CN110352202A - 抗pd-l1抗体和il-7融合蛋白 - Google Patents

抗pd-l1抗体和il-7融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN110352202A
CN110352202A CN201980001526.2A CN201980001526A CN110352202A CN 110352202 A CN110352202 A CN 110352202A CN 201980001526 A CN201980001526 A CN 201980001526A CN 110352202 A CN110352202 A CN 110352202A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
fusion molecule
antibody
cancer
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980001526.2A
Other languages
English (en)
Inventor
方磊
崔菲菲
顾海娟
王正毅
郭炳诗
臧敬五
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Tian Jing Shengwu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tian Jing Shengwu filed Critical Tian Jing Shengwu
Publication of CN110352202A publication Critical patent/CN110352202A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Abstract

提供了具有通过肽接头与人IL‑7蛋白或其片段融合的PD‑L1抑制剂的融合分子。所公开的融合分子表现出协同的抗肿瘤效果。

Description

抗PD-L1抗体和IL-7融合蛋白
背景技术
白细胞介素7(IL-7)是由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌的造血生长因子。IL-7刺激多能造血干细胞分化为淋巴祖细胞。它还刺激淋巴谱系中所有细胞(B细胞、T细胞和NK细胞)的增殖。IL-7是一种对B细胞和T细胞的发育很重要的细胞因子。该细胞因子和肝细胞生长因子(HGF)形成异二聚体，其作为前祖B细胞生长刺激因子起作用。发现该细胞因子是早期T细胞发育过程中T细胞受体β(TCRβ)的V(D)J重排的辅因子。该细胞因子可以由肠上皮细胞和上皮杯状细胞局部产生，并且可以作为肠粘膜淋巴细胞的调节因子。
已经在几个I期和II期临床试验中将重组IL-7安全地施用于患者。癌症患者中IL-7的人体研究表明，施用该细胞因子可以瞬时破坏CD8+和CD4+T细胞的稳态，同时CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的百分比相应降低。然而，没有观察到事实上的癌症消退。
程序性死亡配体1(PD-L1)，也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，是40kDa的1型跨膜蛋白，其在妊娠、组织移植、自身免疫性疾病和其他疾病状态，如肝炎等特殊事件期间在抑制免疫系统中起主要作用。PD-L1与PD-1或B7.1的结合传递抑制信号，其减少淋巴结处CD8+T细胞的增殖，除此之外，PD-1还可以通过细胞凋亡控制外源性抗原特异性T细胞在淋巴结中的积累，所述凋亡通过基因bcl-2的下调来消除。
已经显示PD-L1的上调可以使癌症逃避宿主免疫系统。分析来自肾细胞癌患者的肿瘤标本发现，PD-L1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性增加和死亡风险增加相关。许多PD-L1抑制剂作为免疫肿瘤学疗法正在开发中，并且在临床试验中显示出良好的结果。
除了治疗癌症之外，PD-L1抑制还显示出治疗感染性疾病的前景。在细胞内感染的小鼠模型中，单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)诱导T细胞、NK细胞和巨噬细胞中的PD-L1蛋白表达。PD-L1阻断(例如，使用阻断抗体)导致感染小鼠的死亡率增加。阻断减少了巨噬细胞产生的TNFα和一氧化氮、减少了NK细胞产生的颗粒酶B，降低了单核细胞增生李斯特菌抗原特异性CD8 T细胞(但不是CD4 T细胞)的增殖。该证据表明PD-L1在细胞内感染中起积极的共刺激分子的作用。
概要
本公开证明，当PD-L1抑制剂通过肽接头与IL-7蛋白融合时，融合分子可以维持两种组分的结合活性。而且，所述的融合分子表现出与单独两种蛋白质的组合相当的活性。此外，使用活性降低的突变型IL-7蛋白可以实现改善的结果。
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种融合分子，其包含通过肽接头与人IL-7蛋白或其片段融合的PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，所述的肽接头具有5～100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的肽接头具有10～75个氨基酸。在一些实施方案中，所述的肽接头的至少20％的氨基酸残基为选自由丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸构成的群组中的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的肽接头的至少40％的氨基酸残基为选自由丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸构成的群组中的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的肽接头包含选自由SEQ ID NO：1～5构成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的PD-L1抑制剂是诱饵PD-1蛋白，例如结合PD-L1的无活性PD-1。在一些实施方案中，所述的PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体或其片段。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体具有IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体的片段为单链片段、Fab片段或一对Fab片段。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体为单特异性抗体或进一步具有第二特异性的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体能介导ADCC。
在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述的重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:6的第31～35位残基、第50～66位残基以及第99～108位残基的CDR1、CDR2和CDR3；以及轻链可变区，所述的轻链可变区包含分别具有SEQ IDNO:7的第24～34位残基、第50-56位残基以及第89～97位残基的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的IL-7蛋白包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其能够结合IL-7受体α。在一些实施方案中，根据SEQ ID NO：9，所述的IL-7蛋白在142位具有选自G、A、V、C、L、I、M和F的氨基酸残基。在一些实施方案中，根据SEQ ID NO：9，所述的IL-7蛋白在142位具有选自A、V、L、I、M和F的氨基酸残基。在一些实施方案中，与野生型人IL-7蛋白相比，所述的与SEQ ID NO：9具有至少95％序列同一性的氨基酸序列对IL-7受体α的结合亲和力降低。在一些实施方案中，所述的IL-7蛋白包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的融合分子包含所述的IL-7蛋白的片段。在一些实施方案中，所述的片段包含至少一个、两个、三个或所有四个α-螺旋基序。
在一些实施方案中，肽接头与所述的PD-L1抑制剂的C末端残基融合，并与所述的IL-7蛋白的N末端残基融合。在一些实施方案中，所述的肽接头与所述的PD-L1抑制剂的N末端残基融合，并与IL-7蛋白的C末端残基融合。在一些实施方案中，所述的肽接头与所述的抗PD-L1抗体或其片段的轻链的N-末端残基融合。在一些实施方案中，所述的肽接头与所述的抗PD-L1抗体或其片段的重链的N末端残基融合。
在一个实施方案中，还提供了分离的蛋白质，其包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少95％序列同一性的肽，其中所述的肽能够结合IL-7受体α，但与野生型人IL-7蛋白相比，其对IL-7受体α的结合亲和力降低。在一些实施方案中，所述的肽在第142位处具有除Trp之外的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的肽在第142位处具有选自Ala、Gly、Cys、Leu、Ile、Met、Phe和Val的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的肽在第142位处具有选自Ala、Leu、Ile、Met、Phe和Val的氨基酸残基。
还提供了治疗有此需要的患者中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法需要向患者施用本公开的分子。在一些实施方案中，所述方法需要施用所公开的IL-7变体，任选地与PD-L1抑制剂一起施用。在一些实施方案中，所述的癌症选自由膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌和甲状腺癌构成的群组。
附图简要说明
图1，在图1A-D中，展示了一些融合分子结构。
图2显示了降低IL-7蛋白活性的W142A突变的鉴定。
图3证明W142A突变确实降低了抗PD L1-IL7融合分子的IL7效力。
图4，图4A-C，显示了融合分子刺激STAT5信号传导(A)、结合IL7R(B)和促进IL7R内化(C)的能力的结果。
图5显示融合分子结合细胞结合的PD L1蛋白的能力。
图6显示所有测试的融合分子显示出与抗PD L1单克隆抗体相似的结合。
图7显示抗PD L1-IL7W142A与IL7Rα的结合降低，这与其降低的IL7效力一致。
图8显示抗PD L1-IL7和抗PD L1-IL7W142A具有优于抗PD L1 mAb或IL7的增强人T细胞功能的功效。
图9显示测试的融合分子，如抗PD L1抗体，能够在肿瘤部位富集。
图10显示了各种测试分子对肿瘤生长抑制的功效。
图11显示了体内研究结束时每只动物的肿瘤重量。
图12显示了显示在体内研究结束时每只动物的脾脏和肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的绝对数量的数据。
详细描述
定义
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也旨在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。
本发明中关于细胞、核酸例如DNA或RNA所使用的术语“分离的”，是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它DNA或RNA所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。
在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸，意指非天然存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性实施例可以通过组合产生通常并不存在的多核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。该比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序，比如Ausubelet al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序来确定。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，程序是BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多核苷酸。
术语“等价的核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补序列的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补序列杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价的多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。
杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×SSC或相同等离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×SSC中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×SSC中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性实施例指在细胞中通常存在的温度、离子强度、pH和Mg2+浓度。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多种形式的基因或其部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物的任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是非限制性的多核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。该种实施例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。
在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等，已被充分表征并且已知其赋予的功能特异性。鉴于本公开的内容，本领域普通技术人员容易辨别这些种类和同种型中的每一种的修饰形式，因此都在本发明公开的保护范围内。所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG种类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的叉口开始并延续通过可变区包围重链。
本发明公开的抗体、抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。
轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能使用。就这点而言，应理解，轻链(Vκ)和重链(VH)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链中各自的三个CDR(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)限定。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。由定位的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以容易地鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)以及Chothia andLesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括其所有的含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过本发明引用其全部内容并入本文。
根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含以上引用的每个参考文献所定义的CDR的适量的氨基酸残基在下表中被列出进行比较。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的CDR。
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。本发明所使用的“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)中提出的编号系统。
除上述表格之外，Kabat编号系统如下述方式描述CDR区：CDR-H1在大约第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基之后的大约9个残基)开始，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-H2在CDR-H1结束后的第15个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸残基，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。CDR-H3从CDR-H2结束后的大约第33个氨基酸残基开始；包括3-25个氨基酸；并以序列W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。CDR-L1大约从第24个残基开始(即在半胱氨酸残基之后)；包括约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-L2从CDR-L1结束后的大约第16个残基开始，包括大约7个残基。CDR-L3在CDR-L2结束后的大约第33个残基(即在半胱氨酸残基之后)开始；包括大约7-11个残基并且以序列F或W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施例中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
在本发明中，术语“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗原结合多肽可以包括含有CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域以及至少一部分铰链区以及CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施例中，本发明公开的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或部分CH2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。
在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。在本发明中，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。CH1结构域与VH结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
在本发明中，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案时，从抗体的约第244个残基延伸至第360个残基的部分重链分子(第244至360个残基，Kabat编号系统；第231-340个残基，EU编号系统；参见Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))。CH2结构域是独特的，因为该结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入两个N-连接的分支碳水化合物链。还充分记载了CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。
在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链分子。所述铰链区包含约25个残基并且是柔韧的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol161:4083(1998))。
在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在Kabat编号系统中对应的位置239和242(位置226或229，EU编号系统)处相连接。
在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指其免疫反应性区域或位点从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。在某些实施例中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。
在本发明中，“人源化百分比”是通过测定人源化结构域与种系结构域之间的框架氨基酸差异(即非CDR区的差异)的数目，从氨基酸的总数中减去该数目，然后除以氨基酸总数乘以100计算而来。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时，比它与随机的、不相关的表位结合更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”比抗体“B”对特定表位具有更高的特异性，或者可以认为抗体“A”以比结合相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如癌症的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比延长生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”通常指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农场动物和动物园、运动或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
在本发明中，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括从施用本发明公开的抗体或组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的受试者，例如哺乳动物受试者。
融合分子
本公开提供了融合分子，其以协同方式将PD-L1抑制或阻断与IL-7细胞因子活性组合，从而进一步最大化功效和安全性。
在一个实施方案中，所述的融合分子包括与人IL-7蛋白或其片段融合的PD-L1抑制剂(例如，诱饵PD-1蛋白或抗PD-L1抗体或其片段)，优选通过肽接头融合。所述的肽接头通常是具有5～100个氨基酸残基的肽。优选地，所述的接头包括足够小的氨基酸以确保其柔韧性。例如，所述接头的长度可以为5～100个氨基酸、10～90个氨基酸、10～80个氨基酸、10～75个氨基酸、15～90个氨基酸、15～80个氨基酸、15～70个氨基酸、20～80个氨基酸、20～70个氨基酸、20～60个氨基酸、25～90个氨基酸、25～80个氨基酸、25～75个氨基酸、25～70个氨基酸、25～60个氨基酸、30～80个氨基酸、30～70个氨基酸、30～60个氨基酸，或40～70个氨基酸，但不限于此。
通过掺入最小百分比的较小氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸，可以实现接头的灵活性。在一些实施方案中，所述的接头包括至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％选自丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸。肽接头的非限制性实例提供在SEQ ID NO：1-5中。
人IL-7蛋白是已知的，蛋白质序列记载在GenBank中，登记号为No.NP_000871.1，其成熟序列在SEQ ID NO：8中提供。通过计算和测试，确定具有降低的IL-7活性的IL-7蛋白的突变形式与抗PD-L1保持协同作用，与野生型IL7相比，具有总体改善的安全性。此类突变体的非限制性实例包括那些在IL7W142处具有氨基酸取代的突变体。所述取代可以是非极性氨基酸，如G、A、V、C、P、L、I、M和F。
如本文所用的术语“人IL-7蛋白”是指野生型人IL-7及其生物等价物，即与野生型人IL-7具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，并保持野生型的活性，例如与IL-7受体(例如，受体α)的结合(可容易地测得)的那些。在一些实施方案中，与野生型相比，所述的人IL-7蛋白具有降低的IL-7活性。在一些实施方案中，与野生型相比，所述的降低的IL-7活性至少为对IL-7受体的结合活性的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，所述的IL-7活性比野生型的IL-7活性低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％。在一些实施方案中，所述的IL-7活性介于IL-7W142A和野生型IL-7的活性之间。在一些实施方案中，所述的IL-7蛋白是能够结合IL-7受体的合成类似物。
在一些实施方案中，与野生型相比，所述的人IL-7蛋白包含在W142处的突变。在一些实施方案中，所述突变为非极性氨基酸。所述突变的非限制性实例包括突变为Ala、Gly、Cys、Leu、Ile、Met、Phe或Val。在一些实施方案中，所述突变是突变为Phe、Met、Ile、Leu、Val或Ala。在优选的实施方案中，所述突变为W142A(例如，SEQ ID NO：9)。
在一些实施方案中，还可以使用IL-7蛋白的片段。在一些实施方案中，所述片段能够结合IL-7受体(例如，受体α)，优选与野生型蛋白质相比具有降低的IL-7活性。已经证明了与IL-7受体复合的IL-7的三维结构。参见，例如，McElroy et al.,Structure.2009Jan14；17(1):54-65。IL-7采用上-上-下-下4螺旋束拓扑结构，带有两个交叉环。α-螺旋A-D的长度在13～22个残基之间变化。在一些实施方案中，所述片段包含至少一个、两个或三个α螺旋。在一些实施方案中，所述片段包含所有四个α螺旋。在一些实施方案中，上述片段保留界面氨基酸残基，包括S19、D74和K81。
所述IL-7蛋白还可以在其他氨基酸位置进行进一步修饰，例如添加、缺失和/或取代。这些修饰可以是在一个、两个或三个位置上的取代。在一个实施实施方案中，所述的修饰是在一个位置的取代。在一些实施方案中，此类取代为保守取代。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用结构相似的串替换，所述串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
下表提供了保守氨基酸取代的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表明两个氨基酸之间的保守取代。
表A氨基酸相似性矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
表B保守氨基酸取代
原氨基酸 取代氨基酸
丙氨酸 D-Ala,Gly,Aib,β-Ala,L-Cys,D-Cys
精氨酸 D-Arg,Lys,D-Lys,Orn D-Orn
天冬酰胺 D-Asn,Asp,D-Asp,Glu,D-Glu Gln,D-Gln
天冬氨酸 D-Asp,D-Asn,Asn,Glu,D-Glu,Gln,D-Gln
半胱氨酸 D-Cys,S-Me-Cys,Met,D-Met,Thr,D-Thr,L-Ser,D-Ser
谷氨酰胺 D-Gln,Asn,D-Asn,Glu,D-Glu,Asp,D-Asp
谷氨酸 D-Glu,D-Asp,Asp,Asn,D-Asn,Gln,D-Gln
甘氨酸 Ala,D-Ala,Pro,D-Pro,Aib,β-Ala
异亮氨酸 D-Ile,Val,D-Val,Leu,D-Leu,Met,D-Met
亮氨酸 Val,D-Val,Met,D-Met,D-Ile,D-Leu,Ile
赖氨酸 D-Lys,Arg,D-Arg,Orn,D-Orn
甲硫氨酸 D-Met,S-Me-Cys,Ile,D-Ile,Leu,D-Leu,Val,D-Val
苯丙氨酸 D-Phe,Tyr,D-Tyr,His,D-His,Trp,D-Trp
脯氨酸 D-Pro
丝氨酸 D-Ser,Thr,D-Thr,allo-Thr,L-Cys,D-Cys
苏氨酸 D-Thr,Ser,D-Ser,allo-Thr,Met,D-Met,Val,D-Val
酪氨酸 D-Tyr,Phe,D-Phe,His,D-His,Trp,D-Trp
缬氨酸 D-Val,Leu,D-Leu,Ile,D-Ile,Met,D-Met
如本文所用，术语“PD-L1抑制剂”是指能够结合PD-L1并阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用，从而抑制PD-L1活性的分子，例如蛋白质或含蛋白质的复合物。PD-L1抑制剂的非限制性实例是诱饵PD-1蛋白，例如保持结合PD-L1的能力的无活性PD-1变体。Maute etal.,“Engineering high-affinity PD-1variants for optimized immunotherapy andimmuno-PET imaging,”PNAS 2015 112(47)E6506-E6514(2015)中提供了此类PD-1变体的实例。另一个非限制性实例是抗PD-L1抗体。
存在许多已知的适合包含在本公开的融合分子中的抗PD-L1抗体及其片段。对于示例性抗PD-L1抗体，重链可变区和轻链可变区的序列在SEQ ID NO：6和7中提供。包含示例抗体的CDR区的变体抗PD-L1抗体也在本技术的范围内。例如，所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段可包括重链可变区，其包含分别具有SEQ ID NO:6的第31～35位残基、第50～66位残基以及第99～108位残基的CDR1、CDR2和CDR3；以及轻链可变区，其包含分别具有SEQ IDNO:7的第24～34位残基、第50-56位残基以及第89～97位残基的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体具有IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型，并且该片段可以采取任何形式，例如单链片段、Fab片段或一对Fab片段。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体能介导ADCC。
融合分子的一些示例结构在图1的图1A-D中示出。在图1A中，所述的融合分子包括完整的IgG抗PD-L1抗体和两个IL-7蛋白，每个蛋白通过接头融合到抗体CH3的C末端。该融合多肽可以用两个单独的DNA构建体制备。在图1B中，所述的融合分子还包括IgG抗PD-L1抗体和两种IL-7蛋白；然而，所述的IL-7蛋白通过接头融合到轻链可变区的N末端。
在图1的图1C中，不同的是，在图1C中所述的IL-7蛋白通过接头与重链的N-末端融合。另一个示例性结构在图1D中示出，其显示每个通过接头融合至抗体CH2的N末端的IL-7蛋白，其中CH2-CH3片段位于VH-CH2部分的上游。
还可以制备更多未在图中示出的结构，其可以是单特异性抗体或进一步具有第二特异性的双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述的诱饵PD-1蛋白或抗体包含通常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个基团。以下更详细地描述示例性修饰。例如，本公开的抗体可以包含柔性接头序列，或者可以被修饰以添加功能基团(例如，PEG、药物、毒素或标记)。
本公开内容的抗体、其变体或衍生物包括经修饰(即通过任何类型的分子与抗体的共价连接，其不阻止抗体与表位的结合)的衍生物。例如但不限于，抗体可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非经典氨基酸。
在一些实施方案中，所述的诱饵PD-1蛋白或抗体可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
所述的诱饵PD-1蛋白或抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可以包括可检测的标记，例如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂(可为药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记，及其组合以及本领域已知的其他此类试剂。
可以通过将所述的诱饵PD-1蛋白或抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记诱饵PD-1蛋白或抗体。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、热稳定的吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
所述的诱饵PD-1蛋白或抗体也可以使用荧光发射金属如152Eu或其他镧系元素可检测地标记。可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团将这些金属连接到抗体上。用于将各种基团与抗体缀合的技术是公知的，参见例如Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For DrugDelivery”,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.,(eds.),MarcelDekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review”,in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin etal.(eds.),Academic Press pp.303-16(1985)，以及Thorpe et al.,“The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.(52:119-58(1982))。
IL-7变体
制备了与野生型蛋白质相比，具有降低活性的人IL-7蛋白质的突变体。这些突变体被证明在需要这种活性降低的情况下(例如出于安全考虑)是有用的。因此，在一个实施方案中，本公开还提供了包含此类突变体的分离的多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方案中，所述的多肽包含与SEQ ID NO：9具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的肽，其中所述的肽能够结合IL-7受体α，但与野生型人IL-7蛋白相比，其对IL-7受体α具有降低的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述的人IL-7蛋白与野生型相比，具有降低的IL-7活性。在一些实施方案中，IL-7活性的所述降低为对IL-7受体的结合活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，与野生型相比，所述的人IL-7蛋白包括W142处的突变。在一些实施方案中，所述的突变为非极性氨基酸。所述的突变的非限制性实例包括突变为Ala、Gly、Cys、Leu、Ile、Met、Phe或Val。在一些实施方案中，所述的突变为Phe、Met、Ile、Leu、Val或Ala。在优选的实施方案中，所述的突变为W142A。在一些实施方案中，W142处的突变选自Gly、Cys、Leu、Ile、Met、Phe或Val。
在一些实施方案中，还可以使用IL-7蛋白的片段。在一些实施方案中，所述的片段能够结合IL-7受体(例如，受体α)，优选与野生型蛋白质相比具有降低的IL-7活性。在一些实施方案中，所述的片段包含至少一个、两个或三个α螺旋。在一些实施方案中，所述的片段包括所有四个α螺旋。在一些实施方案中，所述的片段保留界面氨基酸残基，包括S19、D74和K81。
所述的IL-7蛋白可以允许在其他氨基酸位置进一步修饰，例如添加、缺失和/或取代。这些修饰可以是在一个、两个或三个位置上的取代。在一个实施方案中，所述的修饰是在一个位置的取代。在一些实施方案中，此类取代为保守取代。
编码多肽的多核苷酸和制备多肽的方法
本公开还提供了编码本公开的诱饵PD-1蛋白、抗体、融合分子、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本公开的所述多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的完整重链和轻链可变区。另外，本公开的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的重链和轻链可变区的部分。
制备诱饵蛋白和抗体的方法是本领域熟知的并在本文中有所描述。在某些实施方案中，本公开的所述抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域描述的技术和如本文所述的技术制备全人源抗体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特定抗原的全人源抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生这样的抗体，但其内源基因座已失去功能。美国专利第6,150,584号、第6458592号和第6,420,140号描述了可用于制备此类抗体的示例性技术，其全部内容通过引用并入本申请。
癌症治疗
如本文所述的，本公开的所述融合分子在治疗癌症中表现出协同效应，并且可以用于某些治疗和诊断方法。
本公开内容还涉及治疗，其涉及将本公开的融合分子施用于患者，例如动物、哺乳动物和人，以用于治疗本文所述的一种或多种病症或病症。本公开的治疗化合物包括但不限于本公开的融合分子(包括如本文所述的变体和衍生物)和编码本公开的融合分子的核酸或多核苷酸(包括如本文所述的变体和衍生物)。
所述治疗还可以包括施用本文公开的IL-7变体，任选地与本文公开的PD-L1抑制剂施用组合。在一些实施方案中，施用的所述IL-7变体和施用的所述PD-L1抑制剂的摩尔比至少为5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1或者1:2。在一些实施方案中，施用的所述IL-7变体和施用的所述PD-L1抑制剂的摩尔比不大于2:1、1.5:1、1:1、1:2、1:3、1:4或者1:5。在一些实施方案中，施用的所述IL-7变体和施用的PD-L1抑制剂的摩尔比为2:1～1:2或1.5:1～1:1.5。
在本公开中还提供了细胞疗法，例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。可以使用合适的细胞，其与本公开的抗PD-L1抗体接触(或者可选地工程化以表达本公开的抗PD-L1抗体)。在这种接触或工程化后，可将细胞引入需要治疗的癌症患者。所述的癌症患者可患有本文公开的任何类型的癌症。细胞(例如，T细胞)可以是，例如，肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合，但不限于此。
在一些实施方案中，所述的细胞是从癌症患者自身中分离的。在一些实施方案中，所述的细胞由供体或细胞库提供。当所述的细胞与所述的癌症患者分离时，可以最小化不期望的免疫反应。
可以用本公开的融合分子或其变体或衍生物治疗、预防、诊断和/或预后的与细胞存活增加相关的其他疾病或病症包括但不限于恶性肿瘤和相关疾病的进展和/或转移，相关疾病为例如白血病[包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病)和慢性淋巴细胞白血病]、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括使用的特定融合分子、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄率、药物组合和所治疗的特定疾病的严重程度。医疗护理人员对这些因素的判断在本领域的普通技术范围内。用量还取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特征、疾病的严重程度和期望的效果。可以通过本领域周知的药理学和药代动力学原理来使用的量确定。
融合分子、变体的施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过静脉输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。因此，含有本发明的抗原结合多肽的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、脑内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏、滴剂或透皮贴剂)、含服或口腔或鼻腔喷雾施用。
本文所用的术语“肠胃外”是指施用方式，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
给药可以是全身性的或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的融合分子引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管来促进，例如，连接到贮液囊[如奥马耶贮液囊(Ommaya reservoir)]。也可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及使用雾化剂的制剂。
可能需要将本公开的融合分子或组合物局部施用于需要治疗的区域；可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、局部应用来实现，例如，与手术后的伤口敷料、通过注射、借助于导管、通过栓剂或者通过植入物结合。所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如弹性膜或纤维。优选地，当施用本公开的蛋白质(包括抗体)时，必须小心使用蛋白质不吸收的材料。
可通过标准临床技术确定本发明的融合分子在治疗、抑制和预防炎性、免疫或恶性疾病、病症或病症中的有效量。此外，可任选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径，以及疾病、病症或症状的严重程度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
作为一般建议，向患者施用本公开的抗原结合多肽的剂量通常为0.1～100mg/kg患者体重，在0.1mg/kg至20mg/kg患者体重之间，或1～10mg/kg患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫应答，在人体内人抗体具有比来自其他物种的抗体更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的施用是可能的。此外，本发明的融合分子的给药剂量和频率可以通过修饰例如脂化来增强融合分子的摄取和组织渗透(例如，进入大脑)来减少。
组合物
本公开还提供了药物组合物。此类组合物包含有效量的融合分子和可接受的载体。在一些实施方案中，所述的组合物还包含第二种抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，特别是人类。此外，“药学上可接受的载体”通常是无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的制剂助剂。
术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。当静脉内施用所述的药物组合物时，水为优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述的组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖也可以使用。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。所述的组合物可以与传统的粘合剂和载体如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例由E.W.Martin在雷明登氏药学全书中描述，其通过引用并入本申请。此类组合物含有治疗有效量的抗原结合多肽，优选为纯化形式，以及合适量的载体，以便为患者提供合适的给药形式。所述的制剂应适合给药方式。母本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一个实施方案中，根据常规程序将所述的组合物配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式单独或混合在一起，例如，在指示活性剂的量的密封容器如安瓿或小药囊中以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式供应。当所述的组合物通过输注施用时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合成分。
具体实施方式
实施例1设计和产生抗PD L1和人IL7融合分子
设计抗PD L1抗体的重链或轻链基因(参见表1中的可变区序列)以通过表3中的肽接头与人IL7基因(表2)融合。然后将得到的基因克隆进入哺乳动物表达载体并转染入HEK293T细胞。从转染细胞的上清液中通过蛋白A纯化抗体-细胞因子融合蛋白(图1，图1A中的结构)。
表1抗PD-L1抗体序列(下划线表示CDR残基)
表2 IL-7序列
表3肽接头序列
接头序号 序列 SEQ ID NO:
1 GGGGSGGGGS 1
2 GGGGSGGGGS GGGGS 2
3 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 3
4 GSGSGSGSGS GSGSGSGS 4
5 EPKSSDKTHT CPPCP 5
实施例2抗PD L1-IL7融合分子的IL7细胞因子效力
以下实施例中的所有抗PD L1-IL7融合分子均使用图1中的A设计。这些双功能分子结合PD L1拮抗作用和IL7细胞活性。考虑到抗PD L1分子和IL7的固定摩尔比(1:1)，预期具有不同活性水平的IL7变体可能与抗PD L1功能具有更好的协同作用。
已经解析了IL7/IL7R的晶体结构(Structure 2009,17：54-65)。数据显示氨基酸K120、R133、L135、Q136、E137、K139、T140、W142、N143和K144位于IL7和共有γ链(IL7信号转导受体)的界面处(图2)。将这10个氨基酸中的每一个突变为Ala，并通过SEC-HPLC评估纯度，通过2E8细胞增殖测定评估IL7活性(IL7可以驱动2E8细胞的增殖)。突变体W142A显示出显著降低的IL7效力和优异的纯度，如图2所示。
因为IL7可诱导STAT5磷酸化(pSTAT5)并随后诱导CD4T细胞增殖，为进一步评估野生型(WT)和W142A IL7对人原代T细胞的IL-7效力，进行pSTAT5测定和CD4增殖测定。简而言之，在pSTAT5测定中，用指定浓度的抗PD L1-IL7和抗PD L1-IL7W142A处理人PBMC 15分钟。在CD4增殖测定中，用抗PD L1-IL7和抗PD L1-IL7W142A处理纯化的CD4T细胞1周。如图3所示，W142A突变明显降低了抗PD L1-IL7融合分子的IL7效力。
为了微调抗PD L1-IL7融合分子的IL7活性，在IL7的W142位点上产生一系列单点突变。根据极性、氨基和羟基的数目，可以将20个氨基酸分为四类：非极性(G、A、V、C、P、L、I、M、W和F)、极性(S、T、Y、N和Q)、带正电(K、R和H)和带负电(D和E)基团。从每组中选择一些代表性氨基酸构建如下所述的突变型抗PD L1-IL7分子(表4)。结果表明，除脯氨酸(P)外的所有非极性氨基酸都可以用W142取代，产生具有高SEC纯度的突变型抗PD L1-IL7(>96.8％)。相反，W142突变为其他三种类型的氨基酸导致分子稳定性和SEC纯度下降(<84％)。接下来，使用非极性氨基酸亚型内的每个氨基酸取代W以产生一系列突变的抗PD L1-IL7分子，通过2E8增殖测定对其进行IL7活性验证(表5)。结果表明，取代氨基酸与W的相似性越低，突变分子的IL7活性越低(W>F>M>I>L>V>A)。
为了证实抗PD L1-IL7突变分子在原代CD4+T细胞中IL7活性的减弱，如上进行p-STAT5信号传导测定。如图4A所示，融合分子刺激人原CD4+T细胞中STAT5信号传导的能力逐渐降低(W>I>V>A)，其与2E8增殖测定中的相应活性相关联。为了解释连续突变抗PD L1-IL7分子的IL7活性减弱的机制，评估了IL7受体(IL7R)结合和连接介导的内化。简而言之，对于IL7R结合测定，将人原代CD4+T细胞与各种抗PD L1-IL7融合分子在4℃下孵育30分钟。PE缀合的抗人Fc二抗用于通过FACS检测与CD4+T细胞的IL7R结合的融合分子。如图4B所示，具有降低的IL7活性的所有三种抗PD L1-IL7融合分子(W142I、V和A)具有IL7R结合的降低。对于连接介导的受体内化测定，将人原代CD4+T细胞与融合分子在37℃共培养15分钟。PE-cy7-缀合的抗-CD127(IL7Ra)抗体用于通过FACS检测表面IL7R。与IL7R结合的趋势类似，那些具有降低的IL7受体结合效力的融合分子损害了IL7R内化(图4C)，表明IL7信号转导受损。总之，我们通过修饰W142的单个位点突变，开发了一系列具有不同和减弱的IL7活性的抗PDL1-IL7分子。
表4比较各种PD L1-IL7突变体的SEC特性
表5比较各种PD L1-IL7突变体在2E8增殖试验中的EC50
实施例3 PD L1与抗PD L1-IL7融合分子的结合特性
该实施例通过检测人源化抗体的完全动力学的亲和力。
使用捕获方法通过测试抗PD L1-IL7融合分子与重组PD-L1蛋白(人PD-L1-his taq)的结合。使用包被在CM5芯片上的抗人Fc抗体捕获抗PD L1-IL7融合分子。将一系列人PD-L1-his taq蛋白的稀释液以25μg/ml的流速注射到捕获的抗体上3分钟。使抗原解离900秒。所有实验均在Biacore T200上进行。使用Biacore T200评估软件进行数据分析。数据显示融合分子中PD L1的结合亲和力没有受损(表6)。
表6亲和力测试结果
样本 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
抗-PD L1 mAb 8.50E+04 1.78E-04 2.09E-09
抗-PD L1-IL7 1.03E+05 2.78E-04 2.70E-09
抗-PD L1-IL7<sup>W142V</sup> 8.20E+04 4.15E-04 5.06E-09
为了评估抗原结合特性，通过FACS分析融合分子与哺乳动物表达的PD-L1的结合。简言之，首先将PD L1-Raji细胞与从15μg/ml开始3倍深度稀释的人源化抗体一起在室温下温育1小时。用FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS)洗涤后，将Alexa 488-抗人IgG抗体加入各孔中，并在室温下温育1小时。使用FACSAriaIII评估Alexa 488的MFI。如图5所示，所有融合分子显示出与抗PD L1单克隆抗体相似的结合。
实施例4抗PD L1-IL7融合分子的PD L1拮抗剂活性
为了评估PD L1拮抗剂，进行PD1/PD L1 Jurkat测定。在Raji细胞存在下，超级抗原葡萄球菌肠毒素(SEE)通过连接Raji上的MHCII和Jurkat上的TCR分子，刺激Jurkat T细胞产生IL2。Raji细胞外源性表达的PD L1与Jurkat T细胞过度表达的PD1结合，并抑制Jurkat产生IL2。抗PD L1单克隆抗体(mAb)逆转由PD1/PD L1途径抑制的IL2产生。如图6所示，抗PD L1-IL7和抗PD L1-IL7W142A融合分子显示出与抗PD L1 mAb相当的PD L1拮抗剂功能。
实施例5抗PD L1-IL7融合分子的双特异性结合
为了验证具有与PD L1和IL7受体α(IL7Ra)双特异性结合特性的融合分子，本实施例使用生物层干涉测量法(BLI)测量双特异性结合。简而言之，生物素标记的IL7Ra首先被链霉抗生物素蛋白传感器捕获。IL7Ra捕获抗PD L1-IL7融合分子。his-PD L1的饱和浓度(100nM)用于评估PD L1结合。所有融合分子均显示对PD L1和IL7Ra的双特异性结合(图7)。此外，抗PD L1-IL7W142A显示与IL7Ra的结合降低，这与其降低的IL7效力一致(图7)。
实施例6抗PD L1-IL7融合分子对人T细胞功能的协同刺激
为了评估融合分子的体外功能，在混合淋巴细胞反应装置中评估人T细胞的反应。在GM-CSF和IL-4存在下，人DC与CD14+单核细胞分化7天。然后将从另一个供体分离的CD4+T细胞与DC和融合分子的连续稀释液共培养。
在接种后第5天，测定培养上清液中IFNγ的产量。结果表明，抗PD L1-IL7和抗PDL1-IL7W142A在增强人T细胞功能方面显示出优于抗PD L1mAb或IL7的效果(图8)。具有降低的IL7效力的抗PD L1-IL7W142A显示出与人类T细胞应答上的L1I7相当的效力。因此，融合分子具有PD L1拮抗作用和IL7作用的协同作用，且完整的IL7活性对于协同作用不是必需的。具有降低的IL7活性和对免疫刺激的强协同效应的抗PD L1-IL7分子在未来的临床中可具有更好的安全性。
实施例7体内追踪抗PD L1-IL7
为了评估体内抗PD L1-IL7融合分子的分布，进行了体内追踪测定。简而言之，当肿瘤大小达到500mm3时，将ICG标记的抗PD L1 mAb、抗PD L1-IL7或Fc-IL7静脉内注射到移植了HCC827的CD34+造血干细胞(HSC)人源化小鼠中。成像系统用于在不同的时间间隔捕获荧光信号。如图9所示，与抗PD L1 mAb相似，抗PD L1-IL7在肿瘤部位显著富集，而Fc-IL7在给药后第1天广泛扩散。这些数据共同显示了抗PD L1-IL7的选择性和特异性分布，证明了融合分子中的IL7的全身作用下降。
实施例8抗PD L1-IL7在PD L1-治疗抗性B16F10小鼠模型中的体内功效
为了评价抗PD L1-IL7的体内功效，使用PD L1抗体抗性B16F10黑素瘤同系小鼠模型与替代抗PD L1-IL7(一种由与抗PD L1抗体融合的两只小鼠IL7组成的分子，其与小鼠PDL1交叉反应)。此时，使用两种具有(hIgG1N297A)或不具有(mIgG2a)ADCC功能的IgG同种型来评估ADCC对功效的功效。简而言之，在B16F10肿瘤细胞移植当天向C57/Bl6小鼠皮下施用等摩尔的抗PD L1、mIL7-Fc，这两种分子或融合分子的组合，并且每四天重复一次。
如图10所示，mIL7-Fc和不介导ADCC的抗PD L1-hIgG1N297A单治疗在肿瘤生长抑制中显示出极弱的效力(肿瘤生长指数(TGI)分别为22.5％和21％)。相反，具有介导ADCC功能的抗PD L1-mIgG2a显示出肿瘤生长中度的减弱(TGI＝52.0％)。抗PD L1 mAb和mIL7的组合在ADCC不介导组和介导组中与它们各自的单一疗法相比显示出协同效应，在介导ADCC组中肿瘤生长具有更强烈的抑制(TGI＝42.3％和73.4％)。更重要的是，与组合组相比，两种融合分子(有和没有ADCC功能)在预防肿瘤生长方面表现出更好的效果(TGI＝82.0％和86.3％)，从机理上表明双功能分子在肿瘤发展的位点特异性控制中具有益处。在实验结束时，测量每只动物的肿瘤重量。肿瘤重量变化的趋势类似于肿瘤体积变化的趋势(图11)。这些数据表明ADCC对抗PD L1-IL7分子控制肿瘤生长的贡献。
接下来，通过FACS分析脾脏和肿瘤浸润性CD4+T和CD8+T细胞的绝对数量。在mIL-7治疗相关组中观察到脾脏和肿瘤浸润CD4+T和CD8+T细胞的增加，无论是单独、联合治疗还是融合分子治疗，表明IL7在外周增强T细胞增殖和肿瘤内环境中所起的作用(图12)。这些数据表明，抗PD L1-IL7融合分子通过PD L1拮抗作用与IL7衍生的T细胞增殖的结合表现出优异的功效，产生重新激活的抗肿瘤微环境。
***
本公开内容不限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面的单一说明，并且功能上等同的任何组合物或方法都在本公开的范围内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的实质或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
SEQUENCE LISTING
<110> 天境生物
<120> 抗PD-L1抗体和IL-7融合蛋白
<130> P19112083CP
<150> PCT/CN2018/074121
<151> 2018-01-25
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 9
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 9
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Ala Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150

Claims (35)

1.一种融合分子，其包含通过肽接头与人IL-7蛋白或其能够结合IL-7受体的片段融合的PD-L1抑制剂。
2.如权利要求1所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头具有5～100个氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头具有10～75个氨基酸。
4.如权利要求1所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头的至少20％的氨基酸残基为选自由丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸构成的群组中的氨基酸残基。
5.如权利要求1所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头的至少40％的氨基酸残基为选自由丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和丝氨酸构成的群组中的氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头包含选自由SEQ ID NO:1～5构成的群组中的氨基酸序列。
7.如权利要求1～6中任一项所述的融合分子，其特征在于，所述的PD-L1抑制剂为诱饵PD-1蛋白或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的融合分子，其特征在于，所述的诱饵PD-1蛋白为结合PD-L1的无活性PD-1。
9.如权利要求7所述的融合分子，其特征在于，所述的抗PD-L1抗体的所述抗原结合片段为单链片段、Fab片段或一对Fab片段。
10.如权利要求7所述的融合分子，其特征在于，所述的抗PD-L1抗体为单特异性抗体或进一步具有第二特异性的双特异性抗体。
11.如权利要求10所述的融合分子，其特征在于，所述的抗PD-L1抗体能介导ADCC。
12.如权利要求7所述的融合分子，其特征在于，所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述的重链可变区包含分别具有SEQ ID NO:6的第31～35位残基、第50～66位残基以及第99～108位残基的CDR1、CDR2和CDR3；以及轻链可变区，所述的轻链可变区包含分别具有SEQ ID NO:7的第24～34位残基、第50-56位残基以及第89～97位残基的CDR1、CDR2和CDR3。
13.如权利要求7所述的融合分子，其特征在于，所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包括含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
14.如权利要求1～13中任一项所述的融合分子，其特征在于，所述的IL-7蛋白包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，同时能够结合IL-7受体α。
15.如权利要求13所述的融合分子，其特征在于，与野生型人IL-7蛋白相比，所述的与SEQ ID NO：9具有至少75％序列同一性的氨基酸序列对IL-7受体α的结合亲和力降低。
16.如权利要求15所述的融合分子，其特征在于，所述的IL-7蛋白在SEQ ID NO：9的第142位具有选自G、A、V、C、L、I、M和F的氨基酸残基。
17.如权利要求15所述的融合分子，其特征在于，所述的IL-7蛋白在SEQ ID NO：9的第142位具有选自A、V、L、I、M和F的氨基酸残基。
18.如权利要求14所述的融合分子，其特征在于，所述的IL-7蛋白包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
19.如权利要求14～18中任一项所述的融合分子，其包含IL-7蛋白的片段，其中所述片段包含至少四个α-螺旋基序。
20.如权利要求1～19中任一项所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头与所述的PD-L1抑制剂的C末端残基融合，并与所述的IL-7蛋白或其片段的N末端残基融合。
21.如权利要求1～19中任一项所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头与所述的PD-L1抑制剂的N末端残基融合，并与所述的IL-7蛋白的C-末端残基融合。
22.如权利要求21所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头与所述的抗PD-L1抗体或其片段的轻链的N末端残基融合。
23.如权利要求21所述的融合分子，其特征在于，所述的肽接头与所述的抗PD-L1抗体或其片段的重链的N末端残基融合。
24.一种分离的蛋白质，其包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少85％序列同一性的肽，其中与野生型人IL-7蛋白相比，所述的肽能够结合IL-7受体α但对IL-7受体α的结合亲和力降低。
25.如权利要求24所述的蛋白质，其特征在于，所述的肽在第142位具有除Trp之外的氨基酸残基。
26.如权利要求24所述的蛋白质，其特征在于，所述的肽在第142位具有选自G、A、V、C、L、I、M和F的氨基酸残基。
27.如权利要求24所述的蛋白质，其特征在于，所述的肽在第142位具有选自A、V、L、I、M和F的氨基酸残基。
28.如权利要求24所述的蛋白质，其特征在于，所述的肽在第142位具有丙氨酸。
29.一种组合物，其包含如权利要求1～23中任一项所述的分子或如权利要求24～28中任一项所述的蛋白质，以及药学上可接受的载体。
30.一种分离的细胞，其包含编码如权利要求1～23中任一项所述的分子或如权利要求24～28中任一项所述的蛋白质的一种或多种多核苷酸。
31.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括向患者施用如权利要求1～23中任一项所述的分子。
32.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括向患者施用如权利要求24～28中任一项所述的蛋白质。
33.如权利要求32所述的方法，进一步包括向患者施用PD-L1抑制剂。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质和所述的PD-L1抑制剂的摩尔比约为2:1至1:2。
35.如权利要求31～34中任一项的方法，其特征在于，所述的癌症选自由膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌和甲状腺癌构成的群组。
CN201980001526.2A 2018-01-25 2019-01-25 抗pd-l1抗体和il-7融合蛋白 Pending CN110352202A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018074121 2018-01-25
CNPCT/CN2018/074121 2018-01-25
PCT/CN2019/073264 WO2019144945A1 (en) 2018-01-25 2019-01-25 Anti-pd-l1 antibody and il-7 fusions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110352202A true CN110352202A (zh) 2019-10-18

Family

ID=67395659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980001526.2A Pending CN110352202A (zh) 2018-01-25 2019-01-25 抗pd-l1抗体和il-7融合蛋白

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11401331B2 (zh)
EP (1) EP3568417A4 (zh)
JP (2) JP7102670B2 (zh)
KR (1) KR20200058322A (zh)
CN (1) CN110352202A (zh)
AU (2) AU2019203918B2 (zh)
BR (1) BR112020010536A2 (zh)
CA (1) CA3082975A1 (zh)
EA (1) EA202091054A1 (zh)
IL (1) IL274564A (zh)
MX (1) MX2020005193A (zh)
SG (1) SG11202005036RA (zh)
WO (1) WO2019144945A1 (zh)
ZA (1) ZA202002568B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117660358A (zh) * 2024-01-31 2024-03-08 青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司 表达分泌型融合蛋白的工程化免疫细胞及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210108978A (ko) * 2018-12-21 2021-09-03 오제 이뮈노테라프틱스 이작용성 항-pd-1/il-7 분자
US11512122B2 (en) 2019-05-17 2022-11-29 Xencor, Inc. IL-7-FC-fusion proteins
KR102400884B1 (ko) * 2019-11-15 2022-05-23 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 및 인터루킨-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
CR20220512A (es) * 2020-04-15 2022-11-07 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados
WO2022020637A1 (en) * 2020-07-22 2022-01-27 Nektar Therapeutics Il-7 receptor agonist composition and related methods and uses
KR20230129441A (ko) 2020-12-17 2023-09-08 오제 이뮈노테라프틱스 이기능성 항-pd1/il-7 분자
KR20240041379A (ko) * 2021-07-09 2024-03-29 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 Il-2에 접합된 체크포인트 억제제 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107488229A (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 臧敬五 Pd‑l1抗体及其用途
CA3026474A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN113365650A (zh) * 2018-11-16 2021-09-07 新免疫技术有限公司 用il-7蛋白和免疫检查点抑制剂的组合治疗肿瘤的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
AU2002240818C1 (en) 2001-03-14 2008-11-06 Agilent Technologies, Inc. MHC molecule constructs and their uses for diagnosis and therapy
KR20070085886A (ko) 2004-12-09 2007-08-27 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성의 ｉｌ-7 변이체
EP1746161A1 (en) 2005-07-20 2007-01-24 Cytheris Glycosylated IL-7, preparation and uses
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
RU2573912C2 (ru) * 2008-10-08 2016-01-27 Интрексон Корпорейшн Сконструированные клетки, экспрессирующие множественные иммуномодуляторы, и их применения
WO2011119773A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Roeth Jeremiah F Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
CN108409856B (zh) 2012-09-13 2022-03-04 百时美施贵宝公司 结合至肌生成抑制素的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
CA2956987C (en) 2014-08-18 2023-03-21 Apceth Gmbh & Co. Kg Genetically modified mesenchymal stem cells expressing an immune response-stimulating cytokine to attract and/or activate immune cells
CN113773387A (zh) * 2016-06-13 2021-12-10 天境生物科技(上海)有限公司 Pd-l1抗体及其用途
US9567399B1 (en) * 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107488229A (zh) * 2016-06-13 2017-12-19 臧敬五 Pd‑l1抗体及其用途
CA3026474A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN113365650A (zh) * 2018-11-16 2021-09-07 新免疫技术有限公司 用il-7蛋白和免疫检查点抑制剂的组合治疗肿瘤的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHANNA C VANDERSPEKET AL.: "structure function analysis of interleukin 7:requirement for an aromatic ring at position 143 of helix D", 《CYTOKINE》 *
LARRY COSENZA ET AL.: "comparative model building of interleukin-7 using interleukin-4 as a template:a structural hypothesis that displays atypical surface chemistry in helix D important for receptor activation", 《PROTEIN SCIENCE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117660358A (zh) * 2024-01-31 2024-03-08 青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司 表达分泌型融合蛋白的工程化免疫细胞及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3082975A1 (en) 2019-08-19
JP2022101631A (ja) 2022-07-06
EP3568417A4 (en) 2020-07-15
JP7102670B2 (ja) 2022-07-20
ZA202002568B (en) 2021-06-30
EP3568417A1 (en) 2019-11-20
JP2021506748A (ja) 2021-02-22
AU2019203918B2 (en) 2020-04-30
AU2020210258A1 (en) 2020-08-20
SG11202005036RA (en) 2020-06-29
US11401331B2 (en) 2022-08-02
BR112020010536A2 (pt) 2020-12-01
KR20200058322A (ko) 2020-05-27
WO2019144945A1 (en) 2019-08-01
AU2019203918A1 (en) 2019-08-08
EA202091054A1 (ru) 2020-12-24
IL274564A (en) 2020-06-30
US20190352405A1 (en) 2019-11-21
MX2020005193A (es) 2020-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634490B2 (en) Blocking antibodies against CD47 and methods of use thereof
CN110352202A (zh) 抗pd-l1抗体和il-7融合蛋白
CA2919790C (en) Anti-cxcr4 antibodies and antibody-drug conjugates
US9758586B2 (en) Chimeric rabbit/human ROR1 antibodies
CN110352200A (zh) 抗具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的抗体及其应用
JP2019503709A (ja) ヒト化抗ｃｄ７３抗体
KR20190008171A (ko) 항-bcma 폴리펩티드 및 단백질
CN108136002A (zh) 治疗性抗体和它们的用途
US11554177B2 (en) Antibody-drug conjugates targeting human Claudin 18.2
CN104603151A (zh) 与dll-4结合的抗原结合蛋白
CN115109160B (zh) 抗epcam抗体和双特异性抗体
US20220169726A1 (en) ANTI-SIRPalpha MONOCLONAL ANTIBODIES AND USES THEREOF
US20210261676A1 (en) Anti-Baff Receptor Antibodies and Uses Thereof
AU2019401657A1 (en) Antibodies specific to MUC18
US11485783B2 (en) Anti-GPRC5D monoclonal antibodies and uses thereof
CN115109164A (zh) 靶向epcam和cd3的双特异性抗体
US20220112258A1 (en) Bifunctional molecules with il-7 activity
RU2783685C2 (ru) Анти-pd-l1 антитело и его применение
IL285313A (en) Antibodies for cancer treatment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20191107

Address after: Room 802, 8th floor, West Tower, building 1, No. 88, Shangke Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Tianjing Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: Grand exhibition hall, sibys Road, 802 West Bay Road, 1205, zone 1, Cayman Islands, P.O. Box 31119, Cayman Islands

Applicant before: I-MAB

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40014711

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191018