노산 잔기는 Pro이다. 일부 구체예에서, VH CDR3 변이체의 제4 아미노산 잔기는 Trp이다.
서열 번호: 3의 예시의 변이체는, 서열 번호: 78-90과 같이, 아미노산 잔기 1-6에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다:
서열 번호: 117의 예시의 변이체는, 서열 번호: 128-139와 같이, 아미노산 잔기 1, 5 및 6에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다:
일부 구체예에서, 서열 번호: 4의 변이체는, 서열 번호: 91-92와 같이, 아미노산 잔기 에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다:
일부 구체예에서, 서열 번호: 5의 변이체는, 서열 번호: 93-105와 같이, 아미노산 잔지 1-6 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다:
서열 번호: 6의 예시의 변이체는, 서열 번호: 106-111과 같이, 아미노산 잔기 1과 2 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 예시의 변이체는 서열 번호: 140이다.
VL CDR3의 세 개의 잔기에서 치환을 가진 돌연변이 A3는 또한 인간 PD-L1에 대하여 우수한 결합 친화도를 나타냈다. 그러므로, 한 구체예에서는, 다음 CDR 및 그것들의 변이체를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다:
그러므로, 한 구체예에서는, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 다음을 포함하는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다: (a) 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 1과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 1의 변이체의 아미노산을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 번호: 116 또는 서열 번호: 116과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 116의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 3과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 3의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 4와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 4의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 5와 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 5의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열 번호: 140 또는 서열 번호: 140과 비교하여 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 서열 번호: 140의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 (여기서 적어도 (i) VL CDR3의 아미노산 잔기 4는 Ser이거나, (ii) VL CDR3의 아미노산 잔기 5는 Asp이거나, 또는 (iii) VL CDR3의 아미노산 잔기 6은 Ala이다).
서열 번호: 1의 예시의 변이체는, 서열 번호: 61-67과 같이, 아미노산 잔기 1, 2 및 5 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
서열 번호: 116의 예시의 변이체는, 서열 번호: 118-127, 2 및 68-77과 같이, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
서열 번호: 3의 예시의 변이체는, 서열 번호: 117 및 128-139와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
서열 번호: 4의 예시의 변이체는, 서열 번호: 91-92와 같이, 아미노산 잔기 3에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
서열 번호: 5의 예시의 변이체는, 서열 번호: 93-105와 같이, 아미노산 잔기 1-6 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, VL CDR3 변이체의 아미노산 잔기 4는 Ser이다. 일부 구체예에서, VL CDR3 변이체의 아미노산 잔기 5는 Asp이다. 일부 구체예에서, VL CDR3 변이체의 아미노산 잔기 6은 Ala이다. 서열 번호: 140의 예시의 변이체는, 서열 번호: 161-166과 같이, 아미노산 잔기 1과 2 중 하나에서 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
돌연변이 유발 연구로부터 유래된 항체 또는 그것들이 항원-결합 단편의 예는 표 15에서 제공된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 가진 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 141을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 142를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 143을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 144를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 145를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 146을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 147을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 148을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 149를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 150을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 151을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 152를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 153을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 154를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 155를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 156을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 157을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 158을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 159를 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 160을 포함한다.
또한 당업자는 본원에서 개시된 항체가 그것들이 유래된 자연 발생 결합 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사하며, 예를 들어, 시작 서열에 대하여 특정 퍼센트의 동일성을 가지며, 예를 들어, 시작 서열과 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수도 있다.
특정 구체예에서, 항체는 일반적으로는 항체와 회합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시의 변형은 하기 더 상세히 기술된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 플렉시블 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 항체, 이것의 변이체, 또는 유도체는, 즉, 공유 부착이 항체가 에피토프에 결합하는 것을 방지하지 않도록 항체로의 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 항체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 세포 리간드 또는 다른 단백질, 등으로의 결합에 의해 변형될 수 있다. 많은 화학적 변형 중 어느 것도 공지된 기술에 의해 수행될 수 있으며, 특정 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사합성, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수도 있다.
일부 구체예에서, 항체는 치료제, 프로드러그(prodrug), 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학적 작용제, 또는 PEG에 컨쥬게이션될 수도 있다.
항체는 치료제에 컨쥬게이션되거나 융합될 수도 있으며, 이것은 검출 가능한 라벨, 예컨대 방사성 라벨, 면역 조절 물질, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광 활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수도 있는 세포 독성제, 초음파 증강제, 비-방사성 라벨, 이것들의 조합 및 해당 분야에 공지된 다른 이러한 작용제를 포함할 수도 있다.
항체는 그것을 화학 발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 그 다음에 화학 반응의 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 화학 발광-태그된 항원-결합 폴리펩타이드의 존재가 결정된다. 특히 유용한 화학 발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 써모메틱(theromatic) 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
항체는 또한 152Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것들과 같은 형광 방출 금속을 사용하여 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 금속 킬레이트 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 컨쥬게이션하는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)) 참조.
이기능적 분자
PD-L1은 면역 체크포인트(checkpoint) 분자이고 또한 종양 항원이다. 종양 항원 표적화 분자로서, PD-L1에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 면역 세포에 특이적인 제2 항원-결합 단편과 조합되어 이중특이적 항체를 생성할 수 있다.
일부 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 대식 세포, 호중구, 수지상세포, 포식 세포, 자연 살해 세포, 호산구, 호염기구, 및 비만 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적화될 수 있는 면역 세포 상의 분자는, 예를 들어, CD3, CD16, CD19, CD28, 및 CD64를 포함한다. 다른 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3 (CD223으로도 알려져 있음), CD28, CD122, 4-1BB (CD137로도 알려져 있음), TIM3, OX-40 또는 OX40L, CD40 또는 CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA (CD272로도 알려져 있음), 살 세포(killer-cell) 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 및 CD47을 포함한다. 이중특이성의 특정 예는, 제한 없이, PD-L1/PD-1, PD-L1/LAG3, PD-L1/TIGIT, 및 PD-L1/CD47을 포함한다.
면역 체크포인트 억제자로서, PD-L1에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 종양 항원에 특이적인 제2 항원-결합 단편과 조합되어 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. "종양 항원"은 종양 세포에서 생산된 항원성 물질이며, 즉, 그것은 숙주에서 면역 반응을 촉발시킨다. 종양 항원은 종양 세포를 확인하는데 유용하고 암 치료법에서 사용을 위한 잠재적 후보이다. 체내에서 정상적인 단백질은 항원성이 아니다. 하지만, 특정 단백질은 종양 형성 중에 생산되거나 과발현되며 따라서 신체에 "이질적인" 것으로 보인다. 이것은 면역 시스템으로부터 잘 격리된 단백질, 일반적으로 극소량으로 생산되는 단백질, 일반적으로 특정 발달 스테이지에서만 생산되는 단백질, 또는 돌연변이로 인해 구조가 변형된 단백질을 포함한다.
종양 항원의 풍부함은 해당 분야에 공지되어 있으며 새로운 종양 항원은 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 종양 항원의 비-제한적 예는 EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CIX, PSMA, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, 인테그린, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP 및 테나신을 포함한다.
일부 양태에서, 1가 유닛은 상응하는 비-종양 세포에 비해 종양 세포에서 과발현되는 단백질에 대하여 특이성을 갖는다. 본원에서 사용된 "상응하는 비-종양 세포"는 종양 세포의 기원과 동일한 세포 유형인 비-종양 세포를 지칭한다. 이러한 단백질이 종양 항원과 반드시 상이해야 하는 것은 아니다. 비-제한적 예는 대부분의 결장, 직장, 유방, 폐, 췌장 및 위장관 암종에서 과발현되는 암종 배아 항원 (CEA); 유방, 난소, 결장, 폐, 전립선 및 자궁경부암에서 종종 과발현되는 헤레굴린 수용체 (HER-2, neu 또는 c-erbB-2); 유방, 두경부, 비-소세포 폐 및 전립선의 종양을 포함한 다양한 고체 종양에서 고도로 발현되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 아시알로당단백질 수용체; 트랜스페린 수용체; 간 세포에서 발현되는 세르핀 효소 복합 수용체; 췌장관 선암종 세포에서 과발현되는 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR); 항-혈관 형성 유전자 요법을 위한 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR); 90%의 비점액성 난소 암종에서 선택적으로 과발현되는 폴레이트 수용체; 세포 표면 글리코칼릭스; 탄수화물 수용체; 및 호흡 상피 세포로의 유전자 전달에 유용하고 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis)과 같은 폐 질환의 치료에 매력적인 폴리머 면역글로불린 수용체를 포함한다. 이 점에 있어서 이중특이성의 비-제한적 예는 PD-L1/EGFR, PD-L1/Her2, PD-L1/CD33, PD-L1/CD133, PD-L1/CEA 및 PD-L1/VEGF를 포함한다.
상이한 포맷의 이중특이적 항체가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 각각의 항-PD-L1 단편 및 제2 단편은 독립적으로 Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일-도메인 항체로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 Fc 단편을 더 포함한다.
단지 항체 또는 항원 결합 단편만을 포함하는 것이 아닌 이기능적 분자가 또한 제공된다. 종양 항원 표적화 분자로서, PD-L1에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은, 본원에서 기술된 것들과 같이, 선택적으로 펩타이드 링커를 통해 면역 사이토카인 또는 리간드와 조합될 수 있다. 결합된 면역 사이토카인 또는 리간드는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT 및 GITRL을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 이기능적 분자는 면역 체크포인트 차단 효과를 종양 부위 국소 면역 조절와 조합할 수 있다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체 제조 방법
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 이것의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자 (예를 들어, 서열 번호: 34-60, 112, 및 114)를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수도 있다. 추가적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수도 있다.
항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되고 본원에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역 모두는 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 해당 분야에 기술된 기술을 사용하여 및 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원의 공격에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌가 비활성화된 트랜스제닉 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 제조된 항체는 치료될 동물에서, 예를 들어, 인간에서 해로운 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체, 또는 유도체는 해당 분야에서 인식되는 기술을 사용하여 그들의 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화되거나, 영장류화되거나, 탈면역화될 수 있거나, 또는 키메라 항체가 만들어질 수 있다. 이들 유형의 항체는 모체 항체의 항원-결합 성질을 가지고 있거나 또는 실질적으로 가지고 있지만, 인간에서 덜 면역원성인 비-인간 항체, 전형적으로 쥐 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역으로 이식하여 키메라 항체를 생성하는 단계; (b) 중요한 프레임워크 잔기의 체류 여부에 관계없이 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상의 적어도 일부를 인간 프레임워크 및 불변 영역으로 이식하는 단계; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 섹션으로 그것들을 "은폐"하는 단계를 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 번호: 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,190,370 (이것들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시되어 있다.
탈면역화는 또한 항체의 면역원성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "탈면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변화를 포함한다 (예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2 참조). 예를 들어, 시작 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 분석되고 서열 내 상보성 결정 영역 (CDR) 및 다른 핵심 잔기에 관한 에피토프의 위치를 나타내는 각 V 영역으로부터의 인간 T-세포 에피토프 "맵"이 생성된다. T-세포 에피토프 맵의 개개의 T-세포 에피토프는 최종 항체의 활성이 변화될 위험이 적은 대안의 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 광범위한 대안의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 설계되고 이들 서열은 그 이후 광범위한 결합 폴리펩타이드에 통합된다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되고 결합 및/또는 기능에 대하여 테스트된다. 그 다음에 변형된 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터에 클로닝되고 이후의 플라스미드는 전체 항체의 생산을 위해 세포주에 도입된다. 이어서 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 검정에서 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드의 결합 특이성은 면역침강법, 방사 면역 검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 시험관 내 검정에 의해 결정될 수 있다.
대안으로, 단일 사슬 유닛의 생산에 대하여 설명된 기술 (미국 특허 번호 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 본 발명의 단일-사슬 유닛을 생산하도록 조정될 수 있다. 단일-사슬 유닛은 아미노산 다리를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합시킴으로써 형성되며, 그 결과 단일 사슬 융합 펩타이드가 생성된다. 대장균(E. coli)에서 기능적 Fv 단편의 조립 기술이 또한 사용될 수 있다 (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
단일 사슬 Fv (scFv) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에서 기술된 것들을 포함한다. 인간 및 시험관 내 검출 검정에서 항체의 생체 내(in vivo) 사용을 포함한 어떤 용도의 경우에, 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 해당 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
인간화된 항체는 비-인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가진 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 때때로, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 CDR 공여체 항체의 상응하는 잔기와 치환되어 항원-결합을 변화시킬 것이며, 바람직하게는 이것을 개선할 것이다. 이들 프레임워크 치환은 해당 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 항체는, 예를 들어, CDR-이식 (EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨))을 포함하여, 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전한 인간 항체는 특히 인간 환자의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하여, 해당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
인간 항체는 또한 기능적인 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수도 있다. 대안으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에도 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수도 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별개로 또는 이와 동시에 비-기능적으로 될 수도 있다. 특히, JH 영역의 동형 접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포가 확장되고 배반포에 미세주사되어 키메라 마우스가 생산된다. 이어서 키메라 마우스가 교배되어 인간 항체를 발현하는 동형 접합성 자손(offspring)을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 원하는 표적 폴리펩타이드 전부 또는 그 일부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원에 대한 단클론성 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻어질 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 숨겨져 있는 인간 면역글로불린 이식 유전자는 B-세포 분화 중에 재배열되고, 그 이후 클래스 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 거친다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개요를 위해, Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995) 참조. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서는, 예를 들어, PCT 공보 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 및 5,939,598 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 이에 더하여, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 GenPharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사들이 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 종사할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 또한 "유도된(guided) 선택"이라고 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 단클론성 항체, 예를 들어, 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다 (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). 또한 미국 특허 번호 5,565,332 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조.
또 다른 구체예에서, 원하는 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 단리되면, DNA는 발현 벡터로 배치될 수 있으며, 이어서 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 면역글로불린을 생산하지 않는 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포에 트랜스펙션된다. 더 구체적으로는, 단리된 DNA (본원에서 기술된 바와 같이 합성될 수 있음)는 1995년 1월 25일에 출원된 Newman et al., 미국 특허 번호 5,658,570 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 바와 같이 제조 항체에 대한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 근본적으로, 이것은 선택된 세포로부터 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 번호 5,658,570에 기술되어 있다. 하기 더 상세히 논의된 것처럼, 원하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급량을 제공하기 위해 비교적 대량으로 키워질 수도 있다.
추가적으로, 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드의 CDR 중 하나 이상이 프레임워크 내에서, 예를 들어, 인간 프레임워크 영역으로 삽입되어 비-인간 항체를 인간화할 수도 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 프레임워크 영역일 수도 있고, 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수도 있다 (인간 프레임워크 영역의 목록에 대하여, 예를 들어, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 원하는 폴리펩타이드 중 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, LIGHT를 암호화한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임워크 영역 내에서 이루어질 수도 있고, 바람직하게는, 아미노산 치환이 항원에 대한 항체의 결합을 개선한다. 추가적으로, 이러한 방법은 사슬 내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산을 치환 또는 결실시켜 하나 이상의 사슬 내 이황화 결합이 없는 항체 분자를 생성하는데 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변화는 본 발명에 의해 및 해당 분야의 기술 내에 포함된다.
이에 더하여, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자의 유전자와 함께, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱(splicing)함으로써 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥐 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 가진 것들이다.
재조합 항체를 생성하기 위한 또 다른 고도로 효율적인 수단은 Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)에 개시되어 있다. 구체적으로, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화된 항체의 생성을 유도한다. 이 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 이 기술은 또한 일반적으로 할당된 미국 특허 번호 5,658,570, 5,693,780 및 5,756,096 (각각 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
대안으로, 항체-생산 세포주는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 간행물에 기술되어 있다. 이 점에 있어서, 하기 기술된 바와 같이 본 발명에서의 사용에 적합한 기술은, 보충판을 포함한, Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
추가적으로, 당업자에게 공지된 표준 기술은 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 아미노산 치환을 일으키는 부위-관련 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는 참조 가변 중쇄 영역, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3에 관하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. 대안으로, 돌연변이는, 예컨대 포화 돌연변이 유발에 의해, 암호화 서열 전부 또는 그 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 결과로 생성된 돌연변이는 활성을 가지고 있는 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
암 치료
본원에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체, 변이체 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에서 기술된 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자, 예컨대 동물, 포유동물, 및 인간에게 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 수반하는 항체-기반 요법과 추가로 관련이 있다. 본 발명의 치료적 화합물은 발명의 항체 (본원에서 기술된 이것의 변이체 및 유도체 포함) 및 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 (본원에서 기술된 이것의 변이체 및 유도체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 또한 암을 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다. PD-L1은 종양 세포에서 과발현될 수 있다. 종양-유래된 PD-L1은 면역 세포 상의 PD-1에 결합하여 항종양 T-세포 면역력을 제한할 수 있다. 쥐 종양 모델에서 PD-L1을 표적화하는 소분자 억제자, 또는 단클론성 항체를 이용한 결과는 표적화된 PD-L1 요법이 종양 성장의 효과적인 제어를 위해 중요한 대안의 및 현실적인 접근법임을 나타낸다. 실험예에서 입증된 바와 같이, 항-PD-L1 항체는 적응성 면역 반응 기작을 활성화시켰으며, 이것은 암 환자의 생존을 개선할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서는, 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 본 발명의 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 환자의 암 세포 (예를 들어, 간질 세포) 중 적어도 하나는 PD-L1을 발현하거나, 과발현하거나, 또는 발현하도록 유도된다. 예를 들어, PD-L1 발현의 유도는 종양 백신 투여 또는 방사선 요법에 의해 실행될 수 있다.
PD-L1 단백질을 발현하는 종양은 방광암, 비-소세포 폐암, 신장암, 유방암, 요도암, 결장직장암, 두경부암, 편평 세포 암, 메르켈 세포 암종, 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암을 포함한다. 따라서, 본원에서 개시된 항체는 임의의 하나 이상의 이러한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 발명에서 제공된다. 본 발명의 항-PD-L1 항체와 접촉된 (또는 대안으로 본 발명의 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, 세포는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 유형 중 어느 암에 걸릴 수도 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)는, 제한 없이, 예를 들어, 종양-침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 암 환자 자체로부터 단리되었다. 일부 구체예에서, 세포는 공여체 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치않는 면역 반응이 최소화될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예측될 수 있는, 증가된 세포 생존과 관련된 추가적인 질환 또는 병태는 악성 종양 및 관련 장애, 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수구성 백혈병(acute myelocytic leukemia) (골수모구성(myeloblastic), 전골수구성(promyelocytic), 골수단핵구성(myelomonocytic), 단핵구성(monocytic), 및 적백혈병(erythroleukemia)) 포함) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성(chronic myelocytic) (과립구성(granulocytic)) 백혈병 및 만성 림프구성(chronic lymphocytic) 백혈병) 포함), 진성다혈구증(polycythemia vera), 림프종 (예를 들어, 호지킨 병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 병(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's 마크로글로불린emia), 중쇄 질환, 및, 제한되는 것은 아니지만, 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골원성 육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 혈관내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyo sarcoma), 결장 암종(colon carcinoma), 췌장암, 유방암, 갑상선암, 자궁체부암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포 암종(renal cell carcinoma), 간 종양(hepatoma), 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 흑색종, 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastoma)을 포함하는 고체 종양의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
조합 요법
추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항신생물제, 항바이러스제, 항박테리아제 또는 항생제 또는 항진균제와 조합하여 투여된다. 해당 분야에 공지된 이들 작용제 중 어느 것도 본 발명의 조성물 중에서 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학치료제와 조합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 화학치료제는 항생물질 유도체 (예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 다우노루비신, 및 닥티노마이신); 항에스트로겐제 (예를 들어, 타목시펜); 항대사물질 (예를 들어, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록슈리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 메르캅토퓨린, 및 6-티오구아닌); 세포독성제 (예를 들어, 카르무스틴, BCNU, 로무스틴, CCNU, 시토신 아라비노시드, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 하이드록시유레아, 프로카르바진, 미토마이신, 부설판, 씨스-플라틴, 및 빈크리스틴 설페이트); 호르몬 (예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메게스트롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트, 클로로트라이아니센, 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체 (예를 들어, 메팔렌, 코람부실, 메클로르에타민 (질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드 및 조합 (예를 들어, 베타메타손 나트륨 포스페이트); 및 기타 (예를 들어, 디카르바진, 아스파라기나아제, 미토탄, 빈크리스틴 설페이트, 빈블라스틴 설페이트, 및 에토포시드)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 사이토카인과 조합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, 항-CD40, CD40L, 및 TNF-α를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 치료적 또는 예방적 양생법, 예컨대 방사선 요법과 조합하여 투여된다.
제2 항암제 (화학치료제)와 함께 본 발명의 항-PD-L1 항체 중 하나 이상의 사용을 포함하는 조합 요법이 또한 제공된다. 화학치료제는 작용 메커니즘에 의해, 예를 들어, 다음 군으로 분류될 수 있다:
- 항대사물질/항암제, 예컨대 피리미딘 유사체 플록슈리딘, 카페시타빈, 및 시타라빈;
- 퓨린 유사체, 폴레이트 안타고니스트(antagonist), 및 관련 억제자;
- 천연물, 예컨대 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴) 및 미세소관, 예컨대 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론, 베노렐빈 (NAVELBINE®), 및 데피포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드)을 포함하는 항증식제/세포 분열 방지제;
- DNA 손상제, 예컨대 액티노마이신, 암사크린, 부설판, 카르보플라틴, 클로람부실, 씨스플라틴, 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®), 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이포스파미드, 멜팔란, 메르클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소유레아, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 에토포시드, 및 트리에틸렌티오포스포르아미드;
- 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 및 미토마이신;
- 전신에서 L-아스파라긴을 대사하고 자신의 아스파라긴을 합성할 능력이 없는 세포를 박탈하는 효소, 예컨대 L-아스파라기나아제;
- 항혈소판제;
- 항증식제/세포 분열 방지성 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 사이클로포스파미드 및 유사체 (멜팔란, 클로람부실, 헥사메틸멜라민, 및 티오테파), 알킬 니트로소유레아 (카르무스틴) 및 유사체, 스트렙토조신, 및 트리아젠 (다카르바진);
- 항증식제/세포 분열 방지 항대사물질, 예컨대 폴산 유사체 (메토트렉세이트);
- 백금 배위 복합체 (씨스플라틴, 옥실로플라티님, 및 카르보플라틴), 프로카르바진, 하이드록시유레아, 미토탄, 및 아미노글루테티미드;
- 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 및 닐루타미드), 및 아로마타아제 억제자 (레트로졸 및 아나스트로졸);
- 항응고제, 예컨대 헤파린, 합성 헤파린 염, 및 트롬빈의 다른 억제자;
- 섬유소 용해제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화 물질, 스트렙토키나아제, 유로키나아제, 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 및 클로피도그렐;
- 이동 방지제;
- 항분비제 (브레벨딘);
- 면역억제제 타크롤리무스, 시롤리무스, 아자티오프린, 및 미코페놀레이트;
- 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제자 (혈관 내피 성장 인자 억제자 및 섬유아세포 성장 인자 억제자);
- 안지오텐신 수용체 블로커, 산화질소 공여체;
- 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
- 항체, 예컨대 트라스투쥬맙 및 리툭시맙;
- 세포 주기 억제자 및 분화 유도 물질, 예컨대 트레티노인;
- 억제자, 토포아이소머라아제 억제자 (독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 이리노테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 및 이리노테칸), 및 코르티코스테로이드 (코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론);
- 성장 인자 신호 변환 키나아제 억제자;
- 기능 장애 유도 물질;
- 독소, 예컨대 콜레라(Cholera) 독소, 리신, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 아데닐레이트 사이클라아제 독소, 디프테리아(diphtheria) 독소, 및 카스파아제 활성화 물질;
- 및 크로마틴.
화학치료제의 추가의 예는 다음을 포함한다:
- 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®);
- 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판;
- 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보큐온, 메투레도파, 및 유레도파;
- 알프레타민, 트리에밀렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메밀롤로멜라민을 포함한, 에밀레루민 및 메밀아멜라민;
- 아세토게닌, 특히 불라타신 및 불라타시논;
- 합성 유사체 토포테칸을 포함한, 캄프토테신;
- 브리오스타틴;
- 칼리스타틴;
- 아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 유사체를 포함한, CC-1065;
- 크립토피신, 특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8;
- 돌라스타틴;
- 합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI를 포함한, 듀오카르마이신;
- 엘레유테로빈;
- 판크라티스타틴;
- 사르코딕티인;
- 스폰지스타틴;
- 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 유라실 머스타드;
- 니트로소유레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포레무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴;
- 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 gammaII 및 칼리키아마이신 phiI1), 디네마이신, 예컨대 디네마이신 A, 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트, 에스페르아미신, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소 단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 프로피로마이신, 퓨로마이신, ??라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신;
- 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU);
- 폴산 유사체, 예컨대 데모프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트;
- 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌;
- 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록슈리딘;
- 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스토락톤;
- 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 및 트릴로스탄;
- 폴산 레플리니셔, 예컨대 프롤린산;
- 트리코테센, 특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A, 및 안구이딘;
- 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 (TAXOL®) 및 도세탁셀 (TAXOTERE®);
- 백금 유사체, 예컨대 씨스플라틴 및 카르보플라틴;
- 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐유라실; 암사크린; 헤스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지큐온; 엘포름틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 류코보린; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 플루오로피리미딘; 폴린산; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 다당류-K (PSK); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지큐온; 2,2',2''-트리큐오로트리에밀아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오페타; 클로람부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미트록산트론; 반크리스틴; 베노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 제오로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라아제 억제자 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DFMO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; FOLFIRI (플루오로우라실, 류코보린, 및 이리노테칸);
- 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체.
또한 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절기 (SERM), 효소 아로마타아제의 억제자, 항-안드로겐, 및 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는, 상기 언급된 것들 중 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 "화학치료제"의 정의에 포함된다.
항에스트로겐제 및 SERM의 예는, 예를 들어, 타목시펜 (NOLVADEX™ 포함), 라록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트레옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON®)을 포함한다.
효소 아로마타아제의 억제자는 부신에서 에스트로겐 생산을 조절한다. 예는 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGACE®), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®), 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)을 포함한다.
항-안드로겐의 예는 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프로드, 및 고세렐린을 포함한다.
화학치료제의 예는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 레티노이드 산 및 그 유도체를 포함하는 혈관 형성 방지제, 2-메톡시에스트라디올, ANGIOSTATIN®, ENDOSTATIN®, 수라민, 스콸라민, 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제자, 메탈로프로테이나아제-2의 조직 억제자, 플라스미노겐 활성화 물질 억제자-1, 플라스미노겐 활성화 물질 억제자-2, 연골-유래된 억제자, 파클리탁셀 (납(nab)-파클리탁셀), 혈소판 인자 4, 프로타민 설페이트 (클루페인), 황산화된 키틴 유도체 (대게 껍데기로부터 제조됨), 황산화된 다당류 펩티도글리칸 복합체 (sp-pg), 스타우로스포린, 기질 대사의 조절기, 예컨대 프롤린 유사체 ((1-아제티딘-2-카르복시산 (LACA)), 씨스하이드록시프롤린, d,I-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, α,α'-디피리딜, 베타-아미노프로피오니트릴 푸마레이트, 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3h)-옥사졸론, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 헤파린, 인터페론, 2 마크로글로불린-혈청, 닭 메탈로프로테이나아제-3 억제자 (ChIMP-3), 키모스타틴, 베타-사이클로덱스트린 테트라데카설페이트, 에포네마이신, 푸마길린, 금 나트륨 티오말레이트, d-페니실아민, 베타-1-항콜라게나아제-혈청, 알파-2-항플라스민, 비산트렌, 로벤자리트 이나트륨, n-2-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 이나트륨 또는 "CCA", 탈리도미드, 혈관 형성 억제 스테로이드, 카르복시 아미노이미다졸, 및 메탈로프로테이나아제 억제자, 예컨대 BB-94를 포함한다. 다른 혈관 형성 방지제는 항체, 바람직하게는 이들 혈관 형성 성장 인자에 대한 단클론성 항체를 포함한다: 베타-FGF, 알파-FGF, FGF-5, VEGF 아이소폼, VEGF-C, HGF/SF, 및 Ang-1/Ang-2.
화학치료제의 예는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 베타-아미노프로프리오니트릴 (BAPN)과 같은 화합물, 뿐만 아니라 리실 옥시다아제의 억제자 및 콜라겐의 비정상적 침착과 관련된 질환 및 병태의 치료에서의 사용에 관한 미국 특허 번호 4,965,288 (Palfreyman, et al.) 및 다양한 병리학적 섬유증 상태의 치료를 위해 LOX를 억제하는 화합물에 관한 미국 특허 번호 4,997,854 (Kagan et al.)에서 개시된 화합물을 포함하는 항섬유증제를 포함한다 (이것들은 본원에 참조로 포함됨). 추가의 예시의 억제자는 2-아이소부틸-3-플루오로-, 클로로-, 또는 브로모-알릴아민과 같은 화합물에 관한 미국 특허 번호 4,943,593 (Palfreyman et al.), 2-(1-나프틸옥시메밀)-3-플루오로알릴아민에 관한 미국 특허 번호 5,021,456 (Palfreyman et al.), 5,059,714 (Palfreyman et al.), 5,120,764 (Mccarthy et al.), 5,182,297 (Palfreyman et al.), 5,252,608 (Palfreyman et al.) 및 미국 공개 번호 2004/0248871 (Farjanel et al.) (이것들은 본원에 참조로 포함됨)에서 기술되어 있다.
예시의 항섬유증제는 또한 리실 옥시다아제의 활성 부위의 카르보닐 기와 반응하는 1차 아민, 및 더 구체적으로는, 카르보닐과 결합한 후, 공명에 의해 안정화된 생성물, 예컨대 다음의 1차 아민을 생산하는 것들을 포함한다: 에밀렌마민, 히드라진, 페닐히드라진, 및 그것들의 유도체; 세미카르바지드 및 유레아 유도체; 아미노니트릴, 예컨대 BAPN 또는 2-니트로에틸아민; 불포화된 또는 포화된 할로아민, 예컨대 2-브로모-에틸아민, 2-클로로에틸아민, 2-트리플루오로에틸아민, 3-브로모프로필아민, 및 p-할로벤질아민; 및 셀레노호모시스테인 락톤.
다른 항섬유증제는 세포를 침투하거나 침투하지 않는 구리 킬레이트화제이다. 예시의 화합물은 리실 옥시다아제에 의한 리실 및 하이드록시리실 잔기의 산화성 탈아미노화로부터 기원한 알데하이드 유도체를 차단하는 간접 억제자를 포함한다. 예는 티올아민, 특히 D-페니실아민, 및 그 유사체, 예컨대 2-아미노-5-메르캅토-5-메틸헥산산, D-2-아미노-3-메틸-3-((2-아세트아미도에틸)디티오)부탄산, p-2-아미노-3-메틸-3-((2-아미노에틸)디티오)부탄산, 나트륨-4-((p-1-디메틸-2-아미노-2-카르복시에틸)디티오)부탄 설퍼레이트, 2-아세트아미도에틸-2-아세트아미도에탄티올 설파네이트, 및 나트륨-4-메르캅토부탄설피네이트 트리하이드레이트를 포함한다.
화학치료제의 예는 또한, 제한되는 것은 아니지만, 환자를 치료하는데 적합한 치료 항체를 포함한 면역치료제를 포함한다. 치료 항체의 일부 예는 심투쥬맙, 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투쥬맙, 알렘투쥬맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시쥬맙, 비바투쥬맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투쥬맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투쥬맙, 식수투무맙, 클리바투쥬맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투쥬맙, 달로투쥬맙, 에크로멕시맙, 엘로투쥬맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시쥬맙, 파를레투쥬맙, 피클라투쥬맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 젬투쥬맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 임가투쥬맙, 인다툭시맙, 이노투쥬맙, 인테투무맙, 이플리무맙, 이라투무맙, 라베투쥬맙, 렉사투무맙, 린투쥬맙, 로르보투쥬맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투쥬맙, 밀라투쥬맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 나프투모맙, 네시투무맙, 니모투쥬맙, 노페투모맙, 오카라투쥬맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오나르투쥬맙, 오포르투쥬맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투쥬맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투쥬맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투쥬맙, 실툭시맙, 솔리토맙, 타카투쥬맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투쥬맙, 토시투모맙, 트라스투쥬맙, 투코투쥬맙, 유블리툭시맙, 벨투쥬맙, 보르세투쥬맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 및 3F8을 포함한다. 리툭시맙은 변연부(marginal-zone) 림프종, WM, CLL 및 소형 림프구성 림프종을 포함한 무통성 B-세포 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 리툭시맙과 화학요법제의 조합이 특히 효과적이다.
예시된 치료 항체는 방사성 동위원소 입자, 예컨대 인듐-111, 이트륨-90, 또는 요오드-131로 추가로 라벨링되거나 또는 이것들과 조합될 수 있다.
한 구체예에서, 추가적인 치료제는 질소 머스타드 알킬화제이다. 질소 머스타드 알킬화제의 비제한적 예는 클로람부실을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에서 기술된 화합물 및 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 하나 이상의 치료제는 Abl의 억제자, 활성화된 CDC 키나아제 (ACK), 아데노신 A2B 수용체 (A2B), 아폽토시스 신호-조절 키나아제 (ASK), 오로아(Auroa) 키나아제, 브루톤 티로신 키나아제 (Bruton's tyrosine kinase: BTK), BET-브로모도메인 (BRD), 예컨대 BRD4, c-Kit, c-Met, CDK-활성화 키나아제 (CAK), 칼모듈린-의존적 단백질 키나아제 (CaMK), 사이클린-의존적 키나아제 (CDK), 카세인 키나아제 (CK), 디스코이딘 도메인 수용체 (DDR), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 초점 접착 키나아제 (FAK), Flt-3, FYN, 글리코겐 신타아제 키나아제 (GSK), HCK, 히스톤 데아세틸라아제 (HDAC), IKK, 예컨대 IKKβε, 아이소시트레이트 데하이드로게나아제 (IDH), 예컨대 IDH1, 야누스(Janus) 키나아제 (JAK), KDR, 림프구-특이적 단백질 티로신 키나아제 (LCK), 리실 옥시다아제 단백질, 리실 옥시다아제-유사 단백질 (LOXL), LYN, 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), MEK, 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK), NEK9, NPM-ALK, p38 키나아제, 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 포스포릴라아제 키나아제 (PK), 폴로(polo)-유사 키나아제 (PLK), 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K), 단백질 키나아제 (PK), 예컨대 단백질 키나아제 A, B, 및/또는 C, PYK, 비장 티로신 키나아제 (SYK), 세린/트레오닌 키나아제 TPL2, 세린/트레오닌 키나아제 STK, 신호 변환 및 전사 (STAT), SRC, 세린/트레오닌-단백질 키나아제 (TBK), 예컨대 TBK1, TIE, 티로신 키나아제 (TK), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), YES, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
ASK 억제자는 ASK1 억제자를 포함한다. ASK1 억제자의 예는 WO 2011/008709 (Gilead Sciences) 및 WO 2013/112741 (Gilead Sciences)에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
BTK 억제자의 예는 이브루티닙, HM71224, ONO-4059, 및 CC-292를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
DDR 억제자는 DDR1 및/또는 DDR2의 억제자를 포함한다. DDR 억제자의 예는 WO 2014/047624 (Gilead Sciences), US 2009/0142345 (Takeda Pharmaceutical), US 2011/0287011 (Oncomed Pharmaceuticals), WO 2013/027802 (Chugai Pharmaceutical), 및 WO 2013/034933 (Imperial Innovations)에 개시된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
HDAC 억제자의 예는 프라시노스타트 및 파노비노스타트를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다
JAK 억제자는 JAK1, JAK2, 및/또는 JAK3을 억제한다. JAK 억제자의 예는 필고티닙, 룩소리티닙, 페드라티닙, 토파시티닙, 바리시티닙, 레스타우르티닙, 파크리티닙, XL019, AZD1480, INCB039110, LY2784544, BMS911543, 및 NS018을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
LOXL 억제자는 LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4, 및/또는 LOXL5의 억제자를 포함한다. LOXL 억제자의 예는 WO 2009/017833 (Arresto Biosciences)에서 기술된 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
LOXL2 억제자의 예는 WO 2009/017833 (Arresto Biosciences), WO 2009/035791 (Arresto Biosciences), 및 WO 2011/097513 (Gilead Biologics)에서 기술된 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
MMP 억제자는 MMP1 내지 10의 억제자를 포함한다. MMP9 억제자의 예는 마리마스타트 (BB-2516), 시페마스타트 (Ro 32-3555), 및 WO 2012/027721 (Gilead Biologics)에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3K 억제자는 PI3Kγ, PI3Kδ, PI3Kβ, PI3Kα, 및/또는 팬(pan)-PI3K의 억제자를 포함한다. PI3K 억제자의 예는 보르트만닌, BKM120, CH5132799, XL756, 및 GDC-0980을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kγ 억제자의 예는 ZSTK474, AS252424, LY294002, 및 TG100115를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kδ 억제자의 예는 PI3K II, TGR-1202, AMG-319, GSK2269557, X-339, X-414, RP5090, KAR4141, XL499, OXY111A, IPI-145, IPI-443, 및 WO 2005/113556 (ICOS), WO 2013/052699 (Gilead Calistoga), WO 2013/116562 (Gilead Calistoga), WO 2014/100765 (Gilead Calistoga), WO 2014/100767 (Gilead Calistoga), 및 WO 2014/201409 (Gilead Sciences)에서 기술된 화합물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kβ 억제자의 예는 GSK2636771, BAY 10824391, 및 TGX221을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
PI3Kα 억제자의 예는 부파를리십, BAY 80-6946, BYL719, PX-866, RG7604, MLN1117, WX-037, AEZA-129, 및 PA799를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
팬-PI3K 억제자는 LY294002, BEZ235, XL147 (SAR245408), 및 GDC-0941을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
SYK 억제자의 예는 타마티닙 (R406), 포스타마티닙 (R788), PRT062607, BAY-61-3606, NVP-QAB 205 AA, R112, R343, 및 미국 특허 번호 8,450,321 (Gilead Connecticut)에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
TKI는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체를 표적화할 수도 있다. EGFR을 표적화하는 TKI의 예는 제피티닙 및 에를로티닙을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 수니티닙은 FGF, PDGF, 및 VEGF에 대한 수용체를 표적화하는 TKI의 비-제한적 예이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 면역 체크포인트 억제자와 함께 사용될 수 있다. 면역 체크포인트는 면역 시스템에서 신호를 켜거나 (동시-자극 분자) 또는 신호를 끄는 (동시-억제 분자) 분자이다. 많은 암들은 동시-억제 분자에 대한 아고니스트 또는 동시-자극 분자에 대한 안타고니스트를 통해 T 세포 신호를 억제함으로써 면역 시스템으로부터 스스로를 보호한다. 면역 체크포인트 아고니스트 또는 안타고니스트는 세포에 의한 이러한 보호적 메커니즘을 중단시키는 것을 도울 수 있다. 면역 체크포인트 아고니스트 또는 안타고니스트는 체크포인트 분자, PD-1, CTLA-4, LAG-3 (CD223로도 알려져 있음), CD28, CD122, 4-1BB (CD137로도 알려져 있음), TIM3, OX-40/OX40L, CD40/CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA (CD272로도 알려져 있음) 중 임의의 하나 이상을 표적화할 수 있다.
예정된 T 세포 사멸 1 (PD-1)은 T 세포의 표면 상에서 발견된 막관통 단백질이며, 이것은 종양 세포에서 예정된 T 세포 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합될 때, T 세포 활성의 저해 및 T 세포-매개된 세포독성의 감소를 초래한다. 따라서, PD-1 및 PD-L1은 면역 하향-조절자 또는 면역 체크포인트 "오프 스위치(off switch)"이다. 예시의 PD-1 억제자는, 제한 없이, 니볼루맙 (Opdivo) (BMS-936558), 펨브롤리쥬맙 (Keytruda), 피딜리쥬맙, AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), PDR001, MPDL3280A, MEDI4736, BMS-936559 및 MSB0010718C를 포함한다.
CTLA-4는 면역 시스템을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4 억제자의 비-제한적 예는 이플리무맙 (Yervoy) (BMS-734016, MDX-010, MDX-101으로도 알려져 있음) 및 트레멜리무맙 (이전에는 티실리무맙, CP-675,206)을 포함한다.
림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3)은 세포 표면 상의 면역 체크포인트 수용체로서 Treg에 대한 작용에 의해 면역 반응, 뿐만 아니라 CD8+ T 세포에 대한 직접적인 효과를 저해하는 작용을 한다. LAG-3 억제자는, 제한 없이, LAG525 및 BMS-986016을 포함한다.
CD28은 거의 모든 인간 CD4+ T 세포 및 모든 CD8 T 세포의 거의 절반에서 구성적으로 발현된다. T 세포 확장을 촉진한다. CD28 억제자의 비-제한적 예는 TGN1412를 포함한다.
CD122는 CD8+ 효과기 T 세포의 증식을 증가시킨다. 비-제한적 예는 NKTR-214를 포함한다.
4-1BB (CD137로도 알려져 있음)는 T-세포 증식에 수반된다. CD137-매개된 신호 전달은 또한 활성화-유도된 세포 사멸로부터 T 세포, 및 특히 CD8+ T 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. PF-05082566, 우렐루맙 (BMS-663513) 및 리포칼린은 예시의 CD137 억제자이다.
상기 조합 처리 중 어느 것에 대하여, 항-PD-L1 항체는 다른 항암제와 동시에 또는 별도로 투여될 수 있다. 별도로 투여될 때, 항-PD-L1 항체는 다른 항암에 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.
감염의 치료
실험예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체는 면역 반응을 활성화시킬 수 있으며 이는 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.
감염은 질환 유발 물질에 의한 유기체 신체 조직의 침입, 그것들의 증식, 및 이들 유기체 및 그것들이 생산하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응이다. 감염은 감염원, 예컨대 바이러스, 비로이드(viroid), 프리온(prion), 박테리아, 선충, 예컨대 기생충 회충 및 요충, 절지동물, 예컨대 진드기(tick), 진드기(mite), 벼룩, 및 이, 균류, 예컨대 백선, 및 다른 거대 기생충, 예컨대 촌충 및 그 밖의 기생충에 의해 유발될 수 있다. 한 양태에서, 감염원은 박테리아, 예컨대 그람 음성(Gram negative) 박테리아이다. 한 양태에서, 감염원은 바이러스, 예컨대 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 및 역전사 바이러스이다. 바이러스의 비-제한적 예는 아데노바이러스(Adenovirus), 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus), 단순 헤르페스바이러스 1형(Herpes simplex virus, type 1), 단순 헤르페스바이러스 2형(Herpes simplex virus, type 2), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스 8형(Human herpesvirus, type 8), HIV, 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 볼거리 바이러스(Mumps virus), 인간 유두종 바이러스(Human papillomavirus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 수두 대상 포진 바이러스(Varicella-zoster virus)를 포함한다.
본 개시물의 항체는 또한 미생물 및 면역 세포를 표적화하여 미생물을 제거함으로써 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환을 치료하거나, 또는 미생물을 살해하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 미생물은 RNA 및 DNA 바이러스를 포함한 바이러스, 그람 양성(Gram positive) 박테리아, 그람 음성 박테리아, 원생동물문(protozoa) 또는 균류이다. 감염성 질환 및 관련 미생물의 비-제한적 예는 하기 표 4에서 제공된다.
임의의 특정 환자에 대한 특이적 투약 및 처리 양생법은 사용된 특정 항체, 이것의 변이체 또는 유도체, 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식습관, 및 투여 시기, 배출 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 심각도를 포함한 다양한 요인에 따라 다를 것이다. 의료 간병인에 의한 이러한 요인들의 판단은 해당 분야의 기술 범위 내에 있다. 양은 또한 처리되는 개개의 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질환의 심각도, 및 원하는 효과에 따라 다를 것이다. 사용된 양은 해당 분야에 널리 공지된 약리학적 및 약물동역학적 원리에 의해 결정될 수 있다.
항체, 이것의 변이체 또는 유도체의 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 구강 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝(lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구로, 수조내로, 질내로, 복강내로, 국부적으로 (분말, 연고, 안약 또는 경피성 패치에 의해), 볼에, 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여될 수도 있다.
용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 말한다.
투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 항체를, 심실내 및 척추강내 주사를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수도 있다; 심실내 주사는, 예를 들어, 레저버, 예컨대 Ommaya 레저버에 부착된 심실내 카테터에 의해 용이해질 수도 있다. 폐 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저, 및 에어로졸화제를 함유한 제제의 사용에 의해 이용될 수 있다.
치료를 필요로 하는 영역에 본 발명의 항체 폴리펩타이드 또는 조성물을 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이것은, 제한하는 것이 아니라, 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입에 의해, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 국부 도포에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수도 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료이고, 막, 예컨대 실라스틱 막, 또는 섬유를 포함한다. 바람직하게는, 항체를 포함한, 본 발명의 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.
또 다른 구체예에서, 항체 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조; 일반적으로 같은 책 참조).
또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 구체예에서는, 펌프가 사용될 수도 있다 (Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또 다른 구체예에서는, 폴리머 재료가 사용될 수도 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하게 배치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 Langer의 논평 (1990, Science 249:1527-1533)에서 논의된다.
본 발명의 조성물이 단백질을 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 특정 구체예에서, 핵산은 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 투여하여 세포 내에 있도록 함으로써, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주사에 의해, 또는 극미립자 충격 (예를 들어, 유전자 총(gene gun); Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션제로의 코팅의 사용에 의해, 또는 핵에 들어가는 것으로 알려진 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드에 결합된 채로 투여함으로써 (예를 들어, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 참조), 등에 의해 생체 내에 투여되어 암호화된 단백질의 발현을 촉진할 수 있다. 대안으로, 핵산은 상동 재조합에 의해 세포 내로 도입되고 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내로 통합될 수 있다.
염증, 면역 또는 악성 질환, 장애 또는 병태의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 발명의 항체의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 시험관 내 검정이 최적의 투약 범위를 확인하는 것을 돕는데 선택적으로 이용될 수도 있다. 제제화에 이용되어야 하는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환, 장애 또는 병태의 심각도에 따라 다를 것이며, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 환자에게 투여되는 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드의 투약량은 전형적으로 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 환자 체중의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래의 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종의 항체보다 인간 신체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 작은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 때때로 가능하다. 또한, 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투 (예를 들어, 뇌로)를 강화시킴으로써 본 발명의 항체의 투약량 및 투여 빈도가 감소될 수도 있다.
본 발명의 항체, 이것의 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함한, 감염성 또는 악성 질환, 병태 또는 장애를 치료하는 방법은 전형적으로 인간에서 사용하기 전에, 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대하여, 시험관 내에서 테스트된 다음, 허용 가능한 동물 모델의 생체 내에서 테스트된다. 트랜스제닉 동물을 포함한 적합한 동물 모델은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 본원의 다른 곳에서 개시된 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 특정 항원-결합 폴리펩타이드의 투여가 지시되는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 환자 조직 샘플이 배양액에서 키워지고, 화합물에 노출되거나 그렇지 않으면 화합물이 투여된 시험관 내 세포 배양 검정을 포함하고, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과가 관찰된다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 예를 들어, 리포솜, 극미립자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포에서의 캡슐화, 수용체-매개된 세포 내 흡수(endocytosis) (예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성, 등이 있다.
진단 방법
PD-L1의 과발현이 특정 종양 샘플에서 관찰되고, PD-L1-과발현 세포를 가진 환자는 본 발명의 항-PD-L1 항체로의 처리에 반응성일 가능성이 크다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 진단 및 예후 목적으로도 사용될 수 있다.
바람직하게는 세포를 포함한 샘플은 환자로부터 얻어질 수 있으며, 이 환자는 암 환자 또는 진단을 요구하는 환자일 수 있다. 세포는 환자의 종양 조직 또는 종양 블록, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 임의의 샘플의 세포일 수 있다. 샘플의 선택적 전처리시, 샘플은 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 PD-L1 단백질과 상호작용하게 하는 조건 하에서 본 발명의 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. ELISA와 같은 방법들이 항-PD-L1 항체를 이용하여 샘플에서 PD-L1 단백질의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
샘플에서 PD-L1 단백질의 존재 (선택적으로 양 또는 농도와 함께)는 환자가 항체의 처리에 적합하다는 표시로서, 또는 환자가 암 치료에 반응했다는 (또는 하지 않았다는) 표시로서 암의 진단에 사용될 수 있다. 예측 방법을 위해서, 치료의 진행을 표시하기 위해 암 치료의 시작시, 특정 단계에서, 즉시, 2회 이상 검출이 실행될 수 있다.
조성물
본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제자)를 더 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서 사용에 대하여 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 제제화 보조제일 것이다.
용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수도 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사 가능한 용액에 대하여, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 모체 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량의 바이알에 동봉될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 일상적인 과정에 따라 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요하면, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 국소마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나 또는 활성제의 양을 표시하는 밀폐 용기, 예컨대 앰플 또는 사세(sachette) 내에서, 예컨대 동결건조된 분말 무수 농축물로서, 단일 투약 형태로 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2 철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
실시예
실시예 1: 인간 PD-L1에 대한 인간 단클론성 항체의 생성
하이브리도마 기술을 사용하여 항-인간-PD-L1 마우스 단클론성 항체를 생성하였다.
항원: 인간 PDL1-Fc 단백질 및 인간 PD-L1이 고도로 발현된 CHOK1 세포주 (PDL1- CHOK1 세포주).
면역화: 인간 PD-L1에 대한 마우스 단클론성 항체를 생성하기 위해서, 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 먼저 1.5 Х 107 PDL1- CHOK1 세포로 면역화하였다. 최초 면역화 후 제14 일 및 제33 일에, 면역화된 마우스를 각각 1.5 Х 107 PDL1- CHOK1 세포로 재면역화하였다. PD-L1 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA로 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1 단백질로 실온 (RT)에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 면역화된 마우스의 혈장의 희석액을 각 웰에 첨가하고 RT에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (Horse Radish Peroxidase: HRP)와 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 ABTS 기질로 현상하여 OD 405nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 항-PDL1 IgG의 충분한 역가를 가진 마우스를 면역화 후 제54 일에 50 μg 인간 PDL1-Fc 단백질로 부스팅(boost)하였다. 결과로 생성된 마우스를 융합에 사용하였다. 하이브리도마 상층액을 항-PD-L1 IgG에 대하여 ELISA로 테스트하였다.
하이브리도마 클론 HL1210-3, HL1207-3, HL1207-9 및 HL1120-3을 추가의 분석을 위해 선택하였다. HL1210-3의 가변 영역의 아미노산과 폴리뉴클레오타이드 서열은 하기 표 5에서 제공된다.
실시예 2: 인간 PD-L1에 대한 HL1210-3 마우스 단클론성 항체의 결합 활성
하이브리도마 클론 HL1210-3의 결합 활성을 평가하기 위해서, 이 클론으로부터 정제된 mAb를 ELISA 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 0.2 μg/ml에서 시작한 HL1210-3 항체의 3배 희석액을 각 웰에 첨가하고 RT에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 1에서 도시된 바와 같이, HL1210-3은 높은 활성으로 인간 PD-L1에 결합할 수 있다 (EC50=5.539ng/ml).
실시예 3: HL1210-3 마우스 mAb는 수용체 PD-1로의 인간 PD-L1 결합을 차단하였다
재조합 인간 PD-L1을 사용하는 수용체 차단 검정
수용체 PD-1에 결합 하기 위한 재조합 인간 PD-L1에 대한 HL1210-3 마우스 mAb의 차단 효과를 평가하기 위해서, ELISA 기반 수용체 차단 검정을 이용하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 50 μl 비오틴-라벨링된 인간 PD-1-Fc 단백질 및 50 μl로 2 μg/ml에서 시작한 HL1210-3 항체의 3배 희석액을 각 웰이 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 스트렙타비딘-HRP과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 2에서 도시된 바와 같이, HL1210-3은 IC50=0.7835nM으로 인간 PD1으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다.
포유류 세포 발현된 인간 PD-L1을 사용하는 수용체 차단 검정
수용체 PD-1에 결합 하기 위한, 포유류 세포 상에서 발현된 인간 PD-L1에 대한 HL1210-3 마우스 mAb의 차단 효과를 평가하기 위해서, FACS-기반 수용체 차단 검정을 사용하였다. 간략히 말하면, PDL1-CHOK1 세포을 먼저 20 μg/ml에서 시작하여 3배 단계 희석된 HL1210-3 마우스 mAb와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로 세척 후, 비오틴-라벨링된 huPD-1을 각 웰에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, FACS 버퍼로 2회 세척 후 0.5시간 동안 스트렙타비딘-PE를 각 웰에 첨가하였다. PE의 평균 형광 강도 (MFI)를 FACSAriaIII로 평가하였다. 도 3에서 도시된 바와 같이, HL1210-3 항체는 2.56nM의 IC50으로 포유류 세포에서 발현된 PD-L1 상에 PD-1의 결합을 매우 효율적으로 억제할 수 있으며 92.6%의 최고 억제율을 갖는다.
실시예 4: HL1210-3 마우스 mAb는 인간 T 세포 면역 반응을 촉진하였다
HL1210-3 마우스 mAb의 효과를 평가하기 위해, 혼합된 림프구 반응 설정에서 인간 T 세포의 반응을 평가하였다. 인간 DC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 7일 ㄷ동안 CD14+ 단핵구로부터 분화시켰다. 그 다음에 또 다른 공여체로부터 단리된 CD4+ T 세포를 DC 및 항-PD-L1 차단 항체의 단계 희석액과 동시 배양하였다. 접종 후 제5 일에, 배양 상층액을 IFNγ 생산에 대하여 분석하였다. 결과는 HL1210-3 항체가 IFNγ 생산을 용량-의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 나타냈으며, 항-PD-L1 항체가 인간 T 세포 반응을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다 (도 4).
실시예 5: HL1210-3 마우스 mAb의 결합 친화도
재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his taq)로의 HL1210-3 항체의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 BIACORE™으로 테스트하였다. CM5 칩 상에 코팅된 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 HL1210-3 마우스 mAb를 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his taq 단백질의 단계 희석액을 캡쳐된 항체 위에 3분 동안 25 μg/ml의 유속으로 주사하였다. 항원을 900s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200에서 수행하였다. Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 결과는 하기 도 5 및 표 6에 나타나있다.
실시예 6: HL1210-3 마우스 mAb의 인간화
mAb HL1210-3 가변 영역 유전자를 이용하여 인간화된 MAb를 생성하였다. 이 공정의 첫 번째 단계에서, MAb HL1210-3의 VH 및 VK의 아미노산 서열을 인간 Ig 유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여 전체적으로 가장 잘 일치하는 인간 생식계열 Ig 유전자 서열을 찾았다. 경쇄에 대하여, 가장 가까운 인간 매치는 O18/Jk2 및 KV1-39*01/KJ2*04 유전자이며, 중쇄에 대해서는 가장 가까운 인간 매치는 VH3-21 유전자였다. VH3-11, VH3-23, VH3-7*01 및 VH3-48 유전자를 또한 가까운 매치로 인해 선택하였다.
그 다음에 HL1210-3 경쇄의 CDR1 (서열 번호: 4), 2 (서열 번호: 5) 및 3 (서열 번호: 6)이 O18/Jk2 및 KV1-39*01/KJ2*04 유전자의 프레임워크 서열로 이식되고, HL1210-3 VH의 CDR1 (서열 번호: 1), 2 (서열 번호: 2), 및 3 (서열 번호: 3) 서열이 VH3-21, VH3-11, VH3-23, VH3-48 또는 VH3-7*01 유전자의 프레임워크 서열로 이식된 인간화된 가변 도메인 서열을 디자인하였다. 그 다음에 3D 모델을 생성하여 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 줄 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지를 결정하였다. 경쇄의 경우에, 프레임워크에서 22S, 43S, 60D, 63T 및 42Q (Kabat 넘버링, 표 7 참조)를 확인하였다. 중쇄의 경우에는, 프레임워크의 1E, 37V, 40T, 44S, 49A, 77N, 91I, 94R 및 108T가 역돌연변이에 수반되었다.
인간화된 항체 중 일부의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 8에서 나열된다.
인간화된 VH 및 VK 유전자를 합성으로 생산한 다음 각각 인간 감마 1 및 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 벡터로 클로닝하였다. 인간 VH 및 인간 VK의 쌍 형성은 40개의 인간화된 항체를 생성하였다 (표 9 참조).
실시예 7: 인간화된 PD-L1 항체의 항원 결합 성질
재조합 인간 PD-L1에 대한 결합 성질
항원 결합 활성을 평가하기 위해서, 인간화된 항체를 ELISA 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작한 인간화된 항체의 5배 희석액을 각 웰에 첨가하고 RT에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 6에서 도시된 바와 같이, 모든 인간화된 항체는 키메라 항체와 접촉된 채로 인간 PD-L1에 대하여 비슷한 결합 효율을 나타낸다.
포유류 발현된 인간 PD-L1에 대한 결합 성질
항원 결합 성질을 평가하기 위해서, 인간화된 항체를 포유류 발현된 PD-L1로의 결합에 대하여 FACS로 분석하였다. 간략히 말하면, PDL1-CHOK1 세포를 먼저 2 μg/ml에서 시작하여 5배 단계 희석된 인간화된 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로의 세척 후, alexa 488-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Alexa 488의 MFI를 FACSAriaIII로 평가하였다. 도 7에서 도시된 바와 같이, 모든 인간화된 항체는 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 매우 효율적으로 결합할 수 있으며, 이는 키메라 항체와 비슷하였다.
인간화된 항체의 결합 역학을 조사하기 위해, 이 실시예에서는 Octet Red 96을 사용하여 친화도 순위 결정을 수행하였다. 표 10에서 나타난 바와 같이, hu1210-3, hu1210-8, hu1210-9, hu1210-14, hu1210-17, hu1210-1 및 Hu1210-22가 더 높은 친화도를 나타내며, 이는 키메라 항체와 비슷하다.
Biacore®에 의한 인간화된 항체의 전체 역학 친화도
재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his taq)로의 인간화된 항체의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 BIACORE™으로 테스트하였다. HL1210-3 마우스 mAb를 CM5 칩 상에 코팅된 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his taq 단백질의 단계 희석액을 캡쳐된 항체 위에 3분 동안 25 μg/ml의 유속으로 주사하였다. 항원을 900s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200에서 수행하였다. Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였고 하기 표 11에 나타나있다.
교차 종 활성
huPD-L1, 마우스 PD-L1, 래트 PD-L1, 붉은털 원숭이 PD-L1로의 인간화된 항체의 결합을 평가하기 위해서, 항체에 ELISA 테스트를 수행하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간, 마우스, 래트 및 붉은털 원숭이 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 1 μg/ml에 시작한 인간화된 항체의 3배 희석액을 각 웰에 첨가하고 RT에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. Hu1210-41 항체는 붉은털 원숭이 PD-L1에 낮은 친화도로 결합할 수 있지만 래트 및 마우스 PD-L1에는 결합할 수 없다 (도 8).
패밀리 구성원 특이성
인간 B7 패밀리 및 다른 면역 체크포인트로의 인간화된 항-PD-L1 항체의 결합을 평가하기 위해서, B7-H1 (PD-L1), B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS 및 BTLA로의 결합에 대하여 ELISA로 항체를 평가하였다. 도 9에서 도시된 바와 같이, Hu1210-41 항체는 B7-H1 (PD-L1)에만 특이적으로 결합할 수 있다.
실시예 8: 인간화된 항체는 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 활성을 차단하였다
세포 기반 수용체 차단 검정
수용체 PD-1에 결합 하기 위한, 포유류 세포에서 발현된 인간 PD-L1에 대한 인간화된 항체의 차단 효과를 평가하기 위해서, FACS-기반 수용체 차단 검정을 이용하였다. 간략히 말하면, PDL1-CHOK1 세포를 먼저 20 μg/ml에서 시작하여 3배 단계 희석된 HL1210-3 마우스 mAb와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로 세척 후, 비오틴-라벨링된 huPD-1을 각 웰에 첨가하였고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 스트렙타비딘-PE를 각 웰에 FACS 버퍼로 2회 세척 후 0.5시간 동안 첨가하였다. PE의 평균 형광 강도 (MFI)를 FACSAriaIII로 평가하였다.
하기 표 12에 나타난 바와 같이, Hu1210-3, Hu1210-9, Hu1210-8, Hu1210-14, Hu1210-17, Hu1210-19 및 Hu1210-22 항체는 PD-1로의 PD-L1의 결합을 차단하는 것에 대하여 키메라 항체와 비슷한 효능을 나타낸다.
재조합 인간 PD-L1을 사용하는 수용체 차단 검정
인간 PD-L1에 대하여 두 개의 수용체, 즉, PD-1 및 B7-1이 존재한다. 이들 두 개의 단백질에 대한 인간화된 PD-L1 항체의 차단 성질을 조사하기 위해서, 본원에서는 단백질 기반 수용체 차단 검정을 이용하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 200 μl/웰의 5% BSA로 37℃에서 2 hr 동안 블로킹하였다. 50 μl 비오틴-라벨링된 인간 PD-1-Fc 또는 B7-1v 단백질 및 50 μl로 100 nM에서 시작한 PD-L1 항체의 5배 희석액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 스트렙타비딘-HRP와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 10 및 11에서 도시된 바와 같이, Hu1210-41은 인간 PD1 및 B7-1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다.
실시예 9: 인간화된 항체는 인간 T 세포 면역 반응을 촉진하였다.
혼합된 림프구 반응 검정
인간화된 항체의 시험관 내 기능을 평가하기 위해, 혼합된 림프구 반응 설정에서 인간 T 세포의 반응을 평가하였다. 인간 DC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 7일 동안 CD14+ 단핵구로부터 분화시켰다. 그 다음에 또 다른 공여체로부터 단리된 CD4+ T 세포를 DC 및 항-PD-L1 차단 항체의 단계 희석액과 함께 동시-배양하였다. 접종 후 제5 일에, 배양 상층액을 IL-2 및 IFNγ 생산에 대하여 분석하였다. 결과는 Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16 및 Hu1210-17 항체가 IL-2 및 IFNγ 생산을 용량-의존적으로 촉진할 수 있다는 것을 나타냈으며, 항-PD-L1 항체가 인간 T 세포 반응을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다.
CMV 리콜 검정
인간화된 항체의 시험관 내 기능을 평가하기 위해서, CMV 리콜 검정에서 인간 T 세포의 반응을 평가하였다. 인간 PBMC를 단계 희석된 인간화된 항체의 존재 하에 1 μg/ml CMV 항원으로 자극하였다. 도 12 및 13에서 도시된 바와 같이, Hu1210-40, Hu1210-41 및 Hu1210-17은 IFNγ 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있다.
실시예 10: 항-PD-L1 mAb에 의한 종양 성장 억제.
인간 폐 선암종 세포주 HCC827의 세포를 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 이식할 것이다. NSG 마우스는 NOD scid 감마 결핍이고 가장 면역결핍된 마우스가 인간 종양 세포 및 PBMC 이식에 대한 이상적인 수령체가 된다. 이식 후 10일에, 인간 PBMC를 종양-함유 마우스로 이식할 것이다. 이식 후 대략 20일에, 종양 부피가 100-150mm3에 도달하면, PD-L1 항체가 격일마다 5 mg/kg으로 마우스에 투여될 것이다. 종양 부피를 항체 투여와 함께 격일마다 모니터링할 것이다. 도 14에서 도시된 바와 같이, Hu1210-31은 5mg/kg에서 종양 성장을 30%까지 억제할 수 있다. Hu1210-41 항체는 종양 성장을 용량-의존적으로 억제할 수 있는 한편, 종양 중량이 또한 Hu1210-41 항체에 의해 용량-의존적으로 저해되었다 (도 15).
실시예 11. 인간화된 항체의 추가의 변이 및 최적화의 컴퓨터 시뮬레이션
CDR 영역 또는 프레임워크 영역 내 특정 아미노산 잔기가 항체의 활성 및/또는 안정성을 더 개선하거나 보유하도록 변경될 수 있다는 것을 고려하였다. 변이체를 구조적, 입체구조적 및 기능적 성질에 관하여 컴퓨터 도구 (VectorNTI, www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/에서 이용 가능)를 이용하여 테스트하였고, 징후를 나타내는 것들 (CDR 영역 내에서)을 하기 표에서 나열하였다.
밑줄: 핫스팟 돌연변이 잔기 및 그것들의 치환물
실시예 12: PD-L1 에피토프의 확인
본 발명의 항체로의 PD-L1의 결합에 수반된 아미노산 잔기를 확인하기 위해 이 연구를 실행하였다.
PD-L1의 알라닌-스캔 라이브러리를 구성하였다. 간략히 말하면, PD-L1의 217개의 돌연변이 클론을 Integral Molecular's 단백질 조작 플랫폼에서 생성하였다. PD-L1 돌연변이 라이브러리의 각각의 변이체로의 Hu1210-41 Fab의 결합을 고처리량 유동 세포 분석법에 의해 2배수로 결정하였다. 각각의 미처리 데이터 포인트는 백그라운드 형광을 뺀 것이며 PD-L1 야생형 (WT)과의 반응성에 대하여 표준화하였다. 각각의 PD-L1 변이체에 대하여, 평균 결합 값을 발현 (대조군 항-PD-L1 mAb 반응성)의 함수로서 플롯팅하였다. 예비의 중요한 클론 (십자가가 표시된 원)을 확인하기 위해서, 대조군 MAbD에 대한 >70% WT 결합 및 Hu1210-41 Fab에 대한 <30% WT 반응성의 임계치 (점선)를 적용하였다 (도 16). PDL1의 Y134, K162, 및 N183을 Hu1210-41 결합에 필요한 잔기로 확인하였다. Hu1210-41 Fab와의 N183A 클론의 낮은 반응성은 그것이 Hu1210-41에 대한 주요한 효과적인 기여자이며, Y134 및 K162에 의한 기여는 더 작다는 것을 시사한다.
3D PD-L1 구조 (PDB ID# 5JDR, Zhang et al., 2017)에서 중요 잔기 (구형)를 확인하였으며, 도 17에서 예시된다. 그러므로, 이들 잔기, Y134, K162, 및 N183은 본 발명의 다양한 구체예의 항체로의 결합의 원인이 되는 PD-L1의 에피토프를 구성한다.
Y134, K162, 및 N183이 모두 PD-L1 단백질의 IgC 도메인 내에 위치한다는 것을 언급하는 것은 흥미롭다. PD-1 및 PD-L1 둘 다의 세포 외 부분은 IgV 도메인 및 IgC 도메인을 갖는다. 일반적으로 PD-L1이 IgV 도메인 사이의 결합을 통해 PD-1에 결합한다는 것이 알려져 있다. 하지만, 이러한 통상적인 항체와 달리, Hu1210-41은 IgC 도메인에 결합하며, 이는 PD-1/PD-L1 결합을 억제하는데 있어서 비효과적일 것으로 예상된다. 놀랍게도, Hu1210-41의 이 상이한 에피토프는 Hu1210-41의 우수한 활성에 기여할 가능성이 크다.
실시예 13. 항-PDL1 항체의 항체 조작
실시예 13-17에서는 돌연변이 유발을 사용하여 Hu1210-41을 기반으로 더 개선된 항체를 확인하려는 시도를 하였다.
뉴클레아제-비활성 클러스터링된(clustered) 규칙적으로 간격을 둔 짧은 반복부위 (CRISPR)-관련 단백질 (dCas9)와 함께 활성화-유도된 시티딘 데아미나아제 (AID)를 293 T 세포에서 기능적 변이체의 고처리량 스크리닝에 사용하였다. 간략히 말하면, 항체의 6개의 CDR을 인식하는 단일 안내 (sg)RNA는 항체의 6개의 CDR을 dCas9-AID 융합 단백질로 안내하고 CDR 영역에서의 돌연변이를 유도할 수 있다. 돌연변이된 항체는 293 세포의 세포 표면에서 나타났다. 결과로 생성된 세포는 돌연변이되지 않은 대응물보다 더 우수한 결합 능력을 나타냈으며 상기 세포를 이후의 시퀀싱을 위해 FACS 분류하였다. CDRH2에서 S60의, R로의 돌연변이는 잠재적으로 항체에 대한 긍정적인 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
S60R (CDRH2) 돌연변이의 항원 결합 성질을 평가하기 위해서, 항체를 포유류에서 발현된 PD-L1으로의 결합에 대하여 FACS로 분석하였다. 간략히 말하면, PD-L1 Raji 세포를 먼저 2 μg/ml에서 시작하여 5배 단계 희석된 인간화된 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로 세척 후, Alexa 488-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Alexa 488의 MFI를 FACSAriaIII로 평가하였다. 도 18에서 도시된 바와 같이, S60R 돌연변이는 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 고도로 효율적으로 결합하였으며, 이는 모체 항체 Hu1210-41보다 더 강력했다. 이 S60R 돌연변이를 아래의 추가의 돌연변이 분석을 위한 모체 항체로서 사용하였고, "WT"라고 불렀다.
다음 전략 중 하나를 사용하여 항-PD-L1 단클론성 항체의 항체 조작을 위한 4개의 하위 라이브러리를 구성하였다. 전략 1에서, 중쇄 가변 도메인 VH CDR3 또는 VL-CDR3의 돌연변이 유발을 매우 무작위적인 돌연변이로 수행하였다. 전략 2에서는, (VH-CDR3, VL-CDR3 및 VL-CDR1) 또는 (VH-CDR1, VH-CDR2 및 VL-CDR2)로 구성된 두 개의 CDR 조합 라이브러리를 제어된 돌연변이 속도로 이동하는 CDR로 생성하였다.
바이오-패닝(Bio-Panning): 거친 세척 조건 이전의 인큐베이션/결합 시간을 짧게 하여 파지 패닝 방법을 조정하였다. 간략히 말하면, 100 μl 자기 스트렙타비딘 비드 (Invitrogen, USA)를 실온에서 1 hr 동안 1 ml MPBS로 블로킹하였다. 또 다른 튜브에서는, 라이브러리 파지를 1 ml MPBS 중의 100 μl 자기 스트렙타비딘 비드와 함께 사전 인큐베이션하여 (각 라운드 동안 5 x 10^11~12) 원치않는 바인더를 제거하였다. 자석 입자 농축기를 사용하여 파지와 비드를 분리하였다. 비오티닐화된 PD-L1 단백질을 파지에 첨가하여 실온에서 2h 동안 인큐베이션하고, 오버-헤드(over-head) 셰이커를 사용하여 부드럽게 혼합하였다. 용액으로부터 비드를 가지고 있는 파지를 자기 입자 농축기에서 분리하고 상층액을 제거하였다. 비드를 신선한 세척 버퍼로, PBST로 10회 및 PBS (pH7.4)로 10회 세척하였다. PBS (Sigma, USA) 중의 0.25% 트립신 0.8 ml를 첨가하고 37℃에서 20 min 동안 인큐베이션하여 파지를 용출하였다. 산출 파지를 적정하고 다음 패닝 라운드를 위해 구조하여, 라운드별로 항원 농도를 감소시켰다.
ELISA 스크리닝 및 온/오프(On/off) 속도 순위
클론을 선별하여 원하는 패닝 산출물로부터 유도하였고; 1차 스크리닝을 위해 파지 ELISA를 실행하였고; 양성 클론을 시퀀싱으로 분석하였고; 고유한 핫스팟을 발견하였다. 표 14는 확인된 돌연변이를 나타낸다. 아래 나타난 바와 같이, CDRH3에서 FGK 잔기가 개선된 항체를 생산하는 핫스팟 잔기이다.
* WT는 Hu1210-41과 중쇄의 S60R (Kabat 넘버링) 치환이 상이하여 친화도를 개선한다.
이들 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 아래 표 15에 나타나있다.
실시예 14. PD-L1 항체의 항원 결합 성질
표 14 및 15에서 나타난 바와 같이, 총 9개의 독특한 클론을 특성화하고 전장 IgG로 전환하였다.
재조합 인간 PD-L1에 대한 결합 성질
항원 결합 활성을 평가하기 위해서, 항체를 ELISA 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 2 μg/ml, 100 μl/웰의 인간 PD-L1-Fc 단백질로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 100 μl/웰의 5% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 인간화된 항체의 4배 희석액을 각 웰에 추가하고 RT에서 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하여 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 19에서 도시된 바와 같이, 모든 인간화된 항체는 인간 PD-L1에 대한 우수한 결합 효율을 나타냈고, B6과 C3가 모체 클론 WT보다 더 우수하게 작동했다.
포유류 발현된 인간 PD-L1에 대한 결합 성질
항원 결합 성질을 평가하기 위해서, 항체를 포유류 발현된 PD-L1로의 결합에 대하여 FACS로 분석하였다. 간략히 말하면, PDL1-Raji 세포를 먼저 2 μg/ml에서 시작하여 5배 단계 희석된 인간화된 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로 세척 후, Alexa 488-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Alexa 488의 MFI를 FACSAriaIII로 평가하였다. 도 20에서 도시된 바와 같이, B6이 포유류 세포에서 발현된 PD-L1에 매우 효율적으로 결합하였으며, 이는 모체 항체 WT보다 더 강력했다.
Biacore에 의한 인간화된 항체의 친화도 순위 결정
인간화된 항체의 결합 역학을 조사하기 위해, 이 예에서는 Biacore를 사용하여 친화도 순위 결정을 수행하였다. 표 16에서 나타난 바와 같이, B6, C3, C6, A1 및 A3이 모체 항체 WT보다 더 우수한 친화도를 나타냈다.
실시예 15. 항-PDL1 항체 세포 기반 기능
T 세포 반응을 자극할 수 있는 항-PDL1 항체의 능력을 테스트하기 위해서, hPD-1-발현된 Jurkat 세포를 사용하였다. 간략히 말하면, Jurkat은 TCR 자극시 IL2를 생산할 수 있는 인간 T 세포 백혈병 세포주이다. 이 검정에서, 인간 PD-1 유전자로 트랜스펙션된 Jurkat 세포를 반응 세포로 사용하였다. Raji-PDL1 세포를 항원 제공 세포 (APC)로 사용하였다. 포도상구균 장독소 (SE)를 사용하여 TCR 신호를 자극하였다. 이 시스템에서, 이소성으로 발현된 huPDL1은 Jurkat 세포에 의한 SE 자극된 IL-2 생산을 저해할 수 있는 한편, 항-PDL1 항체는 IL-2 생산을 반전시킬 수 있다. 요컨대, APC (2.5 Х 104)를 SE 자극의 존재 하에 PD-1 발현 Jurkat T 세포 (1 Х 105)와 동시-배양하였다. 항-PDL1 항체 (100nM에서 시작하여 8회 용량 동안 1:4로 단계 희석됨)를 배양을 시작할 때 첨가하였다. 48hr 후, 배양 상층액을 ELISA로 IL2 생산에 대하여 평가하였다. 도 21에서 도시된 바와 같이, B6 단클론성 항체가 모체 항체 WT보다 더 강력했다.
실시예 16. 혼합된 림프구 반응
PDL1 항체의 시험관 내 기능을 평가하기 위해서, 혼합된 림프구 반응 설정에서 인간 T 세포의 반응을 평가하였다. 간략히 말하면, 인간 DC를 GM-CSF와 IL-4의 존재 하에 7일 동안 CD14+ 단핵구로부터 분화시켰다. 또 다른 공여체로부터 단리된 CD4+ T 세포를 DC 및 항-PD-L1 차단 항체의 단계 희석액과 동시 배양하였다. 접종 후 제5 일에, 배양 상층액을 IFNγ 생산에 대하여 분석하였다. 결과 (도 22)는 IFNγ 생산을 촉진하는데 있어서 B6 항체가 모체 항체 WT보다 더 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 17. MC38 동계 모델에서 PDL1 항체의 생체 내 효능
종양 성장에 대한 PDL1의 효과를 평가하기 위해서, PDL1 인간화된 MC38 동계 종양 모델을 적용하였다. 이 모델에서, 인간 PDL1 유전자를 마우스 MC38 세포에서 발현시키는 한편, 마우스 PDL1 유전자의 세포 외 도메인을 인간 PDL1 유전자로 대체하였다. 이와 관련하여, 이 PDL1 유전자 인간화된 MC38 동계 모델에서 종양 성장에 대한 인간 PDL1 항체의 효능을 평가할 수 있다. huPDL1 MC38 세포를 PDL1 인간화된 마우스에 피하로 접종하였다. 종양이 100-150m3의 부피에 도달하면, 모체 항체 WT 및 B6 항체를 3mg/kg으로 6회 용량 동안 주 2회 복강내로 투여하였다. 결과 (도 23)는 제19 일에서 제26 일까지 B6 항체가 모체 항체 WT보다 더 강력했음을 나타낸다.
* * *
본 개시물은 본 개시물의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되는 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되어서는 안 되고, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법이 본 개시물의 범위 내에 포함된다. 본 개시물의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시물의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 개시물은 첨부된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에 있으면 본 개시물의 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
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<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 119
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
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<220>
<223> Synthetic
<400> 27
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Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
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<220>
<223> Synthetic
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1 5 10 15
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<220>
<223> Synthetic
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
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35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
<223> Synthetic
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
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Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
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35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<211> 108
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 34
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agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt gaggcagacc 120
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ggcaagaggt acgccctgga ctactgggga cagggcacca gcgtgaccgt gagcagc 357
<210> 35
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 35
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt gagacaggcc 120
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tccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagttc 300
ggcaaaaggt acgccctgga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 36
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 36
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gcctggagtg ggtggccacc atctccgatg gcggcggcta catctattac 180
tccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagttc 300
ggcaaaaggt acgccctgga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 37
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 37
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaaaa gcctggagtg ggtggccacc atctccgatg gcggcggcta catctattac 180
tccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt acatctgcgc cagggagttc 300
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<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 38
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
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<210> 39
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 39
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc agctacgaca tgagctggat cagacaggcc 120
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tccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggagttc 300
ggcaaaaggt acgccctgga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 40
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 40
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgaagc ccggaggcag cctgagactg 60
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<210> 41
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 41
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<210> 42
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 42
gaggtgcagc tgctggagag cggaggagga ctggtgcaac ccggaggcag cctgagactg 60
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ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt acatctgcgc cagggagttc 300
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<210> 43
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 43
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcaac ccggaggcag cctgagactg 60
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ggcaaaaggt acgccctgga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcaac ccggaggcag cctgagactg 60
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cctggcaaag gcctggagtg ggtggccacc atctccgatg gcggcggcta catctattac 180
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<210> 45
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcaac ccggaggcag cctgagactg 60
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cctggcaaaa gcctggagtg ggtggccacc atctccgatg gcggcggcta catctattac 180
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ctgcagatga acagcctgag ggatgaggac accgccgtgt acatctgcgc cagggagttc 300
ggcaaaaggt acgccctgga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357
<210> 46
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 46
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<210> 47
<211> 357
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 47
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<210> 48
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 48
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<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 49
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<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 50
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgcaac ctggaggctc cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggctt caccttcagc tcctacgata tgagctgggt gaggcaggct 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtggccacc atctccgacg gaggcggcta catctactac 180
tccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actctctcag ggctgaggac accgccgtgt atatctgcgc cagggagttt 300
ggcaagaggt acgccctgga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 51
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 51
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgcaac ctggaggctc cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggctt caccttcagc tcctacgata tgagctgggt gaggcaggct 120
cctggaaagg gcctggagtg ggtggccacc atctccgacg gaggcggcta catctactac 180
tccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa caacctgtac 240
ctgcagatga actctctcag ggctgaggac accgccgtgt atatctgcgc cagggagttt 300
ggcaagaggt acgccctgga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 52
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 52
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgcaac ctggaggctc cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggctt caccttcagc tcctacgata tgagctgggt gaggcagacc 120
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tccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa caacctgtac 240
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ggcaagaggt acgccctgga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gagctcc 357
<210> 53
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 53
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgcaac ctggaggctc cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggctt caccttcagc tcctacgata tgagctgggt gaggcaggct 120
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tccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actctctcag ggctgaggac accgccgtgt atatctgcgc cagggagttt 300
ggcaagaggt acgccctgga ttactggggc cagggcacaa ccgtgacagt gagctcc 357
<210> 54
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 54
gacatcgtga tgacccagag ccacaagttc atgagcacca gcgtgggcga tagggtgagc 60
atcagctgca aggccagcca ggatgtgacc cctgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggccagagcc ccaagctgct gatctacagc accagcagca ggtacaccgg cgtgcccgac 180
aggttcacag gaagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cgtgcaggcc 240
gaggacctgg ccgtgtacta ctgccagcag cactacacca cccctctgac cttcggcgcc 300
ggcaccaagc tggagctgaa g 321
<210> 55
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 55
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggatgtgacc cctgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc accagcagca ggtacaccgg cgtgcccagc 180
aggtttagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa g 321
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 56
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggatgtgacc cctgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaagtccc ccaagctgct gatctacagc accagcagca ggtacaccgg cgtgcccagc 180
aggtttagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa g 321
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 57
gacattcaga tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgaca cctgctgtgg cctggtatca acagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctcct gatctacagc acatcctccc ggtacaccgg agtgccctcc 180
aggtttagcg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatttcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cacccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 58
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 58
gacattcaga tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgaca cctgctgtgg cctggtatca acagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctcct gatctacagc acatcctccc ggtacaccgg agtgcccgac 180
aggtttaccg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatttcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cacccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 59
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
gacattcaga tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgaca cctgctgtgg cctggtatca acagaagcct 120
ggccagagcc ctaagctcct gatctacagc acatcctccc ggtacaccgg agtgcccgac 180
aggtttaccg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatttcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cacccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgg 324
<210> 60
<211> 324
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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gacattcaga tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcagctgca aggccagcca ggacgtgaca cctgctgtgg cctggtatca acagaagcct 120
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aggtttaccg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatttcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cacccctgac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggagatcaa gcgg 324
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<223> Synthetic
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Gly
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Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly His Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
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Gly
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Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
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Gly
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Gly
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Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Met Lys
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Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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Lys Ala Thr Gln Asp Val Thr Pro Ala Val Ala
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 92
Lys Ala Cys Gln Asp Val Thr Pro Ala Val Ala
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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1 5
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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1 5
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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Asn Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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Gln Glu His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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Gln Asp His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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Gln Asn His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
gaagtgaaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga gtctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtggtta catctactat 180
tcagacagtg tgaaggggcg atttaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt atatttgtgc aagagaattt 300
ggtaagcgct atgctttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr
115
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 114
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cggtaggaga cagggtcagc 60
atctcctgca aggccagtca ggatgtgact cctgctgtcg cctggtatca acagaagcca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcc acatcctccc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 115
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 117
Glu Leu Pro Trp Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Ala Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Pro Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Phe Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly His Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Trp Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 123
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Cys Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 126
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Ile Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Met Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 10
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<220>
<223> Synthetic
<400> 128
Glu Leu Phe Asn Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 129
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<220>
<223> Synthetic
<400> 129
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1 5 10
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<220>
<223> Synthetic
<400> 130
Glu Leu Tyr Phe Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr
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<220>
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1 5
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<223> Synthetic
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
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<220>
<223> Synthetic
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Lys Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105
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<220>
<223> Synthetic
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115
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<211> 107
<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Trp Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105
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<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Phe Asn Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Pro Trp Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105
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<211> 119
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu His Phe Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 152
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 153
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Tyr Phe Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu His Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 156
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 157
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
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100 105 110
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115
<210> 158
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asp Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
Glu Gln His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
Asp Gln His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
Asn Gln His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 164
Gln Glu His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 165
Gln Asp His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 166
Gln Asn His Ser Asp Ala Pro Leu Thr
1 5
Claims (78)
- 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) 서열 번호: 129, 130 또는 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
(f) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함하는 항체 또는 그것의 단편. - 제1 항에 있어서, 서열 번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 152의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
- 제1 항에 있어서, 서열 번호: 153의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 154의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
- 제1 항에 있어서, 서열 번호: 155의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
- 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제5 항의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는, 단리된 세포.
- 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편을 포함하는, 대상체의 암 또는 감염 치료용 약학적 조성물.
- 제7 항에 있어서, 상기 암은 고체 종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제7 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁체부암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제7 항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 제2 암 치료제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제7 항에 있어서, 상기 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 균류 감염 또는 기생충에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 시험관 내에서 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편으로 처리된 세포를 포함하는, 대상체의 암 또는 감염 치료용 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 세포는 상기 대상체로부터 단리된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 세포는 상기 대상체와 상이한 공여 개체로부터 단리된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제12 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제15 항에 있어서, 상기 T 세포는 종양-침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 샘플에서 PD-L1의 발현을 검출하는 방법으로서, 항체 또는 그것의 단편이 PD-L1에 결합하는 조건 하에서 샘플을 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 PD-L1의 발현을 나타내는 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
- 제17 항에 있어서, 샘플은 종양 세포, 종양 조직, 감염된 조직, 또는 혈액 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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