KR20210005082A - 항-cd40 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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리브젠 바이오파마 코., 엘티디.
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Abstract

작용적 항-CD40 항체 및 CD40 신호전달을 유도함으로써, 면역 반응, 예컨대 수지상 세포 기능을 향상시키기 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 본원에 개시된 항체는 질환, 예컨대 암 및 면역 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항-CD40 항체 및 이의 용도
TNF-수용체 상과의 구성원인 CD40은 항원 제시 세포 상에서 발견되는 공동자극 단백질로서, 다양한 면역 및 염증 반응, 예컨대 T 세포-의존적 면역글로불린 클래스 스위칭(class switching), 기억 B 세포 발달, 및 배아 중심(germinal center) 형성을 매개한다. 상기 단백질은 수지상 세포, B 세포, 및 대식세포를 비롯한 항원 제시 세포에 의해 구성적으로 발현되지만, 또한 내피성 세포, 평활근 세포, 섬유모세포, 및 상피 세포 상에서 발현될 수 있다. CD40는 또한 비-호지킨 및 호지킨 림프종, 골수종, 및 비인두, 방광, 자궁경부, 신장, 및 난소를 포함하는 특정 암종을 포함하는 다양한 종양 세포 상에서 발현된다 (Vonderheide 등, Clin Cancer Res. 2013; 19(5): 1035-1043).
CD40은 CD40 리간드 (CD40L, CD154로도 알려져 있음)에 대한 결합을 통해 면역 반응을 매개한다. 예컨대, T 헬프(help) (TH) 세포 상에서의 CD40과 CD40L과의 결합은 항원 제시 세포를 활성화함으로써, 다양한 다운스트림 사건을 유발한다.
수많은 면역 및 염증 반응에서의 필수적인 역할로 인해, CD40/CD40L 신호전달 경로를 조절할 수 있는 효과적인 조절제를 개발하는 것에 관심이 있다.
발명의 요약
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 인간 CD40에 결합할 수 있고 FcγRIIB를 발현시키는 세포의 존재에서 향상된 작용적 효과를 나타내는 항체의 발견을 기초로 한다. 그와 같은 항체는 CD40/CD40L 신호전달에 의해 매개된 면역 반응을 조절하는데 효과적이고, 그에 의해 본 명세서에서 기재된 것과 같은 암 및 면역 장애의 치료에 유익할 것으로 예상된다.
따라서, 본 개시내용의 일 측면은 인간 CD40에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 한다. 그와 같은 항-CD40 항체는 본원에 기재된 항-CD40 항체 클론 13F1A7, 17C5C2, 19G6D6, 36G7B8, 또는 9F12D9와 동일한 인간 CD40의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 사례에서, 본 항체는 기준 항체와 동일한 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 항체는 기준 항체와 동일한 중쇄 가변 영역 및 동일한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 하기를 포함한다:
(a) 중쇄 가변 영역 (VH)으로서, (i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1) (여기서, X1은 F 또는 Y이고, X2는 N, T, 또는 I이고, X3은 N, T, 또는 I이고, X4는 D, S, 또는 N이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F, N, W, 또는 G이고, X7은 M, I, 또는 L이고, 그리고 X8은 N, D, 또는 H임)로서 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1); (ii) QIRNX1NYX2YAX3YYX4ESLEG (서열번호: 2) (여기서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A임); X1IX2PNNX3X4X5X6YNX7KFRX8 (서열번호: 3) (여기서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y임); 또는 SISPSGGVTYYRDSVKG (서열번호: 4)로서 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2); 및/또는 (iii) YYYDGX1X2DYFDX3 (서열번호: 5) (여기서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N임); RFAY (서열번호: 6); GVITTLVAGDY (서열번호: 7); 또는 PFLGWGGANWIAH (서열번호: 8)로서 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는
(b) 경쇄 가변 영역 (VL)으로서, (i) RSSQSLVYSYGNTYLH (서열번호: 9); SASSSISSNYLH (서열번호: 10); KASQNX1X2X3YLN (서열번호: 11) (여기서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K임); 또는 LASEDISNDLA (서열번호: 12)로 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1); (ii) X1X2SN X3X4S (서열번호: 13) (여기서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A임); NTX1NLX2T (서열번호: 14) (여기서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y임); 또는 FVDRLLD (서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2); 및/또는 (iii) X1Q X2X3X4X5PX6T (서열번호: 16) (여기서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G 또는 S이고, X3은 T, S, 또는 Y이고, X4는 H, S, 또는 K이고, X5는 V, I, 또는 Y이고, 그리고 X6은 W, Y, 또는 P임); 또는 X1QHX2X3RRT (서열번호: 17) (여기서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V임)로서 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
일부 예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 하기를 포함한다:
(i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1)의 HC CDR1로서, X1은 F이고, X2는 N이고, X3은 N이고, X4는 D이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F이고, X7은 M이고, 그리고 X8은 N인, HC CDR1;
(ii) QIRNX1NYX2YAX3YYX4ESLEG (서열번호: 2)의 HC CDR2로서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A인, HC CDR2;
(iii) YYYDGX1X2DYFDX3 (서열번호: 5)의 HC CDR3로서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N인, HC CDR3;
(iv) RSSQSLVYSYGNTYLH (서열번호: 9) 또는 SASSSISSNYLH (서열번호: 10)의 LC CDR1;
(v) X1X2SN X3X4S (서열번호: 13)의 LC CDR2로서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A인, LC CDR2; 및/또는
(vi) X1Q X2X3X4X5PX6T (서열번호: 16)의 LC CDR3으로서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G이고, X3은 T 또는 S이고, X4는 H 또는 S이고, X5는 V 또는 I이고, 그리고 X6은 W 또는 Y인, LC CDR3.
일부 예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 하기를 포함한다:
(i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1)의 HC CDR1로서, X1은 Y이고, X2는 T 또는 I이고, X3은 T 또는 I이고, X4는 D 또는 S이고, X5는 Y이고, X6은 N 또는 W이고, X7은 M 또는 I이고, 그리고 X8은 D 또는 H인, HC CDR1;
(ii) X1IX2PNNX3X4X5X6YNX7KFRX8 (서열번호: 3)의 HC CDR2로서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y인, HC CDR2;
(iii) RFAY (서열번호: 6) 또는 GVITTLVAGDY (서열번호: 7)의 HC CDR3;
(iv) KASQNX1X2X3YLN (서열번호: 11)의 LC CDR1로서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K인, LC CDR1;
(v) NTX1NLX2T (서열번호: 14)의 LC CDR2로서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y인, LC CDR2; 및
(vi) X1QHX2X3RRT (서열번호: 17)의 LC CDR3으로서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V인, LC CDR3.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 인간 CD40을 비-인간 CD40 (예컨대, 사이노몰구스 원숭이 CD40)과 교차반응시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 인간 CD40에 대해 특이적일 수 있다. 일부 예에서, 항-CD40 항체는 세포 표면 상에서 발현된 CD40에 결합할 수 있다. 그와 같은 항체는 작용적일 수 있다 (예컨대, CD40을 발현시키는 면역 세포에서 CD40-매개된 세포 신호전달을 유도할 수 있다).
본원에 기재된 항-CD40 항체 중 임의의 것은 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 사례에서, 상기 항체는 IgG 분자 (예컨대, IgG4 분자)일 수 있는 전장 항체이다. 예컨대, 상기 항체는 그것의 Fc 도메인에서 S228P 아미노산 치환을 갖는 IgG4 분자일 수 있다. 다른 예에서, 상기 항체는 Fab 또는 단일-사슬 항체이다. 본원에 기재된 항-CD40 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 (Fc-FcR 상호작용을 통하지 않고) CD40 및 FcγRIIB 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항-CD40 항체 중 임의의 것을 집합적으로 인코딩하는 단리된 핵산 또는 핵산의 세트를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 또는 핵산의 세트는 1개의 벡터 상에 또는 2개의 벡터 상에, 예컨대, 1 또는 2개의 발현 벡터 상에 위치한다. 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체를 코딩하는 단리된 핵산 또는 핵산의 세트 (예컨대, 발현 벡터와 같은 벡터)를 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 제공된다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항-CD40 항체 중 하나 이상 또는 이 항체를 인코딩하는 핵산 또는 핵산의 세트, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 본원에 또한 기재된 바와 같은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있는 본원에 기재된 항-CD40 항체 중 임의의 것의 유효량을 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 상기 치료가 필요한 대상체는 본원에 기재된 표적 질환, 예컨대, 암 또는 면역 장애를 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 그 위험에 있는 인간 환자일 수 있다.
또한, 본 개시내용은 항-CD40 항체를 생성하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (i) 상기 항-CD40 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 세포 배양으로부터 생성된 상기 항-CD40 항체를 수확하는 단계를 포함한다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 표적 질환 및 장애 중 임의의 것을 치료하는데 사용되는 약제학적 조성물, 본원에 기재된 항-CD40 항체 중 하나 이상 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 표적 질환 및 장애를 치료하는데 사용되는 약제의 제조를 위한 항-CD40 항체 중 임의의 것의 용도가 본 개시내용의 범주 내에 있다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 명세서에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 도면을 참조하는 것으로 더 잘 이해될 수 있는 본 개시내용의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다.
도 1은 FACS 분석에 의해 CHO 세포 상에서 발현된 인간 CD40으로의 결합에서 나타낸 바와 같은 예시적인 항-CD40 항체의 용량 반응을 보여주는 그래프이다.
도 2a-2b는 사이토카인 생성에 의해 입증된 바와 같이 건강한 공여체로부터의 인간 수지상 세포 (DC) (도 2a) 또는 B 세포 (도 2b)의 활성화에서 나타낸 바와 같은 예시적인 항-CD40 항체의 활성을 보여주는 막대 그래프를 포함한다. 도 2a 및 도 2b의 상부 패널은 IL-12의 생성을 보여주는 막대 그래프 및 도 2a의 하부 패널이다.
도 3은 ELISA로 결정시 인간 CD40 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 재조합 키메라 항체의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 4는 FACS로 결정시 세포 인간 CD40에 대해 나타난 바와 같이 키메라 항체의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 5는 ELISA로 결정시 사이노몰구스 원숭이 CD40 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 키메라 항체의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 6a-6b는 용액에서 (도 6a) 또는 인간 FcγRIIB을 발현시키는 CHO 세포의 공-배양에서 (도 6b)에서 항-CD40 항체에 의한 건강한 공여체로부터의 인간 수지상 세포 (DC)의 활성화에서 나타낸 바와 같이 예시적인 항-CD40 항체의 활성을 보여주는 막대 그래프의 세트를 포함한다. 도 6a 및 도 6b에서의 상부 패널은 CD86의 생성을 보여주는 막대 그래프이다. 도 6a 및 도 6b에서의 중간 패널은 IL-12의 생성을 보여주는 막대 그래프이다. 도 6a 및 도 6b에서의 최하부 패널은 IL-8의 생성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7a-7c는 마우스에서 나타낸 바와 같은 키메라 항체의 약동학을 보여주는 그래프의 세트를 포함한다. 각각의 그래프는 수컷 C57BL/6 마우스에 대항 항체의 3 mg/kg IV 용량 (n = 4/시점) 다음에 상이한 키메라 항체의 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 도시한다. 도 7a는 LYV376 (상부 패널) 및 LYV377 (하부 하부)에 대한 데이터를 도시한다. 도 7b는 LYV378 (상부 패널) 및 LYV379 (하부 패널)에 대한 데이터를 도시한다. 도 7c는 LYV391에 대한 데이터를 도시한다.
발명의 상세한 설명
CD40는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 계열의 구성원이다. 수지상 세포, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 흉선 상피, 내피성 세포, 섬유모세포, 및 평활근 세포를 비롯한 수많은 정상 세포 상에서 발현된 48 kDa 세포 표면 당단백질이다 (Elgueta 등, Immunol Rev. 2009). CD40는 또한 B-림프종 세포 상에서 그리고 수많은 고형 종양의 세포 상에서 발현되는 것으로 발혀졌다 (Remer 등, Curr Top Microbiol Immunol. 2014; 405:165-207). 대개의 경우, CD40는 구성적으로 발현되지만; 그러나, 이는 또한 LPS, IL1βp, INF-γ, 및 GM-CSF와 같은 성숙 신호에 의해 항원 제시 세포에서 상향조절될 수 있다 (Ma 등, Semin Immunol . 2009; 21(5): 265-272).
CD40는 관여된 세포 유형에 따라 수많은 다양한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 예컨대, B 세포 상의 CD40 신호전달의 활성화는 B 세포 증식 및 분화, 면역글로불린 생성, 아이소타입 스위칭, 및 B 세포 기억 생성을 자극한다. 비교하자면, 수지상 세포 및 단핵구 상의 CD40 신호전달은 공동자극 분자의 발현 및 염증성 사이토카인 (예컨대, IL-8, IL-12, 및 TNF-α)의 분비를 초래하여, T 림프구의 효율적인 활성화를 제공한다. CD40 활성의 증가는 T-세포 초회감작을 증가시키고, 그리고 CD40-발현 수지상 세포에 대해, Th1 세포 면역 반응의 생성을 돕는 것으로 밝혀졌다.
CD40/CD40L 신호전달 경로는 면역 반응 (예컨대, 수지상 세포의 활성화)을 유발하여, 암 환자에서 항종양 면역 반응을 초래하는데 결정적인 역할을 한다. Gladue 등, Cancer Immunol Immunother (2011) 60:1009-1017. CD40에 결합할 수 있는 항체가 본원에서 제공된다. 그와 같은 항-CD40 항체는 놀랍게도, 특히 FcγRIIB를 발현시키는 세포의 존재에서 수지상 세포 및 B 세포의 활성을 향상시키는 작용적 효과를 나타낸다.
작용적 항-CD40 항체는 CD40의 천연 리간드 (예컨대, CD40L)의 활성을 모방할 수 있고 CD40에 의해 매개된 세포 신호전달을 유발하여 DC 활성화를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 작용적 항-CD40 항체는 CD40/CD40L 신호전달 경로를 통한 면역 반응을 조절하는데 효과적일 것으로 예상됨으로써, 면역 반응을 조절하는데 효과적일 수 있고, 예컨대, 수지상 세포 및 다른 면역 세포의 활성을 향상시킴으로써, 질환 자체 및 암 및 면역 장애의 치료에 유익하다.
CD40에 결합하는 항체
본 개시내용은 임의의 공급원, 예컨대, 인간 및/또는 원숭이 CD40일 수 있는 CD40에 결합하는 항체를 제공한다. 그와 같은 항-CD40 항체 (즉, CD40 항원에 결합하는 항체)은 특정 종의 CD40 (예컨대, 인간 CD40)에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 상이한 종의 CD40 항원과 교차-반응할 수 있다 (예컨대, 인간 및 원숭이 CD40 둘 모두에 결합). 일부 사례에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 세포 표면 CD40, 예컨대, 표면 상에서 CD40을 자연적으로 발현시키는 세포 (예컨대, 수지상 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 유형의 세포) 상에서 발현된 CD40에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 항-CD40 항체는, CD40에 결합시, CD40에 의해 매개된 세포 신호전달을 유도하는 작용적 항체일 수 있다. 본원에 기재된 항-CD40 항체의 작용적 활성은 당해 분야에 알려진 통상적인 방법에 의해 또는 아래의 실시예에서 기재된 검정에 의해 결정될 수 있다.
CD40은 당해 분야에서 잘 알려진 단백질이다. 예컨대, NCBI 유전자은행(GenBank) 기탁 번호 NP_001241.1 및 XP_005569275.1은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD40 항원 각각에 대한 정보를 제공한다. 예시적인 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD40 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 아래에서 제공된다.
인간 CD40 (서열번호: 38):
Figure pct00001
사이노몰구스 원숭이 (마카카 파스시컬라리스) CD40 (서열번호: 39):
Figure pct00002
다른 종으로부터의 CD40 폴리펩타이드는 당해 기술에 공지되어 있고 쿼리로서 인간 서열 또는 사이노몰구스 원숭이 서열을 사용하여 공공연하게 이용가능한 유전자 데이터베이스, 예컨대, 유전자은행으로부터 수득될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 (복수 형태로 교환가능하게 사용되는) 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, 온전한 (즉, 전장) 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라 그의 항원-결합 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (scFv), 그의 돌연변이체, 항체부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 디아바디, 나노바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체의 당화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유결합으로 변형된 항체를 비롯하여 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포괄한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위-부류)를 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있고, 이들 중 몇 개는 하위부류 (아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤 각각으로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성이 잘 알려져 있다.
전형적인 항체 분자는 항원 결합에 일반적으로 관여되는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역" ("FR")으로 알려진 더 보존된 영역과 산재되어 있는 "상보성 결정 영역" ("CDR")으로도 알려진 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL는 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 전형적으로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 예컨대, 모두가 당해 기술에서 잘 알려져 있는 카밧(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의, AbM 정의, 및/또는 컨택(contact) 정의에 의해 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 정확하게 확인될 수 있다. 예컨대, Kabat, E.A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242, Chothia 등, (1989) Nature 342:877; Chothia, C. 등 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani 등 (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)를 참고한다. 또한 hgmp.mrc.ac.uk 및 bioinf.org.uk/abs를 참고한다.
본원에 기재된 항-CD40 항체는, 각각이 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 전장 항체일 수 있다. 대안적으로, 항-CD40 항체는 전장 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 전장 항체의 용어 "항원-결합 단편" 내에 포괄된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 기능성을 유지하는 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 예컨대, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883를 참고한다.
본원에 기재된 항체는 쥣과, 랫트, 인간, 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화된 항체 포함)일 수 있다. 그와 같은 항체는 비-자연 발생이고, 즉, 인간 행동(예컨대, 원하는 항원 또는 이의 단편에 의한 상기 동물의 면역화 또는 항체 라이브러리로부터의 단리)없이 동물에서 생성되지 않을 것이다.
본원에 기재된 항체 중 임의의 것은 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. "단클론성 항체"는 균질한 항체 모집단을 지칭하고, 그리고 "다클론성 항체"는 이종 항체 모집단을 지칭한다. 이들 2개의 용어들은 항체의 공급원 또는 이것이 만들어지는 방식을 제한하지 않는다.
일 예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이들의 항원-결합 단편인 비-인간 (예컨대, 쥣과) 항체의 형태를 지칭한다. 대개, 인간화된 항체는 원하는 특이도, 친화도, 및 수용력을 가지고 있는 마우스, 랫트, 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여체 항체)의 CDR의 잔기에 의해 수령체의 CDR의 잔기가 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체에서도 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하도록 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이되, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것들에 해당하고 FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화된 항체는 최초 항체에 관하여 변경된 하나 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)을 가지며, 이들은 또한 상기 최초 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 지칭된다. 인간화된 항체는 친화도 성숙을 또한 수반할 수 있다.
인간화된 항체의 작제 방법이 또한 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예컨대, Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)을 참고한다. 일 예에서, 모체 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당해 분야에서 알려진 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석을 거친다. 다음으로, 올바른 CDR 구조의 형성에 중요하다고 예상된 프레임워크 아미노산 잔기는 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 확인된다. 병렬적으로, 모체 비-인간 항체의 것들과 상동성인 아미노산 서열을 가지고 있는 인간 VH 및 VL 사슬은 검색 쿼리로서 모체 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 확인된다. 그 다음에 인간 VH 및 VL 수용체 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모체 비-인간 항체 또는 이의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요할 때, CDR 영역과의 상호작용에 중요하다고 예상되는 모체 사슬의 프레임워크 영역 내의 잔기는 인간 수용체 유전자 내의 상응하는 잔기를 치환하는데 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 항체는, 인간 항체로부터 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부 및/또는 경쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 가변 영역의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이들 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 1 종의 포유동물 (예컨대, 마우스, 토끼, 및 랫트와 같은 비-인간 포유동물)로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 인간과 같은 또 다른 포유동물로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 실시될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 상응하는 표적 항원 (예컨대, 인간 CD40 항원) 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당업계에서 잘 이해되는 용어이다. 분자가 대안적인 표적과 반응하는 것보다 특정 표적 항원과 더 자주, 더 빠르게, 더 오랜 기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하면 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체가 다른 서브스턴스에 결합하는 것보다 표적 항원 또는 에피토프에 더 큰 친화도, 결합능으로, 더 쉽게, 및/또는 더 오랜 기간으로 결합한다면 "특이적으로 결합한다". 예컨대, 항원 (CD40) 또는 그에 있는 항원성 에피토프에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 항체는 동일한 항원에서 다른 항원 또는 다른 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합능으로, 더 쉽게, 및/또는 더 오랜 기간으로 이러한 표적 항원에 결합하는 항체이다. 예컨대, 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 아닐 수 있다는 것이 본 정의로 또한 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적인 결합을 (포함할 수 있어도) 반드시 요구하지는 않는다. 일부 예에서, 표적 항원 또는 이의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원에서의 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다 (즉, 유일한 기준선 결합 활성은 종래의 방법에서 검출될 수 있다). 대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 원숭이 대응물에 비해서 인간 CD40 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있거나, (예컨대, 동일한 검정 조건 하에 동일한 검정에서 결정된 경우 다른 것보다 하나의 항원에 적어도 10-배 더 높은 결합 친화도를 갖는) 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 다른 사례에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 인간 및 비-인간 CD40 (예컨대, 원숭이)에 교차-반응할 수 있고, 예컨대, 인간 및 비-인간 CD40에 대한 결합 친화도의 차이는 5-배 미만, 예컨대, 2-배 미만이거나 또는 실질적으로 유사하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체는 표적 항원 (예컨대, CD40) 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 적합한 결합 친화도를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 겉보기 결합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수 (KD)의 역수이다. 본원에 기재된 항-CD40 항체는 표적 항원 또는 항원성 에피토프에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M, 또는 그 미만의 결합 친화도 (KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 해당한다. 제2 항원에 비해 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화도 결합은 제2 항원에 결합하기 위한 KA (또는 수치 KD)보다 제1 항원에 결합하기 위한 더 높은 KA (또는 더 작은 수치 KD)로 표시될 수 있다. 그와 같은 경우에, 항체는 제2 항원 (예컨대, 제2 형태의 동일한 제1 단백질 또는 이의 모방체; 또는 제2 단백질)에 비해 제1 항원 (예컨대, 제1 형태의 제1 단백질 또는 이의 모방체)에 대한 특이도를 갖는다. (예컨대, 특이도 또는 다른 비교를 위한) 결합 친화도의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD40 항체 중 임의의 것은 표적 항원 또는 이의 항원성 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시키기 위해 추가로 친화도 성숙될 수 있다.
결합 친화도 (또는 결합 특이도)는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 분광법 (예컨대, 형광 검정 이용)을 비롯한 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적 조건은 HBS-P 완충액 (10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.005% (v/v) Surfactant P20)이다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질 ([결합된])의 농도는 다음의 방정식에 의해 자유 표적 단백질 ([자유])의 농도에 일반적으로 관련된다:
[결합된] = [유리]/(Kd+[유리])
그럼에도 불구하고 KA를 정확히 결정하는 것이 항상 필요한 것은 아닌데, 예컨대 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정된, KA에 비례하는 친화도의 정량적 측정을 수득하는 것이 때때로 충분하고, 이에 의해 더 높은 친화도가 있는지, 예컨대, 2-배 더 높은지 여부를 결정하는 것과 같이 비교를 위해 사용되어, 친화도의 정성적 측정을 얻거나 또는 기능적 검정에서, 예컨대 시험관내 또는 생체내 검정에서의 활성에 의해 친화도의 추론을 얻을 수 있기 때문이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 작용적 항체는 중쇄 프레임워크 영역에 의해 연결된 중쇄 CDR1 영역 (HC CDR1), 중쇄 CDR2 영역 (HC CDR2), 및 중쇄 CDR3 영역 (HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항-CD40 항체의 HC CDR는 다음의 코어 모티프 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
HC CDR1:
(i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1), 여기서, X1은 F 또는 Y이고, X2는 N, T, 또는 I이고, X3은 N, T, 또는 I이고, X4는 D, S, 또는 N이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F, N, W, 또는 G이고, X7은 M, I, 또는 L이고, 그리고 X8은 N, D, 또는 H이다. 일부 구현예에서, X1은 F이고, X2는 N이고, X3은 N이고, X4는 D이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F이고, X7은 M이고, 그리고 X8은 N이다. 추가 구현예에서, X1은 Y이고, X2는 T 또는 I이고, X3은 T 또는 I이고, X4는 D 또는 S이고, X5는 Y이고, X6은 N 또는 W이고, X7은 M 또는 I이고, 그리고 X8은 D 또는 H이다.
HC CDR2:
(i) QIRNX1NYX2YAX3YYX4ESLEG (서열번호: 2), 여기서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A이다. 일부 구현예에서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A이다.
(ii) X1IX2PX2'X3'X3X4X5X6YX6'X7X7'X7''X8'X8 (서열번호: 41), 여기서, X1은 D, R, 또는 S이고, X2는 N, D, 또는 S이고, X2'는 N 또는 S이고, X3'는 N 또는 G이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I, G 또는 V이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I, K, 또는 Y이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y이다. 일부 구현예에서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X6'는 N 또는 R이고, X7은 Q, E, 또는 D이고, X7'는 K 또는 S이고, X7''는 F 또는 V이고, X8'는 R 또는 K이고, 그리고 X8은 G 또는 Y이다. 일부 구현예에서 HC CDR2는 X1IX2PNNX3X4X5X6YNX7KFRX8 (서열번호: 3)이고, 여기서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y이다. 일부 구현예에서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y이다.
(iii) SISPSGGVTYYRDSVKG (서열번호: 4)
HC CDR3:
(i) YYYDGX1X2DYFDX3 (서열번호: 5), 여기서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N이다. 일부 구현예에서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N이다;
(ii) RFAY (서열번호: 6);
(iii) GVITTLVAGDY (서열번호: 7); 또는
(iv) PFLGWGGANWIAH (서열번호: 8)
본원에 기재된 항-CD40 항체는 경쇄 프레임워크 영역에 의해 연결된 경쇄 CDR1 영역 (LC CDR1), 경쇄 CDR2 영역 (LC CDR2), 및 경쇄 CDR3 영역 (LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 항-CD40 항체의 LC CDR는 다음의 코어 모티프 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
LC CDR1:
(i) RSSQSLVYSYGNTYLH (서열번호: 9)
(ii) SASSSISSNYLH (서열번호: 10)
(iii) X1ASX2X3X4X5LX6 (서열번호: 42), 여기서, X1은 K 또는 L이고, X2는 Q 또는 E이고, X3은 I 또는 L이고, X4는 Y, N, 또는 S이고, X5는 I, K, 또는 N이고, 그리고 X6은 N 또는 A이다. 일부 구현예에서, LC CDR1은 KASQNX1X2X3YLN (서열번호: 11)이고, 여기서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K이다. 일부 구현예에서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K이다. 일부 구현예에서, LC CDR1은 (iv) LASEDISNDLA (서열번호: 12)이다.
LC CDR2:
X1X2X3X4X5X6X7 (서열번호: 43), 여기서, X1은 N, R, 또는 F이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 S, N, 또는 D이고, X4는 N 또는 R이고, X5는 R 또는 L이고, X6은 F, A, Q, Y, 또는 L이고, 그리고 X7은 S, T, 또는 D이다. 일부 구현예에서, LC CDR2는 하기이다:
(i) X1X2SN X3X4S (서열번호: 13), 여기서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A이다. 일부 구현예에서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A이다.
(ii) NTX1NLX2T (서열번호: 14), 여기서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y이다. 일부 구현예에서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y이다.
(iii) FVDRLLD (서열번호: 15).
LC CDR3:
(i) X1Q X2X3X4X5PX6T (서열번호: 16), 여기서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G 또는 S이고, X3은 T, S, 또는 Y이고, X4는 H, S, 또는 K이고, X5는 V, I, 또는 Y이고, 그리고 X6은 W, Y, 또는 P이다. 일부 구현예에서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G이고, X3은 T 또는 S이고, X4는 H 또는 S이고, X5는 V 또는 I이고, 그리고 X6은 W 또는 Y이다.
(ii) X1QHX2X3RRT (서열번호: 17), 여기서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V이다. 일부 구현예에서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V이다.
수많은 예시적인 항-CD40 항체는 아래에 제공된다 (CDR는 볼드체이다).
Figure pct00003
Figure pct00004
예시적인 항체 클론의 VH 및 VL 사슬의 서열 정렬은 상기에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD49 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체 중 임의의 것 (예컨대, 19G6D6 (LYV376), 13F1A7(LYV377), 9F12D9(LYV378), 17C5C2(LYV379), 및 36G7B8(LYV391)과 동일한 CD40 폴리펩타이드의 에피토프에 결합하거나 또는 CD40 항원에 대한 결합으로부터의 예시적인 항체에 대해 완전하다.
"에피토프"는 항체에 의해 인식되고 결합된 표적 항원 상의 부위를 지칭한다. 상기 부위는 전적으로 아미노산 성분으로 구성될 수 있고, 전적으로 단백질 아미노산 (예컨대, 글리코실 모이어티)의 화학 변형으로 구성될 수 있거나, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 중첩 에피토프는 적어도 하나의 공통 아미노산 잔기를 포함한다. 에피토프는 선형일 수 있고, 그 길이는 전형적으로 6-15 개의 아미노산이다. 대안적으로, 에피토프는 형태적일 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프는 통상적인 기술, 예컨대, 에피토프 맵핑 방법 (예컨대, 아래의 설명을 참고한다)에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 예시적인 항체와 정확히 동일한 에피토프 또는 실질적으로 중첩 에피토프 (예컨대, 3개 미만의 비-중첩 아미노산 잔기, 2개 미만의 비-중첩 아미노산 잔기, 또는 단지 1개의 비-중첩 아미노산 잔기 함유)에 결합할 수 있다. 2개의 항체가 동족 항원에 대한 결합으로부터 서로 경쟁하는지 여부는 당해 분야에 잘 알려져 있는 경쟁 검정에 의해 결정될 수 있다.
Figure pct00005
일부 예에서, 항-CD40 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체와 동일한 VH 및/또는 VL CDR을 포함한다. 동일한 VH 및/또는 VL CDR을 갖는 2개의 항체는, 그것의 CDR이 동일한 접근법 (예컨대, 당해 분야에서 알려진 바와 같은 카밧(Kabat) 접근법 또는 초티아(Chothia) 접근법)에 의해 결정될 때 동일하다는 것을 의미한다. 그와 같은 항-CD40 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체와 비교하여 동일한 VH, 동일한 VL, 또는 둘 모두를 가질 수 있다.
또한 본 명세서에서 개시된 바와 같은 예시적인 항-CD40 항체 중 임의의 것의 기능적 변이체가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 그와 같은 기능적 변이체는 구조적으로 그리고 기능적으로 예시적인 항체와 실질적으로 유사하다. 기능적 변이체는 예시적인 항체와 실질적으로 동일한 VH 및 VL CDR을 포함한다. 예컨대, 항체의 총 CDR 영역에서 단지 최대 5개 (예컨대, 4, 3, 2, 또는 1개)의 아미노산 잔기 변동을 포함할 수 있고 (예컨대, 동일한 차수의 KD 값을 갖는) 실질적으로 유사한 친화도로 CD40의 동일한 에피토프에 결합한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 아미노산 잔기 변동은 보존적 아미노산 잔기 치환이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 치환이 행해진 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특성을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 당업자에게 알려진 폴리펩타이드 서열을 변경하는 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 것은 이러한 방법이 모아있는 참조문헌, 예컨대 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook 등, eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York에서 발견된다. 아미노산의 보존적 치환은 다음의 그룹: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D 내의 아미노산 중에서 행해진 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD40 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체의 VH CDR과 비교하여, 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 80% (예컨대, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항-CD40 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체로서 VL CDR과 비교하여, 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 80% (예컨대, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다.
2개 아미노산 서열의 "동일성 퍼센트"는 Karlin 및 Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 그와 같은 알고리즘은 Altschul 등 J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 편입된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3으로 수행되어, 관심 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 갭이 2개의 서열 사이에 존재할 때, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체 중 임의의 것의 중쇄는 중쇄 불변 영역 (CH) 또는 이의 부분 (예컨대, CH1, CH2, CH3, 또는 이들의 조합)을 추가로 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 임의의 적합한 기원, 예컨대, 인간, 마우스, 랫트, 또는 토끼의 것일 수 있다. 일 구체적인 예에서, 중쇄 불변 영역은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 IgG 서브패밀리의 인간 IgG (감마 중쇄)로부터의 것이다.
일 예에서, 상기 불변 영역은 IgG4와 같은 인간 Ig 분자로부터의 것이고, 그의 예시적인 아미노산 서열은 아래에 제공된다 (서열번호: 40; S228는 볼드체임):
Figure pct00006
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는, 항체가 Fc 수용체, 예컨대, FcγRIIB (CD32B)에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖도록 야생형 대응물과 비교하여 돌연변이된 Fc 영역을 함유할 수 있다. 그와 같은 항체는 FcγRIIB-발현 세포와 효율적으로 결합하여, 치료적 효과를 향상시킬 수 있다. 예컨대, 항-CD40 항체는 IgG4 분자 (예컨대, 서열번호: 40)로부터의 Fc 영역을 포함할 수 있고, 이는 표시된 위치 (볼드체 및 밑줄; S228P)에서 S/P 치환을 함유할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체의 중쇄 불변 영역은 단일 도메인 (예컨대, CH1, CH2, 또는 CH3) 또는 단일 도메인 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다.
필요할 때, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체는 변형된 불변 영역을 포함할 수 있다. 예컨대, 면역학적으로 불활성인이고, 예컨대, 보체 매개된 분해를 유발하지 않거나, 또는 항체-의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않는 변형된 불변 영역을 포함할 수 있다. ADCC 활성은 미국 특허 번호 5,500,362에 개시된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 불변 영역은 Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다.
본원에 기재된 항-CD40 항체 중 임의의 것은 당업계에서 알려진 임의의 CL일 수 있는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 예에서, CL은 카파 경쇄이다. 다른 예에서, CL은 람다 경쇄이다.
항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 그 예는 IMGT 데이터베이스 (www.imgt.org)에서 또는 www.vbase2.org/vbstat.php.에 제공된 것들이고, 이 둘 모두는 본원에 참고로 편입되어 있다.
일부 구현예에서, 항-CD40 항체는 (Fc-FcR 상호작용을 통해서는 아니며) CD40 및 FcγRIIB 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다. 그와 같은 이중특이적 항체는 제1 항원-결합 영역 및 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있되, 이들 각각은 VH/VL 쌍을 포함할 수 있다. 제1 항원-결합 영역은 CD40에 결합하는 반면, 제2 항원-결합 영역은 FcγRIIB에 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체 중 임의의 것으로부터 유래된 VH 및 VL 영역 및 인간 면역글로불린으로부터의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 수많은 예가 아래에서 제공된다.
키메라 항체: 인간 IgG4SP에서 LYV376 = 19G6D6의 HC
Figure pct00007
(서열번호: 28)
키메라 항체: 인간 카파에서 LYV376 = 19G6D6의 LC
Figure pct00008
Figure pct00009
(서열번호: 29)
키메라 항체: 인간 IgG4SP에서 LYV377 = 13F1A7의 HC
Figure pct00010
Figure pct00011
(서열번호: 30)
키메라 항체: 인간 카파에서 LYV377 = 13F1A7의 LC
Figure pct00012
(서열번호: 31)
키메라 항체: 인간 IgG4S에서 LYV378 = 9F12D8의 HC
Figure pct00013
Figure pct00014
(서열번호: 32)
키메라 항체: 인간 카파에서 LYV378 = 9F12D8의 LC
Figure pct00015
(서열번호: 33)
키메라 항체: 인간 IgG4SP에서 LYV379 = 17C5C2의 HC
Figure pct00016
Figure pct00017
(서열번호: 34)
키메라 항체: 인간 카파에서 LYV379 = 17C5C2의 LC
Figure pct00018
(서열번호: 35)
키메라 항체: hG4SP에서 LYV391 = 36G7B8의 HC
Figure pct00019
Figure pct00020
(서열번호: 36)
키메라 항체: 인간 카파에서 LYV391 = 36G7B8의 LC
Figure pct00021
(서열번호: 37)
항-CD40 항체의 제조
본원에 기재된 바와 같은 CD40에 결합할 수 있는 항체는 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예컨대, Harlow 및 Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York을 참고한다.
일부 구현예에서, 표적 항원에 특이적인 항체 (예컨대, CD40 또는 이의 단편)은 종래의 하이브리도마 기술에 의해 만들어질 수 있다. KLH와 같은 운반 단백질에 선택적으로 커플링된 전장 표적 항원 또는 이의 단편은 그 항원에의 항체 결합을 생성하기 위해 숙주 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 숙주 동물의 면역화의 경로 및 스케줄은 일반적으로 본원에 추가로 기재된 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립된 및 종래의 기술과 조화된다. 마우스, 인간화된, 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당해 기술에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 그로부터 인간 또는 항체 생산 세포를 포함하는 임의의 포유동물 대상체가 인간 하이브리도마 세포주를 비롯해서 포유동물의 생산을 위한 기반으로서 작용하도록 조작될 수 있다고 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물은, 본원에 기재된 것을 비롯하여 면역원의 양으로 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족부내, 및/또는 진피내로 접종된다.
하이브리도마는 Kohler, B. 및 Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하여 또는 Buck, D. W., 등, In Vitro, 18:377-381 (1982)에 의해 변형된 바와 같이 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 the Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA로부터의 것들을 비제한적으로 포함하는 이용가능한 골수종 계통이 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 푸소겐(fusogen)을 사용하여 또는 당업자에게 잘 알려진 전기 수단에 의해 골수종 세포 및 림프양 세포 융합을 수반한다. 융합 후, 상기 세포는 융합 배지로부터 분리되고 선택적 성장 배지, 예컨대 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장되어, 미혼성화된 모체 세포를 제거한다. 혈청과 함께 또는 혈청없이 보충된 본원에 기재된 배지 중 임의의 것은 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화된 B 세포는 본원에 기재된 항-CD40 단클론성 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마는, 원한다면, 팽창되고 서브클로닝되며, 상청액은 종래의 면역검정 절차 (예컨대, 방사선면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대하여 분석된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 CD40 활성을 향상시킬 수 있는 단클론성 항체를 생산하는 모체 하이브리도마의 자손 세포, 모든 유도체를 포괄한다. 그와 같은 항체를 생산하는 하이브리도마는 알려진 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내 성장될 수 있다. 단클론성 항체는, 원한다면, 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 바람직하지 않은 활성은, 존재할 경우, 예컨대, 고상에 부착된 면역원으로 만들어진 흡착제 상에 제제를 러닝(running)시키고 원하는 항체를 상기 면역원 밖으로 용출 또는 방출함으로써 제거될 수 있다. 이중작용성 또는 유도화제, 예컨대 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여 면역화되어야 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 열쇠구멍 삿갓조개헤모시아닌, 혈청 알부민, 소과 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 표적 항원 또는 단편으로 숙주 동물의 면역화는 항체 (예컨대, 단클론성 항체)의 모집단을 산출할 수 있다.
원한다면, (예컨대, 하이브리도마에 의해 생산된) 관심의 (단클론성 또는 다클론성) 항체가 서열분석될 수 있고 그 다음에 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터에 클로닝될 수 있다. 관심의 항체를 인코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터 내에 유지될 수 있고 그 다음에 상기 숙주 세포는 미래 사용을 위하여 팽창 및 냉동될 수 있다. 대안으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체를 "인간화"하기 위해 또는 항체의 친화도 (친화도 성숙), 또는 다른 특성을 개선하기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예컨대, 불변 영역은 항체가 인간에 있어서 임상시험 및 치료에서 사용되면 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역을 더욱 닮도록 조작될 수 있다. 표적 항원에 대한 더 큰 친화도 및 CD40의 활성 향상에서 더 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전자적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 변화가 항체에 실시될 수 있고 표적 항원에 대한 그것의 결합 특이도를 여전히 유지할 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
다른 구현예에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 구입가능한 마우스를 사용함으로써 수득될 수 있다. 더 바람직한 (예컨대, 완전 인간 항체) 또는 더 강력한 면역 반응을 생산하도록 설계되는 형질전환 동물은 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성에 사용될 수 있다. 그와 같은 기술의 예는 Amgen, Inc. (Fremont, Calif.)로부터 XenomouseTM 및 Medarex, Inc. (Princeton, N.J.)로부터 HuMAb-MouseTM 및 TC MouseTM이다. 또 다른 대안으로, 항체는 파아지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합으로 만들어질 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 Winter 등, (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455를 참고한다. 대안적으로, 파아지 디스플레이 기술 (McCafferty 등, (1990) Nature 348:552-553)은, 미면역화된 공여체로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, 시험관내 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원에 결합할 수 있는 항체는 통상적인 실시를 통해 적합한 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 라이브러리는 통상적인 스크리닝 공정을 통해 표적 항원 (예컨대, CD40)에 결합하는 단백질을 확인하는데 사용될 수 있다. 선택 공정에서, 폴리펩타이드 구성요소는 표적 항원 또는 이의 단편으로 탐색되고, 상기 폴리펩타이드 구성요소가 표적에 결합하면, 항체 라이브러리 구성원은 전형적으로 지지체 상의 체류에 의해 확인된다. 체류된 디스플레이 라이브러리 구성원은 지지체로부터 회복되고 분석된다. 분석은 유사 또는 비유사 조건 하에서 증폭 및 후속적인 선택을 포함할 수 있다. 예컨대, 양성 및 음성 선택은 교대될 수 있다. 분석은 또한 폴리펩타이드 구성요소의 아미노산 서열의 결정 및 상세한 특성규명을 위한 폴리펩타이드 구성요소의 정제를 포함할 수 있다.
파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 또는 포유동물 디스플레이 기술을 비롯하여 본원에 기재된 표적 항원에 결합할 수 있는 항체를 확인 및 단리시키기 위한 당해 분야에서 알려진 수많은 통상적인 방법이 있다.
온전한 항체 (전장 항체)의 항원-결합 단편은 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예컨대, F(ab')2 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지 감소에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편 및, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있다.
유전자적으로 조작된 항체, 예컨대 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일-사슬 항체, 및 이중특이적 항체는 예컨대, 종래의 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다. 일 예에서, 표적 항원에 특이적인 단클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예컨대, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 것에 의해) 쉽게 단리 및 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 그와 같은 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 하나 이상의 발현 벡터에 배치될 수 있고, 그 다음 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다. 예컨대, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 그 다음에 상기 DNA는 예컨대, 상동성 쥣과 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 코딩 서열을 치환함으로써, Morrison 등, (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 또는 면역글로불린 코딩 서열 모두 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드를 위한 코딩 서열의 일부에 공유적으로 결합함으로써 변형될 수 있다. 그 방식에서, 표적 항원의 결합 특이도를 갖는 유전자적으로 조작된 항체, 예컨대 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체;가 제조될 수 있다.
"키메라 항체"의 생산을 위하여 개발된 기술이 당해 기술에 널리 알려져 있다. 예컨대, Morrison 등 (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81, 6851; Neuberger 등 (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda 등 (1984) Nature 314:452를 참고한다.
인간화된 항체의 작제 방법이 또한 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예컨대, Queen 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 86:10029-10033 (1989)를 참고한다. 일 예에서, 모체 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당해 분야에서 알려진 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석을 거친다. 다음으로, 올바른 CDR 구조의 형성에 중요하다고 예상된 프레임워크 아미노산 잔기가 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 확인된다. 병렬적으로, 모체 비-인간 항체의 것들과 상동성인 아미노산 서열을 가지고 있는 인간 VH 및 VL 사슬은 검색 쿼리로서 모체 VH 및 VL 서열을 사용하는 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 확인된다. 그 다음에 인간 VH 및 VL 수용체 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모체 비-인간 항체 또는 이의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요할 때, CDR 영역과 상호작용에 중요하다고 예상되는 모체 사슬의 프레임워크 영역 내의 잔기 (상기 설명을 참고한다)은 인간 수용체 유전자에서 상응하는 잔기를 치환하는데 사용될 수 있다.
단일-사슬 항체는 중쇄 가변 영역에 대하여 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 경쇄 가변 영역에 대하여 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결합시킴으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게, 가요성 링커는 2개의 가변 영역 사이에 편입된다. 대안적으로, 단일 사슬 항체의 생산에 대하여 기재된 기술 (미국 특허 번호 4,946,778 및 4,704,692)는 파아지 또는 효모 scFv 라이브러리를 생산하기 위해 순응될 수 있고 CD40에 특이적인 scFv 클론은 통상적인 절차에 따라 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 양성 클론은 CD40 활성을 향상시키는 것들을 확인하기 위해 추가 스크리닝을 거칠 수 있다.
당업계에서 알려진 그리고 본원에 기재된 방법에 따라 수득된 항체는 당해 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 특성규명될 수 있다. 예컨대, 하나의 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 즉 "에피토프 맵핑"이다. 예컨대, Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 해결, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩타이드-기반 검정을 비롯하여 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특성규명하기 위한 당해 분야에서 알려진 많은 방법이 있다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 에피토프는 선형 에피토프, 즉, 아미노산의 단일 스트레치에 함유될 수 있거나, 또는 단일 스트레치 (일차 구조의 선형 서열)에 반드시 함유되지 않을 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이 (예컨대, 적어도 4-6개의 아미노산 길이)의 펩타이드가 단리될 수 있거나 또는 (예컨대, 재조합으로) 합성될 수 있고 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩타이드를 사용하고 상기 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라, 표적 항원을 인코딩하는 열린 해독틀(open reading frame)은 무작위로 또는 특이적 유전 작제화에 의해 단편화되고 시험되는 항체와 항원의 표현된 단편의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예컨대, 방사성 아미노산의 존재 하에서, PCR에 의해 생산될 수 있고 그 다음 시험관내 단백질에 전사 및 번역될 수 있다. 그 다음에, 방사선활성 표지된 항원 단편에의 항체 결합은 면역침강 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파아지 입자의 표면 상에 표시된 랜덤 펩타이드 서열의 큰 라이브러리 (파아지 라이브러리)를 사용함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩타이드 단편의 정의된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에의 결합에 대하여 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 교환 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 에피토프 결합에 요구된, 충분한, 및/또는 필요한 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대, 도메인 교환 실험은 CD40의 다양한 단편이 밀접하게 관련되었으나 항원성으로 구별되는 단백질 (예컨대 종양 괴사 인자 수용체 계열의 또 다른 구성원)으로부터의 서열로 대체된 (교환된) 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이체 CD40에의 항체 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합한다고 알려진 다른 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 예에서, 항-CD40 항체는 아래에 예시된 바와 같은 재조합 기술에 의해 제조된다.
본 명세서에서 기재된 바와 같은 항-CD40 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 하나의 발현 벡터에 클로닝될 수 있으며, 각각의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 프로모터에 동작가능한 연결된다. 일 예에서, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 각각의 뉴클레오타이드 서열은 구별되는 프롬프터에 동작가능하게 연결된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단일 프로모터와 동작가능한 연결일 수 있어서, 이로써 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 동일한 프로모터로부터 발현된다. 필요할 때, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)는 중쇄 및 경쇄 인코딩 서열 사이에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 2개의 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 2개의 벡터에 클로닝되고, 이는 동일한 또는 상이한 세포 내로 도입될 수 있다. 2개의 사슬이 상이한 세포에서 발현될 때, 이들 각각은 그러한 것을 발현시키는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 허용하는 적당한 조건 하에서 혼합 및 인큐베이션될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 적합한 프로모터와 동작가능하게 연결된 적합한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 예컨대, 뉴클레오타이드 서열 및 벡터는 적당한 조건 하에서 제한 효소와 접촉되어, 서로 짝짓기할 수 있는 각각의 분자 상에서 상보성 단부를 창출할 수 있고 리가제와 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 유전자의 말단에 결찰될 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터에서 특정 제한 부위에 해당하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체를 생산하는데 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 좌우될 것이다.
다양한 프로모터가 사이토메갈로바이러스 (CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR 예컨대 루 육종( Rous sarcoma) 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, E. 콜리 lac UV5 프로모터, 및 단순 포진 tk 바이러스 프로모터를 비제한적으로 포함하는, 본원에 기재된 항체의 발현에 사용될 수 있다.
조절가능 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 조절가능 프로모터는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터 전사를 조절하기 위해 전사 조절제로서 E. 콜리로부터 lac 억제인자를 사용하는 것들 (Brown, M. 등, Cell, 49:603-612 (1987)), 테트라사이클린 억제인자 (tetR)을 사용하는 것들 (Gossen, M., 및 Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. 등, Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995))를 포함한다. 다른 시스템은 FK506 이량체, VP16 또는 p65 사용 아스트라디올, RU486, 디페놀 무리슬레론, 또는 라파마이신을 포함한다. 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad로부터 이용가능하다.
오페론과 억제인자(repressor)를 포함하는 조절가능 프로모터는 사용될 수 있다. 일 구현예에서, E. 콜리로부터 lac 억제인자는, tetR-포유동물 세포 전사 활성제 융합 단백질인 tTa (tetR-VP 16)을 창출하는 전사 활성제 (VP 16)를 갖는 테트라사이클린 억제인자 (tetR)와, 포유동물 세포에서 유전자 발현을 제어하도록 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 창출하는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 주요 전-초기 프로모터로부터 유래된 tetO-보유 최소 프로모터를 조합시킨 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터 (M. Brown 등, Cell, 49:603-612 (1987); Gossen and Bujard (1992); M. Gossen 등, Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))로부터 전사를 조절하는 전사 조절제로서 기능할 수 있다. 일 구현예에서, 테트라사이클린 유도성 스위치가 사용된다. tetR-포유동물 세포 전사 인자 융합 유도체 보다는 테트라사이클린 억제인자 (tetR) 단독이 강력한 트랜스-조절제로서 기능할 수 있어서, 테트라사이클린 오퍼레이터가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소에 대하여 적절하게 다운스트림 자리잡은 경우 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있다 (Yao 등, Human Gene Therapy, 10(16):1392-1399 (2003)). 이러한 테트라사이클린 유도성 스위치의 하나의 특정 이점은 그것의 조절가능 효과를 달성하기 위해 일부 사례에서 세포에 독성일 수 있는 테트라사이클린 억제인자-포유동물 세포 교차활성인자 또는 억제인자 융합 단백질의 사용을 요구하지 않는다는 것이다 (Gossen 등, Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
추가적으로, 벡터는 예컨대 다음의 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 선택가능한 마커 유전자, 예컨대 포유동물 세포에서 안정한 또는 일시적인 감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 전사의 높은 수준을 위한 인간 CMV의 전초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터 전사 종결 및 RNA 처리 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제의 기원 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRESes), 다용도 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 적합한 벡터, 및 이식유전자를 함유하는 벡터의 생산 방법이 당업계에서 잘 알려져 있고 이용가능하다.
본원에 기재된 방법을 실시하는데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 비제한적으로 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 항체의 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예컨대, 발현 벡터)는 항체 생산을 위하여 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 이의 임의의 폴리펩타이드 사슬의 발현을 위하여 적당한 조건 하에서 배양될 수 있다. 그와 같은 항체 또는 이의 폴리펩타이드 사슬은 종래의 방법, 예컨대, 친화도 정제를 통해 (예컨대, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 배양 세포에 의해 회복될 수 있다. 필요하면, 항체의 폴리펩타이드 사슬은 항체의 생성을 허용하는 적합한 기간 동안 적당한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 제조 방법은, 본원에 또한 기재된 바와 같이, 항-CD40 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 재조합 발현 벡터를 수반한다. 재조합 발현 벡터는 종래의 방법, 예컨대, 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예컨대, dhfr-CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는, 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회복될 수 있는 항체를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현을 허용하는 적당한 조건 하에서 선택 및 배양될 수 있다. 필요할 때, 숙주 세포로부터 회복된 2개의 사슬은 항체의 형성을 허용하는 적당한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일 예에서, 2개의 재조합 발현 벡터가 제공되되, 하나는 항-CD40 항체의 중쇄를 인코딩하고, 다른 것은 항-CD40 항체의 경쇄를 인코딩한다. 2개의 재조합 발현 벡터 둘 모두는 종래의 방법, 예컨대, 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예컨대, dhfr-CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드 사슬의 발현을 허용하는 적당한 조건 하에서 양성 형질전환체가 선택 및 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 도입될 때, 본원에서 생성된 항체는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회복될 수 있다. 필요하면, 폴리펩타이드 사슬은 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회복될 수 있고 그 다음 항체의 형성을 허용하는 적당한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내로 도입될 때, 각각의 이들은 상응하는 숙주 세포로부터 또는 상응하는 배양 배지로부터 회복될 수 있다. 그 다음에, 2개의 폴리펩타이드 사슬은 항체의 형성을 위한 적당한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 재조합 발현 벡터의 제조, 숙주 세포의 형질주입, 형질전환체의 선택, 숙주 세포의 배양 그리고 배양 배지로부터 항체의 회복에 사용된다. 예컨대, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 매트릭스를 가진 친화성 크로마토그래피로 단리될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두를 인코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 벡터 (예컨대, 발현 벡터); 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 중 임의의 것이 본 개시내용의 범주 내에 있다.
이렇게 생성된 항-CD40 항체는 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 특성규명될 수 있고, 이에 의해 CD40 생물학적 활성의 증가가 검출되고/거나 측정된다. 예컨대, ELISA-유형 검정은 T 세포 증식의 CD40 촉진의 정성적 또는 정량적 측정에 적합할 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 항-CD40 항체의 치료 유효량을 투여함으로써 질환, 예컨대 암 또는 면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
약제학적 조성물
본원에 기재된 바와 같이, 항체뿐만 아니라 인코딩 핵산 또는 핵산 세트, 이를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체 (부형제)와 혼합되어, 표적 질환을 치료하는데 사용되는 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. "허용가능한"은, 상기 담체가 상기 조성물의 활성 성분과 양립가능해야 하고 (그리고 바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있고), 그리고 치료될 대상체에게 유해하지 않아야 함을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제 (담체)는 완충액을 비롯하여 당해 기술에 공지되어 있다. 예컨대, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 제20판 (2000) Lippincott Williams 및 Wilkins, Ed. K. E. Hoover를 참고한다.
본 방법에서 사용되는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 포함할 수 있다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 제20판 (2000) Lippincott Williams 및 Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투약량 및 농도에서 수령체에게 비독성이고, 그리고 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 단른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEENTM, 플루로닉스TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 Epstein, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 U.S. 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 것과 같은 당해 분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있는 항체 (또는 인코딩 핵산)를 함유하는 리포좀을 포함한다. 순환 시간이 강화된 리포좀은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어, 원하는 직경을 갖는 리포좀을 얻는다.
항체, 또는 인코딩 핵산(들)은 또한 예컨대, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 각각에서, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 매크로에멀젼에서 포획될 수 있다. 그와 같은 기술은 당해 기술에 공지되어 있고, 예컨대, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 제20판 Mack Publishing (2000)를 참고한다.
다른 예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 서방성 형식으로 제형화될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하되, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOTTM (락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주입가능 마이크로구형체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용될 약제학적 조성물은 멸균되어야 한다. 이것은, 예컨대, 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 가지고 있는 용기, 예컨대, 정맥내 용액 백 또는 피하 주입 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼가 있는 바이알에 넣는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌약과 같은 단위 투약 형태일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 약제학적 담체, 예컨대, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 인산제이칼슘 또는 검과 같은 종래의 정제화 성분, 및 다른 약제학적 희석제, 예컨대 물과 혼합되어, 예컨대, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 무독성 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 사전제형 조성물을 형성할 수 있다. 이들 사전제형 조성물이 균질한 것으로 언급될 때, 활성 성분이 상기 조성물 전체에 고르게 분산되어, 상기 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 투약 형태로 쉽게 세분될 수 있음을 의미한다. 그 다음 이러한 고체 사전제형 조성물은 본 발명의 0.1 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유하는 상기에 기재된 유형의 단위 투약 형태로 세분된다. 신규한 조성물의 정제 또는 알약은 코팅되거나 달리 배합되어, 오래 계속되는 작용의 이점을 제공하는 투약 형태를 제공할 수 있다. 예컨대, 정제 또는 알약은 내부 투약량 및 외부 투약량 성분을 포함할 수 있되, 후자는 전자를 덮는 외피(envelope) 형태이다. 2개의 성분은 위에서 붕해되는 것을 저항하는 역할을 하고 내부 성분이 십이지장으로 온전히 통과하도록 하거나 방출이 지연되도록 하는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 장용층 또는 코팅을 위해 사용될 수 있고, 그와 같은 물질은 수많은 폴리머산 및 폴리머산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는 특히, 비-이온성 제제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예컨대, TweenTM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예컨대, SpanTM 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5%의 표면-활성제를 포함할 것이고, 그리고 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요하면 다른 성분, 예컨대 만니톨 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 비히클이 첨가될 수 있음이 인정될 것이다.
적합한 에멀젼이 IntralipidTM, LiposynTM, InfonutrolTM, LipofundinTM 및 LipiphysanTM와 같은 상업적으로 구입가능한 지방 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 또는 대안적으로 오일 (예컨대, 대두 오일, 잇꽃 오일, 목화씨 오일, 참께 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질 (예컨대 난황 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합시에 형성된 에멀젼에 용해될 수 있다. 다른 성분 예컨대 글리세롤 또는 글루코스가 에멀젼의 등장성(tonicity)을 조정하기 위해 첨가될 수 있음이 인정될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예컨대, 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다.
상기 에멀젼 조성물은 항체를 IntralipidTM 또는 그의 성분 (대두 오일, 난황 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조되는 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기에 제시된 바와 같은 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균된 약제학적으로 허용가능한 용매 중 조성물은 기체의 사용에 의해 분무(nebulize)될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나 또는 분무 장치는 안면 마스크, 텐트(tent) 또는 간헐적 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
치료적 적용
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 유효량이 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예컨대, 볼러스로서 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 치료가 필요한 대상체 (예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 비롯해서 액체 제형을 위한 상업적으로 구입가능한 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접 분무될 수 있고 동결건조된 분말은 재구성(reconstitution) 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 플루오로카본 제형 및 정량 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나, 또는 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 더 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 비제한적으로, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함한다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 표적 질환/장애, 예컨대 암 또는 면역 장애 예컨대 자가면역 질환을 가지고 있거나, 그 위험에 있거나, 또는 가지고 있는 것으로 의심되는 인간 대상체일 수 있다.
암의 예는 비제한적으로, 유방암; 담관 암; 방광암; 교모세포종 및 수모세포종을 포함하는 뇌암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막 암; 식도암; 위암; 급성 림프구성 및 골수성 백혈병, 예컨대, B 세포 CLL; T-세포 급성 림프아구성 백혈병/림프종을 포함하는 혈액학적 신생물; 모발상 세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; AIDS-관련된 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병/림프종; 보웬병 및 파젯병을 포함하는 상피내 신생물; 간암; 폐암; 호지킨 질환 및 림프구성 림프종을 포함하는 림프종; 신경교세포종; 편평 세포 암종을 포함하는 구강암; 상피 세포, 기질 세포, 생식세포 및 간엽 세포에서 발생하는 것을 포함하는 난소암; 췌장 암; 전립선암; 직장암; 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 및 골육종을 포함하는 육종; 흑색종, 머켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저 세포 암종, 및 편평 세포 암을 포함하는 피부암; 배아 종양 예컨대 정상피종, 비-정상피종 (기형종, 융모막암종), 간질성 종양, 및 생식세포 종양을 포함하는 고환암; 갑상선 선암종 및 수질 암종을 포함하는 갑상선암; 및 선암종 및 윌름스 종양을 포함하는 신장암을 포함한다.
표적 암을 가지고 있는 대상체는 통상적인 의료 검사, 예컨대, 실험실 테스트, 장기 기능적 테스트, CT 스캔, 초음파, 및/또는 유전 검사에 의해 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 항-암 요법, 예컨대, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 또는 수술을 받았거나 받고 있는 인간 암 환자일 수 있다.
면역 장애는 면역계의 기능이상을 지칭한다. 그 예는 자가면역 질환, 면역결핍, 또는 알러지를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료를 위한 표적 질환은 자가면역 질환이다. 그 예는 비제한적으로, 류마티스성 관절염 (RA), 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증 (MG), 그레이브스병, 특발성 혈소판감소증 자반병 (ITP), 길랑-바레 증후군, 자가면역 심근염, 멤브레인 사구체신염, 하이퍼(Hyper) IgM 증후군, 진성 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 자가면역 갑상선염, 위염, 소아지방변증, 백반증, 간염, 원발성 담도 간경변증, 염증성 장 질환, 척추관절병증, 실험 자가면역 뇌척수염, 면역 호중구감소증, 유년 발병형 당뇨병, 및 사이토카인, 결핵, 유육종증, 및 다발성근염에서 전형적으로 발견되는 T-림프구에 의해 매개된 지연 과민증, 다발동맥염, 피부 혈관염, 천포창, 유천포장, 굿파스투어 증후군, 가와사키병, 전신 경화증, 항-인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 이식편 대 숙주 (GVH) 질환, 및 면역 혈소판감소증과 관련된 면역 반응을 포함한다.
표적 자가면역 질환을 가지고 있는 대상체는 통상적인 의료 검사, 예컨대, 항핵 항체, 항-미토콘드리아 자가항체, 항-중성구 세포질 항체, 항-인지질 항체, 항-시트룰린화된 펩타이드 (항-CCP), 항-류마티스성 인자, 면역글로불린 A의 존재, C-반응성 단백질 테스트, 보체 테스트, 적혈구 침강 속도 (ESR) 테스트, 응혈 프로파일, 및 단백질 전기영동/면역고정 전기영동, 및/또는 유전 검사에 의해 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 자가면역 질환 치료, 예컨대, 면역억제성 중재, 호르몬 대체 요법, 수혈, 항-염증성 약물, 및/또는 통증 약물을 받았거나 받고 있는, 자가면역 질환을 가지고 있는 인간 대상체일 수 있다.
그러한 표적 질환/장애 중 임의의 것을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 상기 질환/장애의 하나 이상의 증상을 보일 수 있다. 질환/장애에 대한 위험이 있는 대상체는 해당 질환/장애에 대한 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 대상체에 치료 효과를 부여하는데 필요한 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 증가된 CD40 활성, 수지상 세포의 활성화, 증가된 T 세포 반응, 및/또는 증가된 항종양 면역 반응이다. 항체의 양이 치료 효과를 달성했는지 여부의 결정은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 유효량은 치료되고 있는 특정 병태, 상기 병태의 중증도, 연령, 신체 조건, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개별 환자 파라미터, 치료 기간, (있다면) 동반 요법의 특성, 특이적 투여 경로 및 건강 의료인의 지식 및 전문지식 내의 유사 인자에 따라, 당업자에게 인식되는 바와 같이 변한다. 이들 인자는 당업자에게 잘 알려져 있고 통상적인 실험으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉, 건전한 의료 판단에 따른 최고 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다.
실증적 고려사항, 예컨대, 반감기는 일반적으로 투약량의 결정에 기여할 것이다. 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하기 위해 인간 면역계와 양립가능한 항체, 예컨대 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체가 사용될 수 있다. 투여 빈도는 요법의 과정에 따라 결정되고 조정될 수 있고, 그리고 반드시는 아니지만 일반적으로 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 근거한다. 대안적으로, 항체의 연속된 서방성 제형이 적절할 수 있다. 서방을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당해 기술에 공지되어 있다.
일 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 투약량은 항체의 하나 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 실증적으로 결정될 수 있다. 개체는 작용제의 증분적 투약량을 제공받는다. 상기 작용제의 효능을 평가하기 위해, 질환/장애의 지표가 뒤따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 항체 중 임의의 것을 투여하기 위해, 초기 후보 투약량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투약량은 상기에 언급된 인자에 따라 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과 중 약 임의의 범위일 수 있다. 며칠에 걸쳐 또는 그보다 길게 반복 투여되는 경우, 병태에 따라, 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 표적 질환 또는 장애, 또는 이의 증상을 경감시킬 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투약 레지멘은 약 2 mg/kg의 초기 용량, 이어서 약 1 mg/kg의 주간 유지 용량의 항체, 또는 이어서 약 1 mg/kg의 격주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의료인이 달성하기를 원하는 약동학적 소실의 패턴에 따라 다른 투약 레지멘이 유용할 수 있다. 예컨대, 일주일에 1 내지 4회의 투약이 고려된다. 일부 구현예에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예컨대 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg)의 투약 범위가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 투약 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매월, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 더 긴 개월마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 종래의 기술 및 검정으로 용이하게 모니터링된다. (사용된 항체를 포함하는) 투약 레지멘은 경시적으로 변할 수 있다.
일부 구현예에서, 정상 체중의 성인 환자에 대해, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg의 용량 범위가 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 항-CD40 항체의 투약량은 10 mg/kg일 수 있다. 특정한 투약 레지멘, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개체 및 그 개체의 병력뿐만 아니라 개별 제제의 특성 (예컨대 상기 제제의 반감기, 및 당해 분야에서 잘 알려진 다른 고려사항들)에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 적절한 투약량은 이용된 특정 항체, 항체들, 및/또는 비-항체 펩타이드 (또는 이의 조성물), 질환/장애의 유형 및 중증도, 상기 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는 지 여부, 선행 요법, 작용제에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 임상의는 투약량이 원하는 결과를 얻는 것에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 일부 구현예에서, 원하는 결과는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응의 증가이다. 투약량이 원하는 결과를 초래하는지 여부를 결정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 하나 이상의 항체의 투여는 예컨대, 수령체의 생리학적 조건, 투여 목적이 치료적 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 의료인에게 알려진 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 사전선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 예컨대, 표적 질환 또는 장애의 발달 전, 그 동안 또는 후에 일련의 이격된 용량일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 질환 또는 장애에 대한 소인을 치료(cure), 치유(heal), 경감(alleviate), 완화(relieve), 변경(alter), 교정(remedy), 개선(ameliorate), 향상(improve) 또는 영향(affect)을 주는 목적으로, 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인을 갖는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
표적 질환/장애의 경감은 질환의 발달 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소 또는 생존의 연장을 포함한다. 질환의 경감 또는 생존의 연장은 치료 결과를 반드시 필요로 하지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표적 질환 또는 장애의 발달을 "지연하는" 것은 질환의 질행을 미루고(defer), 방해하고(hinder), 늦추고(slow), 지체시키고(retard), 안정화(stabilize)시키고/거나 연기시키는(postpone) 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 이력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 질환의 발달을 "지연시키는" 또는 경감시키거나 질환의 개시를 지연시키는 방법은, 본 방법을 사용하지 않는 경우와 비교할 때, 주어진 기간에서 질환의 하나 이상의 증상을 발달시킬 개연성을 감소시키고/거나 주어진 기간에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 그와 같은 비교는 전형적으로, 통계적으로 유의미한 결과를 얻는데 충분한 수많은 대상체를 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "발달" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 후속 진행을 의미한다. 질환의 발달은 당해 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 표준 임상 기술을 사용하여 검출 및 평가될 수 있다. 그러나, 발달은 또한 검출불가능한 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발달 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발달"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 표적 질환 또는 장애의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 생체 내에서 CD40의 활성 (및/또는 DC 활성화)을 적어도 10% (예컨대, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)까지 향상시키는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
의약 업계의 숙련자에게 알려진 종래의 방법은 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본 조성물은 또한 다른 종래의 경로를 통해 투여될 수 있고, 예컨대, 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 병소내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해가능한 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사가능 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 약제학적 조성물은 안구내로 또는 유리체내로 투여된다.
주사가능 조성물은 다양한 담체 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 항체는 드립(drip)법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 상기 항체 및 생리적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약제학적 제형이 주입된다. 생리적으로 허용가능한 부형제는, 예컨대, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예컨대, 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형은 약제학적 부형제 예컨대 주사용 증류수(Water-for-Injection), 0.9% 염수, 또는 5% 글루코스 용액에 용해되고 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 부위-특이적인 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적인 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 항체 또는 국소 전달 카테터의 다양한 이식가능 데포 공급원, 예컨대 주입 카테터, 내재 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식, 외막 랩, 션트(shunt) 및 스텐트(stent) 또는 다른 이식가능 장치, 부위 특이적 캐리어, 직접 주사, 또는 직접 도포를 포함한다. 예컨대, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참고한다.
안티센스 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개된 DNA 전달 기술은, 예컨대, Findeis 등, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou 등, Gene Therapeutics: Methods and Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu 등, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu 등, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu 등, J. Biol. Chem. (1991) 266:338에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 것들)을 함유하는 치료적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여된다. 일부 구현예에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA 또는 그 초과의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 치료적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원의 것일 수 있다 (개괄적으로, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148을 참고한다). 그와 같은 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터가 당해 기술에 잘 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 비제한적으로, 재조합 레트로바이러스 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; U.S. 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242를 참고한다), 알파바이러스-기반 벡터 (예컨대, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말과 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655를 참고한다)를 포함한다. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147에 기재된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 이용될 수 있다.
사멸된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다중양이온성 축합된 DNA (예컨대, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147를 참고한다); 리간드-연결된 DNA (예컨대, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985를 참고한다); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예컨대, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338를 참고한다) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 비제한적으로 포함하는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 이용될 수 있다. 네이키드 DNA이 또한 이용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 특허 번호 0524968에 기재되어 있다. 추가의 접근법은 Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411, 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용되는 특정한 투약 요법, 즉, 용량, 타이밍 및 반복은 특정 대상체 및 대상체의 병력을 따를 것이다.
일부 구현예에서, 1 초과 개의 항체, 또는 항체와 또 다른 적합한 치료제의 조합이, 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 항체는 또한 제제의 유효성을 향상시키고/거나 보완하는 역할을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 표적 효능은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다.
병용 요법
본원에 기재된 항-CD40 항체는 표적 질환 예컨대 암 또는 면역 장애를 위한 다른 유형의 요법과 함께 이용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체가 암을 치료하기 위해 사용될 때, 항-암 요법, 예컨대, 당해 분야에서 알려진 것들과 병용될 수 있다. 추가의 항-암 요법은 화학요법, 수술, 방사선, 면역요법, 유전자 요법 등을 포함한다.
대안적으로, 본 개시내용의 치료는 다음과 병용될 수 있다: 화학치료제, 예컨대, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 사이타라빈), 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 천연 생성물을 포함하는 항증식성/세포분열저지성 제제 예컨대 빈카 알카로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈), 미세소관 교란물질 예컨대 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상 제제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸렌디아민옥살리플라틴, 이포스파마이드, 멜팔란, 메르클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테르, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드 (VP16)); 항생제 예컨대 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신),이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 필리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신으로 대사작용시키고 그들 자신의 아스파라긴을 합성하는 수용력이 없는 세포를 박탈하는 L-아스파라기나제); 항콜혈소판제; 항증식성/세포분열저지성 알킬화제 예컨대 질소 머스타드 (메클로르에타민, 사이클로포스파마이드 및 유사체, 멜팔란, 클로르암부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌 (DTIC); 항증식성/세포분열저지성 항대사제 예컨대 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 착물 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 바이칼루타마이드, 닐루타마이드) 및 방향화효소 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소용해 제제 (예컨대 조직 플라스미노겐 활성제, 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디파이리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 항이동 제제; 항분비 제제 (브레벨딘); 면역억제성 (사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물 (예컨대, TNP-470, 게니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제 (예컨대, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티-센스 올리고뉴클레오타이드; 항체 (트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유발제 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포사이드, 에피루비신, 에토포시드,이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드 (코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손, 및 프로니솔론); 성장 인자 신호 형질도입 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능이상 유발제 및 카스파제 활성제; 및 염색질 교란물질.
면역 장애를 치료하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체를 사용할 때, 예컨대, 치료적 백신 (GVAX, DC-기반 백신 등을 비제한적으로 포함함), 또는 관문 억제제 (CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 제제를 비제한적으로 포함함)와 같은 다른 면역조절 치료제와 함께 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 항체는 자가면역 질환을 위해 또 다른 요법과 병용될 수 있다. 그 예는 비제한적으로, 정맥내 Ig 요법; 비스테로이드 항-염증성 약물 (NSAID); 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신; 사이클로포스파마이드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제제, 또는 접착 분자 억제제를 포함한다.
또한 추가의 유용한 제제의 예에 대해서는 Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro 등, Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald 등, Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow 등, Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J를 참고한다.
제2 치료제가 사용될 때, 그와 같은 제제는 본원에 기재된 치료제와 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다. 추가의 치료제와 함께 투여될 때, 각각의 제제에 적합한 치료적으로 효과적인 투약량은 부가 작용 또는 동반상승효과로 인해 감소될 수 있다.
질환의 치료에 사용하기 위한 키트
본 개시내용은 또한 본 명세서에서 기재된 바와 같은 표적 질환, 예컨대 암 및 면역 장애를 치료하거나 완화하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그와 같은 키트는 항-CD40 항체, 예컨대, 본 명세서에서 기재된 것들 중 임의의 것, 및 선택적으로 본원에 또한 기재되어 있으며 항-CD40 항체와 함께 사용될 제2 치료제를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 포함된 지침은 본원에 기재된 바와 같은 표적 질환을 치료하고, 그 개시를 지연시키거나 또는 완화시키기 위한 항-CD40 항체, 및 선택적으로 제2 치료제의 투여의 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 가지고 있는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하고, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 진단 방법을 적용하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 지침은 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체를 투여하는 설명을 포함한다.
항-CD40 항체의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 의도하는 치료를 위한 투약량, 투약 계획, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예컨대, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침은 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물 (예컨대, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 쓰여진 지침이지만, 기계-판독가능한 지침 (예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 실린 지침)이 또한 허용된다.
라벨 또는 포장 삽입물은, 상기 조성물이 질환, 예컨대 암 또는 면역 장애 (예컨대, 자가면역 질환)을 치료하고, 그 개시를 지연시키고/거나 완화하기 위해 사용됨을 나타낸다. 지침은 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합하게 포장되어 있다. 적합한 포장은, 비제한적으로, 바이알, 병, 자르(jar), 가요성 패키징 (예컨대, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지) 등을 포함한다. 또한 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예컨대, 아토마이저) 또는 주입 장치 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장이 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예컨대 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주입 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼가 있는 바이알일 수 있다). 용기 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예컨대 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주입 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼가 있는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 것과 같은 항-CD40 항체이다.
키트는 추가의 구성요소 예컨대 버퍼 및 해석 정보를 선택적으로 제공할 수 있다. 보통은, 키트는 용기, 및 상기 용기 상에 있거나 용기와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적인 기술
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 그와 같은 기술은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, 및 D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 및 M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, 등, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway 및 P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd 및 C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)과 같은 문헌에서 충분히 설명된다.
추가의 상술없이, 당업자가, 상기 설명에 기초하여, 본 발명을 최대한 이용할 수 있는 것으로 믿어진다. 다음의 특정 구현예는, 따라서, 단지 실례로서 해석되어야 하고, 임의의 방식으로 어떤 식으로든 본 개시내용의 나머지를 제한하지 않아야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 공보는 본 명세서에 언급된 목적 또는 요지를 위하여 참고로 편입된다.
실시예 1: 항-CD40 항체의 생성
시약 및 일반 방법
재조합 인간 CD40/TNFRSF5 단백질 (cat#1493-CD, Fc 키메라) 및 인간 CD40/TNFRSF5 MAb (클론 82111, 마우스 IgG2B, cat# MAB6321)은 R&D Systems (USA)로부터 구매되었다. 붉은털원숭이 CD40/TNFRSF5 단백질 (His Tag)는 Sino Biologics (cat#90097-C02H)로부터 구매되었다. 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 CD40을 발현시키는 안정한 CHO 세포주는 전장 인간 CD40 cDNA (유전자 ID: 958) 또는 사이노몰구스 원숭이 CD40 cDNA (유전자 ID: 102118696)으로 형질감염에 의해 개발되었다.
표준 ELISA는 항-CD40 항체를 검출하는데 사용되었다. 플레이트는 CD40 단백질로 코팅되었고 항-CD40 항체와 함께 인큐베이션되었다. CD40에 결합된 항체 분자는 페록시다아제로 접합된 이차 항체 (염소 항-마우스 또는 랫트 IgG)를 사용하여 검출되었다.
FACS는 CHO-CD40 세포주를 사용하여 항-CD40 항체를 검출하기 위해 수행되었다. 항체 샘플을 이용한 일정 기간의 인큐베이션 후, CHO-CD40 세포는 FACS를 이용하여 상업적으로 구입가능한 PE- 또는 FITC-표지된 이차 항체에 의해 분석되었다.
하이브리도마 개발 및 선도 항체 확인
Balb/c 및 SJL 마우스 및 위스타 랫트는 재조합 인간 CD40/TNFRSF5 단백질 Fc 키메라 및 pcDNA3.1-인간 CD40 플라스미드로 면역화되었다. 면역화된 동물의 항-CD40 혈청 역가는 대조군으로서 인간 CD40 및 인간 IgG를 가진 ELISA를 사용하여 모니터링되었다. 양성 역가는 FACS를 사용하여 추가로 확인되어, CHO-인간 CD40 세포를 스크리닝하였다. 최고 역가를 가진 4마리 마우스 및 1마리 랫트가 희생되었고; 수확된 비장세포는 단리되었고 표준 하이브리도마 프로토콜을 사용하여 SP2/0 골수종 세포와 융합되었다.
총 백개의 96-웰 플레이트의 마우스 또는 랫트 하이브리도마는 ELISA를 사용하여 스크리닝되어, 그로부터 인간 CD40 단백질에 분비된 항체의 결합 활성을 측정하였다. 그 다음에 양성 샘플은 인간 Fc 카운터 스크린에 의해 시험되었다. 다음으로, 이들 양성 CD40-특이적 클론은 FACS에 의해 CHO-세포 상에 발현된 인간 CD40에의 결합에 대하여 시험되었고, 제한된 희석에 의한 단일 세포 클로닝의 2개의 라운드를 거치게 되었다. 26개의 안정한 하이브리도마 클론이 수득되었다.
선택된 하이브리도마 클론은 항체 생산을 위하여 성장되었다. 이들 정제된 항체는 FACS에 의한 인간 세포 CD40에의 결합에 대하여 평가되었다. 도 1은 하이브리도마 세포로부터 분비된 5개의 예시적인 항체의 결합 결과를 도시한다. 이들 5개의 항체는 인간 수지상 세포 또는 B 세포를 사용하는 기능적 검정에서 또한 시험되었다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 수많은 항-CD40 항체는 사이토카인 분비에 의해 입증된 바와 같이 인간 수지상 세포 또는 B 세포의 활성화에서 명백한 작용적 활성을 나타냈다.
키메라 항체의 제조
6개의 확인된 하이브리도마의 항체 가변 도메인은 아래와 같이 서열분석되었다. 간단히 말해서, 총 RNA는 NucleoZOL (MACHEREY-NAGEL, cat# 740404.2)를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 추출되었고, 그 다음 SMARTer® RACE 5'/3' Kit (Clontech, cat# 634858)로 5'-RACE에 의해 cDNA에 역전사되었다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 특정 프라이머 (Novagen, cat# 69831-3)으로 PCR에 의해 증폭되었고, 앰플리콘은 NucleoSpin® Gel 및 PCR Clean-up Kit (MACHEREY-NAGEL, cat# 740609.25)로 정제되었다. 그 다음에 상기 앰플리콘은 TA 클로닝을 사용하여 pMD18-T 벡터 (Takara, cat#D101A)에 클로닝되었다. 상기 클론이 DH5α 세포에서 형질전환된 후, VH 및 VL 단편을 운반하는 15개의 단일 클론이 분석되어, 항체 가변 영역의 서열을 수득하였다. VH/VL 서열은 통상적인 실시에 따라 결정되었다.
항-CD40 항체 가변 도메인 서열을 인코딩하는 cDNA 서열은 힌지 S228P (EU 넘버링; 카밧 넘버링 241) 안정화 돌연변이 (Angal 등, Mol. Immunol 30:105, 1993)을 함유하는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 또는 인간 카파 경쇄 불변 영역에 대한 키메라로서 합성되었다. CHO 일시적 발현은 상응하는 중쇄 및 경쇄 서열을 함유하는 플라스미드에 의해 수행되었다. 이들 키메라 항체는 단백질 친화성 크로마토그래피로 정제되었다. 정제된 항체 제제는 <5 EU/mg 내독소를 함유하고 단량체 형태에서 항체의 수준은 >95%이다.
실시예 2: 항-CD40 키메라 항체의 평가
CD40 결합 ELISA
CD40 단백질 (인간 CD40-His 태그 단백질 (Sino Biological Inc. Cat#10239-H08E) 또는 붉은털원숭이 CD40-His (Sino Biological Inc. Cat#90097-C02H)는 1ug/ml로 PBS에서 희석되었고 50ul/웰의 농도로 ELISA 플레이트 (Corning, Cat#9018, 높은 결합)을 코팅하는데 사용되었다. 상기 플레이트는 4℃에 밤새 인큐베이션되었다. 그 다음에 플레이트는 경사분리되었고 PBS-T로 세정되었고, 200ul/웰 검정 희석제 (1xPBS/1% BSA/0.05%Tween-20/0.05% 프로클린 300)가 첨가되었다. 실온에서 3 시간 인큐베이션 후, 플레이트는 PBS-T로 3회 세정되었다. 시험 항체는 0, 0.000003, 0.00003, 0.0003, 0.003, 0.03, 및 0.3 ug/ml 또는 대략 0, 0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2 및 2 nM로 검정 희석제에서 희석되었고 그 다음에 상기 플레이트 (50 ul/웰)에 첨가되었다. 상기 플레이트는 37℃에 1시간 동안 인큐베이션되었고 그 다음 PBS-T로 3회 세정되었다. 1:10,000 희석으로 항-인간 IgG-HRP 콘주게이트 (Bethyl Cat#A80-319P)가 상기 플레이트 (100 ul/웰)에 첨가되었다. 상기 플레이트는 37℃에 0.5시간 동안 인큐베이션되었고, 이어서 PBS-T로 3회 세정되었다. TMB 기질액은 첨가되었다 (100 ul/웰). 색상이 8 분 동안 현상되도록 한 다음 100ul/웰 2N H2SO4로 중단시켰다. 450nm에서의 흡광도는 ELISA 판독기로 결정되었다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 시험된 예시적인 항체는 용량-의존 방식으로 인간 CD40에 결합된다.
CD40 결합 FACS
CHO 세포 과발현 인간 CD40 또는 사이노몰구스 원숭이 CD40은 트립신-EDTA 부분 소화 이어서 5 분 동안 1000 rpm에서 원심분리를 사용하여 수확되었다. 세포는 5x106/ml로 차가운 PBS-BSA (2%)에 재현탁되었고 100ul/튜브로 분취되었다. 키메라 항-CD40 항체는 PBS-BSA에 3회 희석되었고 (최종 농도는 0.01, 0.1, 1, 및 10 ug/ml이었음) 50ul의 각각의 농축물은 CHO-CD40 세포에 첨가되었다. 세포 용액은 혼합되었고 2 시간 동안 어둠에서 4℃에서 인큐베이션되었다. 그 다음에 세포는 PBS-BSA로 2회 세정되었다. 100 ul/바이알의 농도로 이차 항체 콘주게이트 (염소 F(ab')2 항-인간 IgG - Fc (PE), 사전-흡착됨 (ab98596))가 첨가되었고 세포는 혼합되었고 1시간 동안 어둠에서 4℃에서 인큐베이션되었다. 그 다음에 세포는 PBS-BSA로 2회 세정되었고, 이어서 2% PFA에서 고정되었고, 그 다음 FACScaliber로 FACS 분석을 거치게 되었다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 이들 항체는 CHO 세포의 표면 상에 발현된 인간 CD40에 대해 높은 결합 활성을 나타냈다. 세포 사이노몰구스 원숭이 CD40에의 항체 결합 활성은 도 5에서 나타낸 바와 같이 다양하다.
수지상 세포 기능적 검정
신선한 PBMC는 버피 코트로서 피콜 분리에 의해 건강한 지원자로부터 단리되었고 3x106/ml로 10% FBS를 함유하는 PRMI-1640에 재현탁되었다. 수지상 세포를 제조하기 위해, PBMC는 2 mL/웰로 6-웰 배양 플레이트에 씨딩되었고 37℃에 90 분 동안 부착하도록 하였다. 비-부착 분획을 함유하는 림프구는 제거되었고 부착된 세포는 7 일 동안 37℃, 5% CO2 가습된 인큐베이터에서 100 ng/mL의 rhGM-CSF 및 50 ng/mL의 rhIL-4 (Human Dendritic Cell Cytokine Package, Peprotech, Cat#AF-HDC)로 보충된 RPMI1640 (10% FBS)에서 배양되었고, 신선한 배지는 3일째에 대체되었다.
DC 세포는 수확되었고 96-웰 플레이트에서 1x105/ml DC로 플레이팅되었다. 수용성(soluable) 시험 항체가 첨가되었다. 세포는 3일 동안 배양되었고, 그 다음 상청액은 수확되었고 상청액에서 IL-8 및 IL-12/P40의 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. 또 다른 검정 형식에서, DC 세포는 1.25x106/ml의 세포 밀도로 조정되었다. 상기 세포는 CHO-FcγRIIB 세포의 존재 또는 부재 하에서 24-웰 플레이트 (0.4 mL/웰)에 첨가되었다. 그 다음, 항체 또는 배지 (대조군)은 상기 웰들에 첨가되었다. 상기 플레이트는 대략 24 시간 동안 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션되었다. 그 다음에 세포 배양 상청액은 수확되었고 상청액에서 IL-8, IL-12/P40, 및 IL12/P70의 수준이 측정되었다. 이렇게 수득된 결과가 도 6a-6b에 제공된다. 놀랍게도, 항-CD40 항체는 FcγRIIB를 발현시키는 CHO 세포와 공배양된 경우 사이토카인 분비에 의해 입증된 바와 같이 향상된 작용적 효과를 보여주었다. DC 세포는 수확되었고 DC 활성화에 대한 마커인 CD86의 세포 표면 발현에 대한 FACS 분석을 거치게 되었다.
실시예 3: 키메라 항체의 약동학적 연구
C57BL/6 마우스 (6-7 주령, 19-20 g, 숫컷이 이 연구를 위해 사용되었다. 항체는 PBS에서 제형화되었고 4마리 마우스의 그룹에서 3 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 투여되었다.
혈액 샘플링은 연속 출혈에 의해 투여전, 1h, 2h, 4h, 8h, 1d, 2d, 3d, 5d, 8d, 11d, 15d 및 21d에 실시되었다. 시점(time point)당 10 uL 혈액이 40uL의 PBS-BSA 용액에 첨가되었다. 그 다음에 샘플은 잘 혼합되었고 4℃에 5 분 동안 2000 g로 원심분리되었다. 상청액은 수집 직후 드라이아이스 상에 놓고 분석까지 대략 -70℃에 보관되었다. 혈액 항체 농도는 상기 섹션에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정되었다. 도 7a-7c는 3 mg/kg의 단일 정맥내 주사후 키메라 항체의 혈액 항체 농도를 도시한다. 하기 표 1은 검사된 항체의 약동학적 파라미터를 요약한다.
Figure pct00022
다른 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한, 동등한, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 이와 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등한 또는 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 단지 예이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 이의 사상 및 범위로부터 이탈 없이, 다양한 용법 및 조건에 이것을 순응시키기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 구현예는 또한 청구항들 내에 있다.
등가물
몇 개의 본 발명 구현예가 본원에 기재되고 설명되는 동안, 당업자는 기능을 수행하기 위한 및/또는 본원에 기재된 이점들 중 하나 이상 및/또는 결과를 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이고, 각각의 그와 같은 변동 및/또는 변형은 본원에 기재된 본 발명 구현예의 범위내인 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성이 예시적인 것으로 의미하고 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성이 본 발명 교시가 사용되는 특이적 적용 또는 적용들에 의존할 것임을 쉽게 인정할 것이다. 당업자는 통상적인 실험과정만 사용하여, 본원에 기재된 특이적 본 발명 구현예에 많은 등가물을 인식할 것이거나, 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 구현예가 단지 예로써 제시되는 것 그리고, 거기에 첨부된 청구항 및 등가물의 범위 내에서, 본 발명 구현예가 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 본 발명 구현예는 본원에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 그와 같은 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 그와 같은 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호간에 불일치하지 않으면, 본 개시내용의 본 발명 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 정의된 및 사용된 바와 같이, 모든 정의는 사전 정의, 참고로 편입된 문서의 정의, 및/또는 정의된 용어들의 통상적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참조문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각이 인용되는 요지에 관하여 참고로 편입되고, 일부 경우에 문서의 전체를 포괄할 수 있다.
부정 관사 "a" 및 "an"은, 본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용된 바와 같이, 반대로 분명히 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
어구 "및/또는"은, 본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용된 바와 같이, 그렇게 연합된 요소, 즉, 일부 경우에 연합하여 존재하고 다른 사례에서 분리해서 존재하는 요소의 "어느 한쪽 또는 양쪽"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다중 요소, 즉, 그렇게 연합된 "하나 이상의" 요소는 동일한 방식으로 해석되어야 한다. 다른 요소는, 구체적으로 확인된 그들 요소에 관련된 또는 관련없든 간에, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및/또는 B" 지칭은, 개방형 언어 예컨대 "포함하는"과 공조하여 사용될 때, 일 구현예에서, A 단독 (선택적으로 B 이외 요소 포함); 또 다른 구현예에서, B 단독 (선택적으로 A 이외 요소 포함); 또 다른 구현예에서, 양쪽 A 및 B (선택적으로 다른 요소 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용된 바와 같이, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 목록에서 항목을 분리시키는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은, 요소들의 수 또는 목록, 및, 선택적으로, 추가의 미열거된 항목의, 포함, 즉, 적어도 1개의 포함, 뿐만 아니라 1 초과를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 분명히 반대로 표시된 유일한 용어들, 예컨대 "의 단 하나" 또는 "의 정확히 하나", 또는, 청구항에서 사용될 때, "으로 이루어지는"은 요소들의 수 또는 목록의 정확히 1개 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 용어 "또는"은 본원에서 사용된 바와 같이 배타성의 용어들, 예컨대 "어느 한쪽", "의 하나", "의 단 하나", 또는 "의 정확히 하나"에 의해 선행된 경우 배타적인 대안 (즉, "한쪽 또는 다른 쪽 그러나 양쪽이 아닌")을 나타내는 것으로 해석될 수 있을 뿐이다. "으로 본질적으로 이루어지는"은, 청구항에서 사용될 때, 특허법의 분야에서 사용된 바와 같이 그것의 통상적인 의미를 가질 수 있다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용된 바와 같이, 어구 "적어도 하나"는, 하나 이상의 요소들의 목록에 관련하여, 요소들의 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소들의 목록 내에서 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않고 요소들의 목록에서 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는다. 이러한 정의는 또한 요소들이, 구체적으로 확인된 그들 요소들에 관련된 또는 관련없든 간에, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소들 이외 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 구현예에서, 존재하는 B 없이 (그리고 B 이외 요소를 선택적으로 포함하는), 1 초과를 선택적으로 포함하는, 적어도 하나의 A; 또 다른 구현예에서, 존재하는 A 없이 (그리고 A 이외 요소를 선택적으로 포함하는) 1 초과를 선택적으로 포함하는, 적어도 하나의 B; 또 다른 구현예에서, 1 초과를 선택적으로 포함하는, 적어도 하나의 A, 및 1 초과를 선택적으로 포함하는, (그리고 다른 요소를 선택적으로 포함하는) 적어도 하나의 B; 등을 지칭할 수 있다.
반대로 분명히 표시되지 않는 한, 1 초과 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 본 방법의 단계들 또는 행위들의 순서가 본 방법의 단계들 또는 행위들이 인용되는 순서에 반드시 제한되지 않는 것이 또한 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Lyvgen Biopharma Co., LTD. <120> ANTI-CD40 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> L0839.70003WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> PCT/CN2018/083864 <151> 2018-04-20 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X may be F or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X may be N, T, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X may be N, T, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X may be N, D, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X may be S or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X may be F, N, W or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X may be M, I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X may be N, D, or H <400> 1 Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide 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270 Ser Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 40 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X may be D, R, or S <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X may be D, N, or S <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X may be N, or S <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X may be N, or G <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X may be D, or G <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> X may be I, V or G <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X may be S or T <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> X may be I, K or Y <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> X may be N or R <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> X may be Q, E, or D <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> X may be K or S <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> X may be F or V <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> X may be R or K <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> X may be G or Y <400> 41 Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X may be K or L <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> X may be Q or E <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X may be I or L <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X may be Y, N, or S <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X may be I, K, or N <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X may be N or A <400> 42 Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X may be N, R, or F <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X may be V or T <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X may be S, N, or D <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> X may be N or R <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> X may be R or L <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X may be F, A, Q, Y, or L <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X may be S, T, or D <400> 43 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (24)

  1. 인간 CD40에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 13F1A7, 17C5C2, 19G6D6, 36G7B8, 및 9F12D9로 구성된 군으로부터 선택된 기준 항체와 동일한 인간 CD40의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 중쇄 가변 영역 (VH)으로서,
    (i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1) (여기서, X1은 F 또는 Y이고, X2는 N, T, 또는 I이고, X3은 N, T, 또는 I이고, X4는 D, S, 또는 N이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F, N, W, 또는 G이고, X7은 M, I, 또는 L이고, 그리고 X8은 N, D, 또는 H임)로 제시되는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1);
    (ii) QIRNX1NYX2YAX3YYX4ESLEG (서열번호: 2) (여기서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A임); X1IX2PNNX3X4X5X6YNX7KFRX8 (서열번호: 3) (여기서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y임); 및 SISPSGGVTYYRDSVKG (서열번호: 4)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2); 및
    (iii) YYYDGX1X2DYFDX3 (서열번호: 5) (여기서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N임); RFAY (서열번호: 6); GVITTLVAGDY (서열번호: 7); 및 PFLGWGGANWIAH (서열번호: 8)로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    (b) 경쇄 가변 영역 (VL)으로서,
    (i) RSSQSLVYSYGNTYLH (서열번호: 9); SASSSISSNYLH (서열번호: 10); KASQNX1X2X3YLN (서열번호: 11) (여기서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K임); 및 LASEDISNDLA (서열번호: 12)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1);
    (ii) X1X2SN X3X4S (서열번호: 13) (여기서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A임); NTX1NLX2T (서열번호: 14) (여기서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y임); 및 FVDRLLD (서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2); 및
    (iii) X1Q X2X3X4X5PX6T (서열번호: 16) (여기서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G 또는 S이고, X3은 T, S, 또는 Y이고, X4는 H, S, 또는 K이고, X5는 V, I, 또는 Y이고, 그리고 X6은 W, Y, 또는 P임); 또는 X1QHX2X3RRT (서열번호: 17) (여기서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V임)로서 제시된 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL).
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 단리된 항체:
    (i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1)의 HC CDR1로서, X1은 F이고, X2는 N이고, X3은 N이고, X4는 D이고, X5는 S 또는 Y이고, X6은 F이고, X7은 M이고, 그리고 X8은 N인, HC CDR1;
    (ii) QIRNX1NYX2YAX3YYX4ESLEG (서열번호: 2)의 HC CDR2로서, X1은 K 또는 G이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 T 또는 A이고, 그리고 X4는 T 또는 A인, HC CDR2;
    (iii) YYYDGX1X2DYFDX3 (서열번호: 5)의 HC CDR3으로서, X1은 F 또는 H이고, X2는 A 또는 F이고, 그리고 X3은 Y 또는 N인, HC CDR3;
    (iv) RSSQSLVYSYGNTYLH (서열번호: 9) 또는 SASSSISSNYLH (서열번호: 10)의 LC CDR1;
    (v) X1X2SN X3X4S (서열번호: 13)의 LC CDR2로서, X1은 N 또는 R이고, X2는 V 또는 T이고, X3은 R 또는 L이고, 그리고 X4는 F 또는 A인, LC CDR2; 및
    (vi) X1Q X2X3X4X5PX6T (서열번호: 16)의 LC CDR3로서, X1은 S 또는 Q이고, X2는 G이고, X3은 T 또는 S이고, X4는 H 또는 S이고, X5는 V 또는 I이고, 그리고 X6은 W 또는 Y인, LC CDR3.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 단리된 항체:
    (i) GX1X2FX3X4X5X6 X7X8 (서열번호: 1)의 HC CDR1로서, X1은 Y이고, X2는 T 또는 I이고, X3은 T 또는 I이고, X4는 D 또는 S이고, X5는 Y이고, X6은 N 또는 W이고, X7은 M 또는 I이고, 그리고 X8은 D 또는 H인, HC CDR1;
    (ii) X1IX2PNNX3X4X5X6YNX7KFRX8 (서열번호: 3)의 HC CDR2로서, X1은 D 또는 R이고, X2는 N 또는 D이고, X3은 D 또는 G이고, X4는 I 또는 G이고, X5는 S 또는 T이고, X6은 I 또는 K이고, X7은 Q 또는 E이고, 그리고 X8은 G 또는 Y인, HC CDR2;
    (iii) RFAY (서열번호: 6) 또는 GVITTLVAGDY (서열번호: 7)의 HC CDR3;
    (iv) KASQNX1X2X3YLN (서열번호: 11)의 LC CDR1로서, X1은 I 또는 L이고, X2는 Y 또는 N이고, 그리고 X3은 I 또는 K인, LC CDR1;
    (v) NTX1NLX2T (서열번호: 14)의 LC CDR2로서, X1은 N 또는 D이고, 그리고 X2는 Q 또는 Y인, LC CDR2; 및
    (vi) X1QHX2X3RRT (서열번호: 17)의 LC CDR3로서, X1은 L 또는 M이고, X2는 S 또는 N이고, 그리고 X3은 S 또는 V인, LC CDR3.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 상기 기준 항체와 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는, 단리된 항체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 항체는 상기 기준 항체와 동일한 중쇄 가변 영역 및 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 상기 인간 CD40 및 비-인간 CD40 둘 모두에 결합하는, 단리된 항체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 비-인간 CD40는 사이노몰구스 원숭이 CD4인, 단리된 항체.
  9. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 단리된 항체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 항체는 IgG 분자인 전장 항체인, 단리된 항체.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 IgG 분자는 IgG4 분자인, 단리된 항체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 IgG4 분자의 Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 항체.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 항체는 Fab 또는 단일-사슬 항체인, 단리된 항체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체인, 단리된 항체.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세포 표면 상의 인간 CD40에 결합하는, 단리된 항체.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CD40 및 FcγRIIB 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체인, 항체.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CD40 항체를 집합적으로 인코딩하는, 단리된 핵산 또는 핵산의 세트.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 핵산 또는 핵산의 세트는 1개의 벡터 상에 또는 2개의 벡터 상에 위치하는, 단리된 핵산 또는 핵산의 세트.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 1 또는 2개의 벡터는 1 또는 2개의 발현 벡터인, 단리된 핵산 또는 핵산의 세트.
  20. 청구항 18 또는 19의 단리된 핵산 또는 핵산의 세트를 포함하는 숙주 세포.
  21. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-CD40 항체 또는 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항의 핵산 또는 핵산의 세트, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에게 청구항 21의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체는 암 또는 면역 장애를 가지고 있거나, 가지고 있는 것으로 의심되거나, 또는 그 위험에 있는 인간 환자인, 방법.
  24. 항-CD40 항체를 생성하는 방법으로서,
    (i) 상기 항-CD40 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 청구항 20의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 세포 배양으로부터 생성된 상기 항-CD40 항체를 수확하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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