UA125918C2

UA125918C2 - Антитіла проти pd-l1 та варіанти їх застосування

Info

Publication number: UA125918C2
Application number: UAA202005634A
Authority: UA
Inventors: Лей Фан; Юнцян ВАН; Чженї Ван; Чженйи Ван; Бінши Ґо; Бинши Го; Цзіну Цзан; Цзину Цзан
Original assignee: Ай-Маб Байофарма Юес Лімітед; Ай-Маб Байофарма Юес Лимитед
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-07-06
Also published as: AU2019241339B2; US11220546B2; MX2020007842A; JP2020518233A; WO2019185029A1; CN110891975B; KR102475106B1; CA3086434A1; MY188237A; EA202091590A1; EP3589660A1; IL275734A; EP3589660A4; JP7124257B2; AU2019241339A1; PH12020551173A1; US20220119531A1; IL275734B; SG11202006008WA; CL2020002223A1

Abstract

Винахід стосується антитіла, що має специфічність відносно білка PD-L1 людини та містить: (a) VH CDR1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 1; (b) VH CDR2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 116; (c) VH CDR3, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 117; (d) VL CDR1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 4; (e) VL CDR2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 5; та (f) VL CDR3, яка містить послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO: 6.

Description

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Ліганд запрограмованої смерті 1 (РО-І1), також відомий як кластер диференціювання 274 (С0О274) або гомолог В7 1 (В7-НІ), являє собою трансмембранний білок 1 типу розміром 40 кДа, що імовірно грає значну роль у пригніченні імунної системи при специфічних подіях, таких як вагітність, алотрансплантація тканин, аутоїмунне захворювання та інші хворобливі стани, такі як гепатит. При зв'язуванні РО-І1 з РО-1 або В7.1 відбувається передача інгібуючого сигналу, який знижує проліферацію СО8яТ-клітин у лімфатичних вузлах; крім цього, РО-1 також здатний контролювати акумуляцію специфічних щодо чужорідних антигенів Т-клітин у лімфатичних вузлах за рахунок апоптозу, який додатково опосередкований меншою регуляцією гену Всі-2.

Було показано, що позитивна регуляція РО-Ї1 може дозволяти раку вислизати від імунної системи хазяїна. Аналіз зразків пухлин від пацієнтів з нирково-клітинним раком показав, що висока експресія РО-І1 у пухлинах асоційована з підвищеною агресивністю пухлини та підвищеним ризиком смерті. Багато інгібіторів РО-Ї1 знаходяться у розробці для імуноонкологічної терапії та демонструють хороші результати у клінічних випробуваннях.

Також виявлена перспективність інгібування РО-І 1 для лікування інфекційних захворювань, поряд з лікуванням раку. У моделі внутрішньоклітинної інфекції на мишах І. топосуїодепе5 індукував експресію білку РО-Ї1 у Т-клітинах, МК-клітинах та макрофагах. Блокада РО-Ї 1 (наприклад, із застосуванням блокуючих антитіл) приводила до збільшення смертності у інфікованих мишей. Блокада знижувала продукування ФНО-а та оксиду азоту макрофагами, знижувала продукування гранзиму В МК-клітинами та зменшувала проліферацію специфічних у відношенні антигену І. топосуїодепез5з СО8 Т-клітин (але не СО4 Т-клітин). Ці дані припускають, що РО-І1 діє як позитивна костимулююча молекула при внутрішньоклітинній інфекції.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Згідно з даним винаходом запропоновані антитіла проти РО-І1, що мають високу афінність зв'язування з білками РО-Ї1 людини та здатні ефективно блокувати взаємодію між РО-11 та його рецептором РО-1. Важливо також, що наведені приклади демонструють стимуляцію зазначеними антитілами проти РО-11 Т-клітинної імунної відповіді та інгібування росту пухлин.

На відміну від відомих антитіл проти РО-І 1, які зв'язуються з імуноглобуліновим М-доменом позаклітинної частини білку РО-Ї1, зазначені антитіла зв'язуються з імуноглобуліновим С- доменом, зокрема, залишками амінокислот У134, К162 та М183. Зазначені антитіла проти РО-Ї 1 підходять для застосування у терапевтичних цілях, наприклад, при лікуванні різних типів раку, а також інфекцій, та можуть також застосовуватися для діагностичних та прогностичних цілей.

Відповідно до одного варіанту реалізації даного винаходу запропоноване(ий) антитіло проти

РО-Ї71 або його фрагмент, яке (який) може специфічно зв'язуватися з імуноглобуліновим С- доменом (Ід С) білку ліганду запрограмованої смерті 1 (РО-І1) людини. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений ІдДС-домен складається із залишків амінокислот 133-225.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла може зв'язуватися щонайменше з одним із залишків амінокислот 134, К162 або М183 білку РО-

Ї1. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла може зв'язуватися щонайменше з одним із залишків амінокислот 134, К162 та М183 білку РО-І1. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла не зв'язується з імуноглобуліновим М-доменом (Ід М) білку РО-І1, причому зазначений ІдМ-домен складається із залишків амінокислот 19-127.

РО-Ї1 або його фрагмент, що відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні білку ліганду запрограмованої смерті 1 (РО- 1) людини та містить МН СОК'І1 з 5ЕО ІЮ МО: 1, МН СОК2 з 5ЕО ІО МО: 2, МН СОКЗ з 5ЕО ІЮ

МО: 3, М СОКІ з 5БЕО ІЮО МО: 4, МІ СОК2 з 5БО ІО МО: 5 та М СОКЗ з 5ЕБЕО ІЮО МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений Фрагмент антитіла додатково містить константну область важкого ланцюгу, константну область легкого ланцюгу,

Ес-область або комбінацію перерахованого. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена константна область легкого ланцюгу являє собою константну область ланцюгу каппа або лямбда. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла відноситься до ізотипу ДС, ДМ, ІдА, ЧЕ або дО. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений ізотип представлений Ідс1, ІдсС2, ІдСЗ або Ідс4. Без обмежень, зазначене антитіло або його фрагмент являє собою химерне антитіло, гуманізоване антитіло або повністю людське антитіло. Відповідно до одного аспекту антитіло або його фрагмент являє собою гуманізоване антитіло.

У відповідності з даним винаходом із застосуванням мутагенезу додатково були 60 ідентифіковані гарячі точки для мутацій залишків у МН СОКЗ (див., наприклад, антитіла АТ, А2,

С3, С4, Сб, В1 та Вб у прикладах 13-17) та МІ СОКЗ (див., наприклад, антитіла ВЗ, С4 та АЗ у прикладах 13-17). Відповідно, у відповідності з даним винаходом також запропоновані антитіла, які включають одну або більше мутацій у вказаних гарячих точках.

Відповідно до деяких варіантів реалізації запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент, яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні більюу РО-Ї1ї людини та містить (а) МН СОК1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 1 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1; (5) МН СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 116 або варіанті ЗЕО ІЮО МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО: 116; (с)

МН СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 117 або варіанті

ЗЕО ІЮ МО: 117, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ЗЕО ІЮ

МО: 117, при цьому другий залишок амінокислоти МН СОКЗ являє собою І еи; (4) М. СОКІ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 4 або варіанті БЕО ІЮ МО: 4, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ХЕО ІЮ МО: 4; (є) М СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5 або варіанті БЕО ІЮО МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЗЕО ІЮ МО: 5; та () М.

СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 6 або варіанті 5ЕО ІЮ

МО: 6, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮО МО: 6.

Відповідно до одного варіанту реалізації зазначена МН СОК1 містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 1, зазначена МН СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116, зазначена МН СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 117, зазначена МІ СОК1 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 4, зазначена МІ СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 5, а зазначена МІ СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у БЕО ІЮ МО: 6.

Відповідно до одного варіанту реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла містить варіабельну область важкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІМ МО: 149, та варіабельну область легкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 150.

Також відповідно до одного варіанту реалізації запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент, яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні білюу РО-Ї1 людини та містить: (а) МН СОКІ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 1 або варіанті ЗЕО ІО МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1; (в) МН СОМ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з зЗЕО ІЮ МО: 116; (с)

МН СОКУ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: З або варіанті

ЗЕО ІЮО МО: 3, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ЗЕО ІЮ

МО: 3; (4) МІ СОН, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 4 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 4, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з

ЗЕО ІЮО МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 5 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮО МО: 5; та () М. СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 140 або варіанті БЕО ІО МО: 140, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІО МО: 140, при цьому щонайменше (ї) залишок амінокислоти 4 у МІ.

СОКЗ являє собою 5ег, (і) залишок амінокислоти 5 у МІ СОКЗ являє собою Аб5вр; або (її) залишок амінокислоти 6 у МІ СОКЗ являє собою Аа.

Відповідно до одного варіанту реалізації зазначена МН СОК1 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 1, зазначена МН СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116, зазначена МН СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: З, зазначена МІ СОМ містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 4, зазначена МІ СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 5, а зазначена М СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у БЕО ІЮ МО: 140.

Відповідно до одного варіанту реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла містить варіабельну область важкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІМ МО: 159, та варіабельну область легкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 160. 60 Відповідно до одного варіанту реалізації запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент,

яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні більюу РО-Ї17 людини та містить: (а) МН СОК'І1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 1 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 1; (5) МН СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 116 або варіанті ЗЕО ІЮО МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 116; (с)

МН СОКУ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: З або варіанті

ЗЕО ІЮ МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЗЕО ІЮ МО: 5 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮО МО: 5; та () М. СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 6 або варіанті 5БЕО ІЮО МО: 6, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЗЕО ІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена МН СОК1 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 1, зазначена МН СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116, зазначена МН СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 3, зазначена МІ СОК1 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 4, зазначена МІ СОК2 містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 5, а зазначена МІ СОКЗ містить послідовність амінокислот, представлену у БЕО ІО МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла містить варіабельну область важкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІМ МО: 141, та варіабельну область легкого ланцюгу, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 142.

Також відповідно до деяких варіантів реалізації запропонована композиція, яка містить антитіло або його фрагмент згідно з цим описом, та фармацевтично прийнятний носій.

Додатково відповідно до деяких варіантів реалізації запропонована виділена клітина, яка містить один або більше полінуклеотидів, що кодують антитіло або його фрагмент згідно з цим описом.

Також запропоновані способи лікування та варіанти застосування. Відповідно до одного варіанту реалізації запропонований спосіб лікування раку або інфекції у пацієнта, який цього потребує, який включає введення зазначеному пацієнтові ефективної кількості антитіла або його фрагменту згідно з цим описом. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений рак являє собою солідну пухлину. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений рак вибраний з групи, що складається з раку сечового міхура, раку печінки, раку товстої кишки, раку прямої кишки, раку ендометрію, лейкозу, лімфоми, раку підшлункової залози, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку легені, раку молочної залози, раку уретри, раку голови та шиї, раку шлунково-кишкового тракту, раку шлунку, раку стравоходу, раку яєчників, раку нирок, меланоми, раку передміхурової залози та раку щитовидної залози. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений рак вибраний з групи, що складається з раку сечового міхура, раку печінки, раку підшлункової залози, недрібноклітинного раку легені, раку молочної залози, раку уретри, раку ободової та прямої кишки, раку голови та шиї, плоскоклітинного раку, карциноми з клітин Меркеля, раку шлунково-кишкового тракту, раку шлунку, раку стравоходу, раку яєчників, раку нирок та дрібноклітинного раку легені. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений спосіб додатково включає введення зазначеному пацієнтові другого агенту для терапії раку. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена інфекція являє собою вірусну інфекцію, бактеріальну інфекцію, мікотичну інфекцію або паразитарну інфекцію.

Відповідно до іншого варіанту реалізації запропонований спосіб лікування раку або інфекції у пацієнта, який цього потребує, що включає: (а) обробку клітини іп міо антитілом або його фрагментом згідно з цим описом; та (б) введення обробленої клітини вказаному пацієнтові.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений спосіб додатково включає виділення зазначеної клітини з організму індивідуума перед етапом (а). Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначену клітину виділяють з організму пацієнта. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначену клітину виділяють з організму індивідуума-донора, що не є пацієнтом.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена клітина являє собою Т-клітину, необмежуючі приклади якої включають інфільтруючий пухлину Т-лімфоцит, СО4-Т-клітину,

СОр8-Т-клітину або комбінацію перерахованого. 60 Також запропоновані способи діагностики та варіанти застосування. Відповідно до одного варіанту реалізації запропонований спосіб детекції експресії РО-Ї1 у зразку, що включає приведення зазначеного зразка у контакт з антитілом або його фрагментом в умовах, що дозволяють вказаному антитілу або його фрагменту зв'язуватися з РО-11, та детекцію зазначеного зв'язування, що вказує на експресію РО-1І 1 у зразку. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений зразок містить пухлинну клітину, пухлинну тканину, інфіковану тканину або зразок крові.

Антитіла та фрагмент згідно з цим описом можуть застосовуватися для отримання біспецифічних антитіл. Відповідно до одного варіанту реалізації запропоновано біспецифічне антитіло, що містить фрагмент згідно з цим описом та другий антигензв'язуючий фрагмент, що має специфічність у відношенні молекулярної структури на імунній клітині. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена молекула обрана з групи, що складається з РО-1, СТІ А-4, І ДО-3,

Сбр2г8, Ср122, А-188, ТІМ3, ОХ-40, ОХ401, 2040, С0401, ПСНТ, ІСО5, ІСОБІ, СІТА, СІТІ,

ТІСІТ, СО27, МІЗТА, В7НЗ, В7Н4і, НЕММ або ВТІА, 2047 та СО73. Відповідно до деяких варіантів реалізації і зазначений фрагмент, і другий фрагмент незалежно вибрані з Еар- фрагменту, одноланцюжкового варіабельного фрагменту (5сСЕм) або однодоменного антитіла.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене біспецифічне антитіло додатково містить

Ес-фрагмент.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

На фіг. 1 показано, що НІ. 1210-3 може зв'язуватися з РО-І 1 людини з високою афінністю.

На фіг. 2 показано, що НІ 1210-3 може ефективно інгібувати зв'язування РО-Ї1 людини з

РО1 людини.

На фіг. З показано, що антитіло НІ. 1210-3 може високоефективно інгібувати зв'язування РО- 1 на РО-І1, що експресується на клітинах ссавців.

На фіг. 4 показано, що протестовані антитіла проти РО-/1 можуть стимулювати відповідь Т- клітин людини.

На фіг. 5 показана кінетика зв'язування НІ 1210-3 з рекомбінантним РО-Ї 1.

На фіг. 6 показано, що усі протестовані гуманізовані антитіла мали співставну ефективність зв'язування з РО-11 людини у контакті з химерним антитілом.

На фіг. 7 показано, що всі протестовані гуманізовані антитіла можуть високоефективно зв'язуватися з РО-11, що експресується на клітинах ссавців, співставно з химерним антитілом.

На фіг. 8 показано, що гуманізоване антитіло Ни1210-41 здатне зв'язуватися з РО-І1 макака-резуса з меншою афінністю та не здатне зв'язуватися з РО-І 1 щура та миші.

На фіг. 9 показано, що Ни1210-41 антитіло здатне специфічно зв'язуватися тільки з В7-НІ1 (РО-І 1), але не з В7-ОС, В7-1, В7-2, В7-Н2, РО-1, СО28, СТІ А4, ІСО5 тавтіА.

На фіг. 10 показано, що Ни1210-41 може ефективно інгібувати зв'язування РО-11 людини з

РО1 та В7-1 людини.

На фіг. 11 показано, що Ни1210-41 може ефективно інгібувати зв'язування РО-11 людини з

РО1 та В7-1 людини.

На фіг. 12 показано, що гуманізовані антитіла Ни1210-8, Ни1210-9, Ни1210-16, Ни1210-17,

Ни1210-21 та Ни1210-36 можуть дозозалежним чином стимулювати продукування ІФН-у та ІЛ-2 у реакції змішаної культури лімфоцитів.

На фіг. 13 показано, що гуманізовані антитіла Ни1210-40, Ни1210-41 та Ни1210-17 можуть дозозалежним чином стимулювати продукування ІФН-у у аналізі з панеллю антигенів СМУ.

На фіг. 14 показано, що Ни1210-31 у концентрації 5 мг/кг можуть інгібувати ріст пухлини на 30 95 у моделі ксенотрансплантата НСС827-М5а.

На фіг. 15 показано, що антитіло Ни1210-41 може дозозалежним чином інгібувати ріст пухлини у моделі ксенотрансплантата НСС827-М5О, при цьому антитіло Ни1210-41 також дозозалежним чином знижувало масу пухлини.

На графіках на фіг. 16 для кожного мутанта РО-Ї1 представлене середнє значення зв'язування як функція від експресії (реактивність контрольного моноклонального антитіла (тАбБ) проти РО-Ї 1).

Фіг. 17 ілюструє локалізацію 134, К162 та М183, залишків (сфер), залучених у зв'язування з антитілом проти РО-І1 Ни1210-41.

На фіг. 18 приведене порівняння мутанта 560К з вихідним антитілом Ни1210-41 стосовно ефективності зв'язування з РО-І 1, що експресується на клітинах ссавців.

На фіг. 19 представлені результати аналізу зв'язування (з РО-Ї1 людини) для отриманих антитіл.

На фіг. 20 показано, що антитіло Вб з більшою ефективністю зв'язувалося з РО-11, що експресується на клітинах ссавців, у порівнянні з вихідним антитілом та тецентриком 60 (Тесепігд"М, атезолізумаб).

На фіг. 21 показаний ефект зазначених антитіл на продукування ІЛ-2 у клітинах ЧУигкаї, у яких

Вб також демонстрував більш високу активність.

На фіг. 22 представлена стимулююча продукування ІФН-у активність антитіл іп мійго в умовах змішаної культури лімфоцитів.

На фіг. 23 представлена інгібуюча ріст пухлини активність антитіл іп мімо.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Визначення

Слід зазначити, що терміни у однині відносяться до однієї або більше одиниць зазначеного об'єкта; наприклад, "антитіло" відповідає одному або більше антитілам. Відповідно, терміни у однині, вирази "один або більше" та "цонайменше один" можуть використовуватися у цьому документі як взаємозамінні.

У цьому документі термін "поліпептид" охоплює один "поліпептид", а також множину "поліпептидів", та відноситься до молекули, що складається з мономерів (амінокислот), лінійно з'єднаних амідними зв'язками (також відомими як пептидні зв'язки). Термін "поліпептид" відноситься до будь-якого ланцюгу або ланцюгів з двох або більше амінокислот, та не відноситься до конкретної довжини продукту. Відповідно, пептиди, дипептиди, трипептиди, олігопептиди, "білок", "амінокислотний ланцюг" або будь-який інший термін, що відноситься до ланцюга або ланцюгів з двох або більше амінокислот, включені у визначення "поліпептиду", та термін "поліпептид" може використовуватися замість будь-якого з наведених термінів або взаємозамінно з будь-яким з них. Термін "поліпептид" також відноситься до продуктів післяекспресійних модифікацій поліпептиду, у тому числі, без обмеження, глікозилювання, ацетилювання, фосфорилювання, амідування, дериватизації відомими захисними/)блокуючими групами, протеолітичного розщеплення або модифікації з амінокислотами, що не зустрічаються у природі. Поліпептид може походити з природного біологічного джерела або бути отриманий з застосуванням рекомбінантної технології, проте не обов'язково трансльований із зазначеної послідовності нуклеїнової кислоти. Він може бути отриманий за будь-яким способом, у тому числі шляхом хімічного синтезу.

Термін "виділені" у цьому документі стосовно клітин, нуклеїнових кислот, таких як ДНК або

РНК, відноситься до молекул, відокремлених від інших ДНК або РНК, відповідно, які присутні у природному джерелі зазначеної макромолекули. Термін "виділені" у цьому документі також відноситься до нуклеїнової кислоти або пептиду, який по суті не містить (який не містить) клітинного матеріалу, вірусного матеріалу або культурального середовища при отриманні із застосуванням методик рекомбінантної ДНК, або хімічних попередників або інших хімічних речовин, якщо вони були хімічно синтезовані. Крім того, термін "виділена нуклеїнова кислота" включає фрагменти нуклеїнової кислоти, що не зустрічаються у природі у вигляді фрагментів та не виявляються у природному стані. Термін "виділені" також використовують у цьому документі для позначення клітин або поліпептидів, які відділені від інших клітинних білків або тканин.

Мається на увазі, що до виділених поліпептидів відносяться як очищені, так і рекомбінантні поліпептиди.

У цьому документі термін "рекомбінантний" стосовно поліпептидів або полінуклеотидів має на увазі форму поліпептиду або полінуклеотиду, яка не існує у природі, необмежуючий приклад яких може бути створений шляхом комбінування полінуклеотидів або поліпептидів, які зазвичай не зустрічаються разом. "Гомологія" або "ідентичність" або "подібність" відноситься до подібності послідовностей двох пептидів або між двома молекулами нуклеїнової кислоти. Гомологія може бути визначена шляхом порівняння положення у кожній послідовності, вирівнювання якої може бути проведене з метою порівняння. Якщо положення у порівнюваній послідовності зайняте тією ж основою або амінокислотою, тоді молекули гомологічні у зазначеному положенні. Ступінь гомології між послідовностями являє собою функцію від числа співпадаючих або гомологічних положень у послідовностях. "Неспоріднена" або "негомологічна" послідовність характеризується менш ніж 40 95 ідентичністю, але переважно менше ніж 25 95 ідентичністю з однією з послідовностей згідно з цим описом.

Якщо полінуклеотид або область полінуклеотиду (або поліпептид або область поліпептиду) характеризується певним відсотком (наприклад, 60 бо, 6590, 70905, 75595, 80 95, 85 о, 90 9о, 95 95, 98 95 або 99 95) "ідентичності послідовностей" іншій послідовності, це означає, що після вирівнювання при порівнянні двох послідовностей вони містять зазначений відсоток ідентичних основ (або амінокислот). Зазначені вирівнювання та відсоток гомології або ідентичності послідовностей можуть бути визначені із застосуванням програмного забезпечення, відомого у даній галузі техніки, наприклад, описаного у джерелі: А!Мзибеї єї а. ред. (2007) Сигтепі Ргоїосої5 60 іп МоІесшіаг Віоіоду. Для вирівнювання переважно використовують встановлені за замовчанням параметри. Однією з програм для вирівнювання є ВІ А5Т із встановленими за замовчанням параметрами. Зокрема, програми представлені ВГАБТМ та ВІАБТР із наступними встановленими за замовчанням параметрами: генетичний код-стандартний; фільтр-без фільтра; ланцюг-обидва ланцюги; значення відсікання-боО; очікування-10; матриця-ВІ О5ИОМб62; описи-50 послідовностей; сортування-за найвищим показником (НІСН

ЗСОРМЕ); бази даних-ненадлишкові, зепВапк«ЕМВІ «008-РОВ нтрансльовані послідовності

СО5 СбепВапКие5міз5РгоїеіпяЗРирааетяРІК. Біологічно еквівалентні полінуклеотиди являють собою нуклеотиди, які характеризуються вищевказаним відсотком гомології та кодують поліпептид, що має таку ж або аналогічну біологічну активність.

Термін "еквівалентна нуклеїнова кислота або еквівалентний полінуклеотид" відноситься до нуклеїнової кислоти, що має послідовність нуклеотидів, що характеризується певним ступенем гомології або ідентичності послідовності нуклеотидів зазначеній нуклеїновій кислоті або її комплементу. Передбачається, що гомолог дволанцюгової нуклеїнової кислоти включає нуклеїнові кислоти, які мають послідовність нуклеотидів, що характеризується певним ступенем гомології зазначеній нуклеїновій кислоті або її комплементу. Відповідно до одного аспекту гомологи нуклеїнових кислот здатні гібридизуватися із вказаною нуклеїновою кислотою або її комплементом. Подібним чином, "еквівалентний поліпептид" відноситься до поліпептиду, що характеризується певним ступенем гомології або ідентичності послідовностей відносно послідовності амінокислот референсного поліпептиду. Згідно з деякими аспектами ідентичність послідовностей складає щонайменше приблизно 70 95, 75 90, 80 90, 85 У, 90 Фо, 95 У, 98 965 або 99 95. Згідно з деякими аспектами еквівалентний поліпептид або полінуклеотид містить 1, 2, 3, 4 або 5 додавань, делецій, замін та їх комбінацій у порівнянні з референсним поліпептидом або полінуклеотидом. Згідно з деякими аспектами еквівалентна послідовність зберігає активність (наприклад, епітоп-зв'язуючу) або структуру (наприклад, сольові містки) референсної послідовності.

Реакції гібридизації можуть бути проведені в умовах різної "жорсткості". У загальному випадку, реакцію гібридизації в умовах низької жорсткості проводять при приблизно 40 С у приблизно 10 х 55Х або у розчині з еквівалентною іонною силою/температурою. Гібридизацію в умовах помірної жорсткості, як правило, проводять при приблизно 50 "С у приблизно 6 х 555, та реакцію гібридизації в умовах високої жорсткості, як правило, проводять при приблизно 60 70 у приблизно 1 х 55С. Реакції гібридизації можуть також бути проведені у "фізіологічних умовах", добре відомих фахівцеві у даній галузі техніки. Необмежуючий приклад фізіологічних умов представлений температурою, іонною силою, рН та концентрацією Мд2, що зазвичай виявляються у клітині.

Полінуклеотид складається з конкретної послідовності з чотирьох нуклеотидних основ: аденіну (А); цитозину (С); гуаніну (5); тиміну (Т); та урацилу (ОО) замість тиміну у разі полінуклеотиду РНК. Відповідно, термін "послідовність полінуклеотидів" позначає буквене представлення молекули полінуклеотиду. Зазначене буквене представлення може бути введене у бази даних у комп'ютері, що має центральний процесор та використовується для біо- інформаційних програм, таких як функціональна геноміка та пошук гомології. Термін "поліморфізм" відноситься до співіснування більше ніж однієї форми гену або його частини.

Частина гену, що має щонайменше дві різні форми, тобто представлена двома різними послідовностями нуклеотидів, називається "поліморфною областю гену". Поліморфна область може являти собою одиночний нуклеотид, різний у різних алелях.

Терміни "полінуклеотид" та "олігонуклеотид" використовуються взаємозамінно та відносяться до полімерної формі нуклеотидів будь-якої довжини, дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів, або їх аналогів. Полінуклеотиди можуть мати будь-яку тривимірну структуру та можуть виконувати будь-яку функцію, відому або невідому. Необмежуючі приклади полінуклеотидів представлені: геном або фрагментом гену (наприклад, зондом, праймером, міткою Е5Т або ЗАСЕ), екзонами, інтронами, матричною РНК (мРНК), транспортною РНК, рибосомальною РНК, рибозимами, кДНК, длРНК, міРНК, мікроРНК, рекомбінантними полінуклеотидами, розгалуженими полінуклеотидами, плазмідами, векторами, виділеними ДНК з будь-якою послідовністю, виділеними РНК з будь-якою послідовністю, нуклегновокислотними зондами та праймерами. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та аналоги нуклеотидів. За наявності модифікацій у структурі нуклеотиду вони можуть бути здійснені до або після зборки (складання) полінуклеотиду.

Послідовність нуклеотидів можуть переривати ненуклеотидні компоненти. Полінуклеотид може бути додатково модифікований після полімеризації наприклад, шляхом кон'югації з компонентом для мічення. Також зазначений термін відноситься як до дволанцюгової, так і до 60 одноланцюгової молекули. Якщо не вказано або не потрібно інше, будь-який варіант реалізації даного винаходу, що передбачає полінуклеотид, охоплює і дволанцюгову форму, і кожну з двох утворюючих дволанцюгову форму комплементарних одноланцюгових форм, відомих або передбачених.

Термін "кодувати" стосовно полінуклеотидів відноситься до полінуклеотиду, який, як зазначено, "кодує" поліпептид, якщо він у природному стані або після проведення маніпуляцій із застосуванням способів, добре відомих фахівцям у даній галузі техніки, може бути транскрибований та/(або трансльований з отриманням мРНК поліпептиду та/або його фрагменту. Антисмисловий ланцюг являє собою фермент такої нуклеїнової кислоти, та кодуюча послідовність може бути з неї виведена.

У цьому документі "антитіло" або "антигензв'язуючий поліпептид" відноситься до поліпептиду або поліпептидного комплексу, який специфічно розпізнає та пов'язує антиген.

Антитіло може являти собою повне антитіло та будь-який його антигензв'язуючий фрагмент або одиночний ланцюг. Відповідно, термін "антитіло" включає будь-яку молекулу, яка містить білок або пептид, яка містить щонайменше частину молекули імуноглобуліну, що має біологічну активність, що полягає у зв'язуванні з антигеном. Приклади таких молекул включають, не обмежуючись перерахованим, визначальну компліментарність область (СОК) важкого або легкого ланцюгу або її лігандзв'язуючу частину, варіабельну область важкого ланцюгу або легкого ланцюгу, константну область важкого ланцюгу або легкого ланцюгу, каркасну (ЕК) область або будь-яку її частину, або щонайменше одну частину зв'язуючого білку.

Терміни "фрагмент антитіла" або "антигензв'язуючий фрагмент" у цьому документі відноситься до частини антитіла, такої як Е(аб)», Е(аб)г, Раб", Раб, Ем, зом і т.п. Незалежно від структури, фрагмент антитіла зв'язується з тим же антигеном, що їі розпізнається інтактним антитілом. Термін "фрагмент антитіла" включає аптамери, шпігельмери та діатіла. Термін "фрагмент антитіла" також включає будь-який синтетичний або генетично сконструйований білок, який діє як антитіло, зв'язуючи специфічний антиген з утворенням комплексу. "Одноланцюговий варіабельний фрагмент", або "5сЕм" відноситься до злитого білку з варіабельних областей важких (Мн) та легких ланцюгів (Мі) імуноглобулінів. Згідно з деякими аспектами зазначені області з'єднані коротким лінксерним пептидом довжиною від 10 до приблизно 25 амінокислот. Зазначений лінкер може бути збагачений гліцином для гнучкості, а також серіном або треоніном для розчинності, та може з'єднувати або М-кінець Мн з С-кінцем Мі, або навпаки. Зазначеним білок зберігає специфічність вихідного імуноглобуліну, незважаючи на видалення константних областей та введення лінкеру. Молекули 5сЕм відомі у даній галузі техніки та описані, наприклад, у патенті США Мо 5892019.

Термін "антитіло" охоплює різні широкі класи поліпептидів, які можна розрізнити за допомогою біохімічних методів. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що важкі ланцюги класифікують як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон (у, цН, а, б, є), що включають деякі підкласи (наприклад, у1-у4). Природа зазначеного ланцюгу і визначає "клас" антитіла як

Ід, І9М, ІдА до або ІдЧЕ, відповідно. Підкласи (ізотіпи) імуноглобулінів, наприклад, досі, ІДС»,

Ідсз, ІДС, ІдСі5 і т.п., докладно описані, та відомо, що вони забезпечують функціональну спеціалізацію. Фахівець зможе легко визначити модифіковані варіанти кожного із зазначених класів та ізотипів після ознайомлення з цим описом і, відповідно, такі варіанти входять у обсяг даного винаходу. Усі класи імуноглобулінів явно включені у обсяг даного винаходу; опис нижче в основному відноситься до класу ЇДС молекул імуноглобулінів. У випадку (дос стандартна молекула імуноглобуліну містить два ідентичні поліпептиди легкого ланцюгу з молекулярною масою, яка дорівнює приблизно 23000 Да, та два ідентичні поліпептиди важкого ланцюгу з молекулярною масою, яка дорівнює 53000-70000. Зазначені чотири ланцюги, як правило, з'єднані дисульфідними зв'язками у "У"-подібній конфігурації, причому легкі ланцюги охоплюють важкі ланцюги, починаючись у області "вирізу" літери "У" та проходячи через варіабельну область.

Антитіла, антигензв'язуючі поліпептиди, їх варіанти або похідні згідно з цим описом включають, не обмежуючись перерахованими, поліклональні, моноклональні, мультиспецифічні, людські, гуманізовані, приматизовані або химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, епітоп-зв'язуючі фрагменти, наприклад, Раб, Раб" та К(аб)», га, Ем, одноланцюгові Ем (5сЕм), одноланцюгові антитіла, зв'язані дисульфідними зв'язками Ем (5аЕм), фрагменти, що містять МК- або МН-домен, фрагменти, продуковані експресійною бібліотекою Раб; та антиідіотипові (анти-Ій4) антитіла (включаючи, наприклад, анти-Ід-антитіла до антитіл ГІСНТ згідно з описом у цьому документі). Молекули імуноглобулінів або антитіл згідно 3 цим описом можуть відноситися до будь-якого типу (наприклад, дс, ІДЕ, ІМ, дО, ІдА та дк), класу (наприклад, Ідс1, Ідс2, Ід, Ідс4, ІдА1 та ІдАг) або підкласу молекул імуноглобулінів. 60 Легкі ланцюги класифікують як каппа або лямбда (К, Х). Будь-який клас важких ланцюгів може бути зв'язаний або з легким ланцюгом каппа, або з легким ланцюгом лямбда. У цілому, легкі та важкі ланцюги ковалентно зв'язані один з іншим, та "хвости" двох важких ланцюгів з'єднані між собою ковалентними дисульфідними зв'язками або нековалентними зв'язками при продукуванні імуноглобулінів як гібридомами, так і В-клітинами або генетично сконструйованими клітинами-хазяїнами. У важкому ланцюзі послідовності амінокислот йдуть від

М-кінця на роздвоєній частині У-подібної конфігурації до С-кінця знизу кожного ланцюгу.

Ї легкі, і важкі ланцюги розділені на області структурної та функціональної гомології. Терміни "константний" та "варіабельний" використовують функціонально. У цьому сенсі слід розуміти, що частини варіабельних доменів і легких (МК), і важких (МН) ланцюгів визначають розпізнавання антигену та антигенспецифічність. І навпаки, константні домени легкого ланцюгу (СК) та важкого ланцюгу (СНІ, СН2 або СНЗ) забезпечують важливі біологічні властивості, такі як секреція, трансплацентарна мобільність, зв'язування Ес-рецептору, зв'язування комплементу і т.п. Умовно вважається, що нумерація константної області доменів збільшується по мірі віддалення від сайту зв'язування антигену або амінокінця антитіла. М-кінцева частина являє собою варіабельну область, а С-кінцева частина являє собою константну область; домени СНЗ та СК фактично містять карбоксильний кінець важкого та легкого ланцюгу, відповідно.

Як зазначено вище, варіабельна область дозволяє антитілу селективно розпізнавати та специфічно зв'язувати епітопи на антигенах. Тобто МК-домен та МН-домен, або підгрупа визначальних компліментарність областей (СОК) антитіла, скомбіновані таким чином, щоб формувати варіабельну область, що визначає тривимірний сайт зв'язування антигену.

Зазначена четвертинна структура антитіла утворює сайт зв'язування антигену, присутній на кінці кожного плеча У. Конкретніше, сайт зв'язування антигену визначений трьома СОК на кожному з ланцюгів УН та УК (тобто СОК-НІ, СОВ-Н2г, СОВ-НЗ, СОВ-11, СОВ-12 та СОНВ-Ї 3). У деяких випадках наприклад, у випадку певних молекул імуноглобуліну, що походять з виду верблюжих або сконструйованих на основі імуноглобулінів верблюжих, повна молекула імуноглобуліну може складатися виключно з важких ланцюгів, без легких ланцюгів. Див., наприклад, Натег5-Сазіептап та інш., Маїшге 363: 446-448 (1993).

У антитілах, що зустрічаються у природі, шість "визначальних компліментарність областей", або "СОК", присутніх у будь-якому антигензв'язуючому домені, представлені короткими, не розташованими безперервно послідовностями амінокислот, розташованими специфічним чином, щоб формувати антигензв'язуючий домен при прийнятті антитілом його тривимірної конфігурації у водному середовищі. Решта амінокислот у антигензв'язуючих доменах, що називаються "каркасними" областями, проявляють меншу міжмолекулярну варіабельність.

Каркасні області в основному приймають В-складчасту конформацію, а області СОК утворюють петлі, які з'єднують зазначену В-складчасту структуру та у деяких випадках входять у її склад.

Відповідно, каркасні області утворюють скаффолд, який забезпечує позиціонування областей

СОК у о коректній орієнтації за рахунок міжланцюгових нековалентних взаємодій.

Антигензв'язуючий домен утворений зазначеними позиціонованими СОК, визначає поверхню, комплементарну епітопу на імунореактивному антигені. Зазначена комплементарна поверхня сприяє нековалентному зв'язуванню антитіла з когнатним епітопом. Амінокислоти, що містять області СОК та каркасні області, у будь-якій варіабельній області важкого або легкого ланцюгу, відповідно, можуть бути легко ідентифіковані фахівцем у даній галузі техніки, оскільки вони були точно визначені (див. джерела: "Зедиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипо|одісаї! Іпіегезі", Кабаї, Є., єї аї., 05 Оерагптенпі ої Неакй апа Нитап з5егмісев5, (1983); та Споїйіа апа ГІ езкК, У. Мої. Віої., 196: 901- 917 (1987)).

У тому випадку, якщо для терміну, який використовується та/або прийнятий у даній галузі техніки, є два або більше визначень, визначення терміну у цьому документі включає всі такі значення, якщо явно не вказано інше. Конкретний приклад представлений використанням терміну "визначальна компліментарність область" ("СОК") для опису не розташованих безперервно антигензв'язуючих сайтів, які виявляються у варіабельній області поліпептидів як важкого, так і легкого ланцюгу. Зазначена конкретна область була описана КаБбаї із співавторами та Споїйіа із співавторами у джерелах: Кабаї єї а!., 0.5. Оері. ої Неайй апа Нитап зегмісе5, "Зедиепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодіса! Іпіеге5і" (1983)) та Споївпіа еї аї., У. Мої. Віої. 196: 901-917 (1987), які повністю включені у цей документ за допомогою посилань. При порівнянні визначення СОК за Кабаї та за Споїйіа включають залишки або підгрупи залишків амінокислот, що перекриваються. Проте, використання будь-якого з визначень для СО антитіла або його варіантів охоплено терміном, визначеним та використовуваним у цьому документі. Підходящі залишки амінокислот, які включають області СОК відповідно до кожного із зазначених вище джерел, наведені у таблиці нижче для порівняння. Точні кількості залишків, що 60 включають конкретну СОК, варіюють в залежності від послідовності та розміру зазначеної СОК.

Фахівці у цій галузі техніки можуть рутинними способами визначити залишки, які містять конкретну область СОКБК, на підставі послідовності амінокислот варіабельної області антитіла. 11111110 Кара | Спота.їду///:/(/

Кабаї із співавторами також визначили систему нумерації послідовностей варіабельних доменів, яка може бути застосована до будь-якого антитіла. Фахівець у даній галузі техніки може однозначним чином застосувати зазначену систему "нумерації за Кабраї" до будь-якої послідовності варіабельного домену, не покладаючись на будь-які експериментальні дані, крім власне послідовності. У цьому документі "нумерація за Кара" відноситься до системи нумерації, описаної у джерелі: Кабаї еї а!., 0.5. ЮОері. ої Неайй апа Нитап бегмісев, "Зедиепсе ої

Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї Іпітегеві" (1983).

Поряд з таблицею вище система нумерації за Кабаї описує області СОК наступним чином:

СОВ-НІ починається приблизно з амінокислоти 31 (тобто приблизно через 9 залишків після першого залишку цистеїну), включає приблизно 5-7 амінокислот та закінчується на наступному залишку триптофану. СОМК-Н2 починається з 15-го залишку за кінцем СОК-НІ, включає приблизно 16-19 амінокислот та закінчується на наступному залишку аргініну або лізину. СОБ-

НЗ починається приблизно з 33 залишку амінокислоти за кінцем СОК-Н2; включає 3-25 амінокислот; та закінчується на послідовності МУ-(3-Х-О, де Х - будь-яка амінокислота. СОК-Ї 1 починається приблизно з залишку 24 (тобто за залишком цистеїну); включає приблизно 10-17 залишків; та закінчується на наступному залишку триптофану. СОК-І 2 починається приблизно з 16-го залишку за кінцем СОК-І1 та включає приблизно 7 залишків. СОБ-І| З починається приблизно з 33-го залишку за кінцем СОК-12 (тобто за залишком цистеїну); включає приблизно 7-11 залишків та закінчується на послідовності Е або М/-С-Х-0, де Х - будь-яка амінокислота.

Антитіла згідно з описом у цьому документі можуть походити з будь-яких тварин, у тому числі птахів та ссавців. Переважно зазначені антитіла являють собою антитіла людини, миші, осла, кролика, кози, морської свинки, верблюда, лами, коня або курки. Згідно з іншим варіантом реалізації варіабельна область може походити з хрящових риб (наприклад, від акул).

У цьому документі термін "константна область важкого ланцюгу" включає послідовності амінокислот, що походять з важкого ланцюгу імуноглобуліну. Поліпептид, що містить константні область важкого ланцюгу, містить щонайменше що-небудь одне з: домену СНІ, шарнірного домену (наприклад, верхньої, середньої та/(або нижньої шарнірної області), домену СН2, домену СНЗ, або варіанту або фрагменту перерахованого. Наприклад, антигензв'язуючий поліпептид для застосування у відповідності з даним винаходом може містити поліпептидний ланцюг, який містить домен СНІ; поліпептидний ланцюг, який містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену та домен СН2; поліпептидний ланцюг, яка містить домен СНІ та домен СНЗ; поліпептидний ланцюг, яка містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену та домен СНЗ, або поліпептидний ланцюг, який містить домен СНІ, щонайменше частину шарнірного домену, домен СН2 та домен СНЗ. Згідно з іншим варіантом реалізації поліпептид згідно з цим описом містить поліпептидний ланцюг, який містить домен СНЗ. Крім того, у антитілі для застосування у відповідності з даним винаходом може бути відсутньою щонайменше частина домену СН2 (наприклад, весь домен або частина домену СН2). Як описано вище, фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що константна область важкого ланцюгу може бути модифікована таким чином, що вона відрізняється послідовністю амінокислот від послідовності у молекулі імуноглобуліну, що зустрічається у природі.

Константна область важкого ланцюгу антитіла згідно з описом у цьому документі може походити з різних молекул імуноглобуліну. Наприклад, константна область важкого ланцюгу поліпептиду може містити домен СНІ, що походить з молекули дос, та шарнірну область, яка походить з молекули ІдОз. Згідно з іншим прикладом константна область важкого ланцюгу може містити шарнірну область, яка походить частково з молекули до: та частково з молекули Ідсз.

Згідно з іншим прикладом важколанцюгова частина може містити химерний шарнір, що походить частково з молекули до; та частково з молекули Ідсва.

У даному документі термін "константна область легкого ланцюгу" включає послідовності амінокислот, що походять з легкого ланцюгу антитіла. Переважно константна область легкого ланцюгу містить щонайменше що-небудь одне з константного домену ланцюгу каппа або константного домену ланцюгу лямбда. "Пара легкий ланцюг/важкий ланцюг" відноситься до комплекту з легкого ланцюгу та важкого ланцюгу, який може формувати димер за рахунок дисульфідного зв'язку між доменом Сі. легкого ланцюгу та доменом СНІ важкого ланцюгу.

Як було зазначено раніше, субодиничні структури та тривимірна конфігурація константних областей імуноглобулінів різних класів добре відомі. У цьому документі термін "МН-домен" включає амінокінцевий варіабельний домен важкого ланцюгу імуноглобуліну, а термін "домен

СНІ" включає перший (найближчий до амінокінця) домен константної області важкого ланцюгу імуноглобуліну. Домен СНІ розташований суміжно з МН-доменом та у напрямку амінокінця відносно шарнірної області важкого ланцюгу молекули імуноглобуліну.

У цьому документі термін "домен СН2" включає частину молекули важкого ланцюгу, яка продовжується, наприклад, приблизно від залишку 244 до залишку 360 антитіла при використанні стандартних схем нумерації (залишки 244-360, система нумерації Кабаг та залишки 231-340, система нумерації ЕШ; див. Кабраї еї аІ.,, 05 Оері. ої Неай апа Нитап зегмісе5, "Зедцепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодісаї Іпіегезі" (1983). Домен СНЗ2 унікальний тим, що його тісного спарювання з іншим доменом не відбувається. Замість цього між двома доменами

СН2 інтактної природної молекули ДОС включені два М-зв'язані розгалужені вуглеводневі ланцюги. Також переконливо доведено, що домен СНЗ продовжується від домену СН2 до С- кінця молекули Ідо та містить приблизно 108 залишків.

У цьому документі термін "шарнірна область" включає частину молекули важкого ланцюгу, яка з'єднує домен СНІ з доменом СН2. Зазначена шарнірна область містить приблизно 25 залишків та має гнучкість, дозволяючи таким чином двом М-кінцевим антигензв'язуючим областям незалежно рухатися. Шарнірні області можуть бути поділені на три окремі домени: верхній, середній та нижній шарнірний домени (Коих еї аї., у. Іттипо! 161: 4083 (1998)).

У цьому документі термін "дисульфідний зв'язок" включає ковалентний зв'язок, що формується між двома атомами сірки. Амінокислота цистеїн містить тіольну групу, яка може формувати дисульфідний зв'язок або місток з другою тіольною групою. У більшості молекул Ідс, що зустрічаються у природі, області СНІ та СК з'єднані дисульфідним зв'язком, а два важкі ланцюги з'єднані двома дисульфідними зв'язками у положеннях, що відповідають 239 та 242 при використанні системи нумерації Кабаї (положення 226 або 229, система нумерації ЕМ).

У цьому документі термін "химерне антитіло" означає будь-яке антитіло, яке відрізняється тим, що імунореактивна область або сайт отримана(ий) або походить з першого виду, а константна область (яка може бути інтактною, частковою або бути модифікована відповідно до цього винаходу) отримана з другого виду. Відповідно до визначених варіантів реалізації цільова зв'язуюча область або сайт походить не з джерела, отриманого від людини (наприклад, отримана з миші або примата), а константна область отримана від людини.

Згідно з даним винаходом "відсоток гуманізації" обчислюють шляхом визначення числа відмінностей амінокислот у каркасній послідовності (тобто відмінностей не у СОК) гуманізованого домену та домену зародкової лінії, віднімання отриманого числа із загального числа амінокислот, з наступним діленням результату на загальне число амінокислот та множенням на 100.

Вирази "специфічно зв'язує" або "характеризується специфічністю у відношенні" мають на увазі, як правило, що антитіло зв'язується з епітопом за допомогою антигензв'язуючого домену, та що зазначене зв'язування має на увазі деяку компліментарність між антигензв'язуючим доменом та епітопом. Відповідно до цього визначення про антитіло кажуть, що воно "специфічно зв'язується" з епітопом, якщо воно зв'язується із зазначеним епітопом за допомогою антигензв'язуючого домену легше, ніж зв'язувалося б з випадковим неспорідненим епітопом. Термін "специфічність" застосовують у цьому документі для якісної оцінки відносної афінності, з якою певне антитіло зв'язується з певним епітопом. Наприклад, антитіло "А" може бути визнане таким, що має більш високу специфічність у відношенні заданого епітопу у порівнянні з антитілом "В", або може бути зазначено, що антитіло "А" зв'язується з епітопом "С" з більш високою специфічністю, ніж із спорідненим епітопом "О".

У цьому документі терміни "лікувати" або "лікування" відносяться і до терапевтичного лікування, і до профілактичних або попереджувальних заходів, причому мета полягає у запобіганні або уповільненні (полегшенні) небажаної фізіологічної зміни або розладу, наприклад, прогресування раку. Сприятливі або необхідні клінічні результати включають, не обмежуючись перерахованим, полегшення симптомів, зменшення ступеня захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) статусу захворювання, затримку або уповільнення 60 прогресування захворювання, полегшення або тимчасове пом'якшення хворобливого стану, та ремісію (часткову або повну), що детектуються або недетектуються. "Лікування" може також означати збільшення тривалості виживання у порівнянні з очікуваним виживанням за відсутності лікування. Пацієнти, які потребують лікування, включають тих, що вже мають зазначений стан або розлад, а також схильних до зазначеного стану або розладу; або тих, у кого необхідно запобігти розвитку зазначеного стану або розладу.

Термін "суб'єкт" або "індивідуум" або "тварина" або "пацієнт" або "ссавець" відноситься до будь-якого суб'єкта, зокрема, суб'єкта-ссавця, якому потрібен діагноз, прогноз або терапія.

Суб'єкти-ссавці включають людину, домашніх тварин, сільськогосподарських тварин та тварин у зоопарках, використовуваних у спорті тварин або тварин-компаньйонів, таких як собаки, кішки, морські свинки, кролики, щури, миші, коні, велика рогата худоба, корови тощо.

У цьому документі такі вирази, як "пацієнт, який потребує лікування" або "суб'єкт, який потребує лікування" включає суб'єктів, таких як суб'єкти-ссавці, для яких було б сприятливим введення антитіла або композиції згідно з даним описом, застосовуваних, наприклад, для детекції, для діагностичної процедури та/або для лікування.

Антитіла проти РО-І 1

У відповідності з даним винаходом запропоновані антитіла проти РО-Ї1 з високою спорідненістю до білку РО-Ї1ї людини. Протестовані антитіла демонстрували потужне зв'язування та інгібуючу активність, та підходять для терапевтичного та діагностичного застосування.

Білок РО-І1 являє собою трансмембранний білок типу 1 розміром 40 кДа. Його позаклітинна частина включає М-кінцевий імуноглобуліновий М-домен (І94М) (амінокислоти 19-127) та С- кінцевий імуноглобуліновий С-домен (ІдС) (амінокислоти 133-225). РО-1 та РО-І11 взаємодіють через консервативні передню та бічну частини їх ІдМ-доменів, як і І(дМ-домени антитіл та Т- клітинних рецепторів. Очікуваним чином, всі відомі у даний час антитіла проти РО-Ї1 зв'язуються з |ДМ-доменом, що може порушувати зв'язування між РО-1 та РО-11. Відповідно, дивним та несподіваним було описане у цьому документі відкриття, яке полягає у тому, що антитіла, наприклад, багато антитіл згідно з описом у цьому документі, які зв'язуються з ІдС- доменом білку РО-11, також здатні ефективно та, можливо, навіть більшою мірою інгібувати РО-

Ї1, що призводить до отримання ще більш удосконалених терапевтичних ефектів.

Відповідно до одного варіанту реалізації даного винаходу, відповідно, запропоноване антитіло проти РО-Ї71 або його фрагмент, здатне (здатний) специфічно зв'язуватися з імуноглобуліновим С-доменом (ІдсС) білку ліганду запрограмованої смерті 1 (РО-11) людини.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений ІдС-домен складається із залишків амінокислот 133-225.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла може зв'язуватися щонайменше з одним із залишків амінокислот 134, К162 або М183 білку РО-І1. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла може зв'язуватися щонайменше з двома із залишків амінокислот 134, К162 або М183 білку РО-І1. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла може зв'язуватися щонайменше з одним із залишків амінокислот

У134, К162 та М183 білку РО-І11. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла не зв'язується з імуноглобуліновим М-доменом (І9ДМ) білку

РО-І1, причому зазначений Ідм-домен складається із залишків амінокислот 19-127.

У відповідності з одним варіантом реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, яке включає варіабельні домени важких ланцюгів та легких ланцюгів з областями СО, визначеними у 5ЕО ІЮ МО: 1-6.

Таблиця 1

Послідовності областей СОК ммосовз 0 фоонМТтРІТЇ ///7777777777111111171Ї111111116 1

Як було продемонстровано на експериментальних прикладах, антитіла, що містять зазначені області СОМ - як антитіла миші, так і гуманізовані або химерні - демонстрували виражене зв'язування РО-Ї1 та інгібуючу активність. Із застосуванням додаткового комп'ютерного моделювання було показано, що певні залишки у межах СОМ можуть бути модифіковані для збереження або поліпшення властивостей антитіл. Такі залишки, які виділені підкресленням у таблиці 1, називаються "гарячими точками". Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло проти РО-Ї1 згідно з цим описом включає МН та МІ СОК, представлені у таблиці 1, з однією, двома або трьома додатковими модифікаціями. Такі модифікації можуть являти собою додавання, делецію або заміну амінокислот.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена модифікація являє собою заміну не більше ніж у одній гарячій точці у кожній з СОК. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена модифікація являє собою заміну у одній, двох або трьох таких гарячих точках.

Відповідно до одного варіанту реалізації зазначена модифікація являє собою заміну у одній з гарячих точок. Такі заміни, відповідно до деяких варіантів реалізації, являють собою консервативні заміни. "Консервативна заміна амінокислоти" являє собою таку заміну, при якій залишок амінокислоти замінюють на залишок амінокислоти, що містить аналогічний бічний ланцюг. У даній галузі техніки були визначені сімейства залишків амінокислот, що містять аналогічні бічні ланцюги, у тому числі основні бічні ланцюги (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бічні ланцюги (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Відповідно, залишок замінної амінокислоти у імуноглобуліновому поліпептиді переважно замінюють на інший залишок амінокислоти з того ж сімейства бічних ланцюгів. Згідно з іншим варіантом реалізації відрізок послідовності амінокислот може бути замінений на структурно аналогічний відрізок, що відрізняється порядком та/або складом представників сімейства бічних ланцюгів.

Необмежуючі приклади консервативних замін амінокислот приведені у таблиці нижче, при цьому показник подібності, що дорівнює 0 або більше, вказує на консервативну заміну між двома амінокислотами.

Таблиця 2

Матриця подібності амінокислот (С Те |Р |5 ТА т (о (Е (м (о Ін дк Ів М м По. де М ДМ м 1-81-7|-6|21|-61|-51-71|-7| 4153 3 2) 6| 4| 5 210 о 17.

М 10515133 4| 4| 24,04 5 2| 211717 0

ЕЕ 145153 4|31/6|5|4|5| 2 5 4|1|0/|11219 - 161 4|3|3|2|2|4|з3|3|2г| 2 3 з3|2|4|216 1 тез 2а|ліліо0о|е2|г2г|2|2|2 2 2|14|2|5 мМ 5|З|2|2гі|л|І7|з| 2017, 210 0216!

М е|ліліл оо 2|г2| 21 2|2 2 214 в «|зІ0|0|2г|л7|7|7,|0111,2. 316! | | Її Її

Кк 5І2гілІо0о|л7|0|0|0|11711105 | | | Її Її н/зае|о|ліліл7|1ї|1|21316ї | | | її її 1 1 о 5ІлІ0|л7|10|7І2|2 1114, її її 1 1 171 1 м 4 Іо|л7|1,10101211121 | її її її 1 1 71 1

Е 50710101 01314! Її Її її її її 1 1 1 1 о 5І17|1710101014| | Її Її Її 1 7171717 т его 10111113, Її Її її Її 7177111

А 2гІ1|111112! Її 71 71 17 5 01111117! 7 1 її 11711711 11111

Р з3І716Її Її Її 71 1 Ї717ї717111 он в з3151 ЇЇ ЇЇ її 1 її її 17171111 111 спе! 1

Таблиця З

Консервативні заміни амінокислот й , Заміна на амінокислота:

Конкретні приклади СОК з підходящими замінами представлені у 5ЕО ІЮ МО: 61-111 з прикладу 11. Відповідно до деяких варіантів реалізації, відповідно, антитіло відповідно до даного опису включає МН СОКІ1 з послідовності ФЕО ІЮ МО: 1 або будь-яку з послідовностей 61-67. Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло відповідно до даного опису включає

МН ОСОМК2 з 5ЕБЕО ІЮ МО: 2 або будь-яку з 68-77. Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло відповідно до даного опису включає МН СОМКЗ з 5ЕБО ІО МО: 1 або будь-яку з послідовностей 78-90. Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло відповідно до даного опису включає МІ СОМКІ з 5ЕО ІЮО МО: 4 або будь-яку з послідовностей 91-92. Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло відповідно до даного опису включає МІ СОКа2 з БЕО ІЮ МО: 5 або будь-яку з послідовностей 93-105. Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло відповідно до даного опису включає МІ СОКЗ з 5ЕО ІЮ МО: 6 або будь-яку з послідовностей 106-110.

Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло або його фрагмент включає не більше ніж одну, не більше ніж дві або не більше ніж три із зазначених вище замін. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОМ з

ЗЕО ІЮ МО: 1 або будь-яку з БЕО ІЮ МО: 61-67, МН СОК2 з 5ЕО ІЮ МО: 2, МН СОКЗ з 5ЕО І

МО: 3, МІ. СОКІ з БЕО ІЮ МО: 4, МІ СОК2 з 5ЕО І МО: 5 та М СОКЗ з БЕО ІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОКІ з 5ЕО ІЮ МО: 1, МН СОК2 з БЕО ІЮО МО: 2 або будь-яку з БЕО ІЮ МО: 68-77, МН СОКЗ з 5ЕО ІЮ МО: 3, МІ СОКІ1 з БЕО ІЮ МО: 4, МІ СОКО2 з 5ЕО ІЮО МО: 5 та МІ СОКЗ з ЗЕОІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОР з 5ЕО ІЮО МО: 1, МН СОК2 з 5ЕО І МО: 2, МН СОБЗ з 5ЕО ІЮ МО: З або будь-яку з БЕО ІЮ МО: 78-90, М СОМ з БЕО ІЮ МО: 4, МІ СОМ2 з 5ЕО ІЮ МО: 5 та МІ СОКЗ з ЗЕОІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОР з 5ЕО ІЮО МО: 1, МН СОК2 з 5ЕО ІЮ МО: 2, МН СОКЕЗ з 5БЕО ІЮ МО: 3,

МІ. СОМ з 5ЕО ІЮО МО: 4 або будь-яку з БЕО ІЮ МО: 91-92, МІ СОК2 з 5ЕО І МО: 5 та МІ СОКЗ з ЗЕОІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОР з 5ЕО ІЮ МО: 1, МН СОМК2 з 5ЕО ІЮ МО: 2, МН СОБЗ з 5БЕО ІЮ МО: 3,

МІ СОК1 з 5БЕБЕО ІЮ МО: 4, М СОМ2 з 5ЕО ІЮО МО: 5 або будь-яку з БЕО ІЮ МО: 93-105 та МІ.

СОМКЗ з БЕО ІЮ МО: 6.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла включає МН СОМ з ЗЕО ІЮ МО: 1, МН СОК2 з 5ЕО ІЮ МО: 2, МН СОКЗ з ЗЕО ІЮ МО: 3,

МІ. СОМ з БЕО Ір МО: 4, МІ СОК2 з ЗЕО ІО МО: 5 та МІ СОКЗ з 5ЕО ІО МО: 6, або будь-яку з

ЗЕО І МО: 106-111.

Необмежуючі приклади МН представлені у ЗЕО ІЮ МО: 7-26 та 113, при цьому ЗЕО ІЮ МО: 113 являє собою МН миші, а 5ЕО ІЮО МО: 7-26 являють собою гуманізовані послідовності. Крім того, серед гуманізованих МН 5ЕО ІЮО МО: 9-15, 17-21 та 23-26 включають одну або більше зворотних мутацій до варіанту миші. Подібним чином, необмежуючі приклади Мі (УК) представлені у ЗЕО ІЮ МО: 27-33. 5ЕБЕО ІЮ МО: 28 та 30 являють собою вихідні отримані гуманізовані послідовності з прищепленими СОК, як показано у прикладах. ЗЕО ІЮО МО: 29 та 31-33 являють собою гуманізовані МІ. із зворотними мутаціями.

Показано, що зворотні мутації корисні для зберігання певних характеристик антитіл проти

РО-І1. Відповідно, згідно з деякими варіантами реалізації антитіла проти РО-1Ї 1 згідно з даним описом, зокрема, антитіла людини або гуманізовані, включають одну або більше зворотних мутацій. Відповідно до деяких варіантів реалізації зворотна мутація МН (тобто включена у певному положенні амінокислота) являє собою одну або більше мутацій, вибраних з (а) Зег у положенні 44, (Б) АІа у положенні 49, (с) Аіа у положенні 53, (4) Пе у положенні 91, (е) Сім у положенні 1, () Ма! у положенні 37, (9) Тйг у положенні 40 (п) МаЇ у положенні 53, (ї) Сім у положенні 54, (|) А5п у положенні 77, (К) Агд у положенні 94 та (І) ТПг у положенні 108, у відповідності з нумерацією за КарБбаї, та їх комбінацій. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначені зворотні мутації вибирають з (а) бег у положенні 44, (Б) Аіа у положенні 49, (с) Аа у положенні 53 та/або (4) Пе у положенні 91, у відповідності з нумерацією за КаБбаї, та їх комбінацій.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зворотна мутація МІ. являє собою одну або більше мутацій, вибраних з (а) Зег у положенні 22, (Б) СіІп у положенні 42, (с) бЗег у положенні 43, (а)

Азр у положенні 60 та (е) Тиг у положенні 63, у відповідності з нумерацією за Кабаї, та їх комбінацій.

Відповідно до деяких варіантів реалізації антитіло проти РО-І1 відповідно до даного опису включає МН з 5ЕО ІЮО МО: 7-26, МІ з БЕО ІЮО МО: 27-33 або відповідні їм біологічні еквіваленти.

Біологічний еквівалент МН або Мі являє собою послідовність, яка включає позначені амінокислоти, при цьому ідентичну у цілому на 8095, 8595, 9095, 9595, 9895 або 99 95.

Біологічний еквівалент ЗЕО ІЮ МО: 20, наприклад, може являти собою УН, послідовність якої у цілому на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95 або 99 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 20, однак зберігає області СОМ (ЗЕО ІО МО: 1-46 або їх варіанти) та, необов'язково, зберігає одну або більше, або усі із зворотних мутацій. Відповідно до одного варіанту реалізації МН має послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 20, а Мі. має послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО І МО: 28.

Додатково удосконалені антитіла до РО-І 1

За рахунок застосування випадкового мутагенезу з контрольованими рівнями мутацій у прикладах 13-17 вдалося ідентифікувати цілу низку гарячих точок для мутацій залишків, зокрема, у СОКЗ з варіабельних областей як важких (наприклад, Вб, С3, Сб та АТ), так і легких ланцюгів (наприклад, АЗ) (див. таблиці 14 та 15). Мутагенез проводили на шаблонному антитілі, отриманому з Ни1210-41 (як зазначено у виносці під таблицею 14, шаблонне антитіло УТ містить заміну 56ОК (нумерація за Кара) у СОК2 важкого ланцюгу). Також Ни1210-41 включало заміну С5З3А відносно химерного антитіла (див. 5ЕО ІЮ МО:20) у МН СОК2. Антитіло Вб з протестованих мутантних антитіл продемонструвало значно покращені афінність зв'язування з

РО-І1 людини та біологічну активність.

Згідно з одним варіантом реалізації відповідно, запропоновані антитіла та антигензв'язуючий фрагмент, які включають наступні СОК (з мутанта 56ОК) та їх варіанти. ммосовз 0 доонМТтТРІТЇГ/Г/-:////СЇ111177711вбсЙсЙс2,

Згідно з одним варіантом реалізації відповідно, запропоновані антитіла та антигензв'язуючий фрагмент, які включають наступні СОК (з Вб) та їх варіанти.

ммосовз 0 доонМТтТРІТЇГ/Г/-:////СЇ111177711вбсЙсЙс2,

Відповідно до одного варіанту реалізації запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент, яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні більюу РО-Ї17 людини та містить: (а) МН СОК'І1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 1 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1; (5) МН СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 116 або варіанті БЕО ІЮО МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 116; (с)

МО: 3, при цьому другий залишок амінокислоти МН СОКЗ являє собою І еи; (4) М СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 4 або варіанті ЗЕО ІЮО МО: 4, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ХЕО ІЮ МО: 4; (є) М СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5 або варіанті БЕО ІЮО МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 5; та (9 М.

Відповідно до одного варіанту реалізації запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент, яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні білку РО-Ї1 людини та містить: (ах) МН СОК'І1, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 1 або варіанті ЗЕО ІО МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1; (5) МН СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 116 або варіанті ЗЕО ІЮО МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 116; (с)

ЗЕО ІЮ МО: 117, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ

МО: 117, при цьому другий залишок амінокислоти МН СОКЗ являє собою Іі еи; (4) М СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 4 або варіанті БЕО ІЮ МО: 4, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з ФЕО ІЮ МО: 4; (є) М СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5 або варіанті БЕО ІЮО МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЗЕО ІЮ МО: 5; та () М.

СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 6 або варіанті ЗЕО ІЮ

Приклади варіантів ХЕО ІО МО: 1 містять одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1, 2 та 5, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 61-67: пе ПЕТ Я НО сх ОН 1 1емомМ5 11111116 00 І8БОМ877111111111111111111Ї1111116сСс2с 00 І8НОМ87771111111111111111111Ї11111164с21 001 18ММОМ57771111111111111111171Ї1111117166ссСсСс2с0 нео ЕТ 7 Я ПО ст о недо ЕТ ех НО сум ОО

Приклади варіантів БЕО ІЮ МО: 116 містять одну або більше замін амінокислот, наприклад,

ЗЕО ІЮ МО: 118-127, 2 та 68-77. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначені варіанти представлені ЗЕО ІЮО МО: 118-127.

БЕОТО МО:

Ун сова ТІЗРАСОМІУВОоБУКО 77717111..7.юрю7 7 |ПЗОАСАМІУУВОБУКО 7777777.7.7.юрю7 7 |ТПЗоАОРМУУВОБУКО 7777..7.юрю7ю7 7 (|пізрдаснгіууУВовУКОо 77777.7юрюрюрю7ю7ю7 7 |пзраосніуУВовУКа 77771111.7.7.юрю7 7 |пПЗрАОсУЛУУВОВУКО 7777..7.юрю7ю7ю7 7 (|пізрдасмуУВотТУКао нннннннШПИО ЕІ ДЛ То 771711..7.юрю7 7 |пЗрАсоМуУВОБІКа 77777.7.юрюрю7ю7 7 |пПЗрАсОМуУВОБІКО 7777.7.юрюрюрю7ю7ю7 7 |пвраасмууВОоБМКа 11... фпвоосомуувовука 77000 (піврослумувовуко вв 7700 |пвоссрумувовуко вв 1... фпвросануувовука 7770 |пвоссоніуувовука 1111111... фпвооссулуувовука 7770 (пвооссумувотуко юю... фпвросомуувосука 7770 (пвооссумувовіко 77....ю.ю7 фпвросомуувовіко 777000 пвосссумувовмко

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений третій залишок амінокислоти варіанту

МН оСОМКЗ являє собою Рго. Відповідно до деяких варіантів реалізації четвертий залишок амінокислоти варіанту МН СОКЗ являє собою Ттгр.

Приклади варіантів ЗЕО ІЮ МО: З містять одну або більше замін амінокислот у положеннях залишків амінокислот 1-6, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 78-90:

ЗЕО ІО МО: ун СОовЗ ЕРОКАМАГОУ 777771717ю7ю7ю ТОвОКАУА Оу 77777717... 7 ОРОКАМУАгрУ 22020203 |МЕОКВУдІ ру нини 771111111.1.р.р.7ю7 1 ДЕМОКВМУАСрУ 777711711771.7.7.7.ю7ю7 7 ДЕНОКАМАСОУ 11111117 ЕМОКАМАОУ 11111111. 7 ТЕРАКВУАСОУ 11111117 7 ДЕРРКВУАСОУ 777....р.р.рюрю7 7 ДЕРОВВУАСОУ 11111186 7771111...р.р.рюрюрю 7 ДЕРОККУАСОУ 77111111... 7 ДЕРОКВРАСОУ 77777711..р.рюрю7ю7 7 ДЕРОКАНАСОУ 1111189 11111111... 7 ДЕРОКВМАГОУ 1180111

Приклади варіантів ЗЕО ІЮ МО: 117 містять одну або більше замін амінокислот у положеннях залишків амінокислот 1, 5 та 6, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 128-139:

11111111 ФфЕШЕМАМАСОМ(ВІЇ77777777777777777777717177711111111117128 11111111 ФфЕСНЕнМАОМ(С3)Ї777777777777777777777777117117711111111117129 11111111 ФфеСУЕВМАЦОМ(СЯ 777777777777777777777171177711111111т1во 11111111 ФфЕШНВМАШОМ(А)77777777777777777777717Ї1777771717171717111т1 11111111 ФЕЩОВМАСОМ(А)Г7777777777777777771 17777111 7132 11111111 ФОІРМАМАЮМ //7777777777777777777171Ї1777777771717111 733 11111111 ФОІРМВМАЮМ /::ССС7777777777777171777717171717171711171347 11111111 ФЇМІРМВМАОМ /::СС777777777777771711717171111111111171351 11111111 ФфЕСРМКУМАТЮМЇГГ/:/77777777777171717171711111111111т1361 11111111 ФЕСРМАБАОМ ГГ/:ССС777777777777771171Ї1771111717111111т13 11111111 ФфЕСРМАВНАЮМ ГГ/:/СССССС777777777717171717171711711711111111111т138 11111111 ФЕСРМАМАЮМ /////77777777777777777771171Ї1777777717171111т1391

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений варіант БЕО ІЮО МО: 4 містить одну заміну амінокислоти у положенні залишку амінокислоти 3, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 91-92: 11111111 1ЇКАТО0МТРАМАЇГ/://ССС//7777777777777777/Ї7777771717771711191ИЙ742 11111111 ЇКАСО0МТРАМАЇГ/://ССС//77777777777777/Ї7711717171717171717111927721

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначений варіант БЕО ІЮО МО: 5 містить одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1-6, наприклад, ЗЕ ІЮ МО: 93-105: пол ЕЕ ЕТ: ПНО КОХ: Хе ТО 1 Істе5вМС777777777777777777777777777777717171171Ї171111111111840 1 |5555ВМССССС111111111111111111111111111Г111111119 ИЙ; пол ТЕТ та ООН КОН Те НО пол ТЕ ЕТ: Я ПОН КОН У ОО пол ЕТ: ПОН КОТ: ТО пол ЕТ от Я ПОООООООООООООООННО КОООН ТЕ ОН пол ЕЕ: ПНО КОН СТ КО пол ЕТ тот Я ПОН КОН Кох НО пол ЕТ ТА ПО КОХ КУ З пол ЕЕ: тої ООН КОН КС КОН пол ЕЕ: хі ООН КОН КС У У пол ЕЕ ЕЕ ЕТ ТТ ПОООООООООООООООНННО КОН Ко С: ТО

Приклади варіантів БЕО ІО МО: 6 містять одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1 та 2, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 106-111. Інший приклад варіанту представлений ЗЕО ІЮ МО: 140. мосонз 0 фоонУТттРІТЇГ/:Х(////С/С/С/С/С/С/С/////1771717171717171717171716 пол Петля ПОН КОН СТ ТО 1 фронмтРТЇГГ/Г////777777777777717171717171717171171111111111111о7 пол ТЕТ ак кл ООН КОН С: ТОНН пол Гете ях ПОН КОН С: ПОН 1 форнМтРЇЇГЛГ/Г//7777777777777171711171711711111111111111ло 1 фоМнМтРТЇГЛГСГ/С////777777777771111171ЇС1111111111111 11111111 ФООНБОАРІТАЗІЇГ/Г////77777777777777777/Ї7777171717171717111тла1

Мутант АЗ, який містить заміни по трьом положенням залишків у М СОКЗ, також проявляв прекрасну афінність зв'язування з РО-Ї1 людини. Згідно з одним варіантом реалізації, відповідно, запропоновані антитіла та антигензв'язуючий фрагмент, які включають наступні

СОБК та їх варіанти:

Згідно з одним варіантом реалізації, відповідно, запропоноване(ий) антитіло або його фрагмент, яке(який) відрізняється тим, що зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність у відношенні білюу РО-Ї1 людини та містить: (а) МН СОМ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІО МО: 1 або варіанті БЕО ІЮ МО: 1, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1; (в) МН СОМ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 116 або варіанті ЗЕО ІО МО: 116, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 116; (с)

ЗЕО ІО МО: 3, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІЮ

ЗЕО ІЮ МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5 або варіанті ЗЕО ІЮ МО: 5, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з «ЕО ІЮО МО: 5; та () М СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО І МО: 140 або варіанті БЕО ІО МО: 140, що містить одну, дві або три заміни, делеції або інсерції у порівнянні з БЕО ІО МО: 140, при цьому щонайменше (ї) залишок амінокислоти 4 у МІ.

СОКЗ являє собою 5ег, (і) залишок амінокислоти 5 у М СОКЗ являє собою Аб5р; або (її) залишок амінокислоти 6 у М СОКЗ являє собою Аа.

Приклади варіантів ХЕО ІО МО: 1 містять одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1, 2 та 5, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 61-67.

Приклади варіантів 5ЕО ІО МО: 116 містять одну або більше замін амінокислот, наприклад,

ЗЕО ІО МО: 118-127, 2 та 68-77.

Приклади варіантів зЗЕО ІЮО МО: З містять одну або більше замін амінокислот, наприклад,

ЗЕО ІЮ МО: 117 та 128-139.

Ко) 11111111 1ЕШРМАМАЩОМ(ВУЇ//77777777777777777711171Ї71111717171111128С1С 11111111 1ЕЩНЕВУАЩОМ(С3)77777777777777777771171171Ї111111111291 11111111 1ЕСМЕВМАСОУ(С6)Ї 77777771 17111713 11111111 1ЕШНВАМАСОМ(АТУЇГГ777777777777777717Ї711111111111ВМ 11111111 1ЕЩАОВУАОМ(А)Г/7777777777777777717 17111713 11111111 1ОСРМАМАЮМ 77777771 11111111 10ОІРМАМАЮМ ////7777777771717111111171Ї11111111341 11111111 1МІРМАМАЮЮМЇ Г/л 11111111 1ЕРМКУМАЮМ ////77777777771717171717171171Ї11111113в61 11111111 1ЕРМАРАСЮМЇГГ////77777777771111111171Ї11111111137С 11111111 1ЕРМАНАЮЮМЇГ///77777777171717171111111171Ї111111111т38С1С 11111111 1ЕРМАМАЮМ ////7777777777171717111171171Ї11111т391

Приклади варіантів БЕО ІЮ МО: 4 містять одну заміну амінокислоти у положенні залишку амінокислоти 3, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 91-92.

Приклади варіантів ХЕО ІО МО: 5 містять одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1-6, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 93-105.

Відповідно до деяких варіантів реалізації залишок амінокислоти 4 у варіанті М. СОКЗ являє собою Зег. Відповідно до деяких варіантів реалізації залишок амінокислоти 5 у варіанті МІ.

СОКЗ являє собою Азр. Відповідно до деяких варіантів реалізації залишок амінокислоти 6 у варіанті М. СОМЗ являє собою Аа. Приклади варіантів 5ЕО ІЮ МО: 140 містять одну заміну амінокислоти у одному з положень залишків амінокислот 1 та 2, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 161- 166. пе ГЕТетх Ет ТТЛ ВН КОН Сх ПОН 11111101 ФООНВОАРІТГГ//777777777717171717171111111111111111111111162СсС нем тет и то Столи ПОН КОН С: х УДО пил Гете ЕТ ТТЛ ВО КОН С До пи Геть кто ств ПОН КОН С УДО нем Сет х тестя ПОН КОН С У

Приклади антитіл, отриманих у результаті дослідження мутагенезу, або їх антигензв'язуючих фрагментів включають ті, що містять варіабельні області важких ланцюгів та легких ланцюгів, представлені у таблиці 15. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає 5ЕО ІЮ МО: 141, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 142. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 143, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 144. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 145, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 146. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає

ЗЕО ІО МО: 147, а варіабельна область легкого ланцюгу включає 5ЕО ІЮ МО: 148. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає 5ЕО ІЮ МО: 149, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 150. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає ЗЕО ІО МО: 151, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 152. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає 5ЕО ІЮ МО: 153, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 154. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 155, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 156. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 157, а варіабельна область легкого ланцюгу включає ЗЕО ІЮ МО: 158. Відповідно до одного варіанту реалізації варіабельна область важкого ланцюгу включає

ЗЕО ІЮ МО: 159, а варіабельна область легкого ланцюгу включає 5ЕО ІЮ МО: 160.

Спеціалісту у даній галузі техніки також буде зрозуміло, що антитіла згідно з описом у даному документі можуть бути модифіковані таким чином, що їх послідовність амінокислот відрізняється від послідовності зв'язуючого поліпептиду, що зустрічається у природі, з якого вони були отримані. Наприклад, поліпептид або послідовність амінокислот, який(яка) походить з певного білку, може бути аналогічною, наприклад, характеризуватися певним відсотком ідентичності стартової послідовності, наприклад, може бути на 60 95, 70 95, 75 95, 80 95, 85 бо, 90 9», 95 9», 98 95 або 99 95 ідентична стартовій послідовності.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене антитіло містить послідовність амінокислот або один або більше фрагментів, у нормі не асоційованих з антитілом. Приклади модифікацій більш докладно описані нижче. Наприклад, антитіло згідно з даним описом може містити послідовність гнучкого лінкеру, або може бути модифікована шляхом додавання функціонального фрагменту (наприклад, ПЕГ, лікарського засобу, токсину або мітки).

Антитіла, варіанти або їх похідні згідно з даним описом включають модифіковані похідні, а саме, модифіковані шляхом ковалентного приєднання молекули будь-якого типу до антитіла таким чином, щоб ковалентний зв'язок не попереджав зв'язування зазначеного антитіла з епітопом. Наприклад, але без обмежень, зазначені антитіла можуть бути модифіковані, наприклад, шляхом глікозилювання, ацетилювання, пегілювання, фосфорилювання, фосфорилювання, амідування, дериватизації відомими захисними/блокуючими групами, протеолітичного розщеплення, зв'язування з клітинним лігандом або іншим білком; і т.п. Будь- яка з численних хімічних модифікацій може бути здійснена із застосуванням відомих методик, у тому числі, але не обмежуючись перерахованими, специфічного хімічного розщеплення, ацетилювання, формілювання, метаболічного синтезу тунікаміцину і т.п. Крім того, антитіла можуть містити одну або більше некласичних амінокислот.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначені антитіла можуть бути кон'юговані з терапевтичними агентами, проліками, пептидами, білками, ферментами, вірусами, ліпідами, модифікаторами біологічної відповіді, фармацевтичними агентами або ПЕГ.

Зазначені антитіла можуть бути кон'юговані або злиті з терапевтичним агентом, який може включати мітки, які детектуються, такі як радіоактивні мітки, імуномодулятор, гормон, фермент, олігонуклеотид, фотоактивний терапевтичний або діагностичний агент, цитотоксичний агент, який може являти собою лікарський засіб або токсин, агент для підвищення якості ультразвукового дослідження, нерадіоактивну мітку, комбінацію перерахованого та інші такі агенти, відомі у даній галузі техніки.

Мічення зазначених антитіл, яке може бути детектоване, може бути проведене шляхом сполучення з хемілюмінесцентною сполукою. Потім визначають присутність хемілюмінесцентно- міченого антигензв'язуючого поліпептиду шляхом детекції люмінесценції, що виникає у ході хімічної реакції. Прикладами конкретних сполук, що підходять для хемілюмінесцентного мічення, є люмінол, ізолюмінол, ароматичний складний ефір акридину, імідазол, сіль акридину та складний ефір щавлевої кислоти.

Мічення зазначених антитіл, яке може бути детектоване, може бути проведене із застосуванням флуоресціюючих металів, таких як "7"Еи, або інших металів лантаноїдного ряду.

Зазначені метали можуть бути приєднані до антитіла із застосуванням таких металохелатуючих груп, як діеетилентриамінпентаоцтова кислота (ДТПК) або етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТК). Методики кон'югації різних фрагментів з антитілом добре відомі, див., наприклад, джерела: Атоп еї аї., "Мопосіопаї! Апіїродіе5 Бог Іттипоїагдеййпд ОЇ Огид5 Іп Сапсег Тегару", у роботі: Мопосіопа! Апііродіе5 Апа Сапсег Тпегару, Кеївтеїйй еї аї. (еаз.), рр. 243-56 (Аїап В. І івв,

Іпс. (1985); НеїЇвігот еї аї., "Апіїродіез Рог Огид Оеїїмегу", у роботі: Сопігойеа Огид Оеїїмегу (2па

Е9.), Вобіпзоп еї аї., (єд5.), Магсе! ОеккКег, Іпс., рр. 623-53 (1987); Тнпогре, "Апіїбоду Сатієтв ОЇ

Сушюїохіс Адепі5 Іп Сапсег Тпегару: А Кемієем/", у роботі: Мопосіопаї Апіїбоадіев "84: Віоіодіса! Апа

Сіїпіса! Арріїсайопве, Ріпспега єї аї. (ед5.), рр. 475-506 (1985); "Апаїузіз, Везийв, Апа Ешиге

Ргозресіїме ОЇ Те Тпегарешіс О5е ОЇ Кадйдіоіїареед Апіїбоду Іп Сапсег Тпегару", у роботі: Мопосіопа! Апіїродієз Рог Сапсег ЮОеїесіюп Апа Тнегару, Ваїдмі/п еї аї. (єдв.), Асадетіс Ргезв рр. 3003-16 (1985), та ТПпогре еї аї., "Те Ргерагайоп Апа Суйюїохіс Ргорепіез ОЇ Апіїроаду-Тохіп

Сопійдагтев", Іттипої. ВНему. (52:119-58 (1982)).

Біфункціональні молекули

РО-ЇЇ являє собою молекулу - контрольну точку імунної відповіді, а також пухлинний антиген. Для одержання біспецифічного антитіла специфічне у відношенні РО-1 1 антитіло або специфічний у відношенні РО-І 1 антигензв'язуючий фрагмент може бути скомбіноване(ий), як націлена на пухлинний антиген молекула, з другим антигензв'язуючим фрагментом, специфічним у відношенні імунної клітини.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена імунна клітина вибрана з групи, що складається з Т-клітини, В-клітини, моноцита, макрофага, нейтрофіла, дендритної клітини, фагоцита, природної клітини-кілера, еозинофіла, базофіла та тучної клітини. Підходящі для націлювання молекули на імунній клітині включають, наприклад, СОЗ, СО16, СО19, С028 та сОб64. Інші приклади включають РО-1, СТІ А-4, І ДОа-3 (також відомий як СО223), 028, СО122, 4-188 (також відомий як СО137), ТІМ3, ОХ-40 або ОХ40І, СО40 або СО401І,, ІП ІСНТ, ІСОБЛСОБІ,

СІТВ/СІТАЇ, ТІСІТ, С0О27, МІБТА, В7НЗ, В7Н4, НЕУМ або ВТГА (також відомий як СО272), імуноглобуліноподібні рецептори клітин-кілерів (КІК) та СО47. Конкретні приклади біспецифічності включають, без обмеження, РО-І1/РО-1, РО-І1/Л дСЗ, РО-І1/ГІСІТ та РО- 11/0047.

Антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, специфічне(ий) у відношенні РО-І1, може бути скомбіноване(ий), як інгібітор імунних контрольних точок, з другим антигензв'язуючим фрагментом, специфічним у відношенні пухлинного антигену, для отримання біспецифічного антитіла. "Пухлинний антиген" являє собою антигенну речовину, що продукується у пухлинних клітинах, тобто він запускає імунну відповідь у хазяїна. Пухлинні антигени підходять для ідентифікації пухлинних клітин та є потенційними кандидатами для застосування у терапії раку.

Нормальні білки у організмі не є антигенними. Певні білки, проте, продукуються або надлишково експресуються при туморогенезі та, відповідно, здаються організму "чужорідними".

Зазначені білки можуть включати добре секвестровані недоступні для імунної системи нормальні білки, білки, які у нормі продукуються у екстремально невеликих кількостях, білки, які у нормі продукують тільки на певний стадіях розвитку, або білки, структура яких модифікована через мутації.

У даній галузі техніки відомо багато пухлинних антигенів та нові пухлинні антигени можуть бути легко ідентифіковані за допомогою скринінгу. Необмежуючі приклади пухлинних антигенів включають рЕФР, Нег2, ЕРСАМ, СО20, С030, сО033, 26047, 2052, С0р133, СО73, КЕА, арАЗЗ, муцини, ТАС-72, СІХ, ПСОМА, фолат-зв'язуючий білок, 502, 503, М2, ФРЕС, МЕСЕК (рецептор 60 ФРЕС), інтегрин, аМВ3, «581, ЕКВВ2, ЕКВВЗ, МЕТ, ІСЕ1К, ЕРНАЗ, ТКА КІ, ТЕКА 2, КАМКІ.,

ЕАР та тенасцин.

Згідно з деякими аспектами моновалентна одиниця має специфічність у відношенні білку, який надмірно експресується на пухлинній клітині у порівнянні з відповідною непухлинною клітиною. "Відповідна непухлинна клітина" у цьому документі відноситься до непухлинної клітині, що належить до того ж типу клітин, що і вихідний тип для пухлинної клітини. Відзначимо, що такі білки не обов'язково відрізняються від пухлинних антигенів. Необмежуючі приклади включають карциноембріональний антиген (КЕА), який надмірно експресується у більшості карцином ободової кишки, прямої кишки, молочної залози, легені, підшлункової залози та шлунково-кишкового тракту; рецептори херегулінів (НЕК-2, пеи або с-егрВ-2), які часто надмірно експресуються при раку молочної залози, яєчника, ободової кишки, легені, передміхурової залози та шийки матки; рецептор епідермального фактору росту (РЕФР), який на високому рівні експресується у ряді солідних пухлин, включаючи пухлини молочної залози, голови та шиї, недрібноклітинний рак легені та передміхурової залози; асіалоглікопротеїновий рецептор; рецептор трансферину; рецептор серпін-ферментного комплексу, який експресується на гепатоцитах; рецептор фактору росту фібробластів (ЕСЕК), який надлишково експресується на клітинах аденокарциноми проток підшлункової залози; рецептор фактору росту ендотелію судин (МЕСЕК) для антиангіогенної генної терапії; рецептор фолієвої кислоти, який вибірково надлишково експресується у 90 95 немуцинозних карцином яєчників; глікокалікс поверхні клітин; рецептори вуглеводів; та рецептор полімерних імуноглобулінів, підходящий для доставки генів у клітини епітелію дихальних шляхів та привабливий для лікування захворювань легенів, таких як кистозний фіброз. Необмежуючі приклади біспецифічності у зазначеному випадку включають

РО-І1/рЕФР, РО-І1/Неге, РО-І1/С2033, РО-І 1/20133, РО-І1/КЕА та РО-ІЇ 1/ФРЕС.

Також запропоновані біспецифічні антитіла іншого формату. Відповідно до деяких варіантів реалізації обидва фрагменти, спрямований проти РО-Ї1 фрагмент та другий фрагмент, незалежно вибрані з Раб-фрагменту, одноланцюгового варіабельного фрагменту (5сЕм) або однодоменного антитіла. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначене біспецифічне антитіло додатково включає Ес-фрагмент.

Також запропоновані біфункціональні молекули, які включають не тільки антитіло або антигензв'язуючий фрагмент. Антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, специфічні у відношенні РО-Ї1, таке(ий) як описані у даному документі, може бути скомбіноване(ий) як націлена на пухлинний антиген молекула з імунним цитокіном або лігандом, необов'язково за допомогою пептидного лінкеру. Зв'язані імунні цитокіни або ліганди включають, не обмежуючись перерахованими, ІЛ-2, ІЛ-3, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-б, ІЛ-7, ІЛ-10, ІЛ-12, ІЛ-13, ІЛ-15, ГМ-КСФ, ФНО-а,

СО401, ОХ40І, СО271, СОЗОЇ, 4-18, ГІСНТ та СІТРЕЇ. Такі біфункціональні молекули можуть забезпечувати комбінацію блокуючого контрольну точку імунної відповіді ефекту та локальну імуномодуляцію у сайті пухлини.

Полінуклеотиди, які кодують антитіла, та способи одержання антитіл

У відповідності з даним винаходом також запропоновані виділені полінуклеотиди або молекули нуклеїнових кислот (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 34-60, 112 та 114), які кодують антитіла, їх варіанти або похідні згідно з даним описом. Полінуклеотиди згідно з даним описом можуть кодувати повні варіабельні області важких та легких ланцюгів антигензв'язуючих поліпептидів, їх варіантів або похідних на одній молекулі полінуклеотиду або на окремих молекулах полінуклеотидів. Крім того, полінуклеотиди згідно 3 даним описом можуть кодувати частини варіабельних областей важких та легких ланцюгів антигензв'язуючих поліпептидів, їх варіантів або похідних на одній молекулі полінуклеотиду або на окремих молекулах полінуклеотидів.

Способи отримання антитіл добре відомі у даній галузі техніки та описані у цьому документі.

Відповідно до деяких варіантів реалізації як варіабельні, так і константні області антигензв'язуючих поліпептидів згідно з даним описом є повністю людськими. Повністю людські антитіла можуть бути отримані із застосуванням методик, відомих у даній галузі техніки та описаних у цьому документі. Наприклад, повністю людські антитіла проти конкретного антигену можуть бути отримані шляхом введення антигену трансгенній тварині, яка була модифікована для отримання таких антитіл у відповідь на антигенну стимуляцію, причому ендогенні локуси у неї були дезактивовані. Прикладом методик, які можуть застосовуватися для отримання таких антитіл, описані у патентах США: 6150584; 6458592; 6420140, які включені у цей документ повністю за допомогою посилання.

Відповідно до деяких варіантів реалізації отримані антитіла не викликають згубної імунної відповіді у тварини, що підлягає лікуванню, наприклад, у людини. Відповідно до одного варіанту реалізації антигензв'язуючі поліпептиди, їх варіанти або похідні згідно 3 даним описом модифіковані для зниження імуногенності із застосуванням відомих у даній галузі техніки 60 методик. Наприклад, антитіла можуть бути гуманізовані, приматизовані, деімунізовані; або можуть бути отримані химерні антитіла. Зазначені типи антитіл походять з антитіла, отриманого не від людини, як правило, з антитіла миші або примата, яке зберігає або по суті зберігає антигензв'язуючі властивості вихідного антитіла, однак менш імуногенні у людини. Це може бути досягнуте різними способами, у тому числі шляхом (а) щеплення повних отриманих не від людини варіабельних доменів на константні області людини з отриманням химерних антитіл; (Б) щеплення щонайменше частини однієї або більше отриманих не від людини визначальних комплементарність областей (СОК) на каркасні та константні області людини зі збереженням або без збереження критично важливих залишків каркасних областей; або шляхом (с) трансплантації повних отриманих не від людини варіабельних доменів, але з "маскуванням" їх ділянкою, подібною ділянці людини, шляхом заміни поверхневих залишків. Такі способи розкриті у джерелах: Моіттізоп еї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 57: 6851-6855 (1984); Моттізоп єї аІ,, Адм. Іттипої. 44: 65-92 (1988); Меповєуеп еї аї., Зсієпсе 239: 1534-1536 (1988); Раадіап,

Моїес. Іттип. 25: 489-498 (1991); Радіап, Моїес. Іттип. 31: 169-217 (1994), та у патентах США

МоМо: 5585089, 5693761, 5693762 та 6190370, всі з яких повністю включені у цей документ за допомогою посилань.

Для зниження імуногенності антитіла може також застосовуватися деїмунізація. У цьому документі термін "деімунізація" включає зміну антитіла з модифікацією Т-клітинних епітопів (див., наприклад, опубліковані міжнародні заявки: УМО/9852976 А! та УМО/0034317 АЗ2).

Наприклад, аналізують варіабельні послідовності важких ланцюгів та варіабельні послідовності легких ланцюгів вихідного антитіла, та створюють "карту" Т-клітинних епітопів людини з кожної

М-області, яка відображає локалізацію епітопів відносно визначальних комплементарність областей (СОК) та інших ключових залишків у послідовності. Індивідуальні Т-клітинні епітопи з карти Т-клітинних епітопів аналізують для ідентифікації альтернативних замін амінокислот з низьким ризиком зміни активності отриманого антитіла. Розроблюють ряд послідовностей альтернативних варіабельних областей важких та легких ланцюгів, що містять комбінації замін амінокислот, та зазначені послідовності потім включають у ряд зв'язуючих поліпептидів. Як правило, отримують і тестують зв'язування та/або функції 12-24 варіантів антитіл. Після цього повні гени важких та легких ланцюгів, що містять модифіковані варіабельні та константні області людини, клонують у експресійні вектори, та отримані плазміди вводять у лінії клітин з отриманням повнорозмірного антитіла. Потім зазначені антитіла порівнюють, проводячи відповідні біохімічні та біологічні аналізи, та ідентифікують оптимальний варіант.

Специфічність зв'язування антигензв'язуючих поліпептидів згідно з даним описом може бути визначена із застосуванням аналізів іп міго, таких як імунопреципітація, радіоімунологічний аналіз (РІА) або ферментний імуносорбентний аналіз (ЕЕГ ІЗА).

Як варіант, описані методики одержання одноланцюгових одиниць (патент США Мо4694778;

Віго, Зсієпсе 242:423-442 (1988); Нивіоп вї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 55:5879-5883 (1988); та

Мага еї аї., Майте 334:544-554 (1989)) можуть бути адаптовані для одержання одноланцюгових одиниць згідно з даним описом. Одноланцюгові одиниці утворюються шляхом з'єднання фрагментів важких та легких ланцюгів ЕРм-області через амінокислотний місток, з одержанням одноланцюгового злитого пептиду. Можуть також застосовуватися методики зборки функціональних Еу-фрагментів у Е. соїї (5Кеїта єї аІ., зсіепсе 242: 1038-1041 (1988)).

Приклади методик, які можуть застосовуватися для одержання одноланцюгових Ем (зсЕм) та антитіл, включають описані у патентах США Ме4946778 та Мео5258498; Нивіоп еї аї!., Меїшйодв іп

Епгутоїоду 203:46-88 (1991); Зп! вї аї., Ргос. Май). сі. ОБА 90:1995-1999 (1993); та ЗКеїта еї аї.,

Зсіепсе 240:1038-1040 (1988). Для деяких варіантів застосування, у тому числі застосування антитіл іп мімо у людини та аналізів для детекції іп міго, може бути переважним застосування химерних антитіл, гуманізованих антитіл або антитіл людини. Химерне антитіло являє собою молекулу, різні частини антитіла у якій походять з різних видів тварин, наприклад, антитіла, що містять варіабельну область, яка походить з моноклонального антитіла миші, та константну область імуноглобуліну людини. Способи одержання химерних антитіл відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Моїтізоп, Зсіепсе 229:1202 (1985); ОЇ єї аІ., ВіоТесппіднез 4:214 (1986);

СіШев єї аї., У. Іттипої. Меїпод5 125:191-202 (1989); патенти США Ме5807715; Мо4816567; та

Мо4816397, які включені у даний документ повністю шляхом посилань.

Гуманізовані антитіла являють собою молекули антитіл, які походять з антитіла, отриманого від виду, що не є людиною, які зв'язують потрібний антиген, які містять одну або більше визначальних комплементарність областей (СОК) від виду, що не є людиною, та каркасні області з молекули імуноглобуліну людини. Часто каркасні залишки у каркасних областях людини замінюють на відповідний залишок СОК донорного антитіла для зміни, переважно, покращення зв'язування антигену. Зазначені заміни у каркасних областях ідентифікують із 60 застосуванням способів, добре відомих у даній галузі техніки, наприклад, моделюючи взаємодії

СОК та каркасних залишків для ідентифікації каркасних залишків, важливих для зв'язування антигену, та порівнюючи послідовності для ідентифікації незвичайних каркасних залишків у конкретних положеннях. (Див., наприклад, джерела: Оцееп еї аіЇ., патент США Мо 5585089;

Віесптапп еї аї., Мате 332:323 (1988), які включені у даний документ повністю шляхом посилань). Антитіла можуть бути гуманізовані із застосуванням різних методик, відомих у даній галузі техніки, включаючи, наприклад, щеплення СОМ (ЕР 239,400; РСТ-публікація УМО 91/09967; патенти США Ме5225539; Ме5530101; та Мео5585089), маскування або модифікацію поверхні (ЕР 592,106; ЕР 519,596; Радіап, МоїІесшаг Іттипоіоду 28(4/5):489-498 (1991); зіцапіска еї аї., Ргоївіп Епдіпеєегіпа 7(6):805-814 (1994); ВодивкКа. еї аї., Ргос. Маї). сі. О5А 91:969-973 (1994)), та перестановку ланцюгів (патент США Ме5565332, який включений у даний документ повністю шляхом посилання).

Застосування повністю людських антитіл, зокрема, бажане для терапевтичного лікування пацієнтів- людей. Антитіла людини можуть бути отримані різними способами, відомими у даній галузі техніки, у тому числі способами фагового дисплея із застосуванням бібліотек антитіл, що походять з послідовностей імуноглобулінів людини. Див. також патенти США Мо4444887 та

Мо4716111; та РСТ-публікації М/ЛО 98/46645, МО 98/50433, УМО 98/24893, МО 98/16654, УУО 96/34096, МО 96/33735, та МО 91/10741; кожне із зазначених джерел включене у даний документ повністю шляхом посилання.

Антитіла людини можуть також бути отримані із застосуванням трансгенних мишей, які можуть експресувати функціональні ендогенні імуноглобуліни, однак здатні експресувати гени імуноглобулінів людини. Наприклад, комплекси генів важких та легких ланцюгів імуноглобулінів людини можуть бути введені випадковим чином або шляхом гомологічної рекомбінації у ембріональні стовбурові клітини миші. Як варіант, варіабельна область, константна область та область різноманітності людини можуть бути введені у ембріональні стовбурові клітини миші поряд з генами людини важких та легких ланцюгів. Гени важких та легких ланцюгів імуноглобулінів миші можуть бути позбавлені функціональності, окремо або одночасно з введенням локусів імуноглобуліну людини шляхом гомологічної рекомбінації. Зокрема, гомозиготна делеція -Н-області запобігає продукуванню ендогенних антитіл. Модифіковані ембріональні стовбурові клітини розмножують та вводять шляхом мікроін'єкції у бластоцисти для отримання химерних мишей. Потім зазначених химерних мишей схрещують для отримання гомозиготного потомства, яке експресує антитіла людини. Зазначених трансгенних мишей імунізують звичайним способом обраним антигеном, наприклад, повним необхідним цільовим поліпептидом або його частиною. Моноклональні антитіла, спрямовані проти антигену, можуть бути отримані від імунізованих трансгенних мишей із застосуванням стандартної гібридомної технології. Трансгени імуноглобулінів людини, носіями яких є трансгенні миші, піддаються реаранжуванню під час диференціювання В-клітин, а потім проходять через перемикання класів та соматичний мутагенез. Відповідно, застосування такої методики дозволяє отримати терапевтично корисні антитіла Ідс, ДА, ДМ та ІДЕ. Загальну інформацію відносно зазначеної технології отримання антитіл людини можна знайти у джерелі: Гопрегд апа Низлаг Іпії. Неу.

Іттипої. 73: 65-93 (1995). Детальний опис зазначеної технології отримання антитіл людини та моноклональних антитіл людини, а також протоколи для отримання таких антитіл можна знайти, наприклад, у РСТ-публікаціях М/О 98/24893; УМО 96/34096; УМО 96/33735; патентах США

Мо5413923; Мо5625126; Мо5633425; Мо5569825; Мо5661016; Мо5545806; Мо5814318; та Мео5939598, які повністю включені у цей документ за допомогою посилань. Крім того, такі компанії як

Ардепіх, Іпс. (Фремонт, Каліфорнія) та СепРіагт (Сан-Хосе, Каліфорнія) можуть бути залучені для отримання антитіл людини, спрямованих проти обраного антигену, із застосуванням технології, аналогічної описаній вище.

Повністю людські антитіла, які розпізнають вибраний епітоп, можуть також бути отримані із застосуванням методики, що називається "спрямовуваним відбором". Відповідно до зазначеного підходу вибране отримане не від людини моноклональне антитіло, наприклад, антитіло миші, застосовують для того, щоб направляти відбір повністю людського антитіла, що розпізнає той же епітоп. (Чезрег5 еї аї., Віо/Гесппоїоду 72:899-903 (1988). Див. також патент

США Мо5565332, який включений повністю шляхом посилання.)

Згідно з іншим варіантом реалізації ДНК, що кодує необхідні моноклональні антитіла, може бути легко виділена та секвенована із застосуванням стандартних процедур (наприклад, шляхом застосування олігонуклеотидних зондів, які здатні до специфічного зв'язування з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл миші). Виділені та субклоновані гібридомні клітини служать у якості кращого джерела такої ДНК. Після виділення ДНК може бути поміщена у експресійні вектори, якими потім трансфікують прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяїни, 60 такі як клітини Е. соїї, клітини мавпи СО5, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або клітини мієломи, які у інших випадках не продукують імуноглобуліни. Конкретніше, виділена ДНК (яка може бути синтетичною відповідно з даним описом) може бути використана для клонування послідовностей константних та варіабельних областей для отримання антитіл згідно з описом у патенті США Ме5658570 (Меултап з співавторами), поданому 25 січня 1995 року, який у даний документ включений за допомогою посилання. По суті, це має на увазі екстракцію РНК з обраних клітин, перетворення у кКДНК та ампліфікацію за допомогою ПЛР із застосуванням Ід-специфічних праймерів. Підходящі для зазначеної мети праймери також описані у патенті США Ме5658570. Як більш детально обговорюється нижче, трансформовані клітини, які експресують потрібне антитіло, можуть бути вирощені у відносно великих кількостях для забезпечення клінічних та комерційних поставок імуноглобуліну.

Крім того, одна або більше областей СОК антигензв'язуючих поліпептидів згідно з даним описом можуть бути інсертовані, із застосуванням звичайних методик рекомбінантних ДНК, у каркасні області, наприклад, у каркасні області людини для гуманізації отриманого не від людини антитіла. Каркасні області можуть бути представлені консенсусними каркасними областями або каркасними областями, що зустрічаються у природі, переважно - каркасними областями людини (див., наприклад, перелік каркасних областей людини у джерелі: Споїпіа еї а. у. Мої. ВіоЇ. 278: 457-479 (1998))» Переважно, полінуклеотид, отриманий шляхом комбінування каркасних областей та СОМ, кодує антитіло, яке специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом необхідного поліпептиду, наприклад, ГІОНТ. Переважно, у каркасні області можуть бути введені одна або більше замін амінокислот, та переважно зазначені заміни амінокислот покращують зв'язування зазначеного антитіла з його антигеном.

Крім того, такі способи можуть застосовуватися для отримання замін амінокислот або делецій одного або більше залишків цистеїну варіабельної області, які беруть участь в утворенні внутрішньоланцюгового дисульфідного зв'язку, з отриманням молекул антитіла, позбавлених одного або більше внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків. Інші зміни полінуклеотиду також передбачені цим винаходом та відомі у даній галузі техніки.

Крім того, можуть застосовуватися методики, розроблені для одержання "химерних антитіл" (Моїгтізоп еї аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА:851-855 (1984); Меибегдег єї аї!., Маїште 372:604-608 (1984); ТаКеда еї аї!., Маїште 314:452-454 (1985)) шляхом сплайсингу генів з молекули антитіла миші з підходящою антигенною специфічністю разом з генами з молекули антитіла людини з підходящою біологічною активністю. У цьому документі химерне антитіло являє собою молекулу, різні частини якої походять з різних видів тварин, наприклад, молекули, які містять варіабельну область, що походить з моноклонального антитіла миші, та константну область імуноглобуліну людини.

Ще один високоефективний спосіб одержання рекомбінантних антитіл описаний у джерелі:

Мемлтап, Віоїєесппоіоду 10: 1455-1460 (1992). Зокрема, зазначена методика забезпечує одержання приматизованих антитіл, які містять варіабельні домени мавпи та константні послідовності людини. Зазначене джерело повністю включено шляхом посилання у даний документ. Крім того, зазначена методика також описана у патентах США Мо 5658570, Мо 5693780 та Мо 5756096, що належать одному правовласнику, кожен з яких включений у даний документ шляхом посилання.

Як варіант, продукуючі антитіло лінії клітин можуть бути вибрані та культивовані із застосуванням методик, добре відомих спеціалісту. Такі методики описані у різних лабораторних настановах та основних публікаціях. При цьому методики, які підходять для описаного нижче застосування у відповідності з даним винаходом, приведені у джерелі: Сиггепі

Ргоюосоїв5 іп Іттипоїіоду, Соїїдап еї аї!., Ед5., Стееп Рибіїєпіпуд Авзосіаїе5з апа УМіеу-Іпіегв5сівепсе,

Мем мок (1991), який включений у даний документ повністю шляхом посилання, включаючи додатки.

Крім того, для введення мутацій у послідовність нуклеотидів, що кодує антитіло згідно з даним описом, які приводять до замін амінокислот, можуть застосовуватися стандартні методики, відомі спеціалістам у даній галузі техніки, у тому числі, але не обмежуючись перерахованими, сайт-специфічний мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Переважно, варіанти (у тому числі похідні) кодують менше ніж 50 замін амінокислот, менше ніж 40 замін амінокислот, менше ніж 30 замін амінокислот, менше ніж 25 замін амінокислот, менше ніж 20 замін амінокислот, менше ніж 15 замін амінокислот, менше ніж 10 замін амінокислот, менше ніж 5 замін амінокислот, менше ніж 4 заміни амінокислот, менше ніж З заміни амінокислот або менше ніж 2 заміни амінокислот відносно референсної варіабельної області важкого ланцюгу,

СОоВв-НІ, СОВ-Н2г, СОВ-НЗ, варіабельної області легкого ланцюгу, СОК-І 1, СОВ-12 або СОК-Ї 3.

Як варіант, мутації можуть бути введені випадковим чином протягом всієї кодуючої 60 послідовності або її частини, наприклад, за допомогою насичуючого мутагенезу, та може бути проведений скринінг отриманих мутантів на біологічну активність для ідентифікації мутантів, що зберігають активність.

Лікування раку

Згідно з описом у даному документі антитіла, їх варіанти або похідні у відповідності з даним винаходом можуть застосовуватися у певних способах лікування та діагностики.

Цей винахід відноситься також до терапії на основі антитіл, що включає введення антитіл згідно з даним описом пацієнтові, наприклад, тварині, ссавцю та людині, для лікування одного або більше з розладів або станів, описаних у цьому документі. Терапевтичні сполуки згідно з даним описом включають, що не обмежуючись перерахованими, антитіла згідно з даним описом (у тому числі їх варіанти та похідні згідно з описом у цьому документі), а також нуклеїнові кислоти або полінуклеотиди, що кодують антитіла згідно з даним описом (у тому числі їх варіанти та похідні згідно з описом у цьому документі).

Антитіла згідно з даним описом можуть також застосовуватися для лікування або інгібування раку. РО-Ї1 може надмірно експресуватися у пухлинних клітинах. РО-І1, що походить з пухлини, може зв'язувати з РО-1 на імунних клітинах, обмежуючи таким чином протипухлинний Т-клітинний імунітет. Результати застосування низькомолекулярних інгібіторів або моноклональних антитіл, націлених на РО-Ї1, у моделях пухлин на мишах показують, що націлена на РО-11 терапія є важливою альтернативою та являє собою реалістичний підхід до ефективного контролю росту пухлини. Як продемонстровано у експериментальних прикладах, антитіла проти РО-11 активували механізми адаптивної імунної відповіді, що може призводити до поліпшеного виживання у хворих на рак пацієнтів.

Відповідно, згідно з деякими варіантами реалізації запропоновані способи лікування раку у пацієнта, який цього потребує. Зазначений спосіб, відповідно до одного варіанту реалізації, має на увазі введення зазначеному пацієнту ефективної кількості антитіла згідно з даним описом.

Відповідно до деяких варіантів реалізації щонайменше одна з ракових клітин (наприклад, стромальних клітин) у пацієнта експресує, надлишково експресує або індукована, щоб експресувати РО-11. Індукція експресії РО-Ї1, наприклад, може бути проведена шляхом введення протипухлинної вакцини або проведення радіаційної терапії.

Пухлини, які експресують білок РО-І1, включають рак сечового міхура, недрібноклітинний

Ко) рак легені, рак нирок, рак молочної залози, рак уретри, рак ободової та прямої кишки, рак голови та шиї, плоскоклітинний рак, карциному з клітин Меркеля, рак шлунково-кишкового тракту, рак шлунку, рак стравоходу, рак яєчників, рак нирок та дрібноклітинний рак легені.

Відповідно, запропоновані у відповідності з даним винаходом антитіла можуть застосовуватися для лікування будь-якого одного або більше з таких видів раку.

Також у відповідності з даним винаходом запропонована клітинна терапія, наприклад, терапія із застосуванням Т-клітинних химерних антигенних рецепторів (САК). Може застосовуватися відповідна клітина, яку приводять у контакт з антитілом проти РО-І1 у відповідності з даним описом (або, як варіант, сконструйована таким чином, щоб експресувати антитіло проти РО-1І1 у відповідності з даним описом). Після такого контакту або конструювання клітина може бути, відповідно, введена страждаючому на рак пацієнту, який потребує лікування.

У зазначеного пацієнта, що страждає на рак, може спостерігатися рак будь-якого типу з описаних у цьому документі. Клітина (наприклад, Т-клітина) може являти собою, наприклад, інфільтруючий пухлину Т-лімфоцит, СО4-Т-клітину, СОд8ж-Т-клітину або комбінацію перерахованих клітин, без обмеження.

Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена клітина була виділена власно з організму пацієнта, що страждає на рак. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена клітина була отримана від донора або з банку клітин. Якщо клітину виділяють з організму пацієнта, що страждає на рак, небажані імунні реакції можуть бути мінімізовані.

Додаткові захворювання або стани, асоційовані з підвищеною виживаністю клітин, лікування, запобігання, діагностика та/або прогнозування яких може бути проведене із застосуванням антитіл або їх варіантів або похідних відповідно до даного опису, включають, не обмежуючись перерахованими, прогресування та/або метастазування злоякісних новоутворень та пов'язаних з ними розладів, таких як лейкоз (у тому числі гострий лейкоз (наприклад, гострий лімфоцитарний лейкоз, гострий мієлоцитарний лейкоз (у тому числі мієлобластний, промієлоцитарний, мієломоноцитарний, моноцитарний лейкоз та еритролейкоз)) та хронічні лейкози (наприклад, хронічний мієлоцітарний (гранулоцитарний) лейкоз та хронічний лімфоцитарний лейкоз)), справжня поліцитемія, лімфоми (наприклад, хвороба Ходжкіна та неходжкінські лімфоми), множинна мієлома, макроглобулінемія Вальденстрема, хвороба важких ланцюгів та солідні пухлини, у тому числі, не обмежуючись перерахованими, саркоми та 60 карциноми, такі як фібросаркома, міксосаркома, ліпосаркома, хондросаркома, остеогенна саркома, хордома, ангіосаркома, ендотеліосаркома, лімфангіосаркома, лімфангіоендотеліосаркома, синовіома, мезотеліома, пухлина Юінга, лейоміосаркома, рабдоміосаркома, карцинома товстої кишки, рак підшлункової залози, рак молочної залози, рак щитовидної залози, рак ендометрію, меланома, рак передміхурової залози, рак яєчників, рак передміхурової залози, плоскоклітинна карцинома, базально-клітинна карцинома, аденокарцинома, карцинома потових залоз, карцинома сальних залоз, папілярна карцинома, папілярні аденокарциноми, цистаденокарциноми, медулярна карцинома, бронхогенна карцинома, нирковоклітинний рак, гепатома, карцинома жовчної протоки, хоріокарцинома, семінома, ембріональна карцинома, пухлина Вільмса, рак шийки матки, пухлина яєчка, карцинома легені, дрібноклітинна карцинома легені, карцинома сечового міхура, епітеліальна карцинома, гліома, астроцитома, медуллобластома, краніофарингіома, епендимома, пінеалома, гемангіобластома, акустична невринома, олігодендрогліома, менінгіома, меланома, нейробластома та ретинобластома.

Варіанти комбінованої терапії

Згідно з додатковим варіантом реалізації композиції у відповідності з даним описом вводять у комбінації з антинеопластичним агентом, противірусним агентом, антибактеріальним або антибіотичним агентом або антимікотичними агентами. Кожен із зазначених агентів, відомих у даній галузі техніки, може бути введений у композиції у відповідності з даним винаходом.

Згідно з іншим варіантом реалізації композиції у відповідності 3 даним описом вводять у комбінації з хіміотерапевтичним агентом. Хіміотерапевтичні агенти, які можуть бути введені з композиціями у відповідності 3 даним описом, включають, не обмежуючись перерахованими, похідні антибіотиків (наприклад, доксорубіцин, блеоміцин, даунорубіцин та дактиноміцин); антиестрогени (наприклад, тамоксифен); антиметаболіти (наприклад, фторурацил, 5-РИ, метотрексат, флоксуридин, інтерферон альфа-2р, глутамінову кислоту, плікаміцин, меркаптопурин та б6-тіогуанін); цитотоксичні агенти (наприклад, кармустин, ВСМИ, ломустин,

ССМИ, цитозинарабінозид, циклофосфамід, естрамустин, гідроксисечовину, прокарбазин, мітоміцин, бусульфан, цисплатин та сульфат вінкристину); гормони (наприклад, медроксипрогестерон, естрамустину натрію фосфат, етинілестрадіол, естрадіол, мегестролу ацетат, метилтестостерон, діетилстильбестрол дифосфат, хлортрианізен та тестолактон); похідні мустаргену (наприклад, мефален, хлорамбуцил, мехлоретамін (мустарген) та тіотепа); стероїди та їх комбінації (наприклад, бетаметазону натрію фосфат); та інші (наприклад, дикарбазин, аспарагіназа, мітотан, сульфат вінкристину, сульфат вінбластину та етопозид).

Відповідно до додаткового варіанту реалізації композиції згідно з даним описом вводять у комбінації з цитокінами. Цитокіни, які можуть бути введені з композиціями згідно з даним описом, включають, не обмежуючись перерахованими, ІЛ-2, ІЛ-3, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-б6, ІЛ-7, ІЛ-10, ІЛ- 12, ІЛ-13, ІЛ-15, анти-СО040, СО40їЇ. та ФНО-а.

Відповідно до додаткових варіантів реалізації композиції згідно з даним описом вводять у комбінації з іншими терапевтичними або профілактичними режимами, такими як, наприклад, променева терапія.

Також запропоновані варіанти комбінованої терапії, яка включає застосування одного або більше з антитіл проти РО-Ї1 згідно з даним описом разом з другим протираковим (хіміотерапевтичним) агентом. Хіміотерапевтичні агенти можуть бути розподілені у відповідності з їх механізмом дії, наприклад, у наступні групи: - антиметаболіти/протиракові агенти, такі як аналоги піримідинів флоксуридин, капецитабін та цитарабін; - аналоги пуринів, антагоністи фолатів та споріднені з ними інгібітори; - антипроліферативні/антимітотичні агенти, у тому числі природні продукти, такі як алкалоїд барвінку (вінбластин, вінкристин), та діючі на мікротрубочки агенти, такі як таксан (паклітаксел, доцетаксел), вінбластин, нокодазол, епотилони, вінорелбін (НАВЕЛЬБІНУ), та епіподофілотоксини (етопозид, теніпозид); - пошкоджуючі ДНК агенти, такі як актиноміцин, амсакрин, бусульфан, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид (цитоксан, СУТОХАМУ), дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, епірубіцин, іфосфамід, мелфалан, мехлоретамін, мітоміцин, мітоксантрон, нітрозосечовина, прокарбазин, таксол, таксотер, теніпозид, етопозид та триетилентіофосфорамід; - антибіотики, такі як дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, ідарубіцин, антрацикліни, мітоксантрон, блеоміцини, плікаміцин (мітраміцин) та мітоміцин; - ферменти, такі як І -аспарагіназа, яка системно метаболізує І -аспарагін та позбавляє його клітини, які не мають здатності синтезувати власний аспарагін; 60 - антитромбоцитарні агенти;

- антипроліферативні/антимітотичні алкілуючі агенти, такі як мустаргени циклофосфамід та аналоги (мелфалан, хлорамбуцил, гексаметилмеламін та тіотепа), алкілнітрозосечовини (кармустин) та аналоги, стрептозоцин та триазени (дакарбазин); - антипроліферативні/"антимітотичні антиметаболіти, такі як аналоги фолієвої кислоти (метотрексат); - координаційні комплекси платини (цисплатин, оксаліплатин та карбоплатин), прокарбазин, гідроксисечовина, мітотан та аміноглутетимід; - гормони, аналоги гормонів (естроген, тамоксифен, гозерелін, бікалутамід та нілутамід), та інгібітори ароматази (летрозол та анастрозол); - антикоагулянти, такі як гепарин, синтетичні солі гепарину та інші інгібітори тромбіну; - фібринолітичні агенти, такі як тканинний активатор плазміногену, стрептокіназа, урокіназа, аспірин, дипіридамол, тиклопідин та клопідогрел; - перешкоджаючі міграції агенти; - антисекреторні агенти (брефельдин); - імуносупресивні речовини такролімус, сіролімус, азатіоприн та мікофенолат; - сполуки (ТМР-470, геністеїн) та інгібітори факторів росту (інгібітори фактору росту ендотелію судин та інгібітори фактору росту фібробластів); - блокатори ангіотензинових рецепторів, донори оксиду азоту; - антисмислові олігонуклеотиди; - антитіла, такі як трастузумаб та ритуксимаб; - інгібітори клітинного циклу та індуктори диференціювання, такі як третиноїн; - інгібітори, інгібітори топоіїзомерази (доксорубіцин, даунорубіцин, дактиноміцин, еніпозид, епірубіцин, етопозид, ідарубіцин, іринотекан, мітоксантрон, топотекан та іринотекан) та кортикостероїди (кортизон, дексаметазон, гідрокортизон, метилпреднізолон, преднізон та преднізолон); - інгібітори кіназ передачі сигналів факторів росту; - індуктори дисфункції; - токсини, такі як холерний токсин, рицин, Рзхендотопаб5 екзотоксин, аденілатциклазний токсин ВогаеєїеїЇа репивві5, дифтерійний токсин та активатори каспази;

Ко) - та хроматин.

Додаткові приклади хіміотерапевтичних агентів включають: - алкілуючі агенти, такі як тіотепа та циклофосфамід (СУТОХАМ); - алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан та піпосульфан; - азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа та уредопа; - оетиленаміни та метиленаміни, у тому числі алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід та триметилолмеламін; - ацетогеніни, зокрема, буллатацин та буллатацинон; - камптотецин, у тому числі синтетичний аналог топотекану; - бріостатин; - калістатин; - б0-1065, у тому числі його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин та бізелесин; - криптофіцини, зокрема, криптофіцин 1 та криптофіцин 8; - доластатин; - дуокарміцин, у тому числі синтетичні аналоги КУУ-2189 та СВІ-ТМІ; - елеутеробін; - панкратистатин; - саркодиктиїн; - спонгістатин; - мустаргени, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, циклофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміноксиду гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід та урамустин; - нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин та ранімустин; - антибіотики, такі як ендіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема, каліхеаміцин гамма-!!Ї та каліхеаміцин рії), динеміцин, включаючи динеміцин А, бісфосфонати, такі як клодронат, еспераміцин, неокарциностатин з хромофором та споріднені ендіїнові антибіотики- хромопротеїни з хромофорами, аклациноміцини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, сактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-І -норлейцин, доксорубіцин (у тому числі морфоліно- 60 доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2-піроліно-доксорубіцин та дезоксидоксорубіцин),

епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марселломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин с, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, порфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин та зорубіцин; - антиметаболіти, такі як метотрексат та 5-фторурацил (5-Е)); - аналоги фолієвої кислоти, такі як демоптерин, метотрексат, птероптерин та триметрексат; - аналоги пуринів, такі як рлударабін, б-меркаптопурин, тіаміприн та тіогуанін; - аналоги піримідинів, такі як анцитабін, азацитидин, б-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін та флоксуридин; - андрогени, такі як калустерон, дромостанолон пропіонат, епітіостанол, мепітіостан та тестолактон; - пригнічуючі функції наднирковиків засоби, такі як аміноглутетимід, мітотан та трилостан; - поповнювачі фолієвої кислоти, такі як фролінова кислота; - трихотецини, зокрема, токсин Т-2, верракурин А, роридин А та ангідин; -таксоїди, такі як паклітаксел (ТАХОЇ У) та доцетаксел (ТАКСОТЕРУ); - аналоги платини, такі як цисплатин та карбоплатин; - ацеглатон; альдофосфамід глікозид; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бізантрен; едатрексат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; ефлорнітин; елліптинію ацетат; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лейковорин; лонідамін; мейтансиноїди, такі як майтансин та ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; фторпіримідин; фолінову кислоту; подофілінову кислоту; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахарид-К (РУК); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,22"7- трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; манномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); циклофосфамід; тіотепа; хлорамбуцил; гемцитабін (аЕМ72АНРУ); б6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; вінбластин; платину; етопозид (МР-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін (навельбін, МАМЕЇВІМЕ?У); новантрон; теніпозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгібітор топоїзомерази КЕЗ 2000; дифторметилорнітин (ОЕМО); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін; РОЇ РІКІ (фторурацил, лейковорин та іринотекан); - та фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з перерахованих вище.

Також визначенням "хіміотерапевтичного агенту" охоплені антигормональні агенти, такі як антиестрогени та селективні модулятори естрогенових рецепторів (ЗЕРЕМ), інгібітори ферменту ароматази, антиандрогени, а також фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь- якого з перерахованих вище, які регулюють або інгібують дію гормонів на пухлини.

Приклади антиестрогенів та 5ЕКМ включають, наприклад, тамоксифен (у тому числі нольвадекс, МОЇ МАБЕХ"М), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, І У117018, онапристон та тореміфен (фарестон, РАВЕБТОМЄ).

Інгібітори ферменту ароматази регулюють продукування естрогену наднирковими залозами.

Приклади включають 4(5)-імідазоли, аміноглутетимід, мегестрол ацетат (мегейс, МЕСАСЕЗ), ексеместан, форместан, фадрозол, ворозол (ривізор, КІМІЗОК-У), летрозол (фемара, РЕМАКАЗ?) та анастрозол (аримідекс, АКІМІОЕХ).

Приклади антиандрогенів включають флутамід, нілутамід, бікалутамід, лейпролід та гозерелін.

Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають антиангіогенні агенти, у тому числі, однак не обмежуючись перерахованими, ретиноєву кислоту та її похідні, 2-метоксиестрадіол, ангіостатин (АМОСІОЗТАТІМУ), ендостатин (ЕМООБ5ТАТІМУ), сурамін, скваламін, тканинний інгібітор металопротеїнази-1ї, тканинний інгібітор металопротеїнази-2, інгібітор активатора плазміногену-!1, інгібітор активатора плазміногену-2, хрящовий інгібітор, паклітаксел (наб- паклітаксел), тромбоцитарний фактор 4, сульфат протаміну (клупеїн), сульфатовані похідні хітину (отримані з панцирів краба-стригуна), комплекс сульфатованих полісахаридів з пептидогліканами (5р-рд), стауроспорин, модулятори матриксного метаболізму, у тому числі аналоги проліну ((І-ацетидин-2-карбонова кислота (ГАСА)), цисгідроксипролін, а, 1-3,4- дегідропролін, тіапролін, сс'-дипіридил, бета-амінопропіонітрилфумарат, 4-пропіл-5-(4- піридиніл)-2(3Н)-оксазолон, метотрексат, мітоксантрон, гепарин, інтерферони, сироватковий 2- макроглобулін, інгібітор металопротеїнази-3 курки (СПІМР-3), хімостатин, бета- циклодекстринтетрадекасульфат, епонеміцин, фумагіллін, ауротіомалат натрію, а- пеніцилламін, сироваткову бета-1-антиколагеназу, альфа-2-антиплазмін, бізантрен, лобензарит динатрію, динатрієву сіль н-2-карбоксифеніл-4-хлорантранілової кислоти, або "ССА", талідомід, 60 ангіостатичний стероїд, карбоксиаміноїмідазол та інгібітори металопротеїнази, такі як ВВ-94.

Інші антиангіогенні агенти включають антитіла, переважно моноклональні антитіла проти зазначених ангіогенних факторів роста: бета-ФРФ, альфа-ФРФ, ФРФ-5, ізоформ ФРЕС, ФРЕС-

С, ФРГ/5Е та Апд-1/Апо-2.

Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають антифібротичні агенти, у тому числі, не обмежуючись перерахованими, такі сполуки, як бета-амінопропіонітрил (ВАРМ), а також сполуки, розкриті у патенті США Мо 4965288 (Райгеутап, еї аІ.), що відноситься до інгібіторів лізилоксидази та їх застосування у лікуванні захворювань та станів, асоційованих з аномальним відкладенням колагену, та у патенті США Мо 4997854 (Кадап еї аїЇ.), що відноситься до інгібуючих Г ОХ сполук для лікування різних патологічних фіброзних станів, які включені у даний документ шляхом посилання. Додаткові приклади інгібіторів описані у патенті США Мо 4943593 (Райгеутап еї а), що відноситься до сполук, таких як 2-ізобутил-З3-фтор-, хлор- або бром- аліламін, патентах США Мо 5021456 (Райгеутап еї а!.), Ме 5059714 (Райгеутап еї аї.), Мо 5120764 (Мсосапнпу еї аІ.), Ме 5182297 (Райгеутап еї а!), Мо 5252608 (Райгеутап еї аї.), що відносяться до 2-(1-нафтилоксиметил)-3-фтораліламінів; та публікації США Мо2004/0248871 (Рагіапеї єї а!ї.), які включені у даний документ шляхом посилання.

Приклади антифібротичних агентів також включають первинні аміни, які вступають у реакції з карбонільною групою активного сайту лізилоксидаз, та, конкретніше, ті, які продукують, після зв'язування з карбонілом, продукт, що стабілізується резонансом, такі як наступні первинні аміни: етилендіамін, гідразин, фенілгідразин та їх похідні; семікарбазид та похідні сечовини; амінонітрили, такі як ВАРМ або 2-нітроетиламін; ненасичені або насичені галоаміни, такі як 2- бром-етиламін, 2-хлоретиламін, 2-трифторетиламін, З-бромпропіламін та п-галобензиламіни; та селеногомоцистеїнлактон.

Інші антифібротичні агенти представлені мідь-хелатуючими агентами, що проникають або не проникають у клітини. Приклади сполук включають непрямі інгібітори, які блокують похідні альдегідів, які отримують шляхом окисного дезамінування залишків лізилу та гідроксилізилу лізилоксидазами. Приклади включають тіоламіни, зокрема, О-пеніциламін та його аналоги, такі як о 2-аміно-5-меркапто-5-метилгексанова кислота, О-2-аміно-3-метил-3-(2-ацетамідоетил)- дитіо)бутанова кислота, п-2-аміно-3-метил-3-(2-аміноетил)дитіо)бутанова кислота, натрій-4-((п- 1-диметил-2-аміно-2-карбоксиетил)дитіо)бутансульфурат, 2-ацетамідоетил-2-ацетамідо- етантіолсульфанат та тригідрат натрій-4-меркаптобутансульфінату.

Приклади хіміотерапевтичних агентів також включають імунотерапевтичні агенти, у тому числі терапевтичні антитіла, які підходять для лікування пацієнтів, не обмежуючись наведеними. Деякі приклади терапевтичних антитіл включають симтузумаб, абаговомаб, адекатумумаб, афутузумаб, алемтузумаб, альтумомаб, аматуксимаб, анатумомаб, арцитумомаб, бавітуксимаб, бектумомаб, бевацизумаб, біватузумаб, блінатумомаб, брентуксимаб, кантузумаб, катумаксомаб, цетуксимаб, цитатузумаб, циксутумумаб, кліватузумаб, конатумумаб, даратумумаб, дрозитумаб, дуліготумаб, дузигітумаб, детумомаб, дацетузумаб, далотузумаб, екромексимаб, елотузумаб, енситуксимаб, ертумаксомаб, етарацизумаб, фарлетузумаб, фіклатузумаб, фігітумумаб, фланвотумаб, футуксимаб, ганітумаб, гемтузумаб, гірентуксимаб, глембатумумаб, ібритутомаб, іговомаб, імгатузумаб, індатуксимаб, інотузумаб, інтетумумаб, іпілімумаб, іратумумаб, лабетузумаб, лексатумумаб, лінтузумаб, лорвотузумаб, лукатумумаб, мапатумумаб, матузумаб, мілатузумаб, мінретумомаб, мітумомаб, моксетумомаб, нарнатумаб, наптумомаб, нецитумумаб, німотузумаб, нофетумомаб, окаратузумаб, офатумумаб, оларатумаб, онартузумаб, опортузумаб, ореговомаб, панітумумаб, парсатузумаб, патритумаб, пемтумомаб, пертузумаб, пінтумомаб, притумумаб, ракотумомаб, радретумаб, рилотумумаб, ритуксимаб, робатумумаб, сатумомаб, сибротузумаб, силтуксимаб, солітомаб, такатузумаб, таплітумомаб, тенатумомаб, тепротумумаб, тигатузумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тукотузумаб, ублітуксимаб, велтузумаб, ворсетузумаб, вотумумаб, залутумумаб,

СС49 та ЗЕ8. Ритуксимаб може застосовуватися для лікування індолентного В-клітинного раку, у тому числі лімфоми маргінальної зони, макроглобулінемії Вальденстрема (М/М), ХЛЛ та дрібноклітинної лімфоцитарної лімфоми. Зокрема, ефективна комбінація ритуксимабу та агентів для хіміотерапії.

Приведені приклади терапевтичних антитіл можуть бути додатково помічені або скомбіновані з частинкою-радіоізотопом, такою як індій-111, їтрий-90 або йод-131.

Відповідно до одного варіанту реалізації додатковий терапевтичний агент являє собою алкілуючий агент - мустарген. Необмежуючі приклади алкілуючих агентів - мустаргенів включають хлорамбуцил.

Відповідно до одного варіанту реалізації сполуки та композиції, описані у даному документі, можуть застосовуватися разом або бути скомбіновані з одним або більше додатковими 60 терапевтичними агентами. Зазначені один або більше терапевтичних агентів включають, не обмежуючись перерахованими, інгібітор АБІ, активовану кіназу СОС (АСК), аденозиновий рецептор А2В (А2В), кіназу, що регулює сигнал апоптозу (А5К), аврора-кіназу, тирозинкіназу

Брутона (ВТК), бромодомен ВЕТ (ВКО), такий як ВКО4, с-Кії, с-Меї, СОК-активуючу кіназу (САК), кальмодулін-залежну протеїнкіназу (СамкК), циклін-залежну кіназу (СОК), казеїнкіназу (СК), рецептор домена дискоїдину (ОВ), рецептори епідермального фактору росту (рЕФР), кіназу фокальної адгезії (РАК), РІЇ-3, ЕУМ, кіназу глікогенсинтази (ОК), НСК, гістондеацетилазу (НОАС), ІКК, таку як ІККрє, ізоцитратдегідрогеназу (ІДГ), таку як ІДГІ1, Янус-кіназу (ФАК), КОК, лімфоцит-специфічну тирозинову протеїнкіназу (СК), білок лізилоксидазу, подібний лізилоксидазі білок (ОХ), І УМ, матриксну металопротеїназу (ММР), МЕК, мітоген-активовану протеїнкіназу (МАРК), МЕКО, МРМ-АЇГК, кіназу р38, тромбоцитарний фактор росту (ТРФ), кіназу фосфорилази (РК), РоІо-подібну кіназу (РІК), фосфатидилінозитол-З-кіназу (РІЗК), протеїнкіназу (РК), таку як протеїнкіназа А, В та/або С, РУК, тирозинкіназу селезінки (ЗУК), серін/треонінову кіназу ТРІ2, серін/треонінову кіназу ЗК, фактор передачі сигналу та транскрипції (ТАТ), ЗКС, серін/треонінову протеїнкіназу (ТВК), таку як ТВКІ1, ТІЕ, тирозинкіназу (ТК), рецептор фактору росту ендотелію судин (МЕСЕК), МЕЗ або будь-яку комбінацію перерахованого.

Інгібітори А5К включають інгібітори А5К1. Приклади інгібіторів А5КІ включають описані у

УМО 2011/008709 (Сійеай бсіепсе5) та УМО 2013/112741 (Сіеєай 5сіепсе5), однак не обмежені ними.

Приклади інгібіторів ВТК включають ібрутиніб, НМ71224, ОМО-4059 та СС-292, однак не обмежені перерахованими.

Інгібітори 0ОК включають інгібітори ООМК1 та/лабо 0ОМ2. Приклади інгібіторів СО включають, не обмежуючись перерахованими, розкриті у МО 2014/047624 (Сіеай 5сієепсе5), О5 2009/0142345 (Такеда РНнаптасешіса)), 05 2011/0287011 (Опсотей РНаптасешіса!5), МО 2013/027802 (Спидаі Рнаптасешцшіісаї) та УМО 2013/034933 (Ітрегіа! Іппомайіоп5).

Приклади інгібіторів НОАС включають, не обмежуючись перерахованими, прациностат та панобіностат.

Інгібітори ЗАК інгібують УЗАКТ, УАК2 та/або ХАКЗ. Приклади інгібіторів "АК включають, не обмежуючись перерахованими, філготиніб, руксолітиніб, федратиніб, тофацитиніб, барицитиніб, лестауртиніб, пакритиніб, ХІГ019, А2О1480, ІМСВОЗ39110, І 2784544, ВМ5911543 та М5О18.

Інгібітори ГОХІ. включають інгібітори ГОХІ1, ГОХІ2, І ОХІ З, І ОХ 4 та/або І ОХІ 5. Приклади інгібіторів ГОХІ включають, не обмежуючись перерахованими, антитіла, описані у УМО 2009/017833 (Аїтевіо Віозсієпсев).

Приклади інгібіторів І ОХІ 2 включають, не обмежуючись перерахованими, антитіла, описані у УМО 2009/017833 (Аггевіо Віоб5сіепсе5), УМО 2009/035791 (Аггево Віозсіепсе5) та УМ 2011/097513 (Сіїєаа Віоіодісв).

Інгібітори ММР включають інгібітори ММР1-10. Приклади інгібіторів ММРО включають, не обмежуючись перерахованими, маримастат (88-2516), ципемастат (Ко 32-3555), та описані у

МО 2012/027721 (Сіїєаа Віоіодісв).

Інгібітори РІЗК включають інгібітори РІЗКУ, РІЗКО, РІЗКВД, РІЗКа та/або пан-РІЗК. Приклади інгібіторів РІЗК включають, не обмежуючись перерахованими, вортманнін, ВКМ120, СН5У132799,

ХІ 756 та ОЮС-0980.

Приклади інгібіторів РІЗКУ включають, не обмежуючись перерахованими, 257т7К474,

АБЗ252424, 1 294002 та ТО100115.

Приклади інгібіторів РІЗКО включають, не обмежуючись перерахованими, РІЗК ІІ, ТО-1202,

АМа-319, й5К2269557, Х-339, Х-414, АВРБОЗО, КАВА141, ХІ 499, ОХМУ1114А, ІРІ-145, ІРІ-443, та сполуки, описані у УМО 2005/113556 (1005), МО 2013/052699 (Сіїєай Саїївіода), УМО 2013/116562 (Сієай Саїївіюда), УМО 2014/100765 (СіІеай Саїївіода), УМО 2014/100767 (Сйеаа Саїїсода) та МО 2014/201409 (Сіїєайд 5сієпсев).

Приклади інгібіторів РІЗКВД включають, не обмежуючись перерахованими, 55К2636771, ВАУ 10824391 та ТОХ221.

Приклади інгібіторів РІЗКа включають, не обмежуючись перерахованими, бупарлісиб, ВАХ 80-6946, ВМІ 719, РХ-866, НСИ7604, МІ М1117, М/Х-037, АЕ7/А-129 та РА799.

Приклади інгібіторів пан-РІЗК включають, не обмежуючись перерахованими, 1294002,

ВЕ2235, ХІ 147 (БАК245408) та СЮС-0941.

Приклади інгібіторів ХУК включають, не обмежуючись перерахованими, таматиніб (К406), фостаматиніб (К788), РКТО62607, ВАМ-61-3606, ММР-ОАВ 205 АА, К112, КЗ343; та описані у патенті США Мо:8450321 (Сієай Соппесіїсий. 60 ТКІ можуть бути націлені на рецептори епідермального фактору росту (рЕФР) та рецептори

Зо фактору росту фібробластів (ФРФ), тромбоцитарного фактору росту (ТРФ) та фактору росту ендотелію судин (ФРЕС). Приклади ТКІ, націлених на рЕФР, включають, не обмежуючись перерахованими, гефінитіб та ерлотиніб. Сунітиніб являє собою необмежуючий приклад ТКІ, націленого на рецептори ФРФ, ТРФ та ФРЕС.

Антитіла проти РО-1І1 згідно з даним описом можуть застосовуватися, відповідно до деяких варіантів реалізації, разом з інгібітором імунних контрольних точок. Контрольні точки імунної відповіді являють собою молекули імунної системи, які або включають сигнал (костимулюючі молекули), або виключають сигнал (коінгібувальні молекули). Багато видів раку захищаються від імунної системи, інгібуючи Т-клітинний сигнал за рахунок агоніста для коінгібувальних молекул або антагоніста для костимулюючих молекул. Агоніст або антагоніст контрольних точок імунної відповіді може сприяти зупинці такого захисного механізму у клітинах. Агоніст або антагоніст контрольних точок імунної відповіді може бути націлений на будь-яку одну або більше з наступних молекул контрольних точок: РО-1, СТІ А-4, І Да-3 (також відомий як СО223), бр28, 00122, 4-188 (також відомий як СО137), ТІМЗ3, ОхХ-40/0Х401, Сбр40/С60401, ПСИНТ,

ІСОБЛСОЗБІ, СІТЕУСІТКІ,, ТІСІТ, СО27, МІЗТА, В7НЗ, В7Н4, НЕММ або ВТГА (також відомий як бОр272).

Білок програмованої смерті Т-клітин 1 (РО-1) являє собою трансмембранний білок, що виявляється на поверхні Т-клітин, зв'язування якого з лігандом програмованої смерті Т-клітин 1 (РО-І1) на пухлинних клітинах приводить до пригнічення Т-клітинної активності та зниження опосередкованої Т-клітинами цитотоксичності. Відповідно, РО-1 та РО-Ї17 являють собою знижуючі регулятори імунної системи, або "вимикачі" контрольних точок імунної відповіді.

Приклади інгібіторів РО-1 включають, без обмеження, ніволумаб, (Опдиво) (ВМ5-936558), пембролізумаб (Кітруда), підилізумаб, АМР-224, МЕ0ІО68О (АМР-514), РОВООТ, МРОЇ З280А,

МЕБОІ4736, ВМ5-936559 та М5ВО010718С.

СТІ А-4 являє собою білковий рецептор, який понижуюче регулює імунну систему.

Необмежуючі приклади інгібіторів СТІ А-4 включають іпілімумаб (Ервой) (також відомий як ВМ5- 734016, МОХ-010, МОХ-101) та тремелімумаб (раніше тицилімумаб, СР-675,206).

Ген активації лімфоцитів З ((АС-3) являє собою рецептор контрольної точки імунної відповіді поверхні клітин, який функціонує, пригнічуючи імунну відповідь за рахунок дії на клітини Тгед, а також за рахунок прямих ефектів на СО8--Т-клітини. Інгібітори І АС-3 включають, без обмеження, І Ас525 та ВМ5-986016.

СОр28 конститутивно експресується майже на всіх СО4Т-клітинах людини та приблизно на половині всіх СО8 Т-клітин, викликаючи розмноження Т-клітин. Необмежуючі приклади інгібіторів СО28 включають ТОМ1412.

СО0122 підвищує проліферацію СО8- ефекторних Т-клітин. Необмежуючі приклади включають МКТК-214. 4-188 (також відомий як СО137) залучений у проліферацію Т-клітин. Відомо також, що опосередкована СО137 сигналізація захищає Т-клітини та, зокрема, СО8-Т-клітини від індукованої активацією клітинної смерті. Прикладами інгібіторів СО137 є РЕ-05082566, урелумаб (8М5-663513) та ліпокалін.

При застосуванні будь-якого з перерахованих вище варіантів комбінованого лікування антитіло проти РО-І1 може вводитися одночасно з іншим протираковим агентом або окремо від нього. При введенні окремо антитіло проти РО-Ї1 може вводитися до або після іншого протиракового агенту.

Лікування інфекції

Як продемонстровано у експериментальних прикладах, антитіла згідно з даним описом можуть активувати імунну відповідь, яка, відповідно, може бути корисна для лікування інфекції.

Інфекція являє собою інвазію у тканини організму хвороботворних агентів, їх розмноження та реакцію тканин хазяїна на зазначені організми та продуковані ними токсини. Інфекція може бути викликана інфекційними агентами, такими як віруси, віроїди, пріони, бактерії, нематоди, такі як паразитичні круглі черви та гострики, членистоногі, такі як кліщі та іксодові кліщі, блохи та воші, гриби, такі як збудники трихофітії, та інші макропаразити, такі як стрічкові черви та інші гельмінти. Відповідно до одного аспекту зазначений інфекційний агент являє собою бактерію, таку як грамнегативна бактерія. Відповідно до одного аспекту зазначений інфекційний агент являє собою вірус, такий як ДНК-віруси, РНК-віруси та віруси, що використовують зворотну транскрипцію. Необмежуючі приклади вірусів включаються аденовірус, вірус Коксакі, вірус

Епштейна-Барра, вірус гепатиту А, вірус гепатиту В, вірус гепатиту С, вірус простого герпесу типу 1, вірус простого герпесу 2 типу, цитомегаловірус, герпесвірус людини 8 типу, НІМ, вірус грипу, вірус кору, вірус епідемічного паротиту, папіломавірус людини, вірус парагрипу, 60 поліовірус, вірус сказу, респіраторно-синцитіальний вірус, вірус краснухи, вірус вітряної віспи.

Антитіла згідно з даним описом можуть також застосовуватися для лікування інфекційного захворювання, що викликається мікроорганізмом, або знищення мікроорганізму шляхом націлювання на зазначений мікроорганізм та імунну клітину для здійснення елімінації зазначеного мікроорганізму. Відповідно до одного аспекту зазначений мікроорганізм являє собою вірус, у тому числі РНК-віруси та ДНК-віруси, грампозитивну бактерію, грамнегативну бактерію, найпростіше або гриб. Необмежуючі приклади інфекційних захворювань та зв'язаних з ними мікроорганізмів приведені у таблиці 4 нижче.

Таблиця 4

Інфекційні захворювання та зв'язані з ними мікроорганізми-джерела

Актиномікоз с. і є.

Ргоріопірасієтіит ргоріопісив

СНІД (Синдром набутого імунодефіциту) й й як правило, ВигКпоїЇдегіа серасіа та інші види еіарпуЇососсив

Хвороба Шагаса (американський ТІ ! трипаносомоз) урапозота сгигі

Продовження Таблиці 4 гострий риніт) " "

Конго-кримська геморагічна лихоманка й . о. паразитів ихоманка денге Нще

Флавівіруси людини 7 (ННМ-7 некроз Сіовігідійт

Синдром Герстмана - Штраусслера - й

Продовження Таблиці 4 синдромом (ГЛПС)

Інфекційний мононуклеоз, викликаний . -

Лімфатичний філяріоз (елефантіаз) висипний тиф)

Продовження Таблиці 4 (еуміцетома) новонароджених) допотппоєає

Новий) варіант хвороби Крейцфельда- .

Слон рок ери ен

Нокардіоз й

Мосагаїіа

Парагонімоз .

Рагадопітив площиці як правило, Маеєедієгіа Тоулегі (ПАМ) лейкоенцефалопатія синдром)

Продовження Таблиці 4 (парикмахерський висип) частини голови)

Тіпеа сгигі5 (паховий дерматомікоз) . гиргит та Тгіспорпуїп тепіадгорпусе5

Дерматофітія стоп (стопа атлета) тідгапе (ОЇ М

Іата тідгапв5 (МІ М

Зигомікоз .

ЕпіоторпїПпогаїез (ентомофторамікоз)

Конкретні дозування та схема лікування для конкретного пацієнта залежать від різних факторів, у тому числі від конкретних використовуваних антитіл, їх варіантів або похідних, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі та раціону харчування пацієнта; часу введення, швидкості виведення, комбінацій лікарських засобів та важкості конкретного захворювання, лікування якого проводиться. Оцінка таких факторів медичними робітниками входить у звичайну компетенцію для даної області техніки. Кількість також залежить від індивідуального пацієнта, якого необхідно лікувати, шляху введення, типу складу, характеристик використовуваної сполуки, важкості захворювання та потрібного ефекту. Кількість для використання може бути визначена із застосуванням фармакологічних та фармакокінетичних принципів, добре відомих у даній галузі техніки.

Способи введення антитіл або їх варіантів включають, не обмежуючись перерахованими, внутрішньошкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний та пероральний шляхи. Антигензв'язуючі поліпептиди або композиції можуть бути введені за будь-яким зручним способом, наприклад, шляхом інфузії або болюсної ін'єкції, шляхом абсорбції через епітеліальні або шкірно-слизові оболонки (наприклад,

через слизову оболонку порожнини рота, слизову оболонку прямої кишки та кишечника і т.п.), а також можуть бути введені спільно з іншими біологічно активними агентами. Відповідно, фармацевтичні композиції, що містять антигензв'язуючі поліпептиди згідно з даним описом, можуть бути введені перорально, ректально, парентерально, інтрацистернально, вагінально, внутрішньочеревинно, місцево (наприклад, шляхом застосування порошків, мазей, крапель або трансдермального пластиру), букально або у вигляді перорального або назального спрею.

Термін "парентеральний" у даному документі відноситься до способів введення, які включають внутрішньовенні, внутрішньом'язові, внутрішньочеревинні, інтрастернальні, підшкірні та внутрішньосуглобні ін'єкції та інфузії.

Введення може бути системним або місцевим. Крім того, може бути бажаним введення антитіл згідно з даним описом у центральну нервову систему за будь-яким підходящим способом, у тому числі шляхом інтравентрикулярних та інтратекальних ін'єкцій; для полегшення інтравентрикулярної ін'єкції може бути використаний інтравентрикулярний катетер, наприклад, приєднаний до резервуару, такого як резервуар Оммайя. Може також застосовуватися легеневе введення, наприклад, за допомогою інгалятора або небулайзера, та у складах з аерозольним агентом.

Може бути бажаним введення поліпептидів-антитіл або композицій з антитілами згідно з даним описом локально у область, де необхідно лікування; це може бути досягнуте, наприклад, але без обмежень, шляхом місцевої інфузії під час хірургічного втручання, місцевого нанесення, наприклад, у поєднанні з пов'язкою на рану після хірургічного втручання, шляхом ін'єкції, через катетер, у вигляді супозиторію або імплантату, причому зазначений імплантат може бути представлений пористим, непористим або гелеподібним матеріалом, у тому числі мембранами, такими як силастикові мембрани, або волокнами. Переважно при введенні білку згідно з даним описом, у тому числі антитіла, слід використовувати матеріали, що не абсорбують зазначений білок.

Згідно з іншим варіантом реалізації зазначені антитіла або композиція можуть бути доставлені у везикулі, зокрема, у ліпосомі (див. І апдег, 1990, Зсіепсе 249:1527-1533; Тгєаї еї аї., у Прозотез іп їйе ТПегару ої Іп'есіои5 Оізеазе апа Сапсег, Горе;-Вегезівїп апа РіаІег (ред.),

Їів5, Мем МоїКк, рр. 353-365 (1989); І оре2-Вегезівіп, там же, рр. 317-327; див. там же у цілому).

Відповідно до ще одного варіанту реалізації зазначені антигензв'язуючий поліпептид або композиція можуть бути доставлені у системі контрольованого вивільнення. Відповідно до одного варіанту реалізації може застосовуватися насос (див. 5ейоп, 1987, САС сій. Веї.

Віотеа. Епо. 14:201; Виспумаїа еї аї., 1980, бБигодегу 88:507; Зацаек еї а!., 1989, М. Епо). У. Меа. 321:574). Відповідно до іншого варіанту реалізації можуть застосовуватися полімерні матеріали (див. джерела: Медіса! Арріїсайоп5 ої СопігоПейд ВРеїеазе, Іапдег апа М/ізе (єдз.), САС Ргеєзв.,

Воса Раїйоп, Ріа. (1974); СопітоПей Огид Віоамаїйарійу, Огид Ргодисі Оевзідп апіа Репоптапсе,

Зтоїеп апа Ваї! (еа5.), ММіеу, Мем Хоїк (1984); Вападег апа Рерразв, у9., 1983, Масготої. осі. Веу.

Мастотої. Спет. 23:61; дивись також І ему еї аї., 1985, Зсіепсе 228:190; Вигіпо еї аї., 1989, Апп.

Меийгої. 25:351; Ноучага еї аї., 1989, 9. Меигозигуд. 71:105). Відповідно до ще одного варіанту реалізації система для контрольованого вивільнення може бути розміщена поблизу від терапевтичної мішені, тобто головного мозку, відповідно, потрібна тільки частина системної дози (див., наприклад, Соодзоп, у роботі "Медісаї! Арріїсайоп5 ої Сопігоїїей Кеїєазе", див. вище, т. 2, стор. 115-138 (1984)). Інші системи для контрольованого вивільнення описані у огляді

Ї апдег (1990, бсіепсе 249:1527-1533).

Згідно з конкретним варіантом реалізації, якщо композиція відповідно до даного опису містить нуклеїнову кислоту або полінуклеотид, що кодує білок, зазначена нуклеїнова кислота може бути введена іп мімо для стимуляції експресії кодованого білку, шляхом її конструювання як частини підходящого нуклеїновокислотного експресійного вектору та введення таким чином, що вона стає внутрішньоклітинною, наприклад, із застосуванням ретровірусного вектору (див. патент США Мо 4980286), або шляхом прямої ін'єкції, або застосування бомбардування мікрочастинками (наприклад, із застосуванням генної гармати; біолістика, бироп), або покриття ліпідами, або застосування рецепторів клітинної поверхні, або агентів для трансфекції, або шляхом введення у зв'язаному вигляді з гомеобоксо-подібним пептидом, який, як відомо, проникає у ядро (див., наприклад, чЧоїйої еї аї!., 1991, Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 88: 1864-1868); і т.п. Як варіант, нуклеїнова кислота може бути введена внутрішньоклітинно та включена до складу ДНК клітини-хазяїна для експресії за рахунок гомологічної рекомбінації.

Кількість антитіл згідно з даним описом, яка буде ефективною при лікуванні, інгібуванні та запобіганні запального, імунного або злоякісного захворювання, розладу або стану може бути визначено із застосуванням стандартних клінічних методик. Крім того, можуть необов'язково 60 застосовуватися аналізи іп мійго, що допомагають ідентифікувати оптимальні діапазони доз.

Точна доза для застосування у складі також залежить від маршруту введення та серйозності захворювання, розладу або стану, та повинна бути обрана на підставі думки лікаря та обставин кожного пацієнта. Ефективні дози можуть бути виведені шляхом екстраполяції з кривих залежності відповіді від дози, отриманих іп міго або у модельних тестових системах на тваринах.

У загальному випадку, доза антигензв'язуючих поліпептидів згідно 3 даним описом, що вводиться пацієнтові, складає, як правило, від 0,1 мг/кг до 100 мг/кг маси тіла пацієнта, від 0,1 мг/кг до 20 мг/кг маси тіла пацієнта, або від 1 мг/кг до 10 мг/кг маси тіла пацієнта. Зазвичай антитіла людини мають більший час напівжиття у організмі людини у порівнянні з антитілами інших видів через імунну відповідь на чужорідні поліпептиди. Відповідно, для антитіл людини часто можливе використання більш низьких доз та менш часте введення. Крім того, дозування та частота введення антитіл згідно з даним описом може бути знижена за рахунок посилення поглинання та проникнення антитіл у тканини (наприклад, у головний мозок) шляхом модифікацій, таких як, наприклад, ліпідизація.

Способи лікування інфекційного або злоякісного захворювання, стану або розладу, що включають введення антитіла, його варіанту або похідної відповідно до даного опису, як правило, тестують на необхідну терапевтичну або профілактичну активність іп міт, а потім іп мімо у прийнятній моделі на тваринах перед застосуванням у людини. Підходящі моделі на тваринах, у тому числі трансгенних тваринах, добре відомі фахівцям у даній галузі техніки.

Наприклад, аналізи іп мійго для демонстрації терапевтичної корисності антигензв'язуючого поліпептиду, описаного у цьому документі, включають аналіз ефекту антигензв'язуючого поліпептиду на лінію клітин або зразок тканини пацієнта. Ефект антигензв'язуючого поліпептиду на лінію клітин та/або зразок тканини може бути визначений з використанням методик, відомих фахівцям у даній галузі техніки, таких як аналізи, описані у різних розділах цього документа.

Відповідно до цього опису аналізи іп міо, які можуть бути використані для визначення того, чи показане введення специфічного антигензв'язуючого поліпептиду, включаються аналізи клітинної культури іп мйт, коли культивують зразок тканини пацієнта та впливають на нього сполукою або іншим чином вводять сполуку, після чого спостерігають ефект такої сполуки на зразок тканини.

Різні системи доставки відомі та можуть застосовуватися для введення антитіла згідно з даним описом або полінуклеотиду, що кодує антитіло згідно з даним описом, наприклад, інкапсуляція у ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати зазначену сполуку, рецептор-опосередкований ендоцитоз (див., наприклад, УМи апа У/и, 1987, 9. Віої. Спет. 262: 4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти у вигляді частини ретровірусного або іншого вектору, і т.п.

Способи діагностики

Надлишкова експресія РО-Ї1 спостерігається у зразках певних пухлин, та пацієнти з надмірно експресуючими РО-Ї1 клітинами, можливо, будуть відповідати на лікування антитілами проти РО-11 згідно з даним описом. Відповідно, антитіла згідно з даним описом можуть також застосовуватися з діагностичною та прогностичною метою.

Зразок, який переважно включає клітину, може бути отриманий від пацієнта, який може являти собою пацієнта з раком або пацієнта, якому необхідно поставити діагноз. Зазначена клітина являє собою клітину з пухлинної тканини або пухлинного блоку, зразка крові, зразка сечі або будь-якого зразка від пацієнта. Після необов'язкової попередньої обробки зразка зазначений зразок може бути інкубований з антитілом згідно з даним описом в умовах, що дозволяють вказаному антитілу взаємодіяти з білюом РО-1І1, потенційно присутнім у зразку. Для виявлення присутності білку РО-І1 у зразку можна застосовувати такі методи, як ІФА ЕГІЗА, використовуючи антитіло проти РО-1 1.

Присутність білку РО-І1 у зразку (необов'язково з визначенням кількості або концентрації) може бути використана для діагностики раку, як показник того, що пацієнт підходить для лікування зазначеним антитілом, або як показник того, що пацієнт відреагував (або не відреагував) на лікування раку. У разі способу діагностики детекція може бути виконана одноразово, два або більше разів, на певних стадіях, після початку лікування раку для визначення прогресу лікування.

Композиції

У відповідності з даним винаходом також запропоновані фармацевтичні композиції. Такі композиції містять ефективну кількість антитіла та прийнятний носій. Відповідно до деяких варіантів реалізації зазначена композиція додатково включає другий протираковий агент (наприклад, інгібітор імунних контрольних точок). 60 Згідно з конкретним варіантом реалізації термін "фармацевтично прийнятний" означає схвалений контрольним органом федерального або державного уряду, або зазначений у

Фармакопеї США або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування у тварин та, конкретніше, у людини. Крім того, "фармацевтично прийнятний носій" зазвичай являє собою нетоксичний твердий, напівтвердий або рідкий наповнювач, розчинник, інкапсулюючий матеріал або допоміжний рецептурний агент будь-якого типу.

Термін "носій" відноситься до розріджувача, ад'юванта, допоміжної речовини або основи, з якими вводять терапевтичний засіб. Такі фармацевтичні носії можуть являти собою стерильні рідини, такі як вода та масла, у тому числі нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісове масло, соєве масло, мінеральне масло, кунжутне масло і т.п.

Вода являє собою кращий носій, якщо фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенно.

Також у якості рідких носіїв можуть застосовуватися сольові розчини та водні розчини глюкози та гліцерину, зокрема, для розчинів, які вводять ін'єкцією. Відповідні фармацевтичні допоміжні речовини включаються крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, знежирене сухе молоко, гліцерин, пропілен, гліколь, воду, етанол і т.п. Зазначена композиція, якщо це потрібно, може також містити незначні кількості змочувальних або емульгуючих агентів, або рін- буферизуючі агенти, такі як ацетат, цитрат або фосфати. Також включені антибактеріальні агенти, такі як бензиловий спирт або метилпарабен; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або натрію бісульфіт; хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота; та агенти для корекції тонічності, такі як хлорид натрію або декстроза. Зазначені композиції можуть приймати форму розчинів, суспензій, емульсії, таблеток, пігулок, капсул, порошків, складів для тривалого вивільнення і т.п. Зазначена композиція може бути введена до складу супозиторію з традиційними зв'язувальними речовинами та носіями, такими як тригліцериди. Склад для перорального застосування може включати стандартні носії, такі як маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахарин натрію, целюлоза, карбонат магнію фармацевтичної якості і т.п.

Приклади відповідних фармацевтичних носіїв описані у джерелі: Кептіпдіоп'є Рпагтасешісаї! зЗсіепсе5, ред. Е. МУ. Мапіп, включеному у цей документ за допомогою посилання. Такі композиції містять терапевтично ефективну кількість антигензв'язуючого поліпептиду, переважно у очищеній формі, спільно з кількістю носія, що підходить для забезпечення форми для належного введення зазначеному пацієнтові. Зазначений склад повинен відповідати способу введення. Вихідний склад може бути укладений у ампули, одноразові шприци або багатодозові флакони, виготовлені зі скла або пластику.

Згідно з варіантом реалізації склад із вказаною композицією отримують відповідно до звичайних процедур для фармацевтичної композиції, призначеної для внутрішньовенного введення людині. Як правило, композиції для внутрішньовенного введення являються собою розчини у стерильному фізіологічному водному буфері. За необхідності зазначена композиція може також включати солюбілізуючий агент та місцевий анестетик, такий як лігнокаїн для зменшення болю у місці ін'єкції. Зазвичай зазначені інгредієнти або представлені окремо, або змішані у складі одиничної лікарської форми, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату у герметично закритому контейнері, такому як ампула або саше із зазначенням кількості активного агента. Якщо композиція призначена для введення шляхом інфузії, вона може відпускатися з інфузійним флаконом, що містить стерильну воду фармацевтичної якості або сольовий розчин. Якщо композицію вводять шляхом ін'єкції, може бути надана ампула зі стерильною водою для ін'єкцій або сольовим розчином, щоб можна було змішати інгредієнти перед введенням.

Сполуки згідно з даним описом можуть бути введені до складу у нейтральній формі або у формі солі. Фармацевтично прийнятні солі включаються солі, утворені аніонами, наприклад, що походять з соляної, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислоти і т.п., та утворені катіонами, наприклад, що походять з гідроксиду натрію, калію, амонію, кальцію, заліза (ІІ), ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т.п.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Одержання моноклональних антитіл людини проти РО-Ї 1 людини

Отримували моноклональні антитіла миші проти РО-Ї17 людини із застосуванням гібридомної технології.

Антиген: високоекспресуюча білок РОЇ 1-Ес людини та РО-І1 людини лінія клітин СНОК1 (лінія клітин РО-1-СНОКТ).

Імунізація: для одержання моноклональних антитіл миші до РО-Ї1 людини 6-8-тижневих самок мишей ВАГ В/с спочатку імунізували 1,5х107 клітин РОЇ 1-СНОК'І. На 14 день та 33 день після першої імунізації імунізованих мишей повторно імунізували 1,5х107 клітинами РОЇ 1- 60 СНОК'Т, відповідно. Для відбору мишей, які продукують антитіла, які зв'язують білок РО-І 1,

сироватку від імунізованих мишей тестували із застосуванням ІФА ЕЇЇ5А. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білюоюм РО-Ї1 людини у концентрації 1 мкг/мл у ФСБ, вносячи по 100 мкл/лунку при кімнатній температурі (КТ), впродовж ночі, після чого блокували 100 мкл/лунку 5 95 БСА. Розведення плазми від імунізованих мишей додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1-2 годин при КТ. Планшети промивали ФОБ/ЛУгееп, а потім інкубували з антитілом проти до миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (НЕР), впродовж 1 години при КТ.

Після промивання планшети проявляли субстратом АВТ5 та аналізували на спектрофотометрі при 00 405 нм. Мишам з достатніми титрами ДС проти РОЇ 1 вводили бустерну дозу 50 мкг білку РОЇ 1-Ес людини на день 54 після імунізації. Зрештою відібраних мишей використовували для проведення злиття. Супернатанти гібридом тестували на до проти РО-1 1 із застосуванням

ІФА ЕГІЗА.

Клони гібридоми НІ-1210-3, НІ 1207-3, НІ 1207-9 та НІ 1120-3 були вибрані для подальшого аналізу. Послідовності амінокислот та полінуклеотидів варіабельних областей НІ 1210-3 приведені у таблиці 5 нижче.

Таблиця 5

Варіабельні послідовності НІ 1210-3 вААаТалдААСстастаавАастотасаааАвАСТТАатТаАлас ставдацсатоССстТаАААСТСОТОСТатТасАаасстстасАТТ

САСТТ ТСАСТАИСТАТОАСАТО ТС ТТ ТОСОИТТоаССАСАСТ сСсасАдадАдадсатотасалатаватСасСААССАТТАаИатадта

Ніт210-3 УН стаатасайТтТАСАТСТАСТАТТСАСАСАсСТатаААл,аавасСа 112

АТТТАССАТСТОСАСАСАСААТасССААСпСААСААССтТатАс

СстасСсААДАТтТаАласСАаатстаАааатстадасАСАСааосттат

АТАТТІТатТаСААДСАСААТТтТаИатТААаа,аСсастАтТастттасА

СстТАСТаСОасСТСААДааААССТСАСТСАССаИтстТосСтТСА

ЕМКІ МЕЗСОСОЇ МКРОСБІ КІ БСААЗСЕТЕЗ5МОМЗУМУВОТ

Ніт210-3 УН РЕКЗГЕМУМАТІЗоОССЯСІЇЯІ МУ 5ОБУКОаВЕТІЗАОМАКММІ М 113

ГОМ551 А8ЗЕОТАЇ МІСАВЕРСКАМАГ ОУМСсОСТеМТ

САСАТТатТаАТаАСССАаТтТтсСТСАСАААТТСАТатоСАСАТ ссатдасАаАСАсааТСАаСАТСТоСТаСАдасвсСАатсСА саАдтаталстостастатасстаатТАТСААСАаЧАддассА

НІ1210-3 МІ. ааАСААТСТОСТААДАСТАСТаАТТТАСТОСАСАТОСТОСС 114 сатАСсАстасаатосостТадгтсастАСстТассАаатааАТо тааспсАСацпАТТТСАСТТТСАССАТСАСаСАСТатасдааст

СААдаАсСсТайСАсСТТТАТТАСТатсСАасСААСАТТАТАСТА стосастодссттссатастасаАСсСААдасСстаавдастаддд

РІММТОЗНКЕМЗТЗУ,аОВУВІЗСКАБОВОМТРАМАМУООКР

НітТ210-3 МІ СОБРК ПИЗТЗЗАУТаУРєРОвВЕТазавзатрЕТЕТІЗВМОА 115

ЕОГАМУУСООНУТТРІ ТРИАСТКІ ЕІ К

Приклад 2: Активність зв'язування РО-Ї 1 людини моноклональним антитілом миші НІ 1210-3

Для оцінки активності зв'язування клону гібридоми НІ1210-3 проводили тестування очищеного з зазначеного клону тАб методом ІФА ЕГІЗА. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білком РО-І 1-Ес людини у концентрації 0,1 мкг/мл у ФСБ, вносячи по 100 мкл/лунку при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 100 мкл/лунку 5 95 БСА. З-разові розведення антитіл НІ.1210-3, починаючи з 0,2 мкг/мл, додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1-2 годин при КТ. Планшети промивали ФОБ/Імееп, а потім інкубували з антитілом кози проти ДО миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (НЕР), впродовж 1 години при КТ. Після промивання планшети проявляли з субстратом ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при ОО 450-630 нм. Як показано на фіг. 1, НІ 1210-3 може зв'язуватися з РО-Ї1 людини з високою активністю (ЕСво-5,539 нг/мл).

Приклад 3: тАБ миші НІ-1210-3 блокувало зв'язування РО-ІЇ 1 людини з його рецептором РО- 4

Аналіз блокування рецепторів при застосуванні рекомбінантного РО-І1 людини

Для оцінки блокувального ефекту тАБб миші НІ 1210-3 на зв'язування рекомбінантного РО-І 1 людини з його рецептором РО-1 застосовували аналіз блокування рецепторів на основі ІФА

ЕГІ5А. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білком РО-Ї 1-Ес людини у концентрації 1 мкг/мл у ФСБ, вносячи по 100 мкл/лунку, при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 100 мкл/лунку 5 95 БСА. По 50 мкл міченого біотином білку РО-1-Ес людини та по 50 мкл З-разових розведень антитіл НІ.1210-3, починаючи з 2 мкг/мл, додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1 години при 37 "С. Планшети промивали ФСБ/Гмееп, після чого інкубували із стрептавідином-НКР впродовж 1 години при 37 "С. Після промивання планшети проявляли з субстратом ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при 00 450-630 нм. Як показано на фіг. 2,

НІ 1210-3 може ефективно інгібувати зв'язування РО-І1 людини з РО1 людини при ІСво-0,7835

НМ.

Аналіз блокування рецепторів при застосуванні експресованого клітинами ссавців РО-Ї 1 людини

Для оцінки блокувального ефекту тАб миші НІ.1210-3 на зв'язування РО-Ї1 людини, що експресується на клітинах ссавців, з його рецептором РО-1, застосовували аналіз блокування рецепторів на основі методу ЕАС5. Коротко, клітини РОЇ 1-СНОКІ1 спочатку інкубували з 3- разовими серійними розведеннями тАб миші НІ1210-3, починаючи з 20 мкг/мл, при КТ впродовж 1 години. Після промивання буфером для ГАС5 (ФСБ з 2 95 ФБС) у кожну лунку додавали мічені біотином пиРО-1 та інкубували при КТ впродовж 1 години. Потім, після дворазового промивання буфером для ЕБАС5, додавали у кожну лунку стрептавідин-ФЕ впродовж 0,5 години. Середню інтенсивність флуоресценції (МЕ) ФЕ оцінювали з використанням РАСсЗАГіа!. Як показано на фіг. З, антитіло НІГ1210-3 може високоефективно інгібувати зв'язування РО-1 на РО-І1, що експресується на клітинах ссавців, при ІСв5о, що дорівнює 2,56 НМ, з 92,6 95 максимальним показником інгібування. хи тя у, Мікітестованого НтТИтТіях Я 00оз де бвінгрування- є С МЕ контролю-основи ) 7 10055)

Приклад 4: тАБб миші НІ.1210-3 стимулювало імунну відповідь Т-клітин людини

Для оцінки ефекту тАб миші НІ1210-3 оцінювали відповідь Т-клітин людини в умовах реакції змішаної культури лімфоцитів. Проводили диференціювання ДК людини з СО14 моноцитів у присутності ГМ-КСФ та ІЛ-4 протягом 7 днів. Потім СО4 «Т-клітини, виділені у іншого донора, культивували разом з ДК та серійними розведеннями блокуючого антитіла проти РО-Ї 1.

На 5 день після інокуляції аналізували продукування ІФН-у у культуральному супернатанті.

Результати показали, що антитіла НІ1210-3 можуть дозозалежним чином стимулювати продукування ІФН-у, що передбачає здатність антитіла проти РО-І1 стимулювати відповідь Т- клітин людини (фіг. 4).

Приклад 5: Афінність зв'язування тАб миші НІ-1210-3

Зв'язування антитіл НІ 1210-3 з рекомбінантним білком РО-І1 (РО-І/1 людини з Ніб-міткою) тестували у системі ВІАСОКЕ"М із застосуванням способу захоплення. тАб миші НІ.1210-3 захопили із застосуванням антитіла проти Ес миші, яким покривали СМ5-чип. Серійні розведення білку РО-І1 людини з Ніб-міткою вводили поверх захопленого антитіла впродовж З хвилин при швидкості потоку 25 мкг/мл. Дозволяли антигену дисоціювати впродовж 900 с.

Зазначений експеримент повністю проводили на Віасоге 1200. Аналіз даних проводили з використанням програмного забезпечення для оцінки Віасоге 71200. Результат представлений на фіг. 5 та у таблиці 6 нижче.

Таблиця 6

Кінетика зв'язування НІ 1210-3 з рекомбінантним РО-Ї 1 людини

Приклад 6: Гуманізація тАБб миші НІ-1210-3

Гени варіабельних областей тАБ НІ 1210-3 використовували для створення гуманізованого тАр. На першому етапі зазначеного процесу послідовності амінокислот МН та МК з МАБ

НІ1210-3 порівнювали з генними послідовностями Ід людини з доступної бази даних для виявлення у цілому найкращим чином співпадаючих генних послідовностей зародкової лінії Ід людини. Для легкого ланцюгу найкраще співпадіння серед послідовностей людини було виявлено для генів О18/)К2 та КМ1-39701/К902704, а для важкого ланцюгу найкраще співпадіння серед послідовностей людини було виявлено для гену МНЗ-21. Були також вибрані гени МНЗ-11,

УНЗ-23, МНЗ-7701 та МНЗ-48 через їх значне співпадіння.

Потім розробляли гуманізовані послідовності варіабельних доменів, у яких СОКІ (ЗЕО ІЮ

МО: 4), 2 (ЗЕО ІЮ МО: 5) та З (5ЕО ІЮ МО: 6) легкого ланцюгу НІ. 1210-3 були прищеплені на каркасні послідовності генів О18/)К2 та КМ1-39701/К92704, а послідовності СОКІ (ЗЕО ІО МО: 1), 2 (ЗЕО ІЮО МО: 2) та З (ЗЕО ІО МО: 3) з НІ 1210-3 МН були привиті на каркасні послідовності гену

МНЗ-21, МНЗ-11, МНЗ-23, МНЗ-48 або МНЗ3-7701. Потім створювали тривимірну модель, щоб визначити, чи може заміна амінокислоти миші на амінокислоту людини у яких-небудь положеннях каркасної області повпливати на зв'язування та/або конформацію СОК. Для легкого ланцюгу були ідентифіковані 225, 435, 600, 63 та 420 (нумерація за Каваї, див. таблицю 7) у каркасній області. У випадку важкого ланцюгу у зворотні мутації були залучені 1Е, 37М, 40Т, 445, 49А, 77М, 911, 94К та 108 у каркасній області.

Таблиця 7

Дизайн гуманізації

Послідовності амінокислот та нуклеотидів деяких з гуманізованих антитіл перераховані у таблиці 8 нижче.

Таблиця 8

Послідовності гуманізованих антитіл (жирним шрифтом виділені області СОР) нн

Н . . о азва Послідовність Тв

МО:

ЕМКІ МЕЗОСОЇ МУКРОСБІ КІ БЗСААЗаЕТЕЗ5УОМЗУМВОТРЕКБІ ЕМУМАТ ні т210-МН. Б расваміму5раіуУкавЕтІЗАОМАКММІ МІ ОМ55І АЗЕОТАЇ МІСАВЕЕ 7

ЄкКАМАГОоОмУсОоатеМТУЗо

ЕМОЇ МЕЗО УКРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗ5УОМЗУМУВОАРИаКаї ЕМУУЗТ

Ниї1210 МНЛ З оОСИасм мур УКаТвЕТІЗАОМАКМБІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕБ

ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО УКРОСБІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗ5УОМЗУМУВОАРИаКаИїЇ ЕМУМАТ

УНна ІЗОСсасмУмУВОоВУКаТвЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕБ

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО УКРОСБІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗ5УОМОУМВОАРОаКОІ ЕМ МАТ

УНЬ ІЗоОаасУмУОоВУКаИавЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАМУМІСАВЕР 10

І оКАМАГОоОмУсОсТТУТУЗ5

ЕМОЇ МЕЗО УКРОСБІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗЗУОМЗУАОАРИаКагі ЕМУ5тТ

Ниї1210 УН.2 І ОССаамМІУ5О5УКИавЕТІЗАОМАКМБІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕБ 11

ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО УКРОСБІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗЗУОМЗУАОАРИаКагі и ЕМУМАТ

Унга ІЗрааамМмУОБУКаИавЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕБЕ 12

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

УНгв ІЗоОаасУмУОоВУКаИавЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАМУМІСАВЕР 13

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

ЕМО ГЕЗСОСИЇ МОРССБІ ВІ БСААЗаЕТЕЗ5УОМОУМУВОАРИаКаї ЕМУ5ЗТ

Ниї1210 МУНЗ оса мур УКаТвЕТІЗВОМЗКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕРЕ 14

ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМО ГЕЗСОСИІ МОРОСБІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗ5УОМОУМВОАРОаКБІ ЕМ МАТ

УНЗа ІЗОаасУмУОоВУКаИТвЕтТІЗАОМЗКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАМУМІСАВЕР 15

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБОаЕТЕЗЗУОМЗУУВОАРИОаКаї ЕМ/УЗТ

Ниї1210 УН.4 ІЗ ОСИасммУВроУКкавЕтІЗАОМАКМ5І М ОММ5І АРЕОТАМУМСАВЕР 16

ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІІ ВІ БСААБОаЕТЕЗЗУОМЗУУВОАРОаКаИї ЕМУМАТ

МН ла ІЗОСсасУмУВОоВУКаИТвЕтТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І АРЕОТАМУМСАВЕР 17

І еКАМАГОмУсОосатТТУТУ55

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ

НАВ ІЗраасммУОВУКавЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І АРЕОТАММІСАВЕР 18

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБИаЕТЕЗЗУОМЗУУВОАРОКБІ ЕМУМАТ

МНС ІЗЕеЕССИамМІ М У5ОБУКавВЕТІЗВОМАКМБІ М ОММ5І ВРЕОТАММІСАВЕР 19

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

Ни1210 ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБИаЕТЕЗЗУОМЗУУВОАРОКБІ ЕМУМАТ мн. ІЕВАСИаМІ и ЗОБУКаВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАММІСАВЕБ 20

І ЄкКАМАСГОУУсОоаТТТУТУ5о

МН ле ІЕОУсаміУураіуУкавЕтІЗвВОМАКМ5І МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕБ 21

І оКАМАГОмУСсОсСТТУТУ5о

ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІІ ВІ БСААБОаЕТЕЗЗУОМЗУУВОАРОаКаИї ЕМУМАТ

Ниї1210 МН.5 ІЗ ОСаСсмМІУр5УКавЕТІЗАОМАКМБІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВЕБ 22 еКАМАСОоОУМмсОоаті МТУ

Продовження Таблиці 8 прл2іо0 ТЕМОСМЕБСССІУОРОСБІВІ ЗСААБСЕТЕОБУОМЕМУВОАРОКСГЕММАТ на ІЗОСССУУУЗО5УКОВЕТІЗВОМАКМВІ У ОММ5І ВАЕОТАУХІСАВЕЕ 23

СКВАУАІ СУМ СОСТІ УТУВ5 п1210. ЕМОІМЕВЗСОСІ УОРОСБІ ВІ ЗСААБСЕТЕОБУОМЕМУВОАРОКСГ ЕММА

Нв ІЗОСССУУУЗО5УКОВЕТІЗВОМАКМВІ ХУ ОММ5І ВАЕОТАУМІСАВЕЄЕ 24

СКВАУАІ ОУМСОСсТТУТУЗе п1210. ЕУОІМЕВССОСІ МОРОСБІВІ ЗСААБСЕТЕ5БУСМОМУВОАРОКСГ ЕММА ун ес ІЗОСССУУУЗО5УКОВЕТІЗВОМАКММІ У! ОММ8І ВАЕОТАУХІСАВЕЕ 25

СКВАУАІ ОУМ/СОСТІ УТУВ5 п1210. ЕМОСМЕВЗСОСІ УОРССОБІ ВІ ЗСААБСЕТЕОБУОМОМУВОТРЕКВІЕМ/МАТ

МН ва ІЗОСССУУУЗО5УКОВЕТІЗВОМАКММІ У! ОММ8І ВАЕОТАУХІСАВЕЕ 26

СКАУАІ ОУМ/СОСТІ УТУВ5

ОІУМТО5ЗНКЕМОТЗУСОВУВІЗСКАБОРУТРАМАМ УООКРООЗРКІТУ З

НІ 1210-УК. | Т9ВУТОУРОВЕТО5О5ОТОЕТЕТІЗ5МОАЕОІ АУУУСООНУТТРІ ТЕСА 27

СТКІ ЕК

ПІОМТО5РУБІ ЗАЗУСОВУТІТСКАЗОБУТРАМАМ УООКРОКАРКО У 5

Ниї1210 УК.1| Т9ВУТОУРОВЕ5О5О5ОТОЕТЕТІЗЗІ ОРЕОТАТУУСООНУТТРІ ТЕСО 28

СТКІ ЕК пі ПІОМТО5РУБІ ЗАЗУСОВУТІТСКАБОРУТРАМАМ УООКРОКОРКІІУ З

Т85ВУТОУРОЗВЕЗО5О5ОТОЕТЕТІЗ5І ОРЕОІАТУУСООНУТТРІ ТЕСО 29

Укла СТКІ ІК

Ниї1210 Ук.2 | Т9ВУТОУРОВЕ5О5О5ОТОЕТІ ТІЗ5ІОРЕОБАТУУСООНУТТРІ ТЕСО 30

СТКІЕІКВ пі ПІОМТО5РУБІ ЗАЗУСОВУТІТСКАБОРУТРАМАМ УООКРОКАРКІІУ 5

Т85ВУТОУРОВЕТО5О5ОТОЕТІ ТІЗ8ІОРЕОРАТУУСООНУТТРІТЕСО 81

Ук га СТКІ КВ пі ПІОМТО5РУБІ ЗАЗУСОВУТІТСКАБОРУТРАМАМ/ УООКРООБРКІТУ З

Т85ВУТОМУРОВЕТО5О5ОТОЕТІ ТІЗВІОРЕОРАТУУСООНУТТРІ.ТЕСО 32

Ук.2о СТКІ КВ пі ПІОМТО5РУБІ БАБУСОВУТІЗСКАЗОБУТРАМАМ УООКРООБРКІТУ 5

Т85ВУТОУРОВЕТО5О5ОТОЕТІ ТІЗ8ІОРЕОРАТУУСООНУТТРІ.ТЕСО 33

Укго СТКІ КВ

САССТОААССТОСТОСАСАССОССОСАСАТСТОСТОААСССТОССООСАС

ССТОААОСТО

АОСТСТОССОССАСССОСТТСАССТТСАОСАОСТАССАСАТОАОСТОСОСТО

АСССАСАСС

СССОСАСААСАСССТОСАСТОСОТСОССАССАТСАССОАТОССОССООСТА нілгто ун. | САТСТАСТАС 34

АСССАСАОССТОААСОССАССТТСАССАТСАОСАСОСАСААССОССААСААС

ААССТОТАС

СТОСАСАТОАОСАСССТОАССАССОАОСАСАССОСССТОСТАСАТСТОСОСС

АСССАСТТС

СОСААСАССТАСОСССТОСАСТАСТОСООАСАСОССАССАССОТСАСССТО

АССАСС

Продовження Таблиці 8

САССТОСАССТОСТОСАСАССОСАССАССАСТОСТОААОСССОСАСОСАС

ССТОАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССОСТТСАССТТСАОСАССТАССАСАТСАССТООСТО

АСАСАСССС

ССТОССАДАСОССТОСАСТООСТОАССАССАТСТОССАТОССОСССОСТАС

Ниї210 мн.1| АТСТАТТАС 35

ТОССОАСАСССТОАДАССОСАССТТСАССАТСАССАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

СТОСАСАТОААСАСССТОАСОСССОАСОАСАССОСССТСТАСТАСТОСОСС

АСОСАСТТС

СОСААААОСТАСОСССТОСАСТАСТООСОССАСОССАСААССОТСАСССТО

АССАСС

ССТОАСАСТО

АСАСАСССС

ССТОССАДАСОССТОСАСТООСТООССАССАТСТОСОАТООССОСООСТАС

Ни1210 АТСТАТТАС зв

Унла ТОССОАСАСССТОАДАССОСАССТТСАССАТСАССАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

АСОСАСТТС

АССАСС

ССТОАСАСТО

АСАСАСССС

ССТОССААДААОССТОСАСТООСТООССАССАТСТОСОАТОоСССОСОСстТАС

Ни1210 АТСТАТТАС 87

Унль ТОССОАСАСССТОАДАССОСАССТТСАССАТСАССАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

СТОСАСАТСААСАСССТОАСОСССОАСОАСАССОССОТСТАСАТСТОСОСС

АСОСАСТТС

АССАСС

ССТОАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССОСТТСАССТТСАОСАССТАССАСАТСАССТОСАТСА

САСАСОСС

Ниї210 ун.2| АТСТАТТАС 38 "2| ТСССАСАССОТОААСОССАССТТСАССАТСАОСАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

АСОСАСТТС

АССАСС

Продовження Таблиці 8

ССТОАСАСТО

САСАСОСС

Ниї1210 АТСТАТТАС за

Унга ТОССОАСАСССТОАДАССОСАССТТСАССАТСАССАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

АСОСАСТТС

АССАСС

ССТОАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССООСТТСАССТТСАОСАОСТАССАСАТОАОСТОССТО

АСАСАСССС

Ниї1210 АТСТАТТАС й ун. ТОССОАСАСССТОАДАССОСАССТТСАССАТСАССАСОСАСААСОССААСААС

АСССТОТАС

СТОСАСАТОААСАСССТОАСОСССОАСОАСАССОСССТСТАСАТСТОСОСС

АСОСАСТТС

АССАСС

САССТОСАССТОСТОСАСАССОСАССАССАСТОСТОСААСССОСАСОСАС

ССТОАСАСТО

АСАСАСССС

Ниї210 ун.з| АТСТАТТАС 4

ТОССОАСАСССТОААССОСАСОТТСАССАТСАССАСССАСААСАССААСААС

АСССТСТАС

АСОСАСТТС

АССАСС

ССТОАСАСТО

АСАСАСССС

Ниї1210 АТСТАТТАС й

УН.За ТОССОАСАСССТОААССОСАСОТТСАССАТСАССАСССАСААСАССААСААС

АСССТСТАС

АСОСАСТТС

АССАСС

Продовження Таблиці 8

ССТСАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССОСТТСАССТТСАОСАОСТАССАСАТОАОСТОСОСТО

АСАСАСОСС

ССТООСАААСОССТОСАСТООСТОАССАССАТСТОССАТООССОССОСТАС

Ниї210 ун.4| АТСТАТТАС 43

ТОССАСАСССТОААОСОСАОСТТСАССАТСАССАСССАСААСОССААСААС

АОССТСТАС

СТОСАСАТОААСАСССТОАСССАТОАОСАСАССОССОТОТАСТАСТОСОСС

АССОСАСТТС

СОСАДААОСТАСОСССТОСАСТАСТОССОССАССОСАСААСССТОАССОТО

АССАСС

ССТСАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССОСТТСАССТТСАОСАОСТАССАСАТОАОСТОССТО

АСАСАСОСС

ССТООСААДАСОССТОСАСТООСТОСССАССАТСТОССАТООСООССОСТАС

Ниї1210 АТСТАТТАС д

Унла ТОССАСАСССТОААСООСАССТТСАССАТСАССАССОАСААСОССААСААС

АОССТСТАС

АССОСАСТТС

АССАСС

ССТСАСАСТО

АСАСАСОСС

ССТООСААААОССТОСАСТООСТОСССАССАТСТОССАТОСССОССОСТАС

Ниї1210 АТСТАТТАС 15

УНлЬ ТОССАСАСССТОААСООСАССТТСАССАТСАССАССОАСААСОССААСААС

АОССТСТАС

СТОСАСАТОААСАСССТОАСССАТОАОСАСАССОССОТОТАСАТСТОСОСС

АССОСАСТТС

АССАСС

ССТСАСАСТО

АССТОСОСТОССАСССОСТТСАССТТСАОСАОСТАССАСАТОАОСТООСТО

АСАСАСОСС

ССТООСААААСССТОСАСТООСТОСССАССАТСТОССААСОСООССОСТАС

Ниї1210 АТСТАТТАС 16

УНас ТОССАСАСССТОААСООСАССТТСАССАТСАССАССОАСААСОССААСААС

АОССТСТАС

АССОСАСТТС

АССАСС

Продовження Таблиці 8 салдастасластастасАдсдаСсавАсаАд,аАстаатасСсААссСссадаасСАа

СсСтТОАсСАСТа дастасастассдасаастТТсАССТТСАаСАаСТАСОАСАТаАХаСсТааста

АВАСАСОСС сСсТааСААААласставастаа,втасССАССАТСТОСОАТОаСОСаСсаасСтТАС

Ни1210 МН. | АТСТАТТАС 47 да ТоСОАСАДЯаСаТаАдА,аайСАааТТСАССАТСАаСАпасСАСААСаТссААСААС дасстатАСс

СстТасСсАпАтТаААСАХассталаавАтТаАапАСАССассСаТаТАСАТСТОСОаСС давалатто васСсАААДАСОатТАСсассстааАстТАстававаССАапаСАСААССатадосата даслас салдастасластастасАдсдаСсавАсаАд,аАстаатасСсААссСссадаасСАа

СсСтТОАсСАСТа дастасастассдасаастТТсАССТТСАаСАаСтТАСОАСАтТадастастТа

АВАСАСОСС сСсТОаСААААласставаастаасТаССАССАТСТОСОСАТОТТЇССсОаТстАС

Ни1210 МН. | АТСТАТТАС 48 де ТоСОАСАДЯаСаТаАдА,аайСАааТТСАССАТСАИ,САСОСАСААСаССАдаААС дасстатАСс

СстТасСсАпАтТаААСАХассталаавАтТаАапАСАССассСаТаТАСАТСТОСОаСС давалатто васСАААДАСОатТАСсассстааАСстТАстававаССАапаСАСААССатаАсСстТа даслас саластасластастасвХатоСсасвдасвасасстаатасСААсстапавасто сстаАдаастОо теоестатассасттоСаастТТСсАССТТСАасСТоСТАССОСАТАТОДОСТОСОТОА саслсаст

ЄСстТапАдАдосасстасХатаватааССАССАТСТОСОСАСОВаСАХа,СассСтТАС

Ниї210 мн.5| АТСТАСТАС 49 тоСсОАСТоСсатаддаваСАваТтТСсАССАТСТОССОСОПАСААСасССАдДаААСТ

СоСстТатАс стТасСсАдаАтТаААСстТототАа,асастадасАСАССсассатТатАТТАСТаСассА сапАстттТ васСсААдсдастТАсассстасАттАставваССАапаСАСАСТОаСТОАСАСстТа дастос саластасластастасвХатоСсасвдасвасасстаатасСААсстапавасто сстаАдаастОо тестатассасттоСаастТТСсАССТТСАасСТоСтТАССАТАТОЛОСТОСИаТОаА саслсаст

Ни1210 АТСТАСТАС БО

МН.Ба тоСсОАСТоСсатаддаваСАваТтТСсАССАТСТОССОСОПАСААСаССААСААСТ

СоСстТатАс стТасСсАааАтТаААСстТототАа,асастадасАСАССсассатТатТАТАТСТаСассСА сапАстттТ васСсААдсдастТАсассстасАттАставваССАапаСАСАСТОаСТОАСАСстТа дастос

Продовження Таблиці 8 сластасластаатасвАдатоСасадаавАасасстаатасСААсСстасвАавасто сстадааста тостатассасттоСсаастТТСсАССТТСАасСтТоСсТАСЯАТтТАТОДОИСсттТаквсатад сасАдсаст сстааАдАлдссасставаатаватааССАССАТСТОССОСАСацсьавоаасСтАС

Ни1210 АТСТАСТАС БІ

МН.ОБЬ тоСсвАСТОСОЯтТададасвасСАааТтсСАССАТСТОССвИапАСААСасССААаААС

ААСсСТатАС стасСсааАтТадАСстТоттсАдасастадасаАСсАсСсасСса,ататАТАТоТаСаИассА сасАаттТ сасСсААсАаастТАсасССстасАтТтТАСсТвасвсассСсАа,асасСАСАСтТааТаАСАстТа дастос сластасластаатасвАдатоСасадаавАасасстаатасСААсСстасвАавасто сстадааста тостатассасттосаастТТСАССТТсАастосСтТАСаАТтТАТаАСаСТасатад сасАсАСс сСстаАдадАсАаасстасиатаватаайсССАССАТСТОСОСАаСавсАаавасцастАс

Ни1210 АТСТАСТАС Бо

МН.Бе тоСсвАСТОСОЯтТадалдасасАааТтсАССАТСТОССОВапАСААСасСссСсААсаААС

ААСсСТатАС стасСсааАтТадАСстТоттсАдасастадасаАСсАсСсасСса,ататАТАТоТаСаИассА сасАаттТ сасСсААсАаастТАсасССстасАтТтАСсТвЩасвсиассСсАа,асасСАСсАСсТаатаАсАата дастос сластасластаатасвАдатоСасадаавАасасстаатасСААсСстасвАавасто сстадааста тостатассасттоСсаастТТСсАССТТСАасСтТоСсТАСЯАТтТАТОДОИСсттТаквсатад сасАдсаст сстааАдАлдссасставаатаватааССАССАТСТОССОСАСацсьавоаасСтАС

Ни1210 УН. І АТСТАСТАЄС БЗ

Ба тоСбаАСТОСОЯтТаддасасАааа т тсАССАТоТоССвапАСААСаССААадАСТ состТатАС стасСсааАтТадАСстТоттсАдасастадасаАСсАсСсасСса,ататАТАТоТаСаИассА сасАаттТ сасСсААсАастТАсассСстасАтТтАСсТвасвсассСсАасасСАСААССатаАСАсТа дастос

САСАТСЯТаАтТадссСАадассСАСААатТСАтТаласСАсСсАХасатасасасСсАТА сшаватадас

АтТсАдастасАлЧасСАасСсАааасАаАтТатадсоссстассатаасстасптАСсСАа

САПдДАИаСОСС

НІ1210 УК сасСсАда,адассСсСАдастастаАТСТАСАаСАСсСАасСсАасСАаатТАСАССасо БА стассСсаАс дат СсАСАСИААлСаСсааоАаСсааСАССИАСТТСАССТТСАССАТСАСИСАаС стасдассс сласаостаасСсататАСТАСТаССАасСсАасСАСТАСАССАССССТоТаАСстТ товсоесасо ассСАСсСААд,астТапдастТадАа вАСАТССАаАтТадссСсАасАассстаасСАа,ассталасастаасатаваСаАс дасатадсс

АТСсАСсСТасАДОССЯССАаССАсСадтатадссосстассатаасстааТАССАа

САПдДАИаСОСС

Н сасСсААдсасссСсСААдастастаАТСсТАСАаСАСсСАасСсАасСАаатТАСАССасо и1210 УК.1 СТОСССАСС 55 дастттласСсаадАд,аСса,ссАаСсааСАССПАСТТСАССТТСАССАТСАСаСАаС стасдасос вАаспАСАТСасССАССТАСТАСТИАССАаСАасСсАСТАСАССАССССТСТалсст тоа,есСда апСАССсАдастасАсаАТСАДа

Продовження Таблиці 8 вАСАТССАСАТаАСССАсАаСсоСстАаасАа,асстаАда,асастааСсатавасцАс даа,ватаАСс

АТСсАССТтТаСАдДааССАасССАсааАатТатаасссстассатаасстатТАССАа

САпАдаСос

Ни1210 васСсААдатоСССсСААлаСсТа|астаАТСТАСАаСАСсСАааСАаСАааТАСАССаас Бб

УКлла стасссдас дааттлдаСсасАдассасХаСааСАССаАСТТСАССТТСАССАТСДОаСАСС стасдасСсо вдос

САТСаССАССТАСТАСТаССАаСАССАСТАСАССАССССтотТаАСссттаваТс

САс апСАССАдастасвАаАТСААС вАСАТТСАСАТаАССсСсАИатоСсоСстАаасАа,асстатосастсосатаааСцпАСА саеатаАСс

АТСсАССТтТаСАдДОааССАХасССАасаАаСсатаАСсАасстаТастатаассСстасТтАТСААС

АСАдасСсСтТ васСААвасСТоСтТААастосСтТаАТСТАСАаСАСАТСОСТОССОасТАСАССЯИада

Ни1210 МК 2 тессостеос 57 дааттадассасХа,асвастСааСАССаАТТТСАСССТОаАССАТТТОСТОоСС тасдассс свАдапАСТТСсасСАССТАСТАСтТасСсСсАаСАасСАСТАСАССАСАССССТаАСсСтТ тс,сасСАса асАССААдасСтТасАаАсаАТСААаСОас вАСАТТСАСАТаАССсСсАИатоСсоСстАаасАа,асстатосастсосатаааСцпАСА саеатаАСс

АСАдасСсСтТ

Ни1210 васСААвасСТоСтТААастосСтТаАТСТАСАаСАСАТСОСТОССОасТАСАССЯИада 58

УК.2а тасссоАСс дааттАоссасХдаса,вастоСааСАСССАТТСАСССТаАССАТТТОСТОоСС тасдассс свАдапАСТТСсасСАССТАСТАСтТасСсСсАаСАасСАСТАСАССАСАССССТаАСсСтТ тс,сасСАса аасАССААласСтТасдхаАТСААаСсИся вАСАТТСАСАТаАССсСсАИатоСсоСстАаасАа,асстатосастсосатаааСцпАСА саеатаАСс

АСАдасСсСтТ

Ни1210 сасСсАдаАаСсССсТАдасСстТосСтТаАТСТАСАаСАСАТОСТОССааТтТАСАССЯИДаИ Ба

УК.2р тасссоАСс дааттАоссасХаса,аастСааСАСССАТТСАСССТаАССАТТТОСТОоСС тасдассс свАдапАСТТСсасСАССТАСТАСтТасСсСсАаСАасСАСТАСАССАСАССССТаАСсСтТ тс,сасСАса аасАССААласСтТасдхаАТСААаСсИся

САСАТТСАСАТаАСсСсСсАИатоСсоСстАаасАа,асстатсастсосатаавасСсаАСА саеатаАСс

АТтТсАаСсТасСсААлдааСсСА,аСсСАа,асАСса,атаАСАсстастатаасстТастАТСАА

САПАдасСстТ

Ни1210 сасСсАдадасСссСсСтТАдастоСстТаАТСТАСАаСАСАТОСТОоССаатТАСАССОвада

МУК.2е тасссоАСс дааттАоссасХаса,аастСааСАСССАТТСАСССТаАССАТТТОСТОоСС тасдассс свАдапАСТТСсасСАССТАСТАСтТасСсСсАаСАасСАСТАСАССАСАССССТаАСсСтТ тссассСАа аасАССАдастТасьльаАТСААаСсас

Гуманізовані гени МН та МК отримували синтетичним шляхом, а потім, відповідно, клонували у вектори, які містять константні домени гамма 1 людини та каппа людини. При спарюванні УН людини та УК людини отримували 40 гуманізованих антитіл (див. таблицю 9).

Таблиця 9

Гуманізовані антитіла з областями МН та МІ.

УНН. УНлЛа Мине; Унаг УН.га Унг.р УН ншето укл ІНиї210-1 |Нит210-2 |Ниї210-3 ншї210-4 |ншегю5 | / ншето укла І|Ниї210-7 |Нит210-8 |Ниї210-9 нші2г10-0 Іншею1 | Її

Приклад 7: Антигензв'язуючі властивості гуманізованих антитіл до РО-Ї 1

Здатність до зв'язування рекомбінантного РО-І 1 людини

Для оцінки антигензв'язуючої активності гуманізовані антитіла тестували методом ІФА

ЕГІ5А. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білком РО-І1-Рс людини у концентрації 0,1 мкг/мл у ФСБ, 100 мкл/лунку при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 100 мкл/лунку 595 БСА. П'ятиразові розведення гуманізованих антитіл, починаючи з 10 мкг/мл, додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1-2 годин при КТ. Планшети промивали ФОБ/Туееп, а потім інкубували з антитілом кози проти дО миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (НЕР), впродовж 1 години при КТ. Після промивання планшети проявляли з субстратом ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при ОЮ 450-630 нм. Як показано на фіг. б, усі гуманізовані антитіла демонструють співставну ефективність зв'язування з РО-Ї1 людини у порівнянні з химерним антитілом.

Здатність до зв'язування з експресованим у ссавців РО-Ї 1 людини

Для оцінки антигензв'язуючої здатності аналізували зв'язування гуманізованих антитіл з експресованим у ссавців РО-1 1 із застосуванням ЕАС5. Коротко, спочатку клітини РОЇ 1-СНОК інкубували з 5-разовими серійними розведеннями гуманізованих антитіл, починаючи з 2 мкг/мл, при КТ впродовж 1 години. Після промивання буфером для ЕАС5 (ФСБ з 2 95 ФБС) додавали у кожну лунку кон'юговане з АЇІеха 488 антитіло проти Їдс людини та інкубували при КТ впродовж 1 години. МЕЇ АІеха 488 оцінювали з використанням БАСсЗАГгіай. Як показано на фіг. 7, усі гуманізовані антитіла можуть високоефективно зв'язуватися з РО-11, експресованим на клітинах ссавців, співставним з химерним антитілом чином.

Для дослідження кінетики зв'язування гуманізованого антитіла у зазначеному прикладі проводили ранжування за афінністю із застосуванням Осієї Кеа 96. Як показано у таблиці 10, пи1210-3, пи1210-8, пи1210-9, пи1210-14,. пи1210-17, пи1210-1 та Ни1210-22 демонструють найкращу афінність, співставну з химерним антитілом.

Таблиця 10

Ранжування за афінністю гуманізованих антитіл

Визначення повної кінетичної афінності гуманізованих антитіл із застосуванням Віасоге?

Зв'язування гуманізованих антитіл з рекомбінантним білком РО-Ї1 (РО-Ї1 людини з ПВів- міткою) тестували із застосуванням способу захоплення у системі Віасоге "М. тАБ миші НІ-1210-

З захопили із застосуванням антитіла проти Ес миші, нанесеного на СМб5-чип. Серійні розведення білку РО-І 1 людини з Ппіз-міткою вводили поверх захопленого антитіла впродовж З хвилин при швидкості потоку 25 мкг/мл. Антигену дозволяли дисоціювати впродовж 900 с.

Експеримент повністю проводили на Віасоге 1200. Аналіз даних проводили з використанням аналітичного програмного забезпечення Віасоге Т200; результати представлені у таблиці 11 нижче.

Таблиця 11

Визначення афінності із застосуванням Віасоге

Міжвидова активність

Для оцінки зв'язування гуманізованих антитіл з пиРО-І1, РО-І1 миші, РО-Ї71 щура, РО-І 1 макака-резус проводили тестування антитіл методом ІФА ЕГІЗА. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білком РО-І 1-Рс людини, миші, щура та макака-резуса у концентрації 1 мкг/мл у ФСБ, 100 мкл/лунку при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 100 мкл/лунку 5 95

БСА. Триразові розведення гуманізованих антитіл, починаючи з 1 мкг/мл, додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1-2 годин при КТ. Планшети промивали ФОБ/Гмееп, а потім інкубували з антитілом кози проти дб миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (НЕР), впродовж 1 години при КТ. Після промивання планшети проявляли з субстратом ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при 00 450-630 нм. Антитіло Ни1210-41 може зв'язуватися з

РО-І1 макака-резуса з меншою афінністю та не здатне зв'язуватися з РО-І1 щура та миші (фіг. 8).

11111111, Людина, | Макакрезусї | Щур | Миша відсутнє відсутнє

Специфічність у відношенні представників сімейства

Для оцінки зв'язування гуманізованого антитіла проти РО-1/1 з сімейством В7 людини та іншими контрольними точками імунної відповіді досліджували зв'язування зазначеного антитіла 3 В7-НІ (РО-І 1), В7-ОС, В7-1, В7-2, В7-Н2, РО-1, СО28, СТІ А4, ІСО5 та ВТГА із застосуванням

ІФА ЕГІЗА. Як показано на фіг. 9, антитіло Ни1210-41 здатне специфічно зв'язуватися тільки з

В7-НІ (РО-І 1).

Приклад 8: Гуманізовані антитіла блокували активність РО-І 1 людини у відношенні РО-1

Клітинний аналіз блокування рецепторів

Для оцінки блокувального ефекту гуманізованих антитіл на зв'язування РО-Ї1 людини, експресованого на клітинах ссавців, з його рецептором РО-1 використовували аналіз блокування рецепторів на основі методу ЕБАС5. Коротко, клітини РОЇ 1-СНОКІ1 спочатку інкубували з З-разовими серійними розведеннями тАб миші НІ-1210-3, починаючи з 20 мкг/мл, при КТ впродовж 1 години. Після промивання буфером для ЕАС5 (ФСБ з 2 95 ФБС) додавали у кожну лунку мічені біотином пиРО-1 та інкубували при КТ впродовж 1 години. Після цього додавали у кожну лунку стрептавідин-ФЕ на 0,5 години після дворазового промивання буфером для ЕАС5. Середню інтенсивність флуоресценції (МЕ!) ФЕ оцінювали з використанням

ГАСоАГам. | МРЇ тестованоо зетегив) оінгібуванвя -|1---- - - Є Ж т Й Я - - - я Ь ж 514х10095

МЕРЇ контролю- основи

Як показано у таблиці 12 нижче, антитіла Ни1210-3, Ни1210-9, Ни1210-8, Ни1210-14,

Ни1210-17, Ни1210-19 та Ни1210-22 демонструють співставну з химерним антитілом ефективність у відношенні блокування зв'язування РО-І1 з РО-1.

Таблиця 12

Аналіз блокування рецепторів РО-1 11111111 ВісРОТОЗОмкмлуд///////С 1111111111111тоР | вСБО

Аналіз блокування рецепторів при застосуванні рекомбінантного РО-Ї 1 людини

Існують два рецептори РО-І1 людини, а саме, РО-1 та В7-1. Для дослідження блокуючих властивостей гуманізованого антитіла до РО-Ї1 на зазначені два білки у даній роботі використовували білковий аналіз блокування рецепторів. Коротко, мікротитраційні планшети покривали білком людини РО-Ї 1-Ес у концентрації 1 мкг/мл у ФСБ, вносячи по 100 мкл/лунку, при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували 200 мкл/лунку 5 95 БСА при 37 "С впродовж 2 годин. 50 мкл міченого біотином білюу людини РО-1-Рс або В7-1їм та по 50 мкл 5-разових розведень антитіл до РО-Ї1, починаючи з 100 нМ, додавали у кожну лунку та інкубували впродовж 1 години при 37 "С. Планшети промивали ФСБ/Тмееп, а потім інкубували із стрептавідином-НКР впродовж 1 години при 37 "С. Після промивання планшети проявляли з субстратом ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при 00 450 нм. Як показано на фіг. 10 та 11, Ни1210-41 може ефективно інгібувати зв'язування РО-І1 людини з РО1 людини та В7-1.

Приклад 9: Стимульована гуманізованим антитілом імунна відповідь Т-клітин людини.

Аналіз з використанням реакції змішаної культури лімфоцитів

Для оцінки функції гуманізованих антитіл іп міго оцінювали відповідь Т-клітин людини в умовах реакції змішаної культури лімфоцитів. Проводили диференціювання ДК людини з СЮО14-- моноцитів у присутності ГМ-КОФ та ІЛ-4 протягом 7 днів. Потім СО4 «Т-клітини, взяті від іншого донора, культивували разом з ДК та серійними розведеннями блокуючого антитіла проти РО-Ї 1.

На 5 день після інокуляції аналізували продукування ІЛ-2 та ІФН-у у культуральному супернатанті. Результати показали, що антитіла Ни1210-8, Ни1210-9, Ни1210-16 та Ни1210-17 можуть дозозалежним чином стимулювати продукування ІЛ-2 та ІФН-у, що вказує на здатність антитіл проти РО-І 1 стимулювати відповідь Т-клітин людини.

Аналіз з панеллю антигенів СММУ

Для оцінки функції гуманізованих антитіл іп міго оцінювали відповідь Т-клітин людини у аналізі з панеллю антигенів СММ. МКПК людини стимулювали 1 мкг/мл антигену СММ у присутності серійних розведень гуманізованих антитіл. Як показано на фіг. 12 та 13, Ни1210-40,

Нит1210-41 та Ни1210-17 можуть дозозалежним чином стимулювати продукування ІФН-у.

Приклад 10: Інгібування росту пухлини під дією тАБ проти РО-І 1.

Клітини лінії аденокарциноми легені людини НСС827 прищеплюють мишам МОЮ зсіа

Сатта (МО). Миші М5О являють собою імунодефіцитних мишей МОЮ 5сіайа сатта з найбільш вираженим імунодефіцитом, що робить їх ідеальними реципієнтами пухлинних клітин людини та щеплення МКПК. Через 10 днів після щеплення мишам-носіям пухлин трансплантують МКПК людини. Приблизно через 20 днів після щеплення, коли об'єм пухлини досягає 100-150 мму, мишам починають вводити антитіло РО-Ї1 через день у дозуванні 5 мг/кг. Об'єм пухлини відстежують через день при введенні антитіла. Як показано на Фіг. 14, Ни1210-31 може пригнічувати ріст пухлини на 30 9о у дозуванні 5 мг/кг. Антитіло Ни1210-41 може дозозалежним чином пригнічувати ріст пухлини, при цьому антитіло Ни1210-41 також дозозалежно знижує масу пухлини (Фіг. 15).

Приклад 11. Комп'ютерне моделювання додаткових варіантів та оптимізації гуманізованих антитіл

Передбачалось, що певні залишки амінокислот у межах СОК областей або каркасних областей можуть бути змінені для додаткового покращення або зберігання активності та/або стабільності антитіл. Використовуючи обчислювальний інструмент (мМесіогМТІ!, доступний за посиланням /ммлиу.ері.ас.икЛооів/твза/сіивіа(ю/) тестували структурні, конформаційні та функціональні властивості варіантів; виявлені перспективні варіанти (у межах областей СОК) перераховані у таблицях нижче.

Таблиця 13

Області СОВ МН та МІ. та їх варіанти, що підходять для включення у гуманізовані антитіла подо ТТ Ох ПО сх НО (сом 11111116 пн ЕТ я ПО сх ХО 0 І8НноМ87771111111111111111111111111111164с1 нео ТТ ТЕ Ох НО с' ПО 11 І8МОМТ777711111111111111111111111111166сСсСс2 пи ЕТ Тех КО сум ОО 11111111... |(пвросалмууВбоЗуКа -/::/77// 17777171717171717687сИс2с2 11111111. (пвроаРМУУВБОВМКО ///77777777/7171717171717171717169сСс2с2 11111111... фпвросонуувоВУКа, 77777777 17717171 711111111111...ю.ю фпвросонмувовУука.д/7/7////////77/ С! 11111111... |пвроссулууВоВУКад///777777777/717717171717172сСсС 11111111... фпвросомуувОТУуКад 7777 17771115 СС 11111111... |пвросомуувосСУукад 77777 17717171717171174 11111111... фпвросоммуВроВІКа 77777711 11111111 фпвросомуувоВІКад 77777777 17777717171717117176сСсС

Продовження Таблиці 13 .....ю.юИ (пвросомуувовМкКа 77777 / С! пил Гете ТТ) ДЯ НО: ХО 11111110 фОРОКАУАЮМ7777771111111171111111111111791 ни ТЕТ ТТ ДО НО: то ПО ни ТЕТ ТТ ДО ПООєс х НООО ни ТЕТ ТТ ДО НО: У ЗО ни ТТ ТТ До КО: ХТО ни ГЕ Х ТСТЕе ДО НО с У У 11111111 ФЕЕРКВМАОМГ//777777777171717111111111111111111185сСс2С ни Піст ТЕ ТТ ДО НО с ПО ни СТАТИ ДО ПО с У ДО ни ПЕТ ТТ ДО НО: Є: ПО ни ПЕТ та ГТУ ДО НО: ПО 11111111 ФфЕНаКВУУАОМГГ/////77777777777777171711717ї111111111190сСс2 11111111 ДКАТООМТРАУМАЇГ////7777777777777111717111111111111СсСсС20 11111111 ДФКАСО0МТРАМАЇГ//777777777777771711717ї1111111111192сСсС2С подо ЕЕ ТЯ ПО ПО: Х ЗО 1111100 0от55ВМТ1111111111111111111111111111111111111111984с21 11111110 15855ВУТ1111111111111111111111111111111111111195СсСсС2С недо ТТ ЕТ ля ПО НО: У пи ТЕ: Ох ПО: у ОО пи ЕЕ ТЯ ПО ПОТ: ЗО 1111100 |5То5ВМТ77711111111111111111111111111111199871 подо ЕЕ Я я ПОН Те Я пи Ето 7 Ох ПОН То ПОН нини: п Ох То У по пи ЕЕ ЕТ я ПО ПО То х ЗНО ни ЕЕ ЕТ 15 Ох ПО То М 0 15Т85ВММИТ11111111111ї111111111111о51

КУТИ стві; х ПО Гетот и Я «ЛИ НН КОНИК з ПО недо ет то ле ОО НО СТ: З 0000 фронМттРІТЇ 77777771 11000 0МоНнМТтРИТ 77777771717171717171717111111111111111081 11111000 ФОвЕНМТТРТЇГГ////77777777717171717171711111111111111111091 111000 дфорнМтРІЇ ГГ//77777711111111171111111111111ло 111100 бфомМнМтРЇ 1111111111ї111111111

Підкреслюванням виділені гарячі точки для мутованих залишків та відповідні заміни

Приклад 12: Ідентифікація епітопу РО-Ї 1

Зазначене дослідження проводили для ідентифікації залишків амінокислот, залучених у зв'язування РО-1 1 з антитілами згідно з даним описом.

Конструювали бібліотеку РО-Ї1 із застосуванням сканування аланіном. Якщо коротко, отримували 217 мутантних клонів РО-Ї1 на платформі для конструювання білків від Іпіедгаї

Моїіесціаг. Визначали зв'язування Ни1210-41 Раб з кожним варіантом у бібліотеці мутантів РО-Ї 1 у двох повторах із застосуванням високопродуктивної проточної цитометрії. З кожної точки необроблених даних віднімали фонову флуоресценцію та нормували за реактивністю у відношенні РО-Ї1 дикого типу (МУТ). Для кожного варіанту РО-І 1 будували графік середньої величини зв'язування як функції від експресії (реактивність у відношенні контрольного тАБ проти РО-11). Для попередньої ідентифікації найважливіших клонів (перекреслені кола) використовували порогові значення (пунктирні лінії), що відповідають » 70 9о зв'язування УМТ з контрольним МАбБ та «30 95 реактивності М/Т з відношенні Ни1210-41 Раб (Фіг. 16). 134, К162 та М183 з РОІЇ1 були ідентифіковані як необхідні для зв'язування Ни1210-41 залишки. Низька реактивність клону М183А у відношенні Ни1210-41 Рар передбачає, що він є основним енергетичним учасником зв'язування Ни1210-41, та менший внесок роблять У134 та К162.

Найважливіші залишки (сфери) були ідентифіковані у тривимірній структурі РО-І1 (РОВ ІОЖ 5ООК, 2Папо еї аї., 2017), представленій на фіг. 17. Зазначені залишки, 134, К162 та М183, відповідно, складають епітоп РО-І/1, що відповідає за зв'язування з антитілами відповідно до різних варіантів реалізації даного винаходу.

Цікаво відмітити, що всі зазначені залишки, 134, К162 та М183, локалізовані у межах Ідс- домена білку РО-І 1. Позаклітинні частини як РО-1, так і РО-І1 містять І(дМ-домен та ІдС-домен.

Загальновідомо, що РО-1 1 зв'язується з РО-1 за рахунок зв'язування їх ІдМ-доменів між собою.

Однак Ни1210-41, на відміну від таких стандартних антитіл, зв'язується з ІдС-доменом, що, як очікувалось, буде неефективним для інгібування зв'язування РО-1/РО-І1. Зазначений інший епітоп Ни1210-41, неочікуваним чином, можливо робить внесок у чудову активність Ни1210-41.

Приклад 13. Конструювання антитіла проти РОЇ 1

У прикладах 13-17 описана робота з ідентифікації додатково удосконалених антитіл на основі Ни1210-41 із застосуванням мутагенезу.

Злитий білок індукованої активацією цитидиндезамінази (АІЮ) та не маючого нуклеазної активності асоційованого з розділеними регулярними проміжками кластерними короткими паліндромними повторами (СКІ5РК) білку 9 (йСа59) використовували для високопродуктивного скринінгу функціональних варіантів у Т-клітинах 293. Коротко, одиночні гідові (ог) РНК, які розпізнають 6 СОЕ антитіла, можуть направляти злитий білок аСа59-АЇІЮ до 6 СОЕК антитіла та індукують мутації у області СОК. Мутовані антитіла були експоновані на поверхні клітин 293.

Отримані клітини продемонстрували кращу активність зв'язування, ніж немутований еквівалент; проводили їх РГАС5-сортування для наступного секвенування. Була ідентифікована мутація з заміною 560 на К у СОКНАІа, яка потенційно робить позитивний ефект на антитіло.

Для оцінки антигензв'язуючих властивостей мутанта 56бОК (СОКНЗ) аналізували зв'язування зазначених антитіл з експресованим у ссавців РО-11 із застосуванням ЕАС5. Коротко, клітини

РО-І1 Каїї спочатку інкубували з 5-разовими серійними розведеннями гуманізованих антитіл, починаючи з 2 мкг/мл, при КТ впродовж 1 години. Після промивання буфером для ГАСЗ (ФСБ з 296 ФБС) додавали у кожну лунку кон'юЮговане з АІеха 488 антитіло проти ЇД0 людини та інкубували при КТ впродовж 1 години. МЕЇ для АЇеха 488 оцінювали з використанням

ЕАСЗАГгіапй. Як показано на фіг. 18, мутант 5бОК високоефективно зв'язувався з РО-11, експресованим на клітинах ссавців, з більшою активністю у порівнянні з вихідним антитілом

Ни1210-41. Потім зазначений мутант 560К використовували як вихідне антитіло для подальшого мутаційного аналізу відповідно до опису нижче, та воно позначено як "УЛ".

Для конструювання антитіл створювали чотири підбібліотеки моноклональних антитіл проти

РО-І1 із застосуванням будь-якої з наступних стратегій. Відповідно до стратегії 1 проводили мутагенез варіабельного домену важкого ланцюгу МН СОКЗ або МІ-СОКЗ шляхом високорандомізованих мутацій. Відповідно до стратегії 2 отримували дві комбіновані бібліотеки

СОРЕ, які складаються з (МН-СОВЗ, МІ -СОЗ та МІ -СОМКІ) або (МН-СОВІ, МН-СОК2 та МІ-СОВ2) із застосуванням скринінгу СОК методом "проходження" з контрольованим рівнем мутацій.

Біопеннінг; способи фагового пеннінгу адаптували шляхом скорочення тривалості інкубації/зв'язування до промивання у жорстких умовах. Коротко, 100 мкл магнітних стрептавідинових гранул (Іпмігодеп, США) блокували 1 мл МФСБ впродовж 1 години при кімнатній температурі. У іншій пробірці фагову бібліотеку попередньо інкубували (5х10711--12 для кожного раунду) з 100 мкл магнітних стрептавідинових гранул у 1 мл МФСОБ для видалення небажаних зв'язуючих речовин. Магнітний концентратор частинок використовували для розділення фага та гранул. До фагу додавали біотинільований білок РО-І1, інкубували впродовж 2 годин при кімнатній температурі та обережно перемішували за допомогою шейкера з верхнім приводом. Гранули, що несуть фаг, з розчину розділяли у магнітному концентраторі частинок; супернатант утилізували. Гранули промивали свіжим промивним буфером, 10-разово промивали ФСБТ та 10-разово - ФСБ (рН 7,4). Додавали 0,8 мл 0,25 95 трипсину у ФСБ (5Зідта,

США) та інкубували впродовж 20 хвилин при 37 "С для елюювання фага. Отриманий фаг титрували та здійснювали "спасіння" фага для наступного раунду пеннінгу, зі зниженням концентрації антигену від раунда до раунду. 60 Скринінг методом ІФА ЕГІЗА та ранжування швидкості зв'язування/дисоціації

Підбирали та індукували клони з потрібних продуктів пеннінгу; проводили ІФА ЕГІЗА фага для первинного скринінгу; позитивні клони аналізували шляхом секвенування; находили унікальні "гарячі точки". У таблиці 14 представлені ідентифіковані мутації. Як показано нижче, залишки ЕСК у СОКНЗ являють собою залишки - "гарячі точки", що забезпечують одержання удосконалених антитіл.

Таблиця 14

Мутації у СОК 00000 Ї1СОВ-НІ сОов-нН2 СОов-нЗ СОВв-11 сов-І2 сов- З 5УрМ5 | ТІЄВАСОУІМУВОБУКОЇ ЕРСКВМАЇ ОМ КАБОЮУТРАМАЇ 5Т558МТІ ООНУТТРІ Т

ЗЕО

ВЗ | - | с о | ен е О- | -Ки- | - |Ме- б4 | -Щ| 1 "Ют | -2 85 | -ММ-- | -- | -5- ві | - |... с сть | ЗИФНА--- | - | - | с---- вбо | - | 0... Ст | ЯРМА | ----- - 0 | сн 3 | - | с о тя | НЕ | - ОО сб | - | с о ЮТюя | МЕ | - ОЇ

АТО - |. с ст | НА - -

Аг - | 000 с о | ШВА | - - 00 осн

ЛАЗ ОЇ - |... с те - - | с- - 6 | --- | .-80А- х МЛ відрізняється від Ни1210-41 заміною 560ОК (нумерація за Кабаї) у важкому ланцюзі для збільшення афінності

Послідовності амінокислот варіабельних областей зазначених антитіл показані у таблиці 15 нижче.

Таблиця 15

Послідовності антитіл . . ЗЕО І

ЕМО! МЕЗОаСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ

МТ-МН пПЗрАааміиУвОоБУКОаВеЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І АСЕОТАММІСАВЕБЕ 141

СКАМАГОмМУсОоаТТУТУ55

РІОМТО5РББІ БАБМАОВМТІТСКАБОЮМТРАМАМ МООКРОКАРКІ МБ

МТ-УкК 1558 ТаМРЗАЕЗаБЗаЗзатТорЕТЕТІЗБІ ОРЕОІАТУМСООНМУТТРІ ТЕСО 142

СТКІ ЕІК

ЕМО! МЕЗОаСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ в3-Ун ІБВАСОаМІ и вОоЗУКавВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАММІСАВЕР 143

СКАМАГОмМУсОоаТТУТУ55

РІОМТО5РББІ БАБМА ОВТ СКАКОЮСМТРАМАМ МООКРОКАРКИ ІМ

В3-УК т55АУТамРЗНЕЗОаБЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕБВІАТУУСМОНУТТРІ ТРаО 144

СТКІ ЕІК

ЕМО! МЕЗОаСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ б4А-Ун ІБВАСОаМІ и вОоЗУКавВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАММІСАВЕР 145 екАМАГОоБУОСТТУТУЗ5

РІОМТО5РББІ БАБМАОВМТІТСКАБОЮММ РАМА МООКРИЕКАРКИО ІМ б4-Ук т5зАУтТамРЗНЕЗОВаБатоОЕТЕТІЗЗГОРЕПІАТУМСООНЗТТРІТРСО 146

СТКІ ЕІК

Продовження Таблиці 15

В1-Ун ІБВАСОаМІ и вОоЗУКавВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ 147

ЕМАМАСОМУСОоС,СТТУТУ55

В1-МУК т55АУТамРЗНЕЗОаЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕБОІАТУУСООНУТТРІ ТЕСЮО 148

СТКІ ЕК

ЕМО! МЕЗОаСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ вв-н ІБ)ВАСОаМІ во ЗУКаТвВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ. 149

РУАХАГОУМСсОо,СТТУТУЗ5

РІОМТО5РББІ БАБМАОВМТІТСКАБОЮМТРАМАМ МООКРОКАРКІ МБ вб-УК т55АУТамРЗНЕЗОаЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕБОІАТУУСООНУТТРІ ТЕСЮО 150

СТКІ ЕК

С3-УН ІБ)ВАСОаМІ во ЗУКаТвВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ. 151

НЕВМАГОУМСОоС,ТТУТУ55

С3-МУК т55АУТамРЗНЕЗОаЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕПОІАТУУСООНУТТРІ ТЕО 152

СТКІ ЕК

ЕМО! МЕЗОаСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЕТЕЗЗ5УОМЗУМУУАОАРОКБІ ЕМУМАТ б6-Ун ІБ)ВАСОаМІ во ЗУКаТвВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ. 153

ХЕВМАГОУМСсОоСТТУТУ55

Сб6-УК т55АУТамРЗНЕЗОаЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕБВІАТУУСООНУТТРІ ТЕО 154

СТКІ ЕК

А1-иН ІБ)ВАСОаМІ во ЗУКаТвВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ. 155

ІНАмМАСОоОУМУсаОатТТУТУ55

А1-УК т55АУТамРЗНЕЗОаЗавзатТОЕТЕТІЗІ ОРЕБОІАТУУСООНУТТРІ ТЕО 156

СТКІ ЕК

А2-УН ІБ)ВАСОаМІ во ЗУКаТвВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАМУМІСАВЕЇ. 157 вав оУмаоаттУТУ5о

А2-УК т55АУТамРЗНЕЗИаЗаватТОЕТЕТІЗІ ОРЕОІАТУУСООНУТТРІ ТЕО 158

СТКІ ЕК

АЗ-МУН ІБВАСОаМІ и вОоЗУКавВЕТІЗВОМАКМ5ЗІ МІ ОММ5І ВОЕОТАММІСАВЕР 159

СКАМАГОУМмсОстТТУТУЗо

АЗ-МК т55АУТамРЗАЕЗазавзаТтОЕТЕТІЗІ ОРЕОІАТУУСООНЗОАРІ ТЕО 160

СТКІ ЕК

Приклад 14. Антигензв'язуючі властивості антитіл до РО-Ї 1

Як показано у таблицях 14 та 15, у цілому 9 унікальних клонів були охарактеризовані та перетворені у повнорозмірний дз.

Здатність до зв'язування з рекомбінантним РО-І1 людини

Для оцінки антигензв'язуючої активності проводили тестування антитіл методом ІФА ЕГІЗА.

Коротко, мікротитраційні планшети покривали РО-І 1-Ес-білком людини у концентрації 2 мкг/мл у

ФСБ, додаючи по 100 мкл/лунку, при 4 "С впродовж ночі, після чого блокували додаванням 100 мкл/лунку 5906 БСА. У кожну лунку додавали 4-разові розведення гуманізованих антитіл, починаючи з 10 мкг/мл, та інкубували впродовж 1-2 годин при КТ. Планшети промивали

ФоСБ/Тугееп, а потім інкубували з антитілом кози проти дос миші, кон'югованим з пероксидазою хріну (НЕР), впродовж 1 години при КТ. Після промивання планшети проявляли з субстратом

ТМВ та аналізували на спектрофотометрі при 00 450-630 нм. Як показано на фіг. 19, усі гуманізовані антитіла продемонстрували високу ефективність зв'язування з РО-Ї1 людини, причому Вб та СЗ показали кращі результати у порівнянні з вихідним клоном дикого типу (М/1).

Для оцінки антигензв'язуючої здатності антитіл аналізували їх зв'язування з експресованим у ссавців РО-Ї1 із застосуванням РАС5. Коротко, клітини РОЇ 1-Каїї спочатку інкубували з 5- разовими серійними розведеннями гуманізованих антитіл, починаючи з 2 мкг/мл, при КТ впродовж 1 години. Після промивання буфером для РГАС5З (ФСБ з 2 95 ФБС) додавали у кожну лунку кон'юговане з АЇеха 488 антитіло проти (ДС людини та інкубували при КТ впродовж 1 години. МЕЇ АІеха 488 оцінювали з використанням ЕРАСс5ЗАГгіаП. Як показано на фіг. 20, Вб високоефективно зв'язувався з РО-І 1, експресованим на клітинах ссавців, з більшою активністю у порівнянні з вихідним антитілом дикого типу (М/1Т).

Ранжування гуманізованих антитіл за афінністю із застосуванням Віасоге

Для дослідження кінетики зв'язування гуманізованого антитіла у зазначеному прикладі проводили ранжування за афінністю із застосуванням Віасоге. Як показано у таблиці 16, Вб, С3,

Сб, АТ та АЗ демонстрували більш високу афінність у порівнянні з вихідним антитілом дикого типу (МТ).

Таблиця 16

Ранжування за афінністю

Вб 77777771 1711111242ЕчЮ5 | 246-304 | ї02Е-09

Приклад 15. Клітинна функція антитіл проти РОЇ 1

Для тестування здатності антитіл проти РОЇ7 стимулювати Т-клітинну відповідь використовували експресуючі ПРО-1 клітини УигКкаї. Коротко, УигКкаї являє собою лінію клітин Т- клітинного лейкозу людини, які можуть продукувати ІЛ-2 при стимуляції ТОК. У зазначеному аналізі клітини игкаї, трансфіковані геном РО-1 людини з використанням лентивірусу, використовували як клітини-респондери. Клітини Каїї-РОЇ 1 використовували як антигенпрезентуючі клітини (АПК). Ентеротоксини стафілококів (ЗЕ) використовують для стимуляції сигналу ТСК. У зазначеній системі ектопічно експресований ПпПиРОЇ1 може пригнічувати стимульоване 5Е продукування ІЛ-2 клітинами УигкКаї, тоді як антитіла проти РОЇ 1 можуть попереджати продукування ІЛ-2. Коротко, АПК (2,5х107) культивували разом з експресуючими РО-1 Т-клітинами Уигкаї (1х105) при стимуляції 5Е. На початку культивування додавали антитіла проти РОЇ 1 (починаючи з 100 нМ, серійні розведення 1:4 для 8 доз). Через 48 годин оцінювали продукування ІЛ-2 у культуральному супернатанті із застосуванням ІФА

ЕСІЗА. Як показано на фіг. 21, моноклональні антитіла Вб мали велику активність у порівнянні з вихідним антитілом дикого типу (УМТ).

Приклад 16. Реакція змішаної культури лімфоцитів

Для оцінки функції антитіл до РОЇ 1 іп міго оцінювали відповідь Т-клітин людини в умовах реакції змішаної культури лімфоцитів. Коротко, проводили диференціювання ДК людини з

СОр14 моноцитів у присутності ГМ-КОФ та ІЛ-4 протягом 7 днів. Потім СО4-«Т-клітини, взяті від іншого донора, культивували разом з ДК та серійними розведеннями блокуючого антитіла проти

РО-Ї1. На день 5 після інокуляції аналізували продукування ІФН-у у культуральному супернатанті. Результати (фіг. 22) показали, що антитіло Вб більш активно стимулювало продукування ІФН-у у порівнянні з вихідним антитілом дикого типу (М/Т).

Приклад 17. Іп мімо ефективність антитіла до РОЇ 1 у сингенній моделі МСЗ8

Для оцінки ефекту РОЇ1 на ріст пухлини використовували гуманізовану РОЇ1 сингенну модель пухлини МСОСЗ38. У зазначеній моделі ген РОЇ 1 людини експресували у клітинах миші

МСОС38, при цьому позаклітинний домен гену РОЇ1 миші замінювали геном РОЇ 1 людини.

Відповідно, у зазначеній сингенній моделі з гуманізованими геном РОЇ1 МОЗ38 можна оцінити ефективність дії антитіла проти РОЇ1 людини на ріст пухлини. Клітини пиРОЇ1 МОЗз8 інокулювали підшкірно гуманізованим РОЇ 1 мишам. Після досягнення пухлиною об'єму 100-150 м3 внутрішньочеревинно вводили у дозуванні З мг/кг два рази на тиждень у цілому б доз вихідного антитіла М/Т та антитіл Вб. Результат (фіг. 23) показав, що антитіло Вб було більш активним у порівнянні з вихідним антитілом УМТ з 19 по 26 день.

Обсяг даного винаходу не обмежений конкретними описаними варіантами реалізації, які наведені у якості окремих ілюстративних прикладів індивідуальних аспектів даного винаходу, та будь-які функціонально еквівалентні їм композиції або способи входять у обсяг даного винаходу. Фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що можуть бути реалізовані різні модифікації та варіанти способів та композицій відповідно до даного опису без відступу від суті або обсягу даного винаходу. Відповідно, передбачається, що даним описом охоплені модифікації та варіанти даного винаходу за умови того, що вони входять у обсяг прикладеної формули винаходу, а також їх еквіваленти.

Усі публікації та патентні заявки, що згадуються у цьому описі, включені у даний документ шляхом посилань у тому ж ступені, як якби кожна індивідуальна публікація або патентна заявка була конкретним та індивідуальним чином вказана як включена шляхом посилання.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

-110» І-Мар «120». АНТИТІЛА ПРОТИ РО-11 ТА ВАРІАНТИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ -1305 541 М/-269085-М02 -1505 РСТ/СМ2018/081079 -1515» 2018-03-29 «1605» 166 «170» РаїепіНп мегвіоп 3.5 «2105» 1 «2115» 5 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 1 зЗег Туг Азр Меї 5ег 1 5 «2105» 2 «2115 17 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 2

Тпиг Пе Зег А5р Спіу Спу Спу Тут Пе Туг Туг Зег Авр Зег Маї Гув 1 5 10 15 сьуу -2105» З «2115» 10 «212» РАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 З

Сім Рне Сту Гуз Агу Туг Аа Гей Авр Туг 1 5 10 «210» 4 «2115 11 (218) «212» РАТ бо

213» Штучна послідовність «223» Синтетична «400» 4

Гуз АІа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аїа Маї Аа 1 5 10 «2105» 5 «2115 7 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 5 зег Тиг Зег Зег Ага Тут ТНг 1 5 «2105» 6 «2115» 9 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 6

Сіп Сп Ні Тук Тнг ТАг Рго І єи ТНг 1 5 -2105 7 «2115» 119 зо «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 7

Сіи Ма! Гуз І еи Ма! Спи Зег Сіу Сіу Авр Геи Ма! Гуз Рго Сіу Спу 1 5 10 15 зег і єи Гуз І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег Спу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 Зо

Ар Меї 5ег Тр Ма! Агу Сіп Тнг Рго Сім І уз Зег І ей Спи Тгр Ма! 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спіу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 50 55 60

Гуз Спу Ага Ре ТНг Пе 5ег Ага Авр Авп Аїа Гуз Авп Авп І ви Туг 65 70 75 80

Ї єи СіІп Меї 5ег 5ег І єи Ага бег Сім Авр ТНг Аа І єи Тут Пе Суз 85 90 95

Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110

Тниг Зег Маї Тиг Ма! Бег Зег 115 «210» 8 «2115» 119 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005» 8

Спи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Гуз Рго Счу Спу бо 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Ттр Маї Аго Сп Аа Рго Стпу Гуз Спу І еи Спи Тр Маї 35 40 45 зег ТП Пе Зег Азр Спу Спу Спу Туг Пе Тук Туг Зег Авр Зег Маї 50 55 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95

Аа Агу Сім Рпе Сту Гуз Ага Туг Ага Г еи Авр Туг Тгр Спу Сіп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «210» 9 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 9

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Гуз Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї

Ко) Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спіу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 35 85 90 95

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 40 «2105» 10 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність 45 «220» «г2З» Синтетична «4005» 10

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Гуз Рго Спу Спу 1 5 10 15 50 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег Спу Рпе ТНиг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Сту Гуз 5ег І еи Сім Тгр Маї 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спіу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Азр 5ег Маї 55 50 55 60

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Суб 85 90 95 60

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 в) «2105 11 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 11

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Гуз Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 0)

Азр Меї 5ег Ттр Пе Аг Сп Аїа Рго Стпу Гуз Спу Геи Сти Тер Маї 35 40 45 зег ТП Пе Зег Азр Спу Спу Спу Туг Пе Тук Туг Зег Авр Зег Маї 20 50 55 бо

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95 25 Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 12 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 12

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Гуз Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 Зо

Азр Меї 5ег Ттр Пе Аг Сп Аїа Рго Стпу Гуз Спу Геи Сти Тер Маї 35 40 45

Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Сіу Сп СІу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 13 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична 60 «4005 13

Сіи Маї Сіп І еи Маї Спи Бег Спу Спу Спу Гей Маї Гув Рго СПу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго ап Аа Рго Стпу Гуз 5ег І еи Сім Тгр Маї 35 40 45

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Суб 85 90 95

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105» 14 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 14

Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Ко) Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї зег ТП Пе Зег Азр Спу Спу Спу Туг Пе Тук Туг Зег Авр Зег Маї 60 35 Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 65 70 75 80

Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 40 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105» 15 45 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична 50 «4005 15

Сім Маї Сіп Г еи Геи Сі Зег Сіу Спу Спу Геи Маї Сип Рго Сіу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа бег Спу Рне Тиг Ріє 5ег Зег Туг 20 25 0) 55 Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Сту Гуз 5ег І еи Сім Тгр Маї 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 50 55 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Авп з5ег І уз Азп ТНг ГГ еи Туг 60 65 70 75 80

Тиг Тиг Маї Тнг мМаї 5ег Зег 115 «2105» 16 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 16

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 0) 20 Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї зег ТП Пе Зег Азр Спу Спу Спу Туг Пе Тук Туг Зег Авр Зег Маї 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 25 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І веи Агу Азр Си Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95

Ко) Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 -2105 17 «2115» 119 35 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 17 40 Спи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сип Рго Счу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Ттр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз Спу Геи Спи Тр Маї 45 35 40 45

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Агу Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80 50 Ї еи Сп Меї Авп 5ег І веи Агу Азр Си Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95

Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аїа Г еи Авр Туг Тгтр Спу Сп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 55 115 «2105» 18 «2115» 119 «2125 РВАТ 60 213» Штучна послідовність

«г2З» Синтетична «4005» 18

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Ї еи Сп Меї Авп з5ег ГГ еи Агу Авр Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Сув 85 90 95

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105» 19 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 19

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зо зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНиг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Сту Гуз 5ег І еи Сім Тгр Маї

Аа Тиг Пе Зег Си пу Спу СЧПу Туг Пе Туг Туг Зег Азр Зег Маї 35 50 55 60

Ї еи Сп Меї Авп з5ег ГГ еи Агу Авр Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Сув 85 90 95 40 Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 45 «2105» 20 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 20

Аа Тиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 50 55 60 60

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І еи Агу Азр Си Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Сув 85 90 95

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 21 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 21

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 Зо

Аа Тиг Пе Зег Азр Маї Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 50 55 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І єи Туг 65 70 75 80

Ко) Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Ттр Сіу Сп СІу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 22 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 22

Сіи Маї Сіп Г еи Маї Спи Зег Спу Сіу Спу Геи Маї Сип Рго СПу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 Зо

Азр Меї з5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спіу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 60 50 Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Аа Агу Сім Рпе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 55 100 105 110

Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 23 бо «2115» 119

«2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 23

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї 35 40 45

Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 24 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 24

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа бег Спіу Рне Тиг Рне 5ег Зег Туг 20 25 0)

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105» 25 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 25

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Спу Гуз СПУ Геи Спи Тгр Маї 60 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Азр Спу Спіу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Маї 50 55 бо

Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115 «2105» 26 «2115» 119 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 26

Сі Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Сіу Сіу Спу Гей Маї Сип Рго Счу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Ар Меї 5ег Тр Ма! Агу Сіп Тнг Рго Сім Гуз Зег І єи Сіи Тр Маї 35 40 45

Гуз Спіу Ага Ре ТНг Пе Зег Агу Авр Авп Аа Гуз Авп Авп І єи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Суб

Зо 85 90 95

Аа Агу Сім Рпе Сту Гуз Ага Туг Аїа Г еи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110

Тиг Ге Маї Тниг Ма! бег Зег 115

Зо «2105» 27 «2115 107 «212» РВАТ 213» Штучна послідовність 40 «220» «г2З» Синтетична «4005» 27

Азр Іе Маї Меї Тнг Сіп Зег Ні Гуз Рне Меї Зег Тнг Зег Ма! СПУ 1 5 10 15 45 Азр Аг Маї 5ег Пе бег Сув Гуз Аа 5ег Сіп Авр Маї Тиг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Спу Сп Бег Рго Гуз ГГ еи Г єи Пе

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго Авр Ага РНе Тниг Спу 5О 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тниг РНе Тнг Пе 5ег Зег Маї Сп Аа 65 70 75 80

Сім Авр І єм Аа Маї Туг Туг Сув Сп Сп Нів Туг ТАг ТНг Рго ГІ єи 85 90 95

Тиг РНе ау Аа Сіу Тиг Гуз Геи Спи Гей Гув 100 105 «2105» 28 «2115 107 60 «212» РВАТ

213» Штучна послідовність «г2З» Синтетична «4005» 28

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! Спу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СіІп Гув Рго Сту Гуз Аа Рго Гуз І еи І єи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе ТнНг Пе 5ег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80

Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Туг Тиг ТНг Рго ГІ єи 85 90 95

Тиг Ре Стпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Си Пе Гуз 100 105 «2105» 29 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 29

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сип Сіп Гув Рго Спу Гуз 5ег Рго Гуз ГГ еи Гей Пе

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 60 35 Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе ТнНг Пе 5ег 5Зег І єи Сп Рго 65 70 75 80

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 40 100 105 «2105» 30 «2115 108 «2125 РВАТ 45 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 30

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 50 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45 55 Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Ні Туг Ти Тнг Рго Гей 60 85 90 95

Тиг Ре Сату Сіп Спу Тиг Гуз Гей Спи Пе Гуз Аг9 100 105 «2105 31 «2115 108 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 31

Азр Аг Маї Тниг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег Зег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго Авр Ага РНе Тниг Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сп Ні Туг Ти Тнг Рго Гей 85 90 95

Тиг Ре Сату Сіп Спу Тиг Гуз Гей Спи Пе Гуз Аг9 100 105 «2105 32 «2115 108 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 32

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Ма! Тниг Рго Аіа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Спу Сп Бег Рго Гуз ГГ еи Г єи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег Зег Ага Туг ТАиг Стпу Маї Рго Авр Агу Ре ТАиг Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу ТНиг Азр Ре Тнг І єи Тнг Пе бЗег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80 сій Авр РНе Аа Тнг Туг Туг Сув Сип Сіп Ні Тут Тиг Тнг Рго Гей 85 90 95

Тиг Ре Сату Сіп Спу Тиг Гуз Гей Спи Пе Гуз Аг9 100 105 «2105» ЗЗ3 «2115 108 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 33

Азр Аг Маї Тнг Іе Зег Суз Гуз Аа 5ег Сп Ар Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) 60 маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Спу Сп Бег Рго Гуз ГГ еи Г єи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго Авр Ага РНе Тниг Спу 50 55 бо

Тиг Ре Сату Сіп Спу Тиг Гуз Гей Спи Пе Гуз Аг9 100 105 «2105» 34 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 34 даддіюдаадс ддіддадад сдасддадаї сюдідаадс сіддсдасад ссічаадсід (610) аасщідссд ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасадасс 120 сссдадаада дссіддадід ддіддссасс аїсадсдаїд дсдодсододсіа саїсіасіас 180 адсдасадсу Юаадддсад дисассаїс адсадддаса асдссаадаа саассідіас 240 сідсадаїда дсадссідад дадсдаддас ассодсссіді асаїісідсдс садддадіїс 300 дасаададді асдсссідда сїіасюддда садддсасса дсддассодї дадсадс 357 «2105» 35 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 35 даддідсадс юддіддадад сддаддадда сіддідаадс ссддаддсад ссюдадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсааад дссіддадчія додідадсасс аїсіссдаї осоддсодосіа саїсіанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асіасідсос садоддаднс 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105 36 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 36 даддідсадс юддіддадад сддаддадда сіддідаадс ссддаддсад ссюдадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсааад дссіддадід даїодссасс аїсіссдаїд дсдоасододсіа саїсїанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асіасідсос садоддаднс 300 доасаааадді асдсссідда сіасідддодас садддсасаа ссодассодї дадсадс 357 «-2105 37 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична 60 «4005 37 даддідсадс ддіддадад сддаддаадда сіддчдаадс ссддаддсад ссічадасю (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсідаді дадасаддос 120 ссіддсаааа дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд дсдосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асаісідсос садоддаднс 300 дасаааадді асдсссідда сіасіддддас садддсасаа ссуддассої дадсадс 357 «2105» 38 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005» 38 даддідсадс юддіддадад сддаддадда сіддідаадс ссддаддсад ссюдадасід (610) адсдсодсід ссадсддсії сассісадс адсіасдаса дадсіддаї садасаддсс 120 ссіюдсааад дссюдадю дададсасс аїсіссдаї дсодсдасіа саїсіанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссаїіді асіасідсдссадддаднис 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 39 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 39

Ко) даддідсадс ддіддадад сддаддадда сіддідаадс ссддаддсад ссідадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддаі садасаддсс 120 ссіддсааад дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд дсдосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асіасідсос садоддаднс 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 40 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 40 даддідсадс юддіддадад сддаддадда сіддідаадс ссддаддсад ссдадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд дсдосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асаісідсос садоддаднс 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 41 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 41 даддідсадс (дсіддадад сддаддадда сіддідсаас ссддаддсад ссідадасід бо аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 60 ссіюдсааад дссюдадю дададсасс аїсіссдаї дсодсдасіа саїсіанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асадсаадаа сасссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асіасідсос садоддаднс 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 42 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 42 даддідсадс (дсіддадад сддаддадда сіддідсаас ссддаддсад ссідадасід бо аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдаїд дсдоасодсіа саїсіїанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асадсаадаа сасссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддссдаддас ассдссодіді асаісідсос садоддаднс 300 доасаааадді асдсссідда сіасідддодас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105 43 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 43 даддідсадс ддіддадад сддаддадада сіддідсаас ссддадоасад ссідадасід бо аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддсес 120 ссіюдсааад дссюдадю дададсасс аїсіссдаї дсодсдасіа саїсіанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240

Ко) сідсадаїда асадссідад ддададдас ассоссдіді асіасідсдс ссадддааійс зо дасаааадді асдсссідда сїіасюддоас садддсасаа ссддассодїі дадсадс 357 «210» 44 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 4А даддідсадс ддіддадад сддаддадада сіддідсаас ссддадоасад ссідадасід бо аасдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддаї дадасаддасс 120 ссіддсааад дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд дсдосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддаїдаддас ассоссдіді асіасідсос ссадддадис 300 дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 45 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 45 даддідсадс ддіддадад сддаддадада сіддідсаас ссддадоасад ссідадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд дсдосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддададдас ассоссдіді асаїсідсдс садддасаійс зо дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 бо

«2105» 46 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 46 даддідсадс ддіддадад сддаддадда сюдіодсаас ссддаддсад ссідадасід (610) аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссюдадю доаддссасс аїсіссдаад дсоддсодосіа саїсіанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асодссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддададдас ассоссдіді асаїсідсдс ссадддааійс зо дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «210» 47 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 47 даддідсадс ддіддадад сддаддадада сіддідсаас ссддадоасад ссідадасід бо аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссіддадчі ддіддссасс аїсіссдагд содосдосіа саїстанас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддададдас ассоссдіді асаїсідсдс ссадддааійс зо дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 468 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 48 даддідсадс ддіддадад сддаддадада сіддідсаас ссддадоасад ссідадасід бо аадсдсодсід ссадсддсії сасснсадс адсіасдаса дадсіддої дадасаддес 120 ссіддсаааа дссіддадія ддіддссасс аїсіссдаїд Подсодсіа саїсіацас 180

Іссдасадсо Фааддодсаяд аїйсассаїс адсадддаса асдссаадаа садссідіас 240 сідсадаїда асадссідад ддададдас ассоссдіді асаїсідсдс ссадддааійс зо дасаааадді асдсссідда сіасідддоас садддсасаа ссддассої дадсадс 357 «2105» 49 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 49 даддідсадс ддіддадісє сддаддаддс сіддідсаас сіддаддсіс ссюадодсід (610) їссідідссо сіссдасії сасснсадс іссіасдаїа дадсіддої даддсадосі 120 ссіддааадд дссіддаєдчія доїддссасс аїсіссдасу дзадодсдосіа саїсіасіас 180 їссдасіссу дааддосад діісассаїс Ісссдодаса асдсосаадаа сісссідіас 240 сідсадаїда асісісісад ддсюаддас ассдссодіді апасідсоассадодаддидичзоо дасаададді асдсссідда Насюдддс садддсасас ддіщдасаді дадсісс 357 «2105 50 «2115 357 «2125 ДНК 60 213» Штучна послідовність

«223» Синтетична -4005 50 даддідсадс ддіддадісє сддаддаддс сіддідсаас сіддаддсіс ссюадодсід (610) їссідідссу снссдасії сассіїсадс іссіасдага дадсіддої дадасадасі 120 ссіддааадд дссіддаєдчія доїддссасс аїсіссдасу дзадодсдосіа саїсіасіас 180 їссдасіссу дааддосад діісассаїс Ісссдодаса асдсосаадаа сісссідіас 240 сідсадаїда асісісісад ддсюаддас ассдссодіді агаісідсассадддадчшй /зоо0 дасаададді асдсссідда НКасіддддс садддсасас даюдасаді дадсісс 357 «2105 51 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 51 даддідсадс ддіддадісє сддаддаддс сіддідсаас сіддаддсіс ссюадодсід (610)

Іссідідссу снссдасії сассісадс іІссіасдата дадсіддді дадодсадосі 120 ссіддааадд дссіддаєдчія доїддссасс аїсіссдасу дзадодсдосіа саїсіасіас 180 їссдасіссуд щааддосад діісассаїс Ісссдддаса асдссаадаа саассідіас 240 сідсадаїда асісісісад ддсюаддас ассодссодіді агаісідсоас садодадш ьзоо дасаададді асдсссідда НКасіддддс садддсасас даюдасаді дадсісс 357 «2105 52 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 52 даддідсадс ддіддацдісє сддаддаддс сідддсаас сідчаддсіс ссідадусід (610) їссідідссу снссдасії сассісадс іссіасдата дадсіддді даддсадасс 120 ссідадаада дссіддадія доїддссасс аїсіссдасу дзадодсдосіа саїсіасіас 180 їссдасіссуд щааддосад діісассаїс Ісссдддаса асдссаадаа саассідіас 240 сідсадаїда асісісісад ддсюаддас ассдссодіді агаісідсоассадодадни ди зо дасаададді асдсссідда НКасіддддс садддсасас даюдасаді дадсісс 357 «2105 53 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 53 даддідсадс ддіддадісє сддаддаддс сіддідсаас сіддаддсіс ссюадодсід (610)

Іссідідссу снссдасії сассісадс іІссіасдата дадсіддді дадодсадосі 120 ссіддааадд дссіддаєдчія доїддссасс аїсіссдасу дзадодсдосіа саїсіасіас 180

Іссдасіссу дааддосад діісассаїс Ісссдддаса асдссаадаа сісссідіас 240 сідсадаїда асісісісад ддсюаддас ассдссодіді агаісідсоассадодадни ди зо дасаададді асдсссідда НКасіддддс садддсасаа ссудідасаді дадсісс 357 «2105 54 «2115 321 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 54 бо дасаїсдда Юасссадад ссасааднс аїдадсасса дсдідддсда їіадддідадс (610) аїсадсідса аддассадсса ддадткасс ссідссодідао ссіддіасса дсадаадссс 120 ддссададсс ссаадсідсі даїсіасадс ассадсадса ддїасассдуд сдідсссдас 180 адднсасад даадсддсад сддсассдас Нсасснса ссаїсадсад сдідсадасс 0/ 240 даддассідд ссдідіасіа сідссадсад сасіасасса ссссісідас сісдудсудсс 300 ддсассаадс І(ддадсюдаа 9 321 «2105 55 «2115 321 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 55 дасаїссада дасссадад сссіадсадс сідадсосіа дсдідддсда садддідасс (510) аїсассюдса аддссадсса ддаїдідасс ссідссодіду ссіддіасса дсадаадссс 120 ддсааддссс ссаадсідсі даїсіасадс ассадсадса ддіасассда сдідсссадс 180 аддшадса даадсддсад сддсассдас йсассиса ссаїсадсад ссідсадсос 0240 даддасаїсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса ссссісідас сісддссад 300 ддсассаадс Іддадаїсаа а 321 «2105 56 «2115 321 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 56 дасаїссада дасссадад сссіадсадс сідадсосіа дсдідддсда садддідасс (10)

Ко) аїсассдса аддссадсса ддаїдідасс ссідссаї99 ссіддіасса дсадаадссс 120 ддсаадіссс ссаадсідсі даїсіасадс ассадсадса ддіасассда сдідсссадс 180 аддшадса даадсддсад сддсассдас йсассиса ссаїсадсад ссідсадсос 0240 даддасаїсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса ссссісдас сісддссад 300 додсассаадс Іддадаїсаа 9 321 «2105 57 «2115 324 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 57 дасайсада ідасссадіс сссіадсадс сідіссдсії ссдідддсда садддідасс (610) аїсассюдса аддссадсса ддасдідаса ссідсідіда ссіддіаїса асадаадссії 120 ддсааддсіс сіаадсіссі даїсіасадс асаїссіссс даїасассдд адідсссісс 180 аддшадса дсадсддсіс сддсассдаї Нсасссіда ссашссіс ссідсадсос 0240 даддасійсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса сассссідас спйсдассая /-з00 додсассаадс Іддадаїсаа дсда 324 «2105 58 «2115 324 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 58 дасайсада ідасссадіс сссіадсадс сідіссдсії ссцідддсда саддадасс (610) аїсассюдса аддссадсса ддасдідаса ссідсідіда ссіддіаїса асадаадссії 120 ддсааддсіс сіаадсіссі даїсіасадс асаїссіссс ддїасассддадідсссдас 180 60 аддшассд дсадсодсіс сддсассдаї Нсасссіда ссашессіс ссідсадссс 240 даддасійсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса сассссідас спсддссад 300 додсассаадс Іддадаїсаа дсда 324 «2105 59 «2115 324 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 59 дасайсада ідасссадіс сссіадсадс сідіссдсії ссдідддсда садддідасс (610) аїсассюдса аддссадсса ддасдідаса ссідсідіда ссіддіаїса асадаадссії 120 ддссададсс сіаадсіссі даїсіасадс асаїссіссс даїасассдуд адідсссдас 180 аддшассд дсадсодсіс сддсассдаї Псасссюда ссашессіс ссідсадссс 240 даддасійсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса сассссідас спсддссад 300 додсассаадс Іддадаїсаа дсда 324 «2105» 60 «2115 324 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 60 дасайсада ідасссадіс сссіадсадс сідіссдсії ссдідддсда садддідасс бо аїсадсідса адассадсса ддасоїдаса ссідсідюдао ссіддіаїса асадаадссії 120 ддссададсс сіаадсіссі даїсіасадс асаїссіссс даїасассдуд адідсссдас 180 аддшассд дсадсодсіс сддсассдаї Нсасссіда ссашессіс ссідсадссс 240 даддасійсд ссассіасіа сідссадсад сасіасасса сассссідас спсддссад 300 додсассаадс Іддадаїсаа дсда 324 -2105 61 «2115 5 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 61

Тниг Туг Авр Меї Зег 1 5 «2105» 62 «2115 5 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична -4005 62

Суз Туг Азр Меї 5ег 1 5 «2105» 63 «2115 5 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «-4005 63

Зег Рпєе Азр Меї 5ег бо 1 5

«-2105» 64 «-2115 5 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 64 зЗег Ні Азр Меї 5ег 1 5 «-2105» 65 «-2115 5 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 65 зЗег Тр Азр Меї 5ег 1 5 «-210» 66 «-2115 5 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 66 зЗег Туг Азр Меї ТНиг 1 5 «-2105» 67 «-2115 5 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 67

Зег Туг Азр Меї Суб 1 5 -2105» 68 «-2115 17 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 68

Тпиг Пе Зег Авр Сіпу Спу Аа Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Ма! Гуз 1 5 10 15 сьуу «-210» 69 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична 60 «400» 69

Тпиг Пе Зег Авр Сіу Спу Рго Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Ма! Г ув 1 5 10 15 сьуу в) «2105 70 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 70

Тпиг Пе Зег А5р Сіу Спу Спу РНе Пе Туг Туг Зег Азр Зег Маї ГГ ув 1 5 10 15

Спу «2105 71 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 71

Тпиг Пе Зег А5р Сіу Спу Спу Нів Пе Туг Туг Зег Авр Зег Маї Гув 1 5 10 15 сьуу «2105 72 «2115 17 зо «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 72

Тпиг Пе Зег А5р Спіу Спу Спу Ттр Пе Туг Туг Зег Авр Зег Маї Гув 1 5 10 15 сьуу «2105 73 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 7З

Тпиг Пе Зег А5р Спіу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Азр Тнг Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу «2105» 74 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 74

Тпиг Пе Зег А5р Сіу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Азр Суз Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу 60

«-2105 75 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 75

Тпиг Пе Зег А5р Спіу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Авр 5ег Геи Гуз 1 5 10 15

Спу «-2105 76 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 76

Тпиг Пе Зег Азр Сіу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Ар зе Пе Гув 1 5 10 15 сьуу «-2105 77 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 77

Ко) Тпиг Пе Зег А5р Спіу Спу Спу Туг Пе Туг Туг Зег Азр 5ег Меї Гуз 1 5 10 15 сьуу «-2105 78 «-2115 10 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 78

Сіп Ре Слу Гуз Ага Туг Аа Геи Авр Туг 1 5 10 «-2105» 79 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 79

Азр Ре Су Гуз Аго Туг Аа І еи Ар Туг 1 5 10 «210» 80 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична 60 «400» 80

Азп Ре Су Гуз Аго Туг Аа І еи Авр Туг 1 5 10 «-2105» 81 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 81

Сім Туг Спу Гуз Аго Туг Аа І єи Ар Туг 1 5 10 «-2105» 82 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 82

Сім Ні Спу Гуз Аго Туг Аа І єи Ар Туг 1 5 10 «-2105» 83 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 83

Сім Тер Су Гуз Аго Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 «-2105» 84 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 84

Сім Ре Аїа Гуз Аго Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 «2105» 85 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 85

Сім Рне Рго Гуз Агу Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 «2105» 86 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична 60 «400» 86

Сім Рпе Сіу Агу Аг Туг Аа І еи Авр Туг 1 5 10 «-210» 87 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 87

Сім Рпе Сіу Гуз Гуз Туг Аіа Г еи Авр Туг 1 5 10 «210» 88 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 88

Сім Ре Сіу Гуз Агу Ре Аа І єи Ар Туг 1 5 10 «210» 89 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 89

Сім Рпе Сіу Гуз Ага Ні Ага Г еи Авр Туг 1 5 10 «210» 90 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 90

Сім Рпе Сту Гуз Ага Ттр Ага Геи Ар Туг 1 5 10 «2105» 91 «2115 11 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 91

Гуз Аіа ТАг Сип Авр Маї Тнг Рго Аїа Маї Аа 1 5 10 «-2105» 92 «2115 11 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична 60 «400» 92

Гуз Аа Суз СіІп Азр Маї Тниг Рго Аїа Маї Аа 1 5 10 «-2105» 93 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005» 93

Тиг Тиг Зег Зег Аго Туг ТНг 1 5 «-2105» 94 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 94

Сув Тпиг Зег Зег Агу Тут ТНг 1 5 «2105» 95 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «-4005» 95 зЗег Зег 5ег Зег Агоу Туг ТИг 1 5 «210» 96 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005» 96 зЗег Меї 5ег Зег Агу Тут ТНг 1 5 «-2105» 97 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 97 зЗег Ма! Зег Зег Аго Туг ТНг 1 5 «210» 98 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

-4005» 98 зЗег Тпг ТНг Зег Аго Туг ТНг 1 5 «210» 99 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «-4005» 99 зЗег Тиг Сувз Зег Агу Тут ТНг 1 5 «-2105» 100 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 100 зег Тпг Зег ТАг Аго Туг ТНг 1 5 -2105» 101 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005» 101 зЗег Тиг Зег Суз Аг Тут ТНг 1 5 -2105 102 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 102 зег Тиг Зег Зег Гуз Тут ТНг 1 5 «-2105 103 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 103 зег Тиг Зег Зег Агу Рпе ТНг 1 5 «2105» 104 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

«400» 104 зег Тиг Зег Зег Ага Ні ТНг 1 5 «-2105» 105 «-2115 7 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 105 зег Тиг Зег Зег Ага Тр Тиг 1 5 «-2105» 106 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 106

Сі Сп Ні Тук ТНг ТАг Рго Гей ТНг 1 5 «-2105» 107 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 107

Азр ап Ні Туг Тег Тнг Рго Геи ТНг 1 5 «2105» 108 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 108

Авп ап Ні Туг Тег Тнг Рго Геи ТНг 1 5 «-210» 109 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 109

Сіп Сім Ні Тук ТНг ТАг Рго Гей ТНг 1 5 «2105» 110 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

«4005» 110

Сіп Авр Ні Тут ТАг Тнг Рго І єи ТНг 1 5 «2105 111 «2115» 9 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 111

Сіп Авп Нів Тут ТАг Тнг Рго І єи ТНг 1 5 «2105 112 «2115 357 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 112 даадщдааас іддіддадісє ддаддадас Падіаадс сюдадодіс ссідааасіс (10) їссіддсаяд ссісюдаїй сасшсаді адсіаїдаса ідісподдіісдссадасі 120 ссддадаада дісіддадід ддісдсаасс айадщда! дідаїдона саїсіасіаї 180 їсадасадід щаададосд ашассаїс іІссададаса адссаадаа саассідіас 240 сідсаааїда дсадієдаяд дісідаддас асоадссіоі аташоісаададаайш зо даїаадсосі аїдстудда сіасідддаї сааддаассі садісассоді сіссіса 357 «2105 113 «2115 116 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 113

ТАг Зег Ма! ТНг 115 «2105» 114 «2115 321 «2125 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична бо «4005» 114 дасайдюда ідасссадіс іІсасааанс адіссасаї сддіаддада садддісадс (610) аїсіссідса аддссадіса ддаюдідасі ссідсідісу ссіддіаїса асадаадсса 120 ддасааїсіс сіааасіас!і дашасісс асаїссіссс даїасасідод адісссідаї 180 сдснсасід дсадіддаїс дадасоддаї Нсасшса ссаїсадсад щідсадодсі 240 даадассщюод садшацна сідісадсаа санаїасіа сіссдсісас дісдоасі 300 дддассаадс ддадсідаа а 321 -2105 115 «2115 107 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 115

Азр Іе Маї Меї Тнг Сіп Зег Ні Гуз Рне Меї Зег Тнг Зег Ма! СПУ 1 5 10 15

Азр Аг Маї 5ег Пе бег Суз Гуз АІа 5ег Сп Ар Маї Тнг Рго Аа зо 20 маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Спу Сп Бег Рго Гуз ГГ еи Г єи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег Зег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго Авр Ага РНе Тниг Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тниг РНе Тнг Пе 5ег Зег Маї Сп Аа 25 65 70 75 80

Сім Авр І єи Аа Маї Туг Туг Су Сип Сіп Нів Туг ТАг Тег Рго ГІ єи 85 90 95

Тиг РНе ау Аа Сіу Тиг Гуз Геи Спи Гей Гув 100 105 «2105» 116 «2115 17 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 116

Тпиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї Гуз 1 5 10 15

Спу «2105 117 «2115 10 «2125» РАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 117

Сім Гей Рго Тгр Агу Туг Аа І єи Авр Туг 1 5 10 «-2105» 118 «2115 17 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005 118

Ти Пе Зег Ар Аїа Сту Аа Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї ГГ ув (218) 1 5 10 15 сьуу «210» 119 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 119

Тпиг Пе Зег Авр Аа Сту Рго Тут Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу «210» 120 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 120

Тпиг Пе Зег Авр Аа Спу Спіу РНе Іе Туг Туг Агу Авр Зег Маї Гув 1 5 10 15 сьуу «2105 121 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «4005» 121

Тпиг Пе Зег Авр Аа Спу Сту Ні Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу «2105» 122 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 122

Тпиг Пе Зег Авр Аа Спу Стпу Тр Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї Гув 1 5 10 15 сьуу «2105» 123 «2115 17 «212» РВАТ -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична «400» 123

Ти Пе Зег А5р Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр ТНг Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу (218) «210» 124

«-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 124

Тпиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Ага Авр Суз Маї Гуз 1 5 10 15 сьуу «2105» 125 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 125

ТА Пе Бег Азр Аїа Сіу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 56ег І єи І уз 1 5 10 15 сьуу «210» 126 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 126

ТА Пе Бег Азр Аїа Сіу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Пе ГГ ув 1 5 10 15 сьуу «-2105» 127 «-2115 17 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 127

ТА Пе Бег Азр Аїа Сіу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Меї ГГ уз 1 5 10 15 сьуу «210» 128 «-2115 10 «212» РВТ -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 128

Сі Геи РНе Авзп Ага Туг Аа І єи Авр Туг 1 5 10 «210» 129 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

«4005» 129

Сій Гей Ні Рне Аго Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 -2105» 130 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 130

Сій Гей Туг Рне Аго Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 -2105 131 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 131 сін Ї еи Геи Ніз Аго Туг Аа І єи Азр Туг 1 5 10 «-2105 132 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 132

Сім Ї еи Аго Сту Ага Туг Аа І єи Авр Туг 1 5 10 -2105 133 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 133

Сіп Гей Рго Тгр Агу Туг Аа І єи Авр Туг 1 5 10 «2105» 134 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 134

Авр І єи Ріо Тр Ага Туг Аа І еи Ар Туг 1 5 10 2105 135 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

-4005 135

Авп І єи Рго Тр Ага Туг Аа І ви Азр Туг 1 5 10 -2105 136 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 136

Сім Гей Рго Тгр Гуз Туг Ага І єи Авр Туг 1 5 10 «-2105» 137 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 137

Сіш Гей Рго Тгр Агу РПє Аїа Геи Авр Туг 1 5 10 «2105» 138 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична -4005 138

Сім І еи Рго Тгтр Ага Ні Аа І єи Ар Туг 1 5 10 «2105» 139 «-2115 10 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «-4005» 139

Сім Гей Рго Тгр Агу Тгр Авіа Гей Авр Туг 1 5 10 «2105» 140 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 140

Сіп Сп Ні5 Зег Авр Аа Рго І еи ТнНг 1 5 «2105» 141 «2115» 119 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична

«4005» 141

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Аа 5ег СПу Рпе Тнг Ріє 5ег Зег Туг 20 25 0)

Аа Тиг Пе Зег Авр Аа Стпу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Ар 5ег Маї 50 55 60

Тиг Тиг Маї Тнг мМаї 5ег Зег 115 «2105» 142 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 142

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0)

Ко) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 60

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе ТнНг Пе 5ег Зег І еи Сп Рго 35 65 70 75 80

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 40 «210» 143 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність 45 «220» «г2З» Синтетична «400» 143

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 1 5 10 15 50 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа бег Спу Ре Тиг Рне 5ег Зег Туг 20 25 0)

Аа Тиг Пе Зег Азр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї 55 50 55 60

Ї еи Сп Меї Авп з5ег ГГ еи Агу Авр Сім Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Сув 85 90 95 60

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 в) «210» 144 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 144

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа Гуз Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 20 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе ТнНг Пе 5ег Зег І еи Сп Рго 65 70 75 80

Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Меї ап Нів Туг Тиг Тнг Рго І єи 85 90 95 25 Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «2105» 145 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 145

Аа Тиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї 50 55 60

Аа Агу Сім РНе Су Гуз Ага Туг Аа І єи Авр 5ег Ттр Спу Сп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «210» 146 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 146 60

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тгр Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45

Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Зег Тит Тнг Рго І єи 85 90 95

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «2105» 147 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 147

Аа Агу Сім Пе Ре Авп Аг Туг Аа Геи Азвр Туг Ттр Спу Сп Су 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «210» 148 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 148

Азр Пе Сп Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа бег Ма! СПУ 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Стпу Гуз Аа Рго Гуз І єи Геи Пе 35 40 45

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе Тнг Пе 5ег 5ег І ви Сп Рго 65 70 75 80

Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Туг Тиг ТНг Рго ГІ єи 85 90 95 60

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «210» 149 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 149

Аа Агу Сім Гей Рго Ттр Аго Туг Аа І еи Авр Туг Ттр Сіу Сіп Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 150 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 150

Азр Пе Сп Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа Зег Ма! Спу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сип СІп Гув Рго Су Гуз Аа Рго І уз І ви І єи Пе 35 40 45

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр РНе Тнг РНе Тнг Пе 5ег 5ег І єи Сп Рго 65 70 75 80

Тиг Ре Су Сп Спу ТАг Гуз Гей Си Пе Гув 100 105 «2105 151 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 151

Сіи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Сіп Рго Спу Спу 60 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Аа Агу Сім Геи Нів Ріє Аго Туг Аа І єи Ар Туг Тгр Спіу Сип Спу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105 152 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 152

Азр Пе Сп Меї Тнг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа бег Ма! СПу 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аїа Рго Гуз І ви І еи Пе

Ко) Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 60

Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Туг Тиг ТНг Рго ГІ єи 35 85 90 95

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «2105 153 40 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична 45 «4005» 153

Спи Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Геи Маї Спп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0) 50 Азр Меї 5ег Тр Маї Аго ап Аа Рго Сту Гуз 5ег І ви Спи Тр Маї 35 40 45

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 55 65 70 75 80

Аа Агу Сім Ге Туг Ріє Аго Туг Аа І еи Авр Туг Тгр Спу Сп Спу 100 105 110 60

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег «2105 154 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 154

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «2105 155 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 155

Сі Маї Сіп Г еи Ма! Спи Зег Счу Сіу Спу Гей Маї Сп Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго Сп Аа Рго Стпу Гуз 5ег І еи Спи Тгр Маї 35 40 45

Аа Тиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї 50 55 бо

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Пе Зег Агу Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Аа Агу Сім Геи І єи Ніз Аго Туг Аа І еи Авр Туг Ттр Сіу Сп СІу 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 «2105» 156 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 156

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 60 20 25 0)

маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «-2105» 157 «2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005 157

Сіи Маї Сіп І еи Маї Спи Бег Спу Сіу Спу Гей Маї Сп Рго СПу Спу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аа Аа 5ег СПу Рпе ТНг Рне Зег Зег Туг 20 25 0)

Азр Меї 5ег Тр Маї Аго ап Аа Рго Стпу Гуз 5ег І еи Сім Тгр Маї

Аа Тиг Пе Зег Авр Аа Спу Спу Туг Пе Туг Туг Агу Авр 5ег Маї 60

Ко) Ї еи Сп Меї Авп 5ег І еи Агу Азр Си Авр ТНг Аа Маї Туг Пе Сув 85 90 95

Аа Агу Сім Гей Агу сіу Аго Туг Аа І еи Авр Туг Ттр Сіу Сіп СПУ 100 105 110

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 35 115 «2105 158 «2115 107 «2125 РВАТ 40 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 158

Азр Пе Сип Меї ТАг Сп Зег Рго Зег Зег І ви Зег Аа 5ег Ма! СПу 45 1 5 10 15

Азр Аг Маї Тнг Пе Тнг Суз Гуз Аа 5ег Сп Авр Маї Тнг Рго Аа 20 25 0) маї Ага Тгр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго Гуз І еи І еи Пе 35 40 45 50 Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг Тиг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 50 55 60

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Азр Рпе Тнг РНе ТнНг Пе 5ег Зег І еи Сп Рго 65 70 75 80 55 Сім Авр Іе Аїа Тнг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Туг Тиг ТНг Рго ГІ єи 85 90 95

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 бо «210» 159

«2115» 119 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 159

Тиг Тиг Маї Тнг Маї 5ег Зег 115 2105» 160 «2115 107 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «4005» 160

Туг Зег Тиг Зег 5ег Ага Туг ТАг Спу Маї Рго 5ег Агу Рпе Зег Спу 50 55 бо

Сім Авр Іе Аїа Тниг Туг Туг Суз Сп Сп Ні Зег Авр Аїа Рго І єи 85 90 95

Тиг Ре Сатпу Сип Спу ТАг Гуз Гей Спи Пе Гув 100 105 «2105» 161 «2115» 9 «2125 РВАТ 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Синтетична «400» 161

Сі Сп Ні Зег Авр Аа Рго І еи ТНг 1 5 «2105» 162 «2115» 9 60 «2125 РВАТ

213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «4005» 162

Азр ап Нів бег Авр Айа Рго ГГ еи Тиг 1 5 «-2105 163 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 163

Авп ап Нів бег Авр Айа Рго ГГ еи Тиг 1 5 «210» 164 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 164

Сіп Сім Ні Зег Авр Аа Рго І еи ТНг 1 5 «-2105 165 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 165

Сіп Авр Нів Зег Ар Аїа Рго І єи ТНг 1 5 «-2105» 166 «-2115» 9 «212» РВТ 213» Штучна послідовність «020» «223» Синтетична «400» 166

Сіп Авп Нів Зег Ар Аїа Рго І єи ТНг

Claims

1 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло або його фрагмент, причому зазначене антитіло або його фрагмент має специфічність відносно білка РО-І 1 людини та містить: (а) МН СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 1; (в) МН СОН, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116; (с) МН СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 117; (4) МІ СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5; та () М СОКУ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 6.

2. Антитіло або його фрагмент за п. 1, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 149, та варіабельну область 60 легкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 150.

3. Антитіло або його фрагмент, де зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність відносно білка РО-І 1 людини та містить: (а) МН СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 1; (в) МН СОН, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 116; (с) МН СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 3; (4) МІ СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 5; та () М СОКУ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 140.

104. Антитіло або його фрагмент за п. 3, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІО МО: 159, та варіабельну область легкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 160.

5. Антитіло або його фрагмент, де зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла має специфічність відносно білка РО-І 1 людини та містить: (а) МН СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 1; (в) МН СОН, яка містить послідовність амінокислот, представлену у БЕО ІЮ МО: 116; (с) МН СОКЗ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮО МО: 3; (4) МІ СОКТ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮ МО: 4; (є) МІ СОК2, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 5; та () М СОКУ, яка містить послідовність амінокислот, представлену у БЕО ІЮ МО: 6.

6. Антитіло або його фрагмент за п. 5, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у 5ЕО ІЮО МО: 141, та варіабельну область легкого ланцюга, яка містить послідовність амінокислот, представлену у ЗЕО ІЮ МО: 142.

7. Антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-6, що додатково містить константну область важкого ланцюга, константну область легкого ланцюга, Ес-область або комбінацію перерахованого.

8. Антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-6, де зазначене антитіло або зазначений фрагмент антитіла являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло.

9. Антитіло або його фрагмент за п. 8, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить один або більше залишків амінокислот, вибраних з групи, що складається з: (а) Зег у положенні 44, (Б) Аа у положенні 49, (с) АІа у положенні 53, (а) Пе у положенні 91, (є) Сім у положенні 1, (Ї) ма! у положенні 37, (9) Тиг у положенні 40, (п) маї у положенні 53, (Ї) Сімс у положенні 54, () Азп у положенні 77, (К) Агд у положенні 94, та (І) Тиг у положенні 108, відповідно до нумерації за Кабаї, та їх комбінацій.

10. Антитіло або його фрагмент за п. 8, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить (а) Зег у положенні 44, (Б) Аіа у положенні 49, (с) АІа у положенні 53 та/або (а) Пе у положенні 91, відповідно до нумерації за Кабаї, та їх комбінації.

11. Антитіло або його фрагмент за п. 8, що містить варіабельну область легкого ланцюга, яка містить один або більше залишків амінокислот, вибраних з групи, що складається з: (а) Зег у положенні 22, (Б) СІп у положенні 42, (с) зег у положенні 43, (а) А5р у положенні 60, та (є) Тиг у положенні 63, відповідно до нумерації за Кабаї, та їх комбінацій.

12. Композиція, яка містить антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-11 та фармацевтично прийнятний носій.

13. Один або більше полінуклеотидів, що кодують поліпептидні ланцюги антитіла або його фрагмента за будь-яким з пп. 1-11.

14. Виділена клітина, яка містить один або більше полінуклеотидів, що кодують антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-11.

15. Застосування антитіла або його фрагмента за будь-яким з пп. 1-11 для виготовлення 60 лікарського засобу для лікування раку або інфекції, де рак характеризується експресією РО-І 1.

16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що зазначений рак являє собою солідну пухлину.

17. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що зазначений рак вибраний з групи, що складається з раку сечового міхура, раку печінки, раку товстої кишки, раку прямої кишки, раку ендометрія, лейкозу, лімфоми, раку підшлункової залози, дрібноклітинного раку легені, недрібноклітинного раку легені, раку молочної залози, раку уретри, раку голови та шиї, раку шлунково-кишкового тракту, раку шлунка, раку стравоходу, раку яєчників, раку нирок, меланоми, раку передміхурової залози та раку щитовидної залози.

18. Застосування за п. 15, яке додатково включає введення зазначеному пацієнту другого агента для терапії раку.

19. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що зазначена інфекція являє собою вірусну інфекцію, бактеріальну інфекцію, мікотичну інфекцію або паразитарну інфекцію.

20. Спосіб виявлення експресії РО-Ї1 іп міго у зразку, що включає приведення зазначеного зразка у контакт з антитілом або його фрагментом за будь-яким з пп. 1-11 в умовах, що дозволяють зазначеному антитілу або його фрагменту зв'язуватися з РО-І1, та виявлення зазначеного зв'язування, яке вказує на експресію РО-11 у зразку.

21. Спосіб іп міго за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений зразок містить пухлинну клітину, пухлинну тканину, інфіковану тканину або зразок крові. Зв'язування НІ 121055 в БА ЕЦВА й К: ди 5, / яй - А о у; - -4 в і кі 3 ЛПЛогарифшонана концентрація (нг/мл!) ГЕС ТЕ

Фіг. 1

Аналіз блокування рецепторів з НЕТ210-3 те - ов й й Ге ше я 02 і «З -Е «і В Я Логарифмована концентрація їни

Фіг. 2 Клітинний конкурентний знапіз «о щоодвну -е НІЛ що я і І що о с ке я щ о К с о нн нин шин «в -0. с МН Б щі Б т «о ов ЇКониц., МІ г СБО 1 вовною

Фіг. З

Анапіза використанням реакції льншаної культури лікфоцитів 2 нини ! С во І шк НІ 12103 ЕЕ - 105 до ; щі й ! т8-З Коня шк й ! і ! Б І І я і бо : а «З м чи г М МИ СИ НУ Концентвація антитла (мкм

Фіг. 4 НЕТТО деко, "Зі с г Е | вне й ее РШШЕ ШО ВИМИ й ї ї й ЕІ ско ВМ а Її Її й Кк: пн сек; че Я хво ШЕ ско У КИ ше свя» ВА НМ я г Де рек кн А А АКА Кп попокобоосюсрекічих - плете : м їй а м 128 НМ к К ж АННУ КК АНА КАН КАК КА КАК КК КАКАО ТА, МИ у в'я ніх ж жншшннннлвшинниишн в Екон пен в ША й ж о часі

Фіг. 5 Кк Зв'язування з покритим ВЕ а й Зв'язування х псздттяхм НЕД в. 7 А ЕЦ5А з АЖ людини ІА Ба з АК людини и: ЕТО х попав 4 ОА с нано : Я х Мечі : Ж з паче Н пищи Н у х МеМТУТя ї Ї я Мені зі су Й в Зх ї т вна ї ї ї я нЕНнтТЖнКьтО в і Її в ненізіяне В Я свя 8 ту Е Ще Хек 7 КЕ яожееке ї ГУ і Я ; н е й ї Косий дует я КВ онечєтеулнуоти ок пи з ха пахова 1 зва Днтитіло см АНТИ НИЗіНМ у і 1 ЕН З тНаНІйН і БО МЕМІЙМІ ї: ЛВ Писнтмея обов, кінаеня ВОК Гненіятня і бивБб іентатя 1 ОЛВОБ ТнНиИвійчваЇ пиві: оніми ї аж: ІНІЙ: 0,828 Нет БА НЕ Ї Коие БІВ Химера 1 ООИЕРЕ І (див. продовження нижче)

т Зеязування з покриттям КР Л є в Зв'язування з покриттям КЕН є Ме ІВАНА з АТ тоднни х ІВАНА з АТ людяни ; ОВ нон а досєна х НЕВЯФІШЬТИ З ще енанталя й п х Невнаів КУ а нин з з Кі КУ Мама й я ї знане що. Я «пня ! Я З Куваера Н у е НеЕНТаНЬИ й й ТК же 1 | й ще нжкну Уесесооковкухккююєєрє еко юю. ва 1 ПУ ОМ 1 ще ви Днтитіле мі ще Антитіпо (не сов : АВеНІНВ СОН ненінатяі пот ЕОМНЕАНЬЯЕ | слвев, ен БІ ромннатов | лк. Химич КЕН : ЗЕІНЖионвя КОЛЯЕ їдив. продовження нижче) еЕ Зв'язування з покриттям ПРО в ІФА ЕНІЗА з АТ людини

4 .. в Нині 10-8и ду з | й | ж Химера 8 г т РОЯЛ-ТВНО ; ї Її З К я о ї я З о ОВ нн НН ОО ОН 1 105 Антитіпло (НМ СО ЗНунігі | би химера пилваз ! ОВО л-тив; ов уЄ ! Її но 84.82 фіг. 5 (продовження)