KR20220110522A

KR20220110522A - 항gdf15 항체

Info

Publication number: KR20220110522A
Application number: KR1020227022234A
Authority: KR
Inventors: 시게키 니시하라; 유이치 이시카와; 유이치로 나카이시; 다츠야 가와토
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-08-08
Also published as: CA3164041A1; CN114746443A; EP4070816A1; JPWO2021112185A1; US20230036655A1; WO2021111636A1; TW202128751A; EP4070816A4; AU2020396341A1; WO2021112185A1

Abstract

본 개시는 DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 hGDF15의 에피토프에 결합하는 항hGDF15 항체 및 그 용도 등을 포함한다.

Description

항GDF15 항체

본 출원은 국제출원번호 PCT/JP2019/047956에 대해서 우선권을 주장하는 것으로, 여기에 참조함으로써, 그 전체가 본 명세서 내에 편입되는 것으로 한다.

본 개시는 항GDF15 항체 및 그 용도에 관한 것이다.

악액질은 만성 질환에 수반하는, 체중 감소·근력 저하를 특징으로 하는 복합적 대사성 질환이다. 그 중에서도, 암 악액질은 많은 진행 암 환자에게서 볼 수 있으며, 환자의 예후나 QOL을 악화시키기 때문에, 적극적인 치료가 요구된다. 그러나, 악액질의 병태는 복잡하고, 발생 기서에 불분명한 점도 많아, 현재의 시점에서 효과적인 치료약은 존재하지 않는다.

GDF15(성장 분화 인자(Growth Differentiation Factor) 15)는 TGF-β 슈퍼패밀리의 분비 단백질이며, 암이나 당뇨병 등 각종 질환에 대한 관여가 보고되고 있다. 혈중 GDF15 농도에 관한 임상 연구의 보고는 다수 존재하며, 예를 들어 암 환자에 있어서의 혈중 및 암 조직의 GDF15 레벨이 높은 것, 암 환자의 혈중 GDF15 레벨과 예후가 상관하는 것이 보고되고 있다. 또한, GDF15는 뇌의 섭식 중추에 작용해서 식욕부진을 유발하고, 악액질의 발증에 관여하는 것이 알려져 있다.

본 개시는 GDF15에 관련하는 질환 또는 증상의 처치에 유용한 항GDF15 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 개시는 어느 양태에 있어서, DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 hGDF15의 에피토프에 결합하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 실시 형태에 있어서,

서열번호 18의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 8의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열 혹은 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 9의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열 혹은 서열번호 9의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 137의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 138의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 139의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 140의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 141의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 142의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서,

서열번호 143의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 144의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 145의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 146의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 147의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 148의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서, hGDF15와의 결합에 대해서 상기 어느 것의 항체와 경합하는 항hGDF15 항체를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서, 상기 어느 것의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 세포를 제공한다.

본 개시는, 가일층의 양태에 있어서, 상기 어느 것의 항체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

본 개시의 항hGDF15 항체는, 기존의 항hGDF15 항체와는 다른 에피토프를 인식하고, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상의 처치에 유용하다.

도 1은 4종류의 항hGDF15 모노클로날 항체(HuMAB2, MAB17, Hu01G06-127, MAB957)를 사용한 경합 시험의 결과를 나타낸다.
도 2a는 HuMAB2의 Fab와 hGDF15의 공결정의 입체 구조 해석의 결과를 나타낸다.
도 2b는 HuMAB2의 Fab와 hGDF15의 공결정의 입체 구조 해석에 의한 에피토프 및 파라토프의 해석 결과를 나타낸다.
도 3은 HuMAB2의 Fab와 hGDF15의 결합 입체 구조 해석 결과이다. hGDF15는 호모 이량체를 형성하고 있고, HuMAB2가 결합하는 아미노산 중, hGDF15 단량체 중 하나(Monomer1)에 존재하는 아미노산을 밑줄로, 다른 하나의 단량체(Monomer2)에 존재하는 아미노산(71D72T)을 이중 밑줄로 나타낸다. 결합에 중요한 아미노산을 굵은 글씨로 나타내고, 특히 결합이 강한 아미노산을 화살표로 나타낸다.
도 4는 hGDF15 또는 DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 합성 펩티드와 HuMAB2의 결합 시험의 결과를 나타낸다.
도 5a는 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합(H쇄 개변 항체 1/2)을 나타낸다.
도 5b는 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합(H쇄 개변 항체 2/2)을 나타낸다.
도 5c는 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합(L쇄 개변 항체 1/2)을 나타낸다.
도 5d는 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합(L쇄 개변 항체 2/2)을 나타낸다.
도 6은 HuMAB2 및 MAB17에 의한 혈중 hGDF15의 포착을 나타낸다.
도 7은 담암 마우스 모델의 혈중 비결합 hGDF15 농도에 대한 항hGDF15 항체의 효과를 나타낸다.
도 8은 담암 마우스 모델의 체중 감소, 누적 섭이량, 및 혈중 비결합 hGDF15 농도에 대한 HuMAB2의 효과를 나타낸다.
도 9는 담암 마우스 모델의 활동성(개일 리듬)에 대한 HuMAB2의 효과를 나타낸다.
도 10은 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합을 나타낸다.
도 11은 변이를 갖는 H쇄(H49R, H49D, H48S, H71Y, H83R 또는 H120F) 및 L쇄(L48K, L112D, L72F 또는 L24H)로 구성되는 HuMAB2 변이체와 hGDF15의 결합을 나타낸다.
도 12는 GDF15 및 GFRAL의 복합체 형성에 대한 항GDF15 항체의 저해 활성의 평가 모식도를 나타낸다.
도 13은 GDF15, GFRAL 및 RET의 복합체 형성에 대한 HuMAB2의 저해 활성의 평가 모식도 및 그 평가 결과를 나타낸다.
도 14는 담암 마우스 모델의 체중 감소, 누적 섭이량, 및 혈중 비결합 hGDF15 농도에 대한 MAB1의 효과를 나타낸다.

특히 구체적인 규정이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어는, 유기 화학, 의학, 약학, 분자 생물학, 미생물학 등의 분야에 있어서의 당업자에게 일반적으로 이해되는 그대로의 의미를 갖는다. 이하에 몇 가지 본 명세서에서 사용되는 용어에 관한 정의를 기재하지만, 이들의 정의는, 본 명세서에 있어서, 일반적인 이해에 우선한다.

본 개시에서는, 수치가 「약」의 용어를 수반하는 경우, 그 값의 ±10%의 범위를 포함하는 것을 의도한다. 예를 들어, 「약 20」은, 「18 내지 22」를 포함하는 것으로 한다. 수치의 범위는, 양 끝점의 사이 모든 수치 및 양 끝점의 수치를 포함한다. 범위에 관한 「약」은, 그 범위의 양 끝점에 적용된다. 따라서, 예를 들어 「약 20 내지 30」은, 「18 내지 33」을 포함하는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서, 아미노산 잔기는 이하의 약호로 표현된다.

Ala 또는 A: 알라닌

Arg 또는 R: 아르기닌

Asn 또는 N: 아스파라긴

Asp 또는 D: 아스파르트산

Cys 또는 C: 시스테인

Gln 또는 Q: 글루타민

Glu 또는 E: 글루탐산

Gly 또는 G: 글리신

His 또는 H: 히스티딘

Ile 또는 I: 이소류신

Leu 또는 L: 류신

Lys 또는 K: 리신

Met 또는 M: 메티오닌

Phe 또는 F: 페닐알라닌

Pro 또는 P: 프롤린

Ser 또는 S: 세린

Thr 또는 T: 트레오닌

Trp 또는 W: 트립토판

Tyr 또는 Y: 티로신

Val 또는 V: 발린

본 명세서에 있어서, 어느 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 잔기는, 그 위치를 나타내는 숫자와 아미노산 잔기를 나타내는 약호로(예를 들어, 13번째의 아르기닌 잔기를 「13R」로서) 나타내는 경우가 있다.

GDF15(성장 분화 인자 15)는 MIC-1, PLAB, PDF, NAG-1로서도 알려지는, TGF-β 슈퍼패밀리의 분비 단백질이다. GDF15 유전자는, 전구체인 프로GDF15를 발현하고, 이 프로 GDF15가 막형 메탈로엔도프로테아제에 의해 절단되고, 성숙 GDF15가 생성된다. GDF15는 가용형이며, 이량체를 형성하여 그 수용체인 GFRAL에 인식된다고 생각되어 있다. 특히 기재하는 경우를 제외하고, 본 명세서에 있어서의 GDF15 되는 용어는, 성숙 GDF15를 의미한다.

본 명세서가 있어서, GDF15라는 용어는, 모든 생물종의 GDF15를 포함하는 의미에서 사용된다. 어느 실시 형태에 있어서, GDF15는 인간GDF15(hGDF15)이다. 프로hGDF15의 대표적 아미노산 서열을 서열번호 1로 나타낸다. 프로hGDF15는 29아미노산을 포함하는 시그널 펩티드(밑줄), 167아미노산을 포함하는 프로 펩티드 및 112아미노산을 포함하는 성숙 펩티드(이중 밑줄, hGDF15)의 308아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. hGDF15의 대표적 아미노산 서열을 서열번호 2로 나타내지만, 본 개시에 있어서의 hGDF15는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것에 한정되지 않는다.

본 명세서에 있어서의 「항체」라는 용어는, 항원에 대한 결합성을 갖는 면역 글로불린 또는 그 일부를 포함하는 분자를 의미하며, 천연의 면역 글로불린 형태 분자뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체, 다중 특이성 항체, 항체 단편 등 여러가지 구조의 분자를 포함하는 의미에서 사용된다. 본 명세서에 있어서의 「모노클로날」이라는 용어는, 각각 다른 에피토프에 대한 복수 종류의 항체 혼합물인 「폴리클로날 항체」와 구별하기 위해서 사용되며, 단일 종류의 항체 집단으로부터 얻어지는 것을 의미한다. 그 때문에, 「모노클로날 항체」라는 용어는, 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중 특이성 항체 및 항체 단편을 의미할 수 있다. 항체 단편은, 면역 글로불린의 일부를 구성 요소로서 포함하는 분자를 의미하고, 예를 들어 한정은 되지 않지만, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(V_H 및 V_L), F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, 디술피드-링크드(disulphide-linked) FV(sdFv), 단일-쇄(Single-Chain) FV(scFV) 및 이들의 중합체를 들 수 있다. 항체의 종은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 염소, 인간 유래의 항체를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「단리되었다」라는 용어는, 어떤 생물학적 분자(예를 들어, 항체 또는 폴리뉴클레오티드)가, 천연의 환경에 있어서의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되고 있는 것을 의미한다.

항체의 이뮤노글로불린 클래스는, 중쇄 정상 영역에 기초하여 결정된다. 이뮤노글로불린 클래스로서는, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 들 수 있고, 이들에 대응하는 중쇄는 각각, α쇄, δ쇄, ε쇄, γ쇄 및 μ쇄라고 불린다. 이뮤노글로불린 클래스를, 또한 서브클래스(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 분류할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 항체의 이뮤노글로불린 클래스 및 서브클래스는, 특별히 한정은 되지 않는다. 어느 실시 형태에 있어서, 이뮤노글로불린 클래스는 IgG이다. 항체의 경쇄는, 그 정상 영역에 기초하여 κ쇄 및 λ쇄에 나눌 수 있지만, 본 명세서에 있어서의 항체는, κ쇄 및 λ쇄의 어느 것을 갖고 있어도 된다.

항체의 가변 영역은, 통상 4개의 프레임워크 영역(framework region)(FR이라고도 기재한다) 사이에 두어진 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region)(CDR이라고도 기재한다)으로 구성된다. FR 및 CDR은 일반적으로, 경쇄 및 중쇄로도, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순으로 존재한다. 항체의 가변 영역이나 CDR을 정의하는 방법은 복수 보고되고 있고, 예를 들어 Kabat의 정의(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991), Chothia의 정의(Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987; 196:901-917), AbM의 정의(Martin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989; 86:9268-9272), Contact의 정의(MacCallum et al., J. Mol. Biol. 1996; 262:732-745) 및 IMGT의 정의(Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 2003; 27(1):55-77) 등이다. 본 명세서에 있어서는, 특히 기재하는 경우를 제외하고, Kabat의 정의를 사용한다.

본 명세서에 있어서, 항hGDF15 항체란, 원하는 효과의 발휘에 충분한 친화성으로 hGDF15에 결합하는 항체를 의미한다. 본 개시의 항hGDF15 항체는, hGDF15 또는 그 일부를 면역원으로서 사용하여, 일반적인 방법에 의해 취득할 수 있다. 면역원은 통상의 펩티드 합성법에 의해, 예를 들어 유전자 공학적 방법 또는 화학 합성에 의해, 제작할 수 있다. 혹은, 본 개시의 항체는, 유전자 공학적 방법을 사용해서 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 세포로 발현시킴으로써도, 얻을 수 있다.

폴리클로날 항체는, 「Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H.D.et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989」 등에 기재된 일반적인 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, 상기한 면역원에 의해, 래트, 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 포유 동물을 면역하는 것으로, 제작할 수 있다.

모노클로날 항체는, 항체를 산생하는 하이브리도마를 제작하는 방법이나, 유전자 공학적 방법을 사용해서 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작해서 세포로 발현시키는 방법 등, 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다.

모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마는, Kohler et al., Nature 256:495, 1975에 기재된 방법에 준해서 제작할 수 있다. 먼저, 면역원을, 항원성을 높이기 위한 적당한 물질(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌이나 소 혈청 알부민 등) 및 필요에 따라 면역 부활제(프로인트의 완전 혹은 불완전 아쥬반트 등)와 함께 혼합하고, 래트, 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 비인간 포유 동물에 면역한다. 통상, 면역 동물은 3 내지 10일 간격으로 복수회 면역되어, 면역원인 펩티드는 1 내지 100㎍이 투여된다. 이어서, 복수회의 면역을 거친 면역 동물로부터 면역 담당 세포(면역 동물에 있어서 항체 산생 능을 갖는 세포)를 회수하고, 자기항체 산생능이 없는 미엘로마 세포(예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유 동물에서 유래하는 세포)와, 세포 융합시킨다. 세포 융합에는, 폴리에틸렌글리콜법, 전기 융합법 등이 사용된다. 또한, 융합 세포가 갖는 선택 마커에 기초하여 세포 융합에 성공한 세포를 선택하고, 선택된 세포가 산생하는 항체의 면역원에 대한 반응성을, 후술하는 면역 측정법 등에 의해 확인함으로써, 목적의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마가 얻어진다. 모노클로날 항체는, 얻어진 하이브리도마를 시험관 내에서 배양한 배양 상청으로부터 단리할 수 있다. 또한, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복수 중 등의 생체 내에서 배양하고, 복수로부터 단리할 수도 있다.

모노클로날 항체는, 또한 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하고 숙주 세포로 발현시킴으로써, 얻을 수 있다(P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W.Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS). 또한, 트랜스제닉 동물 제작 기술을 사용하여, 목적으로 하는 항체의 유전자가 내재성 유전자에 내장된 트랜스제닉 동물(예를 들어, 소, 염소, 양 또는 돼지)을 제작하고, 그 트랜스제닉 동물의 밀크 중에서 그 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 취득할 수도 있다.

얻어진 모노클로날 항체는, 당해 분야에 있어서 주지의 방법, 예를 들어 프로테인 A칼럼에 의한 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 황산암모늄염석법, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 그래피 등을 적절히 조합함으로써, 정제할 수 있다.

키메라 항체는, 서로 유래가 다른 서열을 포함하는 항체이며, 예를 들어 서로 유래의 다른 가변 영역과 정상 영역을 연결한 항체이다. 어느 실시 형태에 있어서, 키메라 항체는, 인간 이외의 포유 동물 유래의 항체 가변 영역과, 인간 항체 유래의 정상 영역으로 구성된다. 키메라 항체는, 예를 들어 인간 이외의 포유 동물 유래의 항체 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 인간 항체의 정상 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 내장하고, 이 발현 벡터를 숙주에 도입해서 발현시킴으로써 취득할 수 있다.

CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하는 영역이며, 그 아미노산 서열은 다양성이 많다. 한편, FR을 구성하는 아미노산 서열은, 다른 결합 특이성을 갖는 항체의 사이에서도 높은 상동성을 나타낸다. 그 때문에, CDR의 이식에 의해, 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있다.

CDR 이식의 방법은 여러가지 알려져 있고, 예를 들어 하기의 문헌에 기재되어 있다: 미국특허 제7,022,500호 명세서, 미국특허 제6,982,321호 명세서, 미국특허 제6,180,370호 명세서, 미국특허 제6,054,297호 명세서, 미국특허 제5,693,762호 명세서, 미국특허 제5,859,205호, 미국특허 제5,693,761호, 미국특허 제5,565,332호 명세서,; 미국특허 제5,585,089호 명세서, 미국특허 제5,530,101호 명세서, 미국특허 제5,225,539호 명세서; Jones et al.(1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327; Queen, et al.(1989)Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033; Verhoeyen et al.(1988) Science 239:1534-1536; Winter(1998) FEBS lett 430:92-94.

인간화 항체는, 일반적으로, 인간 이외의 동물 유래의 항체 CDR과, 인간 항체 유래의 FR 및 인간 항체 유래의 정상 영역과로 구성된다. 인간화 항체는, 인간 이외의 동물 유래의 항체 CDR을 인간 항체에 이식하는 것에 의해 얻을 수 있다. 인간화 항체는 다양한 방법에 의해 제작할 수 있지만, 일례로서, 오버랩 익스텐션(Overlap Extension) PCR을 들 수 있다(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)). 본 방법에서는, 인간 이외의 동물 유래의 항체(예를 들어 마우스 항체)의 CDR과 인간 항체의 FR과의 말단에 오버랩하는 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용해서 PCR을 행하고, 인간 이외의 동물 유래의 항체 CDR과 인간 항체의 FR이 연결된 폴리뉴클레오티드를 합성한다. 이어서, 얻어진 폴리뉴클레오티드를 인간 항체의 정상 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결하고, 발현 벡터에 내장하고, 이 발현 벡터를 숙주에 도입해서 발현시킴으로써, 인간화 항체를 취득할 수 있다.

FR의 서열은, 예를 들어 생식 세포 계열의 항체 유전자 서열을 개시하는 데이터베이스(예를 들어, VBase, https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/) 또는 참고 문헌(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991); Tomlinson, I. M. et al.(1992)J. Mol. Biol. 227:776-798; Cox, J. P. L. et al.(1994) Eur. J Immunol. 24:827-836)에 기초하여, 결정할 수 있다. FR은 생식세포 계열의 서열과 비교해서 1 이상의 아미노산의 변이를 포함하고 있어도 된다. 적합한 FR의 선택 방법은 공지이며, 예를 들어 베스트피트법 (Sims et al. J. Immunol. 151:2296(1993))에 의해 선택된 FR이나, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역이 특정한 서브그룹의 콘센서스 서열에서 유래하는 FR(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285(1992); Presta et al. J. Immunol. 151:2623(1993))을 사용할 수 있다.

인간 항체는, 예를 들어 인간 림프구를 시험관 내에서 원하는 항원으로 감작하고, 이어서 감작 림프구를 인간 미엘로마 세포와 융합시킴으로써 취득할 수 있다(일본특허공고 평1-59878호 공보). 융합 파트너인 인간 미엘로마 세포에는, 예를 들어 U266 등을 이용할 수 있다. 또한, 인간 항체는, 인간 항체 유전자의 모든 레파토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 원하는 항원에서 면역함으로써도 취득할 수 있다(Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125, 2005). 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다(Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 178, 2001). 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 단일쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하고, 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 이어서, 이 가변 영역 서열을 인간 항체 정상 영역의 서열과 인 프레임에서 연결하고, 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 이 발현 벡터를 숙주에 도입해서 발현시킴으로써, 인간 항체를 취득할 수 있다.

다중 특이성 항체는, 적어도 2개의 다른 부위에 결합하는 항체이다. 다중 특이성 항체로서는, 이중 특이성 항체, 삼중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 다중 특이성 항체는, hGDF15와, 1 이상의 다른 항원에 결합한다. 다중 특이성 항체는, 예를 들어 유전자 공학적 방법에 의해, 혹은 인식 항원이 다른 2개 이상의 항체를 결합함으로써, 제작할 수 있다.

항체 단편은, 예를 들어 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의해 항체를 소화하는 것에 의해 얻을 수 있다. 혹은, 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입해 발현시키는 것에서 얻을 수 있다(예를 들어, Co, M.S.et al., J.Immunol.(1994)152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989)178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989)178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986)121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.(1986)121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.(1991)9, 132-137; Hudson et al., Nat. Med.,(2003)9, 129-134).

전술한 바와 같이, 항체는, 이것을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 세포에 도입해서 발현시킴으로써, 얻을 수 있다. 구체적으로는, 항체를 코드하는 서열이 인핸서나 프로모터 등의 발현 제어 영역 를 기초로 발현하도록 발현 벡터를 구축하고, 이 발현 벡터에서 숙주 세포를 형질 전환하고, 항체를 발현시킨다.

즉, 본 개시는 또한, 항hGDF15 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체를 발현 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 세포를 제공한다.

숙주 세포로서는, 예를 들어 동물 세포, 식물세포, 진균 세포 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다. 동물 세포로서는, 포유류 세포(예를 들어, CHO, COS, NIH3T3, 미엘로마, BHK(새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney)), HeLa, Vero), 양서류 세포(예를 들어 아프리카손톱가엘 난모세포) 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf9, Sf21, Tn5)을 들 수 있다. 진균 세포로서는, 효모(예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들어 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들어 아스퍼질러스·니거(Aspergillus niger)) 등을 들 수 있다. 또한, 대장균(E. coli)(예를 들어, JM109, DH5α, HB101 등), 고초균 등의 원핵 세포를 숙주 세포로서 사용할 수도 있다. 숙주 세포에 대한 벡터의 도입은, 예를 들어 인산칼슘법, DEAE덱스트란법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법에 의해 행할 수 있다.

얻어진 항체의 항원에 대한 결합은, 효소 면역 측정법(EIA)(ELISA를 포함한다), 방사 면역 측정법(RIA), 화학 발광 면역 측정법(CIA), 형광 면역 측정법(FIA) 등의 면역 측정법이나, BIACORE(등록상표) 표면 플라스몬 공명 어세이 등에 의해 확인할 수 있다. 항체의 항원에 대한 결합은, 경합 어세이에 의해 확인할 수도 있다. 예를 들어, 얻어진 항체가, hGDF15에 대한 결합이 확인되고 있는 항hGDF15 항체와 경합하는지의 여부를 조사함으로써, 확인할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 소정의 항hGDF15 항체(즉, 참조 항체)와 경합하는 항체란, 실시예에 기재하는 조건에서 측정한 경우에, 참조 항체의 hGDF15에 대한 결합을 유의미하게 감소시키는 항체를 의미한다. 어느 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항체는, 참조 항체의 hGDF15에 대한 결합을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상 감소시킨다.

어느 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는, DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 hGDF15의 에피토프에 결합한다. 서열번호 3의 아미노산 서열은, 서열번호 2에 5 내지 18번째의 아미노산 잔기에 상당한다. DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합할 것인가 아닌가는, hGDF15와의 결합에 대해서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경합하는지의 여부를 조사함으로써, 확인할 수 있다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는, hGDF15와의 결합에 대해서 소정의 항hGDF15 항체와 경합한다. 어느 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항체는, hGDF15와의 결합에 대해서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경합한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.

본 실시 형태에 있어서, CDR은, 어떠한 방법에 의해 특정되어도 된다. 소정의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR이란, 상기 소정의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 어느 것의 방법이 의해 특정된 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 의미하고, 당해 CDR을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은, 상기 소정의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 CDR 이외의 서열은 달라도 된다. 당업자는, 다양한 조건을 고려하고, 적합한 방법에 의해 CDR을 특정할 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, CDR은, Kabat, Chothia, AbM, Contact 및 IMGT에서 선택되는 어느 것의 정의에 의해 특정된다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 18, 38 내지 44 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 45 내지 48, 52 내지 66 및 151 내지 153에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20, 49, 50 및 67 내지 80에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21, 81 내지 89, 100 내지 104 및 154에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22, 90, 106 내지 115 및 155 내지 157에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23, 91 내지 99 및 118 내지 132에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 18, 38 내지 42 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 46 내지 48, 52 내지 66 및 151 내지 152에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20, 71, 73, 77 및 79에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21, 81 내지 83, 85 내지 89, 100 내지 104 및 154에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22, 90, 106, 108 내지 111, 113 내지 115 및 155 내지 157에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23, 93, 95 내지 99, 121, 122, 124, 125, 131 및 132에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는, 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 것의 중쇄 가변 영역 및 하기 (4) 내지 (6)에서 선택되는 어느 것의 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(1) 서열번호 18, 38 내지 44 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(4) 서열번호 21, 81 내지 89, 100 내지 104 및 154에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

(1) 서열번호 18, 38 내지 42 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(4) 서열번호 21, 81 내지 83, 85 내지 89, 100 내지 104 및 154에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

(1) 서열번호 18, 38 및 39에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 52 및 66에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20 및 77에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(4) 서열번호 21 및 85에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22, 155 및 157에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23 및 95에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

(i) 서열번호 18, 38 내지 44 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

(i) 서열번호 18, 38 내지 42 및 149 내지 150에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 45 내지 48, 52 내지 66 및 151 내지 152에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 138아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

를 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

를 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서 H48R, H49R, H49D, H50R, H50S, H50F, H52R, H52Q, H72R, H73D, H73R, H73Y, H119R, H119F, H48S, H71Y, H72A, H72L, H72N, H72T, H72W, H75H, H75L, H75N, H75Q, H79H, H79K, H79Q, H79R, H83R, H117Q, H119E, H119H, H119K, H119N, H119Q, H119S, H119T, H120A, H120D, H120F, H120N, H120Q, H122F, H54T, H54N, H71R, H71H 및 H77I에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 있어서 L47R, L48E, L48R, L48S, L48K, L50D, L50R, L50F, L50Y, L73R, L111F, L111Y, L112E, L112R, L112D, L112F, L113D, L113R, L113F, L48H, L48Y, L50Q, L50W, L51Q, L69Y, L70F, L70H, L72D, L72E, L72R, L72Y, L73K, L73N, L73Y, L75Q, L87K, L87N, L111A, L111N, L111S, L112H, L112Q, L112T, L112Y, L113S, L114F, L114H, L114I, L114N, L114Y, L116H, L116Y, L51Y, L72F, L73Q 및 L74H에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서 H49R, H49D, H50R, H50S, H50F, H73D, H73R, H73Y, H48S, H71Y, H72A, H72L, H72N, H72T, H72W, H75H, H75L, H75N, H75Q, H79H, H79K, H79Q, H79R, H83R, H119N, H119S, H120F, H120Q, H54T, H54N, H71R 및 H71H에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 있어서 L47R, L48E, L48R, L48K, L50D, L50R, L50F, L50Y, L73R, L112E, L112D, L112F, L113D, L113R, L113F, L48H, L48Y, L50Q, L50W, L51Q, L70F, L72D, L72E, L72R, L72Y, L73N, L73Y, L75Q, L112H, L112Q, L112Y, L113S, L116H, L116Y, L51Y, L72F, L73Q 및 L74H에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서 H49R, H49D, H48S, H71Y, H83R 및 H120F에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 있어서 L48K, L112D, L72F 및 L74H에서 선택되는 어느 것의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

이들 실시 형태에 있어서, 아미노산 치환은, 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내는 약호, 그 위치를 나타내는 숫자 및 치환 후의 아미노산 잔기를 나타내는 약호로 표현된다. 예를 들어, 「H48R」은, 48번째의 히스티딘 잔기의 아르기닌 잔기에의 치환을 의미한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

가일층의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항hGDF15 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열 혹은 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 5의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열 혹은 서열번호 5의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

서열번호 6의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열 혹은 서열번호 6의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 7의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 혹은 서열번호 7의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;

서열번호 133의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 133의 아미노산 서열 혹은 서열번호 133의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 134의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 134의 아미노산 서열 혹은 서열번호 134의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

서열번호 135의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 135의 아미노산 서열 혹은 서열번호 135의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 136의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 136의 아미노산 서열 혹은 서열번호 136의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함한다.

본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변에는, 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및 부가가 포함된다. 개변은, 결실, 치환, 삽입 및 부가의 어느 것이거나, 이들의 2 이상의 조합이어도 된다. 개변의 수는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개이다. 어느 실시 형태에 있어서, 아미노산의 개변은, 아미노산의 치환이다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 아미노산의 개변은, 1 내지 3개의 아미노산의 개변이다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 아미노산의 개변은, 1개의 아미노산의 치환이다.

본 명세서에 있어서, 소정의 아미노산 서열을 「포함하는」 아미노산 서열에는, 그 소정의 아미노산 서열에 1 이상의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열과, 그 소정의 아미노산 서열을 포함하는 서열이 포함된다.

본 명세서에 있어서, 소정의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 및, 소정의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에는, 그 소정의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서의 CDR에 개변이 발생하지 않은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역이 포함된다.

본 명세서에 있어서의, 아미노산 서열에 관한 「서열 동일성」이란, 비교 대상의 서열 전체 영역에 걸쳐 최적의 상태로(일치가 최대가 되는 상태로) 얼라인먼트된 2개의 서열간에서 일치하는 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 여기서, 비교 대상의 서열은, 2개의 서열이 최적인 얼라인먼트에 있어서, 부가 또는 결실(예를 들어 갭 등)을 갖고 있어도 된다. 서열 동일성은, 공공의 데이터베이스(예를 들어, DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp))에서 제공되는 FASTA, BLAST, CLUSTAL W 등의 프로그램을 사용해서 산출할 수 있다. 혹은, 시판 중인 서열 해석 소프트웨어(예를 들어, Vector NTI(등록상표) 소프트웨어, GENETYX(등록상표) ver.12)를 사용해서 구할 수도 있다.

아미노산 서열을 개변하여 원하는 특성을 갖는 항체를 얻는 방법으로서, 여러가지 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 개선한 변이체는, 파지 디스플레이에 기초하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 이 방법에서는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 변이 도입법에 의해 항체와 항원의 상호 작용에 영향을 미치는 아미노산 잔기를 동정하거나, 혹은 항원 항체 복합체의 결정 구조를 해석해서 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하거나 해서, 변이 도입 부위를 결정한다. 이 부위의 아미노산을 개변한 변이체를 에러 프론 PCR이나 부위 특이적 변이 도입 등에 의해 제작하고, 얻어진 변이체의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 원하는 특성을 갖는 변이체를 얻을 수 있다.

본 개시의 항체는, 혈중 GDF15 농도의 저하 작용을 갖는다. 이러한 작용을 갖는지의 여부는, 실시예에 기재와 같이, GDF15 발현 암 세포를 이식한 동물에 있어서 대조 항체와 비교해서 혈중 GDF15 농도를 유의미하게 감소시키는지 여부를 평가함으로써, 확인할 수 있다. 어떠한 이론에도 구속받는 것은 아니지만, 본 개시의 항체는, 프로GDF15의 절단을 억제함으로써, 혈중 GDF15 농도를 저하된다고 생각된다. 본 개시의 항체는 또한, 성숙 GDF15에 결합하고, GDF15로부터의 시그널 전달을 저해하는 작용을 가질 수 있다.

본 개시의 항체는, 혈중 GDF15 농도의 저하(경우에 따라, 추가로 GDF15의 시그널 전달 저해)에 의해, 체중 감소, 식욕부진, 개일 리듬 장애 등의 증상을 개선하는 작용을 발휘할 수 있다.

항체는 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성이나 보체 의존성 세포 상해(CDC) 활성 또는 체내 동태의 조절을 위해, 이뮤노글로불린의 서브클래스가 선택되어 있어도 되고, Fc 영역의 아미노산 서열 또는 당쇄가 개변되어 있어도 된다. 예를 들어, 보체 활성화능의 저감을 목적으로 하여, IgG4가 선택될 수 있다. 또한, Fc수용체 또는 C1q에 대한 결합성을 저감 또는 증강하는 개변, 혈중 반감기의 연장 때문에 FcRn으로의 결합 친화성을 상승시키는 개변 등이 행해질 수 있다.

항체는, 또한 예를 들어 항체의 혈중 반감기의 연장 또는 안정성의 개선 등 때문에, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜과의 코폴리머 등의 폴리머와 결합하고 있어도 된다.

항체는, 또한 화학 요법약, 독성 펩티드, 방사성 동위 원소 등과 결합하고 있어도 된다. 화학 요법약으로서는, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 클로람부실 및 이포스파미드 등의 알킬화약; 아자티오프린 및 머캅토퓨린 등의 대사 길향약; 빈카알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신), 탁산(예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 에토포시드 및 테니포시드 등의 알칼로이드; 캄토테신(예를 들어 이리노테칸 및 토포테칸) 등의 토포이소머라아제 저해약; 액티노마이신, 안트라사이클린, 독소루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 및 마이토마이신 등의 세포 상해성 항생 물질 등을 들 수 있다.

본 개시의 항체는, 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 본 개시의 항체는, 혈중 GDF15 농도의 저하 작용(경우에 의해, 또한 GDF15의 시그널 전달 저해 작용)을 갖고, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상의 처치에 유용하다. GDF15에 관련하는 질환 또는 증상으로서는, 체중 감소, 식욕 부진, 근육량 저하, 활동성 저하, 개일 리듬 장애, 뇌하수체 호르몬 분비 이상, 체온 조절 부전, 악액질, 암, 당뇨병, 신부전, 심부전, AIDS, COPD, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 패혈증, 결핵, 사코페니아, 암의 골전이, 항암제 유발성 오심 구토, 임신 입덧, 만성 골수 증식성 질환(예를 들어, 골수 섬유증, 진성 다혈증, 본태성 혈소판 혈증), 신경성 식욕부진증, 양극성 장애, 미토콘드리아병, ICU 관련 근력 저하 등을 들 수 있다.

어느 실시 형태에 있어서, 악액질은, 암, 당뇨병, 신부전, 심부전, AIDS, COPD, 다발성 경화증, 관절 류머티즘, 패혈증 또는 결핵에 수반하는 악액질이다. 가일층의 실시 형태에 있어서, 악액질은, 암 악액질이다. 악액질의 처치에는, 체중 감소, 식욕 부진, 근육량 저하, 활동성 저하, 개일 리듬 장애, 뇌하수체 호르몬 분비 이상 및 체온 조절 부전에서 선택되는 1 이상의 증상의 개선이 포함된다.

암으로서는, 한정은 되지 않지만, 위암, 식도암, 대장암, 폐암, 취장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 자궁경암, 자궁체암, 정소암, 방광암, 갑상선암, 간세포암, 간내 담관암, 두경부암, 백혈병, 다발성 골수종, 림프종, 뇌종양, 신경교종, 흑색종 등을 들 수 있다.

본 개시의 항체는, 원하는 효과(예를 들어, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상의 치료)를 발휘할 수 있는 양(본 명세서에 있어서, 유효량이라고 한다)으로 대상으로 투여된다. 항체의 투여량은, 투여 방법, 투여 대상의 연령, 체중, 건강 상태 등에 따라 적절히 선택된다. 예를 들어, 성인 1일당, 10㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏, 100㎍/㎏ 내지 10㎎/㎏ 또는 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏를, 연일 또는 수일, 1주일, 몇주일, 1개월 혹은 수 개월에 1회, 투여할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 항체의 투여 방법도, 투여 대상의 연령, 체중, 건강 상태 등에 따라 적절히 선택된다. 투여 방법은, 경구 투여이거나 비경구 투여여도 되지만, 비경구 투여가 바람직하다. 비경구 투여로서는, 피하 투여, 피내 투여, 근육 내 투여, 정맥 내 투여 등을 들 수 있지만, 정맥 내 투여에 의한 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 「대상」은 포유 동물이다. 포유 동물로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 말, 소, 원숭이 및 인간을 들 수 있다. 어느 실시 형태에서는, 대상은 인간이다.

의약 조성물은, 통상의 방법에 의해 제제화할 수 있다. 의약 조성물은, 항체에 더하여, 멸균수, 생리 식염수, 안정제, 부형제, 산화 방지제, 완충제, 방부제, 계면 활성제, 킬레이트제, 결합제등의, 의약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

본 개시의 항체는, 다른 치료약과 병용해도 된다. 본 명세서에 있어서, 2종 이상의 유효 성분을 병용하는 경우, 그 모두 또는 일부의 유효 성분이 동일한 조성물에 포함되어 있어도 되고, 모든 약제가 다른 조성물에 포함되어 있어도 된다. 또한, 2종 이상의 유효 성분의 투여 스케줄은 동일하거나 상이해도 된다.

어느 실시 형태에 있어서, 본 개시의 항체는, 암 치료약과 병용된다. 암 치료약으로서는, 한정은 되지 않지만, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 클로람부실 및 이포스파미드 등의 알킬화약; 아자티오프린 및 머캅토퓨린 등의 대사 길향약; 빈카알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신), 탁산(예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 에토포시드 및 테니포시드 등의 알칼로이드; 캄토테신(예를 들어 이리노테칸 및 토포테칸) 등의 토포이소머라아제 저해약; 액티노마이신, 안트라사이클린, 독소루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 및 마이토마이신 등의 세포 상해성 항생 물질; EGFR 저해약, HER2 저해약, ALK저해약, VEGFR 저해약 등의 분자 표적 약; 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 등의 면역 체크포인트 저해약을 들 수 있다.

본 개시의 예시적 실시 형태를 이하에 기재한다.

[1]

DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 hGDF15의 에피토프에 결합하는, 항hGDF15 항체.

[2]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1에 기재된 항체.

[3]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 또는 2에 기재된 항체.

[4]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[5]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[6]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 개변인, 상기 2 내지 5의 어느 것에 기재된 항체.

[7]

상기 아미노산 잔기의 개변이, 아미노산 잔기의 치환인, 상기 2 내지 6의 어느 것에 기재된 항체.

[8]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 치환인, 상기 2 내지 7의 어느 것에 기재된 항체.

[9]

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 8의 어느 것에 기재된 항체.

[10]

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 9의 어느 것에 기재된 항체.

[11]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 내지 10의 어느 것에 기재된 항체.

[12]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 내지 11의 어느 것에 기재된 항체.

[13]

서열번호 18 및 38 내지 44에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 45 내지 48 및 52 내지 66에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21, 81 내지 89 및 100 내지 104에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22, 90 및 106 내지 115에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 내지 12의 어느 것에 기재된 항체.

[14]

서열번호 18 및 38 내지 42에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19, 46 내지 48 및 52 내지 66에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21, 81 내지 83, 85 내지 89 및 100 내지 104에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22, 90, 106, 108 내지 111 및 113 내지 115에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 내지 13의 어느 것에 기재된 항체.

[15]

하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 것의 중쇄 가변 영역 및 하기 (4) 내지 (6)에서 선택되는 어느 것의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 14의 어느 것에 기재된 항체:

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

[16]

하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 것의 중쇄 가변 영역 및 하기 (4) 내지 (6)에서 선택되는 어느 것의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 15의 어느 것에 기재된 항체:

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

[17]

하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 것의 중쇄 가변 영역 및 하기 (4) 내지 (6)에서 선택되는 어느 것의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 16의 어느 것에 기재된 항체:

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(2) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

(3) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(5) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역;

(6) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역.

[18]

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,

상기 1 내지 17의 어느 것에 기재된 항체.

[19]

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,

상기 1 내지 18의 어느 것에 기재된 항체.

[20]

(i) 서열번호 18 및 38 내지 44에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,

상기 1 내지 19의 어느 것에 기재된 항체.

[21]

(i) 서열번호 18 및 38 내지 42에서 선택되는 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(iv) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;

(v) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다; 또는

(vi) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는,

상기 1 내지 20의 어느 것에 기재된 항체.

[22]

서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 내지 21의 어느 것에 기재된 항체.

[23]

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 상기 1 내지 22의 어느 것에 기재된 항체.

[24]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1에 기재된 항체.

[25]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 또는 24에 기재된 항체.

[26]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[27]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[28]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 개변인, 상기 24 내지 27의 어느 것에 기재된 항체.

[29]

상기 아미노산 잔기의 개변이, 아미노산 잔기의 치환인, 상기 28에 기재된 항체.

[30]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 치환인, 상기 28 또는 29에 기재된 항체.

[31]

서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 및 24 내지 30의 어느 것에 기재된 항체.

[32]

서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 및 24 내지 31의 어느 것에 기재된 항체.

[33]

서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 및 24 내지 32의 어느 것에 기재된 항체.

[34]

서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 상기 1 및 24 내지 33의 어느 것에 기재된 항체.

[35]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1에 기재된 항체.

[36]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 또는 35에 기재된 항체.

[37]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[38]

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[39]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 개변인, 상기 35 내지 38의 어느 것에 기재된 항체.

[40]

상기 아미노산 잔기의 개변이, 아미노산 잔기의 치환인, 상기 39에 기재된 항체.

[41]

상기 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 개변이, 1개의 아미노산 잔기의 치환인, 상기 39 또는 40에 기재된 항체.

[42]

서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 및 35 내지 41의 어느 것에 기재된 항체.

[43]

서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 및 35 내지 42의 어느 것에 기재된 항체.

[44]

서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,

서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및

서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하는, 상기 1 및 35 내지 43의 어느 것에 기재된 항체.

[45]

서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 상기 1 및 35 내지 44의 어느 것에 기재된 항체.

[46]

을 포함하는, 상기 1 내지 45의 어느 것에 기재된 항체.

[47]

을 포함하는, 항hGDF15 항체.

[48]

서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 1 내지 47의 어느 것에 기재된 항체.

[49]

을 포함하는, 상기 1 내지 48의 어느 것에 기재된 항체.

[50]

을 포함하는, 상기 1 내지 49의 어느 것에 기재된 항체.

[51]

을 포함하는, 상기 1 내지 50의 어느 것에 기재된 항체.

[52]

hGDF15와의 결합에 대해서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항hGDF15 항체와 경합하는, 상기 1 내지 51의 어느 것에 기재된 항체.

[53]

모노클로날 항체인, 상기 1 내지 52의 어느 것에 기재된 항체.

[54]

hGDF15와의 결합에 대해서, 상기 1 내지 53의 어느 것에 기재된 항체와 경합하는, 항hGDF15 항체.

[55]

서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항hGDF15 항체와 경합하는, 상기 54에 기재된 항체.

[56]

혈중 GDF15 농도를 저하시키는, 상기 54 또는 55에 기재된 항체.

[57]

프로GDF15의 절단을 억제하는, 상기 54 내지 56의 어느 것에 기재된 항체.

[58]

모노클로날 항체인, 상기 54 내지 56의 어느 것에 기재된 항체.

[59]

상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[60]

서열번호 24 및/또는 25의 핵산 서열을 포함하는, 상기 59에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[61]

상기 59 또는 60에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

[62]

상기 59 또는 60에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 세포.

[63]

상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체를 포함하는, 의약 조성물.

[64]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상을 처치하기 위한, 상기 63에 기재된 의약 조성물.

[65]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상이 암인, 상기 64에 기재된 의약 조성물.

[66]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상이 악액질인, 상기 64에 기재된 의약 조성물.

[67]

악액질이 암 악액질인, 상기 66에 기재된 의약 조성물.

[68]

혈중 GDF15 농도를 저하시키기 위한, 상기 63에 기재된 의약 조성물.

[69]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상의 처치에 사용하기 위한, 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체.

[70]

혈중 GDF15 농도의 저하에 사용하기 위한, 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체.

[71]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상을 처치하는 방법이며, 처치를 필요로 하는 대상으로 유효량의 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.

[72]

혈중 GDF15 농도를 저하시키기 위한 방법이며, 상기 저하를 필요로 하는 대상으로 유효량의 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.

[73]

GDF15에 관련하는 질환 또는 증상을 처치하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체의 사용.

[74]

혈중 GDF15 농도를 저하시키기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 1 내지 58의 어느 것에 기재된 항체의 사용.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 재차 설명하지만, 어떠한 의미에 있어서도 본 발명은 본 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

I. 항체 제작 (1)

A. 항hGDF15 항체의 제작

1 동물에 대한 면역

일정

Day1; 첫회 면역 (25㎍/shot/body, Abisco-100, ip)

Day10; 2회째 면역 (25㎍/shot/body, Abisco-100, ip)

Day17; 3회째 면역 (25㎍/shot/body, Abisco-100, ip)

Day21; 티터 체크(Titer check)

Day24; 최종 부스트(Final boost) (25㎍/shot/body, Abisco-100, ip)

Day27; 비장 적출, 세포 융합

시약

·재조합 인간(Recombinant Human) GDF15 (rhGDF15), R&D, 957-GD-025/CF, 25㎍

·Abisco-100 (ISCONOVA)

동물

·3H/HeJ Jms Slc-lpr/lpr (5W, 일본 SLC, 암컷)

수순

1. 50μL의 hGDF15 (0.5㎎/mL), 25μL의 Abisco-100, 175μL의 PBS를 혼합하고, 마우스의 복강 내에 투여했다(첫회 면역).

2. 첫회 면역으로부터 10 및 17일 후도 첫회 면역과 마찬가지로 조제한 hGDF15 용액을 복강 내 투여했다.

3. 첫회 면역으로부터 21일 후에, 마우스의 꼬리부로부터 캐필러리 체혈관을 사용해서 채혈을 행하고, 원심 분리에 의해 혈장을 얻었다.

4. 혈장은 100배, 1000배 및 10000배 희석하고, hGDF15를 고상한 96웰 플레이트를 사용해서 ELISA를 행하고, hGDF15에 대한 항체값이 상승하고 있는 것을 확인했다.

5. 첫회 면역으로부터 24일 후에, 첫회 면역과 마찬가지로 조제한 hGDF15 용액을 복강 내 투여했다.

6. 첫회 면역으로부터 27일 후에, 마취 하에서 비장을 적출하고, 세포 융합을 행하였다.

2 세포 융합 및 HAT 선택

세포

· Sp2/o-14Ag (이하 Sp2/o 세포, ATCC # CRL-1581)

3×10⁵ cells/mL를 초과하지 않도록 계대

시약

· DMEM (GIBCO, 10313-021)

· FBS (56℃, 30분간 비동화 처리 완료)

· 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(Penicillin-Streptomycin-Glutamine) (Invitrogen, 10378-016)

· 인슐린 (후나코시, BT-243) 10㎎/mL에 조제

· 55mM 2-메르캅토에탄올(Mercaptoethanol) (1000x) (Invitrogen, 21985-023)

· rIL-6

· PBS

· 튤크액

· 트리판 블루

· 적혈구 용해 완충액(Red blood cell lysing buffer) (SIGMA, R7757)

· PEG1500 (로슈, 108014)

· HAT 배지 보충(Media Supplement) (50×) Hybri-Max (SIGMA, H0262)

· HT 배지 보충 (50×) Hybri-Max (SIGMA, H0137)

기구

· 6웰 플레이트 (BD, 353046)

· 부유 세포 배양용 대플라스크

· 수술용 핀셋(3개)

· 수술용 가위(3개)

· 50mL 팔콘 튜브

· 1mL 시린지

· 23G 주사 바늘

· 셀 스트레이너 40㎛ (BD, 352340)

배지 조성

· Sp2/o 배양용 배지

DMEM 500mL

FBS 55mL (최종 10%)

페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100×) 5mL (최종 1×)

· 세포 융합용 배지

DMEM

· 하이브리도마용 배지

DMEM 500mL

FBS 55mL (최종 10%)

페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100×) 5mL (최종 1×)

2ME 500μL (최종 0.1%)

인슐린(10㎎/mL) 250μL (최종 5㎍/mL)

rIL-6 적의 (최종 5ng/mL)

· HAT 선택 배지

하이브리도마용 배지

50×HAT 적의 (최종 1×)

수순

· 미엘로마의 준비(세포 융합 1주일 전)

1. 동결 보존되어 있던 Sp2/o 세포(약 1×10⁶cells/vial)를 융해하고, 미리 15mL 팔콘 튜브에 분주해 둔 Sp2/o용 배지 10mL에 현탁하고, 1500rpm으로 3분 원심 분리해서 세정하고, 상청을 제외했다.

2. 펠릿(Sp2/o 세포)을 Sp2/o용 배지 4ml에 현탁했다.

3. 6웰 플레이트의 각 웰에 Sp2/o용 배지 4mL 넣어 두고, 2.에서 현탁한 Sp2/o 세포를 2배 계열로 희석했다.

4. 37℃, 5.5% CO₂ 아래, 1 내지 2일 배양했다.

5. 현미경 관찰에 의해 상태가 좋은 웰의 세포를 회수하고 부유 세포 배양용 대플라스크(또는 중플라스크)에 확대 배양했다. 세포 융합 2일 전에 계대를 행하였다.(세포 융합 당일에 5×10⁵ cells/mL 전후의 세포 밀도가 되도록 했다.)

·마우스로부터의 비장의 적출

1. 마우스에 마취를 걸어서, 70% 에탄올을 충분히 뿌린 후, 안전 캐비넷 안에 있어서, 개복했다. 무균적으로 비장을 적출하기 위해서, 멸균된 핀셋·가위는 외피용과 복강 내용의 것을 준비했다.

2. 마취 하에서 배대동맥으로부터 전체 채혈 후, 비장을 적출했다.

3. 미리 PBS를 넣어 둔 50mL 팔콘 튜브에 비장을 넣고, 세포 융합까지의 사이에 얼음 위에 놓았다.

·세포 융합(하이브리도마의 제작)

DMEM(무혈청)과 PEG를 37℃ 인큐베이터로 미리 따뜻하게 해 두고 이하를 행하였다.

1. Sp2/o 세포를 회수하고, 세포수를 세었다. 1×10⁶cells/mL 이하의 플라스크의 세포만을 사용했다.

2. 6웰 팔콘 플레이트의 1웰에 PBS를 10mL 정도 준비하고, 거기에 적출한 비장을 넣고, 주변에 남아 있는 지방 조직을 제거했다.

3. 나머지 웰의 1개에 PBS 10mL를 새롭게 넣고, 비장을 옮겼다. 멸균된 핀셋과 가위로 비장을 반으로 잘랐다.

4. 1mL 시린지에 23G의 주사 바늘을 장착하고, PBS를 흡수하고, 반으로 자른 비장에 주입하고, 비세포를 PBS 안으로 압출했다. 비장이 하얗게 될 때까지 반복했다.

5. 50mL 팔콘 튜브 상부에 멸균된 메쉬를 두고, 비세포를 포함하는 PBS를 통과함으로써, 비세포 이외의 조직을 제외했다. 총량이 40mL가 되도록 세포 융합용 배지를 첨가했다.

6. 1500rpm으로 3분간, 원심 분리하고, 상청을 제외했다.

7. 비세포를 세포 융합용 배지 20mL에 현탁하고, 튤크액을 사용해서 염색하고(튤크액:현탁액=10:1), 백혈구를 카운트했다. (일반적으로, 1×10⁸cells, 5×10⁶cells/mL 정도가 된다.)

8. 1500rpm으로 3분간, 원심 분리하고, 상청을 제외했다.

9. 적혈구 용해 완충액 3mL에 현탁하고, 얼음 위에서 3분 정치했다.

10. 세포 융합용 배지 17mL 첨가하고, 1500rpm으로 3분간, 원심 분리하고, 비세포를 회수했다.

11. Sp2/o 세포를 포함하는 배지를, 세포수로 비세포:Sp2/o 세포=5:1이 되도록 첨가하고, 현탁했다.

12. 1500rpm으로 3분간, 원심 분리하고, 상청을 제외했다.

13. 침전한 세포를 탭핑에 의해 재현탁했다.

14. 천천히 교반하면서 1분간에 걸쳐 PEG1500을 1mL 적가했다.

15. 추가로 1분간 교반을 계속했다.

16. 14와 마찬가지로 세포 융합용 배지 1mL를 적가했다.

17. 추가로 3분간에 걸쳐 세포 융합용 배지 3mL를 첨가했다.

18. 추가로 1분간에 걸쳐 세포 융합용 배지 10mL를 첨가했다.

19. 37℃에서 10분간 정치했다.

20. 전량 40mL가 되도록 세포 융합용 배지를 첨가했다.

21. 1500rpm으로 3분간 원심 분리하고, 상청을 제외했다.

22. 비세포수로서 1mL당 1×10⁶cells가 되도록 하이브리도마용 배지에 현탁하고, 96웰 평평한 바닥 플레이트에 웰당, 100μL로 하이브리도마를 살포했다.

23. 37℃, CO₂ 5.5% 하, o/n 배양했다

24. 2×HAT 선택 배지를 100μL/well 첨가하고, 계속해서 배양했다.

25. 1일 간격으로 상청 100μL을 제거하고, 1×HAT 선택 배지를 100μL 첨가함으로써 배지 교환을 행하였다.

3 항체의 스크리닝

항hGDF15 항체를 산생하는 하이브리도마의 선택은, 96웰 플레이트로 배양 개시부터 5일 후에, 하이브리도마 상청을 사용해서 ELISA에 의해 측정한 hGDF15에 대한 결합 강도를 지표로, 이하와 같이 행하였다.

hGDF15(R&D Systems, 957-GD-025/CF)를 고상화한 96웰 플레이트의 각 웰에, 100μL의 배양 상청을 첨가하고, 2시간 실온에서 반응시켰다. 웰을 세정 후, 검출용 2차 항체(HRP 표지 항 마우스 IgG 항체(Promega, W402B))를 첨가하고, 1시간 실온에서 반응시켰다. 웰을 세정 후, TMB 용액(Sigma, T2885)을 사용해서 발색하고, 플레이트 리더로 흡광도 450㎚를 측정했다.

450㎚의 흡광도가 1.0 이상의 웰의 하이브리도마는, 추가로 한계 희석법에 의해 단클론화를 행하였다. 최종적으로 16클론을 얻었다. 얻어진 16클론 중, IgM이었던 1클론 및, 비특이적으로 복수의 단백에 결합을 나타낸 2클론을 제외한 13클론을 배양했다.

배양 상청으로부터 HiTrap rProtein A FF(GE 헬스케어 라이프 사이언스, 17508001)를 사용해서 항체의 정제를 행하였다. 정제 항체의 농도는 NanoDrop (Thermo Scientific)을 사용해서 흡광도 280㎚를 사용해서 계측했다.

정제한 각 항체의 hGDF15와의 결합 친화성을 ELISA로 이하와 같이 측정했다. 200ng/mL의 농도의 hGDF15를 100μL/well로 웰에 첨가했다. hGDF15를 고상화한 96웰 플레이트에, 0.39ng/mL로부터 25ng/mL로 단계 희석한 정제 항체를 100μL/well로 반응시킨 뒤, hGDF15-항hGDF15 항체 복합체를 HRP 콘쥬게이트 2차 항체로 검출했다. 발색은 450㎚의 흡광도를 측정하고, 4파라미터 로지스틱스 곡선을 사용하여, 5ng/mL의 농도의 항체량의 값을 산출했다. 각 항체의 결합값은 클론MAB17의 값을 100으로 하고, 상대값을 산출했다.

hGDF15와 얻어진 항hGDF15 항체의 친화성 결과를 표 1에 나타낸다. MAB17보다 훨씬 강한 결합을 나타낸 MAB2를 인간화했다.

[표 1]

4 인간화 항체의 제작

·세포

세포주명: ExpiCHO

유래: 차이니즈 햄스터

세포 입수처: Thermo Fisher Scientific(A29127)

배양액: ExpiCHO 발현 배양액(expression medium)

배양액 입수처: Thermo Fisher Scientific(A2910001)

·발현 벡터

벡터명: pcDNA-3.1

cDNA 유래: 전체 합성

입수처: Thermo Fisher Scientific

·재조합 단백질

단백질명: 인간 GDF15

유래: CHO 세포

입수처: R&D systems (957-GD-025/CF)

·키메라 항체의 서열 디자인

마우스 유래의 항체인 MAB2의 CDR 서열을 포함하는 가변 영역과 베바시주맙(bevacizumab)의 정상 영역을 서로 연결시켜 키메라 항체의 서열로 하였다.

·인간화 항체의 서열 디자인

Blast 서치로 MAB2에 유사성이 높은 인간 항체를 검색했다. 이들 인간 항체에 CDR 서열을 치환하고, 가변 영역을 제작하고, 베바시주맙의 정상 영역을 서로 연결시켜서 전체 길이 인간화 항체를 제작했다. 또한, 구조 예측으로부터 구조의 유지에 중요하다고 생각된 아미노산에 관해서는, 마우스 항체의 아미노산을 그대로 남기고, 인간화 항체의 일부로 하였다.

·항체의 제작과 정제

중쇄 및 경쇄 유전자를 전 합성하고, 각각 발현 벡터에 내장했다. 24웰 플레이트에 ExpiCHO 세포를 파종하고, 다음날, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 TransIT-CHO kit(Takara, V2170)로 유전자 도입(co-transfection)하여, 중쇄 및 경쇄를 공발현시켰다. 5일 후, 산생된 항체를 포함하는 배양 상청을 모두 회수하고, Hitrap rProteinA FF 칼럼(GE healthcare, 17-5080-01)을 사용해서 항체를 정제했다.

·항체 농도의 측정

상청 중의 항체 농도는, Human IgG EIA 키트(Takara, MK136)로, 첨부 프로토콜에 따라서 측정했다. 정제 항체는 NanoDrop(Thermo Fisher Scientific)으로 흡광도는 280㎚를 측정하고, 농도를 결정했다.

·hGDF15에 대한 결합량의 측정(ELISA)

96웰 플레이트에 100μL의 인간GDF15 용액(0.4㎍/mL)을 넣고, 다음날 아침까지 정치하고, ELISA 플레이트를 제작했다. 플레이트의 블로킹은 1% BSA로 1시간 행하고, 항체를 포함하는 배양 상청은 공비 3의 희석 계열을 제작하고, ELISA 플레이트에 100μL씩 첨가하고, 2시간 정치했다. 2차 항체의 반응은, 20000배 희석한 HRP 복합항 인간IgG 항체(Gene Tex, GTX26759)를 100μL 첨가하고, 1시간 반응시켰다. 발색 반응은 TMB(Sigma, T-0440)를 사용하고, 반응 정지액은 2 규정의 황산을 사용했다. 흡광도는 450㎚를 측정했다.

·BLITZ를 사용한 결합 친화성의 측정

항체의 결합 친화성은, 생체 분자간 상호 작용 해석 시스템인 BLITZ(Pall ForteBio)를 사용해서 측정했다. 센서 칩에는 Anti-HIS(Pall ForteBio, 18-5114)를, 세정액에는 ForteBio Sample Diluent(Pall ForteBio, 18-1048)을 각각 사용했다. 측정 프로그램은, hGDF15의 센서 칩에 대한 흡착에 60초, 항체의 결합에 120초, 해리에 120초로 설정했다.

B. 서열 결정

1 시험 방법

10㎝ 샤알레에서 배양한 하이브리도마로부터 토탈 RNA를 조제하고, SMARTer RACE 5'/3' Kit(Takara, 634858)를 사용해서 cDNA를 합성했다. 합성된 cDNA를 pCR4Blunt-TOPO vector에 내장하고, 대장균을 사용해서 증폭시켜서, 플라스미드 DNA를 정제했다. DNA의 서열 결정은, BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo Fisher Scientific, 4337454)와 M13 프라이머를 사용하여, ABI 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 행하였다.

2 결과

MAB17, MAB2 및 HuMAB2의 아미노산 서열을 표 2에, CDR 서열을 표 3에, HuMAB2의 cDNA 서열을 표 4에 나타낸다. CDR은 Kabat의 정의에 의해 특정했다.

[표 2-1]

[표 2-2]

[표 3]

[표 4-1]

[표 4-2]

[표 4-3]

C. 기존의 항hGDF15 항체와의 비교

1 시험 재료 및 방법

항hGDF15 항체

HuMAB2와의 반응성 비교에 사용한 항체를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

시험 방법

HuMAB2 및 표 5에 나타내는 항GDF15 모노클로날 항체(2㎍/mL)를 100μL/well로 96웰 플레이트에 첨가하여, 각각 고상화한 플레이트로, 1ng/ml의 농도로부터 단계 희석한 hGDF15(R&D Systems, 957-GD-025/CF)를 100μL/well 반응시켰다. EZ-Link Micro NHS-PEG4-Bitinylation Kit(Thermo Fisher Scientific, 21955)를 사용해서 비오틴화한 HuMAB2를 검출 항체(1㎍/mL를 100μL/well)로서 사용했다. 샌드위치 ELISA 성립 가부는, Human GDF15 ELISA Kit(R&D Systems, DY957) 첨부의 스트렙트아비딘(Streptavidin)-HRP 콘쥬게이트(conjugate)를 사용해서 검출했다. 샌드위치 ELISA의 포지티브 컨트롤 항체(PC)로서, 어느 것의 모노클로날 항체와도 샌드위치가 가능한 Human GDF15 ELISA Kit (R&D Systems, DY957) 첨부의 검출 항체(표 5)를 사용했다.

2 결과

고상화한 항체와 비오틴화한 항체가 유사한 에피토프를 인식하고 있는 경우, 경합 저해가 일어나지만, 다른 에피토프를 인식하고 있는 경우에는 경합 저해는 일어나지 않다고 생각된다. 도 1에 도시한 바와 같이, HuMAB2는 다른 항체와 동시에 hGDF15를 인식할 수 있었다. 이러한 점에서, HuMAB2는 다른 항체와 다른 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다.

상기한 바와 같이, HuMAB2는 기존의 항체와 경합하지 않는 것이 명확해졌다. 그래서, 금회 얻어진 다른 항체가 HuMAB2와 경합하는지의 여부를, 상기와 동일한 방법으로 시험했다. 결과를 저해%로 산출하고, 표 6에 나타냈다. 시험한 8클론 중, 4클론(MAB1, MAB11, MAB12 및 MAB13)이, HuMAB2와 hGDF15의 결합을 70% 이상 저해하는 것이 명확해졌다.

[표 6]

D. hGDF15와 HuMAB2 Fab와의 복합체의 결정화

1 시험 재료 및 방법

hGDF15(R&D Systems, 9279-GD-050)에 대하여, HuMAB2 Fab(서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다)(20ml Tris-HCl, 200mM NaCl, pH7.2)을 몰비 1:1로 농도가 5㎎/mL가 되도록 혼합하고, 복합체의 단백 용액을 조제했다. HuMAB2 결정화는 시팅 드롭(Sitting drop) 증기 확산법으로 행하였다. 단백 용액과 리저버 용액의 혼합비는 1:1로 하였다. 스크리닝 키트 Crystal Screen 2(Hampton Research, HR2-112)에서 얻어진 결정을 사용하여, 복합체의 결정 구조를 분해능 2.8Å으로 결정했다. 위상 결정은 분자 치환법으로 행하였다.

2 결과

입체 구조 해석에 의해, hGDF15는 호모 이량체를 형성하고 있고, hGDF15의 이량체에 2분자의 HuMAB2의 Fab가 결합하고 있는 것을 알 수 있다(도 2a). HuMAB2와 hGDF15의 결합 경계면에 서열하는 아미노산을 각각 파라토프와 에피토프로서 동정했다(도 2b). 표 7에, 동정된 hGDF15의 에피토프 및 결합에 중요한 HuMAB2 상의 아미노산을 밑줄로 나타낸다.

[표 7]

MOE(Molecular Operating Envirou㎚ent)를 사용해서 해석한 hGDF15의 에피토프를 도 3에 나타낸다. HuMAB2는 hGDF15 단량체 중 하나(Monomer1) 상의 N단측의 5번째의 아스파르트산으로부터 18번째의 히스티딘까지의 14아미노산, 45번째의 이소류신(45I) 및 46번째의 글리신(46G)에, 다른 하나의 단량체(Monomer2) 상의 71번째의 아스파르트산(71D) 및 72번째의 트레오닌(72T)에 결합하는 것이 명확해졌다.

에피토프 내에서 HuMAB2와의 상호 작용에 특히 강하게 관계되어 있다고 추정되는 아미노산 잔기를 MOE의 프로테인 컨택츠(Protein Contacts)를 사용해서 계산했다(표 8). 그 결과, 도 3에 도시한 아미노산이 특히 강하게 HuMAB2와 결합하고 있는 것이 나타내졌다.

[표 8]

E. hGDF15 및 변이hGDF15에 대한 항hGDF15 항체의 반응성

1 시험 재료 및 방법

시험 재료

HuMAB2 항체와의 반응성 비교에 사용한 항체를 표 9에 나타낸다.

[표 9]

시험 방법

시험 개요

변이hGDF15 발현용 컨스트럭트를 ExpiCHO-S 세포에 트랜스펙션하고, 배양 후, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청 중의 각 변이hGDF15의 발현을 시판 중인 GDF15 측정용 ELISA 키트로 확인한 후, 각 변이hGDF15에 대한 HuMAB2의 반응성을 ELISA법으로 평가했다. 에피토프 중에서 특히 중요한 아미노산 잔기의 동정에는, 변이 도입 GDF15에 대한 HuMAB2의 반응성을 ELISA 및 생체 분자간 상호 작용 해석 시스템의 두 방법으로 평가했다. HuMAB2와 다른 항hGDF15 항체와의 에피토프의 차이에 의한 차별화의 검증은, 변이hGDF15에 대한 다른 항hGDF15 항체의 반응성과 HuMAB2의 반응성을 샌드위치 ELISA법으로 비교함으로써 행하였다.

변이hGDF15의 조제

각 변이hGDF15 유전자가 도입된 pcDNA-3.1 벡터(Thermo Fisher Scientific)을, ExpiCHO TM Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific, A29133)를 사용하여, 키트에 포함되는 ExpiCHO-S(Thermo Fisher Scientific) 세포에 트랜스펙션 했다. 트랜스펙션 후 10일째의 배양 상청을 4℃에서 8000rpm으로 30분간 원심 분리하고, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청은, 냉동(설정 온도 -20℃) 보존했다.

변이hGDF15의 발현 확인

회수한 배양 상청 중의 변이hGDF15는, Human GDF15 ELISA Kit(R&D Systems, DY957)을 사용하여, 키트의 첨부 문서에 따라서 측정을 실시하고, 발현의 확인과 농도 측정을 행하였다.

변이hGDF15에 대한 GDF15 항체의 반응성 평가

야생형(Wild-type: Wt) hGDF15는, 재조합 인간 GDF15(R&D Systems, 957-GD-025/CF)를 사용했다. 각 hGDF15 항체를 고상한 플레이트에 단계 희석한 Wt 및 변이hGDF15를 반응시켜서, 결합한 Wt 및 변이hGDF15를 Human GDF15 ELISA Kit(R&D Systems, DY957)의 검출 항체(표 9)를 사용해서 검출했다.

생체 분자간 상호 작용 해석 시스템에 의한 변이 도입 GDF15에 대한 HuMAB2의 반응성 평가

각 변이hGDF15는 MAB17을 세파로스(GE Healthcare, 17-0906-01)에 고정한 어피니티·칼럼을 사용해서 정제했다. 생체 분자간 상호 작용 해석 시스템에서의 평가는 OCTET QKe(ForteBio)를 사용해서 행하였다. Wt의 GDF15는 재조합 인간 GDF15(R&D Systems, 957-GD-025/CF)를 사용했다. 바이오센서 Ni-NTA(ForteBio, 18-5101)에 Wt 및 변이hGDF15를 결합시키고, 계속해서 단계 희석한 HuMAB2를 반응시켜서, 변이hGDF15와 HuMAB2 사이의 상호 작용을 평가했다. 해석은 키네틱스법(Kinetics Method)을 사용해서 실시했다.

2 결과

야생형(WT) hGDF15 및 변이hGDF15의 아미노산 서열을 표 10에 나타낸다. 야생형 hGDF15의 아미노산을 알라닌에 치환한 부위를 밑줄로 나타내고 있다.

[표 10]

표 11에, 4종의 항hGDF15 항체와 hGDF15 및 변이hGDF15의 결합을 나타낸다. HuMAB2는, 변이hGDF15와 결합하지 않았거나, 야생형 hGDF15와의 결합보다 약하게 결합했지만, 다른 항hGDF15 항체와 hGDF15의 결합은 변이에 의해 영향받지 않았다. 이러한 점에서, HuMAB2의 hGDF15의 에피토프 중 N말단측의 5DHCPLGPGRCCRLH18(서열번호 3)이 결합에 중요하고, 특히 13R과 16R이 HuMAB2의 결합에 중요한 것을 알 수 있다. 또한, 이 결과로부터도, MAB17, Hu01G06-127 및 MAB957은 HuMAB2와는 에피토프가 다른 것이 지지되었다.

[표 11]

F. 에피토프 영역 펩티드에 대한 HuMAB2 항체의 반응성 평가

1 시험 방법

hGDF15의 5번째의 아스파라긴 잔기로부터 18번째의 히스티딘 잔기까지의 14 잔기(DHCPLGPGRCCRLH, 서열번호 3)가 HuMAB2의 결합에 중요한 것이 명확해진 점에서, 이 서열의 펩티드를 GenScript사에서 합성했다(표 12). 펩티드 1은 양 말단 모두 미수식으로 하고, 펩티드 2는 이 영역이 hGDF15 내에서는 인터널한 영역이기 때문에, 그 상태를 모방할 목적으로 아미노 말단을 아세틸화하고, 카르복실 말단을 아미드화해서 합성했다. 10㎍/mL의 펩티드 용액을 100μL/well로 첨가해서 고상한 96웰 플레이트에, HuMAB2 항체(10㎍/mL)를 100μL/well로 첨가해서 반응시켰다(3시간 25℃). 결합한 HuMAB2 항체를, 5000배 희석한 항 인간IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch, 109-035-008)를 100μL/well로 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시켜서, 검출했다. 플레이트의 컨트롤로서, hGDF15(R&D Systems, 957-GD-025/CF)를 고상한 플레이트를 사용했다. 펩티드에 반응하는 포지티브 컨트롤 항체로서 Human GDF15 ELISA Kit(R&D Systems, DY957)의 검출 항체(표 9)를, 네거티브 컨트롤 항체로서 인간 IgG1 아이소타입 컨트롤(Human IgG1 Isotype control)(Abcam, ab206198)을 사용했다.

[표 12]

2 결과

도 4에 도시한 바와 같이, 포지티브 컨트롤 항체인 항hGDF15 폴리클로날 항체는, 2종류의 펩티드 및 hGDF15의 어느 것에도 반응했다. 이에 반해, HuMAB2는 hGDF15에만 반응하고, 2종류의 합성 펩티드에 대해서는 네거티브 컨트롤 항체인 인간 IgG1 아이소타입 컨트롤(hIgG1)과 마찬가지로 반응을 나타내지 않았다. 이 결과로부터, HuMAB2의 hGDF15의 에피토프에 대한 결합에는, 주변의 서열 또는 입체 구조가 중요한 것이 시사되었다.

G. CDR 중의 아미노산 치환에 의한 HuMAB2 변이체의 hGDF15에 대한 결합

1 시험 재료 및 방법

시험계

세포

1) 세포주명: ExpiCHO

2) 유래: 차이니즈 햄스터

3) 세포 입수처: Thermo Fisher Scientific (A29127)

4) 배양액: ExpiCHO 발현 배양액

5) 배양액 입수처: Thermo Fisher Scientific (A2910001)

항체 발현 벡터

1) 벡터명: pcDNA-3.1

2) cDNA 유래: 전체 합성

3) 입수처: Thermo Fisher Scientific

재조합 단백질

1) 단백질명: 인간 GDF15(hGDF15)

2) 유래: CHO 세포

3) 입수처: R&D systems(957-GD-025/CF)

시험 방법

발현 벡터의 디자인

HuMAB2와 hGDF15의 결정 구조 해석으로부터 얻어진 정보로부터, 항체와 항원의 결합 경계면에 서열하는 아미노산을 파라토프와 에피토프로 하고, HuMAB2의 중쇄 또는 경쇄에 아미노산 변이를 삽입한 발현 벡터를 디자인했다. 표 13에 변이 항체의 일람을 나타낸다(개변한 아미노산을 밑줄로 나타낸다). 중쇄 및 경쇄 모두, N말단으로부터 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순으로 나열되어 있다.

발현 벡터의 세포 도입

24웰 플레이트에 CHO 세포를 파종하고, 다음날, 표 13의 변이 항체의 발현 벡터를 중쇄 및 경쇄로 조합해서 TransIT-CHO kit(Takara, V2170)로 유전자 도입했다. 5일 후 상청을 모두 회수하고, 사용까지 -20℃ 설정의 냉동고에서 보존했다.

hGDF15에 대한 결합량의 측정

96웰 플레이트에 100μL의 hGDF15 용액(0.4㎍/ml)을 첨가하고, 다음날 아침까지 4℃에서 정치하고, ELISA 플레이트를 제작했다. 1%BSA를 첨가하고, 1시간 블로킹을 행하고, 변이 항체를 포함하는 배양 상청은 30배 희석으로부터 희석 계열(희석 배율의 공비 3)을 제작하여, ELISA 플레이트에 100μL씩 첨가하고, 2시간 정치했다. 2차 항체로서, HRP 복합 항 인간IgG 항체(Gene Tex, GTX26759)(20000배 희석)를 첨가하고, 1시간 정치했다. 발색 반응은 TMB(Sigma, T-0440)를 사용하고, 반응 정지액은 2규정의 황산을 사용했다. 흡광도는 450㎚를 측정했다.

OCTET를 사용한 항체 농도의 측정

배양 상청 중의 항체 농도는, 생체 분자간 상호 작용 해석 시스템인 OCTET QKe(Pall ForteBio)에서 측정했다. 센서 칩에는 Protein L(Pall ForteBio, 18-5085)을, 센서 칩의 재생액에는 10mM 글리신(Glycine)(pH1.1)을, 세정액에는 ForteBio Sample Diluent(Pall ForteBio, 18-1048)를 각각 사용했다. 스탠더드에는, 인간 혈청 리젠트 그레이드의 IgG(IgG from human serum regent grade)(Sigma-Aldrich, I12511-10MG)를 50㎎/mL, 10㎎/mL, 1㎎/mL, 및 0.1㎎/mL로 사용하고, 측정하는 배양 상청은 Sample Diluent(Pall ForteBio, 18-1104)로 2배 희석해서 사용했다. 측정 프로그램은, 센서 칩의 재생을 5초와 세정에 5초를 3사이클 반복한 뒤, 항체 농도 측정을 120초로 설정했다.

HuMAB2의 결합량의 비교

항체 5ng/mL에 있어서의 인간hGDF15에 대한 결합량을 엑셀 상에서 계산하고, HuMAB2의 hGDF15에 대한 결합량을 100으로 했을 때의, 각 변이 항체의 결합량을 상대값으로 나타냈다. 3회의 독립된 시험을 행하여 평균값±표준 오차를 구하였다. 변이를 넣은 것에 의해 항체가 발현하지 않게 된 항체의 결합량은 0으로 하였다. 결과를 도 5a 내지 d에 나타낸다.

2 결과

상대 결합량이 HuMAB2의 1.5배 이상을 나타낸 항체가 5종류 찾아낼 수 있었다. 한편, 50% 이하의 결합량의 저하가 30종류로 관찰되었다. 도 5a의 「H쇄 개변 항체 1/2」에는 「H50S-L7」의 결과가 2개 나타내어져 있지만, 이들은 배양 및 ELISA에 있어서의 웰간 오차의 확인을 위해 놓아둔 동일한 벡터에 의한 결과이다. 2개 모두가 동일 정도의 값인 것으로부터 안정된 시험계인 것이 나타내졌다.

중쇄 변이 항체인 H48S-L7, H83R-L7 및 H120F-L7, 경쇄 변이 항체인 H3-L48K 및 H3-L112D에서는, HuMAB2에 비해 결합력이 약 1.5배 상승하고 있었다. 한편, HuMAB2의 경쇄의 111번째의 글리신(111G)의 변이체 및 114번째의 류신(114L)의 변이체는 모두 결합량의 저하가 확인된 점에서, 이들 아미노산이 hGDF15에 대한 결합 및 HuMAB2의 CDR 서열의 구조 유지에 중요한 부위인 것이 시사되었다.

[표 13-1]

[표 13-2]

[표 13-3]

II. 약리 시험 (1)

A. 혈 중 hGDF15의 포착

1 시험 재료 및 방법

동물

1) 종/계통: 마우스/BALB-c Slc-nu/nu

2) 미생물학적 그레이드: 무특이 병원체(specific pathogen-free)(SPF)

3) 입수처: 닛폰 에스엘씨

4) 성: 암컷

5) 주령: 6주령(hGDF15, 항체 투여 시)

6) 사육 조건

하기의 조건에 설정된 환경 하에서, 동물의 사육을 행한다.

a) 온도: 23±2℃

b) 습도: 60±10%

c) 조명: 조명 시간: 오전 7시 내지 오후 7시

소등 시간: 오후 7시 내지 오전 7시

d) 사료 및 물: 자유 섭취, CRF-1(오리엔탈 효모(주)), 수돗물

시험 스케줄

표 14에 항체 투여일을 0일로 한 시험 스케줄을 나타낸다.

[표 14]

동물의 사육 방법

반입일로부터 3일 후에 마우스를 개별의 케이지로 나누었다. 개별 사육에 대한 순화 때문에, 군 분류까지의 순화 기간을 5일간으로 하였다.

군 분류

체중을 바탕으로, 1군 6마리씩, 계 6군에 실험 데이터 수집 처리 시스템(SAS institute Japan, R9.3)으로 군 분류를 행하였다.

항hGDF15 항체의 투여

rhGDF15, HuMAB2 항체 및 MAB17 항체는, 10mL/㎏로 복강 내 투여했다. 대조 군에는 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(Phosphate-Buffered Saline)(DPBS)을 10mL/㎏로 투여했다. 군 구성을 표 15에 나타낸다.

[표 15]

체중 및 섭이량의 측정

체중 및 섭이량은, 군 분류일과 투여 0일, 1일, 2일, 3일 후에 측정을 행하였다.

채혈·해부

채혈은 항체 투여 후 3일째에, 이소플루란 흡입으로 마취한 마우스의 하대정맥으로부터 행하였다. EDTA2K의 체혈관을 사용해서 혈장으로 하고, 사용까지 -80℃ 설정의 냉동고에서 보존했다. 채혈 후의 마우스는, 마취 하인 상태 그대로 복부 하대정맥 절개에 의해 방혈 안락사시켰다.

혈중 비결합 hGDF15 농도

혈중의 항체에 결합하지 않은 hGDF15(비결합 hGDF15)를 측정하기 위해서, 항원 항체 복합체를 이하의 수순으로 제거했다. 5μL Protein A/G agarose beads(Thermo scientific, 20421)와, 50μL의 마우스 혈장 및 145μL의 PBS를 혼합하고, 4℃에서 2시간 혼화했다. 원심 분리 후, 상청을 새로운 에펜 튜브로 옮기고, 사용까지 -80℃ 설정의 냉동고에서 보존했다. 그 후의 혈중 GDF15 측정은, GDF15 측정 ELISA 키트(R&D systems, DY957)를 사용하고, 수순은 키트의 설명서에 준하였다. 검출 한계 이하의 검체에 관해서는 혈중 GDF15 농도를 0pg/mL로 하였다.

통계 해석 방법

혈중 비결합 GDF15 농도에 관해서는, 윌콕슨의 순위합 검정을 행하였다. 통계 해석에는 SAS software(SAS institute Japan, R9.3)를 사용했다.

2 결과

결과를 도 6에 나타낸다. hGDF15의 혈중 농도는 rhGDF15의 투여량에 의존해서 증가하고, MAB17 및 HuMAB2 모두 혈중의 GDF15를 포착했다.

B. 담암 마우스 모델의 혈중 GDF15 농도의 감소

1 시험 재료 및 방법

피검 물질

·HuMAB2

·MAB1

·MAB13

대조 물질

·MAB17

·MAB957(R&D Systems)

·Hu01G06-127(WO2014/100689)

피검 물질 및 대조 물질의 조제

모든 항체를 DPBS로 1㎎/mL에 조제하고, 투여일까지 -80℃ 설정의 냉동고에 보존했다.

시험계

세포

1) 세포주명: MKN45

2) 유래: 인간 위암

3) 입수처: JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)cell bank

4) 배양 조건: 37℃, 5% CO₂

a) 배양액: RPMI1640

i) 입수처: life technologies

b) 혈청: 소태아 혈청(Fetal bovine serum)

i) 농도: 10%

ii) 입수처: Tissue Culture Biology

동물

5) 종/계통: 마우스/BALB-c Slc-nu/nu

6) 미생물학적 그레이드: 무특이 병원체(SPF)

7) 입수처:닛폰 에스엘씨

8) 성: 암컷

9) 주령: 7주령(세포 이식 시)

10) 상기 「A. 혈중 hGDF15의 포착」에 기재된 환경 하에서, 동물의 사육을 행하였다.

군 구성

[표 16]

[표 17]

시험 방법

동물의 사육 방법

반입일로부터 3일 후에 마우스를 개별의 케이지로 나누었다. 개별 사육에 대한 순화 때문에, MKN45를 이식할 때까지의 순화 기간을 5일간으로 하였다.

세포의 조제와 동물에의 세포 이식

MKN45 세포는 150㎜의 샤알레에서 배양하고, 이식일에 0.25% 트립신-EDTA(SIGMA, T6689) 처리로 세포를 회수하고, 원심 분리(1200rpm, 5분)에 의해 상청을 제거했다. DPBS로 5×10⁶cells/mL가 되도록 현탁하고, 이소플루란 흡입으로 마취한 마우스의 복부피하에 0.2mL/body(1×10⁶cells/body)로 이식하였다.

군 분류

시험 1에서는, MKN45 이식 전에, 42마리의 마우스로부터 랜덤하게 5마리를 선택하고, 노멀(비히클)군으로 하고, 나머지 37마리에 MKN45를 이식했다. MKN45 이식으로부터 12일 후에 체중을 바탕으로, 1군 5마리씩, 계 6군에 SAS software(SAS institute Japan, R9.4)로 군 분류를 행하고, MKN45(비히클)군, MKN45(MAB17)군, MKN45(MAB957)군, MKN45(Hu01G06-127)군 및 MKN45(HuMAB2)군으로 할당했다. 마찬가지로 하여, 시험 2이라도, 노멀(비히클)군, MKN45(비히클)군, MKN45(MAB17)군, MKN45(MAB1)군 및 MKN45(13)군에, 1군 5마리씩 할당했다. 군 분류 후, 잉여 동물은 이소플루란 마취 하에서 방혈 안락사시켰다.

DPBS 및 항체의 투여

MKN45 이식으로부터 14일 후(군 분류로부터 2일 후)에, DPBS 및 항체(10mL/㎏)을 복강 내 투여했다. 시험 1에서는, 항체 투여 개시 후 7일째에도 DPBS 및 항체를 투여했다.

채혈

채혈은 항체 투여 개시 후 14일째(시험 1) 또는 7일 후(시험 2)에, 이소플루란 흡입으로 마취한 마우스의 하대정맥으로부터 행하였다. EDTA2K의 체혈관을 사용해서 혈장으로 하고, 사용까지 -80℃ 설정의 냉동고에서 보존했다. 채혈 후의 마우스는, 마취 하인 상태 그대로 복부 하대정맥 절개에 의해 방혈 안락사시켰다.

혈중 비결합 hGDF15 농도

혈중의 항체에 결합하지 않은 hGDF15(비결합 hGDF15)을 측정하기 위해서, 항원 항체 복합체를 이하의 수순으로 제거했다. 5μL Protein A/G agarose beads(Thermo scientific, 20421)와 50μL의 마우스 혈장, 145μL의 PBS를 혼합하고, 4℃에서 2시간 혼화했다. 원심 분리 후, 상청을 새로운 에펜 튜브로 옮기고, 사용까지 -80℃ 설정의 냉동고에서 보존했다. 그 후의 혈중 GDF15 측정은, GDF15 측정 ELISA 키트(R&D systems, DY957)를 사용하고, 수순은 키트의 설명서에 준했다. 검출 한계 이하(62.5pg/mL 이하)의 검체에 관해서는 혈중 GDF15 농도를 0pg/mL로 하였다.

통계 해석 방법

항체 투여 개시부터 14일째(시험 1) 또는 7일 후(시험 2)의 혈중 비결합 hGDF15 농도에 대하여, 윌콕슨의 순위합 검정을 행하였다. 통계 해석에는 SAS software(SAS institute Japan, R9.4)를 사용했다.

2 결과

시험 1에 있어서, MKN45 세포를 이식한 MKN45군의 혈중 hGDF15 농도는, 약 2000pg/mL였다. MKN45 세포를 이식한 모델 마우스에 항체를 투여한 군에서는, MAB17, MAB957, Hu01G06-127 항체 투여군에서는, 용매 투여군에 비해 혈중 hGDF15 농도의 상승이 관찰되었다. 한편, HuMAB2 투여군에서는, 혈중 hGDF15 농도는 감소하였다(도 7).

시험 2에 있어서, 용매 투여군의 혈중 hGDF15 농도를 100으로 한 경우의 상대값을 표 18에 나타낸다. HuMAB2와 마찬가지로, MAB1 및 MAB13에 의해서도, 혈중 hGDF15 농도의 감소가 관찰되었다.

[표 18]

상기 결과는, 리콤비넌트 hGDF15를 투여한 시험(도 6)에서의 MAB17의 결과와는 다른 것이었다. 이 원인 중 하나로서, HuMAB2와 시험에 사용한 다른 3개의 항체와의 에피토프의 차이를 들 수 있다. hGDF15는 프로hGDF15가 단백질 분해 효소에 의해 절단되는 것으로 산생된다(A.R.Bauson et al.Cancer Res.2005; 65(6):2320-2336). HuMAB2는, 이 절단 부위의 근방에 에피토프가 존재하고, 여기에 결합하는 것으로, hGDF15의 산생을 억제하고 있을 가능성이 생각되었다. 지금까지, 어느 항CCL-2 중화 항체(ABN912)가 류머티즘 환자의 병태를 개선하지 않고 악화시킨 것이 보고되어 있고, 항체의 용량 의존적으로 혈중 CCL-2 농도가 상승한 것이 이 악화의 원인 중 하나로 생각된 점에서, 혈중 항원 농도를 감소시키는 것의 중요성이 시사되어 왔다(J.J.Haringman et al. Arthritis & Rheumatism 2006; 54(8): 2387-2392). 이러한 점에서, HuMAB2와 같은 혈중 GDF15양을 감소시키는 항GDF15 항체는, 혈중 hGDF15를 증가시키는 항체보다 임상 상 유용한 것이 기대된다.

C. 담암 마우스 모델의 악액질 증상의 개선 (1)

1 시험 재료 및 방법

1.1 피검 물질의 조제

HuMAB2를 DPBS로 1㎎/mL에 조제하고, 투여일까지 -80℃ 설정의 냉동고에 보존했다.

1.2 시험계

1.2.1 세포

1) 세포주명: MKN45

2) 유래: 인간 위암

3) 입수처: JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)cell bank

4) 배양 조건: 37℃, 5% CO₂

a) 배양액: RPMI 1640

i) 입수처: life technologies

b) 혈청: 소태아 혈청

i) 농도: 10%

ii) 입수처: Tissue Culture Biology

1.2.2 동물

1) 종/계통: 마우스/BALB-c Slc-nu/nu

2) 미생물학적 그레이드: 무특이 병원체 (SPF)

3) 입수처: 닛폰 에스엘씨

4) 성: 암컷

5) 주령: 7주령(세포 이식 시)

6) 사육 조건

하기의 조건에 설정된 환경 하에서, 동물의 사육을 행한다.

a) 온도: 23±2℃

b) 습도: 60±10%

c) 조명: 조명 시간: 오전 7시 내지 오후 7시

소등 시간: 오후 7시 내지 오전 7시

d) 사료 및 물: 자유 섭취, CRF-1(오리엔탈 효모(주)), 수돗물

1.2.3 군 구성

[표 19]

1.3 시험 방법

1.3.1 시험 스케줄

표 20에 항체 투여일을 0일로 한 시험 스케줄을 나타낸다.

[표 20]

1.3.2 동물의 사육 방법

반입일로부터 3일 후에 마우스를 개별 케이지로 나누었다. 개별 사육에 대한 순화 때문에, MKN45 이식할 때까지의 순화 기간을 5일간으로 하였다.

1.3.3 세포의 조제와 동물에의 세포 이식

MKN45 세포는 150㎜의 샤알레에서 배양하고, 이식일에 0.25% 트립신-EDTA(SIGMA, T6689) 처리로 세포를 회수하고, 원심 분리(1200rpm, 5분)에 의해 상청을 제거했다. DBPS에서 5×10⁶cells/mL가 되도록 현탁하고, 이소플루란 흡입으로 마취한 마우스의 복부피하에 0.2mL/body(1×10⁶cells/body)로 이식했다.

1.3.4 군 분류

MKN45 이식 전에, 32마리의 마우스로부터 랜덤하게 8마리를 선택하고, 노멀군으로 하고, 나머지 24마리에 MKN45를 이식했다. MKN45 이식으로부터 12일 후에 체중을 바탕으로, 1군 8마리씩, 계 2군에 실험 데이터 수집 처리 시스템(EDCS, ver.2.1)으로 군 분류를 행하고, MKN45군과 HuMAB2군에 할당했다. 군 분류 후, 잉여 동물은 이소플루란 마취 하에서 방혈 안락사시켰다.

1.3.5 DPBS 및 HuMAB2의 투여

MKN45 이식으로부터 14일 후(군 분류로부터 2일 후)에 DPBS 및 HuMAB2를 투여했다. DPBS 및 HuMAB2는 10mL/㎏로 복강 내 투여했다.

1.3.6 체중 및 섭이량의 측정

체중 및 섭이량은 MKN45 이식일로부터 항체 투여일까지 3일마다 측정했다. 항체 투여일로부터는 투여 0일, 2일, 4일, 7일 후에 측정을 행하였다.

1.3.7 채혈·해부

채혈은 항체 투여 후 7일째에, 이소플루란 흡입으로 마취한 마우스의 하대정맥으로부터 행하였다. EDTA2K의 체혈관을 사용해서 혈장으로 하고, 사용까지 -80℃ 설정의 냉동고에서 보존했다. 채혈 후의 마우스는, 마취 하인 상태 그대로 복부 하대정맥 절개에 의해 방혈 안락사시켰다. 종양은, 종양부의 피부를 절개하고, 수술용 가위를 사용해서 채취하고, 중량을 측정했다.

1.4 통계 해석 방법

항체 투여 7일 후의 체중 및 종양 중량, 항체 투여일로부터 7일째까지의 누적 섭이량에 관해서는, 노멀군과 MKN45군, MKN45군과 HuMAB2군의 각각에 대하여 대응이 없는 t 검정을 행하였다. 혈중 비결합 GDF15 농도에 관해서는, 윌콕슨의 순위합 검정을 행하였다. 통계 해석에는 SAS software(SAS institute Japan, R9.3)를 사용했다.

2 결과

담암(MKN45 세포 이식) 마우스를 사용하여, 암성 악액질의 증상인 체중 및 섭이량의 변화에 대한 HuMAB2의 효과를 검토하고, 혈중 비결합 GDF15양에 대한 영향도 검토했다. 도 8에 체중의 추이와, 항체 투여 후 7일간의 누적 섭이량, 항체 투여 7일 후의 혈중 비결합 GDF15 농도를 나타낸다. 항체 투여 7일 후의 체중은 노멀군과 비교하여, MKN45군은 4g 정도 감소하여, MKN45 세포의 이식에 의해 유의미한 체중 감소가 확인되었다(P<0.01). 한편, HuMAB2군에서는 항체의 투여 후에 체중 감소의 회복이 관찰되어, MKN45군과 비교해서 유의미한 체중의 증가가 확인되었다(P<0.01). 마찬가지로 항체 투여 후 7일간의 누적 섭이량에 관해서도, MKN45군에서는 유의미하게 감소하고(P<0.01), HuMAB2군에서는 MKN45군과 비교해서 유의미한 증대가 확인되었다(P<0.01). 혈중 비결합 GDF15 농도는, 노멀군에서는 검출되지 않았지만, MKN45군으로 1500pg/mL 정도까지 유의미하게 상승하고(P<0.01), 도 7의 결과와 마찬가지로, HuMAB2군에서는 20분의 1정도로까지 유의미하게 감소하였다(P<0.01). 이들 결과로부터, MKN45 이식 마우스의 악액질양 증상(체중 감소, 섭이량)은 HuMAB2의 투여에 의해 회복하는 것을 확인할 수 있었다.

D. 담암 마우스 모델의 악액질 증상의 개선 (2)

1 시험 재료 및 방법

1.1 피검 물질의 조제

1.2 시험계

1.2.1 세포

1) 세포주명: MKN45

1) 유래: 인간(인간 위암 조직)

2) 입수처: JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)

3) 배양 조건: 37℃ 5% CO₂ 전 배양 조건: 37℃ 5% CO₂

a) 배양액: RPMI1640

i) 입수처: life technologies

b) 혈청: 소태아 혈청

i) 농도: 10%

ii) 입수처: Tissue Culture Biology

1.2.2 동물

1) 종/계통: 마우스/BALB-c Slc-nu/nu

2) 미생물학적 그레이드: 무특이 병원체 (SPF)

3) 입수처: 닛폰 에스엘씨

4) 성: 암컷

5) 주령: 6-12주령

6) 사육 조건

하기의 조건에 설정된 환경 하에서, 동물의 사육을 행하였다.

a) 온도: 23±2℃

b) 습도: 60±10%

c) 조명: 조명 시간: 오전 7시 내지 오후 7시

소등 시간: 오후 7시 내지 오전 7시

d) 사료 및 물: 자유 섭취(시험 1의 짝지워 먹이기(Pair-feeding)군은 매일 규정량을 먹이 공급(사료 공급)), CRF-1(오리엔탈 효모(주)), 수돗물

1.2.3 군 구성

[표 21]

1.3 시험 방법

1.3.1 모델의 제작·군 분류·항체의 투여

먼저, 노멀군으로서 5마리를 랜덤하게 골라 냈다. 악액질 모델 제작은 상기 C에 기재된 바와 같이 행하고, 항체는 복강 내 투여했다(도 9).

1.3.2 자발 운동량의 측정

자발 운동량의 측정은, 케이지 내에 와이어리스 런닝 휠(브레인 사이언스 이데아사, ENV-044)을 설치하고, 런닝 휠의 회전수를 자발 운동량으로서 측정했다. 측정값은 명기(오전 7시부터 오후 7시까지)와 암기(오후 7시부터 오전 7시까지)의 12시간마다 집계했다.

1.4 평가 항목

· 체중

· 자발 운동량

1.5 통계 해석 방법

군 분류에 관해서는, 체중을 지표로 한 일차원으로 행하였다. 군 분류와 검정에 관해서는 SAS software(SAS institute Japan, R9.3)를 사용했다.

2 결과

GDF15에 의해 유도되는 악액질양 증상을 평가하기 위해서, 케이지 내에 런닝 휠을 넣어 자발 운동량을 측정했다. 도 9에 시험 스케줄을 나타낸다. 노멀군에 비해, MKN45군에서는 활동량이 10분의 1정도로까지 감소하였다. 이 활동량의 감소는, HuMAB2 투여 후 3일 정도로 거의 노멀군과 동등 정도로 회복하는 것이 명확해졌다. 또한, MKN45군에서는, 활동량의 감소뿐만 아니라, 활동 패턴에도 상위가 있는 것이 판명되었다. 노멀군에서는, 암기에 활발해지고, 명기에 활동성이 저하되는 야행성 동물의 특징이 관찰되고 있지만, MKN45군에서는, 그 활동 패턴이 명백하게 역전되어 있었다. 그리고, 항체를 투여된 HuMAB2군에서는, 그 패턴도 노멀군과 마찬가지로 회복하고 있었다.

III. 항체 제작 (2)

A. 서열 결정

MAB1 및 MAB13(표 1)에 대해서, MAB2와 마찬가지로 하여 아미노산 서열을 결정했다. H쇄 및 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 표 22에, CDR 서열을 표 23에 나타낸다.

[표 22]

[표 23]

B. 변이 항체의 제작

상기 「I. 항체 제작 (1) G. CDR 중의 아미노산 치환에 의한 HuMAB2 변이체의 hGDF15에 대한 결합」과 마찬가지로 하여, 표 24에 나타내는 가일층의 HuMAB2 변이체를 제작했다. HuMAB2의 hGDF15에 대한 결합량을 100으로 했을 때의 각 변이 항체의 결합량을 도 10에 나타낸다. HuMAB2와 동등 이상의 결합량을 나타내는 항체가 복수 얻어졌다.

[표 24]

또한, hGDF15에 대한 결합력이 높았던 HuMAB2 변이체의 H쇄(H49R, H49D, H48S, H71Y, H83R 또는 H120F) 및 L쇄(L48K, L112D, L72F 또는 L74H)(표 25)을 조합하고, 얻어진 항체의 hGDF15와의 결합을 조사했다. 결과를 도 11에 나타낸다. HuMAB2와 동등 이상의 결합량을 나타내는 다수의 항체가 얻어졌다.

[표 25]

C. GDF15, GFRAL 및 RET 복합체 형성에 대한 저해 활성 평가

GDF15는 수용체인 GFRAL 및 모두 수용체인 RET와 복합체를 형성하고, 세포 내 시그널을 전달한다. 그래서, HuMAB2의 GDF15, GFRAL 및 RET 복합체 형성에 있어서의 영향을 검토했다.

처음에, GDF15와 GFRAL과의 복합체 형성에 대한 영향을 검토했다(도 12). GFRAL(R&D systems, 9697-GR)을 고상화한 플레이트에, EZ-Link Micro NHS-PEG4-Bitinylation Kit(Thermo Fisher Scientific, 21955)를 사용해서 비오틴화한 GDF15(R&D Systems, 957-GD/CF)와, 항GDF15 모노클로날 항체(표 26)의 단계 희석액을 반응시켰다. 네거티브 컨트롤용 항체로서, Human IgG1, kappa-Isotype Control(Abcam)을 사용했다. GFRAL과 결합한 GDF15를, 피어스 고감도 스트렙타비딘(Pierce High Sensitivity Streptavidin)-HRP(Thermo Fisher Scientific, 21130)를 사용해서 검출했다. 발색에는 TMB 1-컴포넌트 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질(Component Microwell Peroxidase Substrate), SureBlue(SeraCare Life Sciences)를 사용하고, 반응은 정지액(Wako)을 첨가하고 정지했다. 흡광도는, Emax(Molecular Devices)를 사용해서 450㎚(OD450)에서 측정했다. 컨트롤 %값은 항체 미첨가 시의 OD450값을 컨트롤로서, 각 항체 첨가 시의 OD450값으로부터 식-1을 사용해서 산출했다. IC50값은 얻어진 컨트롤 %값으로부터 식-2를 사용해서 저해율을 산출하고, 엑셀 IC50 산출 매크로를 사용해서 구하였다.

컨트롤 % = 항체 첨가 샘플의 OD450값÷항체 미첨가 시의 OD450값×100 (식-1)

저해율=100-컨트롤 % (식-2)

표 26에 나타내는 바와 같이, HuMAB2를 제외하는 항GDF15 항체는 GDF15와 GFRAL과의 복합체 형성을 저해했지만, HuMAB2는 저해하지 않았다. 이 차이는 이들 항체의 에피토프의 차이에 기초한다고 생각되었다.

[표 26]

이어서, GDF15, GFRAL 및 RET의 복합체 형성에 대한 영향을 검토했다. 30nM의 GFRAL(R&D systems)을 고상화한 ELISA 플레이트에, 50nM의 GDF15(R&D Systems, 9279-GD), 30nM의 RET(R&D Systems, 1168-CR) 및 HuMAB2의 단계 희석액(0-500nM)의 혼합액을 첨가했다. 네거티브 컨트롤용 항체로서 Human IgG1, kappa-Isotype Control(Abcam)을 사용했다. 형성된 GDF15/GFRAL/RET 복합체를 항-히스 페록시다아제 콘쥬게이티드 항체(Anti-His Peroxidase conjugated antibody)(R&D systems, MAB050H)를 사용해서 검출했다. 발색에는 TMB 1-컴포넌트 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질, SureBlue(SeraCare Life Sciences)를 사용하고, 반응은 정지액(Wako)을 첨가하고 정지했다. 흡광도는 Emax(Molecular Devices)를 사용해서 450㎚로 측정했다. 컨트롤 %값은, 항체 농도(0nM)(항체 미첨가 시)의 OD450값을 컨트롤로 해서, 각 항체 첨가 시의 OD450값으로부터 식-1을 사용해서 산출했다. IC50값은, 얻어진 컨트롤 %값으로부터 식-2를 사용해서 저해율을 산출하고, 엑셀 IC50 산출 매크로를 사용해서 구하였다.

HuMAB2는 GDF15/GFRAL 복합체 형성에 대하여 저해 활성을 나타내지 않았지만(표 26), GDF15/GFRAL/RET 복합체 형성에 대해서는 저해 활성을 나타냈다(도 13). 이들 결과로부터, HuMAB2는 시그널을 세포 내에 전달하는 기능을 갖는 RET와의 복합체 형성을 저해함으로써 GDF15의 기능 저해 활성을 발휘하고 있다고 생각되었다.

VI. 약리 시험 (2)

A. 담암 마우스 모델의 악액질 증상의 개선 (3)

상기 「II. 약리 시험 (1) C. 담암 마우스 모델의 악액질 증상의 개선 (1)」과 마찬가지로 하여, 담암(MKN45 세포 이식) 마우스를 사용하여, MAB1의 체중, 섭이량, 및 혈중 비결합 GDF15양에 대한 영향을 검토했다. 군 구성을 표 27에 나타낸다.

[표 27]

도 14에, 체중의 추이, 항체 투여 후 7일간의 누적 섭이량, 및 항체 투여 7일 후의 혈중 비결합 GDF15 농도를 나타낸다. MKN45군에서는 체중 감소가 관찰되는 데 반해, MAB1군에서는 항체의 투여 후에 체중 감소의 회복이 관찰되었다. 항체 투여 후 7일간의 누적 섭이량도, MAB1군에서는 MKN45군과 비교해서 증대하는 경향이 확인되었다. MKN45 이식에 의해 증대하는 혈중 비결합 GDF15 농도는, HuMAB2(도 8)와 마찬가지로, MAB1에 의해 감소했다. 이들 결과로부터, MKN45 이식 마우스의 악액질양 증상(체중 감소, 섭이량)은 MAB1의 투여에 의해 회복하는 것을 확인할 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Anti-GDF15 Antibody <130> 675712 <150> PCT/JP2019/047956 <151> 2019-12-06 <160> 157 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu 65 70 75 80 Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly 85 90 95 Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu 100 105 110 Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln 130 135 140 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ser Gln Ser 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Claims

DHCPLGPGRCCRLH(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 hGDF15의 에피토프에 결합하는, 항hGDF15 항체.
제1항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 19의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 20의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 21의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 22의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 23의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CR1,
서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서,
서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 또는 제6항에 있어서, 서열번호 137의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 138의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 139의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 140의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 141의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 142의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, 또는 상기 CDR1의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR2, 또는 상기 CDR2의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR3, 또는 상기 CDR3의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 또는 제10항에 있어서, 서열번호 143의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 144의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 145의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 146의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 147의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 148의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 포함되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열 혹은 서열번호 8의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개의 아미노산 잔기가 개변된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 9의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열 혹은 서열번호 9의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20개의 아미노산 잔기 개변된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
hGDF15와의 결합에 대해서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 경합하는, 항hGDF15 항체.
제16항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항hGDF15 항체와 경합하는, 항체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제18항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제18항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 세포.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 포함하는, 의약 조성물.
제21항에 있어서, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상을 처치하기 위한, 의약 조성물.
제22항에 있어서, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상이 암인, 의약 조성물.
제22항에 있어서, GDF15에 관련하는 질환 또는 증상이 악액질인, 의약 조성물.
제24항에 있어서, 악액질이 암 악액질인, 의약 조성물.
제21항에 있어서, 혈중 GDF15 농도를 저하시키기 위한, 의약 조성물.