JP6779299B2

JP6779299B2 - 抗ｐｄ−ｌ１抗体およびその使用

Info

Publication number: JP6779299B2
Application number: JP2018535895A
Authority: JP
Inventors: リルリュ; シンシュヤン; ハイシャンルオ; チェンロンシュアイ; フウリュ; シャオピンフ; シャオランスン; ホンジュアング; チンドュアン; タッチテディヤン
Original assignee: ジアンスーヒャマブファーマシューティカルカンパニーリミテッド
Priority date: 2016-01-04
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2020-11-04
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN108699146A; US10889648B2; EP3400243A1; US20190010233A1; CN108699146B; CN106939047A; JP2019503687A; EP3400243A4; WO2017118321A1; HK1255604A1; CN106939047B

Description

発明の詳細な説明

［関連出願のクロスレファレンス］
本出願は、2016年1月4日に提出した中国特許出願番号が201610003723.6の優先権を出張し、当該出願の公開内容を全体として引用の形で本明細書に取り入れる。

［電子形式で提出された配列表について］
本出願は、配列表を含み、EFS-Webによって電子形式で提出され、ASCIIフォーマットの配列表として、ファイル名は「配列表ファイル」で、作成日付は2016年12月12日で、大きさは約39.1 kBである。EFS-Webによって提出された配列表は本明細書の一部で、かつ全体として引用の形で本明細書に取り入れる。

［発明分野］
本発明は、抗PD-L1モノクローナル抗体、当該抗体をコードする核酸と発現ベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、および当該抗体を含む組成物に関する。また、抗体を製造する方法、および前記抗体で疾患（癌および自己免疫性疾患を含む）を治療する方法を提供する。

［発明背景］
腫瘍細胞は腫瘍微小環境において色々な手段で宿主の免疫を「編集」することによって免疫系から逃れることができる。腫瘍のこのいわゆる「癌免疫逃避」を行う手段の一つは、免疫系の重要な調節剤である免疫チェックポイントタンパク質の発現を上方調節することによって、免疫応答を抑制することである。このような免疫抑制共シグナルはPD-1受容体およびその配位子であるPD-L1によって仲介される。

PD-1（プログラム細胞死タンパク質1またはCD279）は1型膜貫通タンパク質で、主要な免疫チェックポイントの一つである（Blankら，2005，癌免疫療法“Cancer Immunotherapy”，54：307-314）。PD-1は主に活性化細胞において発現され、かつ配位子PD-L1(B7-H1またはCD274)およびPD-L2(B7-DCまたはCD273)と相互作用することによって抑制性シグナルを誘導し、これによってT細胞の増殖が減少し、サイトカインの生成および毒性の活性化が生じる(Freemanら, 2000, J. Exp. Med., 192:1027-34)。

PD-L1(プログラム細胞死配位子1)はI型膜貫通タンパク質で、細胞外Ig-V様ドメイン、Ig-C様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内C-末端ドメインを含む。PD-L1は多くの種類の細胞において発現され、T細胞、B細胞、内皮細胞、上皮細胞および抗原提示細胞が含まれ、肺、肝臓および心臓組織の細胞および多くの種類の腫瘍細胞において発現される。それに対し、PD-L2は抗原提示に特化した細胞、たとえば樹状細胞やマクロファージだけにおいて発現される(Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. Nature Med. 1999; 5:1365-1369.)。

PD-1とPD-L1の間の相互作用は免疫応答の調節にとって非常に重要で、PD-L1を発現する腫瘍細胞がこれによって免疫の監視から逃れる主な機構である（Zippeliusら、2015、Cancer Immunol Res.、3（3）：236-44）。エフェクター機能の低下から、T細胞のPD-1の持続的な発現が疲弊表現型を明確に示すことがわかる。このような表現型は異なる種類の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）においてが観察され、かつ予後不良および腫瘍再発に関連する（Wherry, 2011, Nat. Immunol., 12:492-99; Sheng Yao 2013 Nat Rev Drug Discov. 2013 12(2): 130-146）。

PD-1/PD-L1の相互作用の遮断は免疫系を活性化し、抗腫瘍の免疫応答を強化させることができ、かつ数個の相同マウス腫瘍モデルにおいて、PD-1またはその受容体であるPD-1の遮断は抗腫瘍活性を促進することがすでに証明された（Hiranoら、2005、 Cancer Res.、65：1089-96）。そのため、PD-1とPD-L1の間の相互作用は癌免疫治療で注目される標的である。

さらに、慢性ウイルス感染、たとえばHIVにおいて、HIV特異的CD8+ T細胞の機能が損害され、サイトカインおよびエフェクター分子の発現が減少し、かつT細胞の増殖能力が低下する。研究では、HIVに感染した個体においてHIV特異的CD8+ T細胞のPD-1発現が高度に上方調節され、PD-1/PD-L1経路の遮断は慢性ウイルス感染およびエイズの治療に潜在的な治療方法を提供することが示唆される(Bowers NL, Helton ES, Huijbregts RPHら. PLoS Pathog. 2014年3月; 10 (3): e1003993)。

そのため、PD-1/PD-L1経路を遮断する治療剤は様々な癌、ウイルス感染、たとえばHIV感染、T細胞枯渇に関連する病状およびほかの免疫疾患に使用される新しい療法を提供することができる。

また、PD-1は肺および腎臓で発現されるPD-L2と相互作用し、自己免疫反応を防止する唯一の負のシグナルを提供する。そのため、抗PD-1抗体でPD-1/PD-L1経路を遮断すると、PD-1/PD-L2の相互作用を破壊し、PD-1/PD-L2に基づいた自己免疫反応の抑制を阻害することがある。そのため、抗PD-1抗体を使用すると、自己免疫に関連する肺炎または腎臓炎につながる可能性がある。しかしながら、抗PD-L1抗体はPD-1/PD-L2の相互作用に影響しないため、これらの使用は免疫に関連する有害事象を減少することができる。

腫瘍免疫治療は腫瘍治療の最新の突破で、患者自身の免疫系を利用して腫瘍細胞を攻撃する。免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は数種類の腫瘍（たとえば転移性メラノーマ、肺癌、乳腺癌、腎細胞癌など）を治療する潜在力を有する。癌免疫療法を応用する最近の研究では、特に転移性癌の場合、期待できる結果が示された。（WeinstockおよびMcDermott, 2015, Ther Adv Urol., 7(6):365-77）。また、癌免疫療法はホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫などを含む血液癌の治療において巨大な潜在力が示された（ZouおよびChen L, 2008, Nat Rev Immunol., 8(6):467-77）。免疫チェックポイント阻害剤による副作用は無視できる程度で、可逆的で制御可能で、かつ有効な免疫チェックポイント阻害剤は顕著に癌患者の全生存期間を改善することができる。免疫チェックポイント阻害剤は標的治療または従来の放射線治療や化学治療と併用することができ、かつこのような併用療法は多くの種類の癌の治療において有効である。抗PD-L1モノクローナル抗体の臨床試験はすでにジェネンテック/ロシュ、ファイザー/メルク、セローノおよびメディミューンによって始められている。

ロシュ/ジェネンテックのヒト化抗PD-L1 mAb [Tecentriq（登録商標）]はすでに局部晩期または転移性尿路上皮癌および非小細胞肺癌（NSCLC）の治療への使用が許可された。ネオアジュバントまたはアジュバントの白金含有療法後の晩期または転移性尿路上皮癌が進行した患者の臨床研究では、TECENTRIQ（登録商標）は22％のヒトにおける腫瘍を縮小させた（客観的奏効率、ORR）。しかしながら、2％超の患者はグレード3〜4の有害反応が現れ、3例の患者が敗血症、肺炎または腸閉塞を経験し、死亡に至った。3.2％の患者に有害反応が現れたためTECENTRIQ（登録商標）は中止された。

そのため、進展があったが、本分野では有効にPD-1/PD-L1シグナルの活動を抑制しながら、人体における有害な副作用を最低限にする、抗PD-L1抗体を含むより効果的な治療剤がまだ必要である。

［発明の概要］
このような需要に満足させるため、本発明は、混合リンパ球反応およびT細胞刺激試験で測定されたように、高親和力で特異的にPD-L1と結合して免疫細胞のIFN-γおよびIL-2の分泌を誘導するモノクローナル抗体を提供する。具体的に、本発明の完全ヒト抗PD-L1抗体はPD-L1に対してアテゾリズマブ(Tecentriq（登録商標）、ロシュ/ジェネンテック)(ヒト化IgG1抗PD-L1モノクローナル抗体)に相当する親和力を有する。また、当該抗体はアテゾリズマブに相当する特性を示すが、完全なヒトモノクローナル抗体で、簡単なヒト化モノクローナル抗体ではないため、ヒトにおける免疫原性の有害な副作用がアテゾリズマブよりも少ないと予測されている。

一つの一般的な側面では、本発明は、PD-L1と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（1）それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28で、
（2）それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4で、
（3）それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12で、
（4）それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20で、
（5）それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36で、
（6）それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44で、あるいは
（7）それぞれ配列番号54、55、56、50、51、および52である、
ポリペプチド配列を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片はPD-L1、好ましくは特異的にヒトPD-L1と結合する、
抗体またはその抗原結合断片に関する。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、配列番号25、1、9、17、33、41または49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号29、5、13、21、37、45または53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む、抗体または抗原結合断片に関する。

一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はヒト/ラットキメラのものである。
もう一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はヒトのものである。

また一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、定常領域、好ましくはヒト重鎖IgG4定常領域、より好ましくは一つまたは複数の突然変異、たとえばS228P突然変異を有するヒト重鎖IgG4定常領域と、ヒト抗体の軽鎖κ定常領域とを含む。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸に関する。
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む宿主細胞に関する。
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物に関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象においてPD-L1とPD-1および/またはB7.1の結合を遮断する方法、あるいはIFN-γおよびIL-2の分泌を増加させる方法であって、対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象において疾患、障害または病状、好ましくは感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患または移植片対宿主病を治療する方法であって、対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象において過剰増殖性疾患を治療する方法であって、対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。過剰増殖性疾患は、非悪性疾患でもよく、アテローム性動脈硬化、良性増殖や良性前立腺肥大を含むが、これらに限定されない。過剰増殖性疾患は、腫瘍または悪性疾患でもよい。腫瘍は、固形腫瘍、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれてもよい。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件において前記モノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から前記抗体または抗原結合断片を回収する工程を含む方法に関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得ることを含む方法に関する。

本発明の具体的な実施形態、およびその好適な実施形態ならびに添付された請求の範囲を含む、以下の公開内容から、本発明のほかの側面、特徴および利点は明らかである。

図面と合わせて読むと、本発明の以上の概述および以下の詳細がよりよく理解できる。もちろん、本発明は図面で示された具体的な実施形態に限定されない。
図面において、以下の通りである。

図1は、ビオチンで標識されたPD-L1-hFcタンパク質とその受容体であるPD-1-hFcとの結合活性を示す。図2はhPD-L1タンパク質で形質移入して安定したHEK293細胞のフローサイトメーター検出図を示す。図3は、PD-L1タンパク質で免疫された後のH2L2遺伝子組み換えマウスの血清抗体力価のELISA測定結果を示すが、ここで、1681〜1685はマウスのID番号を表す。図4Aは、ELISAによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とヒトPD-L1-hFcタンパク質の結合活性を示す。図4Bは、ELISAによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とヒトPD-L1-hFcタンパク質の結合活性を示す。図5は、ELISAによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とカニクイザルPD-L1-hFcタンパク質の結合活性を示す。図6は、ELISAによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とPD-L1またはPD-L2の結合活性を示す。図7Aは、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とCHO-K1-hPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図7Bは、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とCHO-K1-hPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図8Aは、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とCHO-K1-cPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図8Bは、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体とCHO-K1-cPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図9Aは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるPD-1との結合に対する抑制を示す。図9Bは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるPD-1との結合に対する抑制を示す。図10Aは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるB7.1との結合に対する抑制を示す。図10Bは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるB7.1との結合に対する抑制を示す。図11は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図12は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図13は、供与体1のPBMCを使用した混合リンパ球反応において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図14は、供与体1のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図15は、供与体2のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図16は、供与体3のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図17は、供与体4のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図18は、供与体5のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図19は、供与体6のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図20は、供与体7のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図21は、供与体6のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図22は、供与体7のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図23は、供与体8のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図24は、供与体9のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図25は、供与体8のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図26は、供与体9のPBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態によるキメラ抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図27Aは、ELISAによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とヒトPD-L1タンパク質の結合を示す。図27Bは、ELISAによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とヒトPD-L1タンパク質の結合を示す。図28Aは、ELISAによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とカニクイザル（cyno）PD-L1タンパク質の結合を示す。図28Bは、ELISAによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とカニクイザル（cyno）PD-L1タンパク質の結合を示す。図29は、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とCHO-K1-hPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図30は、フローサイトメトリーによって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体とCHO-K1-cPD-L1の細胞に基づいた結合活性を示す。図31Aは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるPD-1との結合に対する抑制を示す。図31Bは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるPD-1との結合に対する抑制を示す。図32Aは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるB7.1との結合に対する抑制を示す。図32Bは、タンパク質に基づいた受容体配位子遮断試験によって検出された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のPD-L1蛋白とその受容体であるB7.1との結合に対する抑制を示す。図33は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図34は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図35は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図36は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図37は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図38は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIL-2分泌に対する影響を示す。図39は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図40は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図41は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図42は、PBMCを使用した混合リンパ球反応試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図43は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図44は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図45は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図46は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図47は、PBMCを使用したT細胞刺激試験において本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体のIFN-γ分泌に対する影響を示す。図48は、本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体の抗体依存性細胞傷害（ADCC）に対する影響を示す。図49は、本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体の補体依存性細胞傷害に対する影響を示す。図50は、示差走査熱量測定法（DSC）によって測定された本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体の熱安定性を示す。図51は、本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体の凍結・解凍安定性を示す。図52は、本発明の実施形態による完全ヒト抗PD-L1抗体の溶解度を示す。

［具体的な実施形態］
背景および明細書全体において、複数の出版物、文章および特許が引用または記述され、これらの参考文献は全体として引用の形で本明細書に取り入れられる。本明細書に含まれる書類、法案、材料、装置、製品などの検討は本発明の前後文を提供するためである。本発明で公開されたものまたは保護を要求されたもののいずれに対しても、このような検討はこれらの事項のいずれかまたは全部が既存技術の一部になることを認めるわけではない。

別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。さらに、本明細書で用いられる具体的な用語は明細書で定義された意味を有する。本明細書で引用されたすべての特許、公開された特許出願および出版物は、ここで完全に記述されるように、引用によって本明細書に取り入れられる。注意すべきのは、前後文で別途に明示されない限り、本明細書および添付された請求の範囲で用いられるように、単一の形態の「一」、「一つ」および「当該」は複数の形態を含む。

別途に説明されない限り、すべての場合、本明細書に記載のいずれの数値（たとえば本明細書に記載の濃度または濃度範囲）も用語「約」で修飾されたものと理解されるべきである。そのため、一つの数値は、通常、記載された値の±10％を含む。たとえば、1mg/mLの濃度は0.9mg/mL〜1.1mg/mLを含む。同様に、1％〜10％（w/v）の濃度範囲は0.9％（w/v）〜11％（w/v）を含む。前後文で別途に明示されない限り、本明細書で用いられるように、使用された数値の範囲は特別にすべての可能な下位範囲、当該範囲内におけるすべての単一の数値を含み、このような範囲内における整数および当該値の分数を含む。

本発明は、全体的に単離された抗PD-L1モノクローナル抗体、前記抗体をコードする核酸と発現ベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、および抗体を含む組成物に関する。また、抗体を製造する方法、および前記抗体で疾患（癌および自己免疫性疾患を含む）を治療する方法を提供する。本発明の抗体は一つまたは複数の必要な機能性質を有し、高親和力のPD-L1との結合、PD-1に対する高特異性、PD-L1とその配位子であるPD-1およびB7.1の結合を遮断する能力、ならびにサイトカインであるIFN-γおよびIL-2の分泌を刺激する能力を含むが、これらに限定されない。

一つの一般的な側面では、本発明は、PD-L1と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」は広義で使用され、イムノグロブリンまたは抗体分子を含み、ヒト、ヒト化、複合およびキメラのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびに抗体断片を含む。通常、抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体の構造は、周知のものである。重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって、イムノグロブリンは主に5つのクラス（すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM）に分かれる。IgAおよびIgGはさらに同クラスのIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に細分される。そのため、本発明の抗体は主な5つのクラスまたは相応するサブクラスのいずれでもよい。好ましくは、本発明の抗体はIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。その定常領域のアミノ酸配列によって、脊椎動物の種の抗体の軽鎖を2つの顕著に異なるタイプの一つ、すなわちκおよびλに分類することができる。そのため、本発明の抗体はκまたはλの軽鎖定常ドメインを含んでもよい。具体的な実施形態によって、本発明の抗体はラットまたはヒト抗体由来の重鎖および/または軽鎖の定常領域を含む。重鎖および軽鎖の定常ドメイン以外、抗体は、さらに、軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含み、各領域に3つのドメイン（すなわちCDR1、CDR2およびCDR3）が含まれる。軽鎖可変ドメインはLCDR1、LCDR2およびLCRD3と、重鎖可変ドメインはHCDR1、HCRD2およびHCDR3と呼ばれてもよい。

本明細書で用いられるように、用語「単離された抗体」とは基本的に異なる抗原特異性を有するほかの抗体を含まない抗体をいう（たとえば、特異的にPD-L1と結合する単離された抗体は基本的にPD-L1と結合しない抗体を含まない）。さらに、単離された抗体は基本的にほかの細胞物質および/または化学物質を含まない。

本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体」とは基本的に同質の抗体群から得られる抗体をいい、すなわち、少量に存在しうる天然の突然変異以外、前記抗体群を構成する単一の抗体は同一のものである。本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローン技術、または組換えDNA法によって製造することができる。たとえば、ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を生成させることができるが、前記ハイブリドーマは非ヒト遺伝子組換え動物（たとえば遺伝子組換えマウスまたはラット）から得られる、ヒト重鎖組換え遺伝子および軽鎖組換え遺伝子を含むゲノムを有するB細胞を含む。

本明細書で用いられるように、用語「抗原結合断片」とは抗体断片、たとえばダイアボディ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、ジスルフィド結合安定化Fv断片（dsFv）、(dsFv)₂、二重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、ジスルフィド結合安定化ダイアボディ（dsダイアボディ）、一本鎖抗体分子（scFv）、単一ドメイン抗体（sdab）、scFv二量体（2価ダイアボディ）、一つまたは複数のCDRを含む部分抗体からなる多重特異性抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体、2価ドメイン抗体、または抗原と結合するが完全の抗体構造を含まない任意のほかの抗体断片をいう。抗原結合断片は親抗体または親抗体断片と結合する同様の抗原と結合することができる。具体的な実施形態によれば、抗原結合断片は軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖定常領域のFdセグメントを含む。ほかの具体的な実施形態によれば、抗原結合断片はFabおよびF(ab')を含む。

本明細書で用いられるように、用語「一本鎖抗体」とは約15〜約20のアミノ酸からなる短鎖ペプチドで連結した重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む、本分野の通常の一本鎖抗体をいう。本明細書で用いられるように、用語「単一ドメイン抗体」とは重鎖可変領域および重鎖定常領域を、あるいは重鎖可変領域だけを含む、本分野の通常の単一ドメイン抗体をいう。

本明細書で用いられるように、用語「ヒト抗体」とはヒトから生成する抗体、または本分野で既知の任意の技術によって製造されるアミノ酸配列を有するヒトから生成する抗体に相応するアミノ酸配列を有する抗体をいう。ヒト抗体の定義は、完全または全長の抗体、その断片、ならびに/あるいは少なくとも一つの重鎖および/または軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

本明細書で用いられるように、用語「ヒト化抗体」とは抗体の抗原結合特性が維持され、かつ人体における抗原性が低下するように、修飾によってヒト抗体との配列相同性を増強させた非ヒト抗体をいう。

本明細書で用いられるように、用語「キメラ抗体」とはイムノグロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種由来の抗体をいう。通常、軽鎖および重鎖の可変領域はいずれも1種類の哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ウサギなど）から誘導される、所要の特異性、親和力、および性能を有する抗体の可変領域に相応し、定常領域はもう1種類の哺乳動物（たとえばヒト）から誘導される抗体の配列に相応することで、当該種において免疫応答を引き起こすことを避ける。

本明細書で用いられるように、用語「PD-L1」とはプログラム細胞死配位子1タンパク質をいい、I型膜貫通タンパク質で、T細胞、B細胞、内皮細胞、上皮細胞および抗原提示細胞を含む多くの種類の細胞において発現され、かつ肺、肝臓および心臓組織の細胞において発現され、そしてその発現はいくつかの種類の腫瘍細胞において高度に上方調節されている。ヒトPD-L1のアミノ酸配列はGenBank登録番号NP_054862.1で示される。PD-L1の2つの結合相手のPD-1およびB7.1はすでに同定された。

本明細書で用いられるように、用語「特異的にPD-L1と結合する」抗体とは、PD-L1、好ましくはヒトPD-L1と結合する抗体をいい、有するKDは1×10^-7 Mまたはそれ以下、好ましくは1× 10^-8Mまたはそれ以下、より好ましくは1×10^-9 Mまたはそれ以下あるいは1×10^-10 Mまたはそれ以下である。用語「KD」とはKdとKaの比（すなわちKd/Ka）から得られる解離定数をいい、かつモル濃度（M）で表示される。本発明によれば、本分野の方法によって抗体のKD値を確認することができる。たとえば、抗体のKDは表面プラスモン共鳴、たとえばBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステム、またはバイオレイヤー干渉の測量技術、たとえばOctet RED96システムによって確認することができる。

抗体のKD値が小さいほど、抗体と標的抗原の結合の親和力が高い。
一つの特定の側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（1）それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28で、
（2）それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4で、
（3）それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12で、
（4）それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20で、
（5）それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36で、
（6）それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44で、あるいは
（7）それぞれ配列番号54、55、56、50、51、および52である、
ポリペプチド配列を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片はPD-L1、好ましくは特異的にヒトPD-L1と結合する、
抗体またはその抗原結合断片に関する。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、配列番号25、1、9、17、33、41または49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号29、5、13、21、37、45または53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む、抗体または抗原結合断片に関する。好ましくは、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号25、1、9、17、33、41または49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号29、5、13、21、37、45または53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
a．配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
b．配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
c．配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
d．配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
e．配列番号33のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
f．配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、あるいは
g．配列番号49のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号53のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。

一つの実施形態において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、それぞれ配列番号6、7、8、2、3および4のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号5と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号14、15、16、10、11および12のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号13と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号22、23、24、18、19および20のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号21と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号30、31、32、26、27および28のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号29と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号38、39、40、34、35および26のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号37と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号46、47、48、42、43および44のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号45と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一つの実施形態において、本発明は、それぞれ配列番号54、55、56、50、51および52のポリペプチド配列を有する、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号49のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号53のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、キメラのものである抗体またはその抗原結合断片に関する。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトのものである抗体またはその抗原結合断片に関する。

もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、一つの定常領域、好ましくはヒト重鎖IgG4定常領域、より好ましくはS228P突然変異を有するヒト重鎖IgG4定常領域（配列番号75）と、ヒト抗体の軽鎖定常領域、好ましくはヒト軽鎖κ定常領域（配列番号77）を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸に関する。当業者にとって、タンパク質のコード配列はタンパク質のアミノ酸配列を変えないまま、変えられることがあることがわかる（たとえば、置換、削除、挿入など）。そのため、当業者にとって、タンパク質のアミノ酸配列を変えないまま、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を変えることができることがわかる。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。ここの公開に基づき、当業者に既知の任意のベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターを使用することができる。一部の実施形態において、前記ベクターは組換え発現ベクター、たとえばプラスミドである。前記ベクターは通常の機能の発現ベクターの構築に使用される任意のエレメント、たとえばプロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選別マーカーや複製起点を含んでもよい。プロモーターは構成型、誘導型または抑制型のプロモーターでもよい。核酸を細胞に送達することができる多くの発現ベクターは本分野では既知で、本発明で細胞における抗体またはその抗原結合断片の生成に使用することができる。本発明の実施形態によれば、通常のクローン技術または人工遺伝子合成によって組換え発現ベクターを生産することができる。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む宿主細胞に関する。ここに公開された内容に基づき、当業者に既知の任意の宿主細胞を、本発明の抗体またはその抗原結合断片の組換え発現に使用することができる。一部の実施形態において、宿主細胞は大腸菌TG1またはBL21細胞（たとえばscFvまたはFab抗体の発現に使用される）またはCHO-K1細胞（たとえば全長IgG抗体の発現に使用される）である。具体的な実施形態によれば、通常の方法、たとえば化学的形質移入、熱ショックまたはエレクトロポレーションによって組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換させ、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれ、組換え核酸は有効に発現される。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件においてモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から（たとえば上清液から）抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む方法に関する。本分野で既知の通常の技術および本明細書に記載の通常の技術によって細胞から発現された抗体またはその抗原結合断片を収穫し、かつ精製することができる。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物に関する。

本明細書で用いられるように、用語「ベクター」とは、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、相溶剤、油、脂質、小嚢を含む脂質、マイクロスフェア、リポソームカプセル化（liposomal encapsulation）、または本分野で既知の薬物製剤に使用されるほかの物質をいう。もちろん、ベクター、賦形剤または希釈剤の特性は具体的な応用の投与形態によって決まる。本明細書で用いられるように、用語「薬学的に許容されるベクター」とは、本発明に記載の組成物の有効性または本発明に記載の組成物の生物活性に干渉しない無毒物質をいう。具体的な実施形態によれば、ここの公開に基づき、抗体薬物組成物に適する任意の薬学的に許容されるベクターはいずれも本発明に使用することができる。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象においてPD-L1とPD-1および/またはB7.1の結合を遮断する方法、あるいはIFN-γおよびIL-2の分泌を増強させる方法であって、対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。

PD-L1と結合する抗体およびその抗原結合断片の機能活性は本明細書に記載のように本分野で既知の方法によって特徴付けることができる。PD-L1と結合する抗体およびその抗原結合断片を特徴付ける方法は、Biacore、ELISAおよびFACS分析を含む親和力および特異性の測定、PD-L1とPD-1および/またはB7.1の結合に対する遮断を検出する受容体配位子結合測定、PD-L1とPD-1および/またはB7.1の結合に対する遮断によるリンパ球のサイトカインの生成に対する誘導を検出する試験、抗体の抗体依存性細胞傷害（ADCC）および補体依存性細胞傷害（CDC）の活性を検出する細胞毒性測定、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍生長に対する抑制を検出する実験などを含むが、これらに限定されない。具体的な実施形態によれば、PD-L1と結合する抗体およびその抗原結合断片を特徴付ける方法は以下の実施例2〜12に記載のものを含む。

もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象において感染性疾患または移植片対宿主病を治療する方法であって、対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な対象において腫瘍を治療する方法であって、前記対象に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。

本明細書で用いられるように、用語「対象」とは動物、好ましくは哺乳動物である。具体的な実施形態によれば、対象は哺乳動物で、非霊長類（たとえば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモットまたはマウス）または霊長類動物（たとえばサル、チンパンジーまたはヒト）を含む。具体的な実施形態において、前記対象はヒトである。

本発明の実施形態によれば、薬物組成物は治療有効量の抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片を含む。本明細書で用いられるように、用語「治療有効量」とは対象において所要の生物または薬物反応を引き起こす活性成分または構成要素の量をいう。前記目的によって、経験および通常の手段によって治療有効量を決めることができる。

抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片に対し、本明細書で使用される治療有効量とは必要な対象において免疫応答を刺激する抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片の量をいう。抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片に対し、本明細書で使用される治療有効量とは疾患、障害または病状を治療するか、疾患、障害または病状の進展を防止または緩和するか、あるいは免疫疾患、障害または病状に関連する症状を軽減させるか完全に軽減させる、抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片の量もいう。

特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害または病状は過剰増殖性疾患、感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患、または移植片対宿主病である。より具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病状は感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患、または移植片対宿主病である。より具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病状は非悪性過剰増殖性疾患で、アテローム性動脈硬化、良性増殖、良性前立腺肥大を含むが、これらに限定されない。ほかの具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病状は腫瘍または悪性過剰増殖性疾患で、好ましくは固形腫瘍、血液学的癌、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれる腫瘍である。

具体的な実施形態によれば、治療有効量とは1、2、3、4またはそれ以上の以下の効果を実現させるに十分な治療量をいう。（i）治療される疾患、障害または病状の重篤度あるいはそれに関連する症状の軽減または改善、（ii）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の持続時間の減少、（iii）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の進展の予防、（iv）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の回復、（v）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の進展または発作の防止、（vi）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の再発の防止、（vii）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状を有する対象の入院治療の減少、（viii）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状を有する対象の入院時間の減少、（ix）治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状を有する被験者の生存率の増加、（xi）被験者において治療される疾患、障害または病状あるいはそれに関連する症状の抑制または軽減、ならびに/あるいは（xii）もう一つの療法の一つまたは複数の予防または治療の効果の増強または改善である。

治療有効量または投与量は、様々な要素、たとえば治療される疾患、障害または病状、投与形態、標的部位、対象の生理状態（たとえば年齢、体重、健康状況を含む）、対象がヒトか動物か、施用されるほかの薬物、治療が予防的なものか治療的なものかによって変わる。治療投与量が滴定の測定に合うようにすることによって、安全性および有効性を最適化する。

具体的な実施形態によれば、本明細書に記載の組成物は対象へ投与する予想される経路に合うように調製される。たとえば、本明細書に記載の組成物は静脈内、皮下、または筋肉内での投与に合うように調製することができる。

本明細書で用いられるように、用語「治療」、「治療される」および「療法」とはいずれも癌、炎症性疾患、障害または病状、免疫性疾患、障害または病状あるいは感染性疾患、障害または病症に関連する測定可能な物理的パラメーターの少なくとも一つの改善または逆転をいい、それは対象において必ずしも識別可能なわけではないが、対象において識別可能なものである。用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、さらに、疾患、障害または病状を消退させるか、その進展を阻害するか、あるいは少なくともその進展を遅延させることをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病状に関連する一つまたは複数の症状の進展または発作を軽減・予防するか、その持続時間を減少させることをいうが、前記の、疾患、障害または病状は腫瘍、より好ましくは癌である。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病状の再発を予防することをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病状を有する対象の生存率を増加させることをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、対象の疾患、障害または病状をなくすことをいう。

具体的な実施形態によれば、癌、炎症性疾患、障害または病状、免疫性疾患、障害または病状、自己免疫性疾患、障害または病状あるいは感染性疾患、障害または病状の治療に使用される組成物は、もう一つの治療と併用することができ、化学治療、抗CD20 mAb、抗CTLA-4抗体、抗血管新生剤、放射線治療、ほかの免疫腫瘍薬物、標的療法、抗PD -L1抗体またはほかの抗癌薬を含むが、これらに限定されない。

本明細書で用いられるように、前後文で対象に2種類またはそれ以上の療法を施用する用語「併用」とは1種類よりも多い療法を使用することをいう。使用される用語「併用」は、対象に施用する治療の順番を限定しない。たとえば、対象への第一の療法(たとえば、本明細書に記載の組成物)は第二の療法を施用する前（たとえば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間または12週間前）、同時、あるいは後（たとえば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8周または12周後）でもよい。

［実施形態］
また、本発明は以下の非限定的な実施例を提供する。
実施形態1は単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で、
（1）それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28で、
（2）それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4で、
（3）それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12で、
（4）それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20で、
（5）それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36で、
（6）それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44で、あるいは
（7）それぞれ配列番号54、55、56、50、51、および52である、
ポリペプチド配列を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、
ここで、前記の抗体またはその抗原結合断片はPD-L1と結合する。

実施形態2は、実施形態1の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、配列番号25、1、9、17、33、41または49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号29、5、13、21、37、45または53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。

実施形態3は、実施形態2の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、それぞれ配列番号25、1、9、17、33、41または49と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号29、5、13、21、37、45または53と少なくとも80％、好ましくは85％または90％、またはより好ましくは少なくとも95％の相同性を持つポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。

実施形態4は実施形態3の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、
（a）配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（b）配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（c）配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（d）配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（e）配列番号33のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（f）配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、あるいは
（g）配列番号49のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号53のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む。

実施形態5は実施形態1〜4のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記抗体またはその抗原結合断片はキメラのものである。
実施形態6は実施形態1〜4のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記抗体または抗原結合断片はヒトのものである。

実施形態7は実施形態5または6の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、S228P突然変異を有するヒト重鎖IgG4定常領域、およびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含む。

実施形態8は実施形態1〜7のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記抗体または抗原結合断片はヒトPD-L1との結合のK_Dが5×10^-9 Mまたはそれ以下、好ましくは1×10^-9Mまたはそれ以下、あるいは1×10^-10 Mまたはそれ以下で、ここで、K_Dは表面プラスモン共鳴分析（たとえばBiacoreシステム）またはバイオレイヤー干渉測定技術（たとえばOctet RED96システム）によって測定される。

実施形態9は実施形態1〜8のいずれかのモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸である。
実施形態10は実施形態9の単離された核酸を含むベクターである。

実施形態11は実施形態10の核酸を含む宿主細胞である。
実施形態12は薬物組成物で、実施形態1〜8のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む。

実施形態13は必要な対象においてPD-L1とPD-1および/またはB7.1の結合を遮断する方法、あるいはIFN-γおよびIL-2の分泌を増加させる方法で、前記対象に実施形態12の薬物組成物を施用する工程を含む。

実施形態14は必要な対象において感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患または移植片対宿主病を治療する方法で、前記対象に実施形態12の薬物組成物を施用する工程を含む。

実施形態15は実施形態14の方法で、さらに必要な対象に感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患または移植片対宿主病の治療に使用されるほかの葯剤を施用する工程を含む。

実施形態16は必要な対象において過剰増殖性疾患を治療する方法で、前記対象に実施形態12の薬物組成物を施用する工程を含む。
実施形態17は実施形態16の方法で、前記過剰増殖性疾患は非悪性疾患で、好ましくはアテローム性動脈硬化、良性増殖および良性前立腺肥大からなる群から選ばれる。

実施形態18は実施形態16の方法で、前記過剰増殖性疾患は腫瘍、または悪性疾患で、好ましくは、前記腫瘍は、固形腫瘍、血液学的癌、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれる。

実施形態19は実施形態16〜18のいずれかの方法で、さらに必要な対象において前記対象に過剰増殖性疾患の治療に使用されるほかの葯剤を施用する工程を含む。
実施形態20は実施形態1〜8のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法で、所定の条件において前記モノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、前記モノクローナル抗体または抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から抗体または抗原結合断片を回収する工程を含む。

実施形態21は実施形態1〜8のいずれかのモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって薬物組成物を得る工程を含む。

実施形態22は必要な対象での感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患または移植片対宿主病の治療における実施形態1〜8のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。

実施形態23は必要な対象での過剰増殖性疾患、たとえばアテローム性動脈硬化、良性増殖および良性前立腺肥大からなる群から選ばれる非悪性疾患、または固形腫瘍、血液学的癌、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれる腫瘍の治療における実施形態1〜8のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。

実施形態24は必要な対象において感染性疾患、炎症性疾患、免疫性疾患、自己免疫性疾患または移植片対宿主病を治療する薬物組成物の製造における実施形態1〜8のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。

実施形態25は必要な対象において過剰増殖性疾患、たとえばアテローム性動脈硬化、良性増殖および良性前立腺肥大からなる群から選ばれる非悪性疾患、または固形腫瘍、血液学的癌、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれる腫瘍を治療する薬物組成物の製造における実施形態1〜8のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。

［実施例］
本発明の以下の実施例はさらに本発明の性質を説明するためのものである。もちろん、以下の実施例は本発明を限定せず、かつ本発明の範囲は添付された請求の範囲によって決まる。

実施例1 - 抗PD-L1抗体の製造
ヒトPD-L1タンパク質を免疫原として抗PD-L1抗体を製造した。ヒトイムノグロブリン遺伝子組換えマウス技術を完全ヒト抗体の開発と製造に使用することは、最初にAbgenix（XenoマウスおよびMedarex（HuMab「マウス」）; Lonbergら、1994、ネーチャー 368: 856-859; LonbergおよびHuszar、1995、Internal Rev. Immunol. 13:65-93; HardingおよびLonberg,、1995、Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）によって記載された。

PD-L1に高親和力（K_D＜1×10^-9）を有する抗体は初歩の抗体の生産、精製および検証によって得られた。PD-L1に特異的でかつたとえばPD-L2などのほかの免疫チェックポイントと交差反応しない抗体はPD-L1とPD-1およびB7.1の結合を遮断することができる。標準の分子生物学的方法によって生成した抗PD-L1抗体の重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を測定し、そして表1にまとめた。

表1に挙げられた抗PD-L1抗体の重鎖と軽鎖の可変領域は表2にまとめられた核酸配列によってコードされる。

完全ヒト抗PD-L1抗体を製造した。完全ヒト抗PD-L1抗体は高親和力（K_D＜1×10^-9M）でヒトPD-L1の細胞外ドメインに結合し、かつPD-L1とほかの結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断した。抗PD-L1抗体はヒトPD-L2との非特異的な結合を示さなかった。抗PD-L1抗体の生物学的活性は混合リンパ球およびT細胞刺激試験によって評価したところ、これらはIFN-γおよびIL-2サイトカインの分泌を増加した。理論に束縛されず、抗PD-L1抗体はPD-1が介する免疫応答を負に調節するシグナル伝達経路の抑制に使用することができ、そしてこれによって腫瘍特異的免疫応答を増強させるか、あるいは単一の療法として、または抗PD-1モノクローナル抗体またはほかの抗癌薬、たとえば癌免疫治療と併用し、特にPD-L1陽性腫瘍を罹患する患者に使用することができることが期待されている。抗PD-L1抗体は癌や自己免疫性疾患の治療に使用することができる。

実施例2 - 抗PD-L1抗体の製造
（工程1）免疫原AであるPD-L1^ECD-hFcタンパク質（本明細書でPD-L1-hFcとも呼ばれる）の製造
標準の分子生物学クローン技術（SambrookおよびRussell、1989、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、第二版）によって、ヒトPD-L1の細胞外ドメインのコード配列（PD-L1^ECD、配列番号71および78）、配列番号72に相応するアミノ酸Phe19-Thr239を、ヒトIgG Fc断片（hFc）のコード配列とともに、pCpCベクター（Invitrogen、＃V044-50）にクローンした。ポリエチレンイミン（PEI、ポリサイエンス社）およびプラスミドでHEK293細胞（Invitrogen社）に対して一過性形質移入を行い、かつ37℃でFreeStyle 293発現培地（Invitrogen社）において増幅を行った。4日間増幅した後、培地を収集して遠心で細胞成分を除去した。組換えPD-L1^ECD-hFcを含有する培養物上清液に対してタンパク質Aクロマトグラフィー（Mabselect、GEヘルスケア）を行った。UV検出器によって紫外線（UV）吸収（A280nm）をモニタリングし、UV A280nmの吸光度がベースラインのレベルに戻るまで、PBS（pH7.2）でサンプルを洗浄し、この時点で0.1Mグリシン塩酸塩（pH2.5）でPD-L1^ECD-hFc融合タンパク質をタンパク質A親和カラムから溶離させた。4℃で、サンプルをPBSリン酸塩緩衝液（pH7.2）で一晩透析した。透析後、精製されたPD-L1免疫原に0.22ミクロンの無菌フィルターを通させ、分けて-80℃で保存した。

以上のPD-L1^ECD-hFc組換えタンパク質を製造する方法と同様の方法によって、hFcと融合した組換えヒトPD-1細胞外ドメイン（PD-1^ECD）を製造した（Uniprotデータベースのタンパク質Q15116のアミノ酸Leu25-Glu167に相応する）。

タンパク質をビオチン(シグマS3295)と混合してインキュベートすることによって精製されたPD-L1^ECD-hFc (本明細書でPD-L1-hFcとも呼ばれる)をビオチン化させた。
PD-L1^ECD-hFc免疫原を特徴付けるために、サンプルのタンパク質の濃度および純度を測定し、そして免疫原の分子量および生物活性を測定した。

PD-L1^ECD-hFc免疫原の生物活性はELISAによって測定した。組換えPD-1^ECD-hFcタンパク質をPBSで1μg/mLの濃度まで希釈し、そしてELISAマイクロタイタープレートにおいて各ウェルに100μLの希釈されたPD-1^ECD-hFcタンパク質のサンプルを入れ、4℃で一晩インキュベートすることによって組換えタンパク質でプレートを被覆した。その後、37℃でELISAブロッキング溶液（1％のBSAを含有するpH7.4のPBS緩衝液、w/v）によってプレートを2時間ブロッキングした後、ビオチン化されたPD-L1^ECD-hFcタンパク質の連続希釈液または対照タンパク質（ビオチン化された非PD-L1^ECD-hFc）を使用して37℃で1時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）が複合したストレプトアビジン（シグマB2438）を入れ、そしてプレートを室温で30分間インキュベートした。100μLのテトラメチルベンジジン（TMB）を入れ、そしてプレートを室温で15分間インキュベートした。1N塩酸を50μL入れて反応を中止させ、ELISAマイクロプレートリーダーによってOD450nmで検出した。

図1および表3はビオチン化されたPD-L1^ECD-hFcタンパク質と精製されたPD-1^ECD-hFc融合タンパク質の濃度依存性結合を示す。ビオチン化されたPD-L1^ECD-hFcによってPD-1^ECD-hFcと結合したが、PD-L1^ECD配列を含まない対照タンパク質とは結合しなかったことが観察された。

（工程2）免疫原BであるhPD-L1を過剰発現するHEK293細胞の製造
ヒトPD-L1をコードするヌクレオチド配列（配列番号73）をpIRESベクター（Clontech）にサブクローンし、そしてプラスミドを製造した。X-treme GENE HP DNA形質移入試薬(ロシュ、Cat #06 366 236 001)によってプラスミドでHEK293細胞およびCHO-K1細胞（Invitrogen社）に対して一過性形質移入を行い、そして0.5 g/mLの抗生物質および10％(w/w)の牛胎児血清(FBS)を含有するDMEM培地で形質移入体を選択し、2週間継続した。限られた希釈で96ウェル培養プレートに入れ、そしてプレートを37℃、5％(v/v) CO₂で約2週間インキュベートした。選択後、6ウェルプレートでモノクローンを増幅し、フローサイトメトリーによって市販の抗PD-L1抗体（R & D Systems）で増幅されたクローンを選別した。FACS測定でより高い生長速度およびより高い蛍光強度を示したクローンをさらに増幅させ、かつ液体窒素で冷凍保存した。

図2は組み換えhPD-L1タンパク質で形質移入して安定したHEK293細胞のフローサイトメトリーによる検出結果の図を示す。FACS陽性細胞の百分率をhPD-L1タンパク質の発現レベルの指標として表4に示す。

（工程3）免疫原CであるhPD-L1発現構築体の製造
全長のヒトPD-L1タンパク質のコード配列（配列番号73）をpcDNA3.1ベクター（Invitrogen社）にサブクローンし、そして得られたプラスミドを1.0μM金コロイド弾（Bio-RAD）にコーティングした後、Heliosジーンガンのデータシートの説明に従ってHeliosジーンガン（Bio-rad番号165-2431）によって後続の免疫を行った。

（工程4）ハイブリドーマ細胞の融合と抗体の選別
ヒトIg FcはマウスのFc受容体と相互作用しないため、hFcを含有する免疫原がマウスにおいて引き起こす免疫応答が弱く、モノクローナル抗体の製造の効率が低くなる。マウスのゲノムにヒトイムノグロブリン（Ig）可変領域をコードする遺伝子およびラットIg定常領域の遺伝子を導入し、Harbour H2L2遺伝子組換えマウスを作り、マウスにhV-rCを含むキメラIgを含有させたが、マウスIgが発現できなかった（WO2010/070263A1）。Harbour H2L2遺伝子組換えマウスは野生型マウス（たとえばBalb/c）に相当する免疫応答および抗体力価を示すことができる。

（4A部分）免疫原Aで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、マウスを特定の病原体のない（SPF）条件で飼育した。初回の免疫において、50μgの免疫原Aを0.25mLの完全フロイントアジュバント（CFA）とともに各マウスの腹腔に注射した。免疫応答反応を増強させるために、初回の免疫の2週間後、50μgの免疫原Aを0.25mLの不完全フロイントアジュバント（IFA）とともに各マウスの腹腔に注射した後、3週間置いて後続の強化を与えた。免疫の1週間後血液サンプルを収集した。ELISAおよびFACS分析によって血清における抗体力価および特異性を測定し、結果を図3および表5に示す。表5はPD-L1^ECD-hFcで免疫されたマウスの血清が免疫原Aとの異なるレベルの結合を表したことを示す。最高血清希釈度は約一百万であった。ブランク対照は1％（w/w）BSAであった。表5で示されたOD450nm値はELISAによって測定された3回目の強化の7日間後の血清抗体価値である。

（4B部分）免疫原Bで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、マウスをSPF条件で飼育した。X-treme遺伝子HP DNA形質移入試薬（Roche、＃06 366 236 001）によって、全長hPD-L1をコードするpIRESプラスミドでHEK293細胞に形質移入して安定させた（実施例2、工程2を参照する）。T-75培養瓶において細胞を培養した。細胞が90％コンフルエンスになった時、培地を吸い出し、かつDMEM培地（Invitrogen社）で2回洗浄し、そして細胞が培養瓶から分離するまで、37℃で無酵素細胞分解液（Invitrogen社）で処理した。細胞を収集してDMEM培地で2回洗浄し、そして細胞数を検出し、PBS緩衝液（pH7.2）で2×10⁷細胞/mLに調整した。毎回の免疫は、マウスに0.5mLの細胞懸濁液を注射した。初回の免疫の2週間後、強化免疫を与え、そして3週間置いて後続の強化を行った。免疫の1週間後血液サンプルを収集した。フローサイトメトリーによって血清における抗体価および特異性を測定した。2回目の強化後、フローサイトメトリーによって血清抗体価を測定したところ、1:1000であった。

（4C部分）免疫原Cで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、マウスをSPF条件で飼育した。すべてのマウスをHeliosジーンガンで4回免疫させ、毎回の免疫は4ドースであった。1ドースは1μgのcDNAを含有する。初回の免疫の2週間後、強化免疫を与え、そして3週間置いて後続の強化を行った。免疫の1週間後血液サンプルを収集し、ELISAおよびFACSによって血清抗体価を測定した。2回目の強化後、フローサイトメトリーによって血清抗体価を測定したところ、1:1000で、ELISAでは1:10000超であった。

3回目の強化後、FACSによって免疫原A〜Cで免疫されたマウスの血清抗体価を検出すると、通常1:1000に達することが可能である。
上記工程4A〜Cが完成する前、hPD-1に対して特異的に免疫応答するマウスを選んで融合に使用し、かつ腹膜内に100μgの精製されたPD-L1^ECD-hFc（免疫原Aまたは免疫原Cで免疫されたマウス用）またはhPD-1を形質移入して安定したHKE293細胞（免疫原Bで免疫されたマウス用）を注射することによって、最後の強化を行った。5日後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を収集した。NH₄OHを最後濃度が1％（w/w）になるように当該脾臓細胞のサンプルに入れることによって、サンプルにおける赤血球を分解させた。1000rpmでサンプルを遠心し、かつDMEM培地で3回洗浄した。脾臓細胞の生存能力を測定した後、高効率電気融合方法（酵素学方法「Methods in Enzymology」、220巻を参照する）によって生存する脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞SP2/0（ATCC）と5:1の比率で融合させた。

融合した細胞を20％（w/w）FBSおよび1×ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）培地を含有するDMEM培地に再懸濁させ、濃度を10⁵細胞/200μLに調整した。200μLの融合細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、37℃、5％CO₂の条件においてインキュベートした。細胞の融合の14日間後、ハイブリドーマ上清液を収集してELISAおよびAcumen（マイクロプレート細胞試験）によって選別した。37℃、5％CO₂の条件において、ELISA試験でOD450nmが1.0超でかつAcumen試験でMFI値が100超のクローンを10％(w/w)熱不活性化FBSを含有するDMEMの入った24ウェルプレートで増幅させた。3日間培養した後上清液を収集した。抗体のアイソタイプを検出し、かつELISAおよびフローサイトメトリー（実施例3を参照する）によって組換えPD-L1^ECDタンパク質およびPD-L1を発現する細胞に結合する能力を検出した。受容体配位子結合試験によって、ハイブリドーマ上清液のブロッキング活性を確認した（実施例4〜5を参照する）。

24ウェルプレートの選別結果に基づき、ELISA結合試験ではOD450nm値が1.0超で、FACS結合試験ではMFI値が50超でかつ受容体配位子結合試験では抑制率が60％超のクローンを選んでサブクローンした。37℃、5％CO₂の条件において、96ウェルプレートにおいて10％（v/v）FBSを含有するDMEM培地で有限希釈してサブクローンした。10日間培養した後、上清液を収集してELISAおよびAcumenによって初期選別を行った。陽性クローンを24ウェルプレートにおいて増幅し、3日間培養した。上清液を収集し、ELISAおよびFACS結合試験によって結合活性を測定し、かつ受容体配位子結合試験によって生物活性を評価した。選択基準は、ELISAにおけるOD450nm＞1.0で、FACSにおけるMFI値＞50で、かつ受容体配位子結合試験における抑制率＞60％である。37℃、5％CO₂の条件において、選択基準に合ったクローンを10％（w/w）FBS含有DMEM培地で増幅させ、かつハイブリドーマ細胞がその後の抗体の生成と精製に使用できるように液体窒素で冷凍した。

（工程5）リード候補抗体の生産と精製
ハイブリドーマ細胞が生成した抗体濃度は約1〜10μg/mLと低く、抗体濃度の変化が大きい。また、培地における成分およびFBSは分析に干渉する。そのため、小規模（1〜5 mg）の抗体の生産と精製を行う必要がある。

T-75細胞培養瓶において、ハイブリドーマ無血清培地（Invitrogen社）で実施例2（4部分）におけるハイブリドーマ細胞を培養し、かつ3代継代した。ハイブリドーマ細胞の生長状態が良くなったら、細胞を2Lの培養瓶に接種した。各2Lの培養瓶に500mLの生産培地を入れ、細胞密度を10⁵細胞/mLに調整した。培養瓶を37℃の回転インキュベーターに置き、回転数は3回/分であった。14日間ハイブリドーマ細胞を培養した後、上清液を収集し、細胞を除去した。その後、0.45ミクロンのフィルターで上清液をろ過した。その後、培養上清液を精製したか、あるいは-30℃で保存した。

ハイブリドーマ培養上清液に2 mLのGタンパク質カラム（GEヘルスケア）を通させることによってモノクローナル抗体を精製した。まず、PBS緩衝液（pH7.2）でGタンパク質カラムを平衡化した後、ハイブリドーマ培養上清液を3mL/分の一定の流速で平衡化されたGタンパク質カラムに仕込んだ。その後、4倍体積のPBS緩衝液でカラムを洗浄した。その後、溶離緩衝液（0.1M酢酸塩緩衝液、PH2.5）でキメラ抗PD-L1抗体を溶離し、UV検出器によって溶離液のUV吸光度（A280 UV吸収ピーク）をモニタリングした。10％の1.0M Tris-HCL緩衝液を溶離液に入れることによってpH値を中和し、そしてサンプルに0.22ミクロンのフィルターを通させることによってサンプルを無菌ろ過した。無菌ろ過された精製したキメラ抗PD-L1抗体を得た。

UV吸光度（A280/1.4）で精製したキメラ抗PD-L1抗体の濃度を検出し、かつ純度および内毒素のレベルを検出した（Lonzaキット）。分析結果を表6に示す。精製されたキメラ抗PD-L1抗体が有する内毒素の濃度が1.0 EU/mg未満であった。

実施例3 - リード候補抗体の特徴付け
（A部分） ELISAによる抗PD-L1抗体と組換えPD-L1^ECD-hFcタンパク質の結合の検出
ELISAによって実施例2で精製された抗PD-L1抗体と組み換えヒトPD-L1^ECD-hFcタンパク質、カニクイザルPD-L1^ECD-hFcタンパク質およびほかのPD-L1ファミリー関連の免疫チェックポイントタンパク質PD-L2の結合を分析することによって、抗体の特異性を確認した。

実施例2で精製された免疫原A（hPD-L1^ECD-hFcタンパク質）、Uniprotデータベースのタンパク質G7PSE7のアミノ酸Phe19-Thr239に相応するカニクイザルPD-L1の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むカニクイザルPD-L1^ECD-hFcタンパク質（免疫原Aを製造する方法で製造された。実施例2、工程1を参照する。）、およびほかの免疫チェックポイントタンパク質（PD-L2およびNC-Fc）（R&D Systems）をPBSで1μg/mLに希釈した。100μLの希釈された組換えタンパク質を96ウェルプレートの各ウェルに入れた。プレートをプラスチック膜で密封し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）で2回洗浄し、そして室温でブロッキング緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20 + 1％（w/w）BSA）で2時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を吸い取り、100μLの精製された抗PD-L1抗体を各ウェルに入れ、37℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）で3回洗浄した。HRPが複合した二次抗体（シグマ）を各ウェルに入れ、37℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した後、100μLのTMB基質を各ウェルに入れ、プレートを室温で30分間インキュベートした。100μLの停止溶液(0.1N HCl)を各ウェルに入れ、反応を停止させた。ELISAプレートリーダー（384plus SpectraMax、Molecular Devices）によって450nmにおける吸光度を測定した。結果は図4〜6および表7〜9に示す。IgG対照はヒトIgGであった。

(B部分) フローサイトメトリーによる抗PD-L1抗体とPD-L1を発現する細胞の結合の検出
全長ヒトPD-L1をコードするヌクレオチド配列（実施例2、工程2を参照する）を含むpIRESプラスミドでCHO-K1細胞を形質移入して安定させることによって、ヒトPD-L1を安定して発現するCHO-K1細胞（本明細書でCHO-K1-hPD-L1細胞という）を得た。全長カニクイザルPD-L1をコードするヌクレオチド配列を含むpIRESプラスミドでほかのCHO-K1細胞を形質移入して安定させることによって、カニクイザルPD-L1を安定して発現するCHO-K1細胞（本明細書でCHO-K1-cPD-L1細胞という）を得た。CHO-K1-hPD-L1およびCHO-K1-cPD-L1細胞をT-75細胞培養瓶で90％コンフルエンスに増幅した。培地を全部吸い取り、HBSS（ハンクス平衡塩溶液、Invitrogen社から購入）で細胞を2回洗浄した。無酵素細胞分解液（Versene溶液、Invitrogen社から購入）で細胞を処理して収集した。HBSSで細胞を2回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をHBSSで2 × 10⁶細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液に最終濃度が1％になるようにヤギ血清を入れた。細胞を氷の上で30分間ブロッキングした後、HBSSで2回洗浄した。遠心後細胞を収集し、FACS緩衝液（HBSS + 1％BSA、v/v）で2×10⁶細胞/mLに再懸濁させた。その後100μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れた。100μLの実施例2で得られた精製された抗PD-L1抗体を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、氷の上で2時間インキュベートした。FACS緩衝液でサンプルを2回洗浄し、100μLのAlexa 488で標識された二次抗体（Invitrogen社）を96ウェルプレートに入れ、氷の上で1時間インキュベートした。FACS緩衝液でサンプルを3回洗浄し、各ウェルに100μLの固定緩衝液（4％ v/vパラホルムアルデヒド）を入れ、10分間インキュベート。FACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、かつ100μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。FACS Calibur（BD）によって平均蛍光強度（MFI）を検出し、結果は図7〜8および表10〜11に示す。IgG対照はヒトIgGで、表中のデータは細胞群の平均蛍光強度。

（C部分）抗PD-L1抗体の結合親和力と解離定数
Octed RED 96（Fortiebio）によって解離定数を測定した。メーカーによって提供される装置説明書に従って詳細な操作および方法を実施した。つまり、ストレプトアビジンセンサー（SAセンサー、Fortiebio）を親和力の測定に使用した。0.1％（w/w）BSAおよび0.02％（v/v）ツイン20を含有するPBS緩衝液（pH7.4）でPD-L1^ECD-hFc（免疫原A）を10μg/mLに希釈し、かつストレプトアビジンセンサーとともにインキュベートした。30℃で5種類の異なる濃度の抗PD-L1抗体を免疫原Aを担持するストレプトアビジンセンサーとともに3分間インキュベートした。30℃で反応混合物を0.1％（w/w）BSAおよび0.02％（v/v）ツイン20を含有するPBS緩衝液（pH7.4）でさらに5分間インキュベートした。Octet Red 96によってリアルタイムで抗PD-L1抗体と免疫原Aの結合と解離シグナルを記録した。Octetユーザーソフトによって親和力、結合および解離定数を確認し、結果を表12に示す。

実施例4 - 抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断する能力の検出
タンパク質に基づいた受容体配位子結合試験を実施することによって抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断する能力を測定した。

実施例2で製造されたビオチン化された組換えPD-L1^ECD-hFcのように、ビオチン化された組換えPD-1^ECDおよびB7.1 ^ECDタンパク質を製造した。PD-1の細胞外ドメインはUniprotデータベースのタンパク質Q15116のアミノ酸Leu25-Glu167に、B7.1の細胞外ドメインはUniprotデータベースのタンパク質NP_005182のアミノ酸Val35-Asn242に相応する。

PBSで精製されたPD-L1^ECD-hFc（実施例2）を最終濃度が1.0μg/mLになるまで希釈し、100μLの希釈されたPD-L1^ECD-hFcを96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、プラスチック膜で密封し、4℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）でプレートを2回洗浄し、そして室温でブロッキング緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）BSA + 1％ツイン20（w/w））で2時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を吸い出し、50μLの実施例2の抗PD-L1抗体を96ウェルプレートの各ウェルに入れた。100 μLのビオチン化された組み換えPD-1^ECDまたはB7.1^ECDを各ウェルに入れ、混合し、37℃で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）でプレートを3回洗浄した。その後100μLのHRPが複合したストレプトアビジン（シグマ）を各ウェルに入れ、そして37℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、100μLのTMB基質を各ウェルに入れた。室温で30分間インキュベートした後、100μLの停止溶液(0.1N HCl)を入れて反応を停止させた。ELISAプレートリーダー（384plus SpectraMax、Molecular Devices）によってOD450nmにおける吸光度を測定した。結果は、図9〜10に示すように、抗PD-L1抗体がPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断することができることを証明した。

実施例5 - PBMC刺激試験による抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断する能力の検出
（A） T細胞刺激試験による抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断することによるT細胞刺激に対する効果の検出
（工程1） Ficoll勾配による全血から末梢血単核球（PBMC）の単離
1：1の比率でPBSで全血を希釈し、無菌ピペットで慎重にFicoll溶液（GE Healthcare）の上部に入れた。Ficollと希釈された全血の体積比は3：4であった。20℃でサンプルを400gで30分間遠心した。遠心後3層の溶液になり、上層は血漿で、中間の乳白色の層は単核球であった。無菌ピペットで中間層から単核球を収集してそれを新しい遠心管に移した。サンプルの3倍体積のPBSを入れ、サンプルを室温で100gで10分間遠心した。上清液を捨て、リンパ球を10mLのPBS緩衝液で再懸濁させた。PBSでリンパ球を3回洗浄することによって血液における血小板を除去した。その後リンパ球の懸濁液を10％FBSを含有する10mLのRPMI 1640培地(Invitrogen社)に再懸濁させた。

（工程2） PBMC刺激試験
PD-L1のヌクレオチド配列をpIRESプラスミドにサブクローンして全長PD-L1タンパク質をコードする構築体(pIRES-puro-PD-L1)を生成させた。抗CD3（OKT3）（Kipriyanovら、1997、Peds. 10：445-453を参照する）を細胞膜にアンカーさせ、OKT3 scFvをマウスCD8aのC末端（NCBI登録番号：NP-1074579.1のアミノ酸113-220）に融合させ、かつプラスミドpIRES-OS8にサブクローンした（SambrookおよびRussell，Id.を参照する）。実施例2の製造方法によってpIRES-puro-PD-L1およびpIRES-OS8をCHO-K1およびHep3B細胞に共形質移入させることによって、安定した細胞系CHO-K1-PD-L1/OS8およびHep3B-PD-L1/OS8を生成させた。細胞をT細胞に対する刺激に使用した。実験前に、37℃で10μg/mLのマイトマイシンでCHO-K1-PD-L1/OS8およびHep3B-PD-L1/OS8を3時間処理した。

100μLのPBMC（5×10⁴細胞含有）を96ウェルプレートのウェルに入れた後、テスト抗体溶液を96ウェルプレートに入れ、室温で15分間インキュベートした。50μLの5 × 10³CHO-K1-PD-L1/OS8またはHep3B-PD-L1/OS8を各ウェルに入れて37℃、5％ CO₂の条件において72時間培養した。上清液を収集して分析まで-20℃で保存した。

（工程3） ELISAによるインターフェロンγ（IFN-γ）の分泌の検出
メーカーによって提供された使用説明書およびキット試薬に従い、ヒトIFN-γのQuantikine ELISAキット(R&D Systems SIF50)で培養物上清液におけるIFN-γレベルを定量した。つまり、IFN-γのポリクローナル抗体をELISAマイクロプレートに被覆させ、400μLの培養上清液および標準品を各ウェルに入れ、室温で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液でプレートを4回洗浄した後、HRPが複合した抗ヒトIFN-γ抗体を入れ、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、呈色基質を入れ、室温で光を避けて30分間インキュベートし、停止溶液を入れて反応を停止させた。ELISAプレートリーダーによって450nmにおける吸光度を測定し、図11〜12および表13に示された結果から、PBMCリンパ球刺激実験で分析された抗PD-L1抗体がIFN-γの分泌を増加させることができたことが示された。IgG対照はヒトIgGで、表に挙げられた値は培養上清液におけるIFN-γ濃度（pg/mL）である。

実施例6 - 混合リンパ球試験による抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断する能力の検出
（B）混合リンパ球反応による抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合を遮断することによるT細胞刺激に対する影響の検出
(工程1) ヒトCD14+細胞の樹状細胞の単離と培養
メーカーによって提供された説明に従い、Ficoll Paque Plus（GEヘルスケア）によって全血からPBMCを単離した。当該プロトコールは実施例5A、工程1の記載と同様である。

PBMCを10％FBSを含有するRPMI 1640完全培地に再懸濁させ、細胞濃度を1×10⁵細胞/mLに調整した。37℃、5％（v/v）CO₂の条件において、T-75培養瓶で細胞を2時間培養した。培養物上清液および付着していない細胞を新しいT-75培養瓶に移し、37％FBSが補充してある新しいRPMI 1640完全培地を元のT-75培養瓶に添加して37℃および5％（v/v）CO₂の条件において2時間インキュベートした。培養物上清液および付着していない細胞を捨て、10％FBSを含有するRPMI 1640完全培地を壁付着細胞に添加して37℃および5％（v/v）CO₂の条件において18時間培養した。培養物上清液および付着していない細胞を捨て、500U/mLの組換えヒトGM-CSF（PEPROTECH）および500U/mLの組換えヒトインターロイキンIL-4（PEPROTECH）が補充してあるRPMI 1640完全培地を壁付着細胞に添加して4日間培養した。4日間後、GM-CSFおよびIL-4が補充してあるRPMI 1640完全培地で液置換をしてさらに細胞を2日間培養した。その後1μg/mL LPSを含有するRPMI 1640完全培地で液置換をして18時間インキュベートした。その後EDTAを含有するPBSを入れて樹状細胞を収集して300gで5分間遠心した。上清液を吸い出し、さらにPBSで細胞を1回洗浄した。収集されたヒトCD14+樹状細胞をRPMI 1640完全培地に再懸濁させ、細胞計数を行った。

（工程2）ヒトCD4+ T細胞の単離と精製
メーカーによって提供された説明書に従い、MagCellect^TMヒトCD4+ T細胞単離キット（R& D Systems）によってPBMCからヒトCD4+ T細胞を単離および精製した。

（工程3）混合リンパ球反応
96ウェルプレートにおいて異なる健康なボランティア由来の精製されたCD4+細胞を樹状細胞と共培養した。細胞密度を10⁵細胞/80μLに調整した。10⁵の精製されたCD4+ T細胞および2×10⁴の樹状細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、実施例2で精製された精製した抗PD-1抗体をプレートの相応するウェルに入れ、37℃、5％（v/v）CO₂のインキュベーターでプレートをインキュベートした。3日目に上清を収集してIL-2の検出に使用し、5日目にIFNの検出に使用し、サイトカインのレベルを検出した。

（工程4） ELISAによる上清液におけるIFN-γおよびIL-2のレベルの検出
メーカーによって提供された使用説明書およびキット試薬に従い、それぞれヒトIFN-γのQuantikine ELISAキット（R&D Systems SIF50）およびヒトIL-2のQuantikine ELISAキットD2050（R&D Systems S2050）で前の工程で収集された上清液におけるIFN-γおよびIL-2のレベルを定量した。

IL-2の結果は図14、21〜22、25〜26および表14〜19に示し、IL-2レベルが抗PD-L1抗体濃度の上昇につれて増加したことが示された。IgG対照はヒトIgGで、表14〜19に挙げられた値は培養上清液におけるIL-2濃度（pg/mL）である。PBMC供与体0、1、2などは献血者番号をいう。

IFN-γの結果は図13、15〜20、23〜24および表20〜27に示し、IFN-γレベルが抗PD-L1抗体濃度の上昇につれて増加したことが示された。IgG対照はヒトIgGで、表19〜26に挙げられた値は培養上清液におけるIFN-γ濃度（pg/mL）である。

実施例7 - 抗PD-L1抗体の可変領域のアミノ酸配列の検出
全RNAの単離：実施例2で得られたハイブリドーマのサブクローンの上清液を特徴付けた（すなわち、生物活性の検証と測定、実施例3〜5）後、遠心して5×10⁷のハイブリドーマ細胞を収集した。1mLのTrizolを細胞の沈殿に入れ、混合して1.5mL遠心管に移し、室温で5分間インキュベートした。0.2mLのクロロホルムをサンプルに入れて15秒ボルテックスした。2分間静置した後、4℃、12000gで混合物を5分間遠心した。上清液を収集して新しい1.5mL遠心管に移し、0.5mLのイソプロパノールを入れて軽く混合し、室温でサンプルを10分間インキュベートした。4℃、12000gでサンプルを15分間遠心した。上清液を吸い出し、1mLの75％（v/v）エタノールで沈殿物を洗浄した。4℃、12000gで混合物を5分間遠心し、上清液を出して沈殿物を自然乾燥した。DEPCで処理された水を沈殿物に（55℃の水浴において10分間）入れて全RNAを得た。

逆転写とPCR：1μgのRNAおよび逆転写酵素を最終体積が20μLになるように反応混合物に入れ、42℃で混合物を60分間インキュベートした後、70℃で10分間インキュベートすることによって反応を停止させた。1μL cDNA、25 pmol各プライマー、1μL DNAポリメラーゼ、250μmol dNTPおよび緩衝系を含む50μLのPCR反応混合物を調製した。PCRプログラムは以下の通りに設定された。95℃で3分間変性させ、35サイクルの変性（95℃、30秒）、アニーリング（55℃、30秒）および伸長（72℃、35秒）の後、72℃で最後に5分間伸長させることによって、PCR産物を得た。使用された市販の逆転写キットはPrimeScript RT Master Mix（Takara，RR036）、そして市販のQ5ハイフィデリティーポリメラーゼPCRキットはNEB（M0492）から購入された。

クローンと配列決定：アガロースゲル電気泳動によって5μLのPCR産物を検出し、NucleoSpin Gel& PCR精製（Clean-up）キット（MACHEREY-NAGEL、740609）によってアガロースゲルからサンプルを回収した。連結反応：50ngのサンプルに50ngのTベクター、0.5μLのリガーゼおよび1μLの緩衝液を入れ、最終体積が10μLになるように水を補充した。T4 DNAリガーゼ（NEB、M0402）によって16℃で反応混合物を30分間インキュベートした。5μLの連結産物を100μLの感受性細胞（Ecos 101感受性細胞、Yeastern、FYE607）に入れ、氷の上で1分間インキュベートし、42℃で1分間熱ショックさせ、さらに氷の上で1分間インキュベートした。650μLの抗生物質を含まないSOC培地を入れて振とうインキュベーターにおいて37℃、200rpmで30分間インキュベートして細胞を回収した。37℃で200μLの各細菌培養物を抗生物質を含有するLB寒天プレートに塗布し、一晩置いた。翌日に、TベクターのプライマーであるM13FおよびM13RでPCR反応系をセットした。ピペットで細菌集落を取ってPCR反応混合物に浸漬させ、上下に吹いて吸った。半分の反応混合物を100nMアンピシリンを含有するLB寒天プレートに移した。PCR反応後、5μLのPCR産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性サンプルを配列決定および分析に供した(Kabat、1991、「Sequences of proteins of objective interest」、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ)。配列決定結果を表1〜2に示す。

実施例8 - 完全ヒト抗PD-L1抗体の形質転換、発現および精製
（工程1）プラスミドの構築と製造：実施例6に従って抗PD-L1抗体の重鎖と軽鎖可変領域の配列を得た。抗PD-L1抗体の重鎖可変領域の配列をシグナルペプチドおよび突然変異S228Pを有するヒト重鎖IgG4定常領域を含有する発現ベクターにサブクローンした。抗PD-L1抗体の軽鎖可変領域の配列をシグナルペプチドおよびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含有する発現ベクターにサブクローンした。組み換えプラスミドが検証され、そして配列決定によって確認された（配列決定方法は実施例6と同様である）。キット（MACHEREY-NAGEL）によって塩基性分解を行うことによって組換えプラスミドの純度と質量を改善し、0.22μMフィルター（Millpore）でプラスミドをろ過した。精製されたプラスミドを形質移入に使用した。

（工程2）形質移入：37℃、130RPM、8％CO₂（v/v）の条件において、FreeStyle 293培地（Invitrogen社）でHEK293E細胞（Invitrogen社）を培養した。HEK293E細胞を細胞密度が1〜1.5×10 ⁶/mLになるように調整し、形質移入に使用した。10％（v/v）F68（Invitrogen社）をFreeStyle 293培地に最終濃度が0.1％（v/v）になるように入れ、培地Aとした。5 mLの培地Aおよび200μg/mLのPEI（シグマ）を混合して培地Bを得た。5 mLの培地Aおよび100μg/mLの工程1の組み換えプラスミドを混合して培地Cを得た。5分間インキュベートした後、培地Bと培地Cを混合して15分間インキュベートすることによって、混合物Dを得た。PEIが局部に集中しないように、連続に撹拌しながら、10mLの混合物Dをゆっくり100mLのHEK293E細胞に入れた。振とうしながらHEK293E細胞を一晩インキュベートした。翌日に、最終濃度が0.5％（w/v）になるようにペプトンを入れた。約5〜7日目に、抗体の力価を測定した。約6〜7日目に、HEK293E培養物を遠心し（30分間、3500RPM）、上清液を収集して0.22μMフィルターでろ過することによって精製した。

（工程3）抗体の精製：タンパク質Aカラム（GE）を0.1M NaOHで30分間、または5倍ベッド体積の0.5M NaOHで洗浄することによって内毒素を除去した。長期間に使用されていないカラムは1M NaOHで少なくとも1時間浸漬し、内毒素を含まない水で中性pHまで洗浄し、かつ10倍ベッド体積の1％Triton×100で洗浄した。その後、5倍ベッド体積のPBS（PBSリン酸塩緩衝液、pH7.2）で平衡化した。工程2のろ過された上清液をカラムにかけ、そして必要によって流出液を収集した。5倍ベッド体積のPBSでカラムを洗浄した後、5倍ベッド体積の0.1Mグリシン-HCl pH3.0で溶離させた。0.5倍ベッド体積の1M Tris-HCl（NaCl 1.5M的NaCl）pH8.5で抗PD-L1抗体を含有する溶離液を中和した。内毒素の汚染を避けるように、1×PBSでヒト抗PD-L1抗体を4時間透析した。透析後、分光光度法またはキットによって抗PD-L1抗体の濃度を検出し、HPLC-SECによって抗体の純度を検出し、内毒素検出キット（Lonza）によって内毒素の含有量を検出した。完全ヒト抗PD-L1抗体を特徴付け、その結果は図27〜52および表28〜46に示す。図27〜28および表28〜29はELISAによる完全ヒト抗PD-L1抗体とヒトおよびカニクイザルPD-L1-ECDの結合を示す。図29〜30および表30〜31はFACSによる完全ヒト抗PD-L1抗体とヒトおよびカニクイザルPD-L1を発現するCHOK1細胞の結合を示す。図31〜32は完全ヒト抗PD-L1抗体のPD-L1とその結合相手であるPD-1およびB7.1の結合に対する遮断を示す。図33〜42および表32〜41は混合リンパ球反応において完全ヒト抗PD-L1抗体がIFN-γおよびIL-2の放出を増加させたことを示す。図43〜47および表42〜46はT細胞刺激試験において完全ヒト抗PD-L1抗体がIFN-γおよびIL-2の放出を増加させたことを示す。

実施例9 - Biacoreによる結合と解離定数の検出
抗ヒトFc IgGの流動セル1と2への固定化：HBS-EP+（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％P2O、pH 7.4）を流動緩衝液として使用し、固定化指南テンプレートで抗ヒトFc IgGの固定化を行った。SシリーズCM5センサーチップの流動セル1および2を新しく混合された50mmol/L NHSおよび200mmol/L EDCで活性化した。10mMの酢酸ナトリウム(pH 4.5)で希釈された20 μg/mL抗ヒトFc IgGを活性化された流動セル1および2に注入した。1Mのエタノールアミンでほかの有効な連結部位をブロッキングした。

組換えHisで標識されたhPD-L1 ECDタンパク質を50nMに希釈した後、HBS-EP +緩衝液で2倍の段階希釈を4回行った。His-標識のhPD-L1 ECDタンパク質の濃度はそれぞれ0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nMおよび50nMであった。HBS-EP+を流動緩衝液として使用してK_Dを検出した。10 μL/minの流速で各種類の抗体をCM5センサーの流動セル2に応答が230 RUになるように注射した。その後、製造されたHis標識のhPD-L1 ECDタンパク質を30μL/minの流速で流動セル1および2に180秒で注射した。緩衝液の流動を400秒維持して（30μL/分）解離の測定に使用した。表面からテストされる抗体を除去するため、pH 1.5の10mMグリシン-HClを20秒（30μL/分）で注射した。流動セル1を参照流動セルとした。連続に希釈された各濃度のHis-標識のPD-L1^ECDタンパク質に対し、上記工程を繰り返した。Biacore T200評価ソフトによって各抗体のK_D値を評価し、1：1結合モデルでデータをフィットした。結果を表47に示す。

実施例10 - ADCCとCDCのエフェクター機能分析
抗体依存性細胞傷害（ADCC）試験および補体依存性細胞傷害（CDC）試験を行うことによって推測された完全ヒト抗PD-L1抗体のエフェクター機能の欠失を確認した。

ADCC試験に関し、ADCC培地(フェノールレッド無し)でPD-L1を発現するHCC827細胞のサンプルを12.5 × 10⁴細胞/mLの濃度に調整した。40μLの細胞懸濁液（1×10⁴生存細胞）をV底96ウェルプレートの各ウェルに入れた。ADCC培地(フェノールレッド無し)で20μLの抗体を連続希釈して各ウェルに入れ、同じものに3つずつにした。22〜25℃でプレートを30分間インキュベーションした。標的細胞に40μLの安定してFcγRIII158Vを形質移入したNK92細胞を入れるとき、エフェクター細胞と標的細胞の比が1：1になるように、ADCC培地（フェノールレッド無し）で安定してFcγRIII158Vを形質移入したNK92細胞を調整した。その後プレートを37℃で4時間インキュベートした。4時間の培養後、各ウェルに100μLのCytoTox 96キット（Promega）における基質を入れた。最大の細胞分解対照を得るために、2μLの分解溶液(CytoTox-ONETMキット、Promega)を入れ、10分間後100μL のCytoTox 96キットにおける基質を入れた。プレートを室温で10分間インキュベートした後、50μLの停止溶液を各ウェルに入れ、30秒混合した。560/590nmにおける吸光度を検出し、GraphPad Prism 5.0で1％分解値を計算した。図48で示された結果から、HCC827細胞では陽性対照の抗EGFR抗体がADCCを誘導したが、完全ヒト抗PD-L1抗体はHCC827細胞に対してADCC効果がなかったことがわかる。

CDC試験に関し、細胞培地でHCC827細胞を1.25 × 10⁶細胞/mLに調整した。白い平底96ウェルプレートに40μL/ウェルの細胞を入れた。40μL/ウェルの完全ヒト抗PD-L1抗体は、CDC培地で連続希釈し、同じものに2つずつ各ウェルに入れた。プレートをドラフトチャンバーで30分間インキュベートした。市販の精製ヒト補体（Quidel、カタログ番号042637）を20μL/ウェルで細胞を含有するウェルに最終濃度が20％になるように入れた。プレートを37℃で20時間インキュベートした。メーカーによって提供された説明に従い、Celltiter-glo発光細胞生存力キット（Promega、番号G7573）によって細胞活性を検出した。マイクロプレートシェーカーで200の速度でプレートを2分間振とうした後、室温で10分間インキュベートした。Envisionによって発光シグナルを読み取った。データ分析には、GraphPad Prism 5.0によって細胞毒性％を計算した。結果は図49に示されるように、HCC827細胞では陽性対照の抗EGFR抗体がCDCを誘導したが、完全ヒト抗PD-L1抗体はHCC827細胞に対してCDC効果がなかったことがわかる。

実施例11 - 示差走査熱量測定法（DSC）による抗体の熱安定性の測定
サンプル緩衝液で完全ヒト抗PD-L1抗体を1mg/mLに調整し、最終体積は約700μLであった。パラメーターは以下の通りに設定した（VP-DSC）。開始温度は30℃で、最終温度は100℃で、走査速度は50℃/時間で、再走査回数は0で、プレスキャンは恒温で3分間で、ポストスキャンは恒温で0分間で、サイクル後は恒温25℃で、ろ過周期は25秒で、フィードバックモード/ゲインは無しで、細胞補充パラメーターは35℃であった。相応するバッファー-バッファースキャンを引いてからトレースに基線をフィッティングすることによって得られたタンパク質-バッファーサーモグラムを処理した。Origin^TM 7.0ソフトによってサーモグラムで観察された各ピークの頂点におけるTmを記録した。結果を図50に示す。

実施例12 - 抗体の凍結・解凍安定性
完全ヒト抗PD-L1抗体の凍結・解凍安定性は以下のように特徴付けられた。各抗PD-L1抗体の冷凍保存液の100μL等量試料を室温で解凍した。一旦完全に解凍したらサンプルを-80℃の冷蔵庫ですぐ冷凍して-80℃で少なくとも2時間保存した後、室温でまた解凍した。サンプルに対して同様の凍結・解凍サイクルを3回繰り返した。肉眼で沈殿を検査した。3回の冷凍/解凍サイクル後、サンプルから20μLの等量試料を取ってサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析を行った。HPLC-SECによって特徴付け、冷凍/解凍のサイクルの前と後の完全ヒト抗PD-L1抗体の安定性を分析した。図51に示された結果では、3回の冷凍/解凍サイクル後、単量体IgGが検出された各抗PD-L1抗体の95％以上を占めたことが証明された。

実施例13 - 抗体の溶解度
4℃において、遠心ろ過器（Amicon Ultra-0.5mL 30K）で14000 gで10mgのIgGを＞100mg/mLまで濃縮させることによって、完全ヒト抗PD-L1抗体の溶解度を特徴付けた。2mLまたはそれ以上のIgGを遠心ろ過器に入れ、4℃で14000 gで濃縮させた。遠心の設定時間は2分間、3分間、5分間、8分間、15分間および20分間で、毎回20μLの等量サンプルを収集管に入れてNanoDropによってA280濃度を測定した。濃度が100mg/mLに達したら遠心を止めた。HPLC-SECの特徴付けに関し、6μLの濃縮サンプルをHPLC-SECカラムに注射し、ピーク面積に基づいて単量体および多量体の百分率を確認した。図52に示された結果から、検出されたすべての完全ヒト抗PD-L1抗体の溶解度が100mg/mL超で、かつ検出されたすべての抗PD-L1抗体では単量体IgGが95％超であったことが実証された。

本発明を詳細にかつその具体的な実施形態を参照して説明したが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更や修正を加えることができることは、当業者にとって明らかである。

［参考］
Blankら, 2005, 癌免疫療法「Cancer Immunotherapy」, 54:307-314
Bowers NL, Helton ES, Huijbregts RPHら. PLoS Pathog. 2014年3月; 10 (3): e100399
Dong H, Zhu G, Tamada K, Chen L. Nature Med. 1999; 5:1365-1369
Freemanら, 2000, J. Exp. Med., 192:1027-34
HardingとLonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546
Hiranoら, 2005, Cancer Res., 65:1089-96
Kabat、1991、「Sequences of proteins of objective interest」、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ
Kipriyanovら, 1997, Peds. 10:445-453
LonbergとHuszar, 1995, Internal Rev. Immunol. 13:65-93
Lonbergら, 1994, Nature 368: 856-859
SambrookとRussell、1989、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、第2版
Sheng Yao 2013 Nat Rev Drug Discov. 2013 12(2): 130-146
WeinstockとMcDermott, 2015, Ther Adv Urol., 7(6):365-77
Wherry, 2011, Nat. Immunol., 12:492-99
Zippeliusら, 2015, Cancer Immunol Res.; 3(3):236-44
ZouとChen L, 2008, Nat Rev Immunol., 8(6):467-77

Claims

単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28である、ポリペプチド配列を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、
ここで、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はPD-L1と結合する、
単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、
配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
キメラのものであることを特徴とする請求項1または2に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
ヒトのものであることを特徴とする請求項1または2に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
請求項3または4に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、S228P突然変異を有するヒト重鎖IgG4定常領域およびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含む単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
請求項1〜5のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸。
請求項6に記載の単離された核酸を含むベクター。
請求項6に記載の単離された核酸を含む宿主細胞
請求項1〜5のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物。
必要な対象においてPD-L1とPD-1またはB7.1の結合を遮断するか、あるいはIFN-γおよびIL-2の分泌を増加させるために使用する請求項9に記載の薬物組成物。
必要な対象において感染性疾患または移植片対宿主病を治療するために使用する請求項9に記載の薬物組成物。
必要な対象において腫瘍を治療するために使用する薬物組成物であり、ここで、前記腫瘍は、固形腫瘍、血液学的癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌からなる群から選ばれる請求項9に記載の薬物組成物。
請求項1〜5のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件において前記単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、前記単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片を生成させ、かつ前記細胞または細胞培養物から前記単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片を回収する工程を含む方法。
請求項1〜5のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、前記単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得る工程を含む方法。