KR20210070323A

KR20210070323A - 인간 pd-l1 항체

Info

Publication number: KR20210070323A
Application number: KR1020217012703A
Authority: KR
Inventors: 레이 팡; 위엔위엔 양; 젱이 왕; 빙시 궈; 페이페이 취
Original assignee: 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2020-04-26
Publication date: 2021-06-14
Also published as: IL281397A; SG11202103000WA; CN112996815A; AU2020261961A1; WO2020216379A1; AU2020261961B2; EP3833691A1; ZA202101523B; BR112021005365A2; EP3833691A4; JP2022511311A; CN112996815B; IL281397B; EA202190495A1; CA3112681A1; US20210309747A1; MX2021004897A; US11208486B2; JP7212990B2

Abstract

완전한 인간 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 다양한 예에서, 항체 또는 그것의 단편은 각각 서열 번호:35-42, 서열 번호:43-51, 서열 번호:52-66, 서열 번호:67-79, 서열 번호:80-88 및 서열 번호:89-102의 서열 군으로부터 선택된 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3, 또는 그것들 각각의 변이체를 포함한다. 암 및 감염성 질환과 같은 질환을 치료하고 진단하기 위해 항체 또는 그것의 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

인간 PD-L1 항체

완전한 인간 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편이 제공된다.

분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)로도 알려져 있는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1)에 특이적인 항체는 암 치료 및 다른 임상적 용도에 사용되고 있다. PD-L1은 특정 이벤트, 예컨대 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질환 및 다른 질환 상태, 예컨대 간염 동안 면역 시스템을 억제하는데 주요 역할을 하는 것으로 생각되는 40kDa 1형 막관통 단백질이다. PD-1 또는 B7.1로의 PD-L1의 결합은 림프절에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키고 상기 PD-1에 보충적으로 림프절에서 유전자 Bcl-2의 하위 조절에 의해 추가로 매개되는 아폽토시스(apoptosis)를 통해 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 제어할 수 있는 억제 신호를 전송한다.

암의 치료에 더하여, PD-L1 억제는 또한 감염성 질환을 치료하는데 유망한 것으로 나타냈다. 세포내 감염의 마우스 모델에서, 리스테리아 모노시토게네스(L. monocytogenes)는 T 세포, NK 세포, 및 대식세포에서 PD-L1 단백질 발현을 유도하였다. PD-L1 차단 (예를 들어, 차단 항체를 사용하여)은 감염된 마우스에 대한 사망률을 증가시켰다. 차단은 대식ㅅ포에 의한 TNFα 및 질소 산화물 생산을 감소시키고, NK 세포에 의한 그랜자임 B 생산을 감소시키고, 리스테리아 모노시토게네스 항원-특이적 CD8 T 세포 (CD4 T 세포가 아니라)의 증식을 감소시켰다. 이 증거는 PD-L1이 세포내 감염에서 양성 동시 자극 분자의 역할을 한다는 것을 시사한다.

본 개시물은 인간 PD-L1 단백질에 대해 높은 결합 친화도를 가진 항-PD-L1 항체를 제공하고 PD-L1과 그것의 수용체 PD-1 사이의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다. 확인된 항체는 완전한 인간 항체이고 임상적 사용에서 인간화된 항체보다 개선된 성능을 나타낼 것으로 예상된다.

본 개시물의 한 구체예는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 제공한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 서열 번호:35-42로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR1, 서열 번호:43-51로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR2, 서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR3, 서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR1, 서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR3을 포함한다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:46, 135, 136, 137, 142 또는 143의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, VH CDR2는 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함한다.

예시의 항체 또는 단편에서, VH는 서열 번호:23, 124, 126, 127, 128, 또는 140의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호:24 또는 125의 아미노산 서열을 포함할 뿐 아니라, 그것들의 변이체도 포함한다. 예를 들어, VH는 서열 번호:124의 아미노산 서열 또는 서열 번호:124에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제1 아미노산 서열 (나열된 CDR을 유지하면서)을 포함하고, VL은 서열 번호: 125의 아미노산 서열 또는 서열 번호:125에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제2 아미노산 서열 (나열된 CDR을 유지하면서)을 포함한다.

또한 항체 또는 그것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포가 제공된다.

치료 방법 및 용도가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암 또는 감염을 치료하는 방법이 제공되며, 환자에게 본 개시물의 항체 또는 그것의 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 고체 종양이다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 간암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 결장직장암, 두경부암, 편평세포암, 메르켈 세포(Merkel cell) 암종, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 방법은 환자에게 제2 암 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 균류 감염 또는 기생충에 의한 감염이다.

도 1은 테스트된 항체의 PD-L1 결합 프로파일을 나타낸다.
도 2는 PD1/PDL1 매개된 NF-AT-루시퍼라제 활성의 차단에 있어서 항체의 활성을 나타낸다.
도 3은 모든 테스트된 항체가 PD1/PDL1 매개된 NF-AT-루시퍼라제 억제를 용량-의존적으로 반전시킨다는 것을 나타낸다.
도 4는 돌연변이 항체에 대한 기능적 테스트 결과를 나타낸다.
도 5는 테센트리크 및 아벨루맙와 비교하여 B12-01의 세포-기반 친화도 테스트 결과를 나타낸다.
도 6은 B12-01이 PD-L1에 대해 나노몰 미만의 친화도를 가진다는 것을 나타낸다.
도 7은 B12-01이 인간 PD-L1 및 cyno PD-L1에 대해 비슷한 결합 능력을 가진다는 것을 나타낸다.
도 8은 B12-01이 세포-표면 PDL1로의 PD1 단백질의 결합을 효과적으로 차단한다는 것을 나타낸다.
도 9는 B12-01이 시험관 내에서(in vitro) 인간 T 세포 활성화를 크게 촉진한다는 것을 나타낸다.
도 10은 종양 성장의 억제에 있어서 B12-01의 생체 내(in vivo) 효능을 나타낸다.

정의

용어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"의 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 나타낸다는 것을 주의해야 하며; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나" (또는 "하나), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대해 특정 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 서열을 비교할 때 염기 (또는 아미노산)의 퍼센트가 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기재된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 하나의 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 파라미터를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음 기본 파라미터를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 기준 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-환원성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 명시된 퍼센트 상동성을 가지며 같거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.

용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 그것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 특정 정도의 상동성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 나타낸다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 보체에 대해 특정 정도의 상동성을 가진 뉴클레오타이스 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체에 혼성체화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 특정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드를 나타낸다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가, 결실, 치환 및 그것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염 다리(salt-bridge))를 유지한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 그것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 나타낸다. 항체는 전체 항체 및 그것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 결합하는 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그것들의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 그것들의 일부, 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 스피겔머(spiegelmer), 및 디아바디(diabody)를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.

"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L)의 가변 영역의 융합 단백질을 나타낸다. 일부 양태에서, 영역은 10 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드와 연결된다. 링커는 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, V_H의 N-말단을 V_L의 C-말단과 연결할 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. ScFv 분자가 해당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019에 기재되어 있다.

용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 광범위한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파, 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)로 분류되며 그것들 중에서 일부 하위 분류 (예를 들어, γ1-γ4)를 갖는다는 것을 인정할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것이 이 사슬의 특징이다. 면역글로불린 하위 분류 (아이소타입(isotype)), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgG₅, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 본 개시물을 고려하여 이들 분류 및 아이소타입 각각의 변형된 버전은 당업자에게 쉽게 식별 가능하며, 따라서, 본 개시물의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 분명하게 본 개시물의 범위 내에 있으며, 다음의 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류와 관련이 있을 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 대략 23,000 달톤(Dalton)의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 "Y" 구성형태로 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역까지 계속되는 중쇄를 괄호로 묶었다.

본 개시물의 항체, 그것의 항원-결합 폴리펩타이드, 변이체, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 연결된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-이디오타입(idiotype) (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시물의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위 분류일 수 있다.

"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖다"는 일반적으로 항체가 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체가 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 항원-결합 도메인을 통해 하나의 에피토프에 결합할 때 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대하여 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방 또는 방지 수단 둘 다를 나타내며, 목적은 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 예방하거나 둔화시키는 (약화시키는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능한지 여부에 관계없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 병태 또는 장애에 걸린 것들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 것들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 경작용 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 암소, 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은, 예를 들어, 검출, 진단 절차 및/또는 치료에 사용된 본 개시물의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.

항-PD-L1 항체

본 개시물은 인간 PD-L1 단백질에 대해 높은 친화도를 가진 항-PD-L1 항체, 특히 완전한 인간 항체 및 단편을 제공한다. 테스트된 항체는 강력한 결합 및 억제 활성을 나타내고 치료 및 진단 용도에 유용하다.

실험예에서 입증된 바와 같이, B01-B17을 포함한 많은 완전한 인간 항-PD-L1 항체가 파지 라이브러리로부터 얻어졌다. 이들 항체 중 일부는 훌륭한 결합 활성을 나타냈다. 예를 들어, B04, B05, B06, B07, B10, B11, B12, B13, B14 및 B16은 PD1/PD-L1 매개된 NFAF-루시퍼라제 활성을 용량 의존적으로 차단할 수 있다. 그것들 중에서, B06, B12 및 B16기 가장 강력했다.

본 개시물의 항체는 시판 중인 그리고 임상 개발 중인 기존의 제품과 유리하게 비교된다. 사용된 참조 항체는 IgG1 아이소타입의 완전한 인간화된 Fc-조작된 단클론성 항체인 아테졸리주맙 (Tecentriq™), 및 완전한 인간 단클론성 항체인 아벨루맙 (Bavencio™)을 포함한다. 아테졸리주맙은 전이성 비-소세포 폐암 (NSCLC), 확장기 소세포 폐암, 및 삼중-음성 유방암의 치료에 대해 승인되었다. 아벨루맙은 미국과 유럽에서 메르켈-세포 암중의 치료에 대해 승인되었다. 아테졸리주맙 및 아벨루맙은 현재 시판 중인 가장 중요한 PD-L1 항체이다.

실시예 1에서 나타난 바와 같이, B07, B12, B13 및 B16을 포함한 상당수의 테스트된 항체가 아테졸리주맙보다 더 높은 (또는 적어도 열등하지 않은) PD-L1 결합 친화도를 나타냈다 (도 1). B12의 변이체, B12-01은 아테졸리주맙 및 아벨루맙과 비교하여 추가로 테스트되었다. B12와 비교하여, B12-01은 VH의 C-말단에서 세린 치환을 갖고 VL의 N-말단에서 통상적인 DIQM 스트레치(DIQM stretch)를 갖는다.

실시예 5에서 나타난 바와 같이, 세포-기반 친화도 검정에서, B12-01은 아테졸리주맙 및 아벨루맙 둘 다를 능가하였다 (도 5). B12-01이 아테졸리주맙보다 더 강력하다는 것은 놀라운 일인데 아테졸리주맙보다 나중에 개발된 아벨루맙이 아테졸리주맙보다 덜 강력한 것으로 공지되어 있기 때문이다 (그리고 본원에서 입증되었기 때문이다).

또한 실시예 5에서, 발달 가능성 검정에서, B12-01은 아테졸리주맙보다 더 높은 친수성을 나타냈으며, B12-01이 더 높은 수용성을 가진다는 것을 시사한다. 그러므로, 이러한 B12-01의 특징은 제제 개발 중에 더 높은 유연성을 발생시킨다. 또한, 실시예 7에서 나타난 바와 같이, B12-01은 동물 모델에서 전임상 연구 중에 유리한 cyno PD-L1에 대한 교차 종 반응성을 갖는다.

그러므로, 본 개시물의 한 구체예에 따르면, 이들 새롭게 확인된 항체의 CDR 영역을 포함하는 항체가 제공된다. 이러한 CDR 서열은 하기 표 A에서 나열된다.

항체 활성을 유지하거나 개선할 수 있는 이들 CDR 서열 사이에서 작은 변화 (예를 들어, 하나의 아미노산 추가, 결실 또는 치환)가 디자인될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 변형된 CDR 서열은 CDR 변이체라고 불린다.

실시예 4에서 입증된 바와 같이, 테스트된 CDR 변이체 모두를 가진 돌연변이 항체는 원래의 항체와 비슷한 활성을 나타낸다. 따라서, 이들 CDR 변이체가 또한 본 개시물의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 변이체는 D>E, S>A, G>A, N>Q, DS>ES, DS>DA, DG>DA, NS>NA, 또는 NS>QS와 같은 치환 중 하나 이상을 갖는다. 일부 예가 하기 제공된다.

한 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:35-42로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:132)를 포함하는 VH CDR1, 서열 번호:43-51로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:133-137 및 143-144)를 포함하는 VH CDR2, 서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR3, 서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR1, 서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR2, 그리고 서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:138-139)를 포함하는 VL CDR3을 포함한다.

일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:35-42로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:132와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:43-51로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:133-137 및 143-144와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

일부 구체예에서, CDR 서열은 B04, B05, B06, B07, B10, B11, B12, B13, B14 또는 B16으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:37-38 및 40으로부터 선택된 아미노산 (또는 서열 번호:132와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:45-47 및 49로부터 선택된 아미노산 (또는 서열 번호:133-137 및 143-144와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:54-58 및 61-64로부터 선택된 아미노산을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:67, 70-73 및 75-77로부터 선택된 아미노산을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:80, 83-84 및 86으로부터 선택된 아미노산을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:89, 91-94, 96-99 및 101로부터 선택된 아미노산 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

일부 구체예에서, CDR 서열은 B06, B12 또는 B16으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:37-38로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:132와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:46-47로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:133-137 및 143-144와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:57 및 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:71-72 및 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:93, 97 및 101로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

본 개시물의 항체 또는 단편의 CDR 서열은 표 A에서 나열된 바와 같이 B01-B17의 특정 항체로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, VH CDR1은 서열 번호:35일 수 있고, VH CDR2는 서열 번호:45일 수 있고, VH CDR3은 서열 번호:55일 수 있고, VL CDR1은 서열 번호:70일 수 있고, VL CDR2는 서열 번호:83일 수 있고, VL CDR3은 서열 번호:92 (예를 들어, B01)일 수 있다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:1의 VH 및 서열 번호:2의 VL을 포함한다. 다른 CDR 서열 및 VH/VL 서열은 표 A 및 표 1에서 제공된다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:38의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:132와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:47의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:133-134와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:93의 아미노산 서열 (예를 들어, B06)을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:11의 VH (또는 서열 번호:121-123과 같은 변이체) 및 서열 번호:12의 VL을 포함한다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:46의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:135-137 또는 143-144와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열 (예를 들어, B12)을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:23의 VH (또는 서열 번호:124, 126 및 127과 같은 변이체) 및 서열 번호:24의 VL (또는 서열 번호:125와 같은 변이체)을 포함한다.

본 개시물의 한 구체예는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하는데, 항체 또는 그것의 단편은 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, VH는 서열 번호:124의 아미노산 서열 또는 서열 번호:124에 대해 적어도 95% (또는 적어도 90%, 85%) 서열 동일성을 가진 제1 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 125의 아미노산 서열 또는 서열 번호:125에 대해 적어도 95% (또는 적어도 90%, 85%) 서열 동일성을 가진 제2 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:46의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:135-137 또는 143-144와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:101의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체) (예를 들어, B16)을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:31의 VH (또는 서열 번호:124, 127, 128, 및 130과 같은 변이체) 및 서열 번호:32의 VL (또는 서열 번호:129 및 131과 같은 변이체)을 포함한다.

표 A는 Kabat 시스템에 따른 CDR 서열을 제공한다. Chothia 시스템은 전형적으로 VH CDR1 및 CDR2에 대해 상이한 서열을 갖는다. 그것들은 하기 표 C에 나타나있다.

한 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:103-111로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:141)를 포함하는 VH CDR1, 서열 번호:112-120으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:142)를 포함하는 VH CDR2, 서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR3, 서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR1, 서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체 (예를 들어, 서열 번호:138-139)를 포함하는 VL CDR3을 포함한다.

일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호: 103-111로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:141과 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 112-120으로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:142와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

일부 구체예에서, CDR 서열은 B04, B05, B06, B07, B10, B11, B12, B13, B14 또는 B16으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:105-107 및 109로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:141과 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:114-116 및 118로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:142와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:54-58 및 61-64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:67, 70-73 및 75-77로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:80, 83-84 및 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:89, 91-94, 96-99 및 101로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

일부 구체예에서, CDR 서열은 B06, B12 또는 B16으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:106-107로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:141과 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:115-116으로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:142와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:57 및 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:71-72 및 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:93, 97 및 101로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체)을 포함한다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:107의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:141과 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:116의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:93 (예를 들어, B06)의 아미노산 서열을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:11의 VH (또는 서열 번호:121-123과 같은 변이체) 및 서열 번호:12의 VL을 포함한다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:115의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:142와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열 (예를 들어, B12)을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:23의 VH (또는 서열 번호:124, 126 및 127과 같은 변이체) 및 서열 번호:24의 VL (또는 서열 번호:125와 같은 변이체)을 포함한다.

한 구체예에서, VH CDR1은 서열 번호:106의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:115의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:142와 같은 변이체)을 포함하고, VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호:101의 아미노산 서열 (또는 서열 번호:138-139와 같은 변이체) (예를 들어, B16)을 포함한다. 대표적인 항체 또는 단편은 서열 번호:31의 VH (또는 서열 번호:124, 127, 128, 및 130과 같은 변이체) 및 서열 번호:32의 VL (또는 서열 번호:129 및 131과 같은 변이체)을 포함한다.

또한, 일부 구체예에서는, 인간 PD-L1에 결합하는데 있어서 본원에서 개시된 항체 중 어느 것과도 경쟁하는 항-PD-L1 항체 및 항원 결합 단편이 제공된다. 또한, 일부 구체예에서는, 본원에서 개시된 항체 중 어느 것과 동등한 에피토프에 결합하는 항-PD-L1 항체 및 항원 결합 단편이 제공된다. 또한, 일부 구체예에서는, 본원에서 개시된 항체의 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 그리고 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 항체 및 항원 결합 단편이 제공된다.

항체는 본원에서 개시된 바와 같이 그것들이 유래된 자연 발생한 결합 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사할 수 있는데, 예를 들어, 시작 서열에 대해 특정 퍼센트의 동일성을 가지며, 예를 들어, 시작 서열에 대해 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 항체 또는 단편은 지정된 CDR 서열을 유지한다.

특정 구체예에서, 항체는 일반적으로 항체와 회합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티(moiety)를 포함한다. 예시의 변형이 하기 더 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 본 개시물의 항체는 유연한 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수 있다.

항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체를 제조하는 방법

본 개시물은 또한 본 개시물의 항체, 그것의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수 있다. 추가적으로, 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수 있다.

항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며 본원에서 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역은 둘 다 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 해당 분야에 기재된 기술을 사용하여 그리고 본원에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원성 도전에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌가 비활성화된 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 (이것들은 그 전문이 참조로 포함됨)에서 기재되어 있다.

암 치료

본원에서 기재된 바와 같이, 본 개시물의 항체, 변이체 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다.

본 개시물은 본원에서 기재된 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자, 예컨대 동물, 포유동물, 및 인간에게 본 개시물의 항체를 투여하는 것을 수반하는 항체-기반 치료법과 더 관련이 있다. 본 개시물의 치료적 화합물은, 제한되는 것은 아니지만, 본 개시물의 항체 (본원에서 기재된 바와 같이 그것의 변이체 및 유도체를 포함함) 및 본 개시물의 항체 (본원에서 기재된 바와 같이 그것의 변이체 및 유도체를 포함함)를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 개시물의 항체는 또한 암을 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다. PD-L1은 종양 세포에서 과발현될 수 있다. 종양-유래된 PD-L1은 면역 세포 상의 PD-1에 결합하여 항종양 T-세포 면역력을 제한할 수 있다. 쥐 종양 모델에서 소분자 억제자, 또는 PD-L1을 표적화하는 단클론성 항체를 이용한 결과는 표적화된 PD-L1 요법이 중요한 대안이며 종양 성장의 효과적인 제어를 위한 현실적인 접근법임을 나타낸다. 실험예에서 입증된 바와 같이, 항-PD-L1 항체는 적응성 면역 반응 기작을 활성화시키며, 이것은 암 환자의 생존의 개선으로 이어질 수 있다.

따라서, 일부 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 환자에게 본 개시물의 항체의 유효량을 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 환자에서 암 세포 (예를 들어, 간질 세포) 중 적어도 하나는 PD-L1을 발현하거나, 과발현하거나, 또는 발현하도록 유도된다. 예를 들어, PD-L1 발현의 유도는 종양 백신 또는 방사선 요법의 투여에 의해 실행될 수 있다.

PD-L1 단백질을 발현하는 종양은 방광암, 비-소세포 폐암, 신장암, 유방암, 요도암, 결장직장암, 두경부암, 편평세포암, 메르켈 세포 암종, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암을 포함한다. 따라서, 본원에서 개시된 항체는 하나 이상의 이러한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 개시물에서 제공된다. 본 개시물의 항-PD-L1 항체와 접촉된 (또는 대안으로 본 개시물의 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, 세포는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 유형 중 어느 것의 암을 가질 수 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)는, 제한 없이, 예를 들어, 종양-침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.

일부 구체예에서, 세포는 암 환자 자체로부터 단리되었다. 일부 구체예에서, 세포는 공여체에 의해 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치않는 면역 반응이 최소화될 수 있다.

본 개시물의 항체 또는 그것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수 있는, 세포 생존의 증가와 관련된 추가적인 질환 또는 병태는악성 종양 및 관련된 장애, 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (골수아구성, 전골수성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병을 포함함)) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프성 백혈병)을 포함함), 진성다혈구증, 림프종 (예를 들어, 호지킨 병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 고분자글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병, 및 제한되는 것이 아니라, 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 자궁내막암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간 종양(hepatoma), 담관 암종, 융모 암종, 정상피종(seminoma), 태생성 암종, 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아종을 포함하는 고체 종양의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 그것에 제한되지 않는다.

감염의 치료

실험예에서 입증된 바와 같이, 본 개시물의 항체는 면역 반응을 활성화시킬 수 있으며 이것은 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.

감염은 질환 유발 물질에 의한 유기체의 신체 조직의 칩입, 그것들의 증식, 및 이들 유기체 및 그것들이 생산하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응이다. 감염은 바이러스, 비로이드(viroid), 프리온(prion), 박테리아, 선충(nematode), 예컨대 기생성 회충 및 요충, 절지동물, 예컨대 진드기(tick), 진드기(mite), 벼룩, 및 이(louse), 균류, 예컨대 백선(ringworm), 및 다른 대형 기생 생물, 예컨대 촌충 및 다른 기생충과 같은 감염원에 의해 유발될 수 있다. 한 양태에서, 감염원은 박테리아, 예컨대 그람 음성(Gram negative) 박테리아이다. 한 양태에서, 감염원은 바이러스, 예컨대 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 및 역전사 바이러스이다. 바이러스의 비-제한적 예는 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 시토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 8형, HIV, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 풍진 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-zoster virue)를 포함한다.

본 개시물의 항체는 또한 미생물과 면역 세포를 표적화하여 미생물의 제거에 영향을 미침으로써 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환을 치료하거나, 또는 미생물을 살해하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 미생물은 RNA 및 DNA 바이러스를 포함한 바이러스, 그람 양성(Gram positive) 박테리아, 그람 음성 박테리아, 원생동물 또는 균류이다.

임의의 특정 환자에 대한 특이적 투약량 및 치료 양생법은 사용된 특정 항체, 그것의 변이체 또는 유도체, 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 및 식단, 그리고 투여 시간, 배설률, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 심각도를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 의료 간병인에 의한 이러한 요인의 판단은 해당 분야의 기술 범위 내에 있다. 양은 또한 치료되는 개개의 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질환의 심각도, 및 원하는 효과에 따라 다를 것이다. 사용된 양은 해당 분야에 널리 공지된 약리학적 및 약물동역학적 원칙에 의해 결정될 수 있다.

항체, 변이체의 투여 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함한다. 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 투입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝(lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 창자 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구로, 낭내로, 질내로, 복강내로, 국소적으로 (분말, 연고, 안약 또는 경피 패치에 의한), 볼로, 또는 구강 또는 비강 스프레이로서 투여될 수 있다.

용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 투입을 포함하는 투여 방식을 나타낸다.

투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 본 개시물의 항체를 심실내 및 척추강내 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 심실내 주사는, 예를 들어, 레저버(reservoir), 예컨대 Ommaya 레저버에 부착된 심실내 카테터(catheter)에 의해 용이하게 될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저(nebulizer), 및 에어로졸화제가 들어있는 제제의 사용에 의한 폐 투여가 또한 이용될 수 있다.

본 개시물의 항체 폴리펩타이드 폴리펩타이드 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 지역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이것은, 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 수술 중 국소 투입, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 도포에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료이며, 실라스틱(sialastic) 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시물의 항체를 포함한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.

본 개시물의 항체, 그것의 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함하는, 감염성 질환 또는 악성 질환, 병태 또는 장애를 치료하기 위한 방법은 전형적으로 시험관 내에서 테스트된 다음, 인간에서 사용하기 전에, 허용 가능한 동물 모델의 생체 내에서, 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 테스트된다. 트랜스제닉 동물을 포함한 적합한 동물 모델은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 기재된 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘프렝 대한 항원-결합 폴리펩타이드의 효과는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 본원의 다른 곳에서 개시된 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 본 개시물에 따르면, 특이적 항원-결합 폴리펩타이드의 투여가 지시되는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 환자 조직 샘플이 배양 중에 성장하고, 화합물에 노출되거나 그렇지 않으면 화합물이 투여되며, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과가 관찰되는 시험관 내 세포 배양 검정을 포함한다.

진단 방법

PD-L1의 과발현은 특정 종양 샘플에서 관찰되고, PD-L1-과발현 세포를 가진 환자는 본 개시물의 항-PD-L1 항체로의 처리에 대해 반응성일 가능성이 크다. 따라서, 본 개시물의 항체는 또한 진단 및 예후 목적으로도 사용될 수 있다.

바람직하게는 세포를 포함하는 샘플은 환자로부터 얻어질 수 있으며, 환자는 암 환자 또는 진단을 요구하는 환자일 수 있다. 세포는 종양 조직 또는 종양 블록(block), 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 환자의 임의의 샘플의 세포일 수 있다. 샘플의 선택적인 전처리시, 샘플은 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 PD-L1 단백질과 상호작용할 수 있게 하는 조건 하에서 본 개시물의 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. ELISA와 같은 방법은 항-PD-L1 항체를 이용하여 샘플 내 PD-L1 단백질의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.

샘플 내 PD-L1 단백질의 존재 (선택적으로 양 또는 농도와 함께)는 환자가 항체로의 처리에 적합한지에 대한 지표로서, 또는 환자가 암 치료에 반응했는지 (또는 반응하지 않았는지)에 대한 지표로서 암의 진단에 사용될 수 있다. 예후 방법을 위해, 검출은 암 치료의 시작시 특정 단계에서 1회, 2회 또는 그 이상 실행되어 치료의 진행을 나타낼 수 있다.

조성물

본 개시물은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역체크포인트(checkpoint) 억제자)를 더 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물, 더 구체적으로는 인간에서 사용에 대하여 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 임의의 유형의 보조적인 제제일 것이다.

용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 나타낸다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등과 같이, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사용액으로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 장성 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해, 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량 바이알에 동봉될 수 있다.

한 구체예에서, 조성물은 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 또는 사세(sachette) 내에서 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 투입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 투입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.

실시예

실시예 1: 완전한 인간 나이브 파지 라이브러리 패닝 (panning) 및 스크리닝

이 실시예는 파지 라이브러리로부터의 완전한 인간 항-PD-L1 항체의 스크리닝을 나타낸다.

항원: 인간 PDL1 세포외 도메인 (ECD) avi-His-비오틴 라벨링된 단백질 (B3568B, Biointron).

완전한 인간 나이브 파지 라이브러리의 제조: 건강한 인간 대상체의 PBMC로부터 증폭된 항체 유전자 단편으로 이루어진 파지미드(phagemid) 벡터를 사용하여 파지 라이브러리를 구성하였다. 그것을 Fab 파지 라이브러리로서 구성하였다. 라이브러리 크기는 2 X 10¹¹이었다.

PDL1 ECD 단백질에 대한 파지 라이브러리 용액 패닝 . 파지 라이브러리는 먼저 BSA-코팅된 스트렙타비딘 Dynabead와 함께 인큐베이션하여 음성 스크리닝을 겪었다. 결과로 생성된 파지를 PDL1-ECD-avi-his-비오틴 단백질과 함께 인큐베이션하고 Kingfihser 마그네틱 비드 시스템에 의해 세척하였다. 바인더를 트립신으로 용출시켰다. 그 이후 용출된 파지 (산출물 1)를 항원에 결합하기 위한 역가에 대하여 테스트하였고 대장균(E. coli)와 함께 공동 배양하였다. 패닝 및 스크리닝을 3라운드 수행하였다. 산출물 2 및 산출물 3의 역가는 크게 증가하였다.

단일 클론을 산출물 2 및 3으로부터 선별한 다음 깊은 96웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 상층액는 IgG 농도 및 항원 결합 역가 평가를 받았다. 277개의 양성 클론을 선택하고 시퀀싱하였다. 서열 분석 후 128개의 고유한 서열을 확인하였다. 이들 클론들은 모두 ELISA 결합 분석을 받았다. 상위 17개의 서열이 확인되었으며 하기 표 참조. 상위 17개의 결합 서열이 확인되었으며 하기 표 1 참조.

실시예 2. PDL1 항체의 결합 성질 분석

17개의 고유한 클론을 특성화하고 전장 IgG로 전환시켰다. 그것들의 결합 성질을 재조합 인간 PD-L1 (Sino Biological, Cat#: 10084-H08H)로 검사하였다.

항원 결합 활성을 평가하기 위해서, 항체는 ELISA 테스트를 받았다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 4℃에서 밤새도록 PBS 중의 1 μg/ml, 100μl/웰의 인간 PD-L1 단백질로 코팅한 다음, 100μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작한 인간화된 항체의 4배 희석액을 각 웰에 추가하고 1-2시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG 항체와 함께 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 발달시키고 OD 450 nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 모든 항체가 인간 PD-L1에 대한 결합 효능을 나타냈다. 특히, B03, B04, B05, B06, B07, B10, B12, B13, B14 및 B16은 인간 PD-L1에 대한 훌륭한 결합을 나타냈다. 이들 바인더 중에서도, B04, B06, B07, B12 및 B16은 참조 항-PD-L1 항체인 Tecentriq® (아테졸리주맙)와 비슷하거나 그것보다 더 양호했다.

실시예 3. PDL1 항체의 세포 기반 기능적 분석

항-PDL1 항체가 T 세포 반응을 자극하는 능력을 테스트하기 위해, hPD-1-발현된 Jurkat 세포를 사용하였다. Jurkat은 TCR 자극시 NF-AT 활성화된 루시퍼라제 발현을 활성화시킬 수 있는 인간 T 세포 백혈병 세포주이다. 이 검정에서, 렌티바이러스에 의해 인간 PD-1 유전자로 트랜스펙션된 Jurkat 세포를 반응기 세포로 사용하였다. Raji-PD-L1 세포를 항원 제공 세포 (APC)로 사용하였다. 포도구균 장독소 (Staphylococcal Enterotoxin: SE)를 사용하여 TCR 신호를 자극한다. 이 시스템에서, 이소성으로 발현된 huPDL1은 Jurkat 세포에서 SE 자극된 NF-AT-루시퍼라제 활성을 억제할 수 있지만, 항-PDL1 항체는 NF-AT-루시퍼라제 활성을 반전시킬 수 있다.

요컨대, APC (2.5 Х 10⁴)를 SE 자극의 존재 하에 PD-1 발현 Jurkat T 세포 (1 Х 10⁵)와 공동-배양하였다. 배양 시작시 항-PDL1 항체를 추가하였다. 6 hr 이후, 결과로 생성된 세포를 루시퍼라제 활성에 대해 평가하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 항체 B04, B05, B06, B07, B10, B11, B12, B13, B14 및 B16은 PD1/PDL1 매개된 NF-AT-루시퍼라제 활성을 용량 의존적으로 차단하였다.

PDL1 차단 항체의 기능을 더 평가하기 위해서, 선택된 항체 (B04, B06, B07, B10, B12, B16)를 Jurkat PD1 검정에서 더 많은 용량으로 그 기능에 대해 추가로 평가하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 이들 항체는 모두 PD1/PDL1 매개된 NF-AT-루시퍼라제 억제를 용량 의존적으로 반전시켰다. 그것들 중에서도, B06, B07, B12 및 B16이 가장 강력한 항체였다.

실시예 4 . 번역 후 변형 ( PTM ) 제거 디자인

일반적으로 인간 항체 서열의 CDR 영역 내에 번역 후 변형 (PTM) 부위가 ㅈ존재한다. 서열 검사는 또한 DS 또는 DG에서 아스파르트산 (Asp)의 잠재적인 이성질체화 및 B06, B12 또는 B16 부위에서 탈아미드화 부위를 발견하였다. 이러한 아미노산 치환 (표 2) 중 일부를 제조하여 테스트하였다. 테스트된 서열은 또한 치료 항체 대하여 프레임 워크 영역에서 특정한 관습적인 변화, 예를 들어, VH의 C-말단에서 세린 및 VL의 N-말단에서 DIQM 신장부를 포함하였다.

T 세포 반응을 자극하도록 돌연변이된 항-PDL1 항체의 기능적 효능을 테스트하기 위해, hPD-1-발현된 Jurkat 세포 검정을 상기 기재된 바와 같이 사용하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 대표적인 돌연변이늠 모두 비슷한 기능적 효능을 나타냈으며, 항체에 대한 번역 후 변형의 가능성을 감소시키는데 있어서 이들 돌연변이의 유망함을 입증하였다.

실시예 5. 참조 항체에 대한 비교

B12의 변형된 변이체 중 하나인 B12-01을 대표로 사용하여 공지된 참조 PD-L1 항체와 비교하였다. 참조 항체는 IgG1 아이소타입의 완전히 인간화된 Fc-조작된 단클론성 항체인 아테졸리주맙 (Tecentriq™), 및 완전한 인간 단클론성 항체인 아벨루맙 (Bavencio™)을 포함하였다.

렌티바이러스에 의해 인간 PD-1 유전자로 트랜스펙션된 Jurkat 세포를 반응기 세포로 사용하였다. Raji-PD-L1 세포를 항원 제공 세포 (APC)로 사용하였다. 포도구균 장독소 (SE)를 TCR 신호를 자극하는데 사용하였다. 이 시스템에서, 이소성으로 발현된 huPDL1은 Jurkat 세포에서 SE 자극된 NF-AT-루시퍼라제 활성을 억제할 수 있지만, 항-PDL1 항체는 NF-AT-루시퍼라제 활성을 반전시킬 수 있다.

APC를 SE 자극의 존재 하에 PD-1 발현 Jurkat T 세포와 공동-배양하였다. 배양 시작시 항-PDL1 항체를 추가하였다. 6 hr 후, 결과로 생성된 세포를 루시퍼라제 활성에 대해 평가하였다.

결과는 도 5에서 나타나있다. B12-01은 세포-기반 검정에서 아벨루맙보다 훨씬 더 높은 친화도를 나타냈고 (EC50: 0.098 nM 대 0.27 nM) 또한 테센트리크보다 우수했다 (EC50: 0.098 nM 대 0.12 nM).

그 다음에, 순도 (크기 배제 크로마토그래피 (SEC)), 등전점 (pI), 용융 온도 (Tm), 및 친수성 (소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC))을 포함한 시험(pilot) 발달 가능성 특성을 B12-01에 대해 분석하고 참조 항체 테센트리크와 비교하였다. 결과는 하기 표 3에서 나타나있다.

흥미롭게도, 결과는 B12-01이 테센트리크보다 더 친수성을 나타내는 것으로 나타났다. 친수성의 차이는 상이한 아미노산 조성 때문일 수 있으며 B12-01이 테센트리크보다 더 높은 수용성을 나타낸다는 것을 시사한다. 이 성질은 후속 CMC 단계에서 제제 발달 중에 더 많은 유연성을 제공할 것이다.

실시예 6. Biacore에 의한 결합 친화도

이 실시예에서, His-태그된 인간 PD-L1에 대한 B12-01의 친화도를 Biacore T200으로 평가하였다.

피분석물 B12-01을 단백질 A 칩으로 캡쳐하였다. 인간 PD-L1 단백질 (25 nM-1.56 nM)을 피분석물 위에 10 μL/min의 유속으로 주사하였다. 리간드는 120 s 동안 회합하고 600 s 동안 해리될 수 있다. 데이터는 B12-01이 PD-L1에 대해 나노몰 미만의 친화도를 낸다는 것을 보여주었따 (9.48Х10 ^-10 M, 도 6).

실시예 7. 교차 종 반응성

이 예는 상이한 종의 PDL1 단백질에 대한 항체의 결합 활성을 검사하였다.

인간, cyno, 래트 및 마우스 PDL1-His 단백질을 0.5 μg/ml로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. B12-01을 10 μg/ml로부터 시작하여 1:3의 비로 단계 희석하였고 다양한 PDL1 항원과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 다음 HRP 컨쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG Fc 항체와 함께 인큐베이션한 후 이어서 TMB 기질로 발달시키고 분광 광도계로 OD 450 nm에서 분석하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, B12-01은 인간 PD-L1 및 cyno PD-L1에 대해 비슷한 결합 능력을 나타냈다. 래트 또는 마우스 PDL1로의 B12-01의 특이적 결합은 관찰되지 않았다.

실시예 8. PD1- PDL1 상호작용의 차단

이 예는 Raji-PDL1 세포-기반 차단 검정을 사용하여 PDL1 항체가 세포 리간드 PDL1로의 PD1 단백질의 결합을 차단하는 능력을 평가하였다.

Raji 세포 과발현 인간 PDL1을 웰 당 1Х10⁵개의 세포의 농도로 96웰 플레이트에 분주하였다. B12-01 항체 및 아이소타입 대조군 IgG를 FACS 완충액으로 10 μg/mL으로부터 단계 희석하였고 (1:3, 10회 용량) 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 희석된 비오티닐화된 Avi- 및 His-태그 인간 PD1 단백질 (3 μg/mL)을 얼음 위에서 30분 동안 항체-세포 복합체와 함께 인큐베이션한 후 이어서 스트렙타비딘-PE 항체를 검출하였다. 형광도를 유동 세포 분석법으로 측정하고 Flowjo 소프트웨어로 분석하여 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하였다. 데이터는 B12-01 항체가 세포-표면 PDL1로의 PD1 단백질의 결합을 차단하는 상당한 능력을 나타낸다는 것을 보여주었다 (도 8).

실시예 9. T 세포 활성화시 시험관 내 기능

이 실시예는, 1차 인간 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정을 사용하여, T 세포 활성화시 PDL1 항체의 시험관 내 기능을 평가하였다.

간략히 말하면, CD14⁺ 단핵구를 하나의 공여체의 인간 PBMC로부터 단리시키고 GM-CSF 및 IL-4로 7일 동안 자극하여 미숙한 수지상세포 (imDC)로 분화시켰다. 또 다른 공여체의 인간 PBMC로부터의 2Х10⁵/ml CD4⁺ T 세포 (1Х10⁵개/웰)를 단계 희석된 PDL1 항체의 존재 하에 5일 동안 imDC (1Х10⁴개/웰)와 함께 공동 배양하였다. 상층액 내 IFN-γ의 농도를 ELISA로 측정하였다. 결과는 B12-01이 인간 T 세포 활성화를 크게 촉진하였으며, 배양 배지에서 IFNγ 수준에 의해 측정된 바와 같다는 것을 보여주었다 (도 9).

실시예 10. PDL1 항체의 생체 내 효능

이 실시예는 인간 PDL1 세포외 도메인 (ECD) 트랜스제닉 마우스를 이용하여 PDL1 항체의 생체 내 효능을 평가하였다.

인간 PDL1(MC38-hPD-L1)을 발현하도록 조작된 마우스 결장 선암종 세포 MC38을 hPDL1 인간화된 마우스에 피하로 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 100 mm³에 도달했을 때 마우스를 2개의 군으로 분류하고 B12-01 항체 또는 아이소타입 IgG 대조군을 10 mg/kg으로 3일마다 6회 동안 복강내로 투여하였다. 종양 부피를 실험 중에 주 2회 캘리퍼 측정으로 모니터링하였다. 결과는 B12-01이 IgG 군과 비교하여 종양 성장을 효과적으로 억제했다는 것을 보여주었다 (도 10).

* * *

본 개시물은 본 개시물의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도된, 기재되어 있는 특정 구체예에 의해 범위가 제한되어서는 안 되며, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법이 본 개시물의 범위 내에 있다. 본 개시물의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 본 개시물의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 개시물은 첨부된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에 있는 한 본 개시물의 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타나는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Leu Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 128 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Leu Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 129 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn Ala Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 130 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Leu Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 131 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 131 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gln Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 132 Glu Ser Trp Ile His 1 5 <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 133 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 134 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 135 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 135 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 136 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 136 Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 137 Asn Ile Lys Gln Asp Ala Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 138 Gln His Ser Asn Ala Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 139 Gln His Ser Gln Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 140 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Leu Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 Gly Phe Thr Phe Ser Glu Ser 1 5 <210> 142 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 142 Lys Gln Asp Ala Ser Glu 1 5 <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 Asn Ile Lys Gln Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 144 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 Asn Ile Lys Gln Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 145 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 Gln Val Gln Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Leu Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115

Claims

항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며,
VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 서열 번호:46, 135, 136, 137, 143 또는 144의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서,
VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 서열 번호:46의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 서열 번호:76의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 서열 번호:97의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
제1 항에 있어서, VH은 서열 번호:23, 124, 126, 127, 128, 또는 140의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호:24 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, VH는 서열 번호:124의 아미노산 서열 또는 서열 번호:124에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제1 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 125의 아미노산 서열 또는 서열 번호:125에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며,
VH CDR1은 서열 번호:38 또는 132의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 서열 번호:47, 133 또는 134의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR3은 서열 번호:57의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 서열 번호:84의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 서열 번호:93의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
제5 항에 있어서, VH는 서열 번호: 11, 121, 122 또는 123의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 11, 121, 122 또는 123에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제1 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호:12의 아미노산 서열 또는 서열 번호:12에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며,
VH CDR1은 서열 번호:37의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 서열 번호:46, 135, 136, 137, 143 또는 144의 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR3은 서열 번호:63의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 서열 번호:83의 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 서열 번호:101, 138, 또는 139의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
제7 항에 있어서, VH는 서열 번호:31, 124, 127, 128, 또는 130의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 31, 124, 127, 128, 또는 130에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제1 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호:32, 129 또는 131의 아미노산 서열 또는 서열 번호:32, 129 또는 131에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 제2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 완전한 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 가지며
서열 번호:35-42로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR1,
서열 번호:43-51로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR2,
서열 번호:52-66으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VH CDR3,
서열 번호:67-79로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR1,
서열 번호:80-88로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR2, 및
서열 번호:89-102로부터 선택된 아미노산 서열 및 그것들로부터 1 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 그것의 변이체를 포함하는 VL CDR3
을 포함하는, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
제11 항에 있어서,
VH CDR1은 서열 번호:37-38, 40 및 132로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR2는 서열 번호:45-47, 49, 133-137 및 143-144로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
VH CDR3은 서열 번호:54-58 및 61-64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR1은 서열 번호:67, 70-73 및 75-77로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR2는 서열 번호:80, 83-84 및 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
VL CDR3은 서열 번호:89, 91-94, 96-99, 101 및 138-139로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 그것의 단편은 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각
서열 번호:35, 43, 52, 67, 80, 및 89;
서열 번호:36, 44, 53, 68, 81, 및 90;
서열 번호:37, 45, 54, 69, 82, 및 91;
서열 번호:37, 46, 55, 70, 83, 및 89;
서열 번호:37, 46, 56, 71, 83, 및 92;
서열 번호:38, 47, 57, 72, 84, 및 93;
서열 번호:37, 46, 58, 73, 83, 및 94;
서열 번호:39, 48, 59, 74, 85, 및 95;
서열 번호:37, 46, 60, 67, 80, 및 91;
서열 번호:37, 46, 61, 75, 83, 및 96;
서열 번호:40, 49, 62, 67, 80, 및 91;
서열 번호:37, 46, 63, 76, 83, 및 97;
서열 번호:37, 46, 64, 71, 86, 및 98;
서열 번호:37, 45, 54, 77, 80, 및 99;
서열 번호:41, 50, 65, 78, 87, 및 100;
서열 번호:37, 46, 63, 71, 83, 및 101; 또는
서열 번호:42, 51, 66, 79, 88, 및 102
의 아미노산 서열을 포함하며,
각각의 아미노산 서열은 선택적으로 아미노산 치환을 갖는, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 단편 및 PD-L1이 아닌 항원에 대한 특이성을 가진 제2 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드.
제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 세포.
필요로 하는 환자에서 암 또는 감염을 치료하는 방법으로서, 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편 또는 제15 항의 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제15 항에 있어서, 암 또는 감염을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편 또는 제15 항의 조성물의 용도.
제18 항 또는 제19 항에 있어서, 암은 고체 종양인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
제20 항에 있어서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.
제18 항 또는 제19 항에 있어서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 균류 감염 또는 기생충에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법 또는 사용.