JP2021521804A - 抗ｃｄ４０抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

アゴニスト抗CD40抗体およびCD40シグナリングを誘発して、これにより樹状細胞機能などの免疫応答を増強するためのような使用の方法が本明細書において開示される。この中に開示した抗体は、癌および免疫異常などの疾患を治療するために使用されてもよい。

Description

TNF-受容体スーパーファミリーのメンバーであるCD40は、抗原提示細胞上に見出される共刺激タンパク質であり、これは、T細胞依存性免疫グロブリンクラススイッチ、メモリーB細胞発生および胚中心形成などの多岐にわたる免疫および炎症性応答を媒介する。タンパク質は、樹状細胞、B細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞によって構成的に発現される一方、これは、また内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞および上皮細胞上にも発現される場合がある。また、CD40は、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫、骨髄腫、並びに鼻咽頭、膀胱、頸部、腎臓および卵巣を含む一定の癌腫を含む種々の腫瘍細胞上にも発現される（Vonderheide et al., Clin Cancer Res. 2013; 19(5): 1035-1043）。

CD40は、CD40リガンド（CD40L、またCD154としても知られる）に対するその結合を介して免疫応答を媒介する。たとえば、Tヘルプ（T_H）細胞上のCD40Lに対するCD40の結合は、抗原提示細胞を活性化し、したがって種々の下流のイベントをトリガーする。

多数の免疫および炎症性応答におけるその必須の役割のため、CD40/CD40Lシグナリング経路を調節することができる有効な修飾因子を開発することには関心がもたれている。

本開示は、ヒトCD40に結合することができ、かつFcγRIIBを発現する細胞の存在下で増強されるアゴニストの効果を示す抗体の発見に少なくとも部分的に基づく。このような抗体は、CD40/CD40Lシグナリングによって媒介される免疫応答を調節する際に有効であることが期待され、これにより、本明細書に記述したものなどの癌および免疫異常の治療に利益を与える。

したがって、本開示の一態様は、ヒトCD40を結合する単離された抗体を特徴とする。このような抗CD40抗体は、本明細書に記述した抗CD40抗体のクローン13F1A7、17C5C2、19G6D6、36G7B8または9F12D9と同じヒトCD40のエピトープを結合してもよい。いくつかの例において、抗体は、参照抗体と同じ重鎖および軽鎖相補性決定領域（CDR）を含んでもよい。たとえば、抗体は、参照抗体と同じ重鎖可変領域および同じ軽鎖可変領域を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、
（a）重鎖可変領域（V_H）であって、（i）式中X₁がFまたはYであり、X₂がN、TまたはIであり、X₃がN、TまたはIであり、X₄がD、SまたはNであり、X₅がSまたはYであり、X₆がF、N、WまたはGであり、X₇がM、IまたはLであり、かつX₈がN、DまたはHである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）と記載される重鎖相補性決定領域1（HC CDR1）；（ii）式中X₁がKまたはGであり、X₂がNまたはDであり、X₃がTまたはAであり、かつX₄がTまたはAである、QIRNX₁NYX₂YAX₃YYX₄ESLEG（配列番号：2）；式中X₁がDまたはRであり、X₂がNまたはDであり、X₃がDまたはGであり、X₄がIまたはGであり、X₅がSまたはTであり、X₆がIまたはKであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PNNX₃X₄X₅X₆YNX₇KFRX₈（配列番号：3）；またはSISPSGGVTYYRDSVKG（配列番号：4）と記載される重鎖相補性決定領域2（HC CDR2）；および／または（iii）式中X₁がFまたはHであり、X₂がAまたはFであり、かつX₃がYまたはNである、YYYDGX₁X₂DYFDX₃（配列番号：5）；RFAY（配列番号：6）；GVITTLVAGDY（配列番号：7）；またはPFLGWGGANWIAH（配列番号：8）と記載される重鎖相補性決定領域3（HC CDR3）を決定する、重鎖可変領域（V_H）；および／または、
（b）軽鎖可変領域（V_L）であって、（i）RSSQSLVYSYGNTYLH（配列番号：9）；SASSSISSNYLH（配列番号：10）；式中X₁がIまたはLであり、X₂がYまたはNであり、かつX₃がIまたはKである、KASQNX₁X₂X₃YLN（配列番号：11）；またはLASEDISNDLA（配列番号：12）と記載される軽鎖相補性決定領域1（LC CDR1）；（ii）式中X₁がNまたはRであり、X₂がVまたはTであり、X₃がRまたはLであり、かつX₄がFまたはAである、X₁X₂SNX₃X₄S（配列番号：13）；式中X₁がNまたはDであり、かつX₂がQまたはYであるNTX₁NLX₂T（配列番号：14）；またはFVDRLLD（配列番号：15）からなる群より選択される軽鎖相補性決定領域2（LC CDR2）；および／または（iii）式中X₁がSまたはQであり、X₂がGまたはSであり、X₃がT、SまたはYであり、X₄がH、SまたはKであり、X₅がV、IまたはYであり、かつX₆がW、YまたはPである、X₁QX₂X₃X₄X₅PX₆T（配列番号：16）；またはX₁がLまたはMであり、X₂がSまたはNであり、かつX₃がSまたはVである、X₁QHX₂X₃RRT（配列番号：17）と記載される軽鎖相補性決定領域3（LC CDR3）を含む、軽鎖可変領域（V_L）、を含む。

いくつかの例において、本明細書に記述した抗CD40抗体は：
（i）式中X₁がFであり、X₂がNであり、X₃がNであり、X₄がDであり、X₅がSまたはYであり、X₆がFであり、X₇がMであり、かつX₈がNである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）のHC CDR1；
（ii）式中X₁がKまたはGであり、X₂がNまたはDであり、X₃がTまたはAであり、かつX₄がTまたはAであるQIRNX₁NYX₂YAX₃YYX₄ESLEG（配列番号：2）のHC CDR2；
（iii）X₁がFまたはHであり、X₂がAまたはFであり、かつX₃がYまたはNである、YYYDGX₁X₂DYFDX₃（配列番号：5）のHC CDR3；
（iv）RSSQSLVYSYGNTYLH（配列番号：9）またはSASSSISSNYLH（配列番号：10）のLC CDR1；
（v）式中X₁がNまたはRであり、X₂がVまたはTであり、X₃がRまたはLであり、かつX₄がFまたはAである、X₁X₂SNX₃X₄S（配列番号：13）のLC CDR2；および／または
（vi）式中X₁がSまたはQであり、X₂がGであり、X₃がTまたはSであり、X₄がHまたはSであり、X₅がVまたはIであり、かつX₆がWまたはYである、X₁QX₂X₃X₄X₅PX₆T（配列番号：16）のLC CDR3、を含んでもよい。

いくつかの例において、本明細書に記述した抗CD40抗体は：
（i）式中X₁がYであり、X₂がTまたはIであり、X₃がTまたはIであり、X₄がDまたはSであり、X₅がYであり、X₆がNまたはWであり、X₇がMまたはIであり、かつX₈がDまたはHである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）のHC CDR1；
（ii）式中X₁がDまたはRであり、X₂がNまたはDであり、X₃がDまたはGであり、X₄がIまたはGであり、X₅がSまたはTであり、X₆がIまたはKであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PNNX₃X₄X₅X₆YNX₇KFRX₈（配列番号：3）のHC CDR2；
（iii）RFAY（配列番号：6）またはGVITTLVAGDY（配列番号：7）のHC CDR3；
（iv）式中X₁がIまたはLであり、X₂がYまたはNであり、かつX₃がIまたはKである、KASQNX₁X₂X₃YLN（配列番号：11）のLC CDR1；
（v）式中X₁がNまたはDであり、かつX₂がQまたはYである、NTX₁NLX₂T（配列番号：14）のLC CDR2；および
（vi）式中X₁がLまたはMであり、X₂がSまたはNであり、かつX₃がSまたはVである、X₁QHX₂X₃RRT（配列番号：17）のLC CDR3、を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、ヒトCD40を非ヒトCD40（たとえば、カニクイザルCD40）と交差反応してもよい。その他の実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、ヒトCD40に特異的であってもよい。いくつかの例において、抗CD40抗体は、細胞表面上に発現されるCD40と結合してもよい。このような抗体は、アゴニストであってもよい（たとえば、CD40を発現する免疫細胞においてCD40を媒介した細胞シグナリングを誘発することができる）。

本明細書に記述した抗CD40抗体のいずれも、全長抗体またはこれらの抗原結合断片であってもよい。いくつかの例において、抗体は、全長抗体であり、これはIgG分子（たとえば、IgG4分子）であってもよい。たとえば、抗体は、そのFcドメインにおいてS228Pアミノ酸置換を有するIgG4分子であってもよい。その他の例において、抗体は、Fabまたは単鎖抗体である。本明細書に記述した抗CD40抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、（Fc-FcR相互作用を介さない）CD40およびFcγRIIBの両方を結合する二重特異性抗体とすることができる。

別の態様において、本開示は、本明細書に記述した抗CD40抗体のいずれかを一括してコードする、単離された核酸または核酸のセットを特徴とする。いくつかの実施形態において、核酸または核酸のセットは、1つのベクター上または2つのベクター上（たとえば1つまたは2つの発現ベクター上）に位置する。また、本明細書に記述した抗CD40抗体をコードする単離された核酸または核酸のセット（たとえば、発現ベクターなどのベクター）を含む宿主細胞も本明細書において提供される。

なお別の態様において、本開示は、本明細書に記述した抗CD40抗体のうちの1つ以上、またはそのようなものをコードする核酸もしくは核酸のセットを含む医薬組成物と、薬学的に許容される担体とを提供する。

さらに、本開示は、対象における免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、その必要がある対象に、有効量の本明細書にも記述したとおりの医薬組成物へと製剤化されてもよい本明細書に記述した抗CD40抗体のいずれかを投与することを含む。いくつかの例において、治療の必要がある対象は、本明細書に記述した標的疾患、たとえば癌または免疫異常を有する、これを有する疑いがある、またはこれに対するリスクがあるヒト患者とすることができる。

さらに、本開示は、抗CD40抗体を産生するための方法を提供し、この方法は：（i）抗CD40抗体の発現を可能にする条件下で本明細書に記述したものの宿主細胞を培養すること；および（ii）このようにして細胞培養から産生された抗CD40抗体を採取することを含む。

また、本明細書に記述したとおりの標的疾患および障害のいずれかを治療する際の使用のための医薬組成物、本明細書に記述した抗CD40抗体のうちの1つ以上および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、並びに標的疾患および障害を治療する際の使用のために医薬を製造するための抗CD40抗体のいずれかの使用も本開示の範囲内である。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに示すために含まれ、本明細書において提示された具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、これをより良好に理解することができる。

図１は、ＦＡＣＳ解析によってＣＨＯ細胞上に発現されたヒトＣＤ４０に対する結合において示されたとおりの例示的な抗ＣＤ４０抗体の用量応答を示すグラフである。 図２Ａ〜２Ｂは、サイトカイン産生によって証明したときの健常ドナーからのヒト樹状細胞（ＤＣ）（図２Ａ）またはＢ細胞（図２Ｂ）の活性化において示されたとおりの例示的な抗ＣＤ４０抗体の活性を示す棒グラフを含む。図２Ａの上段パネルおよび図２Ｂは、ＩＬ−１２の産生を示す棒グラフであり、および図２Ａの下方パネル。 同上。 図３は、ＥＬＩＳＡによって決定したときのヒトＣＤ４０タンパク質に対する示したとおりの組換えキメラ抗体の結合を示すグラフである。 図４は、ＦＡＣＳによって決定したときの細胞性ヒトＣＤ４０に対する示したとおりのキメラ抗体の結合を示すグラフである。 図５は、ＥＬＩＳＡによって決定したときのカニクイザルＣＤ４０タンパク質に対する示したとおりのキメラ抗体の結合を示すグラフである。 図６Ａ〜６Ｂは、溶液における（図６Ａ）またはヒトＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ細胞の共培養における（図６Ｂ）のいずれかで、抗ＣＤ４０抗体による健常ドナーからのヒト樹状細胞（ＤＣ）の活性化に対して示したとおりの例示的な抗ＣＤ４０抗体の活性を示す棒グラフのセットを含む。図６Ａおよび図６Ｂにおける上段パネルは、ＣＤ８６の産生を示す棒グラフである。図６Ａおよび図６Ｂにおける中段パネルは、ＩＬ−１２の産生を示す棒グラフである。図６Ａおよび図６Ｂにおける下段パネルは、ＩＬ−８の産生を示す棒グラフである。 同上。 同上。 同上。 図７Ａ〜７Ｃは、マウスにおいて示されたときのキメラ抗体の薬物動態学を示すグラフのセットを含む。それぞれのグラフは、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対する抗体の３ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量（ｎ＝４／時点）後の異なるキメラ抗体の個々の血漿濃度−時間プロフィールを示す。図７Ａは、ＬＹＶ３７６（上段パネル）およびＬＹＶ３７７（下段下段）についてのデータを示す。図７Ｂは、ＬＹＶ３７８（上段パネル）およびＬＹＶ３７９（下段パネル）についてのデータを示す。図７Ｃは、ＬＹＶ３９１についてのデータを示す。 同上。 同上。

CD40は、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。これは、樹状細胞、Bリンパ球、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、繊維芽細胞および平滑筋細胞を含む多数の正常な細胞上に発現される48kDaの細胞表面糖タンパク質である。（Elgueta et al., Immunol Rev. 2009）。また、CD40は、B-リンパ腫細胞上に、および多数の固形腫瘍の細胞上に発現することも見いだされた（Remer et al., Curr Top Microbiol Immunol. 2014; 405:165-207）。ほとんどの場合、CD40は、構成的に発現されるが；しかし、これはまたLPS、IL1βp、INF-γおよびGM-CSFなどの成熟シグナルによって抗原提示細胞においてアップレギュレートすることもできる（Ma et al., Semin Immunol. 2009; 21(5): 265-272）。

CD40は、関与する細胞のタイプに応じて、多数の様々な効果を有することを示してきた。たとえば、B細胞上のCD40シグナリングの活性化は、B細胞増殖および分化、免疫グロブリン産生、アイソタイプスイッチおよびB細胞メモリー発生を刺激する。比較して、樹状細胞および単球上のCD40シグナリングは、共刺激分子の発現および炎症性サイトカイン（たとえば、IL-8、IL-12およびTNF-α）の分泌につながり、Tリンパ球の効率的な活性化を提供する。CD40活性の増加は、T細胞プライミングの増加を示し、またCD40発現樹状細胞ついては、Th1細胞性免疫応答の発生が好都合であることを示した。

CD40/CD40Lシグナリング経路は、免疫応答をトリガーする（たとえば、樹状細胞を活性化する）際に重要な役割を果たし、癌患者における抗腫瘍免疫応答につながる。Gladue et al., Cancer Immunol Immunother (2011) 60:1009-1017。CD40に結合することができる抗体が本明細書において提供される。驚くべきことに、このような抗CD40抗体は、特にFcγRIIBを発現する細胞の存在下において、アゴニスト効果を示して樹状細胞およびB細胞の活性を増強する。

アゴニスト抗CD40抗体は、CD40の天然リガンド（たとえば、CD40L）の活性を模倣し、そしてCD40によって媒介される細胞シグナリングをトリガーしてDC活性を誘導する場合がある。したがって、本明細書に記述したアゴニスト抗CD40抗体は、CD40/CD40Lシグナリング経路を介して免疫応答を調節することにおいて有効であり、したがって免疫応答を調節するうえで、たとえば樹状細胞およびその他の免疫細胞の活性を増強するうえで有効であり、これにより癌および免疫異常などの疾患の治療に利益を与えることが予想される。

CD40に結合する抗体
本開示は、CD40を結合する抗体を提供し、これは、任意の供与源、たとえばヒトCD40および／またはサルCD40であってもよい。このような抗CD40抗体（すなわち、CD40抗原を結合する抗体）は、特定の種のCD40（たとえば、ヒトCD40）を特異的に結合してもよい。あるいは、本明細書に記述した抗CD40抗体は、異なる種のCD40抗原と交差反応してもよい（たとえば、ヒトCD40およびサルCD40の両方に結合する）。いくつかの例において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、細胞表面CD40、たとえば表面上にCD40を天然に発現する細胞（たとえば、樹状細胞または本明細書に記述した細胞のその他のタイプ）上に発現されたCD40を結合することができる。本明細書に記述した抗CD40抗体は、アゴニスト抗体であってもよく、これは、CD40に結合するとCD40によって媒介される細胞シグナリングを誘発する。本明細書に記述した抗CD40抗体のアゴニスト活性は、当該技術分野において公知のルーチンの方法によって、または下の実施例に記述したアッセイによって決定することができる。

CD40は、当該技術分野において周知のタンパク質である。たとえば、NCBI GenBankアクセッション番号NP_001241.1およびXP_005569275.1は、それぞれヒトおよびカニクイザルCD40抗原についての情報を提供する。例示的なヒトおよびカニクイザルCD40ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に提供してある。

ヒトCD40（配列番号：38）：
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ

カニクイザル（Macaca fascicularis）CD40（配列番号：39）：
MVRLPLQCVLWGCLLTAVYPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETRCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGLHCTSESCESCVPHRSCLPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCRPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRQRALVVIPICLGILFVILLLVLVFIKKVAKKPNDKVPHPKQEPQEINFPDDLPGSNPAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ

その他の種由来のCD40ポリペプチドが当該技術分野において公知であり、またクエリとしてヒト配列またはカニクイザル配列を使用して、一般に利用可能な遺伝子データベース、たとえばGenBankから得ることができる。

本明細書に記述した抗体（交換可能に複数形で使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置した、少なくとも1つの抗原識別部を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等などの標的に対して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書に使用される、用語「抗体」は、無処置の（すなわち、全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、（Fab、Fab'、F（ab'）2、Fvなどの）その抗原結合断片、単鎖（scFv）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、ナノボディ、直鎖抗体、単鎖抗体、多特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、並びに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体および共有結合で修飾された抗体を含む必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意のその他の修飾された構成も包含する。抗体は、IgD、IgE、IgG、IgAまたはIgM（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、また抗体は、いずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、またこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けられる場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および3次元構成は、周知である。

典型的な抗体分子は、重鎖可変領域（V_H）および軽鎖可変領域（V_L）を含み、これらは、通常抗原結合に関与する。さらに、V_H領域およびL_H領域は、「相補性決定領域」（「CDR」）としても知られる、「フレームワーク領域」（「FR」）としても知られるより保存された領域を有して散在する、超可変性の領域へと細分することができる。それぞれのV_HおよびV_Lは、典型的には3つのCDRおよび4つのFRで構成され、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、当該技術分野において公知の方法論、たとえばKabat定義、Chothia定義、AbM定義および／または接触定義（全て当該技術分野において周知である）を使用して正確に特定することができる。たとえば、Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948;およびAlmagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)を参照されたい。また、hgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも参照されたい。

本明細書に記述した抗CD40抗体は、全長抗体であってもよく、これは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含有し、それぞれが可変ドメインおよび定常ドメインを含む。あるいは、抗CD40抗体は、全長抗体の抗原結合断片とすることができる。全長抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（i）Fab断片、V_L、V_H、C_LおよびC_H1ドメインからなる一価の断片；（ii）F（ab'）₂断片、ヒンジ領域にてジスルフィドブリッジによって連結された2つのFab断片を含む二価の断片；（iii）V_HおよびC_H1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単一アームのV_LおよびV_HドメインからなるFv断片、（v）V_HドメインからなるdAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；および（vi）機能性を保持する単離された相補性決定領域（CDR）が挙げられる。さらにまた、Fv断片の2つのドメイン、V_LおよびV_Hは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、合成リンカーによって組換え方法を使用して連結することができ、これによりこれらを、V_LおよびV_H領域が対になって単鎖Fv（scFv）として知られる一価の分子を形成する単一タンパク質鎖とすることができる。たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい。

本明細書に記述した抗体は、マウス、ラット、ヒトまたは任意のその他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）のものとすることができる。このような抗体は、天然に存在せず、すなわちヒトの行為（たとえば、このような動物を所望の抗原もしくはその断片で免疫すること、または抗体ライブラリーから単離されること）を伴わずには、動物において産生されないことになる。

本明細書に記述した抗体のいずれも、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかとすることができる。「モノクローナル抗体」は、同種抗体集団を指し、また「ポリクローナル抗体」は、異種抗体集団を指す。これらの2つの用語は、抗体の供与源またはそれが作製される様式を限定しない。

一例において、本明細書に記述した方法において使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するその抗原結合断片である非ヒト（たとえばマウス）抗体の形態を指す。大部分については、ヒト化抗体は、レシピエントのCDR由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、または移入されたCDRもしくはフレームワーク配列においても見出されないが、抗体性能をさらに洗練し、および最適化するために含まれた残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここでCDR領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、またFR領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Fc）、典型的にヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含むことになる。抗体は、WO99/58572に記載されているように修飾されたFc領域を有してもよい。ヒト化抗体のその他の形態は、元の抗体に関して変化された1つ以上のCDR（1、2、3、4、5または6）を有し、またこれは、元の抗体からの1つ以上のCDRに「由来する」1つ以上のCDRと称される。また、ヒト化抗体は、親和性成熟も含んでいてもよい。

また、ヒト化抗体を構築するための方法は、当該技術分野において周知である。たとえば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)を参照されたい。一例において、親非ヒト抗体のV_HおよびV_Lの可変領域を当該技術分野において公知の方法に従って3次元分子モデリング解析に供する。次に、正確なCDR構造の形成のために重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデリング解析を使用して特定する。平行して、親非ヒト抗体のものに相同的であるアミノ酸配列を有するヒトV_HおよびV_L鎖を、検索クエリとして親V_HおよびV_L配列を使用して任意の抗体遺伝子データベースから特定する。次いで、ヒトV_HおよびV_Lアクセプター遺伝子を選択する。

選択されたヒトアクセプター遺伝子内のCDR領域は、親非ヒト抗体またはその機能変異体からのCDR領域と置換することができる。必要に応じて、CDR領域と相互作用することに重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基を使用してヒトアクセプター遺伝子における対応する残基を置換することができる。

別の例において、本明細書に記述した抗体は、キメラ抗体であり、これは、ヒト抗体からの重定常領域もしくはその一部および／または軽定常領域もしくはその一部を含むことができる。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または可変領域の一部および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽および重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（たとえば、マウス、ウサギおよびラットなどの非ヒト哺乳動物）の1つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方で、定常領域は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体における配列に相同である。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、可変領域および／または定常領域において行うことができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、対応する標的抗原（たとえば、ヒトCD40抗原）またはそのエピトープに特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野において十分に理解された用語である。分子は、これが特定の標的抗原と、これが他の標的とするより頻繁に、より迅速に、より長期間で、かつ／またはより大きな親和性で反応する場合、「特異的結合」を示すと言われる。抗体は、これがその他の物質に結合するよりも、より高い親和性、アビディティーで、より迅速に、かつ／またはより長期間で、これが結合する場合、標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。たとえば、抗原（CD40）またはその中の抗原性エピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、これがその他の抗原または同じ抗原におけるその他のエピトープに結合するより大きな親和性、アビディティーで、より迅速に、かつ／またはより長期間で、この標的抗原を結合する抗体である。また、たとえば、第1の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第2の標的抗原に特異的に、または優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいこともこの定義で理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（これを含むことができるが）。いくつかの例において、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、その他の抗原または同じ抗原におけるその他のエピトープに結合しない場合がある（すなわち、ベースライン結合活性のみを従来の方法において検出することができる）。あるいは、または加えて、本明細書に記述した抗CD40抗体は、サル対応物と関連してヒトCD40またはその断片を特異的に結合してもよく、または逆もまた同様であってもよい（たとえば、同じアッセイ条件下で同じアッセイにおいて決定したときにある抗原に対してその他のものよりも少なくとも10倍高い結合親和性を有する）。その他の例において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、ヒトおよび非ヒトCD40（たとえば、サル）に交差反応してもよく、たとえばヒトおよび非ヒトCD40に対する結合親和性における差異は、5倍より少なく、たとえば2倍より少なく、または実質的に同等である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、標的抗原（たとえば、CD40）またはその抗原性エピトープに対して適切な結合親和性を有する。本明細書において使用される、「結合親和性」は、見かけの会合定数、すなわちK_Aを指す。K_Aは、解離定数（K_D）の逆数である。本明細書に記述した抗CD40抗体は、標的抗原または抗原性エピトープに対して少なくとも10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10Mまたはより低い結合親和性（K_D）を有してもよい。増加された結合親和性は、減少されたK_Dに対応する。第2の抗原に比べて第1の抗原に対する抗体のより高い親和性結合は、第2の抗原を結合するためのK_A（または数値K_D）よりも高い第1の抗原を結合するためのK_A（またはより小さい数値K_D）によって示すことができる。このような場合、抗体は、第2の抗原（たとえば、第2のコンフォメーションにおける第1のタンパク質もしくはその擬態；または第2のタンパク質）と比べて第1の抗原（たとえば、第1のコンフォメーションにおける同じ第1のタンパク質またはその擬態）に対して特異性を有する。結合親和性における差異（たとえば、特異性またはその他の比較について）は、少なくとも1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000または10⁵倍であることができる。いくつかの実施形態において、抗CD40抗体のいずれも、標的抗原またはその抗原性エピトープに対する抗体の結合親和性を増加するためにさらに親和性成熟されてもよい。

結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ELISA、表面プラズモン共鳴または分光法（たとえば、蛍光アッセイを使用して）を含む種々の方法によって決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、HBS-P緩衝液（10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005%（v/v） Surfactant P20）におけるものである。これらの技法は、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質の濃度を測定するために使用することができる。一般に、結合した結合タンパク質の濃度（［結合］）は、以下の方程式によって遊離標的タンパク質の濃度（［遊離］）に関連する：
[結合]=［遊離］/（Kd+［遊離］）

時には、たとえば、ELISAまたはFACS解析などの方法を使用して決定される親和性の定量的測定を得ることはK_Aに比例することで十分であるので、K_Aの正確な決定をすることは、必ずしも必要でないが、それ故に、たとえば機能アッセイ、たとえばインビトロでの、またはインビボでのアッセイにおける活性によって、親和性の定性的測定を得るために、または親和性についての推論を得るために、より高い親和性がたとえば2倍より高いかどうか決定することなどの、比較のために使用することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述したとおりの抗CD40アゴニスト抗体は、重鎖フレームワーク領域によって接続された重鎖CDR1領域（HC CDR1）、重鎖CDR2領域（HC CDR2）および重鎖CDR3領域（HC CDR3）を含む重鎖可変領域を含む。抗CD40抗体のHC CDRは、以下のコアモチーフのうちの1つ以上を含んでもよい。
HC CDR1：
（i）式中X₁がFまたはYであり、X₂がN、TまたはIであり、X₃がN、TまたはIであり、X₄がD、SまたはNであり、X₅がSまたはYであり、X₆がF、N、WまたはGであり、X₇がM、IまたはLであり、かつX₈がN、DまたはHである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）。いくつかの実施形態において、X₁はFであり、X₂はNであり、X₃はNであり、X₄はDであり、X₅はSまたはYであり、X₆はFであり、X₇はMであり、かつX₈はNである。さらなる実施形態において、X₁はYであり、X₂はTまたはIであり、X₃はTまたはIであり、X₄はDまたはSであり、X₅はYであり、X₆はNまたはWであり、X₇はMまたはIであり、かつX₈はDまたはHである。
HC CDR2：
（i）式中X₁がKまたはGであり、X₂がNまたはDであり、X₃がTまたはAであり、かつX₄がTまたはAである、QIRNX₁NYX₂YAX₃YYX₄ESLEG（配列番号：2）。いくつかの実施形態において、X₁はKまたはGであり、X₂はNまたはDであり、X₃はTまたはAであり、かつX₄はTまたはAである
（ii）式中X₁がD、RまたはSであり、X₂がN、DまたはSであり、X_2'がNまたはSであり、X_3'がNまたはGであり、X₃がDまたはGであり、X₄がI、GまたはVであり、X₅がSまたはTであり、X₆がI、KまたはYであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PX_2'X_3'X₃X₄X₅X₆YX_6'X₇X_7'X_7''X_8'X₈（配列番号：41）。いくつかの実施形態において、X₁はDまたはRであり、X₂はNまたはDであり、X₃はDまたはGであり、X₄はIまたはGであり、X₅はSまたはTであり、X₆はIまたはKであり、X_6'はNまたはRであり、X₇はQ、EまたはDであり、X_7'はKまたはSであり、X_7''はFまたはVであり、X_8'はRまたはKであり、かつX₈はGまたはYである。いくつかの実施形態において、HC CDR2は、式中X₁がDまたはRであり、X₂がNまたはDであり、X₃がDまたはGであり、X₄がIまたはGであり、X₅がSまたはTであり、X₆がIまたはKであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PNNX₃X₄X₅X₆YNX₇KFRX₈（配列番号：3）である。いくつかの実施形態において、X₁はDまたはRであり、X₂はNまたはDであり、X₃はDまたはGであり、X₄はIまたはGであり、X₅はSまたはTであり、X₆はIまたはKであり、X₇はQまたはEであり、かつX₈はGまたはYである。
（iii）SISPSGGVTYYRDSVKG（配列番号：4）
HC CDR3：
（i）式中X₁がFまたはHであり、X₂がAまたはFであり、かつX₃がYまたはNである、YYYDGX₁X₂DYFDX₃（配列番号：5）。いくつかの実施形態において、X₁はFまたはHであり、X₂はAまたはFであり、かつX₃はYまたはNである；
（ii）RFAY（配列番号：6）；
（iii）GVITTLVAGDY（配列番号：7）；または
（iv）PFLGWGGANWIAH（配列番号：8）

本明細書に記述した抗CD40抗体は、軽鎖フレームワーク領域によって接続された軽鎖CDR1領域（LC CDR1）、軽鎖CDR2領域（LC CDR2）および軽鎖CDR3領域（LC CDR3）を含む軽鎖可変領域をさらに含んでもよい。抗CD40抗体のLC CDRは、以下のコアモチーフのうちの1つ以上を含んでもよい：
LC CDR1：
（i）RSSQSLVYSYGNTYLH（配列番号：9）
（ii）SASSSISSNYLH（配列番号：10）
（iii）X₁がKまたはLであり、X₂がQまたはEであり、X₃がIまたはLであり、X₄がY、NまたはSであり、X₅がI、KまたはNであり、かつX₆がNまたはAである、X₁ASX₂X₃X₄X₅LX₆（配列番号：42）。いくつかの実施形態において、LC CDR1は、式中X₁がIまたはLであり、X₂がYまたはNであり、かつX₃がIまたはKである、KASQNX₁X₂X₃YLN（配列番号：11）である。いくつかの実施形態において、X₁はIまたはLであり、X₂はYまたはNであり、かつX₃はIまたはKである。いくつかの実施形態において、LC CDR1は、（iv）LASEDISNDLA（配列番号：12）である。
LC CDR2：
式中X₁がN、RまたはFであり、X₂がVまたはTであり、X₃がS、NまたはDであり、X₄がNまたはRであり、X₅がRまたはLであり、X₆がF、A、Q、YまたはLであり、かつX₇がS、TまたはDである、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇（配列番号：43）。いくつかの実施形態において、LC CDR2は：
（i）式中X₁がNまたはRであり、X₂がVまたはTであり、X₃がRまたはLであり、かつX₄がFまたはAである、X₁X₂SNX₃X₄S（配列番号：13）。いくつかの実施形態において、X₁はNまたはRであり、X₂はVまたはTであり、X₃はRまたはLであり、かつX₄はFまたはAである。
（ii）式中X₁がNまたはDであり、かつX₂がQまたはYである、NTX₁NLX₂T（配列番号：14）。いくつかの実施形態において、X₁はNまたはDであり、かつX₂はQまたはYである。
（iii）FVDRLLD（配列番号：15）、である。
LC CDR3：
（i）式中X₁がSまたはQであり、X₂がGまたはSであり、X₃がT、SまたはYであり、X₄がH、SまたはKであり、X₅がV、IまたはYであり、かつX₆がW、YまたはPである、X₁QX₂X₃X₄X₅PX₆T（配列番号：16）。いくつかの実施形態において、X₁はSまたはQであり、X₂はGであり、X₃はTまたはSであり、X₄はHまたはSであり、X₅はVまたはIであり、かつX₆はWまたはYである。
（ii）式中X₁がLまたはMであり、X₂がSまたはNであり、かつX₃がSまたはVである、X₁QHX₂X₃RRT（配列番号：17）。いくつかの実施形態において、X₁はLまたはMであり、X₂はSまたはNであり、かつX₃はSまたはVである。

多数の例示的な抗CD40抗体を以下に提供してある（CDRは太字体である）。

例示的な抗体クローンのV_HおよびV_L鎖の配列アライメントを上記に提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD49抗体は、本明細書に記述した例示的な抗体のいずれかと同じCD40ポリペプチドのエピトープに結合する（たとえば、19G6D6（LYV376）、13F1A7（LYV377）、9F12D9（LYV378）、17C5C2（LYV379）および36G7B8（LYV391）、または例示的な抗体がCD40抗原に結合することに対して完全に逆らう。

「エピトープ」は、抗体によって認識され、かつ結合される標的抗原上の部位を指す。この部位は、アミノ酸成分で完全に構成すること、タンパク質のアミノ酸の化学的修飾（たとえば、グリコシル部分）で完全に構成すること、またはこれらの組み合わせで構成することができる。オーバーラップするエピトープは、少なくとも1つの共通のアミノ酸残基を含む。エピトープは、直鎖状とすることができ、これは、典型的には6〜15アミノ酸の長さである。あるいは、エピトープは、コンホメーショナルとすることができる。抗体が結合するエピトープは、たとえばエピトープマッピング法（たとえば、以下の記述を参照されたい）などのルーチンの技術によって決定することができる。本明細書に記述した例示的な抗体と同じエピトープを結合する抗体は、例示的な抗体と正確に同じエピトープまたは実質的にオーバーラップするエピトープ（たとえば、3つより少ないオーバーラップしないアミノ酸残基、2つより少ないオーバーラップしないアミノ酸残基または1つのみのオーバーラップしないアミノ酸残基を含有する）に結合してもよい。2つの抗体が同種抗原に対する結合を互いに競合するかどうかは、競合アッセイによって決定することができ、これは、当該技術分野において周知である。

上から下へ、配列は配列番号：22、26、18、20および24に対応する。

上から下へ、配列は、配列番号：19、23、27、25および21に対応する。

いくつかの例において、抗CD40抗体は、本明細書に記述した例示的な抗体と同じV_Hおよび／またはV_L CDRを含む。同じV_Hおよび／またはV_L CDRを有する2つの抗体は、同じアプローチ（たとえば、当該技術分野において公知のとおりのKabatアプローチまたはChothiaアプローチ）によって決定したときに、これらのCDRが同一であることを意味する。このような抗CD40抗体は、本明細書に記述した例示的な抗体と比較して同じV_H、同じV_Lまたは両方を有してもよい。

また、本明細書に開示されたような例示的な抗CD40抗体のいずれかの機能変異体も、本開示の範囲内である。このような機能変異体は、構造的、および機能的の両方で、例示的な抗体に実質的に類似する。機能変異体は、例示的な抗体と実質的に同じV_HおよびV_L CDRを含む。たとえば、これは、抗体の総CDR領域において5つまで（たとえば、4、3、2または1）のアミノ酸残基変異のみを含んでいてもよく、また実質的に類似の親和性を有する（たとえば、同じ順序でK_D値を有する）CD40の同じエピトープを結合する。あるいは、または加えて、アミノ酸残基変異は、保存的アミノ酸残基置換である。本明細書に使用される、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対電荷またはサイズ特徴を変化させないアミノ酸置換を指す。変異体は、このような方法を編集する参考文献、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, または Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkにおいて見出されるものるなどの当業者に公知のポリペプチド配列を変化させるための方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下のグループ内のアミノ酸の間でなされる置換を含む：（a）M、I、L、V；（b）F、Y、W；（c）K、R、H；（d）A、G；（e）S、T；（f）Q、N；および（g）E、D。

いくつかの実施形態において、抗CD40抗体は、本明細書に記述した例示的な抗体のV_H CDRと比較したときに、個々に、または一括して、少なくとも80%（たとえば、85%、90%、95%または98%）の配列同一性である重鎖CDRを含んでもよい。あるいは、または加えて、抗CD40抗体は、本明細書に記述した例示的な抗体としてのV_L CDRと比較して、個々に、または一括して、少なくとも80%（たとえば、85%、90%、95%または98%）の配列同一性である軽鎖CDRを含んでもよい。

2つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modified as in Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン20）に組み込まれている。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア=50、語長=3で行って、関心対象のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。ギャップが2つの配列の間に存在する場合、Gapped BLASTをAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているとおりに利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（たとえば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体のいずれかの重鎖は、さらに重鎖定常領域（CH）またはその一部分（たとえば、CH1、CH2、CH3またはその組み合わせ）を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、任意の適切な起源、たとえばヒト、マウス、ラットまたはウサギのものとすることができる。１つの特定の例において、重鎖定常領域は、本明細書に記述した任意のIgGサブファミリーのヒトIgG（ガンマ重鎖）由来である。

一例において、定常領域は、IgG4などのヒトIg分子由来であり、その例示的なアミノ酸配列を以下に提供してある（配列番号：40；S228は、太字体である）：

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、抗体がFc受容体、たとえばFcγRIIB（CD32B）に対するよりも高い結合親和性を有するように野生型対応物と比較して変異したFc領域を含んでいてもよい。このような抗体は、効率的にFcγRIIB発現細胞を結合し、これにより治療有効性を増強してもよい。たとえば、抗CD40抗体は、IgG4分子（たとえば、配列番号：40）からのFc領域を含んでいてもよく、これは、示したとおりの位置（太字体にし、および下線を引いた；S228P）においてS/P置換を含んでいてもよい。あるいは、本明細書に記述した抗体の重鎖定常領域は、単一のドメイン（たとえば、CH1、CH2またはCH3）または単一のドメインのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。

必要に応じて、本明細書に記述した抗CD40抗体は、修飾定常領域を含んでいてもよい。たとえば、これは、免疫学的に不活性で、たとえば補体を媒介した溶解をトリガーしない、または抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ADCC）を刺激しない修飾定常領域を含んでいてもよい。ADCC活性は、米国特許第5,500,362号に開示された方法を使用して評価することができる。その他の実施形態において、定常領域は、Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624；PCT特許出願第PCT/GB99/01441号；および／または英国特許出願第9809951.8号に記載されたように修飾される。

本明細書に記述した抗CD40抗体のいずれかは、軽鎖定常領域をさらに含む軽鎖を含んでいてもよく、これは、当該技術分野において公知の任意のCLとすることができる。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。その他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。

抗体重鎖および軽鎖定常領域は、当該技術分野において周知であり、たとえばIMGTデータベース（www.imgt.org）において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであり、その両方は、本明細書において参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態において、抗CD40抗体は、CD40およびFcγRIIBの両方に（Fc-FcR相互作用を介さずに）結合することができる二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、第1の抗原結合性領域および第2の抗原結合性領域を含んでもよく、そのそれぞれは、V_H/V_L対を含んでもよい。第1の抗原結合性領域は、CD40を結合し、一方で第2の抗原結合性領域は、FcγRIIBを結合する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗CD40抗体は、キメラ抗体であり、これは、本明細書に記述した例示的な抗体のいずれかに由来するVHおよびVL領域、並びにヒト免疫グロブリンからの重鎖および軽鎖定常領域を含んでいてもよい。多くの例が以下に提供される。
キメラ抗体：ヒトIgG4SPにおけるLYV376=19G6D6のHC
evqlqqsgpelvkpgasvkipckasgytftdynmdwvkqshgkslewigdinpnndisiynqkfrgkatltvdkssstaymelrsltsedtavyycarrfaywgqgtlvtvsaASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
（配列番号：28）
キメラ抗体：ヒトカッパにおけるLYV376=19G6D6のLC
eivltqspttmaaspgekititcsasssissnylhwyqqkpgsspkvliyrtsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltigtmeaedvatyycqqgssipytfgggtkleikrTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号：29）
キメラ抗体：ヒトIgG4SPにおけるLYV377=13F1A7のHC
evqiletggglvkpggslrlscatsgfnfndsfmnwvrqapgkglewvaqirnknynyatyyteslegrvtisrddsksrvylqvsslraedsavyyctsyyydgfadyfdywgqgvmvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：30）
キメラ抗体：ヒトカッパにおけるLYV377=13F1A7のLC
dikmtqspsflsasvgdsvtftckasqniyiylnwyqqkfgeapklliyntnnlqtgipsrfsgsesgtvftltisslqpedvatyfclqhssrrtfgggtklelkrTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号：31）
キメラ抗体：ヒトIgG4SにおけるLYV378=9F12D8のHC
evhlvesggglvqpgrslklscaasgftftnyglhwirqaptkglewvasispsggvtyyrdsvkgrftisrdngkttlhlqmdslrsedtatyycalpflgwgganwiahwgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：32）
キメラ抗体：ヒトカッパにおけるLYV378=9F12D8のLC
diqmtqspaslsaslgetvsieclasedisndlawyqqksgkspqlliyfvdrlldgvpsrfsgsgsgtrhslkisgmqpedeadyfcqqsykypptfgggtklelkrTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号：33）
キメラ抗体：ヒトIgG4SPにおけるLYV379=17C5C2のHC
evhiletggglvkpggslglscttsgfnfndyfmnwvrqapgkglewvaqirngnydyaayyaeslegrvtisrddskssvnlqvsslraedtaiyyctsyyydghfdyfdnwghgvmvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：34）
キメラ抗体：ヒトカッパにおけるLYV379=17C5C2のLC
dikvtqspsflsasvgdratinckasqnlnkylnwyqqkpgeppklliyntdnlytgipsrfsgsgsvadftltisglqpedvatyfcmqhnvrrtfgggtklelkrTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号：35）
キメラ抗体：hG4SPにおけるLYV391=36G7B8のHC
qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgyifisywihwlkqrpgrglewigridpnnggtkynekfrykasltvdkssstaymqlssltsedsavyyctkgvittlvagdywgqgttltvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：36）
キメラ抗体：ヒトカッパにおけるLYV391=36G7B8のLC
dvvmtqiplslpvsigdqasiscrssqslvysygntylhwflqkpgqspklliynvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaedlgvyfcsqgthvpwtfgggtkleikrTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号：37）

抗CD40抗体の調製
本明細書に記述したCD40を結合することができる抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。たとえば、Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい。

いくつかの実施形態において、標的抗原（たとえば、CD40またはこれらの断片）に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製することができる。任意選択的にKLHなどの担体タンパク質に結合された、全長標的抗原またはその断片を使用してその抗原に結合する抗体を産生するための宿主動物を免疫することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、さらに本明細書に記述したように抗体刺激および産生のための確立された、かつ従来の技法に沿っている。マウス、ヒト化およびヒト抗体の産生のための一般的な技法は、当該技術分野において公知であり、また本明細書に記述されている。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそこからの抗体産生細胞を、ヒトを含む哺乳動物ハイブリドーマ細胞株の産生の基本として役に立つように操作することができることが意図される。典型的には、宿主動物には、本明細書に記述したとおりを含む、ある量の免疫原を腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内および／または皮内に接種する。

ハイブリドーマは、Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497またはBuck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)によって修正されたとおりの一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用してリンパ球および不死化した骨髄腫細胞から調製することができる。利用できる骨髄腫株としては、X63-Ag8.653およびSalk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USAからのものが挙げられるが、これらに限定されず、ハイブリダイゼーションにおいて使用してもよい。一般に、本技法は、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合することを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、およびヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）培地などの選択増殖培地中で増殖して、ハイブリダイズされていない親細胞を除去する。本明細書に記述した培地のいずれかは、血清を補って、または伴わずに、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技法の別の選択肢として、EBV不死化B細胞を、本明細書に記述した抗CD40モノクローナル抗体を産生するために使用してもよい。ハイブリドーマを増殖し、かつ必要に応じて、サブクローニングし、そして上清を従来のイムノアッセイ手順（たとえば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性について分析する。

抗体の供与源として使用されてもよいハイブリドーマは、全ての派生株、CD40活性を増強することができるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞を包含する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用してインビトロで、またはインビボで増殖されてもよい。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィーおよび限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地または体液から単離さてもよい。望ましくない活性が存在する場合、たとえば固相に付着された免疫原でできた吸着剤上に調製物を流すこと、および望まれる抗体を免疫原から溶出すること、または放出することによって取り除くことができる。二機能性または誘導体化剤、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して抱合）、N-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOClまたはR1N=C=NR（式中RおよびR1は、異なるアルキル基である）を使用した、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターなどの免疫される種において免疫原性であるタンパク質に抱合された標的アミノ酸配列を含む標的抗原または断片での宿主動物の免疫化により、抗体（たとえば、モノクローナル抗体）の集団を得ることができる。

必要に応じて、関心対象の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）（たとえば、ハイブリドーマによって産生される）は、配列決定してもよく、そして次に、ポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためにベクターにクローン化してもよい。関心対象の抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクターに維持してもよく、そして次に、宿主細胞を将来の使用のために増殖し、および凍結することができる。あるいは、ポリヌクレオチド配列を、抗体を「ヒト化」するための、または親和性（親和性成熟）または抗体のその他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用してもよい。たとえば、抗体がヒトにおける臨床試験および治療において使用される場合、定常領域を、免疫応答を回避するためによりヒト定常領域に似せるように操作してもよい。抗体配列を遺伝子操作して、標的抗原に対するより高い親和性およびCD40の活性を増強する際により高い有効性を得ることが望ましい場合がある。1つ以上のポリヌクレオチド変化を抗体に対して行うこと、および標的抗原に対するその結合特異性をなおも維持することができることは、当業者には明らかであろう。

その他の実施形態において、完全ヒト抗体は、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することによって得ることができる。また、より望ましい（たとえば、完全ヒト抗体）またはより強い免疫応答を産生するようにデザインされたトランスジェニック動物をヒト化またはヒト抗体の産生のために使用してもよい。このような技術の例は、Amgen, Inc. (Fremont, Calif.)からのXenomouse（商標）およびMedarex, Inc. (Princeton, N.J.)からのHuMAb-Mouse（商標）およびTC Mouse（商標）である。別の選択肢において、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母技術によって組換えで作製してもよい。たとえば、米国特許第5,565,332号、同第5,580,717号、同第5,733,743号、および同第6,265,150号、並びにWinter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553）を使用して未免疫のドナー由来の免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。

あるいは、本明細書に記述した標的抗原に結合することができる抗体は、ルーチンの実務を介して適切な抗体ライブラリーから単離してもよい。抗体ライブラリーを使用して、ルーチンのスクリーニングプロセスを介して標的抗原（たとえば、CD40）に結合するタンパク質を特定することができる。選択プロセスにおいて、ポリペプチド成分を標的抗原またはその断片でプローブし、そしてポリペプチド成分が標的に結合する場合、抗体ライブラリーメンバーを、典型的には支持体上に保持することによって特定する。保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から回収し、かつ解析する。解析は、類似の、または異なる条件下における増幅およびその後の選択を含むことができる。たとえば、陽性および陰性選択を交互に行うことができる。また、解析は、ポリペプチド成分のアミノ酸配列を決定すること、および詳細な特性付けのためのポリペプチド成分の精製を含むことができる。

ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイまたは哺乳動物ディスプレイ技術を含む、本明細書に記述した標的抗原に結合することができる抗体を特定し、および単離するための当該技術分野において公知の多数のルーチンの方法がある。

無処置の抗体（全長抗体）の抗原結合断片は、ルーチンの方法を介して調製することができる。たとえば、F（ab'）₂断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生することができ、またFab断片は、F（ab'）₂断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生することができる。

ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体および二重特異的抗体などの遺伝子操作された抗体は、たとえば従来の組換え技術を介して産生することができる。一例において、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離およびシーケンスすることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供与源として役立つ。一旦単離されたら、DNAは、1つ以上の発現ベクターへと定置されてもよく、これは次いで、大腸菌（E. coli）細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。たとえば、PCT特許公開第WO87/04462号を参照されたい。次いで、DNAは、たとえば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコード配列に置換することによって、Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列の全てまたは部分を共有結合することによって修飾することができる。このようにして、標的抗原の結合特異性を有する遺伝子操作された抗体、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体などを調製することができる。

「キメラ抗体」の産生のために開発された技法は、当該技術分野において周知である。たとえば、Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; および Takeda et al. (1984) Nature 314:452を参照されたい。

また、ヒト化抗体を構築するための方法も、当該技術分野において周知である。たとえば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989) を参照されたい。一例において、親非ヒト抗体のV_HおよびV_Lの可変領域を当該技術分野において公知の方法に従って3次元分子モデリング解析に供する。次に、正確なCDR構造の形成のために重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデリング解析を使用して特定する。平行して、親非ヒト抗体のものに相同であるアミノ酸配列を有するヒトV_HおよびV_L鎖を、検索クエリとして親V_HおよびV_L配列を使用して任意の抗体遺伝子データベースから特定する。次いで、ヒトV_HおよびV_Lアクセプター遺伝子を選択する。

選択されたヒトアクセプター遺伝子内のCDR領域は、親非ヒト抗体またはその機能変異体からのCDR領域と置換することができる。必要に応じて、CDR領域（上の記述を参照されたい）と相互作用するうえで重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基を使用してヒトアクセプター遺伝子における対応する残基を置換することができる。

単鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することによって組換え技術を介して調製することができる。好ましくは、フレキシブルなリンカーが2つの可変領域の間に組み込まれる。あるいは、単鎖抗体の産生のために記述された技法（米国特許第4,946,778号および同第4,704,692号）をファージまたは酵母scFvライブラリーを産生するために適応することができ、またCD40に特異的なscFvクローンをルーチンの手順に従ってライブラリーから特定することができる。陽性クローンをさらなるスクリーニングに供してCD40活性を増強するものを特定することができる。

当該技術分野において公知の、および本明細書に記述した方法に従って得られた抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して特徴づけることができる。たとえば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを特定すること、または「エピトープマッピング」である。たとえば、Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999の第11章、において説明したように、抗体抗原複合体の結晶構造を解くこと、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイおよび合成ペプチドに基づいたアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴づけるための当該技術分野において公知の多くの方法がある。さらなる例において、エピトープマッピングを使用して抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状のエピトープ、すなわちアミノ酸の単一のストレッチに含まれるもの、または単一のストレッチ（一次構造直鎖状の配列）において必ずしも含まれ得るわけではないアミノ酸の3次元相互作用によって形成されたコンホメーショナルエピトープとすることができる。様々な長さ（たとえば、少なくとも4〜6アミノ酸長）のペプチドを単離すること、または合成すること（たとえば、組換えで）、および抗体との結合アッセイのために使用することができる。別の例において、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来したオーバーラップするペプチドを使用すること、および抗体による結合を決定することによって系統的スクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片発現アッセイにしたがって、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームをランダムに、または特異的遺伝的構造によってのどちらかで断片化し、そして抗原の発現された断片の試験される抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、たとえばPCRによって産生してもよく、そして次に放射性アミノ酸の存在下でインビトロで転写し、かつタンパク質に翻訳してもよい。次いで、放射活性物質で標識された抗原断片に対する抗体の結合を免疫沈降法およびゲル電気泳動によって決定する。ある特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上に示されるランダムなペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって特定することもできる。あるいは、オーバーラップするペプチド断片の定義されたライブラリーを、簡単な結合アッセイにおいて試験抗体に対する結合について試験することができる。さらなる例において、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニンスキャン突然変異誘発を実施して、エピトープ結合のために必要とされる、十分な、かつ／または必要な残基を特定することができる。たとえば、ドメイン交換実験は、CD40の種々の断片が、密接に関連するが、しかし抗原性が異なるタンパク質（腫瘍壊死因子受容体ファミリーの別のメンバーなど）からの配列と置換された（交換された）標的抗原の突然変異体を使用して行うことができる。変異体CD40に対する抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。

あるいは、競合アッセイ法を同じ抗原に結合することが公知のその他の抗体を使用して行って、抗体がその他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。競合アッセイ法は、当業者に周知である。

いくつかの例において、抗CD40抗体は、以下に例証される組換え技術によって調製される。

本明細書に記述した抗CD40抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、それぞれのヌクレオチド配列は、適切なプロモーターに作動可能に連結されている１つの発現ベクターにクローン化することができる。一例において、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれは、異なるプロンプターに作動可能に結合される。あるいは、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、単一のプロモーターと作動可能に連結することができ、その結果重鎖および軽鎖の両方は、同じプロモーターから発現される。必要に応じて、内部リボソーム進入部位（IRES）を、重鎖および軽鎖をコードする配列の間に挿入することができる。

いくつかの例において、抗体の2つの鎖をコードするヌクレオチド配列を2つのベクターにクローン化し、これを同じまたは別の細胞に導入することができる。2つの鎖が異なる細胞で発現されるとき、それらのそれぞれは、このように発現する宿主細胞から単離することができ、また単離された重鎖および軽鎖を混合し、および抗体の形成を可能にする適切な条件下でインキュベートすることができる。

一般に、抗体の1つまたは全ての鎖をコードする核酸配列は、当該技術分野において公知の方法を使用して適切なプロモーターと作動可能な連結で適切な発現ベクターにクローン化することができる。たとえば、ヌクレオチド配列およびベクターを適切な条件下で制限酵素と接触して、互いに対になることができ、かつリガーゼと共に連結することができるそれぞれの分子に対して相補的末端を作製することができる。あるいは、合成核酸リンカーを遺伝子の末端に連結することができる。これらの合成リンカーは、ベクターにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。発現ベクター/プロモーターの選択は、抗体を産生することに使用するための宿主細胞のタイプに依存することになる。

サイトメガロウイルス（CMV）中間体初期プロモーター、ラウス肉腫（Rous sarcoma）ウイルスLTR、HIV-LTR、HTLV-1 LTRなどのウイルスのLTR、サルウイルス40（SV40）初期プロモーター、大腸菌（E. coli）lac UV5プロモーターおよび単純ヘルペスtkウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない、多様なプロモーターを本明細書に記述した抗体の発現のために使用することができる。

また、調節可能なプロモーターを使用することもできる。このような調節可能なプロモーターとしては、lacオペレータを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節する転写モジュレーターとして大腸菌（E. coli）からのlacリプレッサーを使用するもの（Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)）、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）を使用するもの（Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）が挙げられる。その他のシステムとしては、アストラジオール、RU486、ジフェノールムリスレロンまたはラパマイシンを使用するFK506二量体、VP16またはp65が挙げられる。誘導性システムは、Invitrogen、ClontechおよびAriadから入手できる。

オペロンでのリプレッサーを含む調節可能なプロモーターを使用することができる。一実施形態において、大腸菌（E. coli）からのlacリプレッサーは、lacオペレータを有する哺乳動物細胞プロモーターから転写を調節するための転写モジュレーターとして機能し（M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987); Gossen and Bujard (1992); M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）を転写活性化因子（VP 16）と組み合わせてtetR-哺乳動物細胞転写活性化因子融合タンパク質、tTa（tetR-VP 16）を作製し、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）主要な最初期プロモーターに由来するtetOを有する最小のプロモーターと組み合わせてtetR-tetオペレータシステムを作製して哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御することができる。一実施形態において、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される。tetR-哺乳動物細胞転写因子融合誘導体ではなく、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）単独は、テトラサイクリンオペレータがCMVIEプロモーターのTATAエレメントに対して適切に下流に配置されるときに、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する強力なトランス-モジュレーターとして機能することができる（Yao et al., Human Gene Therapy, 10(16):1392-1399 (2003)）。このテトラサイクリン誘導性スイッチの１つの特定の利点は、これがテトラサイクリンリプレッサー-哺乳動物細胞トランス活性化因子またはリプレッサー融合タンパク質の使用を必要としないことであり、いくつかの場合において、これは、細胞に対して毒性である可能性があり（Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995) ）、その調節可能な効果を達成することができる。

加えて、ベクターは、たとえば以下のいくつかまたは全てを含有することができる：哺乳動物細胞における安定な、または一過性のトランスフェクタントのためのネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトCMVの最初期遺伝子からのエンハンサー/プロモーター配列；mRNA安定性のためのSV40からの転写終結およびRNAプロセシングシグナル；SV40ポリオーマ複製開始点および適切なエピソームの複製のためのColE1；内部リボソーム結合部位（IRESes）、多用途マルチクローニングサイト；並びにセンスおよびアンチセンスRNAのインビトロでの転写のためのT7およびSP6 RNAプロモーター。導入遺伝子を含有するベクターを産生するための適切なベクターおよび方法は、当該技術分野において周知であり、また利用可能である。

本明細書に記述した方法を実行するために有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ヒトコラーゲンIポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンIIポリアデニル化シグナルおよびSV40ポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。

抗体のいずれかをコードする核酸を含む1つ以上のベクター（たとえば、発現ベクター）を、抗体を産生するために適切な宿主細胞に導入してもよい。宿主細胞は、抗体またはその任意のポリペプチド鎖の発現に適切な条件下で培養することができる。このような抗体またはそのポリペプチド鎖は、従来法、たとえばアフィニティー精製を介して培養した細胞によって（たとえば、細胞または培養上清から）回収することができる。必要に応じて、抗体のポリペプチド鎖を適切な条件下で適切な期間インキュベートして抗体を産生させることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗体を調製するための方法は、本明細書にも記述したとおり、抗CD40抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを含む。組換え発現ベクターは、従来法、たとえばリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって適切な宿主細胞（たとえば、dhfr-CHO細胞）に導入することができる。ポジティブ形質転換宿主細胞を選択し、および適切な条件下で培養して抗体を形成する2つのポリペプチド鎖を発現させることができ、これを細胞から、または培養培地から回収することができる。必要に応じて、宿主細胞から回収された2つの鎖を適切な条件下でインキュベートして抗体の形成をさせることができる。

一例において、2つの組換え発現ベクターが提供され、一方は、抗CD40抗体の重鎖をコードし、またもう一方は、抗CD40抗体の軽鎖をコードする。2つの組換え発現ベクターの両方は、従来法、たとえばリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって適切な宿主細胞（たとえば、dhfr-CHO細胞）に導入することができる。あるいは、発現ベクターのそれぞれを適切な宿主細胞に導入することができる。ポジティブ形質転換体を選択し、および適切な条件下で培養して抗体のポリペプチド鎖を発現させることができる。2つの発現ベクターが同じ宿主細胞に導入されるとき、その中に産生される抗体は、宿主細胞から、または培養培地から回収することができる。必要に応じて、ポリペプチド鎖は、宿主細胞から、または培養培地から回収することができ、そして次に、適切な条件下でインキュベートして抗体を形成させることができる。2つの発現ベクターが異なる宿主細胞に導入されるとき、それらのそれぞれは、対応する宿主細胞から、または対応する培養培地から回収することができる。次いで、2つのポリペプチド鎖は、抗体の形成に適切な条件下でインキュベートすることができる。

標準的な分子生物学技法を使用して組換え発現ベクターを調製する、宿主細胞をトランスフェクトする、形質転換体を選択する、宿主細胞を培養する、および培養培地から抗体を回収する。たとえば、いくつかの抗体は、プロテインAまたはプロテインG結合マトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。

本明細書に記述した抗CD40抗体の重鎖、軽鎖または両方をコードする核酸、このようなものを含むベクター（たとえば、発現ベクター）；およびベクターを含む宿主細胞のいずれも、本開示の範囲内である。

したがって、調製された抗CD40抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用して特徴づけることができ、これによりCD40生物学的活性における増大が検出され、かつ／または測定される。たとえば、ELISA-タイプアッセイは、T細胞増殖のCD40促進の定性的または定量的測定に適切である場合がある。

治療の方法
本開示は、治療上有効量の抗CD40抗体を投与することによって疾患、たとえば癌または免疫異常を治療する方法を提供する。

医薬組成物
抗体、並びにコードする核酸もしくは核酸セット、このようなものを含むベクターまたはベクターを含む宿主細胞は、本明細書に記述したとおり、薬学的に許容される担体（賦形剤）と混合して標的疾患を治療することに使用するための医薬組成物を形成することができる。「許容される」は、担体が組成物の活性成分と適合性があり（かつ好ましくは、活性成分を安定させることができる）、かつ治療される対象に有害であってはならないことを意味する。緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤（担体）は、当該技術分野において周知である。たとえば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。

本方法において使用される医薬組成物は、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含むことができる。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover）。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度にてレシピエントに対して無毒であり、またリン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストランを含む単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；EDTAなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩-形成対イオン；金属錯体（たとえば、Zn-タンパク質複合体）；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性物質などの緩衝液を含んでもよい。

いくつかの例において、本明細書に記述した医薬組成物は、E Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);および米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載されたものなど、当該技術分野において公知の方法によって調製することができる抗体（またはコードする核酸）を含むリポソームを含む。増強された循環時間をもつリポソームは、米国特許第5,013,556号において開示される。特に有用なリポソームは、逆相蒸発法によって生成することができ、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成をもつ。リポソームを、定義された孔径のフィルタを通して押し出して所望の直径をもつリポソームを得る。

また、抗体またはコードする核酸（複数可）は、たとえばコアセルベーション技法によって、または界面重合によって、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリルラート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセルに、コロイド性薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンの状態で封入してもよい。このような技法は、当該技術分野において公知であり、たとえばRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)を参照されたい。

その他の例において、本明細書に記述した医薬組成物は、徐放性形式で製剤化することができる。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸および7エチル-L-グルタマートの共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能な小球体）などの分解可能な乳酸-グリコール酸共重合体、スクロースアセタートイソブチラートおよびpoly-D（-）-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

インビボでの投与のために使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。一般に、治療抗体組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、たとえば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに設置される。

本明細書に記述した医薬組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与または吸入もしくはガス注入による投与のための錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁液もしくは坐薬などの単位剤形とすることができる。

錠剤などの固体組成物を調製するためには、主要活性成分は、医薬品担体、たとえばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、二リン酸カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤化成分およびその他の薬学的希釈剤、たとえば水と混合して、本発明の化合物またはその無毒の薬学的に許容される塩の均質混合物を含む固体の予備処方組成物を形成することができる。均一なものとしてこれらの予備処方組成物に言及するとき、組成物が錠剤、丸剤およびカプセルなどの同等に有効な単位剤形に容易に細分され得るように、活性成分が組成物の全体にわたって均一に分散されることが意味される。次いで、この固体の予備処方組成物は、0.1〜約500mgの本発明の活性成分を含む上述のタイプの単位剤形に細分される。新規組成物の錠剤または丸剤は、被覆すること、または別の方法で延長された作用の利点を与える剤形を提供するように調合することができる。たとえば、錠剤または丸剤は、内側用量および外側用量成分を含むことができ、後者は、前者を覆うエンベロープの形態である。2つの成分は、胃における崩壊に抵抗性であり、かつ内部成分が十二指腸へと無傷で通ること、または放出が遅延されることを可能にするように機能する腸管層によって分離することができる。種々の材料をこのような腸管層またはコーティングのために使用することができ、このような材料は、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料を有する多数のポリマー酸およびポリマー酸の混合物を含む。

適切な界面活性剤は、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（たとえば、Tween（商標）20、40、60、80または85）およびその他のソルビタン（たとえば、Span（商標）20、40、60、80または85）などの非イオン性薬剤を含む。界面活性剤を伴う組成物は、都合よくは0.05〜5%（0.1〜2.5%とすることができる）の界面活性剤を含むことになる。当然のことながら、必要に応じて、その他の成分、たとえばマンニトールまたはその他の薬学的に許容される媒体が添加されてもよい。

適切なエマルジョンは、Intralipid（商標）、Liposyn（商標）、Infonutrol（商標）、Lipofundin（商標）およびLipiphysan（商標）などの市販の脂肪乳剤を使用して調製してもよい。活性成分は、予混合エマルジョン組成物に溶解してもよく、または代替的に、これを油（たとえば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、とうもろこし油またはアーモンド油）、並びにリン脂質（たとえば卵リン脂質、大豆リン脂質またはダイズレシチン）と水とを混合すると形成されるエマルジョンに溶解してもよい。当然のことながら、エマルジョンの浸透圧を調整するために、その他の成分、たとえばグリセロールまたはグルコースを添加してもよい。適切なエマルジョンは、典型的には20%まで、たとえば5〜20%の油を含むことになる。脂肪エマルジョンは、0.1〜1.0μm、特に0.1〜0.5μmの脂肪の液滴を含むことができ、また5.5〜8.0の範囲のpHを有することができる。

エマルジョン組成物は、抗体をIntralipid（商標）またはその成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されたものとすることができる。

吸入またはガス注入のための医薬組成物は、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液および粉末を含む。液体または固体組成物は、上記のとおりの適切な薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的または全身性効果のために経口または経鼻呼吸経路によって投与される。

好ましくは無菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物は、気体の使用によって噴霧されてもよい。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接呼吸されてもよく、または噴霧装置は、フェースマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、好ましくは経口で、または経鼻で適切な様式で製剤を送達する装置から投与されてもよい。

治療適用
本明細書に開示した方法を実践するために、本明細書に記述した有効量の医薬組成物を、たとえばボーラスとして、またはある期間にわたる連続投与による静脈内の投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節腔内、滑液包内、髄腔内、経口、吸入または局所的な経路によってなどの適切な経路を介して治療を必要とする対象（たとえば、ヒト）に投与することができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む液体製剤のための市販の噴霧器は、投与のために有用である。液体製剤は、直接噴霧することができ、また凍結乾燥粉末は、再構成の後に噴霧することができる。あるいは、本明細書に記述した抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化すること、または凍結乾燥された、および粉砕された粉末として吸入することができる。

本明細書に記述した方法によって治療される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトとすることができる。哺乳動物としては、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。治療を必要とするヒト対象は、癌または自己免疫疾患などの免疫異常などの標的疾患/障害を有する、それに対するリスクがある、または有することが疑われるヒト患者であってもよい。

癌の例としては、乳癌；胆道癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病、たとえばB細胞CLLを含む血液腫瘍；T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫；毛様細胞性白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；AIDS関連白血病および成人T細胞白血病/リンパ腫；ボーウェン病およびページェット病を含む上皮内新生物；肝癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、胚細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平細胞癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫（テラトーマ、絨毛癌）などの胚腫瘍、間質腫瘍および胚細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；並びに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。

標的癌を有する対象は、ルーチンの健康診断、たとえば臨床検査、器官機能検査、CTスキャン、超音波および／または遺伝子検査によって特定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記述した方法によって治療される対象は、抗癌療法、たとえば化学療法、放射線療法、免疫療法または外科手術を受けた、または供されているヒト癌患者であってもよい、。

免疫異常は、免疫系の機能不全を指す。例としては、自己免疫疾患、免疫不全症またはアレルギーが挙げられる。いくつかの実施形態において、治療のための標的疾患は、自己免疫疾患である。例としては、関節リウマチ（RA）、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症（MG）、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、ギラン・バレー症候群、自己免疫性心筋炎、膜性糸球体腎炎（Membrane Glomerulonephritis）、高IgM症候群、真性糖尿病、I型またはII型糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、胃炎、セリアック病、白斑症、肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、脊椎関節症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、免疫性好中球減少症、若年性糖尿病およびサイトカインによって媒介される遅延型過敏症と関連する免疫応答、結核において典型的に見出されるTリンパ球、サルコイドーシスおよび多発性筋炎、多発動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡、類天疱瘡（pemphigold）、グッドパスチャー症候群、川崎病、全身性硬化症、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、移植片対宿主（GVH）病および免疫血小板減少症が挙げられるが、これらに限定されない。

標的自己免疫疾患を有する対象は、ルーチンの健康診断、たとえば抗核抗体、抗ミトコンドリアの自己抗体、抗好中球細胞質抗体、抗リン脂質抗体、抗シトルリン化されたペプチド（抗CCP）、抗リウマトイド因子の存在、免疫グロブリンA、C応答性タンパク質試験、補足試験、赤血球沈降速度（ESR）試験、血液凝固プロファイルおよびタンパク質電気泳動/免疫固定泳動および／または遺伝子検査によって特定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記述した方法によって治療される対象は、自己免疫疾患治療、たとえば免疫抑制性媒介、ホルモン置換療法、輸血、抗炎症薬物療法および／または疼痛薬物療法を受けた、または供されている自己免疫疾患を伴うヒト対象であってもよい。

このような標的疾患/障害のいずれかを有すると疑われる対象は、疾患/障害の1つ以上の症候を示す場合がある。疾患/障害に対するリスクがある対象は、その疾患/障害についてのリスク因子の1つ以上を有する対象とすることができる。

本明細書に使用される、「有効量」は、単独で、または1つ以上のその他の活性薬剤と組み合わせてのいずれかで、治療上の効果を対象に与えるために必要とされるそれぞれの活性薬剤の量を指す。いくつかの実施形態において、治療効果は、増加したCD40活性、樹状細胞の活性化、増加したT細胞応答および／または増加した抗腫瘍免疫応答である。抗体の量が治療効果を達成したかどうかの決定は、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の症状、症状の重症度、年齢、健康状態、体の大きさ、性別および体重を含む個々の患者パラメーター、医師の知識および専門知識の範囲内の治療の期間、併用療法（もしあれば）の性質、投与の具体的経路および同様の因子に応じて変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、またルーチンの試験を超えることなく対処することができる。個々の成分またはこれらの組み合わせの最大用量、すなわち堅実な医学的判断に従って最も高い安全な用量が使用されることが一般に好ましい。

一般に、半減期などの実験に基づいた検討は、用量の決定に寄与することになる。たとえば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系と適合する抗体を抗体の半減期を延長し、かつ抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを防ぐために使用してもよい。投与頻度は、療法の間に決定してもよく、また調整してもよく、そしてこれは一般に標的疾患/障害の治療および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づくが、必ずしもこれらに基づかない。あるいは、抗体の持続性連続放出製剤が適切である場合がある。徐放性を達成するための種々の製剤および装置が、当該技術分野において公知である。

一例において、本明細書に記述した抗体に対する用量を、抗体の1回以上の投与（複数可）がなされた個体において経験的に決定してもよい。個体には、徐々に増加してアゴニストの用量が投与される。アゴニストの有効性を評価するために、疾患/障害の指標を追跡することができる。

一般に、本明細書に記述した抗体のいずれかの投与について、最初の候補用量は、約2mg/kgとすることができる。本開示の目的のために、典型的な一日用量は、前述の因子に応じて、約0.1μg/kg〜3μg/kg〜30μg/kg〜300μg/kg〜3mg/kg、〜30mg/kg〜100mg/kgまたはより多くのいずれかの範囲であってもよい。数日またはより長きにわたって繰り返される投与については、症状に応じて、治療は、所望の症候の抑制が生じるまで、または標的疾患もしくは障害またはその症候を緩和するために十分な治療上のレベルが達成されるまで持続される。例示的な投薬計画は、約2mg/kgの初回用量、続いて一週間に一度の約1mg/kgの抗体の維持用量を、または続いて一週おきに約1mg/kgの維持用量を投与することを含む。しかし、その他の投薬計画も、医者が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに応じて有用である場合がある。たとえば、週1〜4回の投薬が想定される。いくつかの実施形態において、約3μg/mg〜約2mg/kg（約3μg/mg、約10μg/mg、約30μg/mg、100μg/mg、約300μg/mg、約1mg/kgおよび約2mg/kgなど）の範囲での投薬を使用してもよい。いくつかの実施形態において、投薬頻度は、毎週、2週ごと、4週ごと、5週ごと、6週ごと、7週ごと、8週ごと、9週ごと、または10週ごとに一回であり；あるいは毎月、2カ月ごと、または3カ月ごと、またはより長い間に一回である。この療法の進歩は、従来技法およびアッセイによって簡単にモニターされる。投薬計画（使用される抗体を含む）は、時間とともに変化させることができる。

いくつかの実施形態において、通常の体重の成人の患者については、約0.3〜5.00mg/kgの範囲の用量を投与してもよい。いくつかの例において、本明細書に記述した抗CD40抗体の用量は、10mg/kgとすることができる。特定の投薬計画、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の医療歴、並びに個々の薬剤の特性（薬剤の半減期および当該技術分野において周知のその他の考慮事項など）に依存することになる。

本開示の目的のために、本明細書に記述した抗体の適切な用量は、使用される具体的抗体（複数可）および／または非抗体ペプチド（またはその組成物）、疾患/障害のタイプおよび重症度、抗体が予防のために投与されるのか、または治療目的のために投与されるのか、以前の療法、患者の臨床歴およびアゴニストに対する応答、並びに主治医の判断に依存することになる。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する用量に達するまで抗体を投与することになる。いくつかの実施形態において、所望の結果は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の増大である。用量が所望の結果を生じたかどうかを決定する方法は、当業者に明らかであろう。1つ以上の抗体の投与は、たとえばレシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的であるのか、または予防的であるのか、および熟練した医者に公知のその他の因子に依存して、連続的または断続的とすることができる。抗体の投与は、たとえば標的疾患または障害を発症する前に、その間に、またはその後のいずれかでの、予め選択された期間にわたる本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔をあけた用量あってもよい。

本明細書に使用される、用語「治療」は、障害、疾患の症候または疾患もしくは障害の素因を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変化する、直す、寛解させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、標的疾患もしくは障害、疾患/障害の症候または疾患/障害の素因を有する対象に対する1つ以上の活性薬剤を含む組成物の適用または投与を指す。

標的疾患/障害を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患重症度を減少させること、もしくは生存を延長することを含む。疾患を緩和すること、または生存を延長することは、治療結果を必ずしも必要とするというわけではない。本明細書に使用される、標的疾患または障害の発症を「遅延すること」は、疾患の進行を延期し、妨げ、遅くさせ、遅延させ、安定させ、かつ／または延ばすことを意味する。この遅延は、治療される疾患および／または個体の履歴に応じて時間の長さを変えることであり得る。疾患の発症を「遅延する」または緩和する、または疾患の発病を遅延する方法は、本方法を使用しないことと比較したときに、所与の時間枠における疾患の1つ以上の症候を発症する確率を低下し、および／または所与の時間枠における症候の程度を減少する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに十分な数の対象を使用する臨床的研究に基づく。

疾患の「発症」または「進行」は、疾患の最初の徴候および／または後に続いて起こる進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知のように標準的な臨床的技術を使用して検出可能とすることができ、かつ評価することができる。しかし発症は、検出不可能である場合がある進行も指す。本開示の目的のためには、発症または進行は、症候の生物学的過程を指す。「発症」は、発生、再発および発病を含む。本明細書に使用される標的疾患または障害の「発病」または「発生」は、最初の発病および／または再発を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記述した抗体は、CD40の活性（および／またはDC活性化）をインビボで少なくとも10%（たとえば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはより多い）だけ増強するために十分な量にて治療を必要とする対象に投与される。

医薬の当業者に公知の従来の方法を、治療される疾患のタイプまたは疾患の部位に応じて、対象に医薬組成物を投与するために使用することができる。また、この組成物は、その他の従来の経路を介して投与すること、たとえば、経口で、非経口で、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、経鼻で、頬側で、経膣で、または埋め込まれたリザーバを介して投与することができる。本明細書に使用される、用語「非経口」としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内および脳内注射または輸液技法が挙げられる。加えて、これは、1、3または6ヵ月のデポー注射可能な、または生物分解可能な材料および方法を使用することなどの注射可能なデポー投与経路を経て対象に投与することができる。いくつかの例において、医薬組成物は、眼球内または硝子体内に投与される。

注射可能な組成物は、植物油、ジメチルラクトアミド（dimethylactamide）、ジメチルホルムアミド（dimethyformamide）、乳酸エチル、炭酸エチル、イソプロピルミリステート、エタノールおよびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび同様のもの）などの種々の担体を含んでいてもよい。静脈内注射については、水溶性抗体は、点滴法によって投与することができ、これにより、抗体および生理的に許容される賦形剤を含む医薬品製剤が輸液される。生理的に許容される賦形剤は、たとえば5%デキストロース、0.9%生理食塩水、リンガー液またはその他の適切な賦形剤を含んでいてもよい。筋肉内調製物、たとえば抗体の適切な可溶性塩形態の無菌製剤は、注射用水、0.9%生理食塩水または5%グルコース溶液などの薬学的賦形剤に溶解すること、および投与することができる。

一実施形態において、抗体は、部位特異的または標的化された局所的送達技法を介して投与される。部位特異的または標的化された局所的送達技法の例としては、輸液カテーテル、留置カテーテルまたは針カテーテルなどの抗体の種々の移植可能なデポー供与源または局所的送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたはその他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接注射または直接適用が挙げられる。たとえば、PCT特許公開第WO00/53211号および米国特許第5,981,568号を参照されたい。

また、アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクターまたはサブゲノムのポリヌクレオチドを含む治療上の組成物の標的化された送達を使用することができる。受容体媒介DNA送達技法は、たとえばFindeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods and Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338に記述される。

ポリヌクレオチド（たとえば、本明細書に記述した抗体をコードするもの）を含む治療組成物は、遺伝子療法プロトコルにおける局所投与のために約100ng〜約200mgのDNAの範囲で投与される。いくつかの実施形態において、また、約500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μgおよび約20μg〜約100μgのDNAまたはより多くの濃度範囲も遺伝子療法プロトコルの間に使用することができる。

本明細書に記述した治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルスまたは非ウイルスの起源とすることができる（Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; およびKaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148を一般に参照されたい）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、恒常的か、または調節するかのいずれかとすることができる。

所望のポリヌクレオチドの送達のためのウイルスに基づいたベクターおよび所望の細胞における発現は、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスに基づいた媒体としては、組換えレトロウイルス（たとえば、PCT特許公開第WO90/07936号；同第WO94/03622号；同第WO93/25698号；同第WO93/25234号；同第WO93/11230号；同第WO93/10218号；同第WO91/02805号；米国特許第5,219,740号および同第4,777,127号；英国特許第2,200,651号；および欧州特許第0 345 242号を参照されたい）、アルファウイルスに基づいたベクター（たとえば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ATCC VR-67；ATCC VR-1247）、ロスリバーウィルス（ATCC VR-373；ATCC VR-1246）およびベネズエラのウマ脳炎ウイルス（ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532））並びにアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター（たとえば、PCT特許公開公報第WO94/12649号、同第WO93/03769号；同第WO93/19191号；同第WO94/28938号；同第WO95/11984号および同第WO95/00655号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。また、Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147に記載されたような死滅されたアデノウイルスに連結されたDNAの投与も使用することもできる。

また、死滅されたアデノウイルス単独に連結された、または連結されていないポリカチオン濃縮されたDNA（たとえば、Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147を参照されたい）；リガンドに連結されたDNA（たとえば、Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985を参照されたい）；真核細胞送達媒体細胞（たとえば、米国特許第5,814,482号；PCT特許公開第WO95/07994号；同第WO96/17072号；同第WO95/30763号；および同第WO97/42338号を参照されたい）および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない非ウイルス送達媒体および方法も使用することができる。また、裸のDNAを使用することもできる。例示的な裸のDNA導入法は、PCT特許公開第WO90/11092号および米国特許第5,580,859号に記述される。遺伝子送達媒体として作用することができるリポソームは、米国特許第5,422,120号；PCT特許公開第WO95/13796号；同第WO94/23697号；同第WO91/14445号；および欧州特許第0524968号に記述される。さらなるアプローチは、Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411、およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581に記述される。

特定の投薬計画、すなわち本明細書に記述した方法において使用される用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の医療歴に依存することになる。

いくつかの実施形態において、２つ以上の抗体、または抗体と別の適切な治療薬との組み合わせを、治療を必要とする対象に投与してもよい。また、抗体は、薬剤の有効性を増強し、かつ／または補完するために役立つその他の薬剤と組み合わせて使用することができる。

標的疾患/障害のための治療効果は、当該技術分野において周知の方法によって評価することができる。

併用療法
本明細書に記述した抗CD40抗体は、癌または免疫異常などの標的疾患のためのその他のタイプの療法と組み合わせて利用してもよい。

本明細書に記述した抗CD40抗体が癌を治療するために使用されるとき、これは、抗癌療法、たとえば当該技術分野において公知のものと組み合わせることができる。さらなる抗癌療法としては、化学療法、外科手術、放射線照射、免疫療法、遺伝子療法などが挙げられる。

あるいは、本開示の治療は、たとえばピリミジン類似体（5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）、プリン類似体、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび2-クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）などの天然物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）などの微小管撹乱物質、ビンクリスチン（vincristin）、ビンブラスチン（vinblastin）、ノコダゾール、エポシロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、DNA損傷薬（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン（hexamethyhnelamineoxaliplatin）、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン（merchlorehtamine）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（VP16））を含む抗増殖性/有糸分裂阻害薬；ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（全身性にL-アスパラギンを代謝し、およびそれ自体のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を取り除くL-アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロランブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホナート-ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（BCNU）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン-ダカルバジニン（DTIC）などの抗増殖性/抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸類似体（メトトレキサート）などの抗増殖性/抗有糸分裂抗代謝剤；白金配位化合物（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびその他のトロンビンの阻害剤）；線維素溶解薬（組織プラスミノーゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗転位薬剤；抗分泌性薬剤（ブレフェルジン（brefveldin）)；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（たとえば、TNP-470、ゲニステイン、ベバシズマブ）および増殖因子阻害剤（たとえば、線維芽細胞増殖因子（FGF）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；mTOR阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；およびクロマチン撹乱物質などの化学療法剤と組み合わせることができる。

免疫異常を治療するための本明細書に記述した抗CD40抗体のとき、たとえば、治療ワクチン（GVAX、DCに基づいたワクチン、その他が挙げられるが、これらに限定されない）またはチェックポイント阻害剤（CTLA4、PD1、LAG3、TIM3、その他を遮断する薬剤が挙げられるが、これらに限定されない）などのその他の免疫調節性治療と併用することができる。いくつかの例において、抗体は、自己免疫疾患のための別の療法と組み合わせることができる。例としては、静脈内Ig療法；非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）；コルチコステロイド；シクロスポリン、ラパマイシン、アスコマイシン；シクロホスファミド；アザチオプリン（azathioprene）；メトトレキサート；ブレキナル；FTY 720；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；15-デオキシスパガリン（deoxyspergualine）；免疫抑制剤または接着分子阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる有用な薬剤の例については、Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.Jもまた参照されたい。

第2の治療薬が使用されるとき、このような薬剤は、本明細書に記述した治療薬と同時に、または順次（任意の順序で）投与することができる。さらなる治療薬と同時投与されるときに、それぞれの薬剤に対する適切な治療的に有効な用量は、相加作用または相乗作用のため低減してもよい。

疾患の治療における使用のためのキット
本開示は、本明細書に記述した癌および免疫異常などの標的疾患を治療または緩和において使用するためのキットもまた提供する。このようなキットは、抗CD40抗体、たとえば本明細書に記述したもののいずれかと、これも本明細書に記述した任意選択的な抗CD40抗体と併用される第2の治療薬とを含む1つ以上の容器を含むことができる。

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記述した方法のいずれかに従って使用するための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、本明細書に記述したもののように標的疾患を治療する、発症を遅延する、緩和するための抗CD40抗体および任意選択的に第2の治療薬の投与の記述を含むことができる。キットは、たとえば本明細書に記述した診断の方法を適用して、その個体が標的疾患を有するかどうかを特定することに基づいて治療に適切な個体を選択する記述をさらに含んでいてもよい。さらに他の実施形態において、説明書は、標的疾患のリスクのある個体に対して抗体を投与する記述を含む。

抗CD40抗体の使用に関する説明書は、一般に意図された治療のための用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（たとえば、複数用量パッケージ）またはサブユニット用量であってもよい。典型的には、本発明のキットにおいて供給される説明書は、ラベルまたは添付文書（たとえば、キットに含まれる紙シート）上に説明が書かれるが、機械で読み取り可能な説明書（たとえば、磁気または光学保存ディスクに保有された説明書）も許容される。

ラベルまたは添付文書は、組成物が癌または免疫異常（たとえば、自己免疫疾患）などの疾患を治療する、発症を遅延する、および／または緩和するために使用されることを示す。説明書は、本明細書に記述した方法のいずれかを実践するために提供されてもよい。

本発明のキットは、適切なパッケージング内にある。適切なパッケージングとしては、バイアル、瓶、広口瓶、柔軟なパッケージング（たとえば、封をしたマイラーまたはプラスチック袋）および同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与装置（たとえば、噴霧器）またはミニポンプなどの輸液装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも想定される。キットは、無菌アクセスポートを有してもよい（たとえば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルでもよい）。また、容器は、無菌アクセスポートも有してもよい（たとえば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物における少なくとも1つの活性薬剤は、本明細書に記述したもののとおりの抗CD40抗体である。

キットは、任意選択的に、緩衝液および翻訳情報などのさらなる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、および容器上または容器に付随したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、上で記述したキットの内容を含む製品を提供する。

一般的技法
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を使用することになり、これは、当該技術分野の技術の範囲内である。このような技法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献において完全に説明される。

さらなる詳述を伴わずに、当業者であれば、上記に基づいて、本発明をその最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例証であり、また何であれいずれの方法でも開示の残りを限定しないものとして解釈される。本明細書に引用される全ての刊行物は、本明細書において参照した目的または主題のために参照により組み込まれる。

実施例1：抗-CD40抗体の産生
試薬および一般的方法
組換えヒトCD40/TNFRSF5タンパク質（cat#1493-CD、Fcキメラ）およびヒトCD40/TNFRSF5 MAb（クローン82111、マウスIgG2B、cat# MAB6321）は、R&D Systems（USA）から購入した。アカゲザルCD40/TNFRSF5タンパク質（His Tag）は、Sino Biologics（cat#90097-C02H）から購入した。ヒトまたはカニクイザルCD40を発現する安定なCHO細胞株は、全長ヒトCD40 cDNA（遺伝子ID：958）またはカニクイザルCD40 cDNA（遺伝子ID：102118696）をトランスフェクションすることによって発生した。

標準ELISAを、抗CD40抗体を検出するために使用した。プレートをCD40タンパク質で被覆し、かつ抗CD40抗体と共にインキュベートした。CD40に結合した抗体分子をペルオキシダーゼと抱合した二次抗体（ヤギ抗マウスまたはラットIgG）を使用して検出した。

CHO-CD40細胞株を使用して抗CD40抗体を検出するためにFACSを行った。抗体試料とのインキュベーションの期間後、CHO-CD40細胞を、FACSを使用して市販のPE-またはFITC標識された二次抗体によって解析した。

ハイブリドーマ発生およびリード抗体特定
Balb/cおよびSJLマウスおよびウィスターラットを組換えヒトCD40/TNFRSF5タンパク質FcキメラおよびpcDNA3.1-ヒトCD40プラスミドで免疫した。免疫された動物の抗CD40血清力価をヒトCD40および対照としてヒトIgGでのELISAを使用してモニターした。陽性力価を、FACSを使用してさらに確認してCHO-ヒトCD40細胞をスクリーニングした。最も高い力価を持つ4匹のマウスおよび1匹のラットを屠殺した；採取した脾細胞を単離し、および標準的なハイブリドーマプロトコルを使用してSP2/0骨髄腫細胞と融合した。

計100個のマウスまたはラットハイブリドーマの96ウェルプレートを、ELISAを使用してスクリーニングしてヒトCD40タンパク質に対するそこから分泌される抗体の結合活性を測定した。次いで、陽性試料は、ヒトFcカウンタースクリーンによって試験した。次に、これらの陽性CD40-特異的クローンをFACSによってCHO細胞上で発現したヒトCD40に対する結合について試験し、そして2ラウンドの限界希釈による単一の細胞クローニングに供した。26個の安定なハイブリドーマクローンが得られた。

選択したハイブリドーマクローンを抗体産生のために増殖した。これらの精製した抗体をFACSによってヒト細胞CD40に対する結合について評価した。図1は、ハイブリドーマ細胞から分泌された5つの例示的な抗体の結合結果を示す。また、これらの5つの抗体をヒト樹状細胞またはB細胞を使用する機能アッセイにおいて試験した。図2Aおよび2Bに示したように、多数の抗CD40抗体は、サイトカイン分泌によって証明したときに、ヒト樹状細胞またはB細胞を活性化する際に明らかなアゴニストの活性を示した。

キメラ抗体の調製
6つの確認されたハイブリドーマの抗体可変ドメインを以下のように配列決定した。簡潔には、総RNAを、NucleoZOL（MACHEREY-NAGEL、cat# 740404.2）を使用してハイブリドーマ細胞から抽出し、そして次に、SMARTer（登録商標）RACE 5'/3'キット（Clontech、cat# 634858）での5'-RACEによってcDNAに逆転写した。重鎖および軽鎖可変領域を特異的プライマー（Novagen、cat# 69831-3）でPCRによって増幅し、そして増幅産物を、NucleoSpin（登録商標）GelおよびPCRクリーンアップキット（MACHEREY-NAGEL、cat# 740609.25）で精製した。次いで、増幅産物は、TAクローニングを使用してpMD18-Tベクター（Takara, cat#D101A）にクローン化した。クローンがDH5α細胞に形質転換された後で、V_HおよびV_L断片を保有している15個の単一クローンを抗体可変領域の配列を得るために解析した。V_H/V_L配列をルーチンの手法に従って決定した。

抗CD40抗体可変ドメイン配列をコードするcDNA配列をヒンジS228P（EUナンバリング; Kabatナンバリング241）を安定する突然変異（Angal et., Mol. Immunol 30:105, 1993）を含むヒトIgG4重鎖定常領域またはヒトカッパ軽鎖定常領域に対するキメラとして合成した。CHO一過性発現を、対応する重鎖および軽鎖配列を含むプラスミドで実施した。これらのキメラ抗体をタンパク質親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製した抗体調製は、<5EU/mgエンドトキシンを含み、また単量体形態における抗体のレベルは、>95%である。

実施例2：抗-CD40キメラ抗体の評価
CD40結合ELISA
CD40タンパク質（ヒトCD40-His Tagタンパク質（Sino Biological Inc. Cat#10239-H08E）またはアカゲザルCD40-His（Sino Biological Inc. Cat#90097-C02H）を1μg/mlにPBS中で希釈し、そして50ul/ウェルの濃度にてELISAプレート（Corning、Cat#9018、高結合）を被覆するために使用した。プレートを4℃にて一晩インキュベートした。次いで、プレートをデカントし、およびPBS-Tで洗浄し、そして200ul/ウェルアッセイ希釈剤（1×PBS/1% BSA/0.05% Tween-20/0.05%プロクリン300）を添加した。室温にて3時間のインキュベーションの後、プレートを3回PBS-Tで洗浄した。試験抗体を0、0.000003、0.00003、0.0003、0.003、0.03および0.3ug/mlまたはおよそ0、0.00002、0.0002、0.002、0.02、0.2および2nMまでアッセイ希釈剤中で希釈し、そして次に、プレート（50ul/ウェル）に添加した。プレートを37℃にて1時間インキュベートし、そして次にPBS-Tで3回洗浄した。抗ヒトIgG-HRP抱合体（Bethyl Cat#A80-319P）を1：10,000希釈にてプレート（100ul/ウェル）に添加した。プレートを37℃にて0.5時間インキュベートし、続いてPBS-Tで3回洗浄した。TMB基質溶液を添加した（100ul/ウェル）。色を8分間発色させた後、これを100ul/ウェルの2N H₂SO₄で停止した。450nmにおける吸光度をELISAリーダーで決定した。図3に示したように、試験した例示的な抗体は、用量依存的にヒトCD40を結合する。

CD40結合FACS
ヒトCD40またはカニクイザルCD40を過剰発現するCHO細胞をトリプシン-EDTA部分消化を使用して採取し、続いて5分間1000rpmにて遠心分離した。細胞を5×10⁶/mlにて冷たいPBS-BSA（2%）中に再懸濁し、そして100ul/チューブに分注した。キメラ抗CD40抗体を3回PBS-BSA中に希釈し（最終濃度は、0.01、0.1、1および10ug/mlであった）、そしてそれぞれの濃度の50μlをCHO-CD40細胞に添加した。細胞溶液を混合し、そして2時間暗闇で4℃にてインキュベートした。次いで、細胞を2回PBS-BSAで洗浄した。100ul/バイアルの濃度にて二次抗体抱合体（ヤギF（ab'）₂抗ヒトIgG Fc（pE）、予め吸着した（ab98596））を添加し、そして細胞を混合し、そして1時間暗闇で4℃でインキュベートした。次いで、細胞をPBS-BSAで2回洗浄し、続いて2% PFA中で固定し、そして次に、FACScaliberでのFACS解析に供した。図4に示したように、これらの抗体は、CHO細胞の表面上に発現されたヒトCD40に対して高い結合活性を示した。細胞のカニクイザルCD40に対する抗体の結合活性は、図5に示したように変化する。

樹状細胞機能アッセイ
新鮮なPBMCをバフィーコートとしてフィコール分離によって健常ドナーから単離し、そして3×10⁶/mlにて10% FBSを含むPRMI-1640中に再懸濁した。樹状細胞を調製するために、PBMCを2mL/ウェルにて6ウェル培養プレートに播種し、そして37℃にて90分間付着させた。リンパ球を含む非接着画分を取り除き、そして接着細胞を100ng/mLのrhGM-CSFおよび50ng/mLのrhIL-4（ヒト樹状細胞サイトカインパッケージ、Peprotech、Cat#AF-HDC）を補ったRPMI1640（10% FBS）中で、37℃の5% CO2加湿インキュベーター内で7日間培養し、そして3日目に培地を新鮮なもので置き換えた。DC細胞を採取し、そして96ウェルプレートに1×10⁵/ml DCにてプレートにまいた。可溶性（Soluable）試験抗体を添加した。細胞を3日間培養し、そして次に上清を採取し、そして上清中のIL-8およびIL-12/P40のレベルをELISAによって測定した。別のアッセイ形式において、DC細胞を1.25×10⁶/mlの細胞密度に調整した。細胞をCHO-FcγRIIB細胞の存在下および非存在下で24ウェルプレート（0.4mL/ウェル）に添加した。次いで、抗体または培地（対照）をウェルに添加した。プレートをおよそ24時間5% CO₂中で37℃にてインキュベートした。次いで細胞培養上清を採取し、そして上清中のIL-8、IL-12/P40およびIL12/P70のレベルを測定した。こうして得られた結果を図6A〜6Bに提供する。驚くべきことに、抗CD40抗体は、FcγRIIBを発現するCHO細胞と共培養したときに、サイトカイン分泌によって証明されるように、増強されたアゴニストの効果を示した。DC細胞を採取し、およびCD86、DC活性化のためのマーカーの細胞表面発現についてFACS解析に供した。

実施例3：キメラ抗体の薬物動態学的研究
C57BL/6マウス（6〜7週齢、19〜20gの雄を研究のために使用した。抗体をPBS中で製剤化し、および4匹のマウスの群において3mg/kgにて尾静脈注射を介して投与した。

血液サンプリングは、投薬前、1時間、2時間、4時間、8時間、1日、2日、3日、5日、8日、11日、15日および21日において連続採血によって行った。時点あたり10uLの血液を40uLのPBS-BSA溶液に添加した。次いで、試料を十分に混合し、および4℃にて5分間2000gにて遠心分離した。上清を収集後即時にドライアイス上に置き、および解析までおよそ−70℃にて保存した。血液抗体濃度を上の節に記載したようにELISAによって決定した。図7A〜7Cは、3mg/kgの単一の静脈内注射の後のキメラ抗体の血液抗体濃度を示す。下の表1は、調べた抗体の薬物動態学的パラメーターを要約する。

その他の実施形態
本明細書に開示した特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書に開示したそれぞれの特徴は、同じ、均等の、または類似の目的の役に立つ代わりの特徴によって置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の言及がされない限り、開示したそれぞれの特徴は、均等の、または類似の特徴の一般的な一連の単なる例にすぎない。

上の記述から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、またその趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、本発明の種々の変更および修飾を行ってこれを種々の使用および状態に適応することができる。したがって、また、その他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内である。

均等物
いくつかの発明の実施形態を本明細書に記述し、および図示してきた一方で、当業者であれば、機能を果たし、かつ／または本明細書に記述した結果および／もしくは1つ以上の利点を得るための種々のその他の手段および／もしくは構造を容易に想像するであろうし、またこのようなバリエーションおよび／または修飾のそれぞれは、本明細書に記述した本発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記述した全てのパラメーター、寸法、材料および構成が例示的であることを意味し、また実際のパラメーター、寸法、材料および／または構成が発明の教示が使用される具体的適用（複数可）に依存するであろうことを容易に認識するであろう。当業者は、本明細書に記述した具体的な発明の実施形態に対する数多くの均等物を、ルーチン以上の実験を使用することなく認識する、または確認することができるであろう。したがって、当然のことながら、前述の実施形態は例としてのみ示され、そして添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の実施形態は、具体的に記述され、かつ特許請求されたのとは別の方法で実践されてもよい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記述したそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法を目的としている。加えて、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に不一致でない場合、2つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲の内に含まれる。

本明細書で定義され、および使用される、全ての定義は、当然のことながら、辞書定義、参照によって組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を通じて統制する。

本明細書に開示した全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、これは、その文書の全体を包含する場合がある。

明細書において、および特許請求の範囲において本明細書に使用される不定冠詞「1つ（a）」および「1つ（an）」は、当然のことながら、明らかに反対であることが示されない限り、「少なくとも1つ」を意味する。

明細書において、および特許請求の範囲において本明細書に使用される語句「および／または」は、当然のことながら、そのように連接した要素の「一方または両方」、すなわちいくつかの場合において接続的に存在する、およびその他の場合において分離的に存在する要素を意味する。「および／または」と共に列記された複数の要素は、同じ様式で、すなわちそのように連接した「1つ以上」の要素と解釈されるべきである。具体的に特定されるこれらの要素と関連がある、または関連がないに関わらず、「および／または」節によって具体的に特定される要素以外のその他の要素が任意選択的に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Aおよび／またはB」に関して、「を含む」などの限定のない言語と組み合わせて使用されるとき、一実施形態において、Aのみを（任意選択的にB以外の要素を含む）；別の実施形態において、Bのみを（任意選択的にA以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、AおよびB両方を（任意選択的にその他の要素を含む）；などを指すことができる。

明細書において、および特許請求の範囲において本明細書に使用される、「または」は、当然のことながら、上記で定義したとおりの「および／または」と同じ意味を有する。たとえば、列記における品目を分離するときに、「または」もしくは「および／または」は、すなわち、ある数の要素または要素の列記のうちの少なくとも１つを含むこと、しかし２つ以上も含むこと、そして任意選択的に追加的に列記されていない品目を含むと解釈されるべきである。「のうちの1つのみ」または「のうちの正確に1つ」などの明らかに反対を示す用語のみ、または特許請求の範囲において使用されるとき、「からなる」は、ある数の要素もしくは要素の列記のうちの正確に1つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書に使用される用語「または」は、「いずれか」、「のうちの1つ」、「のうちの1つのみ」または「のうちの正確に1つ」などの排他的用語によって先行されるときに、排他的選択肢（すなわち、「一方または他方、しかし両方でない」）を示すこととしてのみ解釈されるべきである。特許請求の範囲において使用されるときに、「本質的に〜からなる」は、特許法の分野において使用されるとおりのその通常の意味を有するべきである。

明細書において、および特許請求の範囲において本明細書に使用される語句「少なくとも1つ」は、当然のことながら、1つ以上の要素の列記に関して、要素の列記における要素の任意の1つ以上から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、必ずしも要素の列記内に具体的に列記されたそれぞれの少なくとも1つおよび全ての要素を含むわけではなく、また要素の列記における要素の任意の組合せを除外しない。また、この定義は、要素が、具体的に特定されるこれらの要素に関連があるか、または関連がないかに関わらず、語句「少なくとも1つ」が指す要素の列記内で具体的に特定される要素以外に任意選択的に存在してもよいことも可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBのうちの少なくとも1つ」（または同等に、「AまたはBのうちの少なくとも1つ」または同等に「Aおよび／またはBのうちの少なくとも1つ」）は、一実施形態において、1つより多くのAを任意選択的に含み、Bが存在しない（そしてB以外の要素を任意選択的に含む）少なくとも1つを指し；別の実施形態において、1つより多くのBを任意選択的に含み、Aが存在しない（そしてA以外の要素を任意選択的に含む）少なくとも1つを指し；さらに別の実施形態において、1つより多いAを任意選択的に含み、かつ少なくとも1つの、任意選択的に1つより多いBを含む（そしてその他の要素を任意選択的に含む）少なくとも1つを指す；その他とすることができる。

当然のことながら、明らかに反対であることが示されない限り、1つより多い工程または行為を含む本明細書において請求される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は必ずしも方法の工程または行為が詳述された順序に限定されるわけではない。

Claims (24)

1. ヒトCD40を結合する単離された抗体であって、13F1A7、17C5C2、19G6D6、36G7B8および9F12D9からなる群より選択される参照抗体と同じヒトCD40のエピトープを結合する、単離された抗体。
2. （a）重鎖可変領域（V_H）であって、
   （i）式中X₁がFまたはYであり、X₂がN、TまたはIであり、X₃がN、TまたはIであり、X₄がD、SまたはNであり、X₅がSまたはYであり、X₆がF、N、WまたはGであり、X₇がM、IまたはLであり、かつX₈がN、DまたはHである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）と記載される重鎖相補性決定領域1（HC CDR1）と、
   （ii）式中X₁がKまたはGであり、X₂がNまたはDであり、X₃がTまたはAであり、かつX₄がTまたはAである、QIRNX₁NYX₂YAX₃YYX₄ESLEG（配列番号：2）；式中X₁がDまたはRであり、X₂がNまたはDであり、X₃がDまたはGであり、X₄がIまたはGであり、X₅がSまたはTであり、X₆がIまたはKであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PNNX₃X₄X₅X₆YNX₇KFRX₈（配列番号：3）；および式中SISPSGGVTYYRDSVKG（配列番号：4）からなる群より選択される重鎖相補性決定領域2（HC CDR2）と、
   （iii）式中X₁がFまたはHであり、X₂がAまたはFであり、かつX₃がYまたはNである、YYYDGX₁X₂DYFDX₃（配列番号：5）；RFAY（配列番号：6）；GVITTLVAGDY（配列番号：7）；およびPFLGWGGANWIAH（配列番号：8）からなる群より選択される重鎖相補性決定領域3（HC CDR3）と、を含む重鎖可変領域（V_H）、および
   （b）軽鎖可変領域（V_L）であって、
   （i）RSSQSLVYSYGNTYLH（配列番号：9）；SASSSISSNYLH（配列番号：10）；式中X₁がIまたはLであり、X₂がYまたはNであり、かつX₃がIまたはKである、KASQNX₁X₂X₃YLN（配列番号：11）；およびLASEDISNDLA（配列番号：12）からなる群より選択される軽鎖相補性決定領域1（LC CDR1）と、
   （ii）式中X₁がNまたはRであり、X₂がVまたはTであり、X₃がRまたはLであり、かつX₄がFまたはAである、X₁X₂SNX₃X₄S（配列番号：13）；式中X₁がNまたはDであり、かつX₂がQまたはYである、NTX₁NLX₂T（配列番号：14）；およびFVDRLLD（配列番号：15）からなる群より選択される軽鎖相補性決定領域2（LC CDR2）と、
   （iii）式中X₁がSまたはQであり、X₂がGまたはSであり、X₃がT、SまたはYであり、X₄がH、SまたはKであり、X₅がV、IまたはYであり、かつX₆がW、YまたはPである、X₁QX₂X₃X₄X₅PX₆T（配列番号：16）；または式中X₁がLまたはMであり、X₂がSまたはNであり、かつX₃がSまたはVである、X₁QHX₂X₃RRT（配列番号：17）と記載される軽鎖相補性決定領域3（LC CDR3）と、を含む、軽鎖可変領域（V_L）を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
3. （i）式中X₁がFであり、X₂がNであり、X₃がNであり、X₄がDであり、X₅がSまたはYであり、X₆がFであり、X₇がMであり、かつX₈はNである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）の前記HC CDR1と、
   （ii）式中X₁がKまたはGであり、X₂がNまたはDであり、X₃がTまたはAであり、かつX₄がTまたはAである、QIRNX₁NYX₂YAX₃YYX₄ESLEG（配列番号：2）の前記HC CDR2と、
   （iii）式中X₁がFまたはHであり、X₂がAまたはFであり、かつX₃がYまたはNである、YYYDGX₁X₂DYFDX₃（配列番号：5）の前記HC CDR3と、
   （iv）RSSQSLVYSYGNTYLH（配列番号：9）またはSASSSISSNYLH（配列番号：10）の前記LC CDR1と、
   （v）式中X₁がNまたはRであり、X₂がVまたはTであり、X₃がRまたはLであり、かつX₄がFまたはAである、X₁X₂SNX₃X₄S（配列番号：13）の前記LC CDR2と、
   （vi）式中X₁がSまたはQであり、X₂がGであり、X₃がTまたはSであり、X₄がHまたはSであり、X₅がVまたはIであり、かつX₆がWまたはYである、X₁QX₂X₃X₄X₅PX₆T（配列番号：16）の前記LC CDR3と、を含む、請求項２に記載の単離された抗体。
4. （i）式中X₁がYであり、X₂がTまたはIであり、X₃がTまたはIであり、X₄がDまたはSであり、X₅がYであり、X₆がNまたはWであり、X₇がMまたはIであり、かつX₈がDまたはHである、GX₁X₂FX₃X₄X₅X₆X₇X₈（配列番号：1）の前記HC CDR1と、
   （ii）式中X₁がDまたはRであり、X₂がNまたはDであり、X₃がDまたはGであり、X₄がIまたはGであり、X₅がSまたはTであり、X₆がIまたはKであり、X₇がQまたはEであり、かつX₈がGまたはYである、X₁IX₂PNNX₃X₄X₅X₆YNX₇KFRX₈（配列番号：3）の前記HC CDR2と、
   （iii）RFAY（配列番号：6）またはGVITTLVAGDY（配列番号：7）の前記HC CDR3と、
   （iv）式中X₁がIまたはLであり、X₂がYまたはNであり、かつX₃がIまたはKである、KASQNX₁X₂X₃YLN（配列番号：11）の前記LC CDR1と、
   （v）式中X₁がNまたはDであり、かつX₂がQまたはYである、NTX₁NLX₂T（配列番号：14）の前記LC CDR2と、
   （vi）式中X₁がLまたはMであり、X₂がSまたはNであり、かつX₃がSまたはVである、X₁QHX₂X₃RRT（配列番号：17）の前記LC CDR3と、を含む、請求項３に記載の単離された抗体。
5. 前記抗体が、前記参照抗体と同じ重鎖CDRおよび軽鎖CDRを含む、請求項1に記載の単離された抗体。
6. 前記抗体が、前記参照抗体と同じ重鎖可変領域および同じ軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の単離された抗体。
7. 前記抗体が、ヒトCD40および非ヒトCD40の両方を結合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離された抗体。
8. 前記非ヒトCD40が、カニクイザルCD40である、請求項７に記載の単離された抗体。
9. 前記抗体が、全長抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の単離された抗体。
10. 前記抗体が、IgG分子である全長抗体である、請求項９に記載の単離された抗体。
11. 前記IgG分子が、IgG4分子である、請求項１０に記載の単離された抗体。
12. 前記IgG4分子のFcドメインが、S228Pアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の単離された抗体。
13. 前記抗体が、Fabまたは単鎖抗体である、請求項９に記載の単離された抗体。
14. 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の単離された抗体。
15. 前記抗体が、細胞表面上のヒトCD40を結合する、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の単離された抗体。
16. 前記抗体が、CD40およびFcγRIIBの両方を結合する二重特異性抗体である、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の単離された抗体。
17. 請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗CD40抗体を一括してコードする単離された核酸または核酸のセット。
18. 前記核酸または核酸のセットが、1つのベクター上、または2つのベクター上に位置する、請求項１７に記載の単離された核酸または核酸のセット。
19. 前記1つまたは2つのベクターが、1つまたは2つの発現ベクターである、請求項１８に記載の単離された核酸または核酸のセット。
20. 請求項18または19に記載の前記単離された核酸または核酸のセットを含む宿主細胞。
21. 請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗CD40抗体または請求項17〜19のいずれか1項に記載の核酸もしくは核酸のセット、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
22. 対象における免疫応答を調節する方法であって、有効量の請求項21に記載の医薬組成物をその必要がある対象に投与することを含む、方法。
23. その必要がある前記対象が、癌または免疫異常を有する、有する疑いがある、またはそのリスクがあるヒト患者である、請求項22に記載の方法。
24. 抗CD40抗体を産生するための方法であって、
    （i）前記抗CD40抗体の発現を可能にする条件下で請求項20の前記宿主細胞を培養することと、
    （ii）このようにして前記細胞培養から産生された前記抗CD40抗体を採取することと、
    を含む、方法。

Images