KR20200058322A

KR20200058322A - 항-pd-l1 항체 및 il-7 융합체

Info

Publication number: KR20200058322A
Application number: KR1020197022001A
Authority: KR
Inventors: 레이 팡; 페이페이 추이; 하이쥐안 구; 젱이 왕; 빙시 궈; 징우 장
Original assignee: 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2020-05-27
Also published as: AU2019203918A1; BR112020010536A2; JP2021506748A; CN110352202A; AU2020210258A1; SG11202005036RA; JP2022101631A; MX2020005193A; ZA202002568B; IL274564A; WO2019144945A1; EP3568417A1; CA3082975A1; EA202091054A1; EP3568417A4; US11401331B2; AU2019203918B2; JP7102670B2; US20190352405A1

Abstract

펩타이드 링커를 통해 인간 IL-7 단백질 또는 이것의 단편에 융합된 PD-L1 억제자를 가진 융합 분자가 제공된다. 개시된 융합 분자는 시너지 항-종양 효과를 나타냈다.

Description

항-PD-L1 항체 및 IL-7 융합체

펩타이드 링커를 통해 인간 IL-7 단백질 또는 이것의 단편에 융합된 PD-L1 억제자를 가진 융합 분자에 관한 것이다.

인터류킨 7 (IL-7)은 골수 및 흉선에서 간질 세포에 의해 분비된 조혈성 성장 인자이다. IL-7은 림프성 전구 세포로의 다분화능 조혈 줄기 세포의 분화를 자극한다. 또한 그것은 림프 계통의 모든 세포 (B 세포, T 세포 및 NK 세포)의 증식을 자극한다. IL-7은 B 및 T 세포 발달에 중요한 사이토카인이다. 이 사이토카인 및 간세포 성장 인자 (HGF)는 pre-pro-B 세포 성장-자극 인자로서 기능하는 헤테로다이머를 형성한다. 이 사이토카인은 초기 T 세포 발달 동안에 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 V(D)J 재배열을 위한 공통 인자인 것으로 밝혀졌다. 이 사이토카인은 장 상피 세포 및 상피 배상 세포에 의해 국소적으로 생산될 수 있고, 장 점막 림프구에 대한 조절 인자의 역할을 할 수도 있다.

재조합 IL-7은 여러 단계 I 및 II 임상 시험에서 환자에게 안전하게 투여되었다. 암에 걸린 환자에서 IL-7의 인간 연구는 이 사이토카인의 투여가 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T 조절 세포의 퍼센트의 감소와 함께 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포 둘 다의 항상성을 일과성으로 붕괴시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 하지만, 객관적인 암 퇴화는 관찰되지 않았다.

분화 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)의 클러스터로도 알려져 있는, 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1)는 특정 이벤트, 예컨대 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질환 및 간염과 같은 다른 질환 상태 중에 면역 시스템을 저해하는데 있어서 주요 역할을 하는 것으로 생각되는 40kDa 1형 막관통 단백질이다. PD-1 또는 B7.1로의 PD-L1의 결합은 림프절에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전송하고 상기 PD-1에 대한 보충은 또한 유전자 Bcl-2의 낮은 조절에 의해 더 매개되는 아폽토시스(apoptosis)를 통해 림프절에서 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 또한 제어할 수 있다.

PD-L1의 상향 조절은 암이 숙주 면역계를 회피할 수 있게 하는 것으로 보인다. 신장 세포 암종에 걸린 환자의 종양 견본의 분석으로 PD-L1의 높은 종양 발현이 증가된 종양 공격성 및 증가된 사멸 위험과 관련이 있다는 것을 발견하였다. 많은 PD-L1 억제자가 면역 종양학 요법으로서 개발 중에 있으며 임상 시험에서 양호한 결과를 나타내고 있다.

암 치료 외에도, PD-L1 억제는 또한 감염성 질환을 치료하는데 대한 징후를 나타냈다. 세포 내 감염의 마우스 모델에서, 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)는 T 세포, NK 세포, 및 거대 세포에서 PD-L1 단백질 발현을 유도하였다. PD-L1 차단 (예를 들어, 차단 항체를 사용하여)은 감염된 마우스에 대한 사망률을 증가시켰다. 감소된 차단은 거대 세포에 의한 TNFα 및 산화 질소 생산을 감소시키고, NK 세포에 의한 그랜자임 B 생산을 감소시키고, 리스테리아 모노사이토게네스 항원-특이적 CD8 T 세포의 증식을 감소시켰다 (CD4 T 세포는 아님). 이 증거는 PD-L1이 세포 내 감염에서 양성 동시 자극 분자의 역할을 한다는 것을 시사한다.

본 개시물은 PD-L1 억제자가 펩타이드 링커를 통해 IL-7 단백질에 융합될 때, 융합 분자는 두 구성요소의 결합 활성을 유지할 수 있다는 것을 입증하였다. 또한, 융합 분자는 두 단백질 단독의 조합과 비슷한 활성을 나타냈다. 더욱이, 활성이 감소된 돌연변이 IL-7 단백질로 개선된 결과를 달성할 수 있었다.

그러므로, 본 개시물의 한 구체예에 따르면, 펩타이드 링커를 통해 인간 IL-7 단백질 또는 이것의 단편에 융합된 PD-L1 억제자를 포함하는 융합 분자가 제공된다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 5 내지 100개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 10-75개의 아미노산을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커의 아미노산 잔기 중 적어도 20%는 알라닌, 글리신, 시스테인, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커의 아미노산 잔기 중 적어도 40%는 알라닌, 글리신, 시스테인, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 서열 번호: 1-5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, PD-L1 억제자는 유인(decoy) PD-1 단백질, 예컨대 PD-L1에 결합하는 비활성 PD-1이다. 일부 구체예에서, PD-L1 억제자는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체의 단편은 단일 사슬 단편, Fab 단편, 또는 한 쌍의 Fab 단편이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 단일특이적 항체 또는 제2 특이성을 추가로 가진 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 ADCC-활성화된다.

일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 각각 서열 번호:6의 잔기 31-35, 잔기 50-66, 및 잔기 99-108의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 번호:7의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구체예에서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 서열 또는 IL-7 수용체 알파에 결합할 수 있으면서 서열 번호: 9에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, IL-7 단백질은 서열 번호:9에 따라 위치 142에서 Gly, Ala, Val, Cyc, Leu, Ile, Met, 및 Phe로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예에서, IL-7 단백질은 서열 번호:9에 따라 위치 142에서 A, V, L, I, M, 및 F로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 9에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 인간 IL-7 단백질과 비교하여 IL-7 수용체 알파에 대한 결합 친화도가 감소되었다. 일부 구체예에서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, IL-7 단백질의 단편은 융합 분자에 포함된다. 일부 구체예에서, 단편은 적어도 하나, 둘, 셋 또는 모두 네 개의 알파-나선 모티프(motif)를 포함한다.

일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 PD-L1 억제자의 C-말단 잔기에 융합되고, IL-7 단백질의 N-말단 잔기에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 PD-L1 억제자의 N-말단 잔기에 융합되고, IL-7 단백질의 C-말단 잔기에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편의 경쇄의 N-말단 잔기에 융합된다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편의 중쇄의 N-말단 잔기에 융합된다.

또한, 한 구체예에서, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 9에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 단리된 단백질이 제공되는데, 펩타이드는 IL-7 수용체 알파에 결합할 수 있지만 야생형 인간 IL-7 단백질과 비교하여 IL-7 수용체 알파에 대한 결합 친화도는 감소되었다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 위치 142에서 Trp 이외의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 위치 142에서, Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예에서, 펩타이드는, 위치 142에서, Ala, Leu, Ile, Met, Phe, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는다.

필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 본 개시물의 분자를 환자에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 방법은 선택적으로 PD-L1 억제자와 함께 개시된 IL-7 변이체를 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁체부암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1은, 패널 A-D에서, 몇몇 융합 분자 구조를 예시한다.
도 2는 IL-7 단백질 활성을 감소시키는 W142A 돌연변이의 확인을 나타낸다.
도 3은 W142A 돌연변이가 실제로 항-PDL1-IL7 융합 분자의 IL7 효능을 감소시킨다는 것을 입증한다.
도 4는, 패널 A-C를 이용하여, 융합 분자가 STAT5 신호 전달을 자극하고 (A), IL7R에 결합하고 (B), IL7R 내재화 (C)를 촉진할 수 있는 능력의 결과를 제공한다.
도 5는 융합 분자가 세포-결합된 PDL1 단백질에 결합할 수 있는 능력을 나타낸다.
도 6은 모든 테스트된 융합 분자가 항-PDL1 단클론성 항체에 대하여 유사한 결합을 나타냈다는 것을 보여준다.
도 7은 항-PDL1-IL7^W142A가 IL7Ra로의 결합을 감소시키며, 감소된 IL7 효능과 일치한다는 것을 나타낸다.
도 8은 항-PDL1-IL7 및 항-PDL1-IL7^W142A가 인간 T 세포 기능을 향상시키는데 있어서 항-PDL1 mAb 또는 IL7보다 우수한 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 9는 테스트된 융합 분자가, 항-PDL1 항체와 유사하게, 종양 부위에서 풍부할 수도 있다는 것을 보여준다.
도 10은 다양한 테스트된 분자의 종양 성장 억제에서의 효능을 나타낸다.
도 11은 생체 내 연구가 끝나면 각각의 동물의 종양 중량을 제공한다.
도 12는 생체 내 연구가 끝나면 각각의 동물의 비장 및 종양에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 무명수를 나타내는 데이터를 제공한다.

정의

용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 나타낸다는 것을 알아야 한다; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의" (또는 "하나의"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드", 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포함하도록 의도되고, 아미드 결합 (펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 결합된 모노머 (아미노산)로 구성된 분자를 말한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 말하며, 특정 길이의 생성물을 말하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 어느 것 대신에, 또는 이것과 교체 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 나타내도록 의도되며, 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성을 포함한, 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다.

용어 "단리된"은 본원에서 세포, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA에 관하여 사용된 바와 같이, 각각 거대 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 말한다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 사용된 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 말한다. 더욱이, an "단리된 핵산" is meant to include 핵산 단편 단편으로서 자연 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 간주된다. 용어 "단리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 폴리펩타이드를 나타내는데 사용된다. 단리된 폴리펩타이드는 정제된 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 적용된 바와 같이 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태를 의도하며, 이것의 비-제한적 예는 정상적으로는 함께 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 조합함으로써 생성될 수 있다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩타이드 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 말한다. 상동성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 염기 또는 아미노산을 차지할 때, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는, 일치하거나 상동성인 위치의 개수의 함수이다. "무관한" 또는 "비-상동성" 서열은 본 개시물의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대하여 특정 퍼센트 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지며, 정렬될 때, 두 서열을 비교하는데 있어서 상기 퍼센트의 염기 (또는 아미노산)가 동일한 것임을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 해당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology에서 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 파라미터가 정렬에 사용된다. 한 정렬 프로그램은 BLAST이며, 기본 파라미터를 사용한다. 특히, 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음 기본 파라미터를 사용한다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프(cutoff) = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 정렬 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비-다중, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 명시된 퍼센트의 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 것들이다.

용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 그것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 말한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 그것의 보체와 어느 정도의 상동성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함하도록 의도된다. 한 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체에 혼성체화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 어느 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 추가, 결실, 치환 및 이것들의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염-다리)을 가지고 있다.

혼성체화 반응은 상이한 "엄중도"의 조건 하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 낮은 엄중도 혼성체화 반응은 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 강도/온도의 용액에서 약 40℃에서 수행된다. 중간 엄중도 혼성체화는 전형적으로 약 6 x SSC에서 약 50℃에서 수행되고, 높은 엄중도 혼성체화 반응은 일반적으로 약 1 x SSC에서 약 60℃에서 수행된다. 혼성체화 반응은 또한 당업자에게 널리 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비-제한적 예는 세포에서 보통 발견되는 온도, 이온 강도, pH 및 Mg²⁺의 농도이다.

폴리뉴클레오타이드는 네 개의 뉴클레오타이드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때에는 티민에 대하여 유라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표기이다. 이 알파벳 표기는 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스에 입력되어 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학적 용도로 사용될 수 있다. 용어 "다형성"은 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그 일부의 공존을 말한다. 적어도 두 개의 상이한 형태가 존재하는 유전자의 일부, 즉, 두 개의 상이한 뉴클레오타이드 서열은 "유전자의 다형성 영역"이라고 불린다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드일 수도 있으며, 이것의 정체는 상이한 대립유전자에 있어서 상이하다.

용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 교체 가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것들의 유사체의 폴리머 형태를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지되었든 공지되지 않았든 임의의 기능을 수행할 수도 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리머화 이후, 예컨대 라벨링 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 더 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중-및 단일-가닥 분자를 말한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 개시물의 임의의 구체예는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 각각의 두 개의 상보적 단일-가닥 형태를 모두 포함한다.

용어 "암호화하다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 바와 같이, 고유한 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 이것의 단편에 대한 mRNA를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있으면, 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 언급되는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 안티센스(antisense) 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 암호화 서열은 이것으로부터 추정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 이것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 말한다. 항체는 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서 용어 "항체"는 항원에 대한 결합의 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이것들의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 거울상체, 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특정 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사하게 작용하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.

"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L)의 가변 영역의 융합 단백질을 말한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드로 연결된다. 링커는 플렉시블 성질을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수도 있고, V_H의 N-말단과 V_L의 C-말단을 연결하거나, 그 반대도 가능하다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 원래의 면역글로불린의 특이성을 가지고 있다. ScFv 분자는 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,892,019에서 기술되어 있다.

용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 광범위한 분류의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 엡실론(epsilon) (γ, μ, α, δ, ε)로 분류되고 그것들 중 일부는 하위 분류 (예를 들어, γ l-γ4)를 갖는다는 것을 알 수 있다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "분류"를 결정하는 것이 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위 분류 (아이소타입), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgG₅, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 분류 및 아이소타입 각각의 변형된 버젼은 본 개시물을 고려하여 당업자에게 쉽게 구별 가능하고, 따라서, 본 개시물의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 분류는 분명히 본 개시물의 범위 내에 있으며, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 분류에 관한 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤(Dalton)의 분자량의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량 53,000-70,000의 두 개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 네 개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 "Y" 구성형태로 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속해서 중쇄를 괄호로 묶는다.

본 개시물의 항체, 이것의 항원-결합 폴리펩타이드, 변이체, 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 결합된 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에서 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시물의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 분류일 수도 있다.

경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) (Κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수도 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 서로 공유 이황화 결합에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마(hybridoma), B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때에는 비-공유 결합에 의해 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성형태의 갈래형(forked) 단부의 N-말단에서 각 사슬의 바닥의 C-말단으로 이어진다.

경쇄 및 중쇄 둘 다는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 점에 있어서, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 수 있다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 관례상 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이며; CH3 및 CK 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.

상기 나타난 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이것에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 구조는 Y의 각 아암의 단부에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각 VH 및 VK 사슬 상의 세 개의 CDR (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 한정된다. 어떤 경우에는, 예를 들어, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린에 기초하여 조작된 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 단지 중쇄로만 이루어질 수도 있으며, 경쇄가 없다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 참조.

자연 발생한 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 구성형태를 취하기 때문에 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧고 비-인접한 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 불리는 항원-결합 도메인에서 아미노산의 나머지는 더 적은 분자 간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β-시트(β-sheet) 입체구조를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 어떤 경우에는 그것의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간, 비-공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치한 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역 반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 항체의, 그것의 동계(cognate) 에피토프로의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 정확하게 정의되어 있기 때문에 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참조).

해당 분야에서 사용 및/또는 수용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우에, 용어의 정의는 본원에서 사용된 바와 같이 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하도록 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비-인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 이 특정한 영역은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia et al., J. MoI . Biol. 196:901-917 (1987) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기술되어 있다. Kabat 및 Chothia에 따르는 CDR 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 그 변이체의 CDR을 나타내기 위한 둘 중 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 상기 나열된 참고문헌 각각에 의해 한정된 바와 같이 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교대상으로서 하기 표에서 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.

Kabat, 등은 또한 어떤 항체에도 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 그 자체를 넘어서는 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않으면서 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명료하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 말한다.

상기 표에 더하여, Kabat 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1는 대략 아미노산 31에서 시작하고 (즉, 첫 번째 시스테인 잔기 다음의 대략 9개의 잔기), 대략 5-7개의 아미노산을 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1이 끝난 다음 15번째 잔기에서 시작하고, 대략 16-19개의 아미노산을 시작하고, 그 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2이 끝난 다음 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하고, 3-25개의 아미노산을 포함하고, 서열 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 10-17개의 잔기를 포함하고, 그 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1이 끝난 다음 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2이 끝난 다음 대략 33번째 잔기 (즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고, 대략 7-11개의 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, X는 임의의 아미노산이다.

본원에서 개시된 항체는 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수도 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 설치류, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원 (예를 들어, 상어 기원)이 콘드릭토이드(condricthoid)일 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이것들의 변이체 또는 단편. 예를 들어, 본 개시물에서 사용을 위한 항원-결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 개시물의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 또한, 본 개시물에서 사용을 위한 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인 전부 또는 일부)가 없을 수도 있다. 상기 제시된 바와 같이, 당업자는 중쇄 불변 영역이 아미노산 서열이 자연 발생 면역글로불린 분자와 다르도록 변형될 수도 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에서 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgG_l 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG₃ 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로는 IgG_l 분자로부터 및 부분적으로는 IgG₃ 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG_l 분자로부터 및 부분적으로는 IgG₄ 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.

"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인과 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 말한다.

이전에 나타난 바와 같이, 다양한 면역글로불린 분류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성형태는 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 아미노 말단이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은, 예를 들어, 통상적인 넘버링 계획을 사용하여 항체의 약 잔기 244에서 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 일부를 포함한다 (잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참조). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 대신에, 두 개의 N-결합된 분지형 탄수화물 사슬이 온전하고 고유한 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 또한 CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 잔기를 포함한다는 것이 잘 기록되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 플렉시블(flexible)하며, 따라서 두 개의 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직이게 한다. 힌지 영역은 세 개의 별개의 도메인, 상부, 중부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이황화 결합"은 두 개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 이황화 결합 또는 다리를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 결합되고 두 개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242 (위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에서 두 개의 이황화 결합에 의해 결합된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역 반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역 (온전하거나, 부분적이거나 또는 본 개시물에 따라 변형될 수도 있음)은 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미할 것이다. 특정 구체예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류)로부터 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "퍼센트 인간화"는 인간화된 도메인 및 생식계열 도메인 간의 프레임워크 아미노산 차이 (즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 상기 수를 뺀 다음 그것을 총 아미노산 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.

"특이적으로 결합하다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 그것의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에서 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는, 그것의 항원-결합 도메인을 통해, 무작위의 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 상기 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대하여 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대하여 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방적(prophylactic) 또는 방지적(preventative) 수단을 말하며, 목적은 원치않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 예방하거나 늦추는 (줄이는) 것이다. 유익한 또는 우너하는 임상적 결과는 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 (부분적 또는 전체적), 검출 가능 여부를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 병태 또는 장애에 걸린 것들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 것들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 경작용 동물, 동물원 동물, 스포츠용 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 암소, 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자에게" 또는 치료를 필요로 하는 대상체"는, 예를 들어, 검출, 진단 과정 및/또는 치료에 사용된 본 개시물의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.

융합 분자

본 개시물은 효능 및 안전성을 더 극대화하는 시너지 방식으로 PD-L1 억제 또는 차단과 IL-7 사이토카인 활성을 조합하는 융합 분자를 제공한다.

한 구체예에서, 융합 분자는 바람직하게는 펩타이드 링커를 통해 인간 IL-7 단백질 또는 이것의 단편에 융합된 PD-L1 억제자 (예를 들어, 유인 PD-1 단백질 또는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편)를 포함한다. 펩타이드 링커는 일반적으로 5 내지 100개의 아미노산 잔기를 가진 펩타이드이다. 바람직하게는, 링커는 플렉시블 성질을 보장하기에 충분한 더 작은 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 링커의 길이는, 제한 없이, 5 내지 100개의 아미노산, 10 내지 90개의 아미노산, 10 내지 80개의 아미노산, 10 내지 75개의 아미노산, 15 내지 90개의 아미노산, 15 내지 80개의 아미노산, 15 내지 70개의 아미노산, 20 내지 80개의 아미노산, 20 내지 70개의 아미노산, 20 내지 60개의 아미노산, 25 내지 90개의 아미노산, 25 내지 80개의 아미노산, 25 내지 75개의 아미노산, 25 내지 70개의 아미노산, 25 내지 60개의 아미노산, 30 내지 80개의 아미노산, 30 내지 70개의 아미노산, 30 내지 60개의 아미노산, 또는 40 내지 70개의 아미노산일 수 있다.

링커의 플렉시블 성질은 최소 퍼센트의 더 적은 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신, 시스테인, 및 세린을 포함함으로써 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 알라닌, 글리신, 시스테인, 또는 세린으로부터 선택된 아미노산 중 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%를 포함한다. 펩타이드 링커의 비-제한적 예는 서열 번호: 1-5에서 제공된다.

인간 IL-7 단백질이 공지되어 있으며, 단백질 서열은 GenBank에 기탁 번호 NP_000871.1로 기탁되어있고, 이것의 성숙한 서열은 서열 번호: 8에서 제공된다. 계산 및 테스트를 통해, 야생형 IL7과 비교하여 IL-7 활성이 감소된 IL-7 단백질의 돌연변이 형태가 항-PD-L1 항체와의 시너지 작용을 유지하였으며, 전체적으로 안전성이 개선되었다는 것이 결정되었다. 이러한 돌연변이의 비-제한 예는 IL7^W142에서 아미노산 치환을 가진 것들을 포함한다. 치환은 G, A, V, C, P, L, I, M, 및 F와 같은 비-극성 아미노산으로 이루어질 수 있다.

용어 "인간 IL-7 단백질"은 본원에서 사용된 바와 같이 야생형 인간 IL-7, 뿐만 아니라 그것의 생물학적 동등물, 즉, 야생형 인간 IL-7에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가지며, 쉽게 측정될 수 있는 야생형의 활성, 예컨대 IL-7 수용체 (예를 들어, 수용체 알파)로의 결합을 유지하는 것들을 말한다. 일부 구체예에서, 인간 IL-7 단백질은 야생형과 비교하여 IL-7 활성이 감소된다. 일부 구체예에서, 감소된 IL-7 활성은 야생형 IL-7과 비교하여 IL-7 수용체에 대한 결합 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 일부 구체예에서, IL-7 활성은 야생형 IL-7보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999% 더 낮다. 일부 구체예에서, IL-7 활성은 IL-7^W142A와 야생형 IL-7 사이에 있다. 일부 구체예에서, IL-7 단백질은 IL-7 수용체에 결합할 수 있는 합성 유사체이다.

일부 구체예에서, 인간 IL-7 단백질은 야생형과 비교하여 W142에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 비-극성 아미노산에 대한 것이다. 돌연변이의 비-제한적 예는 Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe, 또는 Val에 대한 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 Phe, Met, Ile, Leu, Val, 또는 Ala에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 W142A이다 (예를 들어, 서열 번호: 9).

일부 구체예에서, IL-7 단백질의 단편이 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단편은 IL-7 수용체 (예를 들어, 수용체 알파)에 결합할 수 있으며, 바람직하게는 야생형 단백질과 비교하여 감소된 IL-7 활성을 갖는다. IL-7 수용체와 복합체를 형성한 IL-7의 3차원 구조가 입증되었다. 예를 들어, McElroy et al., Structure. 2009 Jan 14;17(1):54-65 참조. IL-7은 두 개의 교차형 루프를 가진 업-업-다운-다운 4-나선 번들 위상기하학을 채택한다. α-나선 A-D는 길이가 13 내지 22개의 잔기로 다르다. 일부 구체예에서, 단편은 알파 나선 중 적어도 하나, 두 개, 또는 세 개를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 알파 나선 중 네 개 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 S19, D74 및 K81을 포함한 계면 아미노산 잔기를 가지고 있다.

IL-7 단백질은 또한 다른 아미노산 위치에서도 추가의 변형, 예컨대 추가, 결실 및/또는 치환을 허용할 수 있다. 이러한 변형은 하나, 둘 또는 세 개의 위치에서의 치환일 수 있다. 한 구체예에서, 변형은 위치 중 하나에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 해당 분야에서 정의되어 있으며, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드에서 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 파밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있다.

보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공되며, 0 또는 그 이상의 유사성 점수는 두 개의 아미노산 사이의 보존적 치환을 나타낸다.

[표 A] 아미노산 유사성 매트릭스

[표 B] 보존적 아미노산 치환

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PD-L1 억제자"는 PD-L1에 결합하여 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 차단하며 따라서 PD-L1의 활성을 억제할 수 있는 분자, 예를 들어, 단백질 또는 단백질-함유 복합체를 말한다. PD-L1 억제자의 비-제한적 예는 유인 PD-1 단백질, 예를 들어, PD-L1에 결합하는 능력을 유지하는 비활성 PD-1 변이체이다. 이러한 PD-1 변이체의 예는 Maute et al., "Engineering high-affinity PD-1 variants for optimized immunotherapy and immuno-PET imaging", PNAS 2015 112 (47) E6506-E6514 (2015)에서 제공된다. 또 다른 비-제한적 예는 항-PD-L1 항체이다.

본 개시물의 융합 분자에 포함시키기에 적합한 많은 공지된 항-PD-L1 항체 및 그것들의 단편이 존재한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열은 예시의 항-PD-L1 항체에 대하여 서열 번호: 6 및 7에서 제공된다. 예시의 항체의 CDR 영역을 포함하는 변이체 항-PD-L1 항체는 또한 본 기술의 범위 내에 있다. 예를 들어, 항-PD-L1 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 각각 서열 번호:6의 잔기 31-35, 잔기 50-66, 및 잔기 99-108의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 번호:7의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 아이소타입이고, 단편은 단일 사슬 단편, Fab 단편, 또는 한 쌍의 Fab 단편과 같은 어떠한 형태도 취할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 ADCC-활성화된다.

융합 분자의 일부 예시의 구조는 도 1, 패널 A-D에서 예시된다. 패널 A에서, 융합 분자는 전체 IgG 항-PD-L1 항체 및 링커를 통해 항체의 CH3의 C-말단에 각각 융합된 두 개의 IL-7 단백질을 포함한다. 이 융합 폴리펩타이드는 두 개의 별도의 DNA 구조체로 만들어질 수 있다. 패널 B에서, 융합 분자는 또한 IgG 항-PD-L1 항체 및 두 개의 IL-7 단백질을 포함하지만; IL-7 단백질은 링커를 통해 경쇄 가변 영역의 N-말단에 융합된다.

도 1, 패널 C에서, 패널 C와 상이하게, IL-7 단백질은 링커를 통해 중쇄의 N-말단에 융합된다. 또 다른 예시의 구조는 패널 D에서 예시되며, 이것은 링커를 통해, CH2-CH3 단편이 VH-CH2 부분의 업스트림에 배치된 항체의 CH2의 N-말단에 융합된 각각의 IL-7 단백질을 나타낸다.

도면에서 예시되지 않은 더 많은 구조가 제조될 수 있으며, 이것들은 단일특이적 항체 또는 제2 특이성을 추가로 갖는 이중특이적 항체일 수 있다.

특정 구체예에서, 유인 PD-1 단백질 또는 항체는 일반적으로는 항체와 회합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시의 변형은 하기 더 상세히 기술된다. 예를 들어, 본 개시물의 항체는 플렉시블 링커 서열을 포함할 수도 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수도 있다.

본 발명의 항체, 이것의 변이체, 또는 유도체는, 즉, 공유 부착이 항체가 에피토프에 결합하는 것을 방지하지 않도록 항체로의 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 항체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호 기/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 세포 리간드 또는 다른 단백질, 등으로의 결합에 의해 변형될 수 있다. 많은 화학적 변형 중 어느 것도 공지된 기술에 의해 수행될 수 있으며, 특이적 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사합성, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수도 있다.

일부 구체예에서, 유인 PD-1 단백질 또는 항체는 치료제, 프로드러그(prodrug), 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학적 작용제, 또는 PEG에 컨쥬게이션될 수도 있다.

유인 PD-1 단백질 또는 항체는 치료제에 컨쥬게이션되거나 융합될 수도 있으며, 이것은 검출 가능한 라벨, 예컨대 방사성 라벨, 면역 조절 물질, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광 활성 치료제 또는 진단제, 약물일 수도 있고 독소일 수도 있는 세포 독성제, 초음파 증강제, 비-방사성 라벨, 이것들의 조합 및 해당 분야에 공지된 다른 이러한 작용제를 포함할 수도 있다.

유인 PD-1 단백질 또는 항체는 그것을 화학 발광 화합물에 커플링함으로써 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 그 다음에 화학 반응의 과정 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 화학 발광-태그된 항원-결합 폴리펩타이드의 존재가 결정된다. 특히 유용한 화학 발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 써모메틱(theromatic) 아크리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.

유인 PD-1 단백질 또는 항체는 또한 ¹⁵²Eu, 또는 란탄 계열의 다른 것들과 같은 형광 방출 금속을 사용하여 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 금속 킬레이트 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 컨쥬게이션하는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radio라벨링된 Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)) 참조.

IL-7 변이체

야생형 단백질과 비교하여 활성이 감소된 인간 IL-7 단백질의 돌연변이가 제조되었다. 이들 돌연변이는, 예를 들어, 안전성 문제를 위해 이러한 활성의 감소가 요구되는 상황에서 유용한 것으로 입증된다. 따라서, 한 구체예에서, 본 개시물은 또한 이러한 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호: 9에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하며, 펩타이드는 IL-7 수용체 알파에 결합할 수 있지만 야생형 인간 IL-7 단백질과 비교하여 IL-7 수용체 알파에 대한 결합 친화도가 감소된다.

일부 구체예에서, 인간 IL-7 단백질은 야생형과 비교하여 감소된 IL-7 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, IL-7 활성의 감소는 IL-7 수용체에 대한 결합 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다.

일부 구체예에서, 인간 IL-7 단백질은 야생형과 비교하여 W142에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 비-극성 아미노산에 대한 것이다. 돌연변이의 비-제한적 예는 Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe, 또는 Val에 대한 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 Phe, Met, Ile, Leu, Val, 또는 Ala에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 W142A이다. 일부 구체예에서, W142에서의 돌연변이는 Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe, 또는 Val로부터 선택된다.

일부 구체예에서, IL-7 단백질의 단편이 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단편은 IL-7 수용체 (예를 들어, 수용체 알파)에 결합할 수 있으며, 바람직하게는 야생형 단백질과 비교하여 감소된 IL-7 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 단편은 알파 나선 중 적어도 하나, 두 개, 또는 세 개를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 알파 나선 중 네 개 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 S19, D74 및 K81을 포함하는 계면 아미노산 잔기를 보유한다.

IL-7 단백질은 또한 다른 아미노산 위치에서 추가의 변형, 예컨대 추가, 결실 및/또는 치환을 허용할 수 있다. 이러한 변형은 하나, 두 개 또는 세 개의 위치에서의 치환일 수 있다. 한 구체예에서, 변형은 위치 중 하나에서의 치환이다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.

폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 제조 방법

본 개시물은 또한 본 개시물의 유인 PD-1 단백질, 항체, 융합 분자, 이것의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수도 있다. 추가적으로, 본 개시물의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 이것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수도 있다.

유인 단백질 및 항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되고 본원에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역 둘 다는 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 해당 분야에 기술된 기술을 사용하여 및 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원의 공격에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌가 비활성화된 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.

암 치료

본원에서 입증된 바와 같이, 본 개시물의 융합 분자는 암을 치료하는데 있어서 시너지 효과를 나타냈고, 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다.

본 개시물은 본원에서 기술된 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위해 동물, 포유동물, 및 인간과 같은 환자에게 본 개시물의 융합 분자를 투여하는 단계를 수반하는 요법과 추가로 관련이 있다. 본 개시물의 치료적 화합물은 개시물의 융합 분자 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변이체 및 유도체 포함) 및 본 개시물의 융합 분자 (본원에서 기술된 바와 같이 이것의 변이체 및 유도체 포함)를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

요법은 또한, 선택적으로 본원에서 개시된 PD-L1 억제자의 투여와 조합하여, 본원에서 개시된 IL-7 변이체를 투여하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구체예에서, 투여된 IL-7 변이체 및 투여된 PD-L1 억제자는 적어도 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1.5:1, 1:1, 또는 1:2의 몰 비를 갖는다. 일부 구체예에서, 투여된 IL-7 변이체 및 투여된 PD-L1 억제자는 2:1, 1.5:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 또는 1:5 이하의 몰 비를 갖는다. 일부 구체예에서, 투여된 IL-7 변이체 및 투여된 PD-L1 억제자는 2:1 내지 1:2 또는 1.5:1 내지 1:1.5의 몰 비를 갖는다.

세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 개시물에서 제공된다. 본 개시물의 항-PD-L1 항체와 접촉된 (또는 대안으로 본 개시물의 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, 세포는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 유형 중 어느 것의 암에 걸릴 수도 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)는, 제한 없이, 예를 들어, 종양-침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.

일부 구체예에서, 세포는 암 환자 자체로부터 분리되었다. 일부 구체예에서, 세포는 공여체 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치않는 면역 반응이 최소화될 수 있다.

본 개시물의 융합 분자 또는 이것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예측될 수 있는, 증가된 세포 생존과 관련된 추가적인 질환 또는 병태는 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수구성 백혈병(acute myelocytic leukemia) (골수모구성(myeloblastic), 전골수구성(promyelocytic), 골수단핵구성(myelomonocytic), 단핵구성(monocytic), 및 적백혈병(erythroleukemia)) 포함) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성(chronic myelocytic) (과립구성(granulocytic)) 백혈병 및 만성 림프구성(chronic lymphocytic) 백혈병) 포함), 진성다혈구증(polycythemia vera), 림프종 (예를 들어, 호지킨 병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 병(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환, 및, 제한되는 것은 아니지만, 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골원성 육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 혈관내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyo sarcoma), 결장 암종(colon carcinoma), 췌장암, 유방암, 갑상선암, 자궁체부암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포 암종(renal cell carcinoma), 간 종양(hepatoma), 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 흑색종, 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastoma)을 포함하는 고체 종양과 같은 악성 종양 및 관련 장애의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

임의의 특정 환자에 특이적인 투약 및 처리 양생법은 사용된 특정 융합 분자, 이것의 변이체 또는 유도체, 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식습관, 및 투여 시기, 배출 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 심각도를 포함한 다양한 요인에 따라 다를 것이다. 의료 간병인에 의한 이러한 요인들의 판단은 해당 분야의 기술 범위 내에 있다. 양은 또한 처리되는 개개의 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질환의 심각도, 및 원하는 효과에 따라 다를 것이다. 사용된 양은 해당 분야에 널리 공지된 약리학적 및 약물동역학적 원리에 의해 결정될 수 있다.

융합 분자, 이것의 변이체 또는 유도체의 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 구강 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝(lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구로, 수조내, 질내, 복강내, 국부적으로 (분말, 연고, 안약 또는 경피성 패치에 의해), 볼에, 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여될 수도 있다.

용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 말한다.

투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 본 개시물의 융합 분자를 심실내 및 척추강내 주사를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수도 있다; 심실내 주사는, 예를 들어, 레저버, 예컨대 Ommaya 레저버에 부착된 심실내 카테터에 의해 용이해질 수도 있다. 폐 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저, 및 에어로졸화제가 들어있는 제제의 사용에 의해 이용될 수 있다.

본 개시물의 융합 분자 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이것은, 제한하는 것이 아니라, 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입에 의해, 국부 도포에 의해, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수도 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료이고, 막, 예컨대 실라스틱 막, 또는 섬유를 포함한다. 바람직하게는, 항체를 포함한, 본 개시물의 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.

염증, 면역 또는 악성 질환, 장애 또는 병태의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 개시물의 융합 분자의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 시험관 내 분석이 최적의 투약 범위를 확인하는 것을 돕는데 선택적으로 이용될 수도 있다. 제제화에 이용되어야 하는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환, 장애 또는 병태의 심각도에 따라 다를 것이며, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

일반적인 제안으로서, 환자에게 투여되는 본 개시물의 항원-결합 폴리펩타이드의 투약량은 전형적으로 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 환자 체중, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg 환자 체중, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래의 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종의 항체보다 인간 신체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 작은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 때때로 가능하다. 또한, 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 융합 분자의 흡수 및 조직 침투 (예를 들어, 뇌로)를 강화시킴으로써 본 개시물의 융합 분자의 투약량 및 투여 빈도가 감소될 수도 있다.

조성물

본 개시물은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 융합 분자의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제자)를 더 포함한다.

특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서 사용에 대하여 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 제제화 보조제일 것이다.

용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수도 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사 가능한 용액에 대하여, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 및 장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin (본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 모체 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다회수 용량의 바이알에 동봉될 수 있다.

한 구체예에서, 조성물은 일상적인 과정에 따라 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 중의 용액이다. 필요하면, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 국소마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나 또는 활성제의 양을 표시하는 밀폐 용기, 예컨대 앰플 또는 사세(sachette) 내에서 단일 투약 형태, 예컨대 동결건조된 분말 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.

실시예

실시예 1: 항-PDL1 및 인간 IL7 융합 분자의 디자인 및 생성

항-PDL1 항체의 중쇄 또는 경쇄 유전자 (표 1의 가변 영역 서열 참조)를 디자인하여 인간 IL7 유전자 (표 2)와 표 3의 펩타이드 링커를 융합하였다. 결과로 생성된 유전자를 포유류 발현 벡터로 클로닝하고 HEK293T 세포에 트랜스펙션하였다. 항체-사이토카인 융합 단백질 (도 1, 패널 A의 구조)을 단백질 A에 의해 트랜스펙션된 세포의 상층액으로부터 정제하였다.

실시예 2: 항-PDL1-IL7 융합 분자의 IL7 사이토카인 효능

하기 실시예에서 모든 항-PDL1-IL7 융합 분자는 도 1의 포맷 A를 사용하였다. 이들 이기능적 분자는 PDL1 길항작용과 IL7 세포 활성을 조합하였다. 항-PDL1 분자와 IL7의 고정된 몰 비 (1:1)를 고려해볼 때, 상이한 활성 수준을 가진 IL7 변이체를 항-PDL1 기능과 더 나은 시너지 작용을 할 수도 있는 것으로 고려하였다.

IL7/IL7R의 결정 구조를 분해하였다 (Structure 2009, 17: 54-65). 데이터는 아미노산 K120, R133, L135, Q136, E137, K139, T140, W142, N143 및 K144가 IL7 및 공통 γ 사슬 (IL7 신호 전달 수용체)의 계면에 있다는 것을 나타냈다 (도 2). 이들 10개의 아미노산을 각각 Ala로 돌연변이시키고 SEC-HPLC에 의해 순도에 관하여 및 2E8 세포 증식 분석 (IL7은 2E8 세포의 증식을 구동할 수 있다)에 의해 IL7 활성에 관하여 평가하였다. 돌연변이 W142A는 도 2에서 나타난 바와 같이 크게 감소된 IL7 효능 및 우수한 순도를 나타냈다.

IL7이 STAT5 인산화 (pSTAT5) 및 이후 CD4 T 세포의 증식을 유도할 수 있기 때문에, 1차 인간 T 세포 상에서 야생형 (WT) 및 W142A IL7의 IL-7 효능을 더 평가하기 위해, pSTAT5 분석 및 CD4 증식 분석을 수행하였다. 간략히 말하면, pSTAT5 검정에서, 인간 PBMC에 15min 동안 표시된 농도로 항-PDL1-IL7 및 항-PDL1-IL7^W142A를 처리하였다. CD4 증식 분석에서, 정제된 CD4 T 세포에 1주일 동안 항-PDL1-IL7 및 항-PDL1-IL7^W142A를 처리하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, W142A 돌연변이는 실제로 항-PDL1-IL7 융합 분자의 IL7 효능을 감소시켰다.

항-PDL1-IL7 융합 분자의 IL7 활성을 미세 조정하기 위해서, IL7의 W142 상에서 일련의 단일 부위 돌연변이를 생성하였다. 극성, 아미노 및 하이드록실의 수를 기준으로, 20개의 아미노산이 네 개의 카테고리로 분류될 수 있다: 비-극성 (G, A, V, C, P, L, I, M, W 및 F), 극성 (S,T,Y,N 및 Q), 양으로 대전된 (K,R 및 H) 및 음으로 대전된 (D 및 E) 기. 각각의 군의 몇몇 대표적인 아미노산을 선택하여 하기 기술된 바와 같이 돌연변이 항-PDL1-IL7 분자를 구성하였다 (표 4). 프롤린 (P)을 제외한 모든 비-극성 아미노산이 W142로 치환되어 높은 SEC 순도 (>96.8%)를 가진 돌연변이 항-PDL1-IL7을 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 그에 반해, 다른 세 가지 유형의 아미노산으로의 W142의 돌연변이는 분자 안정성 및 SEC 순도 (<84%)의 감소를 유발하였다. 그 다음에, 2E8 증식 분석에 의해 IL7 활성 확인을 수행하기 위해 비-극성 아미노산 하위유형 내의 각각의 아미노산을 사용하여 W를 대체하여 일련의 돌연변이 항-PDL1-IL7 분자를 생성하였다 (표 5). 유사성이 적을수록 W로 치환되는 아미노산의 유사성이 낮을수록, 돌연변이 분자는 더 낮은 IL7 활성을 갖는 것으로 나타났다 (W>F>M>I>L>V>A).

1차 CD4⁺ T 세포에서 항-PDL1-IL7 돌연변이 분자의 IL7 활성의 약화를 확인하기 위해, p-STAT5 신호 전달 분석을 상기와 같이 수행하였다. 도 4A에서 나타난 바와 같이, 융합 분자가 인간 1차 CD4⁺T 세포에서 STAT5 신호 전달을 자극하는 능력은 점점 감소하였으며 (W>I>V>A), 2E8 증식 분석에서 상응하는 활성과 연관성이 있다. 일련의 돌연변이 항-PDL1-IL7 분자의 약화된 IL7 활성의 메커니즘을 설명하기 위해서, IL7 수용체 (IL7R) 결합 및 결찰-매개된 내재화를 평가하였다. 간략히 말하면, IL7R 결합 분석을 위해, 인간 1차 CD4⁺T 세포를 4℃에서 30분 동안 다양한 항-PDL1-IL7 융합 분자와 함께 인큐베이션하였다. FACS에 의해 CD4⁺ T 세포의 IL7R에 결합된 융합 분자를 검출하기 위해 PE-컨쥬게이션된 항-인간 Fc 2차 항체를 사용하였다. 도 4B에서 나타난 바와 같이, IL7 활성이 감소된 세 개의 항-PDL1-IL7 융합 분자 (W142I, V 및 A) 모두는 IL7R 결합이 감소되었다. 리간드-매개된 수용체 내재화 분석을 위해, 인간 1차 CD4⁺ T 세포를 37℃에서 15분 동안 융합 분자와 동시 배양하였다. FACS에 의해 표면 IL7R을 검출하기 위해 PE-cy7-컨쥬게이션된-항-CD127 (IL7Ra) 항체를 사용하였다. IL7R 결합의 성향과 유사하게, IL7 수용체 결합 효능이 감소된 상기 융합 분자는 손상된 IL7R 내재화를 가지며 (도 4C), 손상된 IL7 신호 변환을 나타낸다. 결론적으로, 발명자들은 W142의 단일 부위 돌연변이를 변형시킴으로써 상이하고 약화된 IL7 활성을 가진 일련의 항-PDL1-IL7 분자를 개발하였다.

다양한 PDL1 -IL7 돌연변이의 SEC 성질의 비교

아미노산의 분류	단백질	발현 (mg/L)	SEC %
야생형	항-PDL1-IL7	4	99.90
비-극성	항-PDL1-IL7^W142A	2.9	97.80
	항-PDL1-IL7^W142I	3.9	99.20
	항-PDL1-IL7^W142M	2.7	96.80
	항-PDL1-IL7^W142P	1.9	52.00
양전하	항-PDL1-IL7^W142R	2.8	39.00
음전하	항-PDL1-IL7^W142D	2.1	54.00
극성	항-PDL1-IL7^W142S	3.2	84.00
극성	항-PDL1-IL7^W142Q	2.6	64.00

2E8 증식 분석에서 다양한 PDL1 -IL7 돌연변이의 EC50의 비교

	단백질	2E8 증식 분석에서 EC50의 배수 변화 (EC50 _돌연변이 /EC50 _WT )
1	항-PDL1-IL7	1
2	항-PDL1-IL7^W142F	1.5
3	항-PDL1-IL7^W142M	5.3
4	항-PDL1-IL7^W142I	10.1
5	항-PDL1-IL7^W142L	96.1
6	항-PDL1-IL7^W142V	346.7
7	항-PDL1-IL7^W142A	4840.4

실시예 3: 항- PDL1 -IL7 융합 분자의 PDL1 결합 성질

이 실시예는 Biacore®에 의해 인간화된 항체의 전체 동역학 친화도를 설명하였다.

재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his taq)로의 항-PDL1-IL7 융합 분자의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 BIACORE®로 테스트하였다. 항-PDL1-IL7 융합 분자를 CM5 칩 상에 코팅된 항-인간 Fc 항체를 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his taq 단백질의 일련의 희석액을 캡쳐된 항체 위에 25μg/ml의 유속으로 3분 동안 주사하였다. 항원을 900s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200에서 수행하였다. 데이터 분석을 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 데이터는 PDL1 결합 친화도가 융합 분자에서 손상되지 않았음을 보여준다 (표 6)

친화도 테스트 결과

샘플	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
항-PDL1 mAb	8.50E+04	1.78E-04	2.09E-09
항-PDL1-IL7	1.03E+05	2.78E-04	2.70E-09
항-PDL1-IL7^W142V	8.20E+04	4.15E-04	5.06E-09

항원 결합 성질을 평가하기 위해서, 융합 분자를 포유류 발현된 PD-L1으로의 결합에 대하여 FACS에 의해 분석하였다. 간략히 말하면, PDL1-Raji 세포를 처음에 15μg/ml에서 시작하여 3배 심각하게 희석된 인간화된 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 버퍼 (2% FBS가 들어있는 PBS)로 세척한 후, Alexa 488-항-인간 IgG 항체를 각 웰에 추가하였고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Alexa 488의 MFI를 FACSAriaIII로 평가하였다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 모든 융합 분자는 항-PDL1 단클론성 항체로의 유사한 결합을 나타냈다. 실시예 4: 항-PDL1-IL7 융합 분자의 PDL1 안타고니스트 활성

PDL1 안타고니스트를 평가하기 위해, PD1/PDL1 Jurkat 분석을 수행하였다. 초항원 스타필로코쿠스 엔테로톡신 (Staphylococcal Enterotoxin; SEE)은 Raji 세포의 존재 하에 Raji 상의 MHCII 및 Jurkat 상의 TCR 분자의 결찰을 통해 Jurkat T 세포에 의한 IL2 생산을 자극하였다. Raji 세포에서 발현된 외인성 PDL1은 Jurkat T 세포에 의해 과발현된 PD1에 결합하고 Jurkat에 의한 IL2 생산을 억제하였다. 항-PDL1 단클론성 항체 (mAb)는 PD1/PDL1 경로에 의해 저해된 IL2 생산을 반전시켰다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 항-PDL1-IL7 및 항-PDL1-IL7^W142A 융합 분자는 항-PDL1 mAb와 비슷한 PDL1 안타고니스트 기능을 나타냈다.

실시예 5: 항-PDL1-IL7 융합 분자의 이중-특이적 결합

PDL1 및 IL7 수용체 알파 (IL7Ra)와의 이중-특이적 결합 성질을 가진 융합 분자를 입증하기 위해, 이 실시예에서는 이중-특이적 결합을 측정하는 Bio-Layer Interferometry (BLI)를 사용하였다. 간략히 말하면, 비오틴-라벨링된 IL7Ra를 먼저 스트렙타비딘 센서로 캡쳐하였다. 항-PDL1-IL7 융합 분자를 IL7Ra에 의해 캡쳐하였다. 포화된 농도 (100nM)의 his-PDL1을 평가된 PDL1 결합에 사용하였다. 모든 융합 분자는 PDL1 및 IL7Ra의 이중-특이적 결합을 나타냈다 (도 7). 이에 더하여, 항-PDL1-IL7^W142A는 IL7Ra로의 감소된 결합을 나타냈으며, 이것은 그것의 감소된 IL7 효능과 일치하였다 (도 7).

실시예 6: 인간 T 세포 기능에 대한 항-PDL1-IL7 융합 분자의 시너지 자극

융합 분자의 시험관 내 기능을 평가하기 위해, 인간 T 세포의 반응을 혼합된 림프구 반응 설정에서 평가하였다. 인간 DC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 CD14⁺ 단핵구로부터 7일 동안 분화시켰다. 그 다음에 또 다른 공여체로부터 단리된 CD4⁺ T 세포를 DC 및 단계 희석된 융합 분자와 공동-배양하였다.

접종 후 제5 일에, 배양 상층액을 IFNγ 생산에 대하여 분석하였다. 결과는 항-PDL1-IL7 및 항-PDL1-IL7^W142A가 증강 인간 T 세포 기능에 대하여 항-PDL1 mAb 또는 IL7보다 우수한 효능을 나타낸다는 것을 가리킨다 (도 8). IL7 효능이 감소된 항-PDL1-IL7^W142A는 인간 T 세포 반응에 대하여 L1I7과 비슷한 효능을 나타냈다. 그러므로, 융합 분자는 PDL1 길항작용과 IL7 효과의 시너지 효과 및 시너지 효과에 필요한 것은 아니지만 전체 IL7 활성을 나타냈다. 감소된 IL7 활성 및 면역-자극에 대한 강력한 시너지 효과를 가진 항-PDL1-IL7 분자가 미래의 임상 의학에 있어서 더 양호한 안전성 프로파일을 가질 수도 있다.

실시예 7: 항-PDL1-IL7의 생체 내 트래킹(tracking)

생체 내에서 항-PDL1-IL7 융합 분자의 분포를 평가하기 위해, 생체 내 트래킹 분석을 실행하였다. 간략히 말하면, ICG-라벨링된 항-PDL1 mAb, 항-PDL1-IL7 또는 Fc-IL7를 종양 크기가 500mm³에 도달할 때까지 HCC827-이식된 CD34⁺ 조혈성 줄기 세포 (HSC) 인간화된 마우스에 정맥 내로 주사하였다. 이미지화 시스템을 사용하여 상이한 시간 간격으로 형광 신호를 캡쳐하였다. 도 9에서 나타난 바와 같이, 항-PDL1 mAb와 유사하게, 항-PDL1-IL7은 종양 부위에서 매우 풍부한 반면에 Fc-IL7은 특히 투여 후 제1 일에 널리 퍼졌다. 이들 데이터는 항-PDL1-IL7의 선택적 및 특이적 분포를 종합적으로 나타냈으며, 융합 분자에서 IL7의 감소된 전신 효과를 입증하였다.

실시예 8: PDL1 -요법 저항성 B16F10 마우스 모델에서 항- PDL1 -IL7의 생체 내 효능

항-PDL1-IL7의 생체 내 효능을 평가하기 위해서, PDL1 항체 저항성 B16F10 흑색종 동계(syngeneic) 마우스 모델을 마우스 PDL1과 교차-반응하는 항-PDL1 항체와 융합된 두 개의 마우스 IL7로 구성된 분자인 대용물 항-PDL1-IL7과 함께 이용하였다. 이 시점에, ADCC 기능을 갖거나 (hIgG1^N297A) 또는 갖지 않는 (mIgG2a) IgG의 두 개의 아이소폼을 사용하여 효능에 대한 ADCC의 기여도를 평가하였다. 간략히 말하면, 같은 몰의 항-PDL1, mIL7-Fc, 이들 두 개의 분자 또는 융합 분자의 조합을 B16F10 종양 세포 이식 날에 C57/Bl6 마우스에 s.c. 투여하였고 4일마다 반복하였다.

도 10에서 나타난 바와 같이, mIL7-Fc 및 ADCC-비활성화된 항-PDL1-hIgG1^N297A 단일 요법은 종양 성장 억제에 있어서 매우 약한 효능을 나타냈다 (종양 성장 지수 (TGI) = 각각 22.5% 및 21%). 그에 반해, 활성화된-ADCC 기능을 갖는 항-PDL1-mIgG2a는 종양 성장의 중간의 감쇠를 나타냈다 (TGI=52.0%). 항-PDL1 mAb와 mIL7의 조합은 ADCC-비활성화된 군과 활성화된 군 둘 다에서 각각의 단일 요법과 비교하여 시너지 효과를 나타냈으며, ADCC-활성화된 군에서 종양 성장을 더 크게 억제하였다 (TGI=42.3% 및 73.4%). 더 중요하게는, 두 융합 분자 (ADCC 기능을 갖거나 갖지 않음)는 조합군과 비교하여 종양 성장을 방지하는데 있어서 더 양호한 효능을 나타내며 (TGI=82.0% 및 86.3%), 종양 발달의 부위-특이적 제어에 있어서 이기능적 분자의 메커니즘의 이점을 나타낸다. 실험이 끝나면, 각 동물의 종양 중량을 측정하였다. 종양 중량의 변화의 경향이 종양 부피 변화와 유사하였다 (도 11). 이들 데이터는 항-PDL1-IL7 분자의 종양 성장 제어에 대한 ADCC의 기여도를 나타냈다.

그 다음에, 비장 및 종양 침윤 CD4⁺ T 및 CD8⁺ T 세포의 무명수를 FACS로 분석하였다. 단일 요법, 조합 요법 또는 융합 분자 처리와 관계없이 mIL-7-처리-관련된 군에서 비장 및 종양 침윤 CD4⁺ T 및 CD8⁺ T 세포의 증가를 관찰하였으며, IL7은 말초 환경 및 종양 내 환경 모두에서 T 세포 증식을 증진시키는 역할을 했다 (도 12). 이들 데이터는 항-PDL1-IL7 융합 분자가 PDL1 길항작용 효과와 IL7-구동된 T 세포 증식의 조합을 통해 우수한 효능을 나타냈으며, 그 결과 항-종양 미세 환경이 다시 활성화되었음을 나타낸다.

* * *

본 개시물은 본 개시물의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되는 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되어서는 안 되고, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법이 본 개시물의 범위 내에 포함된다. 본 개시물의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시물의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 개시물은 첨부된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에 있으면 본 개시물의 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> I-Mab <120> ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND IL-7 FUSIONS <130> P19400321W <150> PCT/CN2018/074121 <151> 2018-01-25 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 9 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Ala Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150

Claims

펩타이드 링커를 통해 IL-7 수용체에 결합할 수 있는 인간 IL-7 단백질 또는 이것의 단편에 융합된 PD-L1 억제자를 포함하는 융합 분자.
제1 항에 있어서, 펩타이드 링커는 5 내지 100개의 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제2 항에 있어서, 펩타이드 링커는 10-75개의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항에 있어서, 펩타이드 링커의 아미노산 잔기 중 적어도 20%는 알라닌, 글리신, 시스테인, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항에 있어서, 펩타이드 링커의 아미노산 잔기 중 적어도 40%는 알라닌, 글리신, 시스테인, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항에 있어서, 펩타이드 링커는 서열 번호: 1-5로 이루어진 군으로부터 건택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 억제자는 유인 PD-1 단백질 또는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제7 항에 있어서, 유인 PD-1 단백질은 PD-L1에 결합하는 비활성 PD-1인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제7 항에 있어서, 항-PD-L1 항체의 항원-결합 단편은 단일 사슬 단편, Fab 단편, 또는 한 쌍의 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제7 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 단일특이적 항체 또는 제2 특이성을 추가로 갖는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제10 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 ADCC-활성화된 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제7 항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 각각 서열 번호:6의 잔기 31-35, 잔기 50-66, 및 잔기 99-108의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 번호:7의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97의 아미노산 서열을 가진 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제7 항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 9에 대하여 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 한편 IL-7 수용체 알파에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제13 항에 있어서, 서열 번호: 9에 대하여 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 야생형 인간 IL-7 단백질과 비교하여 IL-7 수용체 알파에 대하여 감소된 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제15 항에 있어서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 위치 142에서 G, A, V, C, L, I, M, 및 F로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제15 항에 있어서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 위치 142에서 A, V, L, I, M, 및 F로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제14 항에 있어서, IL-7 단백질은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제14 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7 단백질의 단편을 더 포함하며, 단편은 적어도 네 개의 알파-나선 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 링커는 PD-L1 억제자의 C-말단 잔기에 융합되고, 이것의 단편의 IL-7 단백질의 N-말단 잔기에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제1 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 링커는 PD-L1 억제자의 N-말단 잔기에 융합되고, IL-7 단백질의 C-말단 잔기에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제21 항에 있어서, 펩타이드 링커는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편의 경쇄의 N-말단 잔기에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 분자.
제21 항에 있어서, 펩타이드 링커는 항-PD-L1 항체 또는 이것의 단편의 중쇄의 N-말단 잔기에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 분자.
서열 번호: 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 9에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 단리된 단백질로서, 펩타이드는 IL-7 수용체 알파에 결합할 수 있지만 야생형 인간 IL-7 단백질과 비교하여 IL-7 수용체 알파에 대하여 감소된 결합 친화도를 갖는, 단리된 단백질.
제24 항에 있어서, 펩타이드는 위치 142에서 Trp 이외의 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제24 항에 있어서, 펩타이드는 위치 142에서 G, A, V, C, L, I, M, 및 F로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제24 항에 있어서, 펩타이드는 위치 142에서 A, V, L, I, M, 및 F로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제24 항에 있어서, 펩타이드는 위치 142에서 알라닌을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항의 분자 또는 제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항의 단백질, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항의 분자 또는 제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 세포.
필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항의 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항의 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제32 항에 있어서, 환자에게 PD-L1 억제자를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제33 항에 있어서, 단백질 및 PD-L1 억제자는 약 2:1 내지 1:2의 몰 비를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제31 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁체부암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장관암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.