BR112020019827A2 - Anticorpo ou fragmento do mesmo, anticorpo biespecífico, composição, polinucleotídeo nucleotídeo, célula isolada, e, métodos para tratar câncer ou infecção e detectar a expressão de pd-l1 em uma amostra - Google Patents

Anticorpo ou fragmento do mesmo, anticorpo biespecífico, composição, polinucleotídeo nucleotídeo, célula isolada, e, métodos para tratar câncer ou infecção e detectar a expressão de pd-l1 em uma amostra Download PDF

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Abstract

são providos anticorpos anti-pd-l1 ou fragmentos dos mesmos. os anticorpos ou fragmento dos mesmos especificamente se ligam ao domínio da imunoglobulina c da proteína de pd-l1. em vários exemplos, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos incluem uma vh cdr1 da seq id no: 1, uma vh cdr2 da seq id no: 116, uma vh cdr3 da seq id no: 117, uma vl cdr1 da seq id no: 4, uma vl cdr2 da seq id no: 5 e uma vl cdr3 da seq id no: 6 ou variantes de cada uma destas. métodos de usar os anticorpos ou fragmentos dos mesmos para tratar e diagnosticar doenças tais como câncer e doenças infecciosas também são providos.

Description

1 / 116 ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO, ANTICORPO BIESPECÍFICO, POLINUCLEOTÍDEO NUCLEOTÍDEO, E, USO DO
ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO FUNDAMENTOS
[001] O ligante de morte programada 1 (PD-L1), também conhecido como cluster de diferenciação 274 (CD274) ou B7 homólogo 1 (B7-H1), é uma proteína de transmembrana de 40 kDa do tipo 1 acreditada desempenhar um papel principal na supressão do sistema imune durante eventos particulares tais como gravidez, aloenxertos de tecidos, doença autoimune e outros estados de doença tais como hepatite. A ligação de PD-L1 a PD-1 ou B7,1 transmite um sinal inibidor que reduz a proliferação das células CD8+ T nos linfônodos e suplementar àquele de PD-1 também é capaz de controlar o acúmulo de células T específicas do antígeno estranho nos linfônodos através da apoptose que é novamente mediada por uma regulação inferior do gene Bcl-2.
[002] Foi mostrado que a suprarregulagem de PD-L1 pode permitir que cânceres a escapar do sistema imune do hospedeiro. Uma análise das amostras de tumor dos pacientes com carcinoma da célula renal verificou que a expressão de tumor alta de PD-L1 foi associada com agressividade de tumor aumentada e um risco aumentado de morte. Muitos inibidores de PD-L1 estão em desenvolvimento como terapias imuno-oncológicas e estão mostrando bons resultados nos testes clínicos.
[003] Além do tratamento dos cânceres, a inibição de PD-L1 também foi mostrada promissora no tratamento de doenças infecciosas. Em um modelo de camundongo de infecção intracelular, L. monocytogenes induziu a expressão de proteína PD-L1 nas células T, células NK e macrófagos. O bloqueio de PD-L1 (por exemplo, usando anticorpos de
2 / 116 um modelo de camundongo de infecção intracelular, L. monocytogenes induziu a expressão de proteína PD-L1 nas células T, células NK e macrófagos. O bloqueio de PD-L1 (por exemplo, usando anticorpos de bloqueio) resultou em uma mortalidade aumentada para o camundongo infectado. O bloqueio reduziu a produção de TNFα e óxido nítrico pelos macrófagos, reduziu a produção de granzima B pelas células NK e diminuiu a proliferação de células T CD8 específicas ao antígeno de L. monocytogenes (mas não as células T CD4). Esta evidência sugere que PD-L1 age como uma molécula coestimuladora positiva na infecção intracelular.
SUMÁRIO
[005] A presente descrição fornece anticorpos anti-PD-L1 tendo alta afinidade de ligação às proteínas PD-L1 humanas e pode bloquear eficazmente a interação entre PD-L1 e seu receptor PD-1. Também importante, os exemplos demonstram que os mesmos anticorpos anti-PD-L1 promovem a resposta imune da célula T e inibem o crescimento do tumor. Diferente dos anticorpos anti-PD-L1 conhecidos que ligam ao domínio da imunoglobulina V da porção extracelular da proteína PD-L1, os mesmos anticorpos ligam ao domínio C da imunoglobulina, em particular resíduos de aminoácido Y134, K162 e N183. Os mesmos anticorpos anti-PD-L1 são úteis para propósitos terapêuticos tal como tratar vários tipos de câncer, bem como infecções e também podem ser usados para propósitos de diagnóstico e prognóstico.
[006] Uma modalidade da presente descrição provê um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo, cujo anticorpo ou fragmento do mesmo pode especificamente se ligar a um domínio de imunoglobulina C (IgC) de uma proteína do ligante de morte programada 1 humana (PD-L1). Em algumas modalidades, o domínio IgC consiste dos resíduos de aminoácido 133 a 225. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácido Y134, K162, ou
3 / 116 N183 da proteína de PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácido Y134, K162 e N183 da proteína de PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo não se liga a um domínio da imunoglobulina V (Ig V) da proteína de PD-L1, em que o domínio Ig V consiste dos resíduos de aminoácido 19 a 127.
[007] Uma modalidade da presente descrição fornece um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade a uma proteína do Ligante de morte programada 1 humano (PD-L1) e compreende uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste também compreendem uma região constante de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve, uma região Fc, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia leve é uma região constante de cadeia capa ou lambda. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste é de um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD. Em algumas modalidades, o isótipo é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Sem limitação, o anticorpo ou fragmento deste é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo completamente humano. Em um aspecto, o anticorpo ou fragmento deste é um anticorpo humanizado.
[008] Através da mutagênese, a presente descrição tem outros resíduos de ponto crucial de mutação identificados na VH CDR3 (ver, por exemplo, anticorpos A1, A2, C3, C4, C6, B1 e B6 nos Exemplos 13 a 17) e VL CDR3 (ver, por exemplo, anticorpos B3, C4 e A3 nos Exemplos 13 a 17). Portanto, a presente descrição também fornece anticorpos que incorporam uma ou mais das mutações dos mesmos pontos cruciais.
[009] Em algumas modalidades, é provido um anticorpo ou
4 / 116 fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade a uma proteína PD-L1 humana e compreende (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117 ou uma variante da SEQ ID NO: 117 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 117, em que o segundo resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Leu; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 6.
[0010] Em uma modalidade, a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
[0011] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a
5 / 116 sequência de aminoácido da SEQ IN NO: 149 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 150.
[0012] Também é fornecido, em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade para uma proteína PD-L1 humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 3; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 140 ou uma variante da SEQ ID NO: 140 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 140, em que pelo menos (i) resíduo de aminoácido 4 da VL CDR3 é Ser, (ii) resíduo de aminoácido 5 da VL CDR3 é Asp, ou (iii) resíduo de aminoácido 6 da VL CDR3 é Ala.
[0013] Em uma modalidade, a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, a VL CDR1 compreende a sequência de
6 / 116 aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 140.
[0014] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ IN NO: 159 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 160.
[0015] Uma modalidade fornece um anticorpo ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade para uma proteína PD- L1 humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 3; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 6.
[0016] Em algumas modalidades, a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a
7 / 116 sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ IN NO: 141 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 142.
[0018] Também é provida, em algumas modalidades, uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente descrição e um carregador farmaceuticamente aceitável. Também é ainda provida, em algumas modalidades, uma célula isolada compreendendo um ou mais polinucleotídeos codificando o anticorpo ou fragmento deste da presente descrição.
[0019] Os métodos de tratamento e usos também são providos. Em uma modalidade, um método de tratar câncer ou infecção em um paciente em necessidade deste é fornecido, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento deste da presente descrição. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de vesícula, câncer hepático, câncer do cólon, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer de pulmão da célula pequena, câncer de pulmão da célula não pequena, câncer de mama, câncer da uretra, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer de próstata e câncer de tireóide. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de vesícula, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pulmão da célula não pequena, câncer de mama, câncer da uretra,
8 / 116 câncer colorretal, câncer da cabeça e pescoço, câncer da célula escamosa, carcinoma da célula de Merke, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal e câncer de pulmão da célula pequena. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao paciente um segundo agente terapêutico para o câncer. Em algumas modalidades, a infecção é uma infecção viral, infecção bacteriana, infecção fúngica ou infecção por um parasita.
[0020] Em outra modalidade, um método de tratar câncer ou infecção em um paciente em necessidade deste é fornecido, compreendendo: (a) tratar uma célula, in vitro, com o anticorpo ou fragmento deste da presente descrição; e (b) administrar a célula tratada ao paciente. Em algumas modalidades, o método também compreende, antes da etapa (a), isolar a célula de um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula é isolada do paciente. Em algumas modalidades, a célula é isolada de um doador individual diferente do paciente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T, os exemplos não limitantes da qual incorrem em um linfócito T de infiltração tumoral, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ T, ou uma combinação dos mesmos.
[0021] Os métodos de diagnóstico e usos também são providos. Em uma modalidade, um método de detectar a expressão de PD-L1 em uma amostra é provido, compreendendo comunicar a amostra com um anticorpo ou fragmento deste sob condições para o anticorpo ou fragmento deste de ligar ao PD-L1 e detectar a ligação que indica a expressão de PD-L1 na amostra. Em algumas modalidades, a amostra compreende uma célula tumoral, um tecido tumoral, um tecido infectado, ou uma amostra sanguínea.
[0022] Os anticorpos e fragmentos a presente descrição podem ser usados para preparar anticorpos biespecíficos. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico é provido, compreendendo um fragmento da presente descrição e um segundo fragmento de ligação ao antígeno tendo
9 / 116 especificidade para uma molécula em uma célula imune. Em algumas modalidades, a molécula é selecionada do grupo que consiste em PD-1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA, CD47 e CD73. Em algumas modalidades, o fragmento e o segundo fragmento, são cada um independentemente selecionados de um fragmento de Fab, um fragmento variável de cadeia única (scFv), ou um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico também compreende um fragmento de Fc.
DESRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
[0023] A FIG. 1 mostra que HL1210-3 pode ligar ao PD-L1 humano com alta afinidade.
[0024] A FIG. 2 mostra que HL1210-3 pode inibir eficazmente a ligação de PD-L1 humano ao PD1 humano.
[0025] A FIG. 3 mostra que o anticorpo HL1210-3 pode inibir de maneira altamente eficaz a ligação de PD-1 no PD-L1 expressado em células mamíferas.
[0026] A FIG. 4 mostra que os anticorpos anti-PD-L1 testados podem promover a resposta da célula T humana.
[0027] A FIG. 5 mostra as cinéticas de ligação de HL1210-3 ao PD- L1 recombinante.
[0028] A FIG. 6 mostra que todos os anticorpos humanizados testados têm eficácia de ligação comparável ao PD-L1 humano em contato com o anticorpo quimérico.
[0029] A FIG. 7 mostra que todos os anticorpos humanizados testados podem ligar de maneira altamente eficaz ao PD-L1 expressado nas células mamíferas, se comparado com o anticorpo quimérico.
[0030] A FIG. 8 mostra que anticorpo humanizado Hu1210-41 pode ligar ao PD-L1 de rhesus com afinidade inferior e não pode ligar ao PD-L1 de
10 / 116 rato e camundongo.
[0031] A FIG. 9 mostra que o anticorpo Hu1210-41 pode apenas ligar especificamente a B7-H1 (PD-L1), não a B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS e BTLA.
[0032] A FIG. 10 mostra que Hu1210-41 pode inibir eficazmente a ligação de PD-L1 humano ao PD1 e B7-1 humanos.
[0033] A FIG. 11 mostra que Hu1210-41 pode inibir eficazmente a ligação de PD-L1 humano ao PD1 e B7-1 humanos.
[0034] A FIG. 12 mostra que os anticorpos Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16, Hu1210-17, Hu1210-21 e Hu1210-36 humanizados podem promover de maneira dependente da dose a produção de IFNγ e IL-2 na mistura de reação de linfócitos.
[0035] A FIG. 13 mostra que os anticorpos humanizados Hu1210-40, Hu1210-41 e Hu1210-17 podem promover de maneira dependente da dose a produção de IFNγ em um ensaio de rechamada de CMV.
[0036] A FIG. 14 mostra que o Hu1210-31 pode inibir o crescimento do tumor em 30% a 5 mg/kg em um modelo de xenoenxerto HCC827-NSG.
[0037] A FIG. 15 mostra que o anticorpo Hu1210-41 pode inibir de maneira dependente da dose o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto HCC827-NSG, enquanto o peso do tumor também foi inibido de maneira dependente da dose pelo anticorpo Hu1210-41.
[0038] A FIG. 16 representa graficamente, para cada mutante de PD- L1, o valor de ligação médio como uma função da expressão (mAb anti-PD- L1 de controle de reatividade).
[0039] A FIG. 17 ilustra os locais de Y134, K162 e N183, os resíduos (esferas) envolvidos na ligação ao anticorpo Hu1210-41 anti-PD-L1.
[0040] A FIG. 18 compara a mutante de S60R ao anticorpo parental Hu1210-41 em termos de eficácia de ligação ao PD-L1 expressado em células mamíferas.
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[0041] A FIG. 19 mostra os resultados de um ensaio de ligação (ao PD-L1 humano) para os anticorpos derivados.
[0042] A FIG. 20 mostra que o anticorpo B6 liga de maneira mais altamente eficaz ao PD-L1 expressado em células mamíferas, se comparado ao anticorpo parental e Tecentriq™ (atezolizumab).
[0043] A FIG. 21 mostra o efeito dos anticorpos na produção de IL2 em células de Jurkat em que B6 também apresentou uma potência maior.
[0044] A FIG. 22 mostra a atividade in vitro dos anticorpos para promover a produção de IFNγ em um conjunto de linfócitos misturados.
[0045] A FIG. 23 mostra a atividade in vivo dos anticorpos para inibir o crescimento do tumor.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[0046] Deve ser notado que os termos “uma” ou “a” entidade se referem a uma ou mais da entidade; por exemplo, “um anticorpo”, é entendido representar um ou mais anticorpos. Como tal, os termos “um” (ou “o”), “um ou mais”, e “pelo menos um” podem ser aqui permutavelmente usados.
[0047] Como aqui usado, o termo “polipetídeo” é intencionado abranger um “polipetídeo” singular bem como “polipeptídeos” plurais e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligada por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipetídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere ao comprimento específico do produto. Deste modo, os peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácido”, ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição de “polipetídeo”, e o termo “polipetídeo” pode ser usado ao invés de, ou permutavelmente com qualquer um dos mesmos termos. O termo “polipetídeo” também é intencionado se referir aos produtos das modificações
12 / 116 pós-expressão do polipetídeo, incluindo, sem limitação, a glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação através dos aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipetídeo pode ser derivado de uma fonte natural biológico ou produzido através da tecnologia recombinante, mas não é necessariamente produzido a partir de uma sequência de ácido nucleico indicada. Este pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo através da síntese química.
[0048] O termo “isolado” como aqui usado com relação às células, ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, se referem às moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula. O termo “isolado” como aqui usado também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente isento de material celular, material viral, ou meio de cultura quando produzido a partir das técnicas de DNA recombinantes, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Além disso, um “ácido nucleico isolado” é intencionado incluir fragmentos de ácido nucleico que não são de ocorrência natural como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é aqui usado para se referir às células ou polipeptídeos que são isolados de outras proteínas ou tecidos celulares. Os polipeptídeos isolados são intencionados abranger os polipeptídeos tanto purificados quanto recombinantes.
[0049] Como aqui usado, o termo “recombinante” considerando que este pertence aos polipeptídeos ou polinucleotídeos intenciona uma forma do polipetídeo ou polinucleotídeo que não existe naturalmente, um exemplo não limitante do qual pode ser criado combinando-se os polinucleotídeos ou polipeptídeos que normalmente não ocorreriam juntos.
[0050] “Homologia”, “identidade” ou “similaridade” se referem à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de
13 / 116 ácidos nucleicos. A homologia pode ser determinada comparando-se uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para propósitos de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas àquela posição. Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de posições equiparadas ou homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos do que 40% de identidade, ainda que preferivelmente menos do que 25% de identidade, com uma das sequências da presente descrição.
[0051] Um polinucleotídeo ou uma região de polinucleotídeo (ou um polipetídeo ou região de polipetídeo) tendo uma certa porcentagem (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 %) de “identidade de sequência” para outra sequência significa que, quando alinhadas, a porcentagem das bases (ou aminoácidos) são as mesmas ao se comparar as duas sequências. O alinhamento e a homologia ou identidade de sequência em porcento podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos na Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferivelmente, os parâmetros padrão são usados para o alinhamento. Um programa de alinhamento é BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; filamentos = ambos; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenado por = ALTA CONTAGEM; Bancos de Dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os polinucleotídeos biologicamente equivalentes são aqueles tendo a homologia em porcento acima indicada e codificando um polipetídeo tendo a mesma atividade biológica, ou similar.
[0052] O termo “um ácido nucleico ou polinucleotídeo equivalentes”
14 / 116 se referem a um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo tendo um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeos do ácido nucleico ou complemento deste. Um homólogo de um ácido nucleico de filamentos duplos é intencionado incluir ácidos nucleicos tendo uma sequência de nucleotídeos que têm um certo grau de homologia com o complemento deste. Em um aspecto, os homólogos dos ácidos nucleicos são capazes de hibridizar ao ácido nucleico ou complemento deste. Do mesmo modo, “um polipetídeo equivalente” se refere a um polipetídeo tendo um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de aminoácido de um polipetídeo de referência. Em alguns aspectos, a identidade de sequência é de pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99%. Em alguns aspectos, o polipetídeo ou polinucleotídeo equivalentes tem um, dois, três, quatro ou cinco adições, exclusões, substituições e suas combinações dos mesmos se comparado ao polipetídeo ou polinucleotídeo de referência. Em alguns aspectos, a sequência equivalente retém a atividade (por exemplo, ligação ao epítopo) ou estrutura (por exemplo, ponte salina) da sequência de referência.
[0053] As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de “severidade” diferentes. Em geral, uma reação de hibridização de baixa severidade é realizada a cerca de 40°C em cerca de 10 x SSC ou uma solução de força iônica/temperatura equivalentes. Uma hibridização de severidade moderada é tipicamente realizada a cerca de 50°C em cerca de 6 x SSC e uma reação de hibridização de alta severidade é geralmente realizada a cerca de 60°C em cerca de 1 x SSC. As reações de hibridização também podem ser realizadas sob “condições fisiológicas” que são bem conhecidas àqueles habilitados na técnica. Um exemplo não limitante de uma condição fisiológica é a temperatura, força iônica, pH e concentração de Mg2+ normalmente encontrada em uma célula.
[0054] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica
15 / 116 de quatro nucleotídeo bases: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Deste modo, o termo “sequência de polinucleotídeos” é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeos. Esta representação alfabética pode ser entrada em bancos de dados em um computador tendo uma unidade de processamento central e usada para aplicações em bioinformática tais como genômica funcional e pesquisa de homologia. O termo “polimorfismo” se refere à coexistência de mais do que uma forma de um gene ou porção deste. Uma porção de um gene do qual existe pelo menos duas formas existentes, isto é, duas sequências de nucleotídeos diferentes, é indicada como uma “região polimórfica de um gene”. Uma região polimórfica pode ser nucleotídeo único, a identidade da qual difere em alelos diferentes.
[0055] Os termos “polinucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados permutavelmente e indicam uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, etiqueta EST ou SAGE), éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência e, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode compreender os nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, as modificações à estrutura de nucleotídeo podem ser comunicadas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida através de componentes não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser novamente
16 / 116 modificado depois da polimerização, tal como através da conjugação com um componente de rotulação. O termo também se refere às moléculas de filamento tanto duplo quanto simples. A menos que de outro modo especificado ou requerido, qualquer modalidade desta divulgação que é um polinucleotídeo abrange ambas as formas de filamento duplo e cada uma das duas formas de filamento simples complementares conhecidas ou preditas para fazer a forma de filamento duplo.
[0056] O termo “codifica” como é aqui aplicado aos polinucleotídeos se refere a um polinucleotídeo que é dito “codificar” um polipetídeo se, no seu estado nativo ou quando manipulado através dos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipetídeo e/ou um fragmento deste. O filamento antissentido é o complemento de tal ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser deduzido a partir deste.
[0057] Como aqui usado, um “anticorpo” ou “polipetídeo de ligação ao antígeno” se refere a um polipetídeo ou um complexo de polipetídeo que especificamente reconhece e liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo integral e qualquer fragmento de ligação ao antígeno ou uma cadeia simples deste. Deste modo, o termo “anticorpo” inclui qualquer proteína ou molécula contendo peptídeo que compreende pelo menos uma porção da molécula de imunoglobulina tendo atividade biológica de ligação ao antígeno. Os exemplos de tais incluem, mas não são limitados a uma região que determina a complementariedade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção de ligação ao ligante deste, uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de estrutura (FR), ou qualquer porção desta, ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.
[0058] Os termos “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação ao antígeno”, como aqui usado, é uma porção de um anticorpo tal como
17 / 116 F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv e outros. Independente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo “fragmento de anticorpo” inclui aptâmeros, spiegelmers e diacorpos. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente modificada que age como um anticorpo ligando-se a um antígeno específico para formar um complexo.
[0059] Um “fragmento variável de cadeia simples” ou “scFv” se refere a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) e leves (VL) das imunoglobinas. Em alguns aspectos, as regiões são conectadas com um peptídeo ligante mais curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante pode ser rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para a solubilidade e pode conectar o N-terminal da VH com o C-terminal da VL, ou vice versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e a introdução do ligante. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019.
[0060] O termo anticorpo abrange várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser bioquimicamente distintos. Aqueles habilitados na técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon (γ, µ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre as mesmas (por exemplo, γ1-γ4). Esta é a natureza desta cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isótipos) por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc. são bem distinguidas e são conhecidas conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma das mesmas classes e isótipos são prontamente discerníveis ao técnico habilitado em vista da presente descrição e, portanto, estão dentro do escopo da presente descrição. Todas as classes de imunoglobulina estão prontamente dentro do escopo da presente descrição, a seguinte discussão será geralmente direcionada à classe de IgG
18 / 116 das moléculas de imunoglobulina. Com relação à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000 a
70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas pelas ligações de dissulfeto em uma configuração em “Y” em que as cadeias leves sustentam as cadeias pesadas começando na boca do “Y” e continuando através da região variável.
[0061] Os anticorpos, polipeptídeos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da divulgação incluem, mas não são limitados aos anticorpo quiméricos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados em dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VK ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab e anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos LIGHT aqui descritos). A imunoglobulina ou moléculas de anticorpo da divulgação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.
[0062] As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (Κ, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve capa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas umas às outras e as porções de “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas umas às outras através das ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobinas são geradas pelos hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, a sequência de aminoácidos operada em um N-terminal nas terminações bifurcadas da configuração em Y ao C-terminal do fundo de cada cadeia.
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[0063] Tanto as cadeias leves quanto pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável”, são funcionalmente usados. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis das porções de cadeia tanto leve (VK) quanto pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade do antígeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e a cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor de Fc, ligação de complemento e outros. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta como se tornassem mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou terminal amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e na porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CK realmente compreendem o terminal carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.
[0064] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e ligue seletivamente os epítopos nos antígenos. Isto é, o domínio de VK e o domínio de VH, ou subconjunto das regiões que determinam a complementariedade (CDRs), de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação ao antígeno presente na terminação de cada braço de Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido pelas três CDRs em cada uma das cadeias de VH e VK (isto é, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3). Em alguns exemplos, por exemplo, algumas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeos ou modificadas com base nas imunoglobinas de camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir apenas das cadeias pesadas, sem nenhuma cadeia leve. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).
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[0065] Nos anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões que determinam a complementariedade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação ao antígeno são sequências curtas não contíguas de aminoácidos que estão especificadamente posicionados para formar a ligação ao domínio do antígeno conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos na ligação aos domínios do antígeno, indicados como regiões de “estrutura”, mostram menos variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura amplamente adotam uma configuração de lâmina β e as CDRs formam laços que se conectam e em alguns casos formam parte da estrutura de lâmina β. Deste modo, as regiões estruturais agem para formar uma armação que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta através das interações intercadeia, não covalentes. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma complementariedade de superfície ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões estruturais, respectivamente, podem ser prontamente identificados para a dada região variável de cadeia pesada ou leve por uma pessoa de habilidade comum na técnica, visto que os mesmos foram precisamente definidos (ver, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)).
[0066] No caso onde existe duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como aqui suado é intencionada incluir todos tais significados a menos que explicitamente determinado ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região que determina a complementariedade” (“CDR”) para descrever os sítios de combinação ao antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável dos polipeptídeos tanto de cadeia pesada quanto leve. Esta região particular
21 / 116 foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987), que são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades. As definições de CDR de acordo com Kabat and Chothia incluem uma sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados uns aos outros. Não obstante, a aplicação da definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes dos mesmos é intencionada estar dentro do escopo do termo como aqui definido e usado. Os resíduos de aminoácido apropriados que abrangem as CDRs como definido por cada uma das referências citadas acima são apresentadas na tabela abaixo como uma comparação. Os números de resíduos exatos que abrangem uma CDR particular variará dependendo da sequência e tamanho da CDR. Aqueles habilitados na técnica podem determinar rotineiramente que os resíduos compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácido de região variável do anticorpo. Kabat Chothia CDR-H1 31-35 26-32 CDR-H2 50-65 52-58 CDR-H3 95-102 95-102 CDR-L1 24-34 26-32 CDR-L2 50-56 50-52 CDR-L3 89-97 91-96
[0067] A Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Aquele de habilidade comum na técnica pode atribuir sem ambiguidade este sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem confiar em qualquer dado experimental além da sequência em si. Como aqui usado, a “numeração de Kabat” se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983).
[0068] Além da tabela acima, o sistema de numeração de Kabat descreve as regiões de CDR como segue: CDR-H1 começa aproximadamente
22 / 116 no aminoácido 31 (isto é, aproximadamente 9 resíduos depois do primeiro resíduo de cisteína), inclui aproximadamente 5 a 7 aminoácidos e termina no próximo resíduo de triptofano. A CDR-H2 começa no décimo quinto resíduo depois do fim da CDR-H1, inclui aproximadamente 16 a 19 aminoácidos e termina no próximo resíduo de arginina ou lisina. A CDR-H3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo de aminoácido depois do fim da CDR-H2; inclui 3 a 25 aminoácidos; e termina na sequência de W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido. A CDR-L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 10 a 17 resíduos; e termina aproximadamente próximo ao resíduo de triptofano. A CDR-L2 começa aproximadamente no décimo sexto resíduo depois da terminação da CDR-L1 e inclui aproximadamente 7 resíduos. A CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo depois do fim da CDR-L2 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 7 a 11 resíduos e termina na sequência F ou W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido.
[0069] Os anticorpos aqui descritos podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos, de burro, coelho, cabra, porquinho-da-Índia, camelo, lhama, cavalo ou frango. Em outra modalidade, a região variável pode ser condrictóide na origem (por exemplo, de tubarões).
[0070] Como aqui usado, o termo “região constante de cadeia pesada” inclui a sequência de aminoácidos derivada uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipetídeo compreendendo uma região constante de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio de CH1, uma dobradiça (por exemplo, um domínio de região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio de CH2, um domínio de CH3, ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, um polipetídeo de ligação ao antígeno para o uso na divulgação pode compreender uma cadeia de polipeptídeos
23 / 116 compreendendo um domínio de CH1; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio de CH2; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio de CH1 e um domínio de CH3; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio de CH3, ou uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio de CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio de CH2 e um domínio de CH3. Em outra modalidade, um polipetídeo da divulgação compreende uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio de CH3. Além disso, um anticorpo para o uso na divulgação pode carecer de pelo menos uma porção de um domínio de CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio de CH2). Como apresentado acima, será entendido por aquele de habilidade comum na técnica que a região constante de cadeia pesada pode ser modificada tal que os mesmos variam na sequência de aminoácido a partir da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.
[0071] A região constante de cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito pode ser derivada de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de um polipetídeo pode compreender um domínio de CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.
[0072] Como aqui usado, o termo “região constante de cadeia leve” inclui a sequência de aminoácidos derivada do anticorpo de cadeia leve. Preferivelmente, a região constante de cadeia leve compreende pelo menos
24 / 116 um de um domínio constante capa ou domínio constante lambda.
[0073] Um “par de cadeia leve-cadeia pesada” se refere à coleção de uma cadeia leve e cadeia pesada que pode formar um dímero através de uma ligação de dissulfeto entre o de domínio CL da cadeia leve e o domínio de CH1 da cadeia pesada.
[0074] Como previamente indicado, as estruturas de subunidade e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Como aqui usado, o termo “Domínio de VH” inclui o domínio variável do terminal amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo “domínio de CH1” inclui o primeiro (maioria do terminal amino) domínio de região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio de CH1 é adjacente ao domínio de VH e é amino terminal à região de dobradiça de uma cadeia pesada de molécula de imunoglobulina.
[0075] Como aqui usado o termo “domínio de CH2” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando os esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e os resíduos 231 a 340, sistema de numeração EU; ver Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983). O domínio de CH2 é único em que este não é intimamente emparelhado com um outro domínio. Ao invés disso, duas cadeias de carboidrato ramificadas N ligadas são interpostas entre os dois domínios de CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também é bem documentado que o domínio de CH3 se estende do domínio de CH2 ao C- terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
[0076] Como aqui usado, o termo “região de dobradiça” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio de CH1 ao domínio de CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25
25 / 116 resíduos e é flexível, permitindo deste modo que as duas ligações N-terminais às regiões de antígeno se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínio de dobradiça superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
[0077] Como aqui usado0 o termo “ligação de dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação de dissulfeto ou ponte com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões de CH1 e CK são ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas através de duas ligações de dissulfetos nas posições correspondendo a 239 e 242 usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, EU sistema de numeração).
[0078] Como aqui usado, o termo “anticorpo quimérico” será mantido para significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativos são obtidos ou derivados de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente descrição) é obtida a partir de uma segunda espécie. Em algumas modalidades, a região ou sítio de ligação alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.
[0079] Como aqui usado, “humanização em por cento” é calculada determinando-se o número de diferenças da estrutura de aminoácido (isto é, a diferença não CDR) entre o domínio humanizado e o domínio de linha germinativa, subtraindo este número do número total de aminoácidos e depois dividindo este pelo número total de aminoácidos e multiplicando por 100.
[0080] Por “liga especificamente” ou “tem especificidade a”, é geralmente intencionado significar que um anticorpo liga a um epítopo por intermédio de sua ligação ao domínio do antígeno e que a ligação requer alguma complementariedade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito “ligar
26 / 116 especificamente” a um epítopo quando este liga àquele epítopo, por intermédio do seu domínio de ligação ao antígeno mais prontamente do que este ligaria a um epítopo aleatório não relacionado. O termo “especificidade” é aqui usado para qualificar a afinidade relativa através da qual um certo anticorpo liga a um certo epítopo. Por exemplo, o anticorpo “A” ser julgado ter uma especificidade maior para um dado epítopo do que o anticorpo “B”, ou anticorpo “A” pode ser dito ligar ao epítopo “C” com uma especificidade mais alta do que para o epítopo relacionado “D.”
[0081] Como aqui usado, os termos “tratar” ou “tratamento” se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto as medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) uma mudança ou distúrbio fisiológico indesejado, tal como a progressão do câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio dos sintomas, diminuição do grau da doença, estado da doença estabilizado (isto é, que não piora), atraso ou diminuição da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou não detectável. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevivência se comparado à sobrevivência esperada se não recebendo tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio bem como aqueles prontos para ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio deve ser prevenida.
[0082] Por “sujeito”, “indivíduo”, “animal”, “paciente” ou “mamífero”, é intencionado significar qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual o diagnóstico, prognóstico, ou terapia são desejados. Os sujeitos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda e zoológico, amimais de esporte ou animais de estimação tais como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim por diante.
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[0083] Como aqui usado, as frases como “a um paciente em necessidade de tratamento” ou “um sujeito em necessidade de tratamento” incluem sujeitos, tais como sujeito mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo ou composição da presente descrição usada, por exemplo, para a detecção, para um procedimento de diagnóstico e/ou para o tratamento. Anticorpos Anti-PD-L1
[0084] A presente descrição fornece anticorpos anti-PD-L1 com alta afinidade para a proteína PD-L1 humana. Os anticorpos testados apresentaram atividades de ligação inibidoras potentes e são úteis para usos terapêuticos e de diagnósticos.
[0085] A proteína PD-L1 é uma proteína de transmembrana tipo 1 de 40 kDa. Sua porção extracelular inclui uma imunoglobulina N-terminal do domínio V (IgV) (aminoácidos de 19 a 127) e um domínio de imunoglobulina C-terminal C (IgC) (aminoácidos de 133 a 225). PD-1 e PD-L1 interagem através da frente e lateral conservadas de seus domínios IgV, como fazem os domínios IgV de anticorpos e receptores da célula T. Não surpreendentemente, os presentes anticorpos anti-PD-L1 ligam todos ao domínio IgV que pode romper a ligação entre PD-1 e PD-L1. Portanto, foi uma verificação surpreendente e inesperada da presente descrição que os anticorpos, tais como muitos aqui descritos, que ligam ao domínio IgC da proteína PD-L1 podem anda ainda eficazmente e talvez ainda mais, inibir a PD-L1, levando a efeitos terapêuticos ainda mais melhorados.
[0086] Uma modalidade da presente descrição, portanto, fornece um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento deste, cujo anticorpo ou fragmento deste pode ligar especificamente a um domínio de imunoglobulina C (IgC) de uma proteína de ligante de morte programada 1 humana (PD-L1). Em algumas modalidades, o domínio IgC consiste dos resíduos de aminoácido de 133 a
225.
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[0087] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste pode ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácido Y134, K162, ou N183 da proteína PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste pode ligar a pelo menos dois dos resíduos de aminoácido Y134, K162, ou N183 da proteína PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste pode ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácido Y134, K162 e N183 of da proteína PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste não liga a um domínio de imunoglobulina V (Ig V) da proteína PD-L1, em que o domínio de Ig V consiste dos resíduos de aminoácido de 19 a 127.
[0088] De acordo com uma modalidade da presente descrição, é provido um anticorpo que inclui os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve com as regiões de CDR como definidas na SEQ ID NO: 1-6. Tabela 1. Sequências das regiões de CDR Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 VH CDR2 TISDGGGYIYYSDSVKG 2 VH CDR3 EFGKRYALDY 3 VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 VL CDR2 STSSRYT 5 VL CDR3 QQHYTTPLT 6
[0089] Como demonstrado nos exemplos experimentais, os anticorpos que continham as mesmas regiões de CDR, seja de camundongo, humanizadas ou quiméricas, têm atividades de ligação de inibidoras de PD-L1 potentes. Outra modelagem por computador indicou que alguns resíduos dentro da CDR podem ser modificados para reter ou melhorar a propriedade dos anticorpos. Tais resíduos são indicados como “pontos cruciais” os quais estão sublinhados na Tabela 1. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- PD-L1 da presente descrição inclui a CDR VH e VL como listado na Tabela 1, com uma, duas ou três modificações adicionais. Tais modificações podem ser adição, exclusões ou substituição de aminoácidos.
[0090] Em algumas modalidades, a modificação é a substituição em não mais do que uma posição de ponto crucial de cada uma das CDRs. Em
29 / 116 algumas modalidades, a modificação é substituição em uma, duas ou três tais posições de ponto crucial. Em uma modalidade, a modificação é a substituição em uma ou mais das posições de ponto crucial. Tais substituições, em algumas modalidades, são substituições conservativas.
[0091] Uma “substituição de aminoácido conservativa” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias dos resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo as cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Deste modo, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipetídeo de imunoglobulina é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em outra modalidade, um filamento de aminoácidos pode ser substituído com um filamento estruturalmente similar que difere na ordem e/ou composição dos membros da família de cadeia lateral.
[0092] Os exemplos não limitantes de substituições de aminoácido conservativas são providos na tabela abaixo, onde uma contagem de similaridade de 0 ou maior indica a substituição conservativa entre os dois aminoácidos. Tabela 2. Matriz de Similaridade de Aminoácido
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17 Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10 F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9 L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6 I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5 M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
30 / 116 V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6 K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5 H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6 Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4 N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2 E -5 0 -1 0 0 0 3 4 D -5 1 -1 0 0 0 4 T -2 0 0 1 1 3 UM -2 1 1 1 2 S 0 1 1 1 P -3 -1 6 G -3 5 C 12 Tabela 3. Substituições de aminoácido conservativas Para Aminoácido Substituição Com Alanina D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys Arginina D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn Asparagina D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln Ácido aspártico D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Cisteína D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser Glutamina D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Ácido glutâmico D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln Glicina Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala Isoleucina D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leucina Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile Lisina D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn Metionina D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Fenilalanina D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp Prolina D-Pro Serina D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys Treonina D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val Tirosina D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp Valina D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
[0093] Os exemplos específicos das CDRs com substituições adequadas são providos na SEQ ID NO: 61-111 do Exemplo 11. Em algumas modalidades, portanto, um anticorpo da presente descrição inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1 ou qualquer um de 61-67. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descrição inclui uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2 ou qualquer um de 68-77. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descrição inclui uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 1 ou qualquer um de 78-90. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descrição inclui uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4 ou qualquer um de 91-92. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descrição inclui uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 ou qualquer um de 93-105. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente descrição inclui uma VL CDR3 da
31 / 116 SEQ ID NO: 6 ou qualquer um de 106-110.
[0094] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento deste inclui não mais do que uma, não mais do que duas, ou não mais do que três das substituições acima. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 61-67, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6.
[0095] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 68-77, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6.
[0096] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 78-90, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6.
[0097] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 91-92, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6.
[0098] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 93-105 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6.
[0099] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento deste
32 / 116 inclui uma VH CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma VH CDR2 da SEQ ID NO: 2, uma VH CDR3 da SEQ ID NO: 3, uma VL CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma VL CDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma VL CDR3 da SEQ ID NO: 6 ou qualquer uma da SEQ ID NO: 106-111.
[00100] Os exemplos não limitantes da VH são providos na SEQ ID NO: 7-26 e 113, das quais a SEQ ID NO: 113 é a VH de camundongo e SEQ ID NO: 7-26 são as humanizadas. Além disso, entre as VH humanizadas, as SEQ ID NO: 9-15, 17-21 e 23-26 incluem uma ou mais retromutações para a versão de camundongo. Do mesmo modo, os exemplos não limitantes de VL (VK) são providos na SEQ ID NO: 27-33. SEQ ID NO: 28 e 30 são as sequências humanizadas originalmente derivadas, enxertadas em CDR, como mostrado nos exemplos. SEQ ID NO: 29 e 31-33 são VL humanizadas com retromutações.
[00101] As retromutações são mostradas ser úteis para reter certas características dos anticorpos anti-PD-L1. Portanto, em algumas modalidades, os anticorpos anti-PD-L1 da presente descrição, em particular, aqueles humanos ou humanizados, incluem uma ou mais das retromutações. Em algumas modalidades, a retromutação VH (isto é, aminoácido incluído na posição especificada) é um ou mais selecionado dentre (a) Ser na posição 44, (b) Ala na posição 49, (c) Ala na posição 53, (d) Ile na posição 91, (e) Glu na posição 1, (f) Val na posição 37, (g) Thr na posição 40 (h) Val na posição 53, (i) Glu na posição 54, (j) Asn na posição 77, (k) Arg na posição 94 e (l) Thr na posição 108, de acordo com a Numeração de Kabat e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as retromutações são selecionadas de (a) Ser na posição 44, (b) Ala na posição 49, (c) Ala na posição 53, e/ou (d) Ile na posição 91, de acordo com a Numeração de Kabat e combinações dos mesmos.
[00102] Em algumas modalidades, a retromutação de VL é uma ou mais selecionada de (a) Ser na posição 22, (b) Gln na posição 42, (c) Ser na
33 / 116 posição 43, (d) Asp na posição 60 e (e) Thr na posição 63, de acordo com Numeração de Kabat e combinações das mesmas.
[00103] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 da presente descrição inclui uma VH da SEQ ID NO: 7-26, uma VL da SEQ ID NO: 27- 33, ou seus respetivos equivalentes biológicos. Um equivalente biológico de uma VH ou VL é uma sequência que inclui os aminoácidos indicados enquanto tendo uma identidade de sequência global de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%. Um equivalente biológico da SEQ ID NO: 20, por exemplo, pode ser uma VH que tem uma identidade de sequência global de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% para a SEQ ID NO: 20 mas retém as CDRs (SEQ ID NO: 1-6 ou suas variantes) e opcionalmente retém uma ou mais, ou todas das retromutações. Em uma modalidade, a VH tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20 e a VL tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28. Anticorpos PD-L1 mais melhorados
[00104] Através da mutagênese aleatória com taxas de mutação controladas, os Exemplos 13 a 17 foram capazes de identificar vários resíduos de ponto crucial, em particular na CDR3 tanto da cadeia pesada (por exemplo, B6, C3, C6 e A1) quanto da cadeia leve (por exemplo, A3) as regiões variáveis (ver as Tabelas 14 e 15). A mutagênese foi realizada em um anticorpo modelo derivado de Hu1210-41 (como notado na nota de rodapé da Tabela 14, o anticorpo WT modelo tem uma substituição de S60R (Numeração de Kabat) na CDR2 de cadeia pesada). Além disso, se comparado ao anticorpo quimérico, Hu1210-41 incluiu uma substituição de G53A (ver a SEQ ID NO:20) em VH CDR2. Entre os anticorpos mutantes testados, o anticorpo B6 exibiu afinidade de ligação enormemente melhorada ao PD-L1 humano e atividades biológicas.
[00105] Em uma modalidade, portanto, sãos fornecidos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que incluem as seguintes CDRs (da mutante de S60R) e suas variantes.
34 / 116 Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 VH CDR2 TISDAGGYIYYRDSVKG 116 VH CDR3 EFGKRYALDY 3 VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 VL CDR2 STSSRYT 5 VL CDR3 QQHYTTPLT 6
[00106] Em uma modalidade, portanto, sãos providos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que incluem as seguintes CDRs (de B6) e suas variantes. Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 VH CDR2 TISDAGGYIYYRDSVKG 116 VH CDR3 ELPWRYALDY 117 VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 VL CDR2 STSSRYT 5 VL CDR3 QQHYTTPLT 6
[00107] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade para uma proteína PD-L1 humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 3, em que o segundo resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Leu; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO:
35 / 116 6 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 6.
[00108] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade para uma proteína PD-L1 humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117 ou uma variante da SEQ ID NO: 117 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 117, em que o segundo resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Leu; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 6.
[00109] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 1 têm uma substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido 1, 2 e 5, tais como as SEQ ID NO: 61-67: Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 TYDMS 61 CYDMS 62 SFDMS 63 SHDMS 64
36 / 116 SWDMS 65 SYDMT 66 SYDMC 67
[00110] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 116 têm uma ou mais substituições de aminoácido, tais como a SEQ ID NO: 118-127, 2 e 68-77. Em algumas modalidades, as variantes são SEQ ID NO: 118-127. Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR2 TISDAGGYIYYRDSVKG 116 TISDAGAYIYYRDSVKG 118 TISDAGPYIYYRDSVKG 119 TISDAGGFIYYRDSVKG 120 TISDAGGHIYYRDSVKG 121 TISDAGGWIYYRDSVKG 122 TISDAGGYIYYRDTVKG 123 TISDAGGYIYYRDCVKG 124 TISDAGGYIYYRDSLKG 125 TISDAGGYIYYRDSIKG 126 TISDAGGYIYYRDSMKG 127 TISDGGGYIYYSDSVKG 2 TISDGGAYIYYSDSVKG 68 TISDGGPYIYYSDSVKG 69 TISDGGGFIYYSDSVKG 70 TISDGGGHIYYSDSVKG 71 TISDGGGWIYYSDSVKG 72 TISDGGGYIYYSDTVKG 73 TISDGGGYIYYSDCVKG 74 TISDGGGYIYYSDSLKG 75 TISDGGGYIYYSDSIKG 76 TISDGGGYIYYSDSMKG 77
[00111] Em algumas modalidades, o terceiro resíduo de aminoácido da CDR3 da variante VH é Pro. Em algumas modalidades, o quarto resíduo de aminoácido da CDR3 da variante VH é Trp.
[00112] As variantes Exemplares da SEQ ID NO: 3 têm uma ou mais substituições de aminoácidos nos resíduos de aminoácido 1-6, tais como a SEQ ID NO: 78-90: Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR3 EFGKRYALDY 3 QFGKRYALDY 78 DFGKRYALDY 79 NFGKRYALDY 80 EYGKRYALDY 81 EHGKRYALDY 82 EWGKRYALDY 83 EFAKRYALDY 84 EFPKRYALDY 85 EFGRRYALDY 86
37 / 116 EFGKKYALDY 87 EFGKRFALDY 88 EFGKRHALDY 89 EFGKRWALDY 90
[00113] As Variantes exemplares da SEQ ID NO: 117 têm uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos de aminoácido 1, 5 e 6, tais como a SEQ ID NO: 128-139: Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR3 ELPWRYALDY (B6) 117 ELFNRYALDY (B1) 128 ELHFRYALDY (C3) 129 ELYFRYALDY (C6) 130 ELLHRYALDY (A1) 131 ELRGRYALDY (A2) 132 QLPWRYALDY 133 DLPWRYALDY 134 NLPWRYALDY 135 ELPWKYALDY 136 ELPWRFALDY 137 ELPWRHALDY 138 ELPWRWALDY 139
[00114] Em algumas modalidades, a variante da SEQ ID NO: 4 tem uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 3, tal como a SEQ ID NO: 91-92: Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 KATQDVTPAVA 91 KACQDVTPAVA 92
[00115] Em algumas modalidades, a variante da SEQ ID NO: 5 tem uma substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido de 1 a 6, tal como a SEQ ID NO: 93-105: Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR2 STSSRYT 5 TTSSRYT 93 CTSSRYT 94 SSSSRYT 95 SMSSRYT 96 SVSSRYT 97 STTSRYT 98 STCSRYT 99 STSTRYT 100 STSCRYT 101 STSSKYT 102 STSSRFT 103 STSSRHT 104 STSSRWT 105
[00116] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 6 têm uma
38 / 116 substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido 1 e 2, tais como a SEQ ID NO: 106-111. Uma outra variante exemplar é a SEQ ID NO:
140. Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR3 QQHYTTPLT 6 EQHYTTPLT 106 DQHYTTPLT 107 NQHYTTPLT 108 QEHYTTPLT 109 QDHYTTPLT 110 QNHYTTPLT 111 QQHSDAPLT (A3) 140
[00117] A mutante A3, que tem as substituições nos três resíduos na VL CDR3, também apresentou uma excelente afinidade de ligação ao PD-L1 humano. Em uma modalidade, portanto, são providos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que incluem as seguintes CDRs e suas variantes: Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 VH CDR2 TISDAGGYIYYRDSVKG 116 VH CDR3 EFGKRYALDY 3 VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 VL CDR2 STSSRYT 5 VL CDR3 QQHSDAPLT 140
[00118] Em uma modalidade, portanto, é provido um anticorpo ou fragmento deste, em que o anticorpo ou fragmento deste tem especificidade para uma proteína PD-L1 humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 3; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID
39 / 116 NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 140 ou uma variante da SEQ ID NO: 140 tendo uma, duas ou três substituições, exclusões ou inserções se comparado à SEQ ID NO: 140, em que pelo menos (i) resíduo de aminoácido 4 da VL CDR3 é Ser, (ii) resíduo de aminoácido 5 da VL CDR3 é Asp, ou (iii) resíduo de aminoácido 6 da VL CDR3 é Ala.
[00119] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 1 têm uma substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido 1, 2 e 5, tal como a SEQ ID NO: 61-67.
[00120] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 116 têm uma ou mais substituições de aminoácido, tais como a SEQ ID NO: 118-127, 2 e 68-77.
[00121] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 3 têm uma ou mais substituições de aminoácido tais como a SEQ ID NO: 117 e 128-139. Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR3 ELPWRYALDY (B6) 117 ELFNRYALDY (B1) 128 ELHFRYALDY (C3) 129 ELYFRYALDY (C6) 130 ELLHRYALDY (A1) 131 ELRGRYALDY (A2) 132 QLPWRYALDY 133 DLPWRYALDY 134 NLPWRYALDY 135 ELPWKYALDY 136 ELPWRFALDY 137 ELPWRHALDY 138 ELPWRWALDY 139
[00122] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 4 têm uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 3, tal como a SEQ ID NO: 91-92.
[00123] As variantes exemplares da SEQ ID NO: 5 têm uma substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido 1-6, tal como a SEQ ID NO: 93-105.
40 / 116
[00124] Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido 4 da VL CDR3 variante é Ser. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido 5 da CDR3 da VL variante é Asp. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido 6 da VL CDR3 variante é Ala. As variantes exemplares da SEQ ID NO: 140 têm uma substituição de aminoácido em um dos resíduos de aminoácido 1 e 2, tal como a SEQ ID NO: 161-166. Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR3 QQHSDAPLT 140 EQHSDAPLT 161 DQHSDAPLT 162 NQHSDAPLT 163 QEHSDAPLT 164 QDHSDAPLT 165 QNHSDAPLT 166
[00125] Os Exemplos de anticorpos derivado do estudo de mutagênese ou seus fragmentos de ligação ao antígeno incluem aqueles tendo a região variável de cadeia pesada e cadeia leve provida na Tabela 15. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 141 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 142. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 143 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 144. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 145 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 147 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 148. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 149 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 150. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 151 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 152. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 153 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 154. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 155 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO:
41 / 116 157 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 158. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada inclui a SEQ ID NO: 159 e a região variável de cadeia leve inclui a SEQ ID NO: 160.
[00126] Também será entendido por aquele de habilidade comum na técnica que os anticorpos como aqui descritos podem ser modificados tal que os mesmos variam na sequência de aminoácido dos polipetídeo de ligação de ocorrência natural a partir do quais os mesmos foram derivados. Por exemplo, um polipetídeo ou sequência de aminoácido derivados de uma proteína projetada podem ser similar, por exemplo, ter uma certa identidade em por cento com a sequência de partida, por exemplo, esta pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de partida.
[00127] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido ou uma ou mais porções não normalmente associadas com um anticorpo. As modificações exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, um anticorpo da divulgação pode compreender uma sequência ligante flexível, ou pode ser modificada para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou um rótulo).
[00128] Os anticorpos, variantes, ou derivados dos mesmos da divulgação incluem os derivados que são modificados, isto é, através da ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo tal que a ligação covalente não previne que o anticorpo ligue ao epítopo. Por exemplo, mas não por via de limitação, os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, através da glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das várias modificações químicas podem ser realizadas através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc.
42 / 116 Adicionalmente, os anticorpos podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[00129] Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados aos agentes terapêuticos, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídeos, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.
[00130] Os anticorpos podem ser conjugados ou fundidos a um agente terapêutico, que pode incluir rótulos detectáveis tais como rótulos radioativos, um imunomoduladores, um hormônio, uma enzima, um oligonucleotídeo, um agente terapêutico ou de diagnóstico fotoativo, um agente citotóxico, que pode ser um fármaco ou uma toxina, um agente de melhora de ultrassom, um rótulo não-radioativo, uma combinação dos mesmos e outros tais agentes conhecidos na técnica.
[00131] Os anticorpos podem ser detectavelmente rotulados ligado os mesmos a um composto quimioluminescente. A presença do polipetídeo de ligação rotulado com quimioluminescência ao antígeno é depois determinada pela detecção da presença de luminescência que surge durante o decorrer de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulação por luminescência particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
[00132] Os anticorpos também podem ser detectavelmente rotulados 152 usando metais que imitem fluorescência tais como Eu, ou outros da série dos lantanídeos. Os mesmos metais podem ser ligados ao anticorpo usando tais grupos de quelantes metálicos como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). As técnicas para conjugar várias porções a um anticorpo são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2a Ed.),
43 / 116 Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985) e Thorpe et al., “The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)). Moléculas Bifuncionais
[00133] A PD-L1 é uma molécula de ponto de checagem imunológica e também é um antígeno tumoral. Como uma molécula que alveja o antígeno tumoral, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno específico para PD-L1 podem ser combinados com um segundo fragmento de ligação ao antígeno específico para uma célula imune para gerar um anticorpo biespecífico.
[00134] Em algumas modalidades, a célula imunológica é selecionada do grupo que consiste em uma célula T, uma célula B, um monócito, um macrófago, um neutrófilo, uma célula dendrítica, um fagócito, uma célula exterminadora natural, um eosinófilo, um basófilo e um mastócito. As moléculas na célula imune que podem ser alvejadas incluem, por exemplo, CD3, CD16, CD19, CD28 e CD64. Outros exemplos incluem PD-1, CTLA-4, LAG-3 (também conhecidos como CD223), CD28, CD122, 4-1BB (também conhecidos como CD137), TIM3, OX-40 ou OX40L, CD40 ou CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA (também conhecido como CD272), receptores semelhantes à imunoglobulina da célula exterminadora (KIRs) e CD47. Os exemplos específicos da biespecificidade incluem, sem limitação, PD-L1/PD-1, PD- L1/LAG3, PD-L1/TIGIT e PD-L1/CD47.
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[00135] Como um inibidor do ponto de checagem imunológico, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno específico para PD-L1 pode ser combinado com um segundo fragmento de ligação ao antígeno específico a um antígeno de tumor para gerar um anticorpo biespecífico. Um “antígeno de tumor” é uma substância antigênica produzida nas células tumorais, isto é, este dispara uma resposta imune no hospedeiro. Os antígenos tumorais são úteis na identificação de células tumorais e são candidatos potenciais para o uso na terapia do câncer. As proteínas normais no corpo não são antigênicas. Algumas proteínas, contudo, são produzidas ou sobre-expressadas durante a gênese tumoral e deste modo parecem “estranhas” ao corpo. Isto pode incluir as proteínas normais que são bem sequestradas do sistema imune, as proteínas que são normalmente produzidas em quantidades extremamente pequenas, proteínas que são normalmente produzidas somente em alguns estágios de desenvolvimento, ou proteínas cuja estrutura é modificada devido à mutação.
[00136] Uma abundância dos antígenos tumorais é conhecida na técnica e novos antígenos tumorais podem ser prontamente identificados pela triagem. Os exemplos não limitantes dos antígenos tumorais incluem EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, CIX, PSMA, proteína de ligação de folato, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrina, αVβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP e Tenascina.
[00137] Em alguns aspectos, a unidade monovalente tem especificidade para uma proteína que é sobre expressada em uma célula tumoral se comparado a uma célula não tumoral correspondente. Uma “célula não tumoral correspondente” como aqui usada, se refere a uma célula não tumoral que é do mesmo tipo celular que a origem da célula tumoral. É notado que tais proteínas não são necessariamente diferentes dos antígenos tumorais. Os exemplos não limitantes incluem o antígeno carcinoembrionário (CEA), que é sobre-expressado na maioria dos carcinomas do cólon, reto,
45 / 116 mama, pulmão, pâncreas e trato gastrointestinal; receptores de heregulina (HER-2, neu ou c-erbB-2), que são frequentemente sobre-expressados nos cânceres de mama, ovarianos, do cólon, pulmão, próstata e cervicais; receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é altamente expressado em uma faixa de tumores sólidos incluindo aqueles da mama, cabeça e pescoço, pulmão de célula não pequena e próstata; receptor de asialoglicoproteína; receptor de transferrina; receptor do complexo da enzima serpina, que é expressado em hepatócitos; receptor do fator fibroblastos (FGFR), que é sobre-expressado nas células de adenocarcinoma do duto pancreático; receptor do fator de crescimento vascular endotelial (VEGFR), para terapia de gene antiangiogênese; receptor de folato, que é seletivamente sobre- expressado em 90% de carcinomas ovarianos não mucinoso; glycocalyx de superfície celular; receptores de carboidrato; e receptor de imunoglobulina polimérica, que é útil para a liberação do gene às células epiteliais respiratórias e atrativas para o tratamento das doenças pulmonares tais como Fibrose Cística. Os exemplos não limitantes de biespecificidade neste respeito incluem PD-L1/EGFR, PD-L1/Her2, PD-L1/CD33, PD-L1/CD133, PD- L1/CEA e PD-L1/VEGF.
[00138] O formato diferente dos anticorpos biespecíficos também são providos. Em algumas modalidades, cada um dos fragmentos anti-PD-L1 e o segundo fragmento são cada um independentemente selecionados de um fragmento de Fab, um fragmento variável de cadeia única (scFv), ou um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico também inclui um fragmento de Fc.
[00139] As moléculas bifuncionais que incluem não apenas o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno também são providas. Como uma molécula que alveja o antígeno tumoral, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno específico para PD-L1, tal como aqueles aqui descritos, pode ser combinado com uma citocina imune ou ligante opcionalmente
46 / 116 através de um ligador de peptídeo. As citocinas ou ligantes imunes ligados incluem, mas não são limitadas a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4- 1BBL, LIGHT e GITRL. Tais moléculas bifuncionais podem combinar o efeito de bloqueio do ponto de checagem imunológico com a modulação imunológica do local do sítio tumoral. Polinucleotídeos que codificam os anticorpos e métodos de preparar os anticorpos
[00140] A presente descrição também fornece polinucleotídeos isolados ou moléculas de ácido nucleico (por exemplo, SEQ ID NO: 34-60, 112 e 114) codificando os anticorpos, variantes ou derivados dos mesmos da divulgação. Os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar a região variável de cadeias pesadas e leves inteira do polipetídeo de ligação ao antígeno, as variantes ou derivados das mesmas na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeos separadas. Adicionalmente, os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar as porções da região variável de cadeias pesadas e leves do polipetídeo de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas.
[00141] Os métodos de fabricar os anticorpos são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em algumas modalidades, tanto as regiões variáveis quanto constantes do polipetídeo de ligação ao antígeno da presente descrição são completamente humanas. Os anticorpos completamente humanos podem ser feitos usando os procedimentos descritos na técnica e como aqui descritos. Por exemplo, os anticorpos completamente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados administrando-se o antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta à inoculação antigênica, mas aqueles locais endógenos foram desabilitados. As técnicas exemplares que podem ser usadas para fabricar tais anticorpos são
47 / 116 descritas nas Patentes U.S.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140 que são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.
[00142] Em algumas modalidades, os anticorpos preparados não provocarão uma resposta imune nociva no animal a ser tratado, por exemplo, em um ser humano. Em uma modalidade, o polipetídeo de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos da divulgação são modificados para reduzir sua imunogenicidade usando procedimentos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser humanizados, primatizados, desimunizados, ou anticorpos quiméricos ser podem ser fabricados. Os mesmos tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo de murino ou primata, que retém ou substancialmente retém as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo precursor, mas que é menos imunogênico em humanos. Isto pode ser obtido através de vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis não humanos inteiros nas regiões constantes humanas para gerar os anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões não humanas que determinam a complementariedade (CDRs) em uma estrutura humana e regiões constantes com ou sem a retenção de resíduos estruturais críticos; ou (c) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas os “ocultando” com uma seção semelhante à humana através da substituição dos resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994) e Pat. U.S. Nos.: 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e
6.190.370, todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[00143] A desimunização também pode ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Como aqui usado, o termo “de-
48 / 116 imunização” inclui a alteração de um anticorpo para modificar os epítopos da célula T (ver, por exemplo, Publicações de Pedido Internacional Nos.: WO/9852976 A1 e WO/0034317 A2). Por exemplo, as sequências de cadeia pesada variáveis e sequências de cadeia leve variáveis do anticorpo de partida são analisadas e um “mapa” do epítopo da célula T humana de cada região em V mostrando o local dos epítopos em relação às regiões que determinam complementariedade (CDRs) e outros resíduos chave dentro da sequência são criados. Os epítopos de célula T individuais do epítopo da célula T são analisados de modo a identificar as substituições de aminoácido alternativas com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma faixa de sequências pesadas variáveis e cadeias leves variáveis alternativas são projetadas compreendendo as combinações de substituições de aminoácido e as mesmas sequências são subsequentemente incorporadas em uma faixa de polipeptídeos de ligação. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados quanto a ligação e/ou função. Os genes de cadeia pesada e cadeia leve completos compreendendo regiões constantes variáveis e humanas modificadas são depois clonadas em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes são introduzidos em linhagens celulares para a produção de anticorpo integral. Os anticorpos são depois comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados e a variante ótima é identificada.
[00144] A especificidade de ligação do polipetídeo de ligação ao antígeno da presente descrição pode ser determinada através de ensaios in vitro tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
[00145] Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de unidades de cadeia simples (Pat. U.S. No. 4.694.778; Bird, Science 242:423- 442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); e Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir as unidades de cadeia simples da presente descrição. As unidades de cadeia
49 / 116 simples são formadas ligando-se os fragmentos de cadeia pesada e leve da região de Fv por intermédio de uma ponte de aminoácidos, resultando em um peptídeo de fusão de cadeia simples. As técnicas para a montagem de fragmentos de Fv funcionais em E. coli também podem ser usadas (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
[00146] Os exemplos das técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única (scFvs) e os anticorpos incluem aqueles descritos nas Pat. U.S. Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo o uso in vivo dos anticorpos em seres humanos e os ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que as diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como os anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir os anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); Pat. U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[00147] Os anticorpos humanizados são as moléculas de anticorpo derivadas de um anticorpo de espécie não humana que ligam ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões que determinam a complementariedade (CDRs) das espécies não humanas e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana. Frequentemente, os resíduos estruturais nas regiões da estrutura humana serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente melhorar, a ligação ao antígeno. As mesmas substituições estruturais são identificadas através dos
50 / 116 métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, através da modelagem das interações da CDR e resíduos estruturais para identificar os resíduos estruturais importantes para a ligação ao antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos estruturais não usuais em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al., Pat. U.S. No. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.) Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de práticas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; Pat. U.S. Nos. 5.225.539;
5.530.101; e 5.585.089), revestimento ou recapeamento (EP 592.106; EP
519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)) e embaralhamento de cadeia (Pat. U.S. No.
5.565.332, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade).
[00148] Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de visualização de fago usando bibliotecas de anticorpos derivadas das sequências de imunoglobulina humana. Ver também, Pat. U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00149] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar as imunoglobinas endógenas funcionais, mas que podem expressar os genes de imunoglobulina humanos. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulina humana de cadeia pesada e leve podem ser aleatoriamente introduzidos ou através da recombinação homóloga em células tronco embrionárias de camundongo.
51 / 116 Alternativamente, a região variável humana, região constante e região de diversidade podem ser introduzidas nas células tronco embrionárias de camundongo além dos genes humanos de cadeia pesada e leve. Os genes de imunoglobulina de camundongo de cadeia pesada e leve podem ser tornados separada ou simultaneamente não funcionais com a introdução dos locais da imunoglobulina humana através da recombinação homóloga. Em particular, as exclusões homozigóticas da região de JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas nos blastócitos para produzir camundongos quimérico. Os camundongos quiméricos são depois criados para produzir uma descendência homozigótica que expressa os anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados em uma maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todos ou uma porção de um polipetídeo alvo desejado. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos imunizados usando uma tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelo camundongo transgênico rearranjam durante a diferenciação da célula B e subsequentemente sofre uma troca de classe e mutação somática. Deste modo, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, ver, Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Pat. U.S. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806;
5.814.318; e 5.939.598, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Além disso, as companhias tais como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) podem estar comprometidas em prover
52 / 116 anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando uma tecnologia similar àquela descrita acima.
[00150] Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado também podem ser gerados usando uma técnica indicada como “seleção guiada”. Neste método, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). Ver também a Patente U.S. No. 5.565.332, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.)
[00151] Em outra modalidade, o DNA que codifica os anticorpos monoclonais desejados podem ser prontamente isolados e sequenciados usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando-se sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma isoladas e subclonadas servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produziriam imunoglobinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético como aqui descrito) pode ser usado para clonar sequências de região variável constantes e para a fabricação de anticorpos como descrito em Newman et al., Pat. U.S. No. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, a qual é aqui incorporada por referência. Essencialmente, isto vincula a extração do RNA das células selecionadas, conversão para cDNA e amplificação por PCR usando iniciadores específicos de Ig. Os iniciadores adequados para este propósito também são descritos na Pat. U.S. No.
5.658.570. Como será descrito em maiores detalhes abaixo, as células
53 / 116 transformadas que expressam o anticorpo desejado podem ser cultivadas em quantidades relativamente grandes para prover fornecimentos clínicos e comerciais da imunoglobulina.
[00152] Adicionalmente, usando técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs do polipetídeo de ligação ao antígeno da presente descrição, podem ser inseridas dentro das regiões de estrutura, por exemplo, em regiões de estrutura humana para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de estrutura podem ser de ocorrência natural ou regiões de estrutura de consenso e preferivelmente regiões de estrutura humana (ver, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) para uma listagem das regiões de estrutura humana). Preferivelmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e as CDRs codificando um anticorpo que liga especificamente a pelo menos um epítopo de um polipetídeo desejado, por exemplo, LIGHT. Preferivelmente, um ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas dentro das regiões estruturais, e, preferivelmente, as substituições de aminoácido melhoram a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer as substituições ou exclusões de aminoácido de uma ou mais resíduos de cisteína de região variável participando em uma ligação de dissulfeto intracadeia para gerar as moléculas de anticorpo sem uma ou mais ligações de dissulfeto intracadeia. Outras alterações para o polinucleotídeo são abrangidas pela presente descrição e dentro da habilidade da técnica.
[00153] Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos” (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) dividindo-se os genes de uma molécula de anticorpo de camundongo, de especificidade para antígeno apropriada, junto com os genes de uma molécula de anticorpo humana de atividade biológica apropriada podem ser usadas. Como aqui usado, um anticorpo quimérico é uma molécula
54 / 116 em que as diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais espécies, tais como aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana.
[00154] Ainda um outro meio altamente eficaz para gerar anticorpos recombinantes é descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, esta técnica resulta na geração de anticorpos primatizados que contém domínios variáveis de macaco e sequências constantes humanas. Esta referência é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Além disso, esta técnica também é descrita nas Pat. U.S. comumente atribuídas Nos.
5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096 cada uma a qual é aqui incorporada por referência.
[00155] Alternativamente, as linhagens celulares que produzem anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas ao técnico habilitado. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias. Neste respeito, as técnicas adequadas para o uso na divulgação como descrito abaixo são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nova Iorque (1991) que é aqui incorporada por referência na sua totalidade, incluindo os suplementos.
[00156] Adicionalmente, as técnicas padrão conhecidas àqueles habilitados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo da presente descrição, incluindo, mas não limitado à mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR que resulta em substituições de aminoácido. Preferivelmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos do que 50 substituições de aminoácido, menos do que 40 substituições de aminoácido, menos do que 30 substituições de aminoácido, menos do que 25
55 / 116 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituições de aminoácido, menos do que 5 substituições de aminoácido, menos do que 4 substituições de aminoácido, menos do que 3 substituições de aminoácido, ou menos do que 2 substituições de aminoácido com relação à região variável de cadeia pesada de referência, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, região de cadeia leve variável, CDR-L1, CDR-L2, ou CDR-L3. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, tal como pela mutagênese de saturação e as mutantes resultantes podem ser triadas quanto sua atividade biológica para identificar as mutantes que retém atividade. Tratamento de Câncer
[00157] Como aqui descrito, os anticorpos, variantes ou derivados da presente descrição podem ser usados em certos métodos de tratamento e diagnóstico.
[00158] A presente descrição está direcionada ainda às terapias com base em anticorpo que envolvem administrar os anticorpos da divulgação a um paciente tal como um animal, um mamífero e um ser humano para tratar um ou mais dos distúrbios ou condições aqui descritos. Os compostos terapêuticos da divulgação incluem, mas não são limitados aos anticorpos da divulgação (incluindo variantes e derivados das mesmas como aqui descritos) e ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando os anticorpos da divulgação (incluindo variantes e derivados da mesma como aqui descritos).
[00159] Os anticorpos da divulgação também podem ser usados para tratar ou inibir câncer. PD-L1 pode ser superexpresso em células de tumor. PD-L1 derivado de tumor pode ligar-se a PD-1 nas células imunes limitando deste modo a imunidade de célula T antitumor. Os resultados com inibidores de molécula pequena ou anticorpos monoclonais alvejando PD-L1 em modelos de tumor de murino, indicam que a terapia de PD-L1 alvejada é uma
56 / 116 abordagem alternativa e realística importante para controle eficaz de crescimento de tumor. Como demonstrado nos exemplos experimentais, os anticorpos anti-PD-L1 ativaram o mecanismo de resposta imune adaptativa, que pode levar à sobrevivência melhorada em pacientes com câncer.
[00160] Consequentemente, em algumas modalidades, são providos métodos para tratar um câncer em um paciente em necessidade do mesmo. O método, em uma modalidade, acarreta administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente descrição. Em algumas modalidades, pelo menos uma das células cancerosas (por exemplo, células estrômicas) no paciente expressa, superexpressa ou é induzida a expressar PD-L1. A indução da expressão de PD-L1, por exemplo, pode ser feita pela administração de uma vacina contra tumor ou radioterapia.
[00161] Os tumores que expressam a proteína de PD-L1 incluem aqueles de câncer da bexiga, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer renal, câncer mamário, câncer uretral, câncer colorretal, câncer da cabeça e pescoço, câncer de célula escamosa, carcinoma de célula de Merkel, câncer gastrointestinal, câncer estomacal, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal e câncer pulmonar de célula pequena. Consequentemente, os anticorpos presentemente descritos podem ser usados para tratar qualquer um ou mais de tais cânceres.
[00162] As terapias celulares, tais como as terapias de célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR), também são providas na presente descrição. Uma célula adequada pode ser usada, que é colocada em contato com um anticorpo anti-PD-L1 da presente descrição (ou alternativamente engenheirada para expressar um anticorpo anti-PD-L1 da presente descrição). Em tal contato ou engenheiramento, a célula pode ser depois introduzida em um paciente com câncer em necessidade de um tratamento. O paciente com câncer pode ter um câncer de qualquer um dos tipos como aqui descrito. A célula (por exemplo, célula T) pode ser, por exemplo, um linfócito T
57 / 116 infiltrante em tumor, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou a combinação dos mesmos, sem limitação.
[00163] Em algumas modalidades, a célula foi isolada do próprio paciente com câncer. Em algumas modalidades, a célula foi provida por um doador ou a partir de um banco de célula. Quando a célula é isolada do paciente com câncer, reações imunes indesejadas podem ser minimizadas.
[00164] As doenças ou condições adicionais associadas com a sobrevivência de célula aumentada, que podem ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas com os anticorpos ou variantes ou derivados dos mesmos da divulgação incluem, mas não são limitados à progressão e/ou metástases de malignidades e distúrbios relacionados tais como leucemia (incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e leucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia verdadeira, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença não Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e tumores sólidos incluindo, mas não limitado a, sarcomas e carcinomas tais como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer mamário, câncer tireóidico, câncer endometrial, melanoma, câncer prostático, câncer ovariano, câncer prostático, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de célula sudorípara, carcinoma de glândula sebácica, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto biliar,
58 / 116 coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma. Terapias de Combinação
[00165] Em uma modalidade adicional, as composições da divulgação são administradas em combinação com um agente antineoplástico, um agente antiviral, agente antibacteriano ou antibiótico ou agentes antifúngicos. Qualquer um destes agentes conhecidos na técnica pode ser administrado nas composições da corrente divulgação.
[00166] Em uma outra modalidade, as composições da divulgação são administradas em combinação com um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos que podem ser administrados com as composições da divulgação incluem, mas não são limitados a, derivados antibióticos (por exemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorrubicina e dactinomicina); antiestrogênios (por exemplo, tamoxifeno); antimetabólitos (por exemplo, fluorouracila, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2b, ácido glutâmico, plicamicina, mercaptopurina e 6-tioguanina); agentes citotóxico (por exemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabinosida, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiureia, procarbazina, mitomicina, busulfano, cisplatina e sulfato de vincristina); hormônios (por exemplo, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno e testolactona); derivados de mostarda nitrogenada (por exemplo, mefalen, corambucila, mecloretamina (mostarda nitrogenada) e tiotepa); esteróides e combinações (por exemplo, betametasona fosfato de sódio); e outros (por exemplo, dicarbazina, asparaginase, mitotano,
59 / 116 sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina e etoposida).
[00167] Em uma modalidade adicional, as composições da divulgação são administradas em combinação com citocinas. As citocinas que podem ser administradas com as composições da divulgação incluem, mas não são limitados a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, antiCD40, CD40L e TNF-α.
[00168] Em modalidades adicionais, as composições da divulgação são administradas em combinação com outros regimes terapêuticos ou profiláticos, tais como, por exemplo, terapia de radiação.
[00169] As terapias de combinação também são providas, que incluem o uso de um ou mais dos anticorpos anti-PD-L1 da presente descrição junto com um segundo agente anticâncer (quimioterapêutico). Os agentes quimioterapêuticos podem ser categorizados pelo seu mecanismo de ação, por exemplo, nos seguintes grupos: - agentes antimetabólitos/agentes anticâncer tais como análogos de pirimidina, floxuridina, capecitabina e citarabina; - análogos de purina, antagonistas de foliato e inibidores relacionados; - agentes antiproliferativo/antimitóticos incluindo produtos naturais tais como alcalóide vinca (vinblastina, vincristina) e microtúbulo tal como taxano (paclitaxel, docetaxel), vinblastina, nocodazol, epotilonas, vinorrelbina (NAVELBINE®) e epipodofilotoxinas (etoposida, teniposida); - agentes que danificam DNA tais como actinomicina, ansacrina, bussulfano, carboplatina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida (CYTOXAN®), dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, ifosfamida, melfalan, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, procarbazina, taxol, taxotere, teniposida, etoposida e trietilenotiofosforamida; - antibióticos tais como dactinomicina, daunorrubicina,
60 / 116 doxorrubicina, idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; - enzimas tais como L-asparaginase que sistemicamente metaboliza L-asparagina e priva as células que não tem a capacidade para sintetizar a sua própria asparagina; - agentes antiplaquetários; - agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tais como mostardas nitrogenadas ciclofosfamida e análogos (melfalan, clorambucila, hexametilmelamina e tiotepa), alquil nitrosoureias (carmustina) e análogos, estreptozocina e triazenos (dacarbazina); - antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos do ácido fólico (metotrexato); - complexos da coordenação da platina (cisplatina, oxiloplatinim e carboplatina), procarbazina, hidroxiureia, mitotano e aminoglutetimida; - hormônios, análogos de hormônio (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida e nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol e anastrozol); - anticoagulantes tais como heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores de trombina; - agentes fibrinolítios tais como ativador plasminogênico tecidual, estreptocinase, urocinase, aspirina, dipiridamol, ticlopidina e clopidogrel; - agentes antimigratórios; - agentes antissecretores (breveldin); - imunossupressivos tacrolimus, sirolimus, azatioprina e micofenolato; - compostos (TNP-470, genisteína) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular e
61 / 116 inibidores do fator de crescimento de fibroblasto); - bloqueadores do fator de angiotensina, doadores de óxido nítrico; - oligonucleotídeos antissentido; - anticorpos tais como trastuzumab e rituximab; - inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação tais como tretinoína; - inibidores, inibidores da topoisomerase (doxorrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, eniposida, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, irinotecano, mitoxantrona, topotecano e irinotecano) e corticosteróides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona e prednisolona); - inibidores da cinase da transdução de sinal do fator de crescimento; - indutores de disfunção; - toxinas tais como toxina da Cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina da adenilato ciclase de Bordetella pertussis, toxina da difteria e ativadores da caspase; - e cromatina.
[00170] Outros exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem: - agentes de alquilação tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); - alquil sulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; - aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; - emileruminas e memilamelaminas incluindo alfretamina, triemilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimemilolomelamina;
62 / 116
- acetogeninas, especialmente bulatacina e bulatacinona; - uma camptotecina, incluindo topotecano análogo sintético; - briostatina; - calistatina; - CC-1065, incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina; - criptoficinas, particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8; - dolastatina; - duocarmicina, incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI; - eleuterrobina; - pancratistatina; - uma sarcodictiína; - espongistatina; - mostardas nitrogenadas tais como clorambucila, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; - nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, foremustina, lomustina, nimustina e ranimustina; - antibióticos tais como os antibióticos de enediína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina phI1), dinemicina incluindo dinemicina A, bisfosfonatos tais como clodronato, uma esperamicina, neocarzinostatina cromoforo e cromoforos antibióticos de enediína relacionados com cromoproteína, aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-
63 / 116 doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubicina; - antimetabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5- FU); - análogos do ácido fólico tais como demopterina, metotrexato, pteropterina e trimetrexato; - análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; - análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; - androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; - antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano e trilostano; - reabastecedores de ácido fólico tais como ácido frolínico; - tricotecenos, especialmente toxina T-2, verracurina A, rorrideina A e anguidina; - taxóides tais como paclitaxel (TAXOL®) e docetaxel (TAXOTERE®); - análogos de platina tal como cisplatina e carboplatina; - aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; ansacrina; hestrabucila; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diaziquona; elformtina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; leucovorina; lonidamina;
64 / 116 maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; fluoropirimidina; ácido folínico; ácido podofilínico; 2-etil- hidrazida; procarbazina; polissacarídeo-K (PSK); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”- triclorotriemilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiopeta; clorambucila; gencitabina (GEMZAR®); 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; vinblastina; platina; etoposida (VP- 16); ifosfamida; mitroxantrona; vancristina; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeoloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DFMO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina; FOLFIRI (fluorouracila, leucovorina e irinotecano); - e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
[00171] Também incluído na definição de “agente quimioterapêutico” são agentes anti-hormonal tais como antiestrogênios e moduladores do receptor de estrogênio seletivo (SERMs), inibidores da enzima aromatase, antiandrogênios e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima que atuam para regular ou inibir a ação de hormônio sobre tumores.
[00172] Os exemplos de antiestrogênios e SERMs incluem, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX™), raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (FARESTON®).
[00173] Inibidores da produção de estrogênio reguladora da enzima aromatase nas glândulas adrenais. Os exemplos incluem 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGACE®), exemestano,
65 / 116 formestano, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®) e anastrozol (ARIMIDEX®).
[00174] Os exemplos de antiandrogênios incluem flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina.
[00175] Os exemplos de agentes quimioterapêuticos também incluem agentes antiangiogênico incluindo, mas não são limitados a, ácido retinóico e derivados dos mesmos, 2-metoxiestradiol, ANGIOSTATIN®, ENDOSTATIN®, suramina, esqualamina, inibidor de tecido de metaloproteinase-1, inibidor de tecido de metaloproteinase-2, inibidor do ativador de plasminogênio-1, inibidor do ativador de plasminogênio-2, inibidor derivado de cartilagem, paclitaxel (nab-paclitaxel), fator plaquetário 4, sulfato de protamina (clupeína), derivados de quitina sulfados (preparados a partir da casca do caranguejo rainha), complexo de peptidoglicano polissacarídeo sulfatado (sp-pg), estaurosporina, moduladores do metabolismo de matriz incluindo análogos de prolina ((ácido 1-azetidina-2- carboxílico (LACA)), cis-hidroxiprolina, d,I-3,4-deshidroprolina, tiaprolina, α,α'-dipiridila, fumarato de beta-aminopropionitrila, 4-propil-5-(4-piridinil)- 2(3h)-oxazolona, metotrexato, mitoxantrona, heparina, interferons, 2 macroglobulina-sérica, inibidor galináceo de metaloproteinase-3 (ChIMP-3), quimostatina, tetradecassulfato de beta-ciclodextrina, eponemicina, fumagilina, ouro tiomalato de sódio, d-penicilamina, beta-1-anticolagenase- soro, alfa-2-antiplasmina, bisantreno, lobenzarit dissódico, ácido n-2- carboxifenil-4-cloroantronílico dissódico ou “CCA”, talidomida, esteróide angiostático, carbóxi aminoimidazol e inibidores da metaloproteinase tais como BB-94. Outros agentes antiangiogênese incluem anticorpos, preferivelmente anticorpos monoclonais contra estes fatores de crescimento angiogênico: isoformas beta-FGF, alfa-FGF, FGF-5, VEGF, VEGF-C, HGF/SF e Ang-1/Ang-2.
[00176] Os exemplos de agentes quimioterapêuticos também incluem
66 / 116 agentes antifibróticos incluindo, mas não são limitados aos compostos tais como beta-aminoproprionitrila (BAPN), assim como os compostos descritos na Patente U.S. No.: 4.965.288 (Palfreyman, et al.) referente aos inibidores da lisil oxidase e seu uso no tratamento de doenças e condições associadas com a deposição anormal de colágeno e Patente U.S. No.: 4.997.854 (Kagan et al.) referente aos compostos que inibem LOX para o tratamento de vários estados fibróticos patológicos, que são aqui incorporados por referência. Outros inibidores exemplares são descritos na Patente U.S. No.: 4.943.593 (Palfreyman et al.) referente aos compostos tais como 2-isobutil-3-fluoro-, cloro- ou bromo-alilamina, Patentes U.S. Nos.: 5.021.456 (Palfreyman et al.),
5.059.714 (Palfreyman et al.), 5.120.764 (Mccarthy et al.), 5.182.297 (Palfreyman et al.), 5.252.608 (Palfreyman et al.) referentes à 2-(1- naftiloximemil)-3-fluoroalilamina e Pub. U.S. No.: 2004/0248871 (Farjanel et al.), que são aqui incorporadas por referência.
[00177] Os agentes antifibróticos exemplares também incluem as aminas primárias que reagem com o grupo carbonila do sítio ativo das lisil oxidases e mais particularmente aquelas que produzem, depois da ligação com a carbonila, um produto estabilizado pela ressonância, tais como as seguintes aminas primárias: emilenomamina, hidrazina, fenilhidrazina e seus derivados; semicarbazida e derivados de ureia; aminonitrilas tais como BAPN ou 2-nitroetilamina; haloaminas insaturadas ou saturadas tais como 2-bromo- etilamina, 2-cloroetilamina, 2-trifluoroetilamina, 3-bromopropilamina e p- halobenzilaminas; e seleno-homocisteína lactona.
[00178] Outros agentes antifibróticos são agentes queladores de cobre penetrando ou não penetrando as células. Os compostos exemplares incluem inibidores indiretos que bloqueiam os derivados de aldeído originários da desaminação oxidativa dos resíduos de lisila e hidroxilisila pelas lisil oxidases. Os exemplos incluem as tiolaminas, particularmente D-penicilamina e seus análogos tais como o ácido 2-amino-5-mercapto-5-metil-hexanóico,
67 / 116 ácido D-2-amino-3-metil-3-((2-acetamido-etil)ditio)butanóico, ácido p-2- amino-3-metil-3-((2-aminoetil)ditio)butanóico, sulfurato de sódio-4-((p-1- dimetil-2-amino-2-carboxietil)ditio)butano, sulfanato de 2-acetamidoetil-2- acetamido-etanotiol e sódio-4-mercaptobutanossulfinato tri-hidrato.
[00179] Os exemplos de agentes quimioterapêuticos também incluem agentes imunoterapêuticos incluindo e não são limitados a anticorpos terapêuticos adequados para tratar pacientes. Alguns exemplos de anticorpos terapêuticos incluem simtuzumab, abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, , nimotuzumab, nofetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49 e 3F8. Rituximab pode ser usado para tratar cânceres de célula B indolentes, incluindo linfoma de zona
68 / 116 margina, WM, CLL e linfoma linfocítico pequeno. Uma combinação de Rituximab e agentes de quimioterapia é especialmente eficaz.
[00180] Os anticorpos terapêuticos exemplificados podem ser adicionalmente rotulados ou combinados com uma partícula de radioisótopo tal como índio-111, ítrio-90 ou iodo-131.
[00181] Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um agente alquilante de mostarda nitrogenada. Os exemplos não limitantes de mostarda nitrogenada incluem clorambucila.
[00182] Em uma modalidade, os compostos e composições aqui descritos podem ser usados ou combinados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O um ou mais agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, um inibidor de Abl, CDC cinase ativada (ACK), receptor de adenosina A2B (A2B), cinase reguladora do sinal de apoptose (ASK), Aurora cinase, tirosina cinase de Bruton (BTK), bromodomínio BET (BRD) tal como BRD4, c-Kit, c-Met, cinase ativadora de CDK (CAK), proteína cinase dependente de calmodulina (CaMK), cinase dependente de ciclina (CDK), caseína cinase (CK), receptor do domínio de discoidina (DDR), receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR), cinase de adesão focal (FAK), Flt- 3, FYN, glicogênio sintase cinase (GSK), HCK, histona desacetilase (HDAC), IKK tal como IKKβε, isocitrato des-hidrogenase (IDH) tal como IDH1, Janus cinase (JAK), KDR, proteína tirosina cinase específica de linfócito (LCK), proteína lisila oxidase, proteína semelhante à lisila oxidase (LOXL), LYN, metaloprotease de matriz (MMP), MEK, proteína cinase ativada por mitogênio (MAPK), NEK9, NPM-ALK, p38 cinase, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fosforilase cinase (PK), cinase semelhante a polo (PLK), fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K), proteína cinase (PK) tal como proteína cinase A, B e/ou C, PYK, tirosina cinase do baço (SYK), serina/treonina cinase TPL2, serina/treonina cinase STK, transdução e transcrição de sinal (STAT), SRC, serina/treonina-proteína cinase (TBK) tal
69 / 116 como TBK1, TIE, tirosina cinase (TK), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), YES ou qualquer combinação dos mesmos.
[00183] Os inibidores de ASK incluem inibidores de ASK1. Os exemplos de inibidores de ASK1 incluem, mas não são limitados àqueles descritos na WO 2011/008709 (Gilead Sciences) e WO 2013/112741 (Gilead Sciences).
[00184] Os exemplos de inibidores de BTK incluem, mas não são limitados a ibrutinib, HM71224, ONO-4059 e CC-292.
[00185] Os inibidores de DDR incluem inibidores de DDR1 e/ou DDR2. Os exemplos de inibidores de DDR incluem, mas não são limitados àqueles descritos na WO 2014/047624 (Gilead Sciences), US 2009/0142345 (Takeda Pharmaceutical), US 2011/0287011 (Oncomed Pharmaceuticals), WO 2013/027802 (Chugai Pharmaceutical) e WO 2013/034933 (Imperial Innovations).
[00186] Os exemplos de inibidores de HDAC incluem, mas não são limitados a pracinostat e panobinostat.
[00187] Os inibidores de JAK inibem JAK1, JAK2 e/ou JAK3. Os exemplos de inibidores de JAK incluem, mas não são limitados a filgotinib, ruxolitinib, fedratinib, tofacitinib, baricitinib, lestaurtinib, pacritinib, XL019, AZD1480, INCB039110, LY2784544, BMS911543 e NS018.
[00188] Os inibidores de LOXL incluem inibidores de LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4 e/ou LOXL5. Os exemplos de inibidores de LOXL incluem, mas não são limitados aos anticorpos descritos na WO 2009/017833 (Arresto Biosciences).
[00189] Os exemplos de inibidores de LOXL2 incluem, mas não são limitados aos anticorpos descritos na WO 2009/017833 (Arresto Biosciences), WO 2009/035791 (Arresto Biosciences) e WO 2011/097513 (Gilead Biologics).
[00190] Os inibidores de MMP incluem inibidores de MMP1 a 10. Os
70 / 116 exemplos de inibidores de MMP9 incluem, mas não são limitados a marimastat (BB-2516), cipemastat (Ro 32-3555) e aqueles descritos na WO 2012/027721 (Gilead Biologics).
[00191] Os inibidores de PI3K incluem inibidores de PI3Kγ, PI3Kδ, PI3Kβ, PI3Kα e/ou pan-PI3K. Os exemplos de inibidores de PI3K incluem, mas não são limitados a wortmanina, BKM120, CH5132799, XL756 e GDC-
0980.
[00192] Os exemplos de inibidores de PI3Kγ incluem, mas não são limitados a ZSTK474, AS252424, LY294002 e TG100115.
[00193] Os exemplos de inibidores de PI3Kδ incluem, mas não são limitados a, PI3K II, TGR-1202, AMG-319, GSK2269557, X-339, X-414, RP5090, KAR4141, XL499, OXY111A, IPI-145, IPI-443 e os compostos descritos na WO 2005/113556 (ICOS), WO 2013/052699 (Gilead Calistoga), WO 2013/116562 (Gilead Calistoga), WO 2014/100765 (Gilead Calistoga), WO 2014/100767 (Gilead Calistoga) e WO 2014/201409 (Gilead Sciences).
[00194] Os exemplos de inibidores de PI3Kβ incluem, mas não são limitados a GSK2636771, BAY 10824391 e TGX221.
[00195] Os exemplos de inibidores de PI3Kα incluem, mas não são limitados a buparlisib, BAY 80-6946, BYL719, PX-866, RG7604, MLN1117, WX-037, AEZA-129 e PA799.
[00196] Os exemplos de inibidores de pan-PI3K incluem, mas não são limitados a, LY294002, BEZ235, XL147 (SAR245408) e GDC-0941.
[00197] Os exemplos de inibidores de SYK incluem, mas não são limitados a tamatinib (R406), fostamatinib (R788), PRT062607, BAY-61- 3606, NVP-QAB 205 AA, R112, R343 e aqueles descritos na Patente US No.: 8.450.321 (Gilead Connecticut).
[00198] TKIs podem alvejar receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFRs) e receptores para o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e fator de
71 / 116 crescimento endotelial vascular (VEGF). Os exemplos de TKIs que alvejam EGFR incluem, mas não são limitados a gefitinib e erlotinib. Sunitinib é um exemplo não limitante de um TKI que alveja receptores para FGF, PDGF e VEGF.
[00199] Os anticorpos anti-PD-L1 da presente descrição podem ser usados, em algumas modalidades, junto com um inibidor do ponto de checagem imune. Os pontos de checagem imune são moléculas no sistema imune que aumenta um sinal (moléculas coestimuladoras) ou reduzem um sinal (moléculas coinibidoras). Muitos cânceres protegem a si mesmos do sistema imune pela inibição do sinal de célula T através de agonistas para moléculas coinibidoras ou antagonistas para moléculas coestimuladoras. Um agonista ou antagonista do ponto de checagem imune pode ajudar a parar um tal mecanismo protetivo pelas células. Um agonista ou antagonista de ponto de checagem imune podem alvejar qualquer uma ou mais das seguintes moléculas de ponto de checagem, PD-1, CTLA-4, LAG-3 (também conhecida como CD223), CD28, CD122, 4-1BB (também conhecida como CD137), TIM3, OX-40/OX40L, CD40/CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA (também conhecida como CD272).
[00200] A morte de célula T programada 1 (PD-1) é uma proteína de transmembrana encontrada na superfície das células T, que, quando ligadas ao ligante 1 de morte da célula T programada (PD-L1) nas células de tumor, resulta na supressão da atividade da célula T e redução da citotoxicidade mediada pela célula T. Assim, PD-1 e PD-L1 são infrarreguladores imunes ou ponto de checagem imune “comutadores off “. Os inibidores de PD-1 de exemplo incluem, sem limitação, nivolumab, (Opdivo) (BMS-936558), pembrolizumab (Keytruda), pidilizumab, AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), PDR001, MPDL3280A, MEDI4736, BMS-936559 e MSB0010718C.
[00201] CTLA-4 é um receptor de proteína que infrarregula o sistema
72 / 116 imune. Os exemplos não limitantes de inibidores de CTLA-4 incluem ipilimumab (Yervoy) (também conhecido como BMS-734016, MDX-010, MDX-101) e tremelimumab (antigamente ticilimumab, CP-675.206).
[00202] O gene de ativação de linfócito 3 (LAG-3) é um receptor imune do ponto de checagem que na superfície da célula trabalha para suprimir uma resposta imune pela ação aos Tregs assim como efeitos diretos sobre as células T CD8+. Os inibidores de LAG-3 incluem, sem limitação, LAG525 e BMS-986016.
[00203] CD28 é constitutivamente expresso sobre quase todas as células T CD4+ humanas e em torno da metade de todas as células T CD8 induz a expansão de célula T. Os exemplos não limitantes de inibidores de CD28 incluem TGN1412.
[00204] CD122 aumenta a proliferação de células T CD8+ efetoras. Os exemplos não limitantes incluem NKTR-214.
[00205] 4-1BB (também conhecida como CD137) está envolvida na proliferação de célula T. A sinalização mediada pela CD137 também é conhecida proteger as células T e em particular, as células T CD8+ da morte celular induzida pela ativação. PF-05082566, Urelumab (BMS-663513) e lipocalina são exemplos de inibidores de CD137.
[00206] Para qualquer um dos tratamentos de combinação acima, o anticorpo anti-PD-L1 pode ser administrado concorrentemente ou separadamente dos outros agentes anticâncer. Quando administrado separadamente, o anticorpo anti-PD-L1 pode ser administrado antes ou depois dos outros agentes anticâncer. Tratamento de Infecções
[00207] Como demonstrado nos exemplos experimentais, os anticorpos da presente descrição podem ativar resposta imune que pode depois ser útil para tratar infecções.
[00208] Infecção é a invasão de um dos tecidos corporais do organismo
73 / 116 pelos agentes causadores de doença, a sua multiplicação e a reação dos tecidos hospedeiros a estes organismos e as toxinas que eles produzem. Uma infecção pode ser causada pelos agentes infecciosos tais como vírus, viróides, príons, bactérias, nematóides tais como lombrigas e oxiuros parasíticos, artrópodes tais como carrapatos, ácaros, pulgas e piolhos, fungos tais como tinha e outros macroparasitas tais como tênias e outros helmintos. Em um aspecto, o agente infeccioso é uma bactéria, tal como bactéria Gram negativa. Em um aspecto, o agente infeccioso é vírus, tal como vírus de DNA, vírus de RNA e vírus de transcrição reversa. Os exemplos não limitantes de vírus incluem Adenovírus, Coxsackievírus, vírus Epstein–Barr, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus simples do Herpes, tipo 1, vírus simples do Herpes, tipo 2, Citomegalovírus, vírus do herpes humano, tipo 8, HIV, vírus da influenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus do papiloma humano, vírus da parainfluenza, vírus da poliomielite, vírus da raiva, vírus sincicial respiratório, vírus da rubéola, vírus zoster da varicela.
[00209] Os anticorpos da presente descrição também podem ser usados para tratar uma doença infecciosa causada por um micro-organismo ou matar um micro-organismo, alvejando-se o micro-organismo e uma célula imune para efetuar a eliminação do micro-organismo. Em um aspecto, o micro- organismo é um vírus incluindo vírus de RNA e DNA, uma bactéria Gram positiva, uma bactéria Gram negativa, um protozoário ou um fungo. Os exemplos não limitantes de doenças infecciosas e micro-organismos relacionados são providos na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Doenças infecciosas e fontes de micro-organismo relacionadas. Doença Infecciosa Fonte de Micro-organismo Infecções por Acinetobacter Acinetobacter baumannii Actinomicose Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae e Propionibacterium propionicus Doença do sono africana Trypanosoma brucei (tripanossomíase africana) AIDS (síndrome da imunodeficiência HIV (Vírus da imunodeficiência humana) adquirida) Amebíase Entamoeba histolytica Anaplasmose Gênero Anaplasma Antrax Bacillus anthracis
74 / 116 Infecção hemolítica por arcanobactéria Arcanobacterium haemolyticum Febre hemorrágica argentina Vírus Junin Ascaríase Ascaris lumbricoides Aspergilose Gênero Aspergillus Infecção por Astrovírus Família Astroviridae Babesiose Gênero Babesia Infecção por Bacillus cereus Bacillus cereus Pneumonia bacteriana bactérias múltiplas Vaginose bacteriana (BV) bactérias múltiplas Infecção por Bacteróides Gênero Bacteroides Balantidíase Balantidium coli Infecção por Bailisascaris Gênero Bailisascaris Infecção pelo vírus BK Vírus BK Pedra preta Piedraia hortae Infecção por Blastocystis hominis Blastocystis hominis Blastomicose Blastomyces dermatitidis Febre hemorrágica boliviana Vírus Machupo Infecção por Borrelia Gênero Borrelia Botulismo (e botulismo infantil) Clostridium botulinum Febre hemorrágica brasileira Sabia Brucelose Gênero Brucella Infecção por Burkholderia usualmente Burkholderia cepacia e outras espécies Burkholderia Úlcera de Buruli Mycobacterium ulcerans Infecção por Calicivírus (Norovírus e Família Caliciviridae Sapovírus) Campilobacteriose Gênero Campilobacter Candidíase (Monilíase; Afta) usualmente Candida albicans e outras espécies Candida Doença da arranhadura do gato Bartonella henselae Celulite usualmente Grupo A de Streptococcus e Stafilococcus Doença de Chagas (tripanossomíase Trypanosoma cruzi americana) Cancróide Haemofilus ducreyi Varicela Vírus zoster da Varicela (VZV) Clamídia Chlamydia trachomatis Infecção por Chlamydofila pneumoniae Chlamydofila pneumoniae Cólera Vibrio cholerae Cromoblastomicose usualmente Fonsecaea pedrosoi Clonorquíase Clonorchis sinensis Infecção por Clostridium difficile Clostridium difficile Coccidioidomicose Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii Febre do carrapato do Colorado (CTF) Vírus da febre do carrapato do Colorado (CTFV) Resfriado comum (rinofaringite viral usualmente rinovírus e coronavírus. aguda; coriza aguda) Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) Príon CJD Febre hemorrágica da Crimeia-Congo Vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo (CCHF) Criptococcose Cryptococcus neoformans Criptosporidiose Gênero Cryptosporidium Larva migratória cutânea (CLM) usualmente Ancilostoma braziliense; outros parasitas múltiplos Ciclosporíase Cyclospora cayetanensis Cisticercose Taenia solium Infecção por Citomegalovírus Cytomegalovirus Febre da Dengue Vírus da Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) – Flavivírus Dientamoebíase Dientamoeba fragilis Difteria Corynebacterium difteriae Difilobotríase Difillobothrium
75 / 116 Dracunculíase Dracunculus medinensis Febre hemorrágica do ebola Ebolavírus (EBOV) Equinococcose Gênero Echinococcus Erliquiose Gênero Ehrlichia Enterobíase (infecção por oxiuro) Enterobius vermicularis Infecção por Enterococcus Gênero Enterococcus Infecção por Enterovirus Gênero Enterovirus Tifo epidêmico Rickettsia prowazekii Eritema infeccioso (Quinta doença) Parvovirus B19 Exantema súbito (Sexta doença) Vírus do herpes humano 6 (HHV-6) e Vírus do herpes humano 7 (HHV-7) Fasciolopsíase Fasciolopsis buski Fasciolose Fasciola hepatica e Fasciola gigantica Insônia familiar fatal (FFI) Prion FFI Filaríase Superfamília Filarioidea Envenenamento alimentar por Clostridium perfringens Clostridium perfringens Infecção amébica de vida livre múltipla Infecção por Fusobactéria Gênero Fusobacterium Gangrena gasosa (Clostridial usualmente Clostridium perfringens; outras espécies myonecrosis) Clostridium Geotricose Geotrichum candidum Sídrome de Gerstmann-Sträussler- Prion GSS Scheinker (GSS) Giardíase Giardia intestinalis Mormo Burkholderia mallei Gnatostomíase Gnathostoma spinigerum e Gnathostoma hispidum Gonorreia Neisseria gonorrhoeae Granuloma inguinal Klebsiella granulomatis (Donovanose) Infecção estreptocócica do Grupo A Streptococcus pyogenes Infecção estreptocócica do Grupo B Streptococcus agalactiae Infecção pelo Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae doença da mão-pé-boca (HFMD) Enterovírus, principalmente vírus Coxsackie A e Enterovírus 71 (EV71) Síndrome Pulmonar por Hantavírus Vírus Sem Nome (HPS) Infecção por Helicobacter pilori Helicobacter pilori Síndrome hemolítica-urêmica (HUS) Escherichia coli O157:H7, O111 e O104:H4 Febre hemorrágica com síndrome renal Família Bunyaviridae (HFRS) Hepatite A Vírus da Hepatite A Hepatite B Vírus da Hepatite B Hepatite C Vírus da Hepatite C Hepatite D Vírus da Hepatite D Hepatite E Vírus da Hepatite E Herpes simples Vírus simples do herpes 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) Histoplasmose Histoplasma capsulatum Infecção por Ancilóstomo Ancilostoma duodenale e Necator americanus Infecção por bocavírus humano Bocavírus humano (HBoV) Erliquiose ewingii humana Ehrlichia ewingii Anaplasmose granulocítica humana Anaplasma fagocytofilum (HGA) Infecção por metapneumovírus humano Metapneumovírus humano (hMPV) Erliquiose monocítica humana Ehrlichia chaffeensis Infecção pelo vírus do papiloma humano Papilomavírus humano (HPV) (HPV) Infecção pelo vírus da parainfluenza Vírus da parainfluenza humana (HPIV) humana
76 / 116 Himenolepíase Hymenolepis nana e Hymenolepis diminuta Mononucleose infecciosa pelo vírus de Vírus de Epstein-Barr (EBV) Epstein-Barr (Mono) Influenza (flu) Família Orthomyxoviridae Isosporíase Isospora belli Doença de Kawasaki desconhecida; evidências sustentam que a mesma seja infecciosa Ceratite múltipla Infecção por Kingella kingae Kingella kingae Kuru Prion Kuru Febre de Lassa Vírus de Lassa Legionelose (doença dos legionários) Legionella pneumophila Legionelose (Febre de Pontiac) Legionella pneumophila Leishmaniose Gênero Leishmania Lepra Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepromatosis Leptospirose Gênero Leptospira Listeriose Listeria monocytogenes doença de Lima (borreliose de Lima) usualmente Borrelia burgdorferi e outras espécies Borrelia Filaríase linfática (Elefantíase) Wuchereria bancrofti e Brugia malayi Coriomeningite linfocítica Vírus da Coriomeningite linfocítica (LCMV) Malária Gênero Plasmodium Febre hemorrágica de Marburg (MHF) Vírus Marburg Sarampo Vírus do Sarampo Melioidose (doença de Whitmore) Burkholderia pseudomallei Meningite múltipla Doença meningocócica Neisseria meningitidis Metagonimíase usualmente Metagonimus yokagawai Microsporidiose Microsporidia phylum Molusco contagioso (MC) Vírus Molluscum contagiosum (MCV) Cachumba Vírus da cachumba Tifo de murino (Tifo endêmico) Rickettsia typhi Pneumonia micoplasmática Mycoplasma pneumoniae Micetoma Espécie numerosa de bactérias (Actinomycetoma) e fungos (Eumycetoma) Miíase Larvas de mosca díptera parasítica Conjuntivite neonatal (Oftalmia neonatal) mais habitualmente Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae (Nova) Variante da doença de Prion vCJD Creutzfeldt-Jakob (vCJD, nvCJD) Nocardiose usualmente Nocardia asteroides e outras espécies Nocardia Oncocercíase (Cegueira do rio) Onchocerca volvulus Paracoccidioidomicose (Blastomicose Paracoccidioides brasiliensis sul-americana) Paragonimíase usualmente Paragonimus westermani e outras espécies Paragonimus Pasteurelose Gênero Pasteurella Pediculose do couro cabeludo (Piolhos da Pediculus humanus capitis cabeça) Pediculose corporal (Piolhos corporais) Pediculus humanus corporis Pediculose pubiana (Piolho pubianos, Phthirus pubis Chato) Doença inflamatória pélvica (PID) múltipla Coqueluche (Tosse comprida) Bordetella pertussis Peste Yersinia pestis Infecção pneumocócica Streptococcus pneumoniae Pneumonia pneumocística (PCP) Pneumocystis jirovecii Pneumonia múltipla Poliomielite Vírus da poliomielite Infecção por Prevotella Gênero Prevotella
77 / 116 Meningoencefalite amébica primária usualmente Naegleria fowleri (PAM) Leucoencefalopatia multifocal Vírus JC progressiva Psitacose Chlamydophila psittaci Febre Q Coxiella burnetii Raiva Vírus da raiva Febre da mordida do rato Streptobacillus moniliformis e Spirillum minus Infecção pelo vírus sincicial respiratória Vírus sincicial respiratório (RSV) Rinosporidiose Rhinosporidium seeberi Infecção por rinovírus Rhinovirus Infecção por riquetsiose Gênero Rickettsia Riquetsiose Rickettsia akari Febre de Rift Valley (RVF) Vírus da febre de Rift Valley Febre pintada da montanha rochosa Rickettsia rickettsii (RMSF) Infecção por rotavírus Rotavirus Rubéola Vírus da rubéola Salmonelose Gênero Salmonella SARS (Síndrome Respiratória Aguda Coronavírus SARS Severa) Escabiose Sarcoptes scabiei Esquistosomíase Gênero Schistosoma Septicemia múltipla Shigelose (Disenteria bacilar) Gênero Shigella Cobreiro (Herpes zoster) Vírus Varicella zoster (VZV) Varíola (Varíola) Variola major ou Variola minor Esporotricose Sporothrix schenckii Envenenamento alimentar Estafilocócico Gênero Staphilococcus Infecção estafilocócica Gênero Staphilococcus Estrongiloidíase Strongiloides stercoralis Sífilis Treponema pallidum Teníase Gênero Taenia Tétano (Lockjaw) Clostridium tetani Tinha da barba (coceira do barbeiro) Usualmente Gênero Trichophyton Tinha da cabeça (Micose do Escalpo) usualmente Trichofyton tonsurans Tinha do corpo (Micose do Corpo) Usualmente gênero Trichophyton Tinha crural (coceira de Jock) usualmente Epidermophyton floccosum, Trichofyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes Tinha manuum (Micose da mão) Trichophyton rubrum Tinha negra usualmente Hortaea werneckii Tinha do pé (pé de atleta) Usualmente Gênero Trichophyton Tinha unguinal (Onicomicose) Usualmente gênero Trichophyton Tinha versicolor (Pitiríase versicolor) Gênero Malassezia Toxocaríase (Larva Ocular Migratória Toxocara canis ou Toxocara cati (OLM)) Toxocaríase (Larva Visceral Migratória Toxocara canis ou Toxocara cati (VLM)) Toxoplasmose Toxoplasma gondii Triquinelose Trichinella spiralis Tricomoníase Trichomonas vaginalis Tricuríase (infecção por vermes Trichuris trichiura nemátodos) Tuberculose usualmente Mycobacterium tuberculosis Tularemia Francisella tularensis Infecção por Ureaplasma urealyticum Ureaplasma urealyticum Encefalite equina venezuelana Vírus da encefalite equina venezuelana Febre hemorrágica venezuelana Vírus Guanarito Pneumonia viral Vírus múltiplo
78 / 116 Febre do Nilo Ocidental Vírus do Nilo Ocidental Pedra branca (Tinha branca) Trichosporon beigelii Infecção por Yersinia pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis Yersiniose Yersinia enterocolitica Febre amarela Vírus da febre amarela Zigomicose Mucorales order (Mucormycosis) e Ordem Entomophthorales (Entomophthoramycosis)
[00210] Um regime específico de dosagem e tratamento para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo os anticorpos particulares, variantes ou derivados dos mesmos usados, a idade do paciente, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta e o tempo de administração, taxa de excreção, combinação medicamentosa e a severidade da doença particular sendo tratada. O julgamento de tais fatores pelos cuidadores médicos está dentro da habilidade comum na técnica. A quantidade também dependerá do paciente individual a ser tratado, da via de administração, do tipo de formulação, das características do composto usado, da severidade da doença e dos efeitos desejados. A quantidade usada pode ser determinada pelos princípios farmacológicos e princípios farmacocinéticos bem conhecidos na técnica.
[00211] Os métodos de administração dos anticorpos ou variantes incluem, mas não são limitados às vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. Os polipeptídeos de ligação de antígeno ou as composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo pela infusão ou injeção de bolo, pela absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntos com outros agentes biologicamente ativos. Assim, as composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos de ligação de antígeno da divulgação podem ser administradas oralmente, retalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, topicamente (como pelos pós, unguentos, gotas ou emplastros transdérmicos), bucalmente ou como uma pulverização oral ou nasal.
[00212] O termo “parenteral” como aqui usado se refere aos modos de
79 / 116 administração que incluem injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutâneo e intra-articular e infusão.
[00213] A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os anticorpos da divulgação dentro do sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, fixado a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizante.
[00214] Pode ser desejável administrar os polipeptídeos de anticorpo ou composições da divulgação localmente à área em necessidade de tratamento; isto pode ser obtido, por exemplo e não por via de limitação, pela infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunção, com um curativo de ferimento depois da cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas ou fibras. Preferivelmente, quando da administração de uma proteína, incluindo um anticorpo, da divulgação, cuidado deve ser tomado para usar materiais que não absorvam a proteína.
[00215] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou composição podem ser liberados em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; der no geral ibid.)
[00216] Já em uma outra modalidade, o polipeptídeo ou composição de ligação de antígeno pode ser liberado em um sistema de liberação controlada.
80 / 116 Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Já em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, o cérebro, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada são debatidos na revisão por Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
[00217] Em uma modalidade específica onde a composição da divulgação compreende um ácido nucleico ou polinucleotídeo codificando uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão da sua proteína codificada, construindo-a como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e administrando-a de modo que a mesma se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (ver a Pat. U.S. No. 4.980.286) ou pela injeção direta ou pelo uso de bombardeamento de micropartícula (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont) ou revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção ou administrando-a na ligação a um peptídeo semelhante a homeobox que é conhecido entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para expressão, pela
81 / 116 recombinação homóloga.
[00218] A quantidade dos anticorpos da divulgação que serão eficazes no tratamento, inibição e prevenção de uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, imune ou maligna pode ser determinada pelas técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente utilizados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser utilizada na formulação também dependerá da via de administração e a seriedade da doença, distúrbio ou condição e deve ser decidido de acordo com o julgamento do médico e cada circunstância do paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de dose-resposta derivada de sistemas de teste in vitro ou modelo animal.
[00219] Como uma proposição geral, a dosagem administrada a um paciente dos polipeptídeos de ligação de antígeno da presente descrição é tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente, entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente ou 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma meia- vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune para os polipeptídeos estranhos. Assim, as dosagens mais baixas de anticorpos humanos e a administração menos frequente é frequentemente possível. Além disso, a dosagem e frequência de administração de anticorpos da divulgação podem ser reduzidas realçando-se a absorção e penetração tecidual (por exemplo, dentro do cérebro) dos anticorpos pelas modificações tais como, por exemplo, lipidação.
[00220] Os métodos para tratar uma doença, condição ou distúrbio infeccioso ou maligno compreendem a administração de um anticorpo, variante ou derivado do mesmo da divulgação são tipicamente testados in vitro e depois in vivo em um modelo de animal aceitável, para a atividade terapêutica ou profilática desejada, antes do uso em seres humanos. Os modelos animais adequados, incluindo animais transgênicos, são bem
82 / 116 conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Por exemplo, os ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica de polipeptídeo de ligação de antígeno aqui descritos incluem o efeito de um polipeptídeo de ligação de antígeno em uma linhagem de célula ou uma amostra de tecido do paciente. O efeito do polipeptídeo de ligação a antígeno na linhagem de célula e/ou amostra de tecido pode ser determinado utilizando as técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como os ensaios aqui descritos em outro lugar. De acordo com a divulgação, os ensaios in vitro que podem ser usados para determinar se a administração de um polipeptídeo de ligação de antígeno específico é indicada, incluem ensaios de cultura de célula in vitro em que uma amostra de tecido do paciente é cultivada em cultura e exposta ou de outro modo administrada com um composto e o efeito de tal composto na amostra de tecido é observado.
[00221] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar um anticorpo da divulgação ou um polinucleotídeo codificando um anticorpo da divulgação, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), construção de um ácido nucleico como parte de um retroviral ou outro vetor, etc. Métodos de Diagnóstico
[00222] A superexpressão de PD-L1 é observada em certas amostras de tumor e pacientes tendo células superexpressando PD-L1 são provavelmente responsivas para tratamentos com os anticorpos anti-PD-L1 da presente descrição. Consequentemente, os anticorpos da presente descrição também podem ser usados para propósitos de diagnóstico e prognóstico.
[00223] Uma amostra que preferivelmente inclui uma célula pode ser obtida de um paciente, que pode ser um paciente com câncer ou um paciente desejando diagnóstico. A célula pode ser uma célula de um tecido de tumor
83 / 116 ou um bloco de tumor, uma amostra de sangue, uma amostra de urina ou qualquer amostra do paciente. No pré-tratamento opcional da amostra, a amostra pode ser incubada com um anticorpo da presente descrição sob condições permitindo que o anticorpo interagisse com uma proteína de PD-L1 potencialmente presente na amostra. Os métodos tais como ELISA podem ser usados, tirando-se vantagens do anticorpo anti-PD-L1, para detectar a presença da proteína de PD-L1 na amostra.
[00224] A presença da proteína de PD-L1 na amostra (opcionalmente com a quantidade ou concentração) pode ser usada para diagnóstico de câncer, como uma indicação que o paciente é adequado para um tratamento com o anticorpo ou como uma indicação que o paciente respondeu (ou não) a um tratamento de câncer. Para um método de prognóstico, a detecção pode ser feita de uma vez, duas vezes ou mais, em certos estágios, no início de um tratamento de câncer para indicar o progresso do tratamento. Composições
[00225] A presente descrição também provê composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo e um carreador aceitáveis. Em algumas modalidades, a composição inclui adicionalmente um segundo agente anticâncer (por exemplo, um inibidor do ponto de checagem imune).
[00226] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e mais particularmente em seres humanos. Além disso, um “carreador farmaceuticamente aceitável” geralmente será um enchedor sólido, semissólido ou líquido não tóxico, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.
[00227] O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com que o produto terapêutico é administrado. Tais
84 / 116 carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e os semelhantes.
Água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é intravenosamente administrada.
As soluções salinas e de dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser utilizadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis.
Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e os semelhantes.
A composição, se desejado, pode também conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes de tamponação de pH tais como acetatos, citratos ou fosfatos.
Os agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes de quelação tais como ácido etilenodiaminotetraacético; e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose também são concebidos.
Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e os semelhantes.
A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e carreadores tradicionais tais como triglicerídeos.
A formulação oral pode incluir carreadores padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.
Os exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.
W.
Martin, aqui incorporados por referência.
Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de ligação de antígeno, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade adequado de carreador de modo a prover a forma para administração apropriada ao
85 / 116 paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração. A preparação precursora pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla fabricados de vidro ou plástico.
[00228] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, as composições para a administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônica estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente de solubilização e um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são supridos separadamente ou misturados juntos na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição deva ser administrada pela infusão, a mesma pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água grau farmacêutico estéril ou solução salina. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina podem ser providas de modo que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.
[00229] Os compostos da divulgação podem ser formulados como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitável incluem aqueles formados com ânions tais como aqueles derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartáricos, etc. e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxido férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais humanos contra PD-L1 humano
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[00230] Anticorpos monoclonais de camundongo anti-PD-L1 humano foram gerados usando a tecnologia de hibridoma.
[00231] Antígeno: Proteína de PDL1-Fc humana e PD-L1 humano altamente expressaram a linhagem de célula CHOK1 (PDL1-linhagem de célula CHOK1).
[00232] Imunização: Para gerar anticorpos monoclonais de camundongo para PD-L1 humano, camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram primeiramente imunizados com 1,5 × 107 células PDL1-CHOK1. Dia 14 e 33 após a primeira imunização, os camundongos imunizados foram reimunizados com 1,5 × 107 células PDL1-CHOK1 respectivamente. Para selecionar camundongos produzindo anticorpos que ligassem a proteína de PD-L1, os soros dos camundongos imunizados foram testados pelo ELISA. Em resumo, placas microtituladoras foram revestidas com a proteína de PD-L1 humano a 1 μg/ml em PBS, 100 μl/poço na temperatura ambiente (RT) durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. As diluições de plasma de camundongos imunizados foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1 a 2 horas na RT. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG anticamundongo conjugado com Peroxidase de Rábano (HRP) durante 1 hora na RT. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 405nm. Camundongos com títulos suficientes de IgG anti-PDL1 foram reforçados com 50 µg de proteína de PD-L1 humano-Fc no Dia 54 após a imunização. Os camundongos resultantes foram usados para fusões. Os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto a IgGs anti-PD-L1 pelo ELISA.
[00233] Os clones de hibridoma HL1210-3, HL1207-3, HL1207-9 e HL1120-3 foram selecionados para análise adicional. As sequências de aminoácido e polinucleotídeo das regiões variáveis de HL1210-3 são providas na Tabela 5 abaixo.
87 / 116 Tabela 5. Sequências variáveis de HL1210-3 Nome Sequência SEQ ID NO: HL1210-3 VH GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAA 112
GC CTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT T CACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGAC T CCGGAGAAGAGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGA TG GTGGTGGTTACATCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGG CG ATTTACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGT AC CTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTT GT ATATTTGTGCAAGAGAATTTGGTAAGCGCTATGCTTTGG A
CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA HL1210-3 VH EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQ 113
T PEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLY
LQMSSLRSEDTALYICAREFGKRYALDYWGQGTSVT HL1210-3 VL GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACA 114
T CGGTAGGAGACAGGGTCAGCATCTCCTGCAAGGCCAGT CA GGATGTGACTCCTGCTGTCGCCTGGTATCAACAGAAGC CA GGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCCACATCCTCC C GGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGAT C TGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGC T GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATACT A CTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG AA
A HL1210-3 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAWYQQK 115
P GQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQA
EDLAVYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELK Exemplo 2: Atividade de ligação do anticorpo monoclonal de camundongo HL1210-3 para PD-L1 humano
[00234] Para avaliar a atividade de ligação do clone de hibridoma HL1210-3, o mAb purificado deste clone foram submetidos ao teste de ELISA. Em resumo, as placas microtituladoras foram revestidas com proteína de PD-L1 humano-Fc a 0,1 μg/ml em PBS, 100 μl/poço a 4°C durante a noite,
88 / 116 depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. Diluições de três vezes dos anticorpos HL1210-3 partindo de 0,2 μg/ml foram adicionados a cada poço e incubadas durante 1 a 2 horas na RT. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG de cabra anticamundongo conjugado com Peroxidase de Rábano (HRP) durante 1 hora na RT. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 1, HL1210-3 pode se ligar ao PD-L1 humano com alta atividade (EC50 = 5,539 ng/ml). Exemplo 3: O mAb de camundongo HL1210-3 bloqueou a ligação de PD-L1 humano ao seu receptor PD-1 Ensaio de bloqueio de receptor usando-se PD-L1 humano recombinante
[00235] Para avaliar o efeito de bloqueio de mAb HL1210-3 de camundongo no PD-L1 humano recombinante para se ligar ao seu receptor PD-1, o ensaio de bloqueio do receptor com base no ELISA foi utilizado. Em resumo, as placas microtituladoras foram revestidas com proteína de PD-L1 humano-Fc a 1 μg/ml in PBS, 100 μl/poço a 4°C durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. 50 μl de proteína de PD-1 humano-Fc rotulada com biotina e diluições 3 vezes de anticorpos HL1210-3 partindo de 2 μg/ml a 50 μl foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com Estreptavidina-HRP durante 1 hora a 37°C. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 2, HL1210-3 pode eficientemente inibir a ligação de PD-L1 humano ao PD1 humano na IC50 = 0,7835 nM. Ensaio de bloqueio de receptor usando-se PD-L1 humano expresso em célula de mamífero
[00236] Para avaliar o efeito de bloqueio de mAb de camundongo
89 / 116 HL1210-3 no PD-L1 humano expresso nas células de mamífero para se ligar ao seu receptor PD-1, o ensaio de bloqueio de receptor com base em FACS foi usado. Em resumo, as células PDL1-CHOK1 foram primeiramente incubadas com mAb de camundongo HL1210-3 diluído em série de 3 vezes partindo a 20 μg/ml na RT durante 1 hora. Depois da lavagem pelo tampão FACS (PBS com 2% de FBS), o huPD-1 rotulado com biotina foi adicionado a cada poço e incubados na RT durante 1 hora. Depois, a Estreptavidina-PE foi adicionada a cada poço durante 0,5 hora depois de lavar duas vezes com tampão FACS. A intensidade de fluorescência média (MFI) de PE foram avaliadas por FACSAriaIII. Como mostrado na FIG. 3, o anticorpo HL1210-3 pode inibir de modo altamente eficiente a ligação de PD-1 no PD-L1 expresso nas células de mamífero na IC50 de 2,56 nM com 92,6% de taxa de inibição de topo.
% de inibição Exemplo 4: mAb de camundongo HL1210-3 promoveu resposta imune de célula T humana
[00237] Para avaliar o efeito do mAb de camundongo HL1210-3, a resposta de células T humana avaliada em um cenário de reação de linfócito misturado. DCs humanas foram diferenciadas a partir de monócitos CD14+ na presença de GM-CSF e IL-4 durante 7 dias. As células T CD4+ isoladas de um outro doador foram depois cocultivadas com as DCs e diluições em série de anticorpo bloqueador anti-PD-L1. No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante de cultura foi avaliado quanto a produção de IFNα. Os resultados indicaram que os anticorpos HL1210-3 podem promover dependentemente da dose a produção de IFNα, sugerindo que o anticorpo anti-PD-L1 pode promover resposta de célula T humana (FIG. 4). Exemplo 5: A afinidade de ligação de mAb de camundongo HL1210-3
[00238] A ligação dos anticorpos HL1210-3 à proteína de PD-L1 recombinante (PD-L1 humano-his taq) foi testada com BIACORE™ usando
90 / 116 um método de captura. O mAb de camundongo HL1210-3 foi capturado usando anticorpo Fc anticamundongo revestido sobre um chip CM5. Uma diluição em série de proteína de PD-L1 humano-his taq foi injetada em anticorpo capturado durante 3 mins em uma taxa de fluxo de 25 μg/ml. O antígeno foi deixado dissociar durante 900s. Todos os experimentos foram realizados sobre um Biacore T200. A análise de dados foi realizada usando o software de avaliação Biacore T200. Os resultados são mostrados na FIG. 5 e Tabela 6 abaixo. Tabela 6. Cinéticas de Ligação de HL1210-3 ao PD-L1 humano recombinante Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) HL1210-3 1,61E+05 4,69E-05 2,93E-10 Exemplo 6: Humanização do mAb de camundongo HL1210-3
[00239] Os genes da região variável de mAb HL1210-3 foram utilizados para criar um MAb humanizado. Na primeira etapa deste processo, as sequências de aminoácido da VH e VK do mAb HL1210-3 foram comparadas contra a base de dados disponível de sequências de gene de Ig humano para achar as sequências de gene de Ig da linha germinativa humana que melhor se igualassem de ponta a ponta. Para a cadeia leve, o emparelhamento humano mais próximo foi o gene O18/Jk2 e KV1- 39*01/KJ2*04 e opara a cadeia pesada o emparelhamento humano mais próximo foi o gene VH3-21. Os genes VH3-11, VH3-23, VH3-7*01 e VH3- 48 também foram selecionados devido aos seus emparelhamentos próximos.
[00240] As sequencias de domínio variável humanizadas foram depois planejadas onde a CDR1 (SEQ ID NO: 4), 2 (SEQ ID NO: 5) e 3 (SEQ ID NO: 6) da cadeia leve de HL1210-3 foram enxertadas nas sequências de armação do gene O18/Jk2 e KV1-39*01/KJ2*04 e as sequências da CDR1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2) e 3 (SEQ ID NO: 3) da VH de HL1210-3 foram enxertadas nas sequências da armação dos genes VH3-21, VH3-11, VH3-23, VH3-48 ou VH3-7*01. Um modelo 3D foi depois gerado para
91 / 116 determinar se houve alguma das posições da armação onde a substituição do aminoácido de camundongo para o aminoácido humano afetaria a ligação e/ou conformação de CDR. No caso da cadeia leve, 22S, 43S, 60D, 63T e 42Q (numeração de Kabat, ver a Tabela 7) na armação foram identificadas. No caso da cadeia pesada, 1E, 37V, 40T, 44S, 49A, 77N, 91I, 94R e 108T na armação foi envolvida em retromutações. Tabela 7. Planejamento de Humanização VH Projeto I: VH3-21/JH6 Construção Mutação Hu1210 VH Quimera Hu1210 VH.1 Enxertado na CDR Hu1210 VH.1a S49A Hu1210 VH.1b S49A, G44S, Y91I VH Projeto II: VH3-11/JH6 Hu1210 VH.2 Enxertado na CDR, Q1E Hu1210 VH.2a Q1E, S49A Hu1210 VH.2b Q1E, I37V, S49A, G44S, Y91I VH Projeto III: VH3-23/JH6 Hu1210 VH.3 Enxertado na CDR, K94R Hu1210 VH.3a G44S, S49A, Y91I, K94R VH Projeto IV: VH3-48/JH6 Hu1210 VH.4 Enxertado na CDR Hu1210 VH.4a S49A Hu1210 VH.4b S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4c D52E, S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4d G53A, S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4e G53V, S49A, G44S, Y91I ： VH Projeto V VH3-7*01/ HJ1*01 Hu1210 VH.5 Enxertado na CDR Hu1210 VH.5a H91I Hu1210 VH.5b H91I, H108T Hu1210 VH.5c H91I, H77N Hu1210 VH.5d H91I, H77N, H40T VK Projeto I: 018/Jk2 Construção Mutação Hu1210 Vk Quimera Hu1210 Vk.1 Enxertado na CDR Hu1210 Vk.1a A43S VK Projeto II: KV1-39*01/KJ2*04 Hu1210 Vk.2 Enxertado na CDR Hu1210 Vk.2a L60D, L63T Hu1210 Vk.2b L60D, L63T, L42Q, L43S Hu1210 Vk.2c L60D, L63T, L42Q, L43S, T22S
[00241] As sequências de aminoácido e nucleotídeo de alguns dos anticorpos humanizados estão listadas na Tabela 8 abaixo. Tabela 8. Sequências de anticorpo humanizado (negrito indica CDR) Nome Sequência SEQ ID NO:
92 / 116 HL1210-VH EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKS 7
LEWVAT ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYI CAREF
GKRYALDYWGQGTSVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 8 VH.1 GLEWVST
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 9 VH.1a GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 10 VH.1b SLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWIRQAPGKG 11 VH.2 LEWVST
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWIRQAPGKG 12 VH.2a LEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 13 VH.2b SLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 14 VH.3 GLEWVST
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKS 15 VH.3a LEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 16 VH.4 GLEWVST
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 17 VH.4a GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 18 VH.4b SLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI CAREF GKRYALDYWGQGTTVTVSS
93 / 116 Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 19 VH.4c SLEWVAT
ISEGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 20 VH.4d SLEWVAT
ISDAGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 21 VH.4e SLEWVAT
ISDVGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 22 VH.5 GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAREF
GKRYALDYWGQGTLVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 23 VH.5a GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTLVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 24 VH.5b GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYI CAREF
GKRYALDYWGQGTTVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGK 25 VH.5C GLEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVY ICAREF
GKRYALDYWGQGTLVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKS 26 VH.5d LEWVAT
ISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMNSLRAEDTAVY ICAREF
GKRYALDYWGQGTLVTVSS HL1210-VK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAWYQQKPGQS 27
PKLLIYS TSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYTTP LTFGA
GTKLELK Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKAP 28 VK.1 KLLIYS
TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPL TFGQ
GTKLEIK Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKSP 29 VK.1a KLLIYS
TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPL TFGQ
GTKLEIK Hu1210 Vk.2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKAP 30
KLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPL TFGQ GTKLEIKR
94 / 116 Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKAP 31 Vk.2a KLLIYS
TSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP LTFGQ
GTKLEIKR Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGQSP 32 Vk.2b KLLIYS
TSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP LTFGQ
GTKLEIKR Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCKASQDVTPAVAWYQQKPGQSP 33 Vk.2c KLLIYS
TSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTP LTFGQ
GTKLEIKR HL1210 VH GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGATCTGGTGAAGCC 34
TGGCGGCAGCCTGAAGCTG AGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGGCAGACC CCCGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGATGGC GGCGGCTACATCTACTAC AGCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAA CGCCAAGAACAACCTGTAC CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAGAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGACAGGGCACCAG
CGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 35 VH.1 CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 36 VH.1a CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC GTGACCGTGAGCAGC
95 / 116 Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 37 VH.1b CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 38 VH.2 CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGATCAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 39 VH.2a CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGATCAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGAAGCC 40 VH.2b CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 41 VH.3 CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC GTGACCGTGAGCAGC
96 / 116 Hu1210 GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 42 VH.3a CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 43 VH.4 CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 44 VH.4a CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC TACTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 45 VH.4b CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 46 VH.4c CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGAAGGC GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC GTGACCGTGAGCAGC
97 / 116 Hu1210_VH. GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 47 4d CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGCG GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210_VH. GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAACC 48 4e CGGAGGCAGCCTGAGACTG
AGCTGCGCTGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATG AGCTGGGTGAGACAGGCC CCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGATGTT GGCGGCTACATCTATTAC TCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTAC ATCTGCGCCAGGGAGTTC GGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAACCT 49 VH.5 GGAGGCTCCCTGAGGCTG
TCCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGA GCTGGGTGAGGCAGGCT CCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGGA GGCGGCTACATCTACTAC TCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACTCCCTGTAC CTGCAGATGAACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTAT TACTGCGCCAGGGAGTTT GGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTG
GTGACAGTGAGCTCC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAACCT 50 VH.5a GGAGGCTCCCTGAGGCTG
TCCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGA GCTGGGTGAGGCAGGCT CCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGGA GGCGGCTACATCTACTAC TCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACTCCCTGTAC CTGCAGATGAACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTAT ATCTGCGCCAGGGAGTTT GGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTG
GTGACAGTGAGCTCC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAACCT 51 VH.5b GGAGGCTCCCTGAGGCTG
TCCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGA GCTGGGTGAGGCAGGCT CCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGGA GGCGGCTACATCTACTAC TCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACAACCTGTAC CTGCAGATGAACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTAT ATCTGCGCCAGGGAGTTT GGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTG GTGACAGTGAGCTCC
98 / 116 Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAACCT 52 VH.5c GGAGGCTCCCTGAGGCTG
TCCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGA GCTGGGTGAGGCAGACC CCTGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGGA GGCGGCTACATCTACTAC TCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACAACCTGTAC CTGCAGATGAACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTAT ATCTGCGCCAGGGAGTTT GGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACACTG
GTGACAGTGAGCTCC Hu1210_VH. GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGCAACCT 53 5d GGAGGCTCCCTGAGGCTG
TCCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGA GCTGGGTGAGGCAGGCT CCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGGA GGCGGCTACATCTACTAC TCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACTCCCTGTAC CTGCAGATGAACTCTCTCAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTAT ATCTGCGCCAGGGAGTTT GGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACAACC
GTGACAGTGAGCTCC HL1210 VK GACATCGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCACCAGC 54
GTGGGCGATAGGGTGAGC ATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCC TGGTACCAGCAGAAGCCC GGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAGCAGG TACACCGGCGTGCCCGAC AGGTTCACAGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCGTGCAGGCC GAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCGCC
GGCACCAAGCTGGAGCTGAAG Hu1210 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGC 55 VK.1 GTGGGCGACAGGGTGACC
ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCC TGGTACCAGCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAGCAGG TACACCGGCGTGCCCAGC AGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCCTGCAGCCC GAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGCTGGAGATCAAG Hu1210 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGC 56 VK.1a GTGGGCGACAGGGTGACC
ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCC TGGTACCAGCAGAAGCCC GGCAAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCACCAGCAGCAGG TACACCGGCGTGCCCAGC AGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCCTGCAGCCC GAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCCAG GGCACCAAGCTGGAGATCAAG
99 / 116 Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCGCTTCCG 57 VK.2 TGGGCGACAGGGTGACC
ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCC TGGTATCAACAGAAGCCT GGCAAGGCTCCTAAGCTCCTGATCTACAGCACATCCTCCCGGT ACACCGGAGTGCCCTCC AGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACA CCCCTGACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCGCTTCCG 58 VK.2a TGGGCGACAGGGTGACC
ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCC TGGTATCAACAGAAGCCT GGCAAGGCTCCTAAGCTCCTGATCTACAGCACATCCTCCCGGT ACACCGGAGTGCCCGAC AGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACA CCCCTGACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCGCTTCCG 59 VK.2b TGGGCGACAGGGTGACC
ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCC TGGTATCAACAGAAGCCT GGCCAGAGCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCACATCCTCCCGG TACACCGGAGTGCCCGAC AGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACA CCCCTGACCTTCGGCCAG
GGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCGCTTCCG 60 VK.2c TGGGCGACAGGGTGACC
ATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCC TGGTATCAACAGAAGCCT GGCCAGAGCCCTAAGCTCCTGATCTACAGCACATCCTCCCGG TACACCGGAGTGCCCGAC AGGTTTACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACA CCCCTGACCTTCGGCCAG GGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG
[00242] Os genes VH e VK humanizados foram produzidos sinteticamente e depois respectivamente clonados em vetores contendo os domínios constantes gama 1 humano e capa humano. O par do VH humano e do VK humano criou os 40 anticorpos humanizados (ver a Tabela 9). Tabela 9. Anticorpos humanizados com as suas regiões VH e VL VH Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Vk VH.1 VH.1a VH.1b VH.2 VH.2a VH 2.b VH Hu1210 Vk.1 Hu1210-1 Hu1210-2 Hu1210-3 Hu1210-4 Hu1210-5 Hu1210 Vk.1a Hu1210-7 Hu1210-8 Hu1210-9 Hu1210-10 Hu1210-11 Hu1210 Vk H1210 quimera
100 / 116 VH Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Vk VH.3 VH.3a VH.4 VH.4a VH.4b Hu1210 Vk.1 Hu1210-13 Hu1210-14 Hu1210-15 Hu1210-16 Hu1210-17 Hu1210 Vk.1a Hu1210-18 Hu1210-19 Hu1210-20 Hu1210-21 Hu1210-22 VH Hu1210 HU1210 HU1210 HU1210 HU1210 VK VH.5 VH.5a VH.5b VH.5c VH.5d Hu1210 Vk.2 Hu1210-23 Hu1210-27 Hu1210-31 Hu1210-32 Hu1210-36 Hu1210 Vk.2a Hu1210-24 Hu1210-28 Hu1210-33 Hu1210-37 Hu1210 Vk.2b Hu1210-25 Hu1210-29 Hu1210-34 Hu1210-38 Hu1210 Vk.2c Hu1210-26 Hu1210-30 Hu1210-35 Hu1210-39 VH Hu1210 Hu1210 Hu1210 Vk VH.4c VH.4d VH.4e Hu1210 Vk.1 Hu1210-40 Hu1210-41 Hu1210-42 Exemplo 7: As propriedades de ligação de antígeno de anticorpos PD-L1 humanizados Propriedade de ligação ao PD-L1 humano recombinante
[00243] Para avaliar a atividade de ligação de antígeno, os anticorpos humanizados foram submetidos ao teste de ELISA. Em resumo, as placas microtituladoras foram revestidas com proteína de PD-L1 humano-Fc a 0,1 μg/ml em PBS, 100 μl/poço a 4°C durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. Diluições de cinco vezes de anticorpos humanizados partindo de 10 μg/ml foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 a 2 horas na RT. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG de cabra anticamundongo conjugado com Peroxidase de Rábano (HRP) durante 1 hora na RT. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 6, todos os anticorpos humanizados mostram eficácia de ligação comparável ao PD-L1 humano em contato com anticorpo quimérico. Propriedade de ligação para PD-L1 humano expressado em mamífero
[00244] Para avaliar a propriedade de ligação de antígeno, os anticorpos humanizados foram analisados quanto à sua ligação ao PD-L1 de mamífero expressada pelo FACS. Em resumo, as células PDL1-CHOK1 foram primeiramente incubados com 5 vezes anticorpos humanizados diluídos em série partindo a 2 μg/ml na RT durante 1 hora. Depois de lavar em tampão
101 / 116 FACS (PBS com 2% de FBS), o anticorpo IgG alexa 488-anti-humano foi adicionado a cada poço e incubados na RT durante 1 hora. O MFI de Alexa 488 foi avaliado por FACSAriaIII. Como mostrado na FIG. 7, todos os anticorpos humanizados podem de modo altamente eficiente se ligar ao PD- L1 expresso nas células de mamífero, que foi comparável com anticorpo quimérico.
[00245] Para explorar as cinéticas de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou a classificação de afinidade usando Octet Red 96. Como mostrado na Tabela 10, hu1210-3, hu1210-8, hu1210-9, hu1210-14, hu1210-17, hu1210-1 e Hu1210-22 mostraram melhor afinidade, que é comparável com anticorpo quimérico. Tabela 10. Classificação de afinidade de anticorpos humanizados Anticorpo KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Anticorpo KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Hu1210 7,16E-09 3,94E+05 2,83E-03 Hu1210-11 4,18E-09 7,54E+04 3,15E-04 (mIgG) H1210 1,07E-09 1,62E+05 1,73E-04 Hu1210-13 4,36E-09 8,38E+04 3,66E-04 quimera Hu1210-1 4,25E-09 7,10E+04 3,02E-04 Hu1210-14 2,34E-09 8,41E+04 1,97E-04 Hu1210-2 3,23E-09 7,78E+04 2,51E-04 Hu1210-15 4,45E-09 7,87E+04 3,50E-04 Hu1210-3 2,64E-09 8,62E+04 2,28E-04 Hu1210-16 3,14E-09 8,41E+04 2,64E-04 Hu1210-4 7,68E-09 7,12E+04 5,46E-04 Hu1210-17 2,20E-09 8,17E+04 1,80E-04 Hu1210-5 4,83E-09 7,93E+04 3,83E-04 Hu1210-18 4,50E-09 7,92E+04 3,57E-04 Hu1210-7 4,78E-09 8,45E+04 4,04E-04 Hu1210-19 2,50E-09 9,03E+04 2,25E-04 Hu1210-8 1,64E-09 7,72E+04 1,27E-04 Hu1210-20 4,51E-09 8,87E+04 4,00E-04 Hu1210-9 2,33E-09 8,37E+04 1,95E-04 Hu1210-21 3,12E-09 9,39E+04 2,93E-04 Hu1210-10 7,03E-09 8,59E+04 6,04E-04 Hu1210-22 2,56E-09 9,00E+04 2,30E-04 Afinidade cinética completa de anticorpos humanizados pela Biacore®
[00246] A ligação dos anticorpos humanizados para a proteína de PD- L1 recombinante (PD-L1 humano-his taq) foi testado pelo BIACORE™ usando um método de capture. O mAb de camundongo HL1210-3 foi capturado usando anticorpo anticamundongo Fc revestido em um chip CM5. Uma diluição em série de proteína de PD-L1 humano-his taq foi injetada no anticorpo capturado durante 3 mins em uma taxa de fluxo de 25 μg/ml. O antígeno foi deixado dissociar durante 900 s. Todos os experimentos foram realizados em um Biacore T200. A análise de dados foi realizada usando o software de avaliação Biacore T200 e é mostrado na Tabela 11 abaixo.
102 / 116 Tabela 11. Afinidade por Biacore Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Hu1210-8 9,346E+4 7,169E-5 7,671E-10 Hu1210-9 9,856E+4 4,528E-5 4,594E-10 Hu1210-14 1,216E+5 5,293E-5 4,352E-10 Hu1210-16 9,978E+4 6,704E-5 6,720E-10 Hu1210-17 1,101E+5 2,128E-5 1,933E-10 Hu1210-28 1,289E+5 1,080E-4 8,378E-10 Hu1210-31 1,486E+5 1,168E-4 7,862E-10 Hu1210-36 1,461E+5 7,852E-5 5,376E-10 Hu1210-40 8,77E+04 1,31E-04 1,49E-09 Hu1210-41 9,17E+04 3,46E-05 3,78E-10 Hu1210-42 8,68E+04 7,53E-05 8,67E-10 1210 Quimera 1,236E+5 3,265E-5 2,642E-10 Atividade de espécies cruzadas
[00247] Para avaliar a ligação de anticorpos humanizados ao huPD-L1, PD-L1 de Camundongo, PD-L1 de Rato, PD-L1 de Rhesus, os anticorpos foram realizados para o teste de ELISA. Em resumo, as placas microtituladoras foram revestidas com a proteína de PD-L1-Fc de ser humano, camundongo, rato e rhesus a 1 μg/ml em PBS, 100 μl/poço a 4°C durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. Diluições de três vezes de anticorpos humanizados partindo de 1 μg/ml foram adicionadas a cada poço e incubados durante 1 a 2 horas na RT. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG de cabra anticamundongo conjugado com Peroxidase de Rábano (HRP) durante 1 hora na RT. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450 a 630 nm. O anticorpo Hu1210-41 pode se ligar ao PD-L1 de rhesus com afinidade mais baixa e não pode ser ligar ao PD-L1 de rato e camundongo (FIG. 8). Humano Rhesus Rato Camundongo EC50 0,215 nM 0,628 nM Nenhuma ligação Nenhuma ligação Especificidade de membro da família
[00248] Para avaliar a ligação de anticorpo anti-PD-L1 humanizado à família B7 humana e outros ponto de checagem imune, o anticorpo foi avaliado quanto à sua ligação ao B7-H1 (PD-L1), B7-DC, B7-1, B7-2, B7- H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS e BTLA pelo ELISA. Como mostrado na
103 / 116 FIG. 9, o anticorpo Hu1210-41 pode apenas especificamente se ligar ao B7- H1 (PD-L1). Exemplo 8: Os anticorpos humanizados bloquearam a atividade de PD-L1 humano ao PD-1 Ensaio de bloqueio de receptor com base em célula
[00249] Para avaliar o efeito de bloqueio de anticorpos humanizados sobre PD-L1 humano expresso nas células de mamífero para se ligar ao seu receptor PD-1, o ensaio de bloqueio de receptor com base em FACS foi utilizado. Em resumo, as células PDL1-CHOK1 foram primeiramente incubadas com mAb de camundongo HL1210-3 diluído em série de 3 vezes partindo a 20 μg/ml na RT durante 1 hora. Depois de lavar em tampão FACS (PBS com 2% de FBS), o huPD-1 rotulado com biotina foi adicionado a cada poço e incubado na RT durante 1 hora. Depois, a Estreptavidina-PE foi adicionada a cada poço durante 0,5 hora após lavar duas vezes com tampão FACS. A intensidade de fluorescência média (MFI) de PE foi avaliada pelo FACSAriaIII.
% de inibição
[00250] Como mostrado na Tabela 12 abaixo, os anticorpos Hu1210-3, Hu1210-9, Hu1210-8, Hu1210-14, Hu1210-17, Hu1210-19 e Hu1210-22 mostram eficácia comparável com anticorpo quimérico para bloquear a ligação de PD-L1 ao PD-1. Tabela 12. Ensaio de bloqueio de receptor de PD-1 Bio-PD1(30 μg/ml) TOP EC50 H1210 quimera 87,16 3,961 Hu1210-8 86,35 4,194 Hu1210-9 85,7 4,038 Hu1210-16 88,02 5,436 Hu1210-17 80,88 4,424 Hu1210-3 84,28 3,693 Hu1210-14 79,56 3,572 Hu1210-19 87,45 4,52 Hu1210-22 85,83 4,505 Hu1210-27 103,9 11,48 Hu1210-31 92,91 6,179
104 / 116 Hu1210-36 91,75 8,175 Ensaio de bloqueio de receptor usando-se PD-L1 humano recombinante
[00251] Existem dois receptores isto é PD-1 e B7-1 para PD-L1 humano. Para explorar a propriedade de bloqueio de anticorpo PD-L1 humanizado a estas duas proteínas, o ensaio de bloqueio de receptor com base em proteína foi aqui utilizado. Em resumo, placas microtituladoras foram revestidas com proteína de PD-L1 humano-Fc a 1 μg/ml em PBS, 100 μl/poço a 4°C durante a noite, depois bloqueadas com 200 μl/poço de BSA a 5% a 37℃ durante 2 horas. 50 μl das proteínas PD-1-Fc ou B7-1v humanas rotuladas com biotina e diluições de 5 vezes de anticorpos PD-L1 partindo de 100 nM a 50 μl foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com Estreptavidina-HRP durante 1 hora a 37°C. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato de TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450 nm. Como mostrado na FIG. 10 e 11, Hu1210- 41 pode eficientemente inibir a ligação de PD-L1 humano à PD1 e B7-1 humanas. Exemplo 9: Anticorpo humanizado promoveu resposta imune de célula T humana. Ensaio de reação de linfócito misto
[00252] Para avaliar a função in vitro de anticorpos humanizados, a resposta de células T humanas avaliadas em um cenário de reação de linfócito misto. DCs humanas foram diferenciadas de monócitos CD14+ na presença de GM-CSF e IL-4 durante 7 dias. As células T CD4+ isoladas de um outro doador foram depois cocultivadas com as DCs e diluições em série de anticorpo de bloqueio anti-PD-L1. No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante de cultura foi ensaiado quanto a produção de IL-2 e IFNα. Os resultados indicaram que os anticorpos Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16 e Hu1210-17 podem promover dependentemente da dose a produção de IL-2 e IFNα, sugerindo que os anticorpos anti-PD-L1 podem promover resposta de célula T
105 / 116 humana. Ensaio de rechamada de CMV
[00253] Para avaliar a função in vitro de anticorpos humanizados, a resposta de células T humanas foi avaliada no ensaio de rechamada de CMV. PBMCs humanas foram estimuladas com 1 μg/ml de antígeno de CMV na presença de anticorpos humanizados diluídos em série. Como mostrado nas FIGs. 12 e 13 o Hu1210-40, Hu1210-41 e Hu1210-17 podem dependentemente da dose promover a produção de IFNα. Exemplo 10: Inibição do crescimento de tumor pelo mAb anti-PD-L1.
[00254] As células da linhagem de célula de adenocarcinoma pulmonar humano HCC827 serão enxertadas em camundongos NOD scid gama (NSG). Os camundongos NSG são deficientes em NOD scid gama e os camundongos mais imunodeficientes tornando-os receptores ideais para a célula de tumor humana e enxerto de PBMC. 10 dias após o enxerto, as PBMCs humanas serão transplantadas nos camundongos que carregam tumor. Aproximadamente 20 dias após o enxerto, uma vez que o volume do tumor atingiu 100 a 150 mm3, o anticorpo PD-L1 será administrado aos camundongos a cada segundo dia a 5 mg/kg. O volume de tumor será monitorado a cada segundo dia em conjunção com a administração de anticorpo. Como mostrado na FIG. 14, Hu1210-31 pode inibir o crescimento de tumor em 30% a 5 mg/kg. Anticorpo Hu1210-41 pode inibir dependentemente da dose o crescimento de tumor, enquanto o peso do tumor também foi suprimido dependentemente da dose pelo anticorpo Hu1210-41 (FIG. 15). Exemplo 11. Simulação por Computador de Variação e Otimização Adicionais dos anticorpos humanizados
[00255] Foi considerado que certos resíduos de aminoácido dentro das regiões de CDR ou as regiões de armação seriam mudadas para melhorar adicionalmente ou reter a atividade e/ou estabilidade dos anticorpos. As
106 / 116 variantes foram testadas, com uma ferramenta computacional (VectorNTI, disponível em www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/), com respeito às suas propriedades estruturais, conformacionais e funcionais e aquelas (dentro das regiões de CDR) que se mostraram promissores são listados nas tabelas abaixo.
Tabela 13. CDRs VH e VL e suas variantes adequadas para inclusão em anticorpos humanizados Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR1 SYDMS 1 TYDMS 61 CYDMS 62 SFDMS 63 SHDMS 64 SWDMS 65 SYDMT 66 SYDMC 67
Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR2 TISDGGGYIYYSDSVKG 2 TISDGGAYIYYSDSVKG 68 TISDGGPYIYYSDSVKG 69 TISDGGGFIYYSDSVKG 70 TISDGGGHIYYSDSVKG 71 TISDGGGWIYYSDSVKG 72 TISDGGGYIYYSDTVKG 73 TISDGGGYIYYSDCVKG 74 TISDGGGYIYYSDSLKG 75 TISDGGGYIYYSDSIKG 76 TISDGGGYIYYSDSMKG 77
Nome Sequência SEQ ID NO: VH CDR3 EFGKRYALDY 3 QFGKRYALDY 78 DFGKRYALDY 79 NFGKRYALDY 80 EYGKRYALDY 81 EHGKRYALDY 82 EWGKRYALDY 83 EFAKRYALDY 84 EFPKRYALDY 85 EFGRRYALDY 86 EFGKKYALDY 87 EFGKRFALDY 88 EFGKRHALDY 89 EFGKRWALDY 90
Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR1 KASQDVTPAVA 4 KATQDVTPAVA 91 KACQDVTPAVA 92
Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR2 STSSRYT 5
107 / 116 TTSSRYT 93 CTSSRYT 94 SSSSRYT 95 SMSSRYT 96 SVSSRYT 97 STTSRYT 98 STCSRYT 99 STSTRYT 100 STSCRYT 101 STSSKYT 102 STSSRFT 103 STSSRHT 104 STSSRWT 105 Nome Sequência SEQ ID NO: VL CDR3 QQHYTTPLT 6 EQHYTTPLT 106 DQHYTTPLT 107 NQHYTTPLT 108 QEHYTTPLT 109 QDHYTTPLT 110 QNHYTTPLT 111 Sublinhado: resíduos de mutação de pontos cruciais e seus substitutos Exemplo 12: Identificação de Epítopo PD-L1
[00256] Este estudo foi conduzido para identificar resíduos de aminoácido envolvido na ligação de PD-L1 aos anticorpos da presente descrição.
[00257] Uma biblioteca de varredura de alanina de PD-L1 foi construída. Em resumo, 217 clones mutantes de PD-L1 foram gerados na plataforma de engenheiramento de proteína da Integral Molecular. A ligação de Hu1210-41 Fab a cada variante na biblioteca de mutação de PD-L1 foi determinada, em duplicata, pela citometria de fluxo de alto rendimento. Cada ponto de dados bruto teve o fundo de fluorescência subtraído e foi normalizado para a reatividade com PD-L1 tipo selvagem (WT). Para cada variante de PD-L1, o valor de ligação médio foi plotado como uma função da expressão (reatividade de mAb anti-PD-L1 de controle). Para identificar clones críticos preliminares (círculos com cruzes), os limiares (linhas tracejadas) de >70% WT da ligação ao MAb de controle e <30% da reatividade WT ao Hu1210-41 Fab foram aplicados (FIG. 16). Y134, K162 e N183 of PDL1 foram identificados como resíduos requeridos para a ligação
108 / 116 de Hu1210-41. A reatividade baixa do clone N183A com Hu1210-41 Fab sugere que o mesmo é o contribuidor energético principal para a ligação de Hu1210-41, com contribuições menores pelo Y134 e K162.
[00258] Os resíduos críticos (esferas) foram identificados em uma estrutura 3D de PD-L1 (PDB ID# 5JDR, Zhang et al., 2017), ilustrada na FIG.
17. Estes resíduos, Y134, K162 e N183, portanto, constituem um epítopo de PD-L1 responsável pela ligação aos anticorpos de várias modalidades da presente descrição.
[00259] É interessante observar que Y134, K162 e N183 estão todos localizados dentro do domínio IgC da proteína de PD-L1. Porções extracelulares tanto de PD-1 quanto de PD-L1 têm um domínio IgV e um domínio IgC. É habitualmente conhecido que PD-L1 se liga ao PD-1 através de ligações seus domínios IgV. Diferente de tais anticorpos convencionais, entretanto, Hu1210-41 se liga ao domínio IgC, que teria sido esperado ser ineficaz na inibição da ligação de PD-1/PD-L1. Este epítopo diferente de Hu1210-41, surpreendentemente, provavelmente contribui para as atividades excelentes de Hu1210-41. Exemplo 13. Engenheiramento de anticorpo de anticorpo anti-PDL1
[00260] Os exemplos 13 a 17 tentaram identificar anticorpos adicionalmente melhorados com base no Hu1210-41 usando mutagênese.
[00261] Uma proteína de fusão de citidina desaminase induzida na ativação (AID) com proteína 9 (dCas9) associada com repetições palindrômicas curtas interespaçada regularmente agrupadas (CRISPR) inativadas por nuclease foi usada para a triagem de alto rendimento de variantes funcionais em células T 293. Em resumo, RNAs guias únicos (sg) reconhecendo 6 CDRs de anticorpo podem guiar a proteína de fusão de dCas9-AID para 6 CDRs de anticorpo e induzir mutações na região de CDR. Os anticorpos mutados foram exibidos na superfície celular de células 293. As células resultantes mostraram melhor potência de ligação do que as
109 / 116 contrapartes não mutadas e foram classificadas por FACS quanto ao sequenciamento de subsequência. Uma mutação de S60 a R na CDRH2 foi identificada como potencialmente tendo efeito positivo sobre o anticorpo.
[00262] Para avaliar a propriedade de ligação de antígeno do mutante S60R (CDRH2), os anticorpos foram analisados quanto à sua ligação ao PD- L1 de mamífero expressado por FACS. Em resumo, as células Raji PD-L1 foram primeiro incubadas com anticorpos humanizados diluídos em série 5 vezes partindo a 2 µg/ml na RT durante 1 hora. Depois de lavar em tampão FACS (PBS com 2% de FBS), o anticorpo de IgG anti-humano Alexa 488 foi adicionado a cada poço e incubados na RT durante 1 hora. O MFI de Alexa 488 foi avaliado por FACSAriaIII. Como mostrado na FIG. 18, o mutante S60R de modo altamente eficiente se ligou ao PD-L1 expresso nas células de mamífero, que foi mais potente do que o anticorpo precursor Hu1210-41. Este mutante S60R foi depois usado como o anticorpo precursor para análise de mutação adicional abaixo e foi aludido como “WT”.
[00263] Quatro sub-bibliotecas foram construídas para o engenheiramento de anticorpo de anticorpo monoclonal anti-PD-L1, usando cada uma das seguintes estratégias. Na estratégia 1, a mutagênese de domínio variável de cadeia pesada VH CDR3 ou VL-CDR3 foi realizada pela mutação altamente aleatória. Na estratégia 2, duas bibliotecas de combinação de CDR compostas de (VH-CDR3, VL-CDR3 e VL-CDR1) ou (VH-CDR1, VH- CDR2 e VL-CDR2) foram geradas pela CDR caminhando com taxas de mutação controladas.
[00264] Bio-Panning: os métodos de panning de fagos foram adaptados pelo encurtamento do tempo de incubação/ligação antes da condição de lavagem severa. Em resumo, 100 µl de grânulos magnéticos de estreptavidina (Invitrogen, USA) foram bloqueadas com 1 ml de MPBS durante 1 hora na temperatura ambiente. Em um outro tubo, os fagos da biblioteca foram pré-incubados (5 x 10^11~12 para cada rodada) com 100 µl
110 / 116 de grânulos magnéticos de estreptavidina em 1 ml de MPBS para remover aglutinantes indesejados. O concentrador de partícula magnética foi usado para separar os fagos e os grânulos. A proteína de PD-L1 biotinilada foi adicionada aos fagos e incubados 2h na temperatura ambiente e suavemente misturados usando um agitador suspenso. Os grânulos carreando fagos a partir da solução foram separados no concentrador de partícula magnética e o sobrenadante foi descartado. Os grânulos foram lavados com tampão de lavagem fresco, dez vezes com PBST e dez vezes com PBS (pH 7,4). 0,8 ml, Tripsina a 0,25% em PBS (Sigma, USA) foi adicionado e incubado durante 20 min a 37°C para eluir os fagos. O fago de saída foi titulado e salvo para panning da rodada seguinte, a diminuição da concentração de antígeno rodada por rodada. Triagem por ELISA e classificação da taxa de associação/dissociação
[00265] Os clones foram escolhidos e induzidos a partir da saída de panning desejada; ELISA de fagos foi conduzido para triagem primária; os clones positivos foram analisados pelo sequenciamento; pontos cruciais únicos foram achados. A Tabela 14 mostra as mutações identificadas. Como mostrado abaixo, os resíduos FGK in the CDRH3 são anticorpos melhorados produzindo resíduos de ponto crucial. Tabela 14. Mutações nas CDRs CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 WT* SYDMS TISDAGGYIYYRDS EFGKRYAL KASQDVTPA STSSRYT QQHYTTP
VKG DY VA LT SEQ ID 1 116 3 4 5 6 NO: B3 ----- ----------------- ---------- --K-------- ------- M-------- C4 ----- ----------------- ---------S ------W---- ------- ---S----- B1 ----- ----------------- -IFN------ ----------- ------- --------- B6 ----- ----------------- -LPW------ ----------- ------- --------- C3 ----- ----------------- -LHF------ ----------- ------- --------- C6 ----- ----------------- -LYF------ ----------- ------- --------- A1 ----- ----------------- -LLH------ ----------- ------- --------- A2 ----- ----------------- -LRG------ ----------- ------- --------- A3 ----- ----------------- ---------- ----------- ------- ---SDA--- * WT difere de Hu1210-41 em uma substituição S60R (numeração de Kabat) na cadeia pesada para melhorar a afinidade.
[00266] As sequências de aminoácido das regiões variáveis destes
111 / 116 anticorpos são mostradas na Tabela 15 abaixo. Tabela 15. Sequências de Anticorpo Nome Sequência SEQ ID NO: WT-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKS
LEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI
CAREF GKRYALDYWGQGTTVTVSS 141 WT-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKAP
KLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLT
FGQ GTKLEIK 142 B3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKS
LEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI
CAREF GKRYALDYWGQGTTVTVSS 143 B3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAKQDVTPAVAWYQQKPGKAP
KLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCMQHYTTPL
TFGQ GTKLEIK 144 C4-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKS
LEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYI
CAREF GKRYALDSWGQGTTVTVSS 145 C4-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVWPAVAWYQQKPGKAP
KLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHSTTPLT
FGQ GTKLEIK 146 B1-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREI FNRYALDYWGQGTTVTVSS 147 B1-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 148 B6-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREL PWRYALDYWGQGTTVTVSS 149 B6-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 150
112 / 116 C3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREL HFRYALDYWGQGTTVTVSS 151 C3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 152 C6-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREL YFRYALDYWGQGTTVTVSS 153 C6-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 154 A1-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREL LHRYALDYWGQGTTVTVSS 155 A1-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 156 A2-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREL RGRYALDYWGQGTTVTVSS 157 A2-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYTTP
LTFGQ GTKLEIK 158 A3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPG
KSLEWVAT ISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAV
YICAREF GKRYALDYWGQGTTVTVSS 159 A3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQKPGKA
PKLLIYS TSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHSDAP
LTFGQ GTKLEIK 160 Exemplo 14. Propriedades de ligação de antígeno dos anticorpos PD-L1
[00267] Como mostrado nas Tabelas 14 e 15, 9 clones totalmente únicos foram distinguidos e convertidos em IgG de tamanho completo. Propriedade de ligação ao PD-L1 humano recombinante
[00268] Para avaliar a atividade de ligação de antígeno, os anticorpos
113 / 116 foram submetidos ao teste de ELISA. Em resumo, as placas microtituladoras foram revestidas com proteína de PD-L1 humano-Fc a 2 μg/ml em PBS, 100 μl/poço em 4°C durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. diluições 4 vezes de anticorpos humanizados partindo de 10 µg/ml foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 a 2 horas na RT. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG de cabra anticamundongo conjugada com Peroxidase de Rábano (HRP) durante 1 hora na RT. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB e analisadas pelo espectrofotômetro na OD 450 a 630 nm. Como mostrado na FIG. 19, todos os anticorpos humanizados mostraram excelente eficácia de ligação para PD-L1 humano e B6 e C3 se comportaram melhor do que o clone WT precursor. Propriedade de ligação ao PD-L1 humano expresso em mamífero
[00269] Para avaliar a propriedade de ligação a antígeno, os anticorpos foram analisados quanto à sua ligação ao PD-L1 expressado em mamífero pelo FACS. Em resumo, células PDL1-Raji foram primeiramente incubadas com anticorpos humanizados diluídos em série de 5 vezes partindo a 2 μg/ml na RT durante 1 hora. Depois de lavar em tampão FACS (PBS com 2% de FBS), o anticorpo IgG Alexa 488-anti-humano foi adicionado a cada poço e incubado na RT durante 1 hora. O MFI de Alexa 488 foi avaliado pelo FACSAriaIII. Como mostrado na FIG. 20, B6 de modo altamente eficiente se ligou ao PD-L1 expresso nas células de mamífero, que foi mais potente do que o anticorpo WT precursor. Classificação de afinidade de anticorpos humanizados pelo Biacore
[00270] Para explorar as cinéticas de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou a classificação de afinidade usando Biacore. Como mostrado na Tabela 16, B6, C3, C6, A1 e A3 mostraram melhor afinidade do que o anticorpo WT precursor. Tabela 16. Classificação de afinidade Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
114 / 116 WT 1,77E+05 4,64E-04 2,63E-09 B3 1,19E+05 2,96E-04 2,49E-09 C4 1,13E+05 5,06E-04 4,50E-09 B1 1,63E+05 2,61E-04 1,60E-09 B6 2,42E+05 2,46E-04 1,02E-09 C3 2,18E+05 2,99E-04 1,37E-09 C6 2,06E+05 3,34E-04 1,63E-09 A1 2,03E+05 2,76E-04 1,36E-09 A2 1,87E+05 4,75E-04 2,55E-09 A3 2,18E+05 3,24E-04 1,49E-09 Exemplo 15. Função com base na célula de anticorpo Anti-PDL1
[00271] Para testar a capacidade de anticorpos anti-PDL1 para estimular a resposta de célula T, as células Jurkat expressadas em hPD-1 foram usadas. Em resumo, Jurkat é a linhagem de célula de leucemia de célula T humana que pode produzir IL2 na estimulação pela TCR. Neste ensaio, as células Jurkat transfectadas com gene PD-1 humano pelo lentivírus foram usados como as células respondedoras. As células Raji-PDL1 foram usadas como as células que apresentam antígeno (APC). As Enterotoxinas Estafilocócicas (SE) são usados para estimular sinal de TCR. Neste sistema, huPDL1 ectopicamente expresso pode suprimir a produção de IL-2 estimulada por SE pelas células Jurkat, embora os anticorpos anti-PDL1 possam reverter a produção de IL-2. Em resumo, APCs (2,5 × 104) foram cocultivadas com células T Jurkat expressando PD-1 (1 × 105) na presença de estimulação com SE. Anticorpos antiPDL1 (partindo de 100 nM e diluídos em série 1:4 para 8 doses) foram adicionados no começo da cultura. 48 horas mais tarde, o sobrenadante de cultura foi avaliado quanto a produção de IL2 pelo ELISA. Como mostrado na FIG. 21, os anticorpos monoclonais B6 foram mais potentes do que o anticorpo WT precursor. Exemplo 16. Reação de linfócito misto
[00272] Para avaliar a função in vitro de anticorpos PDL1, a resposta de células T humanas foi avaliada em um cenário de reação de linfócito misto. Em resumo, DCs humanas foram diferenciadas a partir de monócitos CD14+ na presença de GM-CSF e IL-4 durante 7 dias. As células T CD4+ isoladas de outro doador foram depois cocultivadas com as DCs e diluições em série de
115 / 116 anticorpo bloqueador anti-PD-L1. No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante de cultura foi ensaiado quanto à produção de IFNα. Os resultados (FIG. 22) indicaram que o anticorpo B6 foi mais potente do que o anticorpo WT precursor na promoção da produção de IFNα. Exemplo 17. A eficácia in vivo de anticorpo PDL1 no modelo singênico MC38
[00273] Para avaliar o efeito de PDL1 sobre o crescimento de tumor, o modelo de tumor singênico MC38 de PDL1 humanizado foi aplicado. Neste modelo, o gene de PDL1 humano foi expresso em células MC38 de camundongo, enquanto o domínio extracelular do gene PDL1 de camundongo foi substituído pelo PDL1 humano. A este respeito, a eficácia do anticorpo de PDL1 humano sobre o crescimento de tumor pôde ser avaliada neste modelo singênico MC38 humanizado no gene PDL1. As células MC38 de huPDL1 foram inoculadas subcutaneamente em camundongos humanizados PDL1. Quando o tumor atingiu o volume de 100 a 150 m3, o anticorpo WT precursor e anticorpos B6 foram administrados intraperitonealmente a 3 mg/kg duas vezes por semana durante 6 doses. O resultado (FIG. 23) mostrou que o anticorpo B6 foi mais potente do que o anticorpo WT precursor do dia 19 ao
26.
[00274] A presente descrição não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas que são intencionadas como ilustrações únicas de aspectos individuais da divulgação e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalente estão dentro do escopo desta divulgação. Estará evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos e composições da presente descrição sem divergir do espírito ou escopo da divulgação. Assim, é pretendido que a presente descrição abranja as modificações e variações da divulgação contanto que elas se situem dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.
116 / 116
[00275] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência ao mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados ser incorporados por referência.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem especificidade para uma proteína de PD-L humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117 ou uma variante da SEQ ID NO: 117 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 117, em que o segundo resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Leu; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO:
    6.
    2. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 1 é selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 61-67.
    3. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 116 é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 118 a 127, 2 e 68 a 77.
    4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o terceiro resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Pro.
    5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o quarto resíduo de aminoácido da VH CDR3 é Trp.
    6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 117 é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 128 a 139.
    7. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 4 é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 91 e 92.
    8. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 5 é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 93 a 105.
    9. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante da SEQ ID NO: 6 é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 140 e 106 a 111.
    10. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
    11. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 149 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 150.
    12. Anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem especificidade para uma proteína de PD-L humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 3; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO:
    5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 140 ou uma variante da SEQ ID NO: 140 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 140, em que pelo menos (i) o resíduo de aminoácido 4 da VL CDR3 é Ser, (ii) o resíduo de aminoácido 5 da VL CDR3 é Asp ou (iii) o resíduo de aminoácido 6 da VL CDR3 é Ala.
    13. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 140.
    14. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 159 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 160.
    15. Anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem especificidade para uma proteína de PD-L humana e compreende: (a) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 1; (b) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116 ou uma variante da SEQ ID NO: 116 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 116; (c) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 3; (d) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 4; (e) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO: 5; e (f) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante da SEQ ID NO: 6 tendo uma, duas ou três substituições, deleções ou inserções quando comparadas com a SEQ ID NO:
    6.
    16. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a VH CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, a VH CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 116, a VH CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, a VL CDR1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, a VL CDR2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e a VL CDR3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.
    17. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ
    ID NO: 141 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 142.
    18. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um segundo fragmento de ligação a antígeno tendo especificidade para uma molécula em uma célula imune.
    19. Polinucleotídeo nucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma das cadeias de polipeptídeo do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
    20. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de um medicamento para tratar câncer.
    21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.
    22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo de câncer da bexiga, câncer hepático, câncer colônico, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer mamário, câncer uretral, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer estomacal, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer prostático e câncer tireóidico.
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