WO2021111636A1 - 抗ｇｄｆ１５抗体 - Google Patents

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WO2021111636A1
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seq
antibody
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茂樹 西原
優一 石川
雄一郎 中石
達矢 川戸
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大塚製薬株式会社
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Definitions

  • This disclosure relates to anti-GDF15 antibody and its uses.
  • Cachexia is a complex metabolic disease characterized by weight loss and muscle weakness associated with chronic diseases. Among them, cancer cachexia is found in many patients with advanced cancer, and it deteriorates the prognosis and QOL of patients, so aggressive treatment is required. However, the pathophysiology of cachexia is complicated, and there are many unclear points about the mechanism of occurrence, and there is currently no effective therapeutic agent.
  • GDF15 (GrowthDifferentiationFactor15) is a secretory protein of the TGF- ⁇ superfamily and has been reported to be involved in various diseases such as cancer and diabetes. There are many reports of clinical studies on blood GDF15 levels, for example, high GDF15 levels in blood and cancer tissues in cancer patients, and a correlation between blood GDF15 levels in cancer patients and prognosis. ing. It is also known that GDF15 acts on the feeding center of the brain to induce anorexia and is involved in the development of cachexia.
  • the present disclosure is intended to provide an anti-GDF15 antibody useful in the treatment of diseases or symptoms associated with GDF15.
  • an anti-hGDF15 antibody that binds to an epitope of hGDF15 comprising the amino acid sequence of DHCPLGPGRCCRLH (SEQ ID NO: 3).
  • Heavy chain variable region including, and CDR1 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or CDR1 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR1.
  • an anti-hGDF15 antibody containing a light chain variable region containing.
  • CDR1 which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence Heavy chain variable region including, and CDR1, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence Provided is an anti-hGDF15 antibody containing a light chain variable region containing.
  • An anti-hGDF15 antibody comprising a light chain variable region comprising a modified amino acid sequence of 5, or 1-3 amino acid residues is provided.
  • the present disclosure provides, in a further aspect, an anti-hGDF15 antibody that competes with any of the above antibodies for binding to hGDF15.
  • the present disclosure provides, in a further aspect, a polynucleotide encoding any of the antibodies, an expression vector containing the polynucleotide, or a transformed cell containing the polynucleotide.
  • the present disclosure provides, in a further aspect, a pharmaceutical composition comprising any of the above antibodies.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure recognizes an epitope different from the existing anti-hGDF15 antibody and is useful for treating diseases or symptoms related to GDF15.
  • FIG. 1 shows the results of a competitive test using four types of anti-hGDF15 monoclonal antibodies (HuMAB2, MAB17, Hu01G06-127, MAB957).
  • FIG. 2A shows the results of the three-dimensional structural analysis of the co-bonding of HuMAB2 Fab and hGDF15.
  • FIG. 2B shows the results of analysis of epitopes and paratopes by conformational analysis of the co-binding of HuMAB2 Fab and hGDF15.
  • FIG. 3 shows the results of three-dimensional structural analysis of the binding between Fab of HuMAB2 and hGDF15.
  • hGDF15 forms a homodimer, and among the amino acids to which HuMAB2 binds, the amino acid present in one of the hGDF15 monomers (Monomer1) is underlined and is present in the other monomer (Monomer2). Amino acids (71D72T) are double underlined. Amino acids that are important for binding are shown in bold, and amino acids that are particularly strongly bound are shown by arrows.
  • FIG. 4 shows the results of a binding test between a synthetic peptide of hGDF15 or DHCPLGPGRCCRLH (SEQ ID NO: 3) and HuMAB2.
  • FIG. 5A shows the binding of the HuMAB2 mutant to hGDF15 (H chain modified antibody 1/2).
  • FIG. 5B shows the binding of the HuMAB2 mutant to hGDF15 (H chain modified antibody 2/2).
  • FIG. 5C shows the binding of the HuMAB2 mutant to hGDF15 (L chain modified antibody 1/2).
  • FIG. 5D shows the binding of the HuMAB2 mutant to hGDF15 (L chain modified antibody 2/2).
  • FIG. 6 shows the capture of hGDF15 in blood by HuMAB2 and MAB17.
  • FIG. 7 shows the effect of the anti-hGDF15 antibody on the blood unbound hGDF15 concentration in a cancer-bearing mouse model.
  • FIG. 8 shows the effect of HuMAB2 on weight loss, cumulative food intake, and blood unbound hGDF15 concentration in a cancer-bearing mouse model.
  • FIG. 9 shows the effect of HuMAB2 on the activity (circadian rhythm) of the cancer-bearing mouse model.
  • amino acid residues are represented by the following abbreviations.
  • Ala or A Alanine Arg or R: Arginine Asn or N: Asparagine Asp or D: aspartic acid Cys or C: Cysteine Gln or Q: Glutamine Glu or E: Glutamic acid Gly or G: Glycine His or H: histidine Ile or I: isoleucine Leu or L: Leucine Lys or K: Lysine Met or M: Methionine Phe or F: Phenylalanine Pro or P: Proline Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Trp or W: Tryptophan Tyr or Y: tyrosine Val or V: Valine
  • amino acid residues in an amino acid sequence are indicated by a number indicating their position and an abbreviation indicating an amino residual residue (for example, the 13th arginine residue is referred to as "13R"). May occur.
  • GDF15 (GrowthDifferentiationFactor15) is a secreted protein of the TGF- ⁇ superfamily, also known as MIC-1, PLAB, PDF, and NAG-1.
  • the GDF15 gene expresses the precursor pro GDF15, and this pro GDF15 is cleaved by a membrane-type metalloendoprotease to produce mature GDF15.
  • GDF15 is soluble and is thought to form a dimer and be recognized by its receptor, GFRAL. Unless otherwise stated, the term GDF15 herein means mature GDF15.
  • GDF15 is used to include GDF15 of all species.
  • GDF15 is human GDF15 (hGDF15).
  • the representative amino acid sequence of pro hGDF15 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Pro hGDF15 is a 308 amino acid polypeptide consisting of a signal peptide consisting of 29 amino acids (underlined), a propeptide consisting of 167 amino acids, and a mature peptide consisting of 112 amino acids (double underlined, hGDF15).
  • the representative amino acid sequence of hGDF15 is shown in SEQ ID NO: 2, but hGDF15 in the present disclosure is not limited to those containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • antibody means a molecule containing an immunoglobulin or a part thereof, which has binding property to an antigen, and is not only a molecule in the form of a natural immunoglobulin, but also a chimeric antibody, a humanized antibody, and the like. It is used to include molecules of various structures such as multispecific antibodies and antibody fragments.
  • monoclonal as used herein is used to distinguish it from a "polyclonal antibody” which is a mixture of multiple types of antibodies against different epitopes and means that it is obtained from a population of a single type of antibody.
  • the term "monoclonal antibody” can mean, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, multispecific antibodies, and antibody fragments.
  • An antibody fragment means a molecule that contains a portion of an immunoglobulin as a component, eg, but not limited to, heavy and light chain variable regions (V H and VL ), F (ab') 2 , F (ab') 2, of the antibody. Examples include Fab', Fab, Fv, disulphide-linked FV (sdFv), Single-Chain FV (scFV) and their polymers.
  • the type of antibody is not particularly limited, and examples thereof include antibodies derived from mice, rats, rabbits, goats, and humans.
  • isolated means that one biological molecule (eg, an antibody or polynucleotide) is substantially separated from other components in the natural environment.
  • the immunoglobulin class of an antibody is determined based on the heavy chain constant region.
  • Immunoglobulin classes include IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and the corresponding heavy chains are called ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, respectively.
  • the immunoglobulin class can be further subclassed into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the immunoglobulin class and subclass of the antibody herein are not particularly limited.
  • the immunoglobulin class is IgG.
  • the light chain of an antibody can be divided into a ⁇ chain and a ⁇ chain based on its constant region, but the antibody herein may have either a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • variable region of an antibody is usually composed of three complementarity determining regions (also referred to as CDRs) sandwiched between four framework regions (also referred to as FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR and CDR generally exist in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 for both light and heavy chains.
  • Multiple methods for defining variable regions and CDRs of antibodies have been reported, for example, Kabat's definition (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991), Definition of Chothia (Chothia et al., J. Mol.
  • the anti-hGDF15 antibody means an antibody that binds to hGDF15 with sufficient affinity for exerting a desired effect.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure can be obtained by a general method using hGDF15 or a part thereof as an immunogen. Immunogens can be made by conventional peptide synthesis methods, for example by genetic engineering techniques or chemical synthesis. Alternatively, the antibody of the present disclosure can also be obtained by preparing an expression vector containing an antibody gene using a genetic engineering technique and expressing it in cells.
  • the polyclonal antibody can be produced by the general method described in "Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989” and the like. Specifically, it can be produced by immunizing mammals such as rats, mice, rabbits, goats, and horses with the above-mentioned immunogen.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by known methods such as a method for producing a hybridoma that produces an antibody, a method for producing an expression vector containing an antibody gene using a genetic engineering technique, and a method for expressing it in cells.
  • a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be prepared according to the method described in Kohler et al., Nature 256: 495, 1975.
  • the immunogen is mixed with a suitable substance for enhancing antigenicity (eg, keyhole limpet hemocyanin, bovine serum albumin, etc.) and, if necessary, an immunostimulator (such as Freund's complete or incomplete adjuvant). It immunizes non-human mammals such as rats, mice, rabbits, goats and horses.
  • immunized animals are immunized multiple times at intervals of 3 to 10 days, and 1 to 100 ⁇ g of the immunogen peptide is administered.
  • immunocompetent cells are recovered from immune animals that have undergone multiple immunizations, and myeloma cells incapable of producing autoantibodies (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, or rabbits)
  • myeloma cells incapable of producing autoantibodies eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, or rabbits
  • Cell-mediated fusion with cells derived from mammals such as humans For cell fusion, a polyethylene glycol method, an electric fusion method, or the like is used.
  • cells that have succeeded in cell fusion are selected based on the selection marker possessed by the fused cells, and the reactivity of the antibody produced by the selected cells to the immune source is confirmed by the above-mentioned immunoassay method or the like.
  • a hybridoma that produces a monoclonal antibody is obtained.
  • the monoclonal antibody can be isolated from the culture supernatant obtained by culturing the obtained hybridoma in vitro. It can also be cultured in vivo in ascites such as mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits and isolated from ascites.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained by preparing an expression vector containing an antibody gene and expressing it in a host cell (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; JW Goding., Monoclonal Antibodies: principals and practices., 1993 ACADEMIC PRESS). Furthermore, using a transgenic animal production technique, a transgenic animal (for example, cow, goat, sheep or pig) in which the gene of the antibody of interest is integrated into an endogenous gene is produced, and the transgenic animal is contained in milk. Monoclonal antibodies derived from the antibody gene can also be obtained from.
  • the obtained monoclonal antibody is purified by appropriately combining methods well known in the art, for example, chromatography using a protein A column, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, salting-out method, gel filtration, affinity chromatography and the like. can do.
  • a chimeric antibody is an antibody containing different sequences derived from each other, for example, an antibody in which different variable regions derived from each other and a constant region are linked.
  • the chimeric antibody is composed of a variable region of an antibody derived from a non-human mammal and a constant region derived from a human antibody.
  • a polynucleotide encoding a variable region of an antibody derived from a non-human mammal and a polynucleotide encoding a constant region of a human antibody are ligated, incorporated into an expression vector, and this expression vector is used as a host. It can be obtained by introducing and expressing it.
  • CDR is a region that substantially determines the binding specificity of an antibody, and its amino acid sequence is rich in diversity.
  • the amino acid sequences constituting FR show high homology even among antibodies having different binding specificities. Therefore, CDR transplantation allows the binding specificity of one antibody to be transplanted into another antibody.
  • Humanized antibodies are generally composed of CDRs of antibodies derived from non-human animals, FR derived from human antibodies, and constant regions derived from human antibodies. Humanized antibodies can be obtained by transplanting CDRs of antibodies derived from non-human animals into human antibodies. Humanized antibodies can be prepared by various methods, and one example is Overlap Extension PCR (Almagro and Francsson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). In this method, PCR is performed using an oligonucleotide having a portion that overlaps the end of the CDR of an antibody derived from a non-human animal (for example, a mouse antibody) and the FR of a human antibody as a primer, and is derived from a non-human animal.
  • a non-human animal for example, a mouse antibody
  • a polynucleotide in which the CDR of an antibody and the FR of a human antibody are linked is synthesized.
  • the obtained polynucleotide can be ligated with a polynucleotide encoding a constant region of a human antibody, incorporated into an expression vector, and the expression vector can be introduced into a host for expression to obtain a humanized antibody. it can.
  • the FR sequence can be, for example, a database (eg, VBase, https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/) or a reference (eg, Kabat) that discloses germline antibody gene sequences. al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991); Tomlinson, I. M. et. It can be decided based on 776-798; Cox, J. P. L. et al. (1994) Eur. J Immunol. 24: 827-836). FR may contain mutations in one or more amino acids compared to germline sequences.
  • FR selected by the best fit method (Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)) and the light chain or heavy chain variable region of a human antibody.
  • Use FR Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Presta et al. J. Immunol. 151: 2623 (1993)) derived from the consensus sequence of a specific subgroup. Can be done.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by sensitizing human lymphocytes in vitro with a desired antigen and then fusing the sensitized lymphocytes with human myeloma cells (Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • human myeloma cells which are fusion partners, for example, U266 can be used.
  • Human antibodies can also be obtained by immunizing transgenic animals with the entire repertoire of human antibody genes with the desired antigen (Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125, 2005).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known (Antibody Phase Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 178, 2001).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by a phage display method, a phage that binds to the antigen is selected, and the gene of the selected phage is analyzed to obtain an antigen.
  • the DNA sequence encoding the variable region of the binding human antibody can be determined.
  • the human antibody can be obtained by linking this variable region sequence with the sequence of the human antibody constant region in frame, inserting it into an appropriate expression vector, and introducing this expression vector into a host for expression. it can.
  • a multispecific antibody is an antibody that binds to at least two different sites.
  • the multispecific antibody include a bispecific antibody and a trispecific antibody.
  • the multispecific antibody binds hGDF15 to one or more other antigens.
  • Multispecific antibodies can be produced, for example, by genetic engineering techniques or by binding two or more antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody fragment can be obtained by digesting the antibody with a protease such as papain or pepsin.
  • a protease such as papain or pepsin.
  • it can be obtained by introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding an antibody fragment into a host cell and expressing it (for example, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968. -2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi , E., Methods Enzymol.
  • an antibody can be obtained by introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding the same into a cell and expressing it.
  • an expression vector is constructed so that the sequence encoding the antibody is expressed under an expression control region such as an enhancer or a promoter, and the host cell is transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the present disclosure also provides transformed cells containing a polynucleotide encoding an anti-hGDF15 antibody, an expression vector containing the polynucleotide, and a polynucleotide capable of expressing the antibody.
  • eukaryotic cells such as animal cells, plant cells, and fungal cells
  • Animal cells include mammalian cells (eg, CHO, COS, NIH3T3, myeloma, BHK (baby hamsterkidney), HeLa, Vero), amphibian cells (eg, Xenopus laevis), or insect cells (eg, Sf9, Sf21). , Tn5).
  • fungal cells include yeast (for example, Saccharomyces genus, for example, Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi (for example, Aspergillus genus, for example, Aspergillus niger) and the like. Be done.
  • prokaryotic cells such as E. coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, etc.) and Bacillus subtilis can also be used as host cells.
  • the vector can be introduced into the host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electroporation method, or a lipofection method.
  • Binding of the obtained antibody to the antigen can be performed by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) (including ELISA), radioimmunoassay (RIA), chemoluminescence immunoassay (CIA), fluorescence immunoassay (FIA), etc. It can be confirmed by immunoassay or BIACORE® surface plasmon resonance assay. Binding of the antibody to the antigen can also be confirmed by a competitive assay. For example, it can be confirmed by examining whether or not the obtained antibody competes with the anti-hGDF15 antibody that has been confirmed to bind to hGDF15.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • CIA chemoluminescence immunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • an antibody that competes with a given anti-hGDF15 antibody means an antibody that significantly reduces the binding of the reference antibody to hGDF15 when measured under the conditions described in the Examples. ..
  • the antibodies of the present disclosure reduce the binding of the reference antibody to hGDF15 by 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% or more. Let me.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure binds to an epitope of hGDF15 comprising the amino acid sequence of DHCPLGPGRCCRLH (SEQ ID NO: 3).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 corresponds to the 5th to 18th amino acid residues of SEQ ID NO: 2.
  • Whether or not to bind to an epitope containing the amino acid sequence of DHCPLGPGRCCRLH (SEQ ID NO: 3) depends on the binding to hGDF15, the heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. It can be confirmed by examining whether or not it competes with the antibody containing the region.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure competes with a given anti-hGDF15 antibody for binding to hGDF15.
  • the antibodies of the present disclosure compete for binding to hGDF15 with an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure is: CDR1 contained in the heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or CDR1 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR1.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or CDR1 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR1.
  • the CDR may be specified by any method.
  • One of ordinary skill in the art can identify the CDR by a suitable method in consideration of various conditions.
  • the CDR is specified by any definition selected from Kabat, Chothia, AbM, Contact, and IMGT.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure is: CDR1, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence Includes a light chain variable region containing.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure is: CDR1, comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, and 38-44, CDR2 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19, 45-48, and 52-66, and CDR3 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 20, 49, 50 and 67-80.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 81-89, and 100-104, CDR2 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 22, 90, and 106-115, and CDR3 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 23, 91-99, and 118-132. Includes a light chain variable region containing.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure is: (I) CDR1, comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, and 38-44.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing;
  • CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 19, 45-48, and 52-66, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDR3 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 20, 49, 50 and 67-80.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (Iv) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (V) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 22, 90, and 106-115, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure is: An amino acid sequence having 80%, 85%, 90%, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or 1 to 20 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a heavy chain variable region containing an amino acid sequence in which 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 amino acid residues are modified, and 80%, 85% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. , 90%, or 95% or more of the sequence identity, or 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. Includes a light chain variable region containing a modified amino acid sequence of 5, or 1-3 amino acid residues.
  • the anti-hGDF15 antibody of the present disclosure comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • amino acid modifications include amino acid deletions, substitutions, insertions, and additions.
  • the number of modifications is not limited, but is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3.
  • the amino acid modification is an amino acid substitution.
  • the amino acid modification is a modification of 1 to 3 amino acids.
  • the amino acid modification is a single amino acid substitution.
  • an amino acid sequence that "contains" a predetermined amino acid sequence includes an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are added to the predetermined amino acid sequence, and a sequence consisting of the predetermined amino acids. ..
  • the heavy chain variable region or light chain variable region containing the modified amino acid sequence includes an antibody in which the CDR in the amino acid sequence of the predetermined heavy chain variable region or light chain variable region has not been modified.
  • sequence identity refers to an amino acid residue that matches between two sequences that are optimally (maximally matched) aligned over the entire region of the sequence to be compared. Means the proportion of.
  • sequence to be compared may have additions or deletions (eg, gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Sequence identity can be calculated using programs such as FASTA, BLAST, and CLUSTAL W provided in a public database (for example, DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp)). Alternatively, it can be obtained using commercially available sequence analysis software (for example, Vector NTI (registered trademark) software, GENETYX (registered trademark) ver. 12).
  • mutants with improved binding affinity can be obtained by methods based on phage display.
  • amino acid residues that affect the interaction between the antibody and the antigen are identified by the alanine scanning mutagenesis method, or the crystal structure of the antigen-antibody complex is analyzed and the contact point between the antibody and the antigen is analyzed.
  • site of mutation introduction such as by identifying.
  • a mutant having a desired characteristic can be obtained by preparing a mutant in which the amino acid at this site is modified by error-prone PCR, site-specific mutation introduction, or the like, and screening the library of the obtained mutant. ..
  • the antibody of the present disclosure has an effect of lowering the blood GDF15 concentration. Whether or not it has such an effect is determined by evaluating whether or not the blood GDF15 concentration is significantly reduced in animals transplanted with GDF15-expressing cancer cells as compared with a control antibody, as described in Examples. , Can be confirmed. Without being bound by any theory, the antibodies of the present disclosure are believed to reduce blood GDF15 levels by suppressing cleavage of pro GDF15. The antibodies of the present disclosure may also bind to mature GDF15 and inhibit signal transduction from GDF15.
  • the antibody of the present disclosure can exert an effect of improving symptoms such as weight loss, loss of appetite, and circadian rhythm disorder by lowering the blood GDF15 concentration (in some cases, further inhibiting signal transduction of GDF15).
  • a subclass of immunoglobulin may be selected for the regulation of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) activity or pharmacokinetics, and the amino acid sequence or sugar in the Fc region may be selected.
  • the chain may be modified.
  • IgG4 may be selected for the purpose of reducing complement activation capacity.
  • modifications that reduce or enhance the binding to the Fc receptor or C1q, modifications that increase the binding affinity to FcRn to prolong the half-life in blood, and the like can be made.
  • Antibodies also bind to polymers such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylene or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, for example to prolong the blood half-life of the antibody or improve stability. You may be doing it.
  • PEG polyethylene glycol
  • polypropylene glycol polypropylene glycol
  • polyoxyalkylene polyoxyalkylene
  • copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol for example to prolong the blood half-life of the antibody or improve stability. You may be doing it.
  • the antibody may also be bound to chemotherapeutic agents, toxic peptides, radioisotopes and the like.
  • Chemotherapeutic agents include alkylating agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechloretamine, cyclophosphamide, chlorambusyl, and iphosphamide; metabolic antagonists such as azathiopurine and mercaptoposide; vincaalkaloids (eg, vincristine, vinblastine, vinorelbine).
  • alkaloids such as taxan (eg, paclitaxel, docetaxel), etoposide and teniposide; topoisomerase inhibitors such as camptothecin (eg, irinotecan and topotecan); Examples include cytotoxic antibiotics such as breomycin, plicamycin and mitomycin.
  • the antibody of the present disclosure can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • the antibody of the present disclosure has an action of lowering the blood GDF15 concentration (in some cases, further an action of inhibiting signal transduction of GDF15), and is useful for treating a disease or symptom related to GDF15.
  • Diseases or symptoms associated with GDF15 include weight loss, loss of appetite, muscle weakness, decreased activity, sarcopenia, sarcopenia, dysregulation, cachexia, cancer, diabetes, and kidney.
  • Insufficiency heart failure, AIDS, COPD, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, sepsis, tuberculosis, sarcopenia, cancer bone metastasis, anticancer drug-induced nausea and vomiting, pregnancy weakness, chronic myeloid proliferative disorders (eg, bone marrow fibers) Disease, sarcopenia, essential plateletemia), neurological cachexia, bipolar disorder, mitochondrial disease, ICU-related muscle weakness, etc.
  • the cachexia is associated with cancer, diabetes, renal failure, heart failure, AIDS, COPD, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, sepsis, or tuberculosis.
  • the cachexia is cancer cachexia.
  • Cachexia treatment includes amelioration of one or more symptoms selected from weight loss, loss of appetite, muscle loss, decreased activity, circadian rhythm disorders, pituitary hormone secretion disorders, and thermoregulatory dysregulation. Is done.
  • Cancers are not limited, but gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, lung cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, cervical cancer, uterine body cancer, Testis cancer, prostate cancer, bladder cancer, thyroid cancer, kidney cancer, hepatocellular carcinoma, intrahepatic bile duct cancer, head and neck cancer, leukemia, multiple myeloma, lymphoma, brain tumor, glioma , Black tumor and the like.
  • the antibody of the present disclosure is administered to a subject in an amount (referred to herein as an effective amount) capable of exerting a desired effect (for example, treatment of a disease or symptom related to GDF15).
  • the dose of the antibody is appropriately selected depending on the administration method, the age, body weight, health condition, etc. of the administration target. For example, 10 ⁇ g / kg to 100 mg / kg, 100 ⁇ g / kg to 10 mg / kg, or 1 mg / kg to 10 mg / kg per day for adults, every day, or for days, weeks, weeks. It can be administered once every one or several months, but is not limited to this.
  • the method of administering the antibody is also appropriately selected depending on the age, body weight, health condition and the like of the administration subject.
  • the administration method may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration is preferable. Parenteral administration includes subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, and the like, but intravenous administration is preferable.
  • the "subject” is a mammal. Mammals include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, horses, cows, monkeys, and humans. In certain embodiments, the subject is a human.
  • the pharmaceutical composition can be formulated by a conventional method.
  • pharmaceutical compositions are pharmaceutically acceptable, such as sterile water, saline, stabilizers, excipients, antioxidants, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents, binders, etc. Carriers or additives can be included.
  • the antibody of the present disclosure may be used in combination with other therapeutic agents.
  • all or some of the active ingredients may be contained in the same composition, and all the agents are contained in different compositions. May be good.
  • the administration schedules of the two or more active ingredients may be the same or different.
  • the antibodies of the present disclosure are used in combination with a cancer therapeutic agent.
  • Cancer treatments include, but are not limited to, alkylating agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechloretamine, cyclophosphamide, chlorambusyl, and iphosphamide; metabolic antagonists such as azathiopurine and mercaptoposide; vincristine alkaloids (eg, vinca alkaloids).
  • Vincristine, vincristine, binorelbin, and bindesin taxanes (eg, paclitaxel, docetaxel), etoposide and alkaloids such as teniposide; topoisomerase inhibitors such as camptothecin (eg, irinotecan and topotecan); Cytotoxic antibiotics such as barrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomycin, plicamycin and mitomycin; molecular targeting agents such as EGFR inhibitors, HER2 inhibitors, ALK inhibitors, VEGFR inhibitors; anti-PD-1 antibodies, anti-PDL- 1 Examples include immune checkpoint inhibitors such as antibodies.
  • taxanes eg, paclitaxel, docetaxel
  • etoposide and alkaloids such as teniposide
  • topoisomerase inhibitors such as camptothecin (eg, irinotecan and topotecan)
  • Cytotoxic antibiotics such as
  • An anti-hGDF15 antibody that binds to an epitope of hGDF15 comprising the amino acid sequence of DHCPLGPGRCCRLH (SEQ ID NO: 3).
  • CDR2 contained in the heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 CDR3 contained in the heavy chain variable region containing, or CDR3 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR3.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or CDR1 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR1.
  • CDR2 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 CDR3 contained in the light chain variable region containing, or CDR3 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR3.
  • the antibody according to 1 above which comprises a light chain variable region comprising.
  • CDR1 which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence Heavy chain variable region including, and CDR1, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence
  • the antibody according to 1 or 2 above which comprises a light chain variable region comprising.
  • CDR2 contained in the heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 CDR3 contained in the heavy chain variable region containing, or CDR3 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR3.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or CDR1 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR1.
  • CDR2 contained in the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 CDR3 contained in the light chain variable region containing, or CDR3 consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence of CDR3.
  • Anti-hGDF15 antibody including a light chain variable region containing.
  • CDR1 which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • CDR3 containing the modified amino acid sequence Heavy chain variable region including, and CDR1, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are modified in the amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence.
  • the antibody according to any one of 1 to 9 above which comprises a light chain variable region containing CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • CDR1 comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 18 and 38-44, CDR2 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19, 45-48, and 52-66, and CDR3 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 20, 49, 50 and 67-80.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 81-89, and 100-104, CDR2 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 22, 90, and 106-115, and CDR3 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 23, 91-99, and 118-132.
  • CDR1 comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 18 and 38-42, CDR2 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19, 46-48, and 52-66, and CDR3 containing any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 20, 71, 73, 77, and 79.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 81-83, 85-89, and 100-104, CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 22, 90, 106, 108-111, and 113-115, and SEQ ID NOs: 23, 93, 95-99, 121, 122, 124, 125, 131, And CDR3 containing any of the amino acid sequences selected from 132
  • the antibody according to any one of 1 to 11 above, which comprises a light chain variable region comprising.
  • CDR1 comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 18 and 38-44, CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (Ii) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 19, 45-48, and 52-66, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDR3 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 20, 49, 50 and 67-80.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (Iv) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (V) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 22, 90, and 106-115, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • CDR1 comprising any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 18 and 38-42, CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (Ii) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 19, 46-48, and 52-66, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDR3 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 20, 71, 73, 77, and 79.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (Iv) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 Contains the light chain variable region containing; (V) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 CDR2 containing any of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 22, 90, 106, 108-111, and 113-115, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. Containing a light chain variable region comprising; or (vi) CDR1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Heavy chain variable region including, and CDR1, which comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • the antibody according to any one of 1 to 16 above which comprises a light chain variable region containing a modified amino acid sequence of 5, or 1 to 3 amino acid residues.
  • An anti-hGDF15 antibody comprising a light chain variable region comprising a modified amino acid sequence of 5, or 1-3 amino acid residues.
  • An anti-hGDF15 antibody that competes with the antibody according to any one of 1 to 21 above for binding to hGDF15.
  • the antibody according to 22 or 23 above which lowers the blood GDF15 concentration.
  • the antibody according to any one of 22 to 25 above which is a monoclonal antibody.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of 1 to 26 above. [32] 31. The pharmaceutical composition according to 31 above, for treating a disease or symptom associated with GDF15. [33] 32. The pharmaceutical composition according to 32 above, wherein the disease or symptom associated with GDF15 is cancer. [34] 32. The pharmaceutical composition according to 32 above, wherein the disease or symptom associated with GDF15 is cachexia. [35] The pharmaceutical composition according to 34 above, wherein the cachexia is cancer cachexia.
  • the antibody according to any one of 1 to 26 above for use in treating a disease or symptomatology associated with GDF15.
  • a method for treating a disease or symptom associated with GDF15 which comprises administering an effective amount of the antibody according to any one of 1 to 26 above to a subject in need of treatment.
  • I. Antibody production A. Preparation of anti-hGDF15 antibody 1 Animal immunity schedule Day1; Initial immunization (25 ⁇ g / shot / body, Abisco-100, ip) Day10; Second immunity (25 ⁇ g / shot / body, Abisco-100, ip) Day17; 3rd immunity (25 ⁇ g / shot / body, Abisco-100, ip) Day21 ; Titer check Day24; Final boost (25 ⁇ g / shot / body, Abisco-100, ip) Day27; Splenectomy, cell fusion Reagents ⁇ Recombinant Human GDF15 (rhGDF15), R & D, 957-GD-025 / CF, 25 ⁇ g ⁇ Abisco-100 (ISCONOVA) Animals ⁇ 3H / HeJ Jms Slc-lpr / lpr (5W, Japan SLC, female)
  • hGDF15 50 ⁇ L of hGDF15 (0.5 mg / mL), 25 ⁇ L of Abisco-100, and 175 ⁇ L of PBS were mixed and administered intraperitoneally to mice (primary immunization). 2. 10 and 17 days after the initial immunization, the hGDF15 solution prepared in the same manner as the initial immunization was intraperitoneally administered. 3. Twenty-one days after the initial immunization, blood was collected from the tail of the mouse using a capillary blood collection tube, and plasma was obtained by centrifugation. 4.
  • Plasma was diluted 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold, and ELISA was performed using a 96-well plate on which hGDF15 was immobilized, and it was confirmed that the antibody titer to hGDF15 was increased. 5. Twenty-four days after the initial immunization, the hGDF15 solution prepared in the same manner as the initial immunization was intraperitoneally administered. 6. Twenty-seven days after the initial immunization, the spleen was removed under anesthesia and cell fusion was performed.
  • Sp2 / o-14Ag (hereinafter Sp2 / o cells, ATCC # CRL-1581) Subculture not to exceed 3 ⁇ 10 5 cells / mL Reagents / DMEM (GIBCO, 10313-021) ⁇ FBS (56 °C, deactivated for 30 minutes) ⁇ Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Invitrogen, 10378-016) ⁇ Prepared to 10 mg / mL of insulin (Funakoshi, BT-243) ⁇ 55 mM 2-Mercaptoethanol (1000x) (Invitrogen, 21985-023) ⁇ RIL-6 ⁇ PBS ⁇ Turk's solution ⁇ Trypan blue ⁇ Red blood cell lysing buffer (SIGMA, R7757) ⁇ PEG1500 (Roche, 108014) ⁇ HAT Media Supplement (50 ⁇ ) Hybri-Max (SIGMA, H0262) ⁇ HT Media Supplement (50 ⁇ )
  • Procedure ⁇ Preparation of myeloma (1 week before cell fusion) 1. Thaw cryopreserved Sp2 / o cells (approximately 1 ⁇ 10 6 cells / vial), suspend in 10 mL of Sp2 / o medium previously dispensed into a 15 mL falcon tube, and at 1500 rpm. The cells were centrifuged for 3 minutes and washed, and the supernatant was removed. 2. Pellets (Sp2 / o cells) were suspended in 4 ml of Sp2 / o medium. 3. 4 mL of Sp2 / o medium was placed in each well of the 6-well plate, and the Sp2 / o cells suspended in 2. were diluted in 2-fold series. 4.
  • mice were anesthetized, thoroughly sprayed with 70% ethanol, and then laparotomized in a safety cabinet. In order to aseptically remove the spleen, sterilized tweezers and scissors were prepared for the exodermis and for the abdominal cavity. 2. After total blood sampling from the abdominal aorta under anesthesia, the spleen was removed. 3. The spleen was placed in a 50 mL falcon tube pre-filled with PBS and placed on ice until cell fusion.
  • DMEM serum-free
  • PEG preheated in a 37 ° C. incubator and the following was performed.
  • Sp2 / o cells were collected and the number of cells was counted. Only cells in flasks of 1 ⁇ 10 6 cells / mL or less were used.
  • About 10 mL of PBS was prepared in 1 well of a 6-well falcon plate, and the excised spleen was placed therein to remove the remaining adipose tissue.
  • a fresh 10 mL of PBS was placed in one of the remaining wells and the spleen was transferred. The spleen was cut in half with sterile tweezers and scissors.
  • the cell fusion medium was added so that the total volume was 40 mL. 21. Centrifuge at 1500 rpm for 3 minutes to remove supernatant. 22. The hybridoma was suspended in a hybridoma medium so that the number of splenocytes was 1 ⁇ 10 6 cells per mL, and the hybridoma was sprinkled on a 96-well flat bottom plate at 100 ⁇ L per well. 23. O / n culture at 37 ° C under CO 2 5.5% 24.2 ⁇ HAT selective medium was added at 100 ⁇ L / well, and the cells were continuously cultured. 25. The medium was exchanged by removing 100 ⁇ L of the supernatant every other day and adding 100 ⁇ L of 1 ⁇ HAT selective medium.
  • Hybridomas in wells with an absorbance of 1.0 or more at 450 nm were further cloned by the limiting dilution method. Finally, 16 clones were obtained. Of the 16 clones obtained, 13 clones were cultured, excluding one clone that was IgM and two clones that showed non-specific binding to multiple proteins.
  • Antibodies were purified from the culture supernatant using HiTrap r Protein A FF (GE Healthcare Life Sciences, 17508001). The concentration of the purified antibody was measured using NanoDrop (Thermo Scientific) with an absorbance of 280 nm.
  • the binding affinity of each purified antibody with hGDF15 was measured by ELISA as follows. HGDF15 at a concentration of 200 ng / mL was added to the wells at 100 ⁇ L / well. A 96-well plate on which hGDF15 was immobilized was reacted with a purified antibody serially diluted at 0.39 ng / mL to 25 ng / mL at 100 ⁇ L / well, and then the hGDF15-anti-hGDF15 antibody complex was subjected to HRP conjugate secondary. Detected with antibody.
  • the absorbance at 450 nm was measured, and the value of the antibody amount at a concentration of 5 ng / mL was calculated using a 4-parameter logistics curve.
  • the value of clone MAB17 was set to 100, and the relative value was calculated.
  • variable region containing the CDR sequences of MAB2, which is an antibody derived from mice, and the constant region of bevacizumab were connected to form a chimeric antibody sequence.
  • the heavy and light chain genes were totally synthesized and incorporated into expression vectors.
  • ExpiCHO cells are seeded in a 24-well plate, and the next day, the heavy chain and light chain expression vectors are co-transfected with a TransIT-CHO kit (Takara, V2170) to co-express the heavy chain and light chain. It was. After 5 days, all culture supernatants containing the antibodies produced were collected and the antibodies were purified using a Hitrap rProteinA FF column (GE healthcare, 17-5080-01).
  • the antibody concentration in the supernatant was measured with a Human IgG EIA kit (Takara, MK136) according to the attached protocol.
  • the concentration of the purified antibody was determined by measuring the absorbance at 280 nm with NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).
  • BLITZ BacteBio
  • Anti-HIS Pieris ForteBio, 18-5114
  • ForteBio Sample Diluent Pall ForteBio, 18-1048
  • the measurement program was set to adsorb hGDF15 to the sensor chip in 60 seconds, antibody binding in 120 seconds, and dissociation in 120 seconds.
  • Table 5 shows the antibodies used to compare the reactivity with the anti-hGDF15 antibody HuMAB2.
  • HuMAB2 and the anti-GDF15 monoclonal antibody (2 ⁇ g / mL) shown in Table 5 were added to a 96-well plate at 100 ⁇ L / well and serially diluted from a concentration of 1 ng / ml to each immobilized plate.
  • the hGDF15 R & D Systems, 957-GD-025 / CF
  • HuMAB2 biotinylated using the EZ-Link Micro NHS-PEG4-Bitinylation Kit was used as the detection antibody (1 ⁇ g / mL as 100 ⁇ L / well).
  • sandwich ELISA was detected using the Streptavidin-HRP conjugate attached to the Human GDF15 ELISA Kit (R & D Systems, DY957).
  • a positive control antibody (PC) for sandwich ELISA a detection antibody (Table 5) attached to the Human GDF15 ELISA Kit (R & D Systems, DY957) capable of sandwiching with any monoclonal antibody was used.
  • HuMAB2 does not compete with existing antibodies. Therefore, whether or not the other antibody obtained this time competes with HuMAB2 was tested by the same method as described above. The results were calculated in% inhibition and are shown in Table 6. Of the 8 clones tested, 4 clones (MAB1, MAB11, MAB12 and MAB13) were found to inhibit the binding of HuMAB2 to hGDF15 by more than 70%.
  • HuMAB2 Fab including a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9) (20 ml) Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7.2) was mixed at a molar ratio of 1: 1 to a concentration of 5 mg / mL to prepare a protein solution of the complex.
  • HuMAB2 crystallization was performed by the Sitting drop vapor diffusion method. The mixing ratio of the protein solution and the reservoir solution was 1: 1.
  • the crystal structure of the complex was determined with a resolution of 2.8 ⁇ .
  • the phase was determined by the molecular substitution method.
  • hGDF15 forms a homodimer, and that two molecules of HuMAB2 Fab are bound to the hGDF15 dimer (Fig. 2A).
  • Amino acids lined up at the binding interface between HuMAB2 and hGDF15 were identified as paratopes and epitopes, respectively (Fig. 2B).
  • Table 7 underlines the identified epitopes of hGDF15 and the amino acids on HuMAB2 that are important for binding.
  • FIG 3 shows the epitope of hGDF15 analyzed using MOE (Molecular Operating Environment).
  • HuMAB2 becomes 14 amino acids from the 5th aspartic acid on the N-terminal side to the 18th histidine on one of the hGDF15 monomers (Monomer1), the 45th isoleucine (45I) and the 46th glycine (46G). , It was revealed that it binds to aspartic acid (71D) at position 71 and threonine (72T) at position 72 on another monomer (Monomer2).
  • Test method Test outline The mutant hGDF15 expression construct was transfected into ExpiCHO-S cells, cultured, and the culture supernatant was collected. After confirming the expression of each mutant hGDF15 in the collected culture supernatant with a commercially available ELISA kit for measuring GDF15, the reactivity of HuMAB2 to each mutant hGDF15 was evaluated by the ELISA method. For the identification of amino acid residues that are particularly important among the epitopes, the reactivity of HuMAB2 with the mutant-introduced GDF15 was evaluated by two methods, ELISA and an intermolecular interaction analysis system.
  • Verification of differentiation by epitope difference between HuMAB2 and other anti-hGDF15 antibodies was performed by comparing the reactivity of other anti-hGDF15 antibodies with mutant hGDF15 and the reactivity of HuMAB2 by the sandwich ELISA method.
  • mutant hGDF15 ExpiCHO-S included in the kit using the pcDNA-3.1 vector (Thermo Fisher Scientific) into which each mutant hGDF15 gene has been introduced, using the ExpiCHO TM Expression System Kit (Thermo Fisher Scientific, A29133).
  • Transfected into cells The culture supernatant 10 days after transfection was centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was collected. The collected culture supernatant was stored frozen (set temperature -20 ° C).
  • Mutant hGDF15 in the collected culture supernatant was measured using the Human GDF15 ELISA Kit (R & D Systems, DY957) according to the package insert of the kit, and the expression was confirmed and the concentration was measured.
  • Table 11 shows the binding of four anti-hGDF15 antibodies to hGDF15 and the mutant hGDF15.
  • HuMAB2 did not bind to mutant hGDF15 or bound weaker than wild-type hGDF15, but binding of other anti-hGDF15 antibodies to hGDF15 was unaffected by the mutation. From this, it was found that among the epitopes of hGDF15 of HuMAB2, 5DHCPLGPGRCCRLH18 (SEQ ID NO: 3) on the N-terminal side is important for binding, and 13R and 16R are particularly important for binding of HuMAB2. The results also support that MAB17, Hu01G06-127, and MAB957 have different epitopes from HuMAB2.
  • HuMAB2 antibody (10 ⁇ g / mL) was added at 100 ⁇ L / well to a solid-phase 96-well plate to which a 10 ⁇ g / mL peptide solution was added at 100 ⁇ L / well and reacted (25 ° C for 3 hours). ..
  • the bound HuMAB2 antibody was detected by adding 5000-fold diluted anti-human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch, 109-035-008) at 100 ⁇ L / well and reacting at 25 ° C. for 1 hour.
  • As a plate control a plate on which hGDF15 (R & D Systems, 957-GD-025 / CF) was solid-phased was used.
  • a detection antibody (Table 9) of Human GDF15 ELISA Kit (R & D Systems, DY957) was used as a positive control antibody that reacts with peptides, and Human IgG1 Isotype control (Abcam, ab206198) was used as a negative control antibody.
  • Test method Expression vector design Based on the information obtained from the crystal structure analysis of HuMAB2 and hGDF15, amino acids lined up at the binding interface between antibody and antigen were used as paratopes and epitopes, and amino acid mutations were inserted into the heavy or light chain of HuMAB2. Designed the vector. Table 13 shows a list of mutant antibodies (modified amino acids are underlined). Both the heavy chain and the light chain are arranged in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 from the N-terminal.
  • an HRP composite anti-human IgG antibody (Gene Tex, GTX26759) (diluted 20000 times) was added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour.
  • TMB Sigma, T-0440
  • sulfuric acid specified in 2 was used as the reaction stop solution. The absorbance was measured at 450 nm.
  • OCTET QKe Protein L (Pall ForteBio, 18-5085) is used for the sensor chip, 10 mM Glycine (pH1.1) is used for the regenerated solution of the sensor chip, and ForteBio Sample Diluent (Pall ForteBio, 18-1048) is used for the cleaning solution. did.
  • IgG from human serum regent grade (Sigma-Aldrich, I12511-10MG) is used at 50 mg / mL, 10 mg / mL, 1 mg / mL, and 0.1 mg / mL, and the culture supernatant to be measured is It was used after being diluted 2-fold with Sample Diluent (Pall ForteBio, 18-1104). In the measurement program, the sensor chip was regenerated for 5 seconds and washed for 5 seconds for 3 cycles, and then the antibody concentration measurement was set at 120 seconds.
  • the heavy chain mutant antibodies H48S-L7, H83R-L7, and H120F-L7, and the light chain mutant antibodies H3-L48K and H3-L112D had an approximately 1.5-fold increase in binding force compared to HuMAB2.
  • the amount of binding of the 111th glycine (111G) mutant and the 114th leucine (114L) mutant of the light chain of HuMAB2 was decreased, these amino acids bind to hGDF15. It was suggested that it is an important site for maintaining the structure of the CDR sequence of HuMAB2.
  • Test schedule Table 14 shows the test schedule with the antibody administration date as 0 day.
  • mice were divided into individual cages 3 days after the date of delivery. In order to acclimatize to individual breeding, the acclimatization period until grouping was set to 5 days.
  • anti-hGDF15 antibody rhGDF15, HuMAB2 antibody, and MAB17 antibody were intraperitoneally administered at 10 mL / kg.
  • the control group received Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) at 10 mL / kg.
  • DPBS Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline
  • Body weight and food intake were measured on the day of grouping and 0 days, 1, 2, and 3 days after administration.
  • hGDF15 Blood unbound hGDF15 concentration
  • the antigen-antibody complex was removed by the following procedure. 5 ⁇ L Protein A / G agarose beads (Thermo scientific, 20421) was mixed with 50 ⁇ L mouse plasma and 145 ⁇ L PBS and mixed at 4 ° C. for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new Eppen tube and stored in a freezer at -80 ° C until use. Subsequent blood GDF15 measurement used the GDF15 measurement ELISA kit (R & D systems, DY957), and the procedure was in accordance with the kit instructions. For samples below the detection limit, the blood GDF15 concentration was set to 0 pg / mL.
  • test substance Preparation of test substance and control substance All antibodies were prepared at 1 mg / mL with DPBS and stored in a freezer at -80 ° C until the day of administration.
  • Test cell 1 Cell line name: MKN45 2) Origin: Human gastric cancer 3) Obtained from: JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) cell bank 4) Culture conditions: 37 ° C, 5% CO 2 Culture medium: RPMI1640 i) Where to get: life technologies b) Serum: Fetal bovine serum i) Concentration: 10% ii) Where to get: Tissue Culture Biology animal 5) Species / strain: mouse / BALB-c Slc-nu / nu 6) Microbiological grade: specific pathogen-free (SPF) 7) Where to get: Japan SLC 8) Gender: Female 9) Week age: 7 weeks old (at the time of cell transplantation) 10) Animals were bred under the environment described in "A. Capture of hGDF15 in blood" above.
  • MKN45 cells are cultured in a 150 mm petri dish, and on the day of transplantation, the cells are collected by treatment with 0.25% trypsin-EDTA (SIGMA, T6689) and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). The supernatant was removed.
  • the mice were suspended in DPBS to 5 ⁇ 10 6 cells / mL and transplanted subcutaneously into the abdomen of mice anesthetized with isoflurane inhalation at 0.2 mL / body (1 ⁇ 10 6 cells / body).
  • mice were randomly selected from 42 mice before transplantation of MKN45, and the remaining 37 mice were transplanted with MKN45. Twelve days after MKN45 transplantation, 5 animals in each group were divided into 6 groups by SAS software (SAS institute Japan, R9.4) based on their weights, and MKN45 (vehicle) group and MKN45 (MAB17). They were assigned to the group, MKN45 (MAB957) group, MKN45 (Hu01G06-127) group, and MKN45 (HuMAB2) group.
  • Test 2 5 animals were assigned to each of the Normal (vehicle) group, MKN45 (vehicle) group, MKN45 (MAB17) group, MKN45 (MAB1) group, and MKN45 (13) group. After grouping, surplus animals were exsanguinated and euthanized under isoflurane anesthesia.
  • DPBS and antibody 14 days after MKN45 transplantation (2 days after grouping) were intraperitoneally administered.
  • DPBS and antibody were also administered 7 days after the start of antibody administration.
  • Blood collection was performed from the inferior vena cava of mice anesthetized with isoflurane inhalation 14 days (Test 1) or 7 days (Test 2) after the start of antibody administration. Plasma was prepared using an EDTA2K blood collection tube and stored in a freezer set at -80 ° C until use. After blood collection, the mice were exsanguinated and euthanized by inferior vena cava incision under anesthesia.
  • hGDF15 Blood unbound hGDF15 concentration
  • the antigen-antibody complex was removed by the following procedure. 5 ⁇ L Protein A / G agarose beads (Thermo scientific, 20421), 50 ⁇ L mouse plasma, and 145 ⁇ L PBS were mixed and mixed at 4 ° C. for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new Eppen tube and stored in a freezer at -80 ° C until use. Subsequent blood GDF15 measurement used the GDF15 measurement ELISA kit (R & D systems, DY957), and the procedure was in accordance with the kit instructions. For samples below the detection limit (62.5 pg / mL or less), the blood GDF15 concentration was set to 0 pg / mL.
  • the blood hGDF15 concentration of the MKN45 group transplanted with MKN45 cells was approximately 2000 pg / mL.
  • an increase in blood hGDF15 concentration was observed in the MAB17, MAB957, and Hu01G06-127 antibody-administered groups as compared with the solvent-administered group.
  • the HuMAB2 administration group the blood hGDF15 concentration decreased (Fig. 7).
  • Table 18 shows the relative values when the blood hGDF15 concentration in the solvent-administered group was 100 in Test 2. Similar to HuMAB2, MAB1 and MAB13 also observed a decrease in blood hGDF15 levels.
  • hGDF15 is produced by cleavage of pro hGDF15 by a proteolytic enzyme (A.R.Bauson et al. Cancer Res. 2005; 65 (6): 2320-2336). It is considered that HuMAB2 has an epitope in the vicinity of this cleavage site, and binding to this epitope may suppress the production of hGDF15.
  • an anti-CCL-2 neutralizing antibody (ABN912) exacerbated the pathology of rheumatoid patients without improving it, and the blood CCL-2 concentration increased in a dose-dependent manner. Since this was considered to be one of the causes of this deterioration, it has been suggested that it is important to reduce the blood antigen concentration (JJ Haringman et al. Arthritis & Rheumatism 2006; 54 (8): 2387-2392. ). Therefore, it is expected that an anti-GDF15 antibody such as HuMAB2 that reduces the amount of blood GDF15 is clinically more useful than an antibody that increases blood hGDF15.
  • test material and method 1.1 Preparation of test substance HuMAB2 was prepared at 1 mg / mL with DPBS and stored in a freezer at -80 ° C until the day of administration.
  • Test method 1.3.1 Test schedule Table 20 shows the test schedule with the antibody administration date as 0 day.
  • mice were separated into individual cages 3 days after the date of delivery. In order to acclimatize to individual breeding, the acclimatization period until transplantation of MKN45 was set to 5 days.
  • MKN45 cells were cultured in a 150 mm petri dish, and on the day of transplantation, the cells were collected by 0.25% trypsin-EDTA (SIGMA, T6689) treatment and centrifuged (1200 rpm, 5). Minutes) to remove the supernatant.
  • the mice were suspended in DBPS to 5 ⁇ 10 6 cells / mL and transplanted subcutaneously to the abdomen of mice anesthetized with isoflurane inhalation at 0.2 mL / body (1 ⁇ 10 6 cells / body).
  • MKN45 Before transplantation of MKN45, 8 mice were randomly selected from 32 mice to form the normal group, and MKN45 was transplanted to the remaining 24 mice. Twelve days after MKN45 transplantation, 8 animals in each group were grouped by the experimental data collection processing system (EDCS, ver.2.1), and assigned to the MKN45 group and HuMAB2 group. After grouping, surplus animals were exsanguinated and euthanized under isoflurane anesthesia.
  • EDCS experimental data collection processing system
  • DPBS and HuMAB2 were administered 14 days after MKN45 transplantation (2 days after grouping). DPBS and HuMAB2 were administered intraperitoneally at 10 mL / kg.
  • Body weight and food intake were measured every 3 days from the day of MKN45 transplantation to the day of antibody administration. Measurements were taken 0 days, 2 days, 4 days, and 7 days after the administration of the antibody.
  • FIG. 8 shows changes in body weight, cumulative food intake for 7 days after antibody administration, and blood unbound GDF15 concentration 7 days after antibody administration.
  • the body weight 7 days after antibody administration was reduced by about 4 g in the MKN45 group as compared with the normal group, and a significant weight loss was observed by transplantation of MKN45 cells (P ⁇ 0.01).
  • test material and method 1.1 Preparation of test substance HuMAB2 was prepared at 1 mg / mL with DPBS and stored in a freezer at -80 ° C until the day of administration.
  • Test method 1.3.1 Model preparation / grouping / antibody administration First, 5 animals were randomly selected as the normal group. The cachexia model was prepared as described in C above, and the antibody was intraperitoneally administered (Fig. 9).
  • FIG. 9 shows the test schedule. Compared to the normal group, the amount of activity in the MKN45 group decreased to about 1/10. It was clarified that this decrease in the amount of activity recovered to almost the same level as the normal group about 3 days after the administration of HuMAB2. In addition, it was found that in the MKN45 group, not only the decrease in activity amount but also the activity pattern was different. In the Normal group, the characteristics of nocturnal animals that became active in the dark period and decreased in the light period were observed, but in the MKN45 group, the activity pattern was clearly reversed. Then, in the HuMAB2 group to which the antibody was administered, the pattern was restored as in the Normal group.

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Abstract

本開示は、DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むhGDF15のエピトープに結合する抗hGDF15抗体およびその用途などを含む。

Description

抗ＧＤＦ１５抗体
　本開示は、抗GDF15抗体およびその用途に関する。
　悪液質は、慢性疾患に伴う、体重減少・筋力低下を特徴とする複合的代謝性疾患である。なかでも、がん悪液質は多くの進行がん患者にみられ、患者の予後やQOLを悪化させるため、積極的な治療が求められる。しかしながら、悪液質の病態は複雑であり、発生機序に不明な点も多く、現在のところ効果的な治療薬は存在しない。
　GDF15（Growth Differentiation Factor 15）は、TGF-βスーパーファミリーの分泌タンパク質であり、がんや糖尿病など各種疾患への関与が報告されている。血中GDF15濃度に関する臨床研究の報告は多数存在し、例えば、がん患者における血中およびがん組織のGDF15レベルが高いこと、がん患者の血中GDF15レベルと予後が相関することが報告されている。また、GDF15は、脳の摂食中枢に作用して食欲不振を誘発し、悪液質の発症に関与することが知られている。
　本開示は、GDF15に関連する疾患または症状の処置に有用な抗GDF15抗体を提供することを目的とする。
　本開示は、ある態様において、DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むhGDF15のエピトープに結合する抗hGDF15抗体を提供する。
　本開示は、さらなる態様において、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む抗hGDF15抗体を提供する。
　本開示は、さらなる実施形態において、
　配列番号１８のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む抗hGDF15抗体を提供する。
　本開示は、さらなる態様において、
　配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　を含む抗hGDF15抗体を提供する。
　本開示は、さらなる態様において、hGDF15との結合について前記いずれかの抗体と競合する抗hGDF15抗体を提供する。
　本開示は、さらなる態様において、前記いずれかの抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または前記ポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を提供する。
　本開示は、さらなる態様において、前記いずれかの抗体を含む医薬組成物を提供する。
　本開示の抗hGDF15抗体は、既存の抗hGDF15抗体とは異なるエピトープを認識し、GDF15に関連する疾患または症状の処置に有用である。
図１は、4種類の抗hGDF15モノクローナル抗体（HuMAB2、MAB17、Hu01G06-127、MAB957）を用いた競合試験の結果を示す。 図２Ａは、HuMAB2のFabとhGDF15との共結合の立体構造解析の結果を示す。 図２Ｂは、HuMAB2のFabとhGDF15との共結合の立体構造解析によるエピトープおよびパラトープの解析結果を示す。 図３は、HuMAB2のFabとhGDF15の結合の立体構造解析結果である。hGDF15はホモ2量体を形成しており、HuMAB2が結合するアミノ酸のうち、hGDF15単量体の1つ（Monomer1）に存在するアミノ酸を下線で、もう1つの単量体（Monomer2）に存在するアミノ酸（71D72T）を二重下線で示す。結合に重要なアミノ酸を太字で示し、特に結合の強いアミノ酸を矢印で示す。 図４は、hGDF15またはDHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）の合成ペプチドとHuMAB2との結合試験の結果を示す。 図５Ａは、HuMAB2変異体とhGDF15との結合（H鎖改変抗体　1/2）を示す。 図５Ｂは、HuMAB2変異体とhGDF15との結合（H鎖改変抗体　2/2）を示す。 図５Ｃは、HuMAB2変異体とhGDF15との結合（L鎖改変抗体　1/2）を示す。 図５Ｄは、HuMAB2変異体とhGDF15との結合（L鎖改変抗体　2/2）を示す。 図６は、HuMAB2およびMAB17による血中hGDF15の捕捉を示す。 図７は、担癌マウスモデルの血中非結合hGDF15濃度に対する抗hGDF15抗体の効果を示す。 図８は、担癌マウスモデルの体重減少、累積摂餌量、および血中非結合hGDF15濃度に対するHuMAB2の効果を示す。 図９は、担癌マウスモデルの活動性（概日リズム）に 対するHuMAB2の効果を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10%の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は、「18～22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約20～30」は、「18～33」を含むものとする。
　本明細書において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
AlaまたはA：アラニン
ArgまたはR：アルギニン
AsnまたはN：アスパラギン
AspまたはD：アスパラギン酸
CysまたはC：システイン
GlnまたはQ：グルタミン
GluまたはE：グルタミン酸
GlyまたはG：グリシン
HisまたはH：ヒスチジン
IleまたはI：イソロイシン
LeuまたはL：ロイシン
LysまたはK：リジン
MetまたはM：メチオニン
PheまたはF：フェニルアラニン
ProまたはP：プロリン
SerまたはS：セリン
ThrまたはT：スレオニン
TrpまたはW：トリプトファン
TyrまたはY：チロシン
ValまたはV：バリン
　本明細書において、あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、その位置を表す数字とアミノ残残基を表す略号とで（例えば、13番目のアルギニン残基を「13R」として）示されることがある。
　GDF15（Growth Differentiation Factor 15）は、MIC-1、PLAB、PDF、NAG-1としても知られる、TGF-βスーパーファミリーの分泌タンパク質である。GDF15遺伝子は、前駆体であるプロGDF15を発現し、このプロGDF15が膜型メタロエンドプロテアーゼにより切断され、成熟GDF15が生成される。GDF15は可溶型であり、二量体を形成してその受容体であるGFRALに認識されると考えられている。特に記載する場合を除き、本明細書におけるGDF15なる用語は、成熟GDF15を意味する。
　本明細書において、GDF15なる用語は、あらゆる生物種のGDF15を含む意味で用いられる。ある実施形態において、GDF15はヒトGDF15（hGDF15）である。プロhGDF15の代表的アミノ酸配列を配列番号１に示す。プロhGDF15は、29アミノ酸からなるシグナルペプチド（下線）、167アミノ酸からなるプロペプチド、および112アミノ酸からなる成熟ペプチド（二重下線、hGDF15）の308アミノ酸からなるポリペプチドである。hGDF15の代表的アミノ酸配列を配列番号２に示すが、本開示におけるhGDF15は、配列番号２のアミノ酸配列を含むものに限定されない。

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　本明細書における「抗体」なる用語は、抗原に対する結合性を有する、免疫グロブリンまたはその一部を含む分子を意味し、天然の免疫グロブリンの形態の分子のみならず、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、抗体断片など、種々の構造の分子を含む意味で用いられる。本明細書における「モノクローナル」なる用語は、それぞれ異なるエピトープに対する複数種類の抗体の混合物である「ポリクローナル抗体」と区別するために用いられ、単一種類の抗体の集団から得られることを意味する。それゆえ、「モノクローナル抗体」なる用語は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、および抗体断片を意味しうる。抗体断片は、免疫グロブリンの一部を構成要素として含む分子を意味し、例えば、限定はされないが、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（VHおよびVL）、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、disulphide-linked FV (sdFv) 、Single-Chain FV (scFV) およびこれらの重合体が挙げられる。抗体の種は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト由来の抗体が挙げられる。
　本明細書において、「単離された」なる用語は、ある生物学的分子（例えば、抗体またはポリヌクレオチド）が、天然の環境における他の成分から実質的に分離されていることを意味する。
　抗体のイムノグロブリンクラスは、重鎖定常領域に基づき決定される。イムノグロブリンクラスとしては、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが挙げられ、これらに対応する重鎖はそれぞれ、α鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖、およびμ鎖と呼ばれる。イムノグロブリンクラスを、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分類することができる。本明細書における抗体のイムノグロブリンクラスおよびサブクラスは、特に限定はされない。ある実施形態において、イムノグロブリンクラスは、IgGである。抗体の軽鎖は、その定常領域に基づきκ鎖およびλ鎖に分けることができるが、本明細書における抗体は、κ鎖およびλ鎖のいずれを有していてもよい。
　抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（framework region）（FRとも記載する）にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity determining region）（CDRとも記載する）で構成される。FRおよびCDRは一般に、軽鎖および重鎖とも、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で存在する。抗体の可変領域やCDRを定義する方法は複数報告されており、例えば、Kabatの定義 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991)、Chothiaの定義(Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987; 196: 901-917)、AbMの定義 (Martin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989; 86: 9268-9272)、Contactの定義 (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 1996; 262: 732-745)、およびIMGTの定義（Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 2003; 27(1): 55-77）などである。本明細書においては、特に記載する場合を除き、Kabatの定義を用いる。
　本明細書において、抗hGDF15抗体とは、所望の効果の発揮に十分な親和性でhGDF15に結合する抗体を意味する。本開示の抗hGDF15抗体は、hGDF15またはその一部を免疫原として用いて、一般的な方法により取得することができる。免疫原は、通常のペプチド合成法により、例えば遺伝子工学的手法または化学合成により、作製することができる。あるいは、本開示の抗体は、遺伝子工学的手法を用いて抗体遺伝子を含む発現ベクターを作製し、細胞で発現させることによっても、得ることができる。
　ポリクローナル抗体は、「Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989」などに記載の一般的な方法により作製することができる。具体的には、前記の免疫原により、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の哺乳動物を免疫することで、作製することができる。
　モノクローナル抗体は、抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法や、遺伝子工学的手法を用いて抗体遺伝子を含む発現ベクターを作製して細胞で発現させる方法など、公知の方法により取得することができる。
　モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、Kohler et al., Nature 256:495, 1975に記載の方法に準じて作製することができる。まず、免疫原を、抗原性を高めるための適当な物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミン等）、および必要に応じて免疫賦活剤（フロイントの完全若しくは不完全アジュバント等）とともに混合し、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。通常、免疫動物は3～10日間隔で複数回免疫され、免疫原であるペプチドは1～100μｇが投与される。次いで、複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞（免疫動物において抗体産生能を有する細胞）を回収し、自己抗体産生能のないミエローマ細胞（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞）と、細胞融合させる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法、電気融合法などが用いられる。さらに、融合細胞が有する選択マーカーに基づき細胞融合に成功した細胞を選択し、選択された細胞が産生する抗体の免疫源に対する反応性を、前述の免疫測定法などにより確認することにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマをインビトロで培養した培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等のインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
　モノクローナル抗体は、また、抗体遺伝子を含む発現ベクターを作製し宿主細胞で発現させることにより、得ることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY; P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的とする抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を取得することもできる。
　得られたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製することができる。
　キメラ抗体は、互いに由来の異なる配列を含む抗体であり、例えば、互いに由来の異なる可変領域と定常領域とを連結した抗体である。ある実施形態において、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の可変領域と、ヒト抗体由来の定常領域から構成される。キメラ抗体は、例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドとヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドを連結し、これを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることによって、取得することができる。
　CDRは、実質的に抗体の結合特異性を決定する領域であり、そのアミノ酸配列は多様性に富む。一方、FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも高い相同性を示す。そのため、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を他の抗体に移植することができる。
　CDR移植の方法は種々知られており、例えば、下記の文献に記載されている：米国特許第7,022,500号明細書、米国特許第6,982,321号明細書、米国特許第6,180,370号明細書、米国特許第6,054,297号明細書、米国特許第5,693,762号明細書、米国特許第5,859,205号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,565,332号明細書、；米国特許第5,585,089号明細書、米国特許第5,530,101号明細書、米国特許第5,225,539号明細書; Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Queen， et al. (1989) Proc． Natl． Acad． U．S．A． 86:10029-10033; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; Winter (1998) FEBS lett 430:92-94。
　ヒト化抗体は、一般に、ヒト以外の動物由来の抗体のCDRと、ヒト抗体由来のFRおよびヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のCDRをヒト抗体に移植することにより得ることができる。ヒト化抗体は種々の方法により作製することができるが、一例として、Overlap Extension PCRが挙げられる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)）。本方法では、ヒト以外の動物由来の抗体（例えばマウス抗体）のCDRとヒト抗体のFRとの末端にオーバーラップする部分を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCRを行い、ヒト以外の動物由来の抗体のCDRとヒト抗体のFRとが連結されたポリヌクレオチドを合成する。次いで、得られたポリヌクレオチドをヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結し、発現ベクターに組み込んで、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることにより、ヒト化抗体を取得することができる。
　FRの配列は、例えば、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を開示するデータベース（例えば、VBase, https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/）または参考文献（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991); Tomlinson, I. M. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cox, J. P. L. et al. (1994) Eur. J Immunol. 24:827-836)に基づき、決定することができる。FRは、生殖細胞系列の配列と比較して1以上のアミノ酸の変異を含んでいてもよい。好適なFRの選択方法は公知であり、例えば、ベストフィット法（Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）により選択されたFRや、ヒト抗体の軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのコンセンサス配列に由来するFR（Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)）を用いることができる。
　ヒト抗体は、例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原で感作し、次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させることによって取得することができる（特公平1-59878号公報）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。また、ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することによっても取得することができる（Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125, 2005)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている（Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 178, 2001）。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択し、選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。次いで、この可変領域配列をヒト抗体定常領域の配列とインフレームで連結し、適当な発現ベクターに挿入して、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることにより、ヒト抗体を取得することができる。
　多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合する抗体である。多重特異性抗体としては、二重特異性抗体、三重特異性抗体などが挙げられる。ある実施形態において、多重特異性抗体は、hGDF15と、1以上の他の抗原とに結合する。多重特異性抗体は、例えば、遺伝子工学的手法により、あるいは認識抗原が異なる2つ以上の抗体を結合することにより、作製することができる。
　抗体断片は、例えば、パパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより抗体を消化することにより得ることができる。あるいは、抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し発現させることで得ることができる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137; Hudson et al., Nat. Med., (2003) 9, 129-134）。
　前述のように、抗体は、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入して発現させることにより、得ることができる。具体的には、抗体をコードする配列がエンハンサーやプロモーターなどの発現制御領域のもとで発現するよう発現ベクターを構築し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、抗体を発現させる。
　すなわち、本開示はまた、抗hGDF15抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および前記抗体を発現可能なポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を提供する。
　宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの真核細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、CHO、COS、NIH3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞）、または昆虫細胞（例えば、Sf9、Sf21、Tn5）が挙げられる。真菌細胞としては、酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））などが挙げられる。また、大腸菌（E. coli）（例えば、JM109、DH5α、HB101等）、枯草菌などの原核細胞を宿主細胞として用いることもできる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法により行うことができる。
　得られた抗体の抗原への結合は、酵素免疫測定法（EIA）（ELISAを含む）、放射免疫測定法（RIA）、化学発光免疫測定法（CIA）、蛍光免疫測定法（FIA）などの免疫測定法や、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイなどにより確認することができる。抗体の抗原への結合は、競合アッセイにより確認することもできる。例えば、得られた抗体が、hGDF15への結合が確認されている抗hGDF15抗体と競合するか否かを調べることにより、確認することができる。
　本明細書において、所定の抗hGDF15抗体（すなわち、参照抗体）と競合する抗体とは、実施例に記載する条件で測定した場合に、参照抗体のhGDF15に対する結合を有意に減少させる抗体を意味する。ある実施形態において、本開示の抗体は、参照抗体のhGDF15に対する結合を10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％以上減少させる。
　ある実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むhGDF15のエピトープに結合する。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号２の５～１８番目のアミノ酸残基に相当する。DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むエピトープに結合するか否かは、hGDF15との結合について、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合するか否かを調べることによって、確認することができる。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、hGDF15との結合について所定の抗hGDF15抗体と競合する。ある実施形態において、本開示の抗体は、hGDF15との結合について、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む。
　本実施形態において、CDRは、如何なる方法により特定されてもよい。当業者は、種々の条件を考慮して、好適な方法によりCDRを特定することができる。ある実施形態において、CDRは、Kabat、Chothia、AbM、Contact、およびIMGTから選択されるいずれかの定義により特定される。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、
　配列番号１８のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、
　配列番号１８、および３８～４４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４５～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、４９、５０および６７～８０から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、および１０６～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９１～９９、および１１８～１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、
（i）配列番号１８、および３８～４４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（ii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４５～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、４９、５０および６７～８０から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iv）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（v）　配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、および１０６～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；または
（vi）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９１～９９、および１１８～１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む、
　を含む。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、
　配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　を含む。
　さらなる実施形態において、本開示の抗hGDF15抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
　本明細書において、アミノ酸の改変には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、および付加が含まれる。改変の数は、限定はされないが、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個である。ある実施形態において、アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換である。さらなる実施形態において、アミノ酸の改変は、１～３個のアミノ酸の改変である。さらなる実施形態において、アミノ酸の改変は、１個のアミノ酸の置換である。
　本明細書において、所定のアミノ酸配列を「含む」アミノ酸配列には、その所定のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列と、その所定のアミノ酸からなる配列とが包含される。
　本明細書において、所定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または軽鎖可変領域、および、所定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または軽鎖可変領域には、その所定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるCDRに改変が生じていない抗体が含まれる。
　本明細書における、アミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた２つの配列間で一致するアミノ酸残基の割合を意味する。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。
　アミノ酸配列を改変し所望の特性を有する抗体を得る方法として、様々な方法が知られている。例えば、結合親和性を改善した変異体は、ファージディスプレイに基づく方法により得ることができる。この方法では、例えば、アラニンスキャニング変異導入法により抗体と抗原の相互作用に影響するアミノ酸残基を同定するか、あるいは、抗原抗体複合体の結晶構造を解析して抗体と抗原の間の接触点を同定するなどして、変異導入部位を決定する。この部位のアミノ酸を改変した変異体をエラープローンPCRや部位特異的変異導入などにより作製し、得られた変異体のライブラリーをスクリーニングすることにより、所望の特性を有する変異体を得ることができる。
　本開示の抗体は、血中GDF15濃度の低下作用を有する。かかる作用を有するか否かは、実施例に記載のように、GDF15発現がん細胞を移植した動物において対照抗体と比較して血中GDF15濃度を有意に減少させるか否かを評価することにより、確認することができる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本開示の抗体は、プロGDF15の切断を抑制することにより、血中GDF15濃度を低下すると考えられる。本開示の抗体はまた、成熟GDF15に結合し、GDF15からのシグナル伝達を阻害する作用を有しうる。
　本開示の抗体は、血中GDF15濃度の低下（場合により、さらにGDF15のシグナル伝達阻害）により、体重減少、食欲不振、概日リズム障害などの症状を改善する作用を発揮しうる。
　抗体は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性や補体依存性細胞傷害（CDC）活性または体内動態の調節のため、イムノグロブリンのサブクラスが選択されていてもよく、Fc領域のアミノ酸配列または糖鎖が改変されていてもよい。例えば、補体活性化能の低減を目的として、IgG4が選択されうる。また、Fc受容体またはC1qへの結合性を低減または増強する改変、血中半減期の延長のためFcRnへの結合親和性を上昇させる改変などが行われうる。
　抗体は、また、例えば抗体の血中半減期の延長、または安定性の改善等のため、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなどのポリマーと結合していてもよい。
　抗体は、また、化学療法薬、毒性ペプチド、放射性同位元素などと結合していてもよい。化学療法薬としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、およびイホスファミドなどのアルキル化薬；アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどの代謝拮抗薬；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、エトポシドおよびテニポシドなどのアルカロイド；カンプトテシン（例えばイリノテカンおよびトポテカン）などのトポイソメラーゼ阻害薬；アクチノマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシンなどの細胞傷害性抗生物質などが挙げられる
　本開示の抗体は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。本開示の抗体は、血中GDF15濃度の低下作用（場合により、さらにGDF15のシグナル伝達阻害作用）を有し、GDF15に関連する疾患または症状の処置に有用である。GDF15に関連する疾患または症状としては、体重減少、食欲不振、筋量低下、活動性低下、概日リズム障害、脳下垂体ホルモン分泌異常、体温調節不全、悪液質、がん、糖尿病、腎不全、心不全、AIDS、COPD、多発性硬化症、関節リウマチ、敗血症、結核、サルコペニア、がんの骨転移、抗がん剤誘発性悪心嘔吐、妊娠悪阻、慢性骨髄増殖性疾患（例えば、骨髄線維症、真性多血症、本態性血小板血症）、神経性やせ症、双極性障害、ミトコンドリア病、ICU関連筋力低下などが挙げられる。
　ある実施形態において、悪液質は、がん、糖尿病、腎不全、心不全、AIDS、COPD、多発性硬化症、関節リウマチ、敗血症、または結核に伴う悪液質である。さらなる実施形態において、悪液質は、がん悪液質である。悪液質の処置には、体重減少、食欲不振、筋量低下、活動性低下、概日リズム障害、脳下垂体ホルモン分泌異常、および体温調節不全から選択される1以上の症状の改善が含まれる。
　がんとしては、限定はされないが、胃がん、食道がん、大腸がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、子宮頸がん、子宮体がん、精巣がん、前立腺がん、膀胱がん、甲状腺がん、腎臓がん、肝細胞がん、肝内胆管がん、頭頚部がん、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、脳腫瘍、神経膠腫、黒色腫などが挙げられる。
　本開示の抗体は、所望の効果（例えば、GDF15に関連する疾患または症状の治療）を発揮しうる量（本明細書において、有効量という）で対象に投与される。抗体の投与量は、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日あたり、10 μg/kg～100 mg/kg、100 μg/kg～10 mg/kg、または1 mg/kg～10 mg/kgを、連日、または数日、１週間、数週間、１か月もしくは数ヵ月に１回、投与することができるが、これに限定されない。抗体の投与方法も、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。投与方法は、経口投与であっても非経口投与であってもよいが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられるが、静脈内投与によることが好ましい。
　本明細書において、「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、サル、およびヒトが挙げられる。ある実施形態では、対象はヒトである。
　医薬組成物は、常法により製剤化することができる。医薬組成物は、抗体に加えて、滅菌水、生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤などの、医薬上許容される担体または添加剤を含むことができる。
　本開示の抗体は、他の治療薬と併用してもよい。本明細書において、2種以上の有効成分を併用する場合、その全てまたは一部の有効成分が同一の組成物に含まれていてもよく、全ての薬剤が別の組成物に含まれていてもよい。また、2種以上の有効成分の投与スケジュールは同じであっても異なっていても良い。
　ある実施形態において、本開示の抗体は、がん治療薬と併用される。がん治療薬としては、限定はされないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、およびイホスファミドなどのアルキル化薬；アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどの代謝拮抗薬；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、エトポシドおよびテニポシドなどのアルカロイド；カンプトテシン（例えばイリノテカンおよびトポテカン）などのトポイソメラーゼ阻害薬；アクチノマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシンなどの細胞傷害性抗生物質；EGFR阻害薬、HER2阻害薬、ALK阻害薬、VEGFR阻害薬などの分子標的薬；抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体などの免疫チェックポイント阻害薬が挙げられる。
　本開示の例示的実施形態を以下に記載する。
［１］
　DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むhGDF15のエピトープに結合する、抗hGDF15抗体。

［２］
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１に記載の抗体。

［３］
　配列番号１８のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１または２に記載の抗体。

［４］
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、抗hGDF15抗体。

［５］
　配列番号１８のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、抗hGDF15抗体。

［６］
　前記１～３個のアミノ酸残基の改変が、１個のアミノ酸残基の改変である、前記２～５のいずれかに記載の抗体。

［７］
　前記アミノ酸残基の改変が、アミノ酸残基の置換である、前記２～６のいずれかに記載の抗体。

［８］
　前記１～３個のアミノ酸残基の改変が、１個のアミノ酸残基の置換である、前記２～７のいずれかに記載の抗体。

［９］
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域を含む、前記１～８のいずれかに記載の抗体。

［１０］
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、前記１～９のいずれかに記載の抗体。

［１１］
　配列番号１８および３８～４４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４５～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、４９、５０および６７～８０から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、および１０６～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９１～９９、および１１８～１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１～１０のいずれかに記載の抗体。

［１２］
　配列番号１８および３８～４２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４６～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、７１、７３、７７、および７９から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８３、８５～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、１０６、１０８～１１１、および１１３～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９３、９５～９９、１２１、１２２、１２４、１２５、１３１、および１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１～１１のいずれかに記載の抗体。

［１３］
（i）配列番号１８および３８～４４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（ii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４５～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、４９、５０および６７～８０から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iv）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（v）　配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、および１０６～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；または
（vi）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９１～９９、および１１８～１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記１～１２のいずれかに記載の抗体。

［１４］
（i）配列番号１８および３８～４２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（ii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９、４６～４８、および５２～６６から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iii）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０、７１、７３、７７、および７９から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（iv）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１、８１～８３、８５～８９、および１００～１０４から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；
（v）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２、９０、１０６、１０８～１１１、および１１３～１１５から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む；または
（vi）配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３、９３、９５～９９、１２１、１２２、１２４、１２５、１３１、および１３２から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域を含む、
　前記１～１３のいずれかに記載の抗体。

［１５］
　配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む重鎖可変領域、および、
　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
　を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１～１４のいずれかに記載の抗体。

［１６］
　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3、および配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、前記１～１５のいずれかに記載の抗体。

［１７］
　配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　を含む、前記１～１６のいずれかに記載の抗体。

［１８］
　配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
　配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列において１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、または１～３個のアミノ酸残基改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
　を含む、抗hGDF15抗体。

［１９］
　配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記１～１８のいずれかに記載の抗体。

［２０］
　hGDF15との結合について、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗hGDF15抗体と競合する、前記１～１９のいずれかに記載の抗体。

［２１］
　モノクローナル抗体である、前記１～２０のいずれかに記載の抗体。
［２２］
　hGDF15との結合について、前記１～２１のいずれかに記載の抗体と競合する、抗hGDF15抗体。

［２３］
　配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗hGDF15抗体と競合する、前記２２に記載の抗体。

［２４］
　血中GDF15濃度を低下させる、前記２２または２３に記載の抗体。

［２５］
　プロGDF15の切断を抑制する、前記２２～２４のいずれかに記載の抗体。

［２６］
　モノクローナル抗体である、前記２２～２５のいずれかに記載の抗体。
［２７］
　前記１～２６のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

［２８］
　配列番号２４および／または２５の核酸配列を含む、前記２７に記載のポリヌクレオチド。

［２９］
　前記２７または２８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

［３０］
　前記２７または２８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
［３１］
　前記１～２６のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。

［３２］
　GDF15に関連する疾患または症状を処置するための、前記３１に記載の医薬組成物。

［３３］
　GDF15に関連する疾患または症状が、がんである、前記３２に記載の医薬組成物。

［３４］
　GDF15に関連する疾患または症状が、悪液質である、前記３２に記載の医薬組成物。

［３５］
　悪液質が、がん悪液質である、前記３４に記載の医薬組成物。
［３６］
　GDF15に関連する疾患または症状の処置に用いるための、前記１～２６のいずれかに記載の抗体。

［３７］
　GDF15に関連する疾患または症状を処置する方法であって、処置を必要とする対象に有効量の前記１～２６のいずれかに記載の抗体を投与することを含む方法。

［３８］
　GDF15に関連する疾患または症状を処置するための医薬の製造のための、前記１～２６のいずれかに記載の抗体の使用。
　　本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、いかなる意味においても本発明は本実施例に限定されるものではない。
I. 抗体作製
A. 抗hGDF15抗体の作製
1　　　　　　動物への免疫
日程
Day1； 初回免疫（25 μg/shot/body、Abisco-100、ip)
Day10； 2回目免疫（25 μg/shot/body、Abisco-100、ip)
Day17； 3回目免疫（25 μg/shot/body、Abisco-100、ip)
Day21； Titer check
Day24； Final boost（25 μg/shot/body、Abisco-100、ip)
Day27； 脾臓摘出、細胞融合

試薬
・Recombinant Human GDF15（rhGDF15）、R&D、957-GD-025/CF、25 μg
・Abisco-100 (ISCONOVA）

動物
・3H/HeJ Jms Slc-lpr/lpr　（5W、日本SLC、メス）
手順
1. 50 μLのhGDF15 (0.5 mg/mL)、25 μLのAbisco-100、175 μLのPBSを混合し、マウスの腹腔内に投与した（初回免疫）。
2. 初回免疫から10および17日後も初回免疫と同様に調製したhGDF15溶液を腹腔内投与した。
3. 初回免疫から21日後に、マウスの尾部からキャピラリー採血管を用いて採血を行い、遠心分離によって血漿を得た。
4. 血漿は100倍、1000倍、および10000倍希釈して、hGDF15を固相した96ウェルプレートを用いてELISAを行い、hGDF15への抗体価が上昇している事を確認した。
5. 初回免疫から24日後に、初回免疫と同様に調製したhGDF15溶液を腹腔内投与した。
6. 初回免疫から27日後に、麻酔下で脾臓を摘出し、細胞融合を行った。
2　　　　　　細胞融合およびHAT選択
細胞
・　Sp2/o-14Ag (以下Sp2/o細胞、ATCC # CRL-1581)
　　　3×105 cells/mLを超えないように継代

試薬
・　DMEM (GIBCO、10313-021)
・　FBS(56℃、30分間非働化処理済み)
・　Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Invitrogen、10378-016)
・　インシュリン (フナコシ、BT-243)10 mg/mLに調製
・　55mM 2-Mercaptoethanol(1000x) (Invitrogen、21985-023)
・　rIL-6 
・　PBS
・　チュルク液
・　トリパンブルー
・　Red blood cell lysing buffer (SIGMA、R7757)
・　PEG1500 (ロッシュ、108014)
・　HAT Media Supplement (50×) Hybri-Max (SIGMA、H0262)
・　HT Media Supplement (50×) Hybri-Max (SIGMA、H0137)

器具
・　6ウェルプレート (BD、353046)
・　浮遊細胞培養用大フラスコ
・　手術用ピンセット(3本)
・　手術用ハサミ(3本)
・　50 mLファルコンチューブ
・　1 mL シリンジ
・　23G　注射針
・　セルストレーナー 40μm (BD、352340）

培地組成
・　Sp2/o培養用培地
　　DMEM                                  500 mL
　　FBS                                     55 mL (final 10%)
　　Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×)     5 mL (final 1×)

・　細胞融合用培地
　　DMEM

・　ハイブリドーマ用培地
　　DMEM                                  500 mL
　　FBS                                     55 mL (final 10%)
　　Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×)      5 mL (final 1×)
　　2ME                                    500 μL (final 0.1%)
　　インシュリン(10 mg/mL)                  250 μL (final 5 μg/mL)
　　rIL-6                                       適宜 (final 5 ng/mL)

・　HAT選択培地
　　ハイブリドーマ用培地
　　50× HAT                                   適宜 (final 1×)
手順
・ミエローマの準備（細胞融合1週間前)
1. 凍結保存されていたSp2/o細胞 （約1×106 cells/vial)を融解し、予め15 mLファルコンチューブに分注しておいたSp2/o用培地 10 mLに懸濁し、1500rpmで3分遠心分離して洗浄し、上清を除いた。
2. ペレット（Sp2/o細胞）をSp2/o用培地4mlに懸濁した。
3. 6ウェルプレートの各ウェルにSp2/o用培地4 mL入れておき、2.で懸濁したSp2/o細胞を2倍系列で希釈した。
4. 37℃、5.5% CO2 下、1～2日培養した。
5. 顕微鏡観察により状態の良いウェルの細胞を回収し浮遊細胞培養用大フラスコ(または中フラスコ)に拡大培養した。細胞融合2日前に継代を行った。(細胞融合当日に5×105 cells/mL前後の細胞密度になるようにした。)
・マウスからの脾臓の摘出
1. マウスに麻酔をかけ、70%エタノールを十分に吹きかけた後、安全キャビネット内において、開腹した。無菌的に脾臓を摘出するために、滅菌済みピンセット・ハサミは外皮用と腹腔内用のものを用意した。
2. 麻酔下で腹大動脈から全採血後、脾臓を摘出した。
3. 予めPBSを入れておいた50 mLファルコンチューブに脾臓を入れ、細胞融合までの間氷上に置いた。
・細胞融合（ハイブリドーマの作成）
　DMEM(無血清)とPEGを37℃インキュベーターで予め温めておいて以下を行った。
1. Sp2/o細胞を回収し、細胞数を数えた。1×106 cells/mL以下のフラスコの細胞のみを使用した。
2. 6ウェルファルコンプレートの1ウェルにPBSを10 mL程度用意し、そこに摘出した脾臓を入れ、周辺に残っている脂肪組織を除去した。
3. 残りのウェルの1つにPBS 10 mLを新たに入れ、脾臓を移した。滅菌済みのピンセットとハサミで脾臓を半分に切った。
4. 1 mLシリンジに23Gの注射針を装着し、PBSを吸い取り、半分に切った脾臓に注入し、脾細胞をPBS中に押し出した。脾臓が白くなるまで繰り返した。
5. 50 mL ファルコンチューブ上部に滅菌済みのメッシュを置き、脾細胞を含むPBSを通すことで、脾細胞以外の組織を除いた。総量が40 mLになるように細胞融合用培地を添加した。
6. 1500rpmで3分間、遠心分離し、上清を除いた。
7. 脾細胞を細胞融合用培地20 mLに懸濁し、チュルク液を用いて染色し（チュルク液：懸濁液＝10：1）、白血球をカウントした。（一般的に、1×108 cells、 5×106 cells/mL程度となる。）
8. 1500rpmで3分間、遠心分離し、上清を除いた。
9. Red blood cell lysing buffer 3 mLに懸濁し、氷上で3分静置した。
10. 細胞融合用培地17 mL添加し、1500rpmで3分間、遠心分離し、脾細胞を回収した。
11. Sp2/o細胞を含む培地を、細胞数で脾細胞：Sp2/o細胞=5:1になるように添加し、懸濁した。
12. 1500rpmで3分間、遠心分離し、上清を除いた。
13. 沈殿した細胞をタッピングにより再懸濁した。
14. ゆっくり撹拌しながら1分間かけてPEG1500を1 mL滴加した。
15. さらに1分間撹拌を続けた。
16. 14と同様に細胞融合用培地1 mLを滴加した。
17. さらに3分間かけて細胞融合用培地3 mLを加えた。
18. さらに1分間かけて細胞融合用培地10 mLを加えた。
19. 37℃で10分間静置した。
20. 全量40 mLになるように細胞融合用培地を添加した。
21. 1500rpmで3分間遠心分離し、上清を除いた。
22. 脾細胞数として1 mLあたり1 × 106 cellsになるようにハイブリドーマ用培地に懸濁し、96ウェル平底プレートにウェルあたり、100 μLでハイブリドーマを撒いた。
23. 37℃、CO2 5.5%下、o/n培養した
24. 2×HAT選択培地を100 μL/well添加し、引き続き培養した。
25. 1日おきに上清100 μLを除去し、1×HAT選択培地を100 μL添加することで培地交換をおこなった。
3　　　　　　抗体のスクリーニング
　抗hGDF15抗体を産生するハイブリドーマの選択は、96ウェルプレートで培養開始から5日後に、ハイブリドーマ上清を用いてELISAにより測定したhGDF15への結合強度を指標に、以下のように行った。
　hGDF15（R&D Systems、957-GD-025/CF）を固相化した96ウェルプレートの各ウェルに、100 μLの培養上清を添加し、2時間室温にて反応させた。ウェルを洗浄後、検出用2次抗体（HRP標識抗マウスIgG抗体（Promega、W402B））を加え、1時間室温にて反応させた。ウェルを洗浄後、TMB溶液（Sigma、T2885）を用いて発色し、プレートリーダーにて吸光度450nmを測定した。
　450nmの吸光度が1.0以上のウェルのハイブリドーマは、さらに限界希釈法によって単クローン化を行った。最終的に16クローンを得た。得られた16クローンのうち、IgMであった1クローンおよび、非特異的に複数のタンパクに結合を示した2クローンを除いた13クローンを培養した。
　培養上清よりHiTrap rProtein A FF（GEヘルスケアライフサイエンス、17508001）を用いて抗体の精製を行った。精製抗体の濃度はNanoDrop（Thermo Scientific）を用いて吸光度280nmを用いて計測した。
　精製した各抗体のhGDF15との結合親和性をELISAにて以下のように測定した。200 ng/mLの濃度のhGDF15を100 μL/wellでウェルに加えた。hGDF15を固相化した96ウェルプレートに、0.39 ng/mLから25 ng/mLで段階希釈した精製抗体を100 μL/wellで反応させたのち、hGDF15-抗hGDF15抗体複合体をHRPコンジュゲート2次抗体で検出した。発色は450nmの吸光度を測定し、4パラメータロジスティックス曲線を用いて、5 ng/mLの濃度の抗体量の値を算出した。各抗体の結合値はクローンMAB17の値を100とし、相対値を算出した。
　hGDF15と得られた抗hGDF15抗体の親和性の結果を表１に示す。MAB17よりもはるかに強い結合を示したMAB2をヒト化した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
4　　　　　　ヒト化抗体の作製
・細胞
　　細胞株名：ExpiCHO
　　由来：チャイニーズハムスター
　　細胞入手先：Thermo Fisher Scientific（A29127）
　　培養液：ExpiCHO expression medium
　　培養液入手先：Thermo Fisher Scientific（A2910001）
・発現ベクター
　　ベクター名：pcDNA-3.1
　　cDNA由来：全合成
　　入手先：Thermo Fisher Scientific
・リコンビナントタンパク質
　　タンパク質名：ヒトGDF15
　　由来：CHO細胞
　　入手先：R&D systems （957-GD-025/CF）
・キメラ抗体の配列のデザイン
　マウス由来の抗体であるMAB2のCDR配列を含む可変領域とベバシズマブ（bevacizumab）の定常領域をつなぎ合わせキメラ抗体の配列とした。
・ヒト化抗体の配列のデザイン
　BlastサーチにてMAB2に類似性の高いヒト化抗体を検索した。これらヒト化抗体にCDR配列を置換し、可変領域を作製し、ベバシズマブの定常領域をつなぎ合わせ全長ヒト化抗体を作成した。また、構造予測から構造の維持に重要だと考えられたアミノ酸に関しては、マウス抗体のアミノ酸をそのまま残し、ヒト化抗体の一部とした。
・抗体の作製と精製
　重鎖および軽鎖遺伝子を全合成し、それぞれ発現ベクターに組み込んだ。24ウェルプレートにExpiCHO細胞を播種し、翌日、重鎖および軽鎖発現ベクターをTransIT-CHO kit（Takara、V2170）にて遺伝子導入（co-transfection）して、重鎖および軽鎖を共発現させた。5日後、産生された抗体を含む培養上清をすべて回収し、Hitrap rProteinA FFカラム（GE healthcare、17-5080-01）を用いて抗体を精製した。
・抗体濃度の測定
　上清中の抗体濃度は、Human IgG EIAキット（Takara、MK136）にて、添付のプロトコールに従って測定した。精製抗体はNanoDrop（Thermo Fisher Scientific）にて吸光度は280nmを測定し、濃度を決定した。
・hGDF15に対する結合量の測定（ELISA）
　96ウェルプレートに100 μLのヒトGDF15溶液（0.4 μg/mL）を入れ、翌朝まで静置し、ELISAプレートを作製した。プレートのブロッキングは1% BSAで1時間行い、変異抗体を含む培養上清は公比3の希釈系列を作製して、ELISAプレートに100 μLずつ添加し、2時間静置した。2次抗体の反応は、20000倍希釈したHRP複合抗ヒトIgG抗体（Gene Tex、GTX26759）を100 μL添加し、1時間反応させた。発色反応はTMB（Sigma、T-0440）を使用し、反応停止液は2規定の硫酸を使用した。吸光度は450nmを測定した。
・BLITZを用いた結合親和性の測定
　抗体の結合親和性は、生体分子間相互作用解析システムであるBLITZ（Pall ForteBio）を用いて測定した。センサーチップにはAnti-HIS（Pall ForteBio、 18-5114）を、洗浄液にはForteBio Sample Diluent（Pall ForteBio、18-1048）をそれぞれ使用した。測定プログラムは、hGDF15のセンサーチップへの吸着に60秒、抗体の結合に120秒、解離に120秒で設定した。
B. 配列決定
1　　　　　　試験方法
　10cmシャーレで培養したハイブリドーマからトータルRNAを調製し、SMARTer RACE 5’/3’ Kit（Takara、634858）を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAをpCR4Blunt-TOPO vectorに組み込み、大腸菌を用いて増幅させ、プラスミドDNAを精製した。DNAの配列決定は、BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific, 4337454）とM13プライマーを用いて、ABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）にて行った。
2　　　　　　結果
　MAB17、MAB2、およびHuMAB2のアミノ酸配列を表２に、CDR配列を表３に、HuMAB2のcDNA配列を表４に示す。CDRは、Kabatの定義により特定した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
C. 既存の抗hGDF15抗体との比較
1　　　　　　試験材料および方法
抗hGDF15抗体
　HuMAB2との反応性比較に用いた抗体を表５に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
試験方法
　HuMAB2および表５に示す抗GDF15モノクローナル抗体（2 μg/mL）を100 μL/wellにて96ウェルプレートに添加して、それぞれ固相化したプレートへ、1 ng/mlの濃度から段階希釈したhGDF15（R&D Systems、957-GD-025/CF）を100 μL/well反応させた。EZ-Link Micro NHS-PEG4-Bitinylation Kit（Thermo Fisher Scientific、21955）を用いてビオチン化したHuMAB2を検出抗体（1 μg/mLを100 μL/well）として用いた。サンドイッチELISA成立可否は、Human GDF15 ELISA Kit（R&D Systems、DY957）添付のStreptavidin-HRP conjugateを用いて検出した。サンドイッチELISAのポジティブコントロール抗体（PC）として、いずれのモノクローナル抗体ともサンドイッチが可能なHuman GDF15 ELISA Kit（R&D Systems、DY957）添付の検出抗体（表５）を用いた。
2　　　　　　結果
　固相化した抗体とビオチン化した抗体が類似のエピトープを認識している場合、競合阻害が起きるが、異なるエピトープを認識している場合は競合阻害は起きないと考えられる。図１に示すように、HuMAB2は他の抗体と同時にhGDF15を認識することができた。このことから、HuMAB2は他の抗体と異なるエピトープを認識することが示唆された。
　上記のとおり、HuMAB2は既存の抗体と競合しないことが明らかとなった。そこで、今回得られた他の抗体がHuMAB2と競合するか否かを、前記と同じ方法で試験した。結果を阻害%で算出し、表６に示した。試験した8クローンのうち、4クローン（MAB1、MAB11、MAB12およびMAB13）が、HuMAB2とhGDF15の結合を70%以上阻害することが明らかとなった。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
D. hGDF15とHuMAB2 Fabとの複合体の結晶化
1　　　　　　試験材料および方法
　hGDF15 (R&D Systems、9279-GD-050)に対して、HuMAB2 Fab（配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む）(20 ml Tris-HCl、200 mM NaCl、pH7.2)をモル比1:1で濃度が5 mg/mLとなるように混合し、複合体の蛋白溶液を調製した。HuMAB2結晶化はSitting drop蒸気拡散法で行った。蛋白溶液とリザーバー溶液の混合比は1:1とした。スクリーニングキットCrystal Screen 2 (Hampton Research、HR2-112)で得られた結晶を用いて、複合体の結晶構造を分解能2.8Åで決定した。位相決定は分子置換法で行った。
2　　　　　　結果
　立体構造解析により、hGDF15はホモ2量体を形成しており、hGDF15の2量体に2分子のHuMAB2のFabが結合していることがわかった（図２Ａ）。HuMAB2とhGDF15の結合境界面に並ぶアミノ酸をそれぞれパラトープとエピトープとして同定した（図２Ｂ）。表７に、同定されたhGDF15のエピトープおよび結合に重要なHuMAB2上のアミノ酸を下線で示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　MOE（Molecular Operating Envirounment）を用いて解析したhGDF15のエピトープを図３に示す。HuMAB2は、hGDF15単量体の1つ（Monomer1）上のN端側の5番目のアスパラギン酸から18番目のヒスチジンまでの14アミノ酸、45番目のイソロイシン（45I）および46番目のグリシン（46G）に、もう1つの単量体（Monomer2）上の71番目のアスパラギン酸（71D）および72番目のスレオニン（72T）に結合することが明らかとなった。
　エピトープ内でHuMAB2との相互作用に特に強く関わっていると推定されるアミノ酸残基をMOEのProtein Contactsを用いて計算した（表８）。その結果、図３に示すアミノ酸が特に強くHuMAB2と結合していることが示された。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
E. hGDF15および変異hGDF15に対する抗hGDF15抗体の反応性
1　　　　　　試験材料および方法
試験材料
　HuMAB2抗体との反応性比較に用いた抗体を表９に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
試験方法
試験概要
　変異hGDF15発現用コンストラクトをExpiCHO-S細胞へトランスフェクションし、培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清中の各変異hGDF15の発現を市販のGDF15測定用ELISAキットにて確認した後、各変異hGDF15に対するHuMAB2の反応性をELISA法で評価した。エピトープの中で特に重要なアミノ酸残基の同定には、変異導入GDF15に対するHuMAB2の反応性をELISAおよび生体分子間相互作用解析システムの2方法にて評価した。HuMAB2と他の抗hGDF15抗体とのエピトープの違いによる差別化の検証は、変異hGDF15に対する他の抗hGDF15抗体の反応性とHuMAB2の反応性をサンドイッチELISA法で比較することにより行った。
変異hGDF15の調製
　各変異hGDF15遺伝子が導入されたpcDNA-3.1ベクター（Thermo Fisher Scientific）を、ExpiCHOTM Expression System Kit（Thermo Fisher Scientific、A29133）を用いて、キットに含まれるExpiCHO-S（Thermo Fisher Scientific）細胞へトランスフェクションした。トランスフェクション後10日目の培養上清を4℃にて8000rpmで30分間遠心分離し、培養上清を回収した。回収した培養上清は、冷凍（設定温度-20℃）保存した。
変異hGDF15の発現確認
　回収した培養上清中の変異hGDF15は、Human GDF15 ELISA Kit（R&D Systems、DY957）を用いて、キットの添付文書に従って測定を実施し、発現の確認と濃度測定を行った。
変異hGDF15に対するGDF15抗体の反応性評価
　野生型（Wild-type: Wt）hGDF15は、Recombinant Human GDF15（R&D Systems、957-GD-025/CF）を用いた。各hGDF15抗体を固相したプレートに段階希釈したWtおよび変異hGDF15を反応させ、結合したWtおよび変異hGDF15をHuman GDF15 ELISA Kit（R&D Systems、DY957）の検出抗体（表９）を用いて検出した。
生体分子間相互作用解析システムによる変異導入GDF15に対するHuMAB2の反応性評価
　各変異hGDF15はMAB17をセファロース（GE Healthcare、17-0906-01）に固定したアフィニティ・カラムを用いて精製した。生体分子間相互作用解析システムでの評価はOCTET QKe （ForteBio）を用いて行った。WtのGDF15はRecombinant Human GDF15（R&D Systems、957-GD-025/CF）を用いた。バイオセンサーNi-NTA (ForteBio、18-5101）にWtおよび変異hGDF15を結合させ、続いて段階希釈したHuMAB2を反応させて、変異hGDF15とHuMAB2間の相互作用を評価した。解析はKinetics Methodを用いて実施した。
2　　　　　　結果
　野生型（WT）hGDF15および変異hGDF15のアミノ酸配列を表１０に示す。野生型hGDF15のアミノ酸をアラニンに置換した部位を下線で示している。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１１に、4種の抗hGDF15抗体とhGDF15および変異hGDF15との結合を示す。HuMAB2は、変異hGDF15と結合しないか、野生型hGDF15との結合よりも弱く結合したが、他の抗hGDF15抗体とhGDF15との結合は変異によって影響されなかった。このことから、HuMAB2のhGDF15のエピトープのうちN末端側の5DHCPLGPGRCCRLH18（配列番号３）が結合に重要であり、特に13Rと16RがHuMAB2の結合に重要であることがわかった。また、この結果からも、MAB17、Hu01G06-127、およびMAB957はHuMAB2とはエピトープが異なることが支持された。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
F. エピトープ領域ペプチドに対するHuMAB2抗体の反応性評価
1　　　　　　試験方法
　hGDF15の5番目のアスパラギン残基から18番目のヒスチジン残基までの14残基（DHCPLGPGRCCRLH、配列番号３）がHuMAB2の結合に重要であることが明らかとなったことから、この配列のペプチドをGenScript社で合成した（表１２）。Peptide 1は、両末端ともに未修飾とし、Peptide 2は、この領域がhGDF15内ではインターナルな領域であるため、その状態を模倣する目的でアミノ末端をアセチル化し、カルボキシル末端をアミド化して合成した。10 μg/mLのペプチド溶液を100 μL/wellで添加して固相した96ウェルプレートに、HuMAB2抗体（10 μg/mL）を100 μL/wellで添加して反応させた（3時間25℃）。結合したHuMAB2抗体を、5000倍希釈した抗ヒトIgG-HRP（Jackson ImmunoResearch、109-035-008）を100 μL/wellにて添加し、25℃で1時間反応させて、検出した。プレートのコントロールとして、hGDF15（R&D Systems、957-GD-025/CF）を固相したプレートを用いた。ペプチドへ反応するポジティブコントロール抗体としてHuman GDF15 ELISA Kit（R&D Systems、DY957）の検出抗体（表９）を、ネガティブコントロール抗体としてHuman IgG1 Isotype control (Abcam、ab206198)を用いた。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
2　　　　　　結果
　図４に示すように、ポジティブコントロール抗体である抗hGDF15ポリクローナル抗体は、2種類のペプチドおよびhGDF15のいずれにも反応した。これに対し、HuMAB2はhGDF15にのみ反応し、2種類の合成ペプチドに対してはネガティブコントロール抗体であるHuman IgG1 Isotype control（hIgG1）と同様に反応を示さなかった。この結果から、HuMAB2のhGDF15のエピトープへの結合には、周辺の配列または立体構造が重要であることが示唆された。
G. CDR中のアミノ酸置換によるHuMAB2変異体のhGDF15への結合
1　　　　　　試験材料および方法
試験系
細胞
1) 細胞株名：ExpiCHO
2) 由来：チャイニーズハムスター
3) 細胞入手先：Thermo Fisher Scientific（A29127）
4) 培養液：ExpiCHO expression medium
5) 培養液入手先：Thermo Fisher Scientific（A2910001）

抗体発現ベクター
1) ベクター名：pcDNA-3.1
2) cDNA由来：全合成
3) 入手先：Thermo Fisher Scientific

リコンビナントタンパク質
1) タンパク質名：ヒトGDF15 (hGDF15) 
2) 由来：CHO細胞
3) 入手先：R&D systems （957-GD-025/CF）
試験方法
発現ベクターのデザイン
　HuMAB2とhGDF15の結晶構造解析から得られた情報から、抗体と抗原の結合境界面に並ぶアミノ酸をパラトープとエピトープとし、HuMAB2の重鎖または軽鎖にアミノ酸変異を挿入した発現ベクターをデザインした。表１３に変異抗体の一覧を示す（改変したアミノ酸を下線で示す）。重鎖および軽鎖とも、N末端からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で並んでいる。
発現ベクターの細胞導入
　24ウェルプレートにCHO細胞を播種し、翌日、表１３の変異抗体の発現ベクターを重鎖および軽鎖で組み合わせてTransIT-CHO kit (Takara、V2170) にて遺伝子導入した。5日後上清をすべて回収して、使用まで-20℃設定の冷凍庫で保存した。
hGDF15に対する結合量の測定
　96ウェルプレートに100 μLのhGDF15溶液 (0.4 μg/ml) を加え、翌朝まで4℃にて静置し、ELISAプレートを作成した。1%BSAを加え、1時間ブロッキングを行い、変異抗体を含む培養上清は30倍希釈から希釈系列（希釈倍率の公比3）を作製して、ELISAプレートに100 μLずつ添加し、2時間静置した。2次抗体として、HRP複合抗ヒトIgG抗体（Gene Tex、GTX26759）（20000倍希釈）を添加し、1時間静置した。発色反応はTMB (Sigma、 T-0440) を使用し、反応停止液は2規定の硫酸を使用した。吸光度は450nmを測定した。
OCTETを用いた抗体濃度の測定
　培養上清中の抗体濃度は、生体分子間相互作用解析システムであるOCTET QKe (Pall ForteBio) にて測定した。センサーチップにはProtein L (Pall ForteBio、18-5085) を、センサーチップの再生液には10 mM Glycine (pH1.1) を、洗浄液にはForteBio Sample Diluent (Pall ForteBio、18-1048 ) をそれぞれ使用した。スタンダードには、IgG from human serum regent grade (Sigma-Aldrich、I12511-10MG) を50 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、および0.1 mg/mLで使用し、測定する培養上清はSample Diluent (Pall ForteBio、18-1104) にて2倍希釈して使用した。測定プログラムは、センサーチップの再生を5秒と洗浄に5秒を3サイクル繰り返したのち、抗体濃度測定を120秒で設定した。
HuMAB2との結合量の比較
　抗体5 ng/mLにおけるヒトhGDF15に対する結合量をエクセル上で計算し、HuMAB2のhGDF15への結合量を100とした際の、各変異抗体の結合量を相対値で表した。3回の独立した試験をおこない平均値±標準誤差を求めた。変異を入れた事によって抗体が発現しなくなった抗体の結合量は0とした。結果を図５Ａ～Ｄに示す。
2　　　　　　結果
　相対結合量がHuMAB2の1.5倍以上を示した抗体が5種類見出せた。一方、50%以下の結合量の低下が30種類で観察された。図５Ａの「H鎖改変抗体1/2」には「H50S-L7」の結果が2つ示されているが、これらは培養およびELISAにおけるウェル間誤差の確認のために置いた同一のベクターによる結果である。2つともが同定度の値である事から安定した試験系であることが示された。
　重鎖変異抗体であるH48S-L7、H83R-L7、およびH120F-L7、軽鎖変異抗体であるH3-L48KおよびH3-L112Dでは、HuMAB2に比べ結合力が約1.5倍上昇していた。一方、HuMAB2の軽鎖の111番目のグリシン（111G）の変異体および114番目のロイシン（114L）の変異体はいずれも結合量の低下が認められたことから、これらのアミノ酸がhGDF15への結合およびHuMAB2のCDR配列の構造維持に重要な部位であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
II. 薬理試験
A. 血中hGDF15の捕捉
1　　　　　　試験材料および方法
動物
1)　　　　　　種/系統：mouse/ BALB-c Slc-nu/nu
2)　　　　　　微生物学的グレイド：specific pathogen-free (SPF)
3)　　　　　　入手先：日本エスエルシー
4)　　　　　　性：雌
5)　　　　　　週齢：6週齢（hGDF15、抗体投与時）
6)　　　　　　飼育条件
　　　　　　　下記の条件に設定された環境下で、動物の飼育を行う。
　　　　　　　a) 温度： 23±2℃
　　　　　　　b) 湿度： 60±10%
　　　　　　　c) 照明： 照明時間：午前7時～午後7時
　　　　　　　          消灯時間：午後7時～午前7時
　　　　　　　d) 餌及び水：自由摂取、CRF-1（オリエンタル酵母(株)）、水道水

　本試験に使用された動物は、「大塚製薬株式会社 動物実験指針」に従って取り扱われた。
試験スケジュール
　表１４に抗体投与日を0日とした試験スケジュールを示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
動物の飼育方法
　搬入日から3日後にマウスを個別のケージに分けた。個別飼育に対する馴化のため、群分けまでの馴化期間を5日間とした。
群分け
　体重をもとに、1群6匹ずつ、計6群に実験データ収集処理システム（SAS institute Japan、R9.3）にて群分けを行った。
抗hGDF15抗体の投与
　rhGDF15、HuMAB2抗体、およびMAB17抗体は、10 mL/kgで腹腔内投与した。対照群にはDulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)を10 mL/kgで投与した。群構成を表１５に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
体重及び摂餌量の測定
　体重及び摂餌量は、群分け日と投与0日、1日、2日、3日後に測定を行った。
採血・解剖
　採血は、抗体投与後3日目に、イソフルラン吸入で麻酔したマウスの下大静脈より行った。EDTA2Kの採血管を用いて血漿とし、使用まで-80℃設定の冷凍庫で保存した。採血後のマウスは、麻酔下のまま腹部下大静脈切開により放血安楽死させた。
血中非結合hGDF15濃度
　血中の抗体に結合していないhGDF15（非結合hGDF15）を測定するために、抗原抗体複合体を以下の手順で除去した。5 μL Protein A/G agarose beads（Thermo scientific、20421）と、50 μLのマウス血漿および145 μLのPBSとを混合し、4℃で2時間混和した。遠心分離後、上清を新しいエッペンチューブに移して、使用まで-80℃設定の冷凍庫で保存した。その後の血中GDF15測定は、GDF15測定ELISAキット（R&D systems、DY957）を使用し、手順はキットの説明書に準じた。検出限界以下の検体に関しては血中GDF15濃度を0 pg/mLとした。
統計解析方法
　血中非結合GDF15濃度に関しては、ウィルコクソンの順位和検定を行った。統計解析にはSAS software (SAS institute Japan、R9.3)を使用した。
2　　　　　　結果
　結果を図６に示す。hGDF15の血中濃度はrhGDF15の投与量に依存して増加し、MAB17およびHuMAB2ともに血中のGDF15を捕捉した。
B. 担癌マウスモデルの血中GDF15濃度の減少
1　　　　　　試験材料および方法
被験物質
・HuMAB2
・MAB1
・MAB13
対照物質
・MAB17
・MAB957　（R&D Systems）
・Hu01G06-127　（WO2014/100689）
被験物質および対照物質の調製
　すべての抗体をDPBSで1 mg/mLに調製し、投与日まで-80℃設定の冷凍庫に保存した。
試験系
細胞
1)　　　　　　細胞株名：MKN45
2)　　　　　　由来：ヒト胃がん
3)　　　　　　入手先：JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) cell bank
4)　　　　　　培養条件：37℃、5% CO2
培養液：RPMI1640
i)　　　　　　入手先：life technologies
b)　　　　　　血清：Fetal bovine serum
i)　　　　　　濃度：10%
ii)　　　　　　入手先：Tissue Culture Biology
動物
5)　　　　　　種/系統：mouse/ BALB-c Slc-nu/nu
6)　　　　　　微生物学的グレイド：specific pathogen-free (SPF)
7)　　　　　　入手先：日本エスエルシー
8)　　　　　　性：雌
9)　　　　　　週齢：7週齢（細胞移植時）
10)　　　　　　前記「A. 血中hGDF15の捕捉」に記載の環境下で、動物の飼育を行った。
群構成
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
試験方法
動物の飼育方法
　搬入日から3日後にマウスを個別のケージに分けた。個別飼育に対する馴化のため、MKN45を移植するまでの馴化期間を5日間とした。
細胞の調製と動物への細胞移植
　MKN45細胞は150 mmのシャーレで培養し、移植日に0.25%トリプシン-EDTA（SIGMA、T6689）処理にて細胞を回収し、遠心分離（1200rpm、5分）により上清を除去した。DPBSにて5 × 106 cells/mLになるように懸濁し、イソフルラン吸入で麻酔したマウスの腹部皮下に0.2 mL/body（1 × 106 cells/body）で移植した。
群分け
　試験1では、MKN45移植前に、42匹のマウスよりランダムに5匹を選び、Normal(vehicle)群とし、残り37匹にMKN45を移植した。MKN45移植から12日後に体重をもとに、1群5匹ずつ、計6群にSAS software（SAS institute Japan、R9.4）にて群分けを行い、MKN45(vehicle)群、MKN45(MAB17)群、MKN45(MAB957)群、MKN45(Hu01G06-127)群、およびMKN45(HuMAB2)群に割り当てた。同様にして、試験2でも、Normal(vehicle)群、MKN45(vehicle)群、MKN45(MAB17)群、MKN45(MAB1)群、およびMKN45(13)群に、1群5匹ずつ割り当てた。群分け後、余剰動物はイソフルラン麻酔下で放血安楽死させた。
DPBSおよび抗体の投与
　MKN45移植から14日後（群分けから2日後）に、DPBSおよび抗体（10 mL/kg）を腹腔内投与した。試験1では、抗体投与開始後7日目にもDPBSおよび抗体を投与した。
採血
　採血は、抗体投与開始後14日目（試験1）または7日後（試験2）に、イソフルラン吸入で麻酔したマウスの下大静脈より行った。EDTA2Kの採血管を用いて血漿とし、使用まで-80℃設定の冷凍庫で保存した。採血後のマウスは、麻酔下のまま腹部下大静脈切開により放血安楽死させた。
血中非結合hGDF15濃度
　血中の抗体に結合していないhGDF15（非結合hGDF15）を測定するために、抗原抗体複合体を以下の手順で除去した。5 μL Protein A/G agarose beads（Thermo scientific、 20421）と50 μLのマウス血漿、145μLのPBSを混合し、4℃で2時間混和した。遠心分離後、上清を新しいエッペンチューブに移して、使用まで-80℃設定の冷凍庫で保存した。その後の血中GDF15測定は、GDF15測定ELISAキット（R&D systems、DY957）を使用し、手順はキットの説明書に準じた。検出限界以下（62.5 pg/mL以下）の検体に関しては血中GDF15濃度を0 pg/mLとした。
統計解析方法
　抗体投与開始から14日目（試験1）または7日後（試験2）の血中非結合hGDF15濃度に対して、ウィルコクソンの順位和検定を行った。統計解析にはSAS software（SAS institute Japan、R9.4）を使用した。
2　　　　　　結果
　試験1において、MKN45細胞を移植したMKN45群の血中hGDF15濃度は、約2000 pg/mLであった。MKN45細胞を移植したモデルマウスに抗体を投与した群では、MAB17、MAB957、Hu01G06-127抗体投与群では、溶媒投与群に比べ血中hGDF15濃度の上昇が観察された。一方、HuMAB2投与群では、血中hGDF15濃度は減少していた（図７）。
　試験2において、溶媒投与群の血中hGDF15濃度を100とした場合の相対値を表１８に示す。HuMAB2と同様に、MAB1およびMAB13によっても、血中hGDF15濃度の減少が観察された。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　上記の結果は、リコンビナントhGDF15を投与した試験（図６）でのMAB17の結果とは異なるものであった。この原因の一つとして、HuMAB2と試験に用いた他の3つの抗体とのエピトープの違いがあげられる。hGDF15は、プロhGDF15がタンパク質分解酵素により切断されることで産生される（A.R.Bauson et al.Cancer Res.2005; 65 (6):2320-2336）。HuMAB2は、この切断部位の近傍にエピトープが存在し、ここに結合することで、hGDF15の産生を抑制している可能性が考えられた。これまでに、ある抗CCL-2中和抗体（ABN912）がリウマチ患者の病態を改善せずに悪化させたことが報告されており、抗体の用量依存的に血中CCL-2濃度が上昇したことがこの悪化の原因の一つと考えられたことから、血中抗原濃度を減少させることの重要性が示唆されてきた（J.J.Haringman et al. Arthritis & Rheumatism 2006;54 (8):2387-2392）。このようなことから、HuMAB2のような血中GDF15量を減少させる抗GDF15抗体は、血中hGDF15を増加させる抗体よりも臨床上有用であることが期待される。
C. 担癌マウスモデルの悪液質症状の改善（1）
1　　　　　　試験材料および方法
1.1　　　　　　被験物質の調製
　HuMAB2をDPBSで1 mg/mLに調製し、投与日まで-80℃設定の冷凍庫に保存した。
1.2　　　　　　試験系
1.2.1　　　　細胞
1)　　　　　　細胞株名：MKN45
2)　　　　　　由来：ヒト胃がん
3)　　　　　　入手先：JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) cell bank
4)　　　　　　培養条件：37℃、5% CO2
a)　　　　　　培養液：RPMI 1640
i)　　　　　　入手先：life technologies
b)　　　　　　血清：Fetal bovine serum
i)　　　　　　濃度：10%
ii)　　　　　　入手先：Tissue Culture Biology
1.2.2　　　　動物
1)　　　　　　種/系統：mouse/ BALB-c Slc-nu/nu
2)　　　　　　微生物学的グレイド：specific pathogen-free (SPF)
3)　　　　　　入手先：日本エスエルシー
4)　　　　　　性：雌
5)　　　　　　週齢：7週齢（細胞移植時）
6)　　　　　　飼育条件
下記の条件に設定された環境下で、動物の飼育を行う。
a)　　　　　　温度： 23 ± 2℃
b)　　　　　　湿度： 60 ± 10%
c)　　　　　　照明： 照明時間：午前7時 ～ 午後7時
  　　　　　　       消灯時間：午後7時 ～ 午前7時
d)　　　　　　餌及び水：自由摂取、CRF-1（オリエンタル酵母(株)）、水道水

　本試験に使用された動物は、「大塚製薬株式会社 動物実験指針」に従って取り扱われた。
1.2.3　　　　群構成
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
1.3　　　　　　試験方法
1.3.1　　　　試験スケジュール
　表２０に抗体投与日を0日とした試験スケジュールを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
1.3.2　　　　動物の飼育方法
　搬入日から3日後にマウスを個別のケージに分けた。個別飼育に対する馴化のため、MKN45移植するまでの馴化期間を5日間とした。
1.3.3　　　　細胞の調製と動物への細胞移植
　MKN45細胞は150 mmのシャーレで培養し、移植日に0.25%トリプシン-EDTA（SIGMA、 T6689）処理にて細胞を回収し、遠心分離（1200rpm、5分）により上清を除去した。DBPSにて5 × 106 cells/mLになるように懸濁し、イソフルラン吸入で麻酔したマウスの腹部皮下に0.2 mL/body（1 × 106 cells/body）で移植した。
1.3.4　　　　群分け
　MKN45移植前に、32匹のマウスよりランダムに8匹を選び、Normal群とし、残り24匹にMKN45を移植した。MKN45移植から12日後に体重をもとに、1群8匹ずつ、計2群に実験データ収集処理システム（EDCS、ver.2.1）にて群分けを行い、MKN45群とHuMAB2群に割り当てた。群分け後、余剰動物はイソフルラン麻酔下で放血安楽死させた。
1.3.5　　　　DPBSおよびHuMAB2の投与
　MKN45移植から14日後（群分けから2日後）にDPBSおよびHuMAB2を投与した。DPBSおよびHuMAB2は10 mL/kgで腹腔内投与した。
1.3.6　　　　体重及び摂餌量の測定
　体重及び摂餌量は、MKN45移植日から抗体投与日まで3日毎に測定した。抗体投与日からは投与0日、2日、4日、7日後に測定を行った。
1.3.7　　　　採血・解剖
　採血は、抗体投与後7日目に、イソフルラン吸入で麻酔したマウスの下大静脈より行った。EDTA2Kの採血管を用いて血漿とし、使用まで-80℃設定の冷凍庫で保存した。採血後のマウスは、麻酔下のまま腹部下大静脈切開により放血安楽死させた。腫瘍は、腫瘍部の皮膚を切開し、手術用ハサミを用いて採取して、重量を測定した。
1.4　　　　　　統計解析方法
　抗体投与7日後の体重および腫瘍重量、抗体投与日から7日目までの累積摂餌量に関しては、Normal群とMKN45群、MKN45群とHuMAB2群のそれぞれに対し対応のないt検定を行った。血中非結合GDF15濃度に関しては、ウィルコクソンの順位和検定を行った。統計解析にはSAS software (SAS institute Japan、R9.3) を使用した。
2　　　　　　結果
　担癌（MKN45細胞移植）マウスを用いて、がん性悪液質の症状である体重および摂餌量の変化に対するHuMAB2の効果を検討し、血中非結合GDF15量への影響も検討した。図８に体重の推移と、抗体投与後7日間の累積摂餌量、抗体投与7日後の血中非結合GDF15濃度を示す。抗体投与7日後の体重はNormal群と比較して、MKN45群は4 g程度減少し、MKN45細胞の移植により有意な体重減少が認められた（P<0.01）。一方、HuMAB2群では抗体の投与後に体重減少の回復が観察され、MKN45群と比較して有意な体重の増加が認められた（P<0.01）。同様に抗体投与後7日間の累積摂餌量に関しても、MKN45群では有意に減少し（P<0.01）、HuMAB2群ではMKN45群と比較して有意な増大が認められた（P<0.01）。血中非結合GDF15濃度は、Normal群では検出されなかったが、MKN45群で1500 pg/mL程度まで有意に上昇し（P<0.01）、図７の結果と同様に、HuMAB2群では20分の1程度にまで有意に減少していた（P<0.01）。これらの結果から、MKN45移植マウスの悪液質様症状（体重減少、摂餌量）はHuMAB2の投与によって回復する事が確認できた。
D. 担癌マウスモデルの悪液質症状の改善（2）
1　　　　　　試験材料および方法
1.1　　　　　　被験物質の調製
　HuMAB2をDPBSで1 mg/mLに調製し、投与日まで-80℃設定の冷凍庫に保存した。
1.2　　　　　　試験系
1.2.1　　　　細胞
1)　　　　　　細胞株名：MKN45
1)　　　　　　由来：ヒト（ヒト胃がん組織）
2)　　　　　　入手先：JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources)
3)　　　　　　培養条件：37℃　5% CO2　前培養条件：37℃　5% CO2
a)　　　　　　培養液：RPMI1640
i)　　　　　　入手先：life technologies
b)　　　　　　血清：Fetal bovine serum
i)　　　　　　濃度：10%
ii)　　　　　　入手先：Tissue Culture Biology
1.2.2　　　　動物
1)　　　　　　種/系統：マウス/ BALB-c Slc-nu/nu
2)　　　　　　微生物学的グレイド：specific pathogen-free (SPF)
3)　　　　　　入手先：日本エスエルシー
4)　　　　　　性：雌
5)　　　　　　週齢：6-12週齢
6)　　　　　　飼育条件
下記の条件に設定された環境下で、動物の飼育を行った。
a)　　　　　　温度： 23 ± 2℃
b)　　　　　　湿度： 60 ± 10%
c)　　　　　　照明： 照明時間：午前7時 ～ 午後7時
  　　　　　　       消灯時間：午後7時 ～ 午前7時
d)　　　　　　餌及び水：自由摂取（試験1のPair-feeding群は毎日規定量を給餌）、CRF-1（オリエンタル酵母(株)）、水道水

　本試験に使用された動物は、「大塚製薬株式会社 動物実験指針」に従って取り扱われた。
1.2.3　　　　群構成
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
1.3　　　　　　試験方法
1.3.1　　　　モデルの作製・群分け・抗体の投与
　まず、Normal群として5匹をランダムに選び出した。悪液質モデル作製は上記Cに記載のとおり行い、抗体は腹腔内投与した（図９）。
1.3.2　　　　自発運動量の測定
　自発運動量の測定は、ケージ内にワイヤレスランニングホイール（ブレインサイエンスイデア社、ENV-044）を設置して、ランニングホイールの回転数を自発運動量として測定した。測定値は明期（午前7時から午後7時まで）と暗期（午後7時から午前7時まで）の12時間ごとに集計した。
1.4　　　　　　評価項目
・　　　　　　体重
・　　　　　　自発運動量
1.5　　　　　　統計解析方法
　群分けに関しては、体重を指標とした一次元で行った。群分けと検定に関してはSAS software (SAS institute Japan、R9.3) を使用した。
2　　　　　　結果
　GDF15によって誘導される悪液質様症状を評価するために、ケージ内にランニングホイールを入れて自発運動量を測定した。図９に試験スケジュールを示す。Normal群に比べ、MKN45群では活動量が10分の1程度にまで減少していた。この活動量の減少は、HuMAB2投与後3日程度でほぼNormal群と同等程度に回復する事が明らかとなった。また、MKN45群では、活動量の減少だけでなく、活動パターンにも相違があることが判明した。Normal群では、暗期に活発になり、明期に活動性が低下する夜行性動物の特徴が観察されているが、MKN45群では、その活動パターンが明らかに逆転していた。そして、抗体を投与されたHuMAB2群では、そのパターンもNormal群と同様に回復していた。

Claims (17)

  1. 　DHCPLGPGRCCRLH（配列番号３）のアミノ酸配列を含むhGDF15のエピトープに結合する、抗hGDF15抗体。
  2. 　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
    　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
    　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
    　を含む重鎖可変領域、および、
    　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、または前記CDR1のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR1、
    　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR2、または前記CDR2のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR2、および
    　配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR3、または前記CDR3のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列からなるCDR3
    　を含む軽鎖可変領域
    　を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 　配列番号１８のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
    　配列番号１９のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
    　配列番号２０のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
    　を含む重鎖可変領域、および、
    　配列番号２１のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR1、
    　配列番号２２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR2、および
    　配列番号２３のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列において１～３個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含むCDR3
    　を含む軽鎖可変領域
    　を含む、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 　配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR1、
    　配列番号１９のアミノ酸配列を含むCDR2、および
    　配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR3
    　を含む重鎖可変領域、および、
    　配列番号２１のアミノ酸配列を含むCDR1、
    　配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR2、および
    　配列番号２３のアミノ酸配列を含むCDR3
    　を含む軽鎖可変領域
    　を含む、請求項１～３のいずれかに記載の抗体。
  5. 　配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3、および配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。
  6. 　配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
    　配列番号９のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸残基改変されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    　を含む、請求項１～５のいずれかに記載の抗体。
  7. 　配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～６のいずれかに記載の抗体。
  8. 　hGDF15との結合について、請求項１～７のいずれかに記載の抗体と競合する、抗hGDF15抗体。
  9. 　配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗hGDF15抗体と競合する、請求項８に記載の抗体。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  12. 　請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
  13. 　請求項１～９のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
  14. 　GDF15に関連する疾患または症状を処置するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　GDF15に関連する疾患または症状が、がんである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　GDF15に関連する疾患または症状が、悪液質である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 　悪液質が、がん悪液質である、請求項１６に記載の医薬組成物。
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