BR112020010536A2

BR112020010536A2 - molécula de fusão, proteína e célula isoladas, composição, e, método para tratar um câncer

Info

Publication number: BR112020010536A2
Application number: BR112020010536-8A
Authority: BR
Inventors: Lei Fang; Feifei Cui; Haijuan Gu; Zhengyi Wang; Bingshi Guo; Jingwu Zang
Original assignee: I-Mab Biopharma Us Limited
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2020-12-01
Also published as: JP2021506748A; EA202091054A1; AU2019203918A1; IL274564A; AU2020210258A1; EP3568417A4; SG11202005036RA; EP3568417A1; MX2020005193A; US11401331B2; WO2019144945A1; JP2022101631A; KR20200058322A; US20190352405A1; CN110352202A; ZA202002568B; JP7102670B2; CA3082975A1; AU2019203918B2

Abstract

É provida uma molécula de fusão tendo um inibidor de PD-L1 fundido a uma proteína IL-7 humana ou fragmento da mesma através de um ligador peptídico. As moléculas de fusão exibem efeitos antitumorais sinergísticos.

Description

MOLÉCULA DE FUSÃO, PROTEÍNA E CÉLULA ISOLADAS, COMPOSIÇÃO, E, MÉTODO PARA TRATAR UM CÂNCER

[001] A presente invenção reivindica prioridade do PCT/CN2018074121, depositado em 25 de janeiro de 2018, o conteúdo do qual está incorporado neste documento integralmente.

FUNDAMENTOS

[002] A interleucina 7 (IL-7) é um fator de crescimento hepatopoiético secretado pelas células estrômicas na medula óssea e timo. À IL-7 estimula a diferenciação de células tronco hematopoiéticas multipotentes dentro das células progenitoras linfoides. A mesma também estimula a proliferação de todas as células na linhagem linfoide (células B, células T e células NK). A IL-7 é uma citocina importante para o desenvolvimento de célula B e T. Esta citocina e o fator de crescimento de hepatócito (HGF) formam um heterodímero que funciona como um fator estimulador de crescimento de célula pré-pró-B. Esta citocina é verificada ser um cofator para o rearranjo de V(D)J do receptor de célula T beta (TCRB) durante o desenvolvimento inicial de célula T. Esta citocina pode ser produzida localmente pelas células epiteliais intestinais e calciformes epiteliais e pode servir como um fator regulador para linfócitos mucósicos intestinais.

[003] A IL-7 recombinante foi administrada com segurança aos pacientes em diversos testes clínicos de fase I e II. Um estudo humano de IL- 7 em pacientes com câncer demonstrou que a administração desta citocina pode transitoriamente romper a homeóstase de células T tanto CD8* quanto CD4* com uma diminuição proporcionada na porcentagem de células reguladoras T CD4*CD25*Foxp3*. Nenhuma regressão de câncer objetiva, entretanto, foi observada.

[004] O ligante de morte programada 1 (PD-L1), também conhecido como grupos de diferenciação 274 (CD274) ou homólogo de B7 1 (B7-HI]), é uma proteína de transmembrana tipo 1 de 40 kDa acreditada desempenhar um papel principal na supressão do sistema imune durante eventos particulares tais como gravidez, aloenxertos de tecido, doença autoimune e outros estados de doença tais como hepatite. A ligação de PD-L1 ao PD-1 ou B7.1 transmite um sinal inibidor que reduz a proliferação de células T CD8+ nos linfônodos e suplementar a este PD-1 também é capaz para controlar o acúmulo de células T específicas de antígeno estranhas nos linfônodos através da apoptose que é mediada adicionalmente em uma regulagem mais baixa do gene Bcl-2.

[005] Foi mostrado que a suprarregulagem de PD-L1 pode permitir que os cânceres escapem do sistema imune do hospedeiro. Uma análise de espécimes de tumor de pacientes com carcinoma de célula renal verificou que a alta expressão em tumor de PD-L1 foi associada com a agressividade de tumor aumentada e um risco aumentado de morte. Muitos inibidores PD-L1 estão em desenvolvimento como terapias imuno-oncológicas e estão mostrando bons resultados nos testes clínicos.

[006] Além do tratamento de cânceres, a inibição de PD-L1 também se mostrou promissora no tratamento de doenças infecciosas. Em um modelo de camundongo de infecção intracelular, L. monocytogenes induziu a expressão de proteína PD-L1 em células T, células NK e macrófagos. O bloqueio de PD-L1 (por exemplo, usando anticorpos bloqueadores) resultou em mortalidade aumentada para camundongos infectados. O bloqueio reduziu a produção de TNFa e óxido nítrico pelos macrófagos, reduziu a produção de granzima B pelas células NK e diminuiu a proliferação de células T CD8 específicas de antígeno de L. monocytogenes (mas não de células T CD4). Esta evidência sugere que PD-L1 atua como uma molécula coestimuladora positiva na infecção intracelular.

SUMÁRIO

[007] A presente descrição demonstra que quando um inibidor de PD-L1 é fundido à uma proteína IL-7 através de um ligador peptídico, a molécula de fusão pode manter as atividades de ligação de ambos os componentes. Adicionalmente, a molécula de fusão exibiu atividades comparáveis à combinação de ambas as proteínas sozinhas. Além disso, resultados melhorados seriam obtidos com proteínas IL-7 mutantes tendo atividades reduzidas.

[008] De acordo com uma modalidade da presente descrição, portanto, é provida uma molécula de fusão compreendendo um inibidor de PD-L1 fundido a uma proteína IL-7 humana ou fragmento da mesma através de um ligador peptídico. Em algumas modalidades, o ligador peptídico tem de a 100 resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, o ligador peptídico tem de 10 a 75 aminoácidos. Em algumas modalidades, pelo menos 20% dos resíduos de aminoácido de ligador peptídico são resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em alanina, glicina, cisteína e serinan Em algumas modalidades, pelo menos 40% dos resíduos de aminoácido de ligador peptídico são resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em alanina, glicina, cisteína e serina. Em algumas modalidades, o ligador peptídico compreende uma sequência de aminoácidos* selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1 a 5.

[009] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é uma proteína PD-1 isca, tal como uma PD-l inativa que liga PD-LI. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é de um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD. Em algumas modalidades, o fragmento do anticorpo anti-PD-L1 é um fragmento de cadeia única, um fragmento Fab ou um par de fragmentos Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L] é um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico que adicionalmente tem uma especificidade secundária. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é capacitado para ADCC.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-LI ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos de resíduos 31 a 35, resíduos 50 a 66 e resíduos 99 a 108 da SEQ ID NO: 6 respectivamente e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos de resíduos 24 a 34, resíduos 50 a 56 e resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 7 respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1I ou o fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO: 7.

[0011] Em algumas modalidades, a proteína IL-7 compreende a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos* tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9 enquanto é capaz de ligar o receptor alfa de IL-7. Em algumas modalidades, a proteína IL-7 tem um resíduo de aminoácido selecionado de Gly, Ala, Val, Cyc, Leu, Ile, Met e Phe na posição 142 de acordo com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a proteína IL-7 tem um resíduo de aminoácido selecionado de A, V, L, Il, Me F na posição 142 de acordo com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos* tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9 tem afinidade de ligação reduzida ao receptor alfa de IL-7 quando comparada com a proteína IL-7 humana do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína IL-7 compreende a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um fragmento da proteína IL-7 é incluído na molécula de fusão. Em algumas modalidades, o fragmento inclui pelo menos um, dois, três ou todos os quatro motivos de hélice alfa.

[0012] Em algumas modalidades, o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal C do inibidor de PD-L1 e fundido ao resíduo de terminal N da proteína IL-7. Em algumas modalidades, o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N do inibidor de PD-L1 e fundido ao resíduo de terminal C da proteína IL-7. Em algumas modalidades, o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N de uma cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N de uma cadeia pesada do anticorpo anti-PD- L1 ou fragmento da mesma.

[0013] Também é provido, em uma modalidade, uma proteína isolada, compreendendo a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO: 9 ou um peptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9, em que o peptídeo é capaz de ligar o receptor alfa de IL-7 mas tem afinidade de ligação reduzida ao receptor alfa de IL-7 quando comparada com a proteína IL-7 humana do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o peptídeo tem um resíduo de aminoácido outro que não Trp no local 142. Em algumas modalidades, o peptídeo tem, no local 142, um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe e Val. Em algumas modalidades, o peptídeo tem, no local 142, um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em Ala, Leu, Ile, Met, Phe e Val.

[0014] Os métodos de tratamento de um câncer também são providos, em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método envolve administrar ao paciente uma molécula da presente descrição. Em algumas modalidades, o método envolve administrar uma variante de IL- 7 como descrita, opcionalmente com um inibidor de PD-LI1. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer hepático, câncer colônico, câncer retal, câncer endométrico, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer mamário, câncer uretral, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinais, câncer estomacal, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer prostático e câncer tireóidico.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0015] A FIG. 1, nos painéis A-D, ilustram umas poucas estruturas de molécula de fusão.

[0016] A FIG. 2 mostra a identificação da mutação WI42A que reduz a atividade de proteína IL-7.

[0017] A FIG. 3 demonstra que a mutação WI42A de fato reduziu a potência de IL7 de moléculas de fusão anti-PDL1-IL7.

[0018] A FIG. 4, com os painéis A-C, apresenta resultados da capacidade das moléculas de fusão para estimular a sinalização de STATS (A), para ligar IL7R (B) e para promover a internalização de IL7R (C).

[0019] A FIG. 5 mostra a capacidade da molécula de fusão para ligar à proteína de PDL1 ligada à célula.

[0020] A FIG. 6 mostra que todas as moléculas de fusão testadas mostraram ligação similar ao anticorpo monoclonal anti-PDL1.

[0021] A FIG. 7 mostra que anti-PDL1-IL7YW!%2 reduziu a ligação à IL7Ra, que foi compatível com a sua potência de IL7 reduzida.

[0022] A FIG. 8 mostra que anti-PDLI-IL7 e anti-PDL1-IL7YW142A tiveram eficácia superior do que o mAb anti-PDL1 ou IL7 no realce da função de célula T humana.

[0023] A FIG. 9 mostra que a molécula de fusão testada, semelhante ao anticorpo anti-PDL1, foi capaz de enriquecer no local do tumor.

[0024] A FIG. 10 mostra a eficácia na inibição do crescimento de tumor de várias moléculas testadas.

[0025] A FIG. 11 apresenta o peso do tumor de cada animal no final do estudo in vivo.

[0026] A FIG. 12 apresenta dados para mostrar os números absolutos de células T CD4* e CD8* no baço e tumor de cada animal no final do estudo in vivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0027] Deve ser mencionado que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais desta entidade; por exemplo, “um anticorpo, é entendido representar um ou mais anticorpos. Como tais, os termos “um” (ou “uma”), “um(a) ou mais,” e “pelo menos um(a)” podem ser aqui usados intercambiavelmente.

[0028] Como aqui usado, o termo “polipeptídeo” é intencionado abranger um “polipeptídeo” singular assim como “polipeptídeos” plurais, e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados pelas ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína,” “cadeia de aminoácido”, ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser usado ao invés de ou intercambiavelmente com qualquer um destes termos. O termo “polipeptídeo” também é intencionado a se referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação pelos aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzida pela tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucleico designada. O mesmo pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo pela síntese química.

[0029] O termo “isolado” como aqui usado com respeito às células, ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, se refere às moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estejam presentes na fonte natural da macromolécula. O termo “isolado” como aqui usado também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido pelas técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Além disso, um “ácido nucleico isolado” é intencionado incluir fragmentos de ácido nucleico que não sejam de ocorrência natural como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é aqui usado para se referir a células ou polipeptídeos que são isolados de outras proteínas ou tecidos celulares. Polipeptídeos isolados são intencionados a abranger polipeptídeos tanto purificados quanto recombinantes.

[0030] Como aqui usado, o termo “recombinante” como o mesmo se refere aos polipeptídeos ou polinucleotídeos pretende uma forma do polipeptídeo ou polinucleotídeo que não existe naturalmente, um exemplo não limitante da qual pode ser criada combinando-se polinucleotídeos ou polipeptídeos que normalmente não ocorreriam juntos.

[0031] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” se referem à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada comparando-se uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para propósitos de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nesta posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de combinações ou posições homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homólogos” compartilha menos do que 40% de identidade, embora preferivelmente menos do que 25% de identidade, com uma das sequências da presente descrição.

[0032] Um polinucleotídeo ou região de polinucleotídeo (ou um polipeptídeo ou região de polipeptídeo) tem uma certa porcentagem (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) de “identidade de sequência” com uma outra sequência significa que, quando alinhado, esta porcentagem de bases (ou aminoácidos) são os mesmos na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a homologia percentual ou identidade de sequência podem ser determinadas usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos em Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferivelmente, parâmetros de default são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento é BLAST, usando parâmetros de default. Em particular, programas são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros de default: Código genético = padrão; filtro = nenhum; filamento = ambos; corte = 60; expectativa = 10; Matriz = BLOSUMO6?2; Descrições = 50 sequências; ordenado por = HIGH SCORE; Base de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank traduções CDS + SwissProtein + SPatualização + PIR. Polinucleotídeos biologicamente equivalente são aqueles tendo a homologia percentual especificada mencionada acima e codificando um polipeptídeo tendo a mesma ou atividade biológica similar.

[0033] O termo “um ácido nucleico ou polinucleotídeo equivalente” se refere a um ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídeo tendo um certo grau de homologia ou identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo do ácido nucleico ou complemento do mesmo. Um homólogo de um ácido nucleico de filamento duplo é intencionado a incluir ácidos nucleicos tendo uma sequência de nucleotídeo que tem um certo grau de homologia com ou com o complemento do mesmo. Em um aspecto, homólogos de ácidos nucleicos são capazes de hibridizar ao ácido nucleico ou complemento do mesmo. Igualmente, “um polipeptídeo equivalente” se refere a um polipeptídeo tendo um certo grau de homologia ou identidade de sequência, com a sequência de aminoácidos* de um polipeptídeo de referência. Em alguns aspectos, a identidade de sequência é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ou polinucleotídeo equivalentes tem uma, duas, três, quatro ou cinco adições, deleções, Substituições e suas combinações dos mesmos quando comparados com o polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. Em alguns aspectos, a sequência equivalente retém a atividade (por exemplo, ligação de epítopo) ou estrutura (por exemplo, ponte salina) da sequência de referência.

[0034] As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de “severidade” diferente. No geral, uma reação de hibridização de severidade baixa é realizada a cerca de 40ºC em cerca de 10 x SSC ou uma solução de concentração —iônica/temperatura “equivalentes. Uma hibridização de severidade moderada é tipicamente realizada a cerca de 50ºC em cerca de 6 x SSC e uma reação de hibridização de alta severidade é geralmente realizada a cerca de 60ºC em cerca de 1 x SSC. As reações de hibridização também podem ser realizadas sob “condições fisiológicas” que são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Um exemplo não limitante de uma condição fisiológica é a temperatura, concentração iônica, pH e concentração de Mg?* normalmente encontrado em uma célula.

[0035] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica de quatro bases de nucleotídeo: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Assim, o termo “sequência de polinucleotídeo” é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética pode ser introduzida dentro de bases de dados em um computador tendo uma unidade de processamento central e usada para aplicações de bioinformática tais como genômicas funcionais e pesquisa de homologia. O termo “polimorfismo” se refere à coexistência de mais do que uma forma de um gene ou porção do mesmo. Uma porção de um gene do qual existem pelo menos duas formas diferentes, isto é, duas sequências de nucleotídeo diferentes, é aludida como uma “região polimórfica de um gene”. Uma região polimórfica pode ser um único nucleotídeo, a identidade do qual difere em alelos diferentes.

[0036] Os termos “polinucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados intercambiavelmente e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, etiqueta EST ou SAGE), exons, introns, RNA mensageiro (mnRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, dsRNA, siRNA, miIiRNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos e análogos de nucleotídeo metilados. Se presentes, modificações para a estrutura de nucleotídeo podem ser codificado antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida pelos componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente depois da polimerização, tal como pela conjugação com um componente de rotulação. O termo também se refere às moléculas tanto de filamento único quanto duplo. A menos que de outro modo especificado ou requerido, qualquer modalidade desta descrição que seja um polinucleotídeo abrange tanto a forma de filamento duplo quanto cada uma de duas formas de filamento único complementar conhecidas ou prognosticadas para compor a forma de filamento duplo.

[0037] O termo “codificar” como é aplicado aos polinucleotídeos se refere a um polinucleotídeo que é dito “codificar” um polipeptídeo se, no seu estado nativo ou quando manipulado pelos métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, o mesmo pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento de antissentido é o complemento de um tal ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser daí deduzida.

[0038] Como aqui usado, um “anticorpo” ou “polipeptídeo de ligação a antígeno” se refere a um polipeptídeo ou um complexo de polipeptídeo que especificamente reconhece e liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo inteiro e qualquer fragmento de ligação a antígeno ou uma cadeia única do mesmo. Assim o termo “anticorpo” inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo que compreenda pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina tendo atividade biológica de ligar ao antígeno. Os exemplos de tal incluem, mas não são limitados a uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção de ligação de ligante do mesmo, uma cadeia pesada ou região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de armação (FR) ou qualquer porção do mesmo ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.

[0039] O termo “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação a antígeno”, como aqui usado, é uma porção de um anticorpo tal como F(ab'),, F(ab),, Fab', Fab, Fv, scFv e similares. Independente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo “fragmento de anticorpo” inclui aptâmeros, spiegelmers e diacorpos. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente engenheirada que atua como um anticorpo pela ligação a um antígeno específico para formar um complexo.

[0040] Um “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” se refere a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de imunoglobulinas. Em alguns aspectos, as regiões são conectadas com um peptídeo ligador curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligador pode ser rico em glicina para flexibilidade, assim como serina ou treonina para solubilidade e pode conectar o terminal N da Vu com o terminal C da V7 ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, a despeito da remoção das regiões constantes e da introdução do ligador. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019.

[0041] O termo anticorpo abrange várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidas bioquimicamente. Aqueles versados na técnica avaliarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon (y, 1, a, ô, €) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, yl-y4). É a natureza desta cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isótipos) por exemplo, IgG,, IgG, IZG3, I8Ga, IgGs, etc. são bem distinguidas e são conhecidas conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma destas classes e isótipos são facilmente discerníveis para o técnico habilitado em vista da presente descrição e, consequentemente, estão dentro do escopo da presente descrição. Todas as classes de imunoglobulina estão claramente dentro do escopo da presente descrição, o debate seguinte geralmente será direcionado para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular 53.000 a 70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas pelas ligações de dissulfeto em uma configuração “Y” em que as cadeias leves suportam as cadeias pesadas começando na boca do “Y” e continuando através da região variável.

[0042] Anticorpos, polipeptídeos de ligação a antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da descrição incluem, mas não são limitados a,

anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação a epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab'),, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VK ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos LIGHT aqui descritos). As moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da descrição podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[0043] As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (x, à). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve capa ou lambda. No geral, as cadeias leve e pesada são covalentemente ligadas entre si e as porções de “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas entre si pelas ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas pelos hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente engenheiradas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos seguem de um terminal N nas extremidades bifurcadas da configuração em Y para o terminal C na base de cada cadeia.

[0044] Tanto a cadeia leve quanto a pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. O termo “constante” e “variável” são usados funcionalmente. A este respeito, será avaliado que os domínios variáveis das porções tanto de cadeia leve (VK) quanto de pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade de antígeno. Ao contrário, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação de receptor Fc, ligação de complemento e similares. Pela convenção da numeração os domínios da região constante aumentam conforme eles se tornam mais distais do sítio de ligação de antígeno ou terminal amino do anticorpo. A porção de terminal N é uma região variável e na porção de terminal C está uma região constante; os domínios CH3 e CK de fato compreendem o terminal carbóxi das cadeias pesada e leve, respectivamente.

[0045] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo seletivamente reconheça e especificamente ligue epítopos nos antígenos. Isto é, o domínio VK e o domínio VH ou subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação de antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação de antígeno é definido pelas três CDRs em cada uma das cadeias VH e VK (isto é, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3). Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies camelídeas ou engenheiradas com base nas imunoglobulinas camelídeas, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir de apenas cadeias pesadas, sem nenhuma cadeia leve. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993).

[0046] Nos anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação a antígeno são sequências curtas, não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação a antígeno conforme o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O resto dos aminoácidos nos domínios de ligação de antígeno, aludidos como regiões de “armação”, mostra menos variabilidade intermolecular. As regiões de armação amplamente adotam uma conformação de folha À e as CDRs formam alças que conectam e em alguns casos formam parte da estrutura de folha B. Assim, as regiões de armação atuam para formar um esqueleto que provê posicionamento das CDRs na orientação correta pelas interações intercadeia, não covalentes. O domínio de ligação a antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar para o epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões de armação, respectivamente, podem ser facilmente identificadas, para qualquer região variável de cadeia pesada ou leve dada, por uma pessoa de versatilidade comum na técnica, visto que elas foram precisamente definidas (ver “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987).

[0047] No caso onde existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo como aqui usado é intencionado a incluir todos de tais significados a menos que explicitamente estabelecido ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região determinante de complementaridade” (“CDR”) para descrever os sítios de combinação de antígeno não contínuos encontrados dentro da região variável de polipeptídeos tanto de cadeia pesada quanto leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. As definições de CDR de acordo com Kabat e Chothia incluem sobreposições ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparadas uma contra a outra. Não obstante, a aplicação de cada definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é intencionada a estar dentro do escopo do termo como aqui definido e usado. Os resíduos de aminoácido apropriados que abrangem as CDRs como definidas por cada uma das referências citadas acima são apresentadas na tabela abaixo como uma comparação. Os números de resíduo exatos que abrangem uma CDR particular variarão dependendo da sequência e tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácidos* da região variável do anticorpo.

[0048] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa de versatilidade comum na técnica pode de modo não ambíguo designar este sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como aqui usado, “numeração de Kabat” se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat er al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983).

[0049] Além da tabela acima, o sistema de numeração de Kabat descreve as regiões de CDR como segue: a CDR-HI começa aproximadamente no aminoácido 31 (isto é, aproximadamente 9 resíduos depois do primeiro resíduo de cisteína), inclui aproximadamente 5 a 7 aminoácidos e termina no resíduo de triptofano seguinte. A CDR-H2 começa no décimo quinto resíduo depois do final da CDR-HI, inclui aproximadamente 16 a 19 aminoácidos e termina nos resíduos de arginina ou lisina seguintes. A CDR-H3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo de aminoácido depois do final da CDR-H2; inclui 3 a 25 aminoácidos; e termina na sequência W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido. A CDR-L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (isto é, a seguir de um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 10 a 17 resíduos; e termina no resíduo de triptofano seguinte. A CDR-L2 começa aproximadamente no décimo sexto resíduo depois do final da CDR-L1 e inclui aproximadamente 7 resíduos. À CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo depois do final da CDR-L2 (isto é, a seguir de um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 7 a 11 resíduos e termina na sequência F ou W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido.

[0050] Os anticorpos aqui descritos podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, de murino, burro, coelho, cabra, porquinho da Índia, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em uma outra modalidade, a região variável pode ser condrictoide na origem (por exemplo, de tubarões).

[0051] Como aqui usado, o termo “região constante de cadeia pesada” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma região constante de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio CHI, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, intermediária e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3 ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação a antígeno para o uso na descrição pode compreender uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CHI e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH3 ou uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CHI, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo da descrição compreende uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH3. Adicionalmente, um anticorpo para o uso na descrição pode carecer de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Como apresentado acima, será entendido por uma pessoa de versatilidade comum na técnica que a região constante de cadeia pesada pode ser modificada tal que a mesma varie na sequência de aminoácidos* da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[0052] A região constante de cadeia pesada de um anticorpo aqui descrita pode ser derivada de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CHI derivado de uma molécula de IgG, e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3z. Em um outro exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG, e, em parte, de uma molécula de IgG;. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG, e, em parte, de uma molécula de IgGa,.

[0053] Como aqui usado, o termo “região constante de cadeia leve” inclui sequências de aminoácidos derivadas da cadeia leve de anticorpo. Preferivelmente, a região constante de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio capa constante ou domínio lambda constante.

[0054] Um “par de cadeia leve-cadeia pesada” se refere à coleção de uma cadeia leve e cadeia pesada que pode formar um dímero através de uma ligação de dissulfeto entre o domínio CL da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

[0055] Como anteriormente indicado, as estruturas de subunidade e configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Como aqui usado, o termo “domínio VH"” inclui o domínio variável de terminal amino de uma cadeia pesada da imunoglobulina e o termo “domínio CHI” inclui o primeiro domínio de região constante (na maior parte terminal amino) de uma cadeia pesada da imunoglobulina. O domínio CHI é adjacente ao domínio VH e é terminal amino em relação à região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada da imunoglobulina.

[0056] Como aqui usado o termo “domínio CH2” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231 a 340, sistema de numeração EU; ver Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983). O domínio CH2 é único em que o mesmo não está intimamente emparelhado com um outro domínio. Ao invés, duas cadeias de carboidrato ramificadas ligadas em N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também é bem documentado que o domínio CH3 estende do domínio CH2 para o terminal C da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0057] Como aqui usado, o termo “região de dobradiça” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que junta o domínio CHI ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de ligação de antígeno de terminal N se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, intermediário e inferior (Roux et al., J. Immunol 161: 4083 (1998)).

[0058] Como aqui usado o termo “ligação de dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CHI e CK são ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas por duas ligações de dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU).

[0059] Como aqui usado, o termo “anticorpo quimérico” será mantido significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo é obtida(o) ou derivada(o) de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente descrição) é obtida de uma segunda espécie. Em certas modalidades a região ou sítio de ligação alvo será de uma fonte não humana (por exemplo camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[0060] Como aqui usado, “humanização percentual” é calculada determinando-se o número de diferenças de aminoácido da armação (isto é, diferença não CDR) entre o domínio humanizado e o domínio da linha germinativa, subtraindo este número do número total de aminoácidos e depois dividindo este pelo número total de aminoácidos e multiplicando por 100.

[0061] Por “especificamente liga” ou “tem especificidade para”, é geralmente intencionado que um anticorpo se ligue a um epítopo por intermédio do seu domínio de ligação a antígeno e que a ligação envolve alguma complementaridade entre o domínio de ligação a antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é dito “especificamente ligar” a um epítopo quando o mesmo se liga a este epítopo, por intermédio do seu domínio de ligação a antígeno mais facilmente do que o mesmo se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo “especificidade” é aqui usado para qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo se liga a um certo epítopo. Por exemplo, anticorpo “A” pode ser julgado ter uma especificidade mais alta para um dado epítopo do que o anticorpo “B”, ou o anticorpo “A” pode ser dito se ligar ao epítopo “C” com uma especificidade mais alta do que o mesmo tem para o epítopo “D” relacionado.

[0062] Como aqui usado, o termo “tratar” ou “tratamento” refere-se tanto ao tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventivas,

em que o objetivo é prevenir ou abrandar (reduzir) uma mudança ou distúrbio fisiológicos indesejados, tais como a progressão de câncer. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio de sintomas, diminuição do grau de doença, estado estabilizado (isto é, não piora) de doença, retardo ou abrandamento da progressão de doença, melhora ou paliação do estado de doença e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevivência quando comparado à sobrevivência esperada se não recebesse tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio assim como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio deva ser prevenida(o).

[0063] Por “sujeito” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero”, é intencionado qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual diagnóstico, prognóstico ou terapia são desejados. Os sujeitos mamíferos incluem seres humanos, aninais domésticos, aninais de fazenda e zoológico, animais esportivos e de estimação tais como cães, gatos, porquinhos da Índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim por diante.

[0064] Como aqui usado, frases tais como “a um paciente em necessidade de tratamento” ou “um sujeito em necessidade de tratamento” inclui sujeitos, tais como sujeitos mamíferos, que beneficiar-se-lam da administração de um anticorpo ou composição da presente descrição usada, por exemplo, para a detecção, para um procedimento de diagnóstico e/ou para tratamento. Moléculas de fusão

[0065] A presente descrição provê moléculas de fusão que combinam inibição ou bloqueio de PD-L1 com uma atividade de citocina de IL-7 em uma maneira sinergística que maximiza adicionalmente a eficácia e a segurança.

[0066] Em uma modalidade, a molécula de fusão inclui um inibidor de PD-L1 (por exemplo, uma proteína PD-1 isca ou um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo) fundido a uma proteína IL-7 humana ou fragmento da mesma, preferivelmente através de um ligador peptídico. O ligador peptídico é geralmente um peptídeo que tem de 5 a 100 resíduos de aminoácido. Preferivelmente, o ligador inclui aminoácidos pequenos o bastante para garantir a sua flexibilidade. Por exemplo, o comprimento do ligador pode ser de 5 a 100 aminoácidos, de 10 a 90 aminoácidos, de 10 a 80 aminoácidos, de 10 a 75 aminoácidos, de 15 a 90 aminoácidos, de 15 a 80 aminoácidos, de 15 a 70 aminoácidos, de 20 a 80 aminoácidos, de 20 a 70 aminoácidos, de 20 a 60 aminoácidos, de 25 a 90 aminoácidos, de 25 a 80 aminoácidos, de 25 a 75 aminoácidos, de 25 a 70 aminoácidos, de 25 a 60 aminoácidos, de 30 a 80 aminoácidos, de 30 a 70 aminoácidos, de 30 a 60 aminoácidos ou de 40 a 70 aminoácidos, sem limitação.

[0067] A flexibilidade do ligador pode ser obtida pela incorporação de uma porcentagem mínima de aminoácidos menores, por exemplo, alanina, glicina, cisteína e serina. Em algumas modalidades, o ligador inclui pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% de aminoácidos selecionados de alanina, glicina, cisteína ou serina. Os exemplos não limitantes de ligador peptídicos são providos na SEQ ID NO: 1-5.

[0068] A proteína IL-7 humana é conhecido, com uma sequência de proteína depositada no GenBank no acesso no. NP 000871.1, a sequência madura da qual é provida na SEQ ID NO: 8. Através de cálculo e teste, foi determinado que as formas mutantes da proteína IL-7 com atividade de IL-7 reduzida manteve sinergismo com o anticorpo anti-PD-L1 quando comparada com a IL7 do tipo selvagem, com segurança global melhorada. Os exemplos não limitantes de tais mutantes incluem aqueles tendo uma substituição de aminoácido em IL7Y'* A substituição pode ser com um aminoácido não polar tal como G, A, V, C, PR, L,I, Me F.

[0069] O termo “proteína IL-7 humana” como aqui usado se refere à IL-7 humana tipo selvagem assim como seus equivalentes biológicos, isto é, aqueles que têm pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a IL-7 humana tipo selvagem e mantendo a atividade do tipo selvagem tal como a ligação a um receptor de IL-7 (por exemplo, receptor alfa), que pode ser facilmente medido. Em algumas modalidades, a proteína IL-7 humana tem atividade de IL-7 reduzida quando comparada com a tipo selvagem. Em algumas modalidades, a atividade de IL- 7 reduzida é pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de atividade de ligação ao receptor de IL-7 quando comparada com a IL-7 tipo selvagem. Em algumas modalidades, a atividade de IL-7 é pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999%, 99,9999% mais baixa do que aquela da IL-7 tipo selvagem. Em algumas modalidades, a atividade de IL-7 está entre aquela de IL-7 WA e I1-7 tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína IL-7 é um análogo sintético que é capaz de ligar a um receptor de IL-7.

[0070] Em algumas modalidades, a proteína IL-7 humana inclui uma mutação em W142 quando comparada com a tipo selvagem. Em algumas modalidades, a mutação é para um aminoácido não polar. Os exemplos não limitantes da mutação incluem uma mutação para Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe ou Val. Em algumas modalidades, a mutação é para Phe, Met, Ile, Leu, Val ou Ala. Em uma modalidade preferida, a mutação é WI42A (por exemplo, SEQ ID NO: 9).

[0071] Um fragmento da proteína IL-7 também pode ser usado, em algumas modalidades. O fragmento, em algumas modalidades, é capaz de ligar um receptor de IL-7 (por exemplo, receptor alfa), preferivelmente com atividade IL-7 reduzida quando comparada com a proteína do tipo selvagem.

As estruturas 3-dimensionais de IL-7 no complexo com receptores de IL-7 foram demonstradas. Ver, por exemplo, McElroy et al., Structure. 14 de janeiro de 2009; 17(1): 54-65. IL-7 adota uma topologia de feixe de 4 hélice up-up-down-down com duas alças cruzadas. As hélices a A-D variam no comprimento de 13 a 22 resíduos. Em algumas modalidades, o fragmento inclui pelo menos uma, duas ou três das hélices alfa. Em algumas modalidades, o fragmento inclui todas as quatro das hélices alfa. Em algumas modalidades, o fragmento retém resíduos de aminoácido de interface incluindo S19, D74 e K81.

[0072] A proteína IL7 também pode permitir modificações adicionais, tais como adições, deleções e/ou Substituições, em outros locais de aminoácido. Tais modificações podem ser a substituição em uma, duas ou três. Em uma modalidade, a modificação é substituição em uma das posições. Tais Substituições, em algumas modalidades, são Substituições conservativas.

[0073] Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Em uma outra modalidade, uma fileira de aminoácidos pode ser substituída com uma fileira estruturalmente similar que difira na ordem e/ou composição de membros da família da cadeia lateral.

[0074] Os exemplos não limitantes de Substituições conservativas de aminoácido são providos na tabela abaixo, onde uma contagem de similaridade de O ou mais alta indica substituição conservativa entre os dois aminoácidos. Tabela A. Matriz de Similaridade de Aminoácido [| lelG[P[/s/AlT|DJE N/JQ|HIKIR|vVIM|I1 L/F|Yw]| Iwl-8|7|-6|2/-6|5|7/ 7 /4/5/3/3]2]/-6/4|5] 2/0 /0|1)| IYlo|s|5s|3/[3/3/4/4/2/4/0 [4] 5 /2/2/1|14/7/10] | IE als |5|3/4/3/6/5/4/5/2/5/ 4/17 /0/1/2/9] | | IL -6 4a 3/3/2/2/4/3/3/2/2/3]3/2/4/2]6] | | | II 2 3/2/1711 /o[2/2/2/2/2/2/2/a 2 ]5] | [| [| IM Ss 3/2 /2/1[1/3/2/0/1/2/0/0/2]6] | | [| [| Ive aja a fo /o[2/2/2/2/2/2/2/a] | || [| [| IR 4 /3/0/o [2/1 [1 /1/0/1/2/3]6] EE | pp) IK|-s 2/1 /0o [1/0 /o0/o/1/1 [os DP IE 3 / 2/0 [1 [1 [14 [1/1 /2/3 6 DP Les] 1 /o|/ 1/0 1/2 / 2/1 fa InJ4jo|1/1/0o/o[ 2/1 /a [E |-s]o | /of/of o 3 a ID |-s 11] o fofo fa

ESPADINDISSENEINNNNNNNNNNNNN La a a a a a O so a a a Ps e Rg e Es ee A Tabela B. Substituições Conservativas de Aminoácido

[0075] Como aqui usado, o termo “inibidor de PD-L1” se refere a uma molécula, por exemplo, uma proteína ou um complexo contendo proteína, que é capaz de ligar a PD-L1 e interação de bloco entre PD-1 e PD- L1 e assim inibir a atividade de PD-L1. Um exemplo não limitante de um inibidor de PD-L1 é uma proteína PD-1 isca, por exemplo, uma variante de PD-1 inativa que mantém a capacidade para ligar PD-L1. Os exemplos de tais variantes PD-1 são providos em Maute et al., “Engineering high-affinity PD-1 variants for optimized imunotherapy and immuno-PET imaging”, PNAS 2015 112 (47) E6506-E6514 (2015). Um outro exemplo não limitante é um anticorpo anti-PD-L1.

[0076] Existem muitos anticorpos anti-PD-LI conhecidos e seus fragmentos que são adequados para a inclusão nas moléculas de fusão da presente descrição. As sequências da região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve são providas nas SEQ ID NOs: 6 e 7 para um anticorpo anti-PD-L1 exemplar. Os anticorpos anti-PD-LI1 variantes que incluem as regiões de CDR do anticorpo de exemplo também estão dentro do escopo da presente tecnologia. Por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode incluir uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos de resíduos 31 a 35, resíduos 50 a 66 e resíduos 99 a 108 da SEQ ID NO: 6 respectivamente e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos de resíduos 24 a 34, resíduos 50 a 56 e resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 7 respectivamente.

[0077] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é de um isótipo de IgG, IM, IgA, IgE ou IgD e o fragmento pode tomar qualquer forma, tal como um fragmento de cadeia única, um fragmento Fab ou um par de fragmentos Fabs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é habilitado para ADCC.

[0078] Algumas estruturas exemplares das moléculas de fusão são ilustradas na FIG. 1, painéis A-D. No painel A, a molécula de fusão inclui um anticorpo anti-PD-L1 IgG completo e duas proteínas IL-7 cada uma fundida, através de um ligador, ao terminal C de CH3 do anticorpo. Este polipeptídeo de fusão pode ser fabricado com duas construções de DNA separadas. No painel B, a molécula de fusão também inclui um anticorpo anti-PD-L1 IgG e duas proteínas IL-7; entretanto, as proteínas IL-7 são fundidas, através de um ligador, ao terminal N das regiões variáveis de cadeia leve.

[0079] Na FIG. 1, painel C, diferente que no painel C, as proteínas IL-7 são fundidas, através dos ligadores, ao terminal N da cadeia pesada. Uma outra estrutura exemplar é ilustrada no painel D, que mostra cada proteína IL- 7 fundido através de um ligador ao terminal N de CH2 do anticorpo no qual o fragmento CH2-CH3 é colocado a montante da porção VA-CH2.

[0080] Ainda mais estruturas, que não são ilustradas nas figuras, podem ser fabricadas, que seriam um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico que adicionalmente tem uma especificidade secundária.

[0081] Em certas modalidades, a proteína PD-1 isca ou anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos* ou uma ou mais porções não normalmente associadas com um anticorpo. As modificações exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, um anticorpo da descrição pode compreender uma sequência ligadora flexível ou pode ser modificada para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina ou um rótulo).

[0082] Anticorpos, variantes ou derivados dos mesmos da descrição incluem derivados que são modificados, isto é, pela fixação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo tal que a fixação covalente não impede o anticorpo de ligação ao epítopo. Por exemplo, mas não por via de limitação, os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, pela glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, fosforilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer modificações químicas numerosas podem ser realizadas pelas técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, os anticorpos podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0083] Em algumas modalidades, as proteínas PD-1l isca ou anticorpos podem ser conjugadas aos agentes, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídeos, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos ou PEG.

[0084] As proteínas PD-1 isca ou anticorpos podem ser conjugados ou fundidos a um agente terapêutico, que podem incluir rótulos detectáveis tais como rótulos radioativos, um imunomodulador, um hormônio, uma enzima, um oligonucleotídeo, um agente fotoativo terapêutico ou de diagnóstico, um agente citotóxico, que pode ser um fármaco ou uma toxina, um agente realçador de ultrassom, um rótulo não radioativo, uma combinação dos mesmos e outros de tais agentes conhecidos na técnica.

[0085] As proteínas PD-lI isca ou anticorpos podem ser detectavelmente rotulados pela ligação dos mesmos a um composto quimioluminescente. A presença do polipeptídeo de ligação a antígeno com rótulo quimioluminescente é depois determinado pela detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulação quimioluminescente particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

[0086] As proteínas PD-1 isca ou anticorpos também podem ser detectavelmente rotuladas usando metais emissores de fluorescência tais como "Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser fixados ao anticorpo usando tais grupos queladores de metal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). As técnicas para conjugar várias porções a um anticorpo são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld er al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies “84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985) e Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. (52: 119-58 (1982)). Variantes de IL-7

[0087] Mutantes da proteína IL-7 humana foram preparados que reduziram a atividade quando comparados com a proteína do tipo selvagem. Estes mutantes provaram ser úteis em situações onde tal redução de atividade é desejada, por exemplo, por problemas de segurança. Consequentemente, em uma modalidade, a presente descrição também provê polipeptídeo isolado que inclui tais mutantes.

[0088] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um polipeptídeo isolado que inclui a sequência de aminoácidos* da SEQ ID NO:

9. Em algumas modalidades, o polipeptídeo inclui um peptídeo tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9, em que o peptídeo é capaz de ligar receptor alfa de TL- 7 mas tem afinidade de ligação reduzida ao receptor alfa de IL-7 quando comparada com a proteína IL-7 humana do tipo selvagem.

[0089] Em algumas modalidades, a proteína IL-7 humana tem atividade IL-7 reduzida quando comparada com a tipo selvagem. Em algumas modalidades, a redução da atividade de IL-7 é pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da atividade de ligação ao receptor de IL-7.

[0090] Em algumas modalidades, a proteína IL-7 humana inclui uma mutação em W142 quando comparada com a tipo selvagem. Em algumas modalidades, a mutação é para um aminoácido não polar. Os exemplos não limitantes da mutação incluem mutação para Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe ou Val. Em algumas modalidades, a mutação é para Phe, Met, Ile, Leu, Val ou Ala. Em uma modalidade preferida, a mutação é WI42A. Em algumas modalidades, a mutação em W142 é selecionada de Gly, Cys, Leu, Ile, Met, Phe ou Val.

[0091] Um fragmento da proteína IL-7 também pode ser usado, em algumas modalidades. O fragmento, em algumas modalidades, é capaz de ligar um receptor de IL-7 (por exemplo, receptor alfa), preferivelmente com atividade IL-7 reduzida quando comparada com a proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o fragmento inclui pelo menos uma, duas ou três das hélices alfa. Em algumas modalidades, o fragmento inclui todas as quatro das hélices alfa. Em algumas modalidades, o fragmento retém resíduos de aminoácido de interface incluindo S19, D74 e K81.

[0092] A proteína IL-7 pode permitir modificações adicionais, tais como adição, deleção e/ou substituições, também em outros locais de aminoácido. Tais modificações podem ser substituição em uma, duas ou três posições. Em uma modalidade, a modificação é substituição em uma das posições. Tais substituições, em algumas modalidades, são substituições conservativas. Polinucleotídeos Codificando os Polipeptídeos e Métodos de Preparar os Polipeptídeos

[0093] A presente descrição também provê moléculas isoladas de polinucleotídeos ou ácido nucleico codificando as proteínas PD-1 isca, anticorpos, moléculas de fusão, variantes ou derivados dos mesmos da descrição. Os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar as regiões variáveis de cadeia pesada e leve inteiras dos polipeptídeos de ligação a antígeno, variantes ou derivados dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeco ou em moléculas de polinucleotídeo separadas. Adicionalmente, os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar porções das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos polipeptídeos de ligação a antígeno, variantes ou derivados dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas de polinucleotídeo separadas.

[0094] Métodos de fabricar proteínas e anticorpos iscas são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em certas modalidades, as regiões tanto variáveis quanto constantes do polipeptídeo de ligação a antígenos da presente descrição são totalmente humanas. Os anticorpos totalmente humanos podem ser fabricados usando técnicas descritas na técnica e como aqui descritas. Por exemplo, anticorpos totalmente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir tais anticorpos em resposta à inoculação antigênica, mas cujos locais endógenos foram desativados. As técnicas exemplares que podem ser usadas para fabricar tais anticorpos são descritas nas patentes U.S.: 6.150.584, 6.458.592,

6.420.140 que são incorporadas por referência em suas totalidades. Tratamento de Câncer

[0095] Como aqui demonstrado, as moléculas de fusão da presente descrição exibiram efeitos sinergísticos no tratamento de câncer e podem ser usadas em certos métodos de tratamento e diagnóstico.

[0096] A presente descrição está direcionada ainda às terapias que envolvem administrar as moléculas de fusão da descrição a um paciente tal como um animal, um mamífero e um ser humano para o tratamento de um ou mais dos distúrbios ou condições aqui descritas. Os compostos terapêuticos da descrição incluem, mas não são limitados às moléculas de fusão da descrição (incluindo variantes e derivados das mesmas como aqui descritos) e ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando as moléculas de fusão da descrição (incluindo variantes e derivados dos mesmos como aqui descritos).

[0097] A terapia também pode envolver administrar variantes de IL-7 como aqui descrito, opcionalmente em combinação com a administração de um inibidor de PD-L1 como aqui descrito. Em algumas modalidades, a variante de IL-7 administrada e o inibidor de PD-L1 administrado têm uma razão molar que é pelo menos 5:1,4:1,3:1,2:1, 1,5:1, 1:1 ou 1:2. Em algumas modalidades, a variante de IL-7 administrada e o inibidor de PD-LI administrado têm uma razão molar que não é maior do que 2:1, 1,5:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ou 1:5. Em algumas modalidades, a variante de IL-7 administrada e o inibidor de PD-L1 administrado têm uma razão molar entre 2:1 e 1:2 ou entre 1,5:1 e 1:1,5.

[0098] As terapias celulares, tais como as terapias de célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR), também são providas na presente descrição. Uma célula adequada pode ser usada, que é colocada em contato com um anticorpo anti-PD-L1 da presente descrição (ou alternativamente engenheirada para expressar um anticorpo anti-PD-L1 da presente descrição). Em tal contato ou engenheiramento, a célula pode ser depois introduzida em um paciente com câncer em necessidade de um tratamento. O paciente com câncer pode ter um câncer de qualquer um dos tipos como aqui descritos. À célula (por exemplo, célula T) pode ser, por exemplo, um linfócito T infiltrante de tumor, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou a combinação das mesmas, sem limitação.

[0099] Em algumas modalidades, a célula foi isolada do próprio paciente com câncer. Em algumas modalidades, a célula foi provida por um doador ou de um banco de célula. Quando a célula é isolada do paciente com câncer, reações imunes indesejadas podem ser minimizadas.

[00100] Doenças ou condições adicionais associadas com a sobrevivência de célula aumentada, que pode ser tratada, prevenida, diagnosticada e/ou prognosticada com as moléculas de fusão ou variantes ou derivados das mesmas da descrição incluem, mas não são limitadas à progressão e/ou metástases de malignidades e distúrbios relacionados tais como leucemia (incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e leucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia verdadeira, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença de não Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e tumores sólidos incluindo, mas não limitados a, sarcomas e carcinomas tais como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, Sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Evwing, leiomiossarcoma, — rabdomiossarcoma, — carcinoma .—colônico, câncer pancreático, câncer mamário, câncer tireóidico, câncer endomíétrico, melanoma, câncer prostático, câncer ovariano, câncer prostático, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma,

menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

[00101] Um regime de dosagem e tratamento específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo as moléculas de fusão particulares, variante ou derivado das mesmas usadas, a idade do paciente, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta e o tempo de administração, taxa de excreção, combinação medicamentosa e a severidade da doença particular que é tratada. O julgamento de tais fatores por cuidadores médicos está dentro da versatilidade comum na técnica. À quantidade também dependerá do paciente individual a ser tratado, da via de administração, do tipo de formulação, das características do composto usado, da severidade da doença e do efeito desejado. A quantidade usada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem conhecidos na técnica.

[00102] Os métodos de administração das moléculas de fusão, variantes ou incluem, mas não são limitados às vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. O polipeptídeo de ligação a antígenos ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo pela infusão ou injeção de bolo, pela absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosas retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntos com outros agentes biologicamente ativos. Assim, as composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos de ligação a antígeno da descrição podem ser administradas oralmente, retalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, topicamente (como por pós, unguentos, gotas ou emplastro transdérmico), bucalmente ou como uma pulverização oral ou nasal.

[00103] O termo “parenteral” como aqui usado se refere aos modos de administração que incluem injeção e infusão intravenosas, intramusculares, intraperitoneais, intraesternais, subcutâneas e intra-articulares.

[00104] A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir as moléculas de fusão da descrição dentro do sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, fixado a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. À administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizante.

[00105] Pode ser desejável administrar as moléculas de fusão ou composições da descrição localmente à área em necessidade de tratamento; isto pode ser alcançado, por exemplo e não por via de limitação, pela infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunção, com um curativo de ferimento depois da cirurgia, por injeção, por meios de um cateter, por meios de um supositório ou por meios de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas ou fibras. Preferivelmente, quando da administração de uma proteína, incluindo um anticorpo, da descrição, cuidado deve ser tomado para usar materiais aos quais a proteína não absorva.

[00106] A quantidade das moléculas de fusão da descrição que serão eficazes no tratamento, inibição e prevenção de uma doença, distúrbio ou condição inflamatórios, imunes ou malignos pode ser determinada pelas técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro podem ser opcionalmente utilizados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. À dose precisa a ser utilizada na formulação também dependerá da via de administração e da seriedade da doença, distúrbio ou condição e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e cada circunstância do paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas das curvas de dose- resposta derivadas de sistemas de teste de modelo in vitro ou animal.

[00107] Como uma proposição geral, a dosagem administrada a um paciente dos polipeptídeos de ligação a antígeno da presente descrição é tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente, entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente ou 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Geralmente, anticorpos humanos têm uma meia- vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune para os polipeptídeos estranhos. Assim, dosagens mais baixas de anticorpos humanos e administração menos frequente é frequentemente possível. Adicionalmente, a dosagem e frequência de administração de moléculas de fusão da descrição podem ser reduzidas realçando-se a absorção e penetração tecidual (por exemplo, dentro do cérebro) das moléculas de fusão pelas modificações tais como, por exemplo, lipidação. Composições

[00108] A presente descrição também provê composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade eficaz de uma molécula de fusão e um carreador aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui ainda um segundo agente anticâncer (por exemplo, um inibidor do ponto de checagem imune).

[00109] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou um estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para o uso em animais e mais particularmente em seres humanos. Adicionalmente, um “carreador farmaceuticamente aceitável” geralmente será um enchedor, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação sólido, semissólido ou liquido não tóxico de qualquer tipo.

[00110] O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o produto terapêutico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos,

incluindo aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares.

A água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente.

Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser utilizadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis.

Os excipientes farmaceuticamente adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e similares.

A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes de umidificação ou emulsificantes ou agentes de tamponação de pH tal como acetatos, citratos ou fosfatos.

Agentes antibacteriano tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes queladores tais como ácido etilenodiaminotetraacético; e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose também são considerados.

Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e similares.

A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e carreadores tradicionais tais como triglicerídeos.

A formulação oral pode incluir carreadores padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.

Os exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E.

W.

Martin, aqui incorporada por referência.

Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de ligação a antígeno, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade adequada de carreador de modo a prover a forma para a administração apropriada ao paciente.

A formulação deve de adequar ao modo de administração. A preparação parental pode ser incluída em ampolas, seringa descartável ou frascos de dose múltipla fabricados de vidro ou plástico.

[00111] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, as composições para a administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no sítio da injeção. Geralmente, os ingredientes são supridos separadamente ou misturados juntos na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição deva ser administrada pela infusão, a mesma pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina grau farmacêutico estéril. Onde a composição é administrada pela injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser provida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

EXEMPLOS Exemplo 1: Planejamento e geração de moléculas de fusão anti-PDL1 e de IL7 humana

[00112] O gene de cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo anti- PDL! (ver as sequências de região variável na Tabela 1) foi designado fundir com o gene IL7 humano (Tabela 2) com ligadores peptídicos na Tabela 3. Os genes resultantes foram depois clonados em vetores de expressão de mamífero e transfectado em células HEK293T. As proteínas de fusão de anticorpo-citocina (estrutura na FIG. 1, painel A) foram purificados pela proteína A dos sobrenadantes de células transfectadas.

40 / 48 Tabela ]. Sequências de Anticorpo Anti-PD-LI (resíduos de CDR sublinhados) Nome Sequência SEQ ID NO: Cadeia EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYDMSWVRQA pesada PGKSLEWVAT variável ISDAGGYIYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED

TAVYICAREF

GKRYALDYWG QGTTVTVSS (Cadeia leve DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVT PAVAWYQQKP 7 variável GKAPKLLIYS

TSSRYTGVPS RFESGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQO HYTTPLTFGQ

GTKLEIK Tabela 2. Sequências de IL-7 Sequência (sublinhado em negrito indica mutação) SEQID NO: IL-7 Humana | DCDIEGKDGK QYESVLMVSI DQLLDSMKEI GSNCLNNEFN

FFKRHICDAN KEGMFLFRAA RKLRQFLKMN STGDFDLHLL KVSEGTTILL NCTGQVKGRK PAALGEAQPT KSLEENKSLK EQKKLNDLCF LKRLLQEIKT CWNKILMGTK

EH Mutante IL-7 DCDIEGKDGK QYESVLMVSI DQLLDSMKEI GSNCLNNEFN 9 WI82A humano FFKRHICDAN

KEGMFLFRAA RKLRQFLKMN STGDFDLHLL KVSEGTTILL NCTGQVKGRK PAALGEAQPT KSLEENKSLK EQKKLNDLCF LKRLLQEIKT CANKILMGTK

EH Tabela 3. Sequências de Ligador Peptídico SEQTID NO:

GGGGSCGGGS GGGGSGGGGS GGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GSGSGSGSGS GSGSGSGS

EPKSSDKTHT CPPCP Exemplo 2: Potência da citocina de IL7 de moléculas de fusão anti-PDL1-IL7

[00113] Todas as moléculas de fusão anti-PDLI1I-IL7 nos exemplos abaixo usaram o Formato A na FIG. 1. Estas moléculas bifuncionais combinaram o antagonismo de PDL1 com a atividade celular de IL7. Dada a razão em mol fixa (1:1) de molécula anti-PDL1 e IL7, foi considerado que variantes IL7 com um nível de atividade diferente teria melhor sinergismo com a função anti-PDL1.

[00114] A estrutura cristalina de IL7/IL7R foi resolvida (Structure 2009, 17: 54-65). Os dados mostraram que os aminoácidos K120, R133,

L135, Q136, E137, K139, TI140, W142, NI43 e K144 estão na interface de IL7 e cadeia y comum (receptor de transdução de sinal de IL7) (FIG. 2). Cada um destes 10 aminoácidos foi mutado para Ala e avaliados com respeito à pureza pela SEC-HPLC e a atividade de IL7 pelo ensaio de proliferação de célula 2E8 (IL7 pode direcionar a proliferação de células 2E8). WI42A mutante mostrou potência de IL7 significantemente reduzida e excelente pureza como mostrado na FIG. 2.

[00115] Porque IL7 pode induzir a fosforilação de STATS (pSTATS) e mais tarde na proliferação de células T CDA, para avaliar adicionalmente a potência de IL-7 do tipo selvagem (WT) e IL7 WI42A nas células T humanas primárias, o ensaio de pSTATS e o ensaio de proliferação de CD4 foram realizados. Em resumo, no ensaio de pSTATS, PBMCs humanas foram tratadas com anti-PDL1-IL7 e anti-PDL1-IL7Y!* na concentração indicada durante 15 min. No ensaio de proliferação de CDA4, as células T CD4 purificadas foram tratadas com anti-PDL1-IL7 e anti-PDL1-IL7YW!%2A durante 1 semana. Como mostrado na FIG. 3, a mutação WI42A de fato reduziu a potência de IL7 de moléculas de fusão anti-PDL1-IL7.

[00116] Para sintonia fina da atividade de IL7 de molécula de fusão anti-PDL1-IL7, uma série de mutações de sítio único em W142 de IL7 foi gerada. Com base na polaridade, números de amino e hidroxila, os 20 aminoácidos podem ser divididos em quatro categorias: grupos não polares (G, A, V, C, , L LM, We FP), polares (S, T, Y, Ne Q), positivamente carregados (K, R e H) e negativamente carregados (D e E). Uns poucos aminoácidos representativos de cada grupo foram selecionados para construir moléculas anti-PDL1-IL7 mutantes como descritas abaixo (Tabela 4). Foi mostrado que todos os aminoácidos não polares exceto Prolina (P) pode substituir com W142 para gerar anti-PDL1-IL7 mutante com alta pureza de SEC (>96,8%). Ao contrário, a mutação de W142 para outros três tipos de aminoácidos causaram estabilidade de molécula e pureza de SEC reduzidas

(<84%). Em seguida, cada aminoácido dentro dos subtipos de aminoácido não polar foi usado para substituir W para gerar uma série de moléculas anti- PDLI1-IL7 mutantes para realizar a validação da atividade de IL7 pelo ensaio de proliferação de 2E8 (Tabela 5). Foi mostrado que quanto menor a similaridade que o aminoácido substituto teve com W, mais baixa a atividade de IL7 a molécula mutada teve (W>F>M>I>L>V>A).

[00117] Para confirmar a atenuação da atividade de IL7 das moléculas mutantes anti-PDLI-IL7 nas células T CD4* primárias, o ensaio de sinalização de p-STATS foi realizado como acima. Como mostrado na FIG. 4A, a capacidade das moléculas de fusão para estimular a sinalização de STATS em células T CD4* primárias humanas gradualmente diminuiu (W>I>V>A), que correlacionou com a sua atividade correspondente no ensaio de proliferação de 2E8. De modo a explicar o mecanismo de atividades de IL7 atenuadas das moléculas anti-PDLI1-IL7 mutantes em série, a ligação do receptor de IL7 (IL7R) e a internalização mediada pela ligação foram avaliadas. Em resumo, para o ensaio de ligação de IL7R, células T CD4* humanas primárias foram incubadas com várias moléculas de fusão anti- PDLI-IL7 a 4ºC durante 30 mins. O anticorpo secundário anti-Fc humano conjugado a PE foram usados para detectar as moléculas de fusão que ligaram ao IL7R de células T CD4* pelo FACS. Como mostrado na FIG. 4B, todas das três moléculas de fusão anti-PDL1-IL7 (W1421, V e A) com atividades de I1L7 diminuídas tiveram ligação de IL7R reduzida. Para o ensaio de internalização do receptor mediado pela ligação, células T CD4* humanas primárias foram cocultivadas com moléculas de fusão a 37ºC durante 15 mins. Anticorpo anti-CD127 conjugado a PE-cy7 (IL7Ra) foi usado para detectar a IL7R de superfície pelo FACS. Similar às tendências de ligação de IL7R, estas moléculas de fusão com potência de ligação ao receptor de IL7 reduzida tiveram internalização de IL7R comprometida (FIG. 4C), indicando transdução da sinalização de IL7 prejudicada. Em conclusão, nós desenvolvemos uma série de moléculas anti-PDL1-IL7 com atividades de IL7 diferentes e atenuadas pela modificação de uma única mutação de sítio de WI142. Tabela 4. Comparação da propriedade de SEC de vários mutantes PDL1-IL7 Classificação de aminoácidos Proteína Expressão (mg/L) | SEC % Tipo selvagem anti-PDLI-IL7 4 99,90 anti-PDL1-IL7NA 2,9 97,80 Não polar anti-PDL1-IL7N12 99,20 9 poi anti-PDLI-IL79 ON 96,80 anti-PDL1-IL7Y12 52,00 Carga Positiva anti-PDL1-IL7Y1º2R 2,8 39,00 Carga Negativa anti-PDL1-IL7Y42D 2,1 54,00 Polar anti-PDLIILT9 16 3,2 84,00 > anti-PDL1IL7N!PO 64,00 Tabela 5. Comparação de EC50 de vários mutantes de PDLI-IL7 no ensaio de proliferação de 2E8 Proteína Alteração de número de EC50 no ensaio de proliferação de 2E8 (EC5Ovmutante/ EC5Otipo setvagem) anti-PDL1-IL7 Po | E am 346,7 4840,4 Exemplo 3: Propriedades de ligação de PDL1 de moléculas de fusão anti- PDL1-IL7

[00118] Este exemplo examinou a afinidade cinética completa de anticorpos humanizados pelo Biacore€.

[00119] A ligação da molécula de fusão anti-PDL1-IL7 à proteína PD- LI recombinante (PD-LI-his taq humana) foi testada pelo BIACOREº usando um método de captura. As moléculas de fusão anti-PDL1-IL7 foram capturadas usando anticorpo anti-Fc humano revestido sobre um chip CMS. Uma série de diluições da proteína PD-L1-his taq humana foi injetada sobre anticorpo capturado durante 3 mins em uma taxa de fluxo de 25 ug/ml. O antígeno foi deixado dissociar durante 900 s. Todos os experimentos foram realizados em um Biacore T200. A análise de dados foi realizada usando o software T200 Evaluation da Biacore. Os dados mostram que a afinidade de

44 / 48 ligação de PDL1 não foi comprometida nas moléculas de fusão (Tabela 6). Tabela 6. Resultados do teste de afinidade

[00120] Para avaliar a propriedade de ligação de antígeno, as moléculas de fusão foram analisadas quanto à sua ligação à PD-L1 expressa em mamífero pelo FACS. Em resumo, as células PDL1-Raji foram primeiro incubadas com 3 vezes anticorpos humanizados diluídos em série começando a 15 ug/ml na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois lavando pelo tampão de FACS (PBS com 2% de FBS), o anticorpo anti-IeG humana Alexa 488 foi adicionado a cada poço e incubados na temperatura ambiente durante 1 hora. O MFI de Alexa 488 foi avaliado pelo FACSAriaIIll. Como mostrado na FIG. 5, todas as moléculas de fusão mostraram ligação similar ao anticorpo monoclonal anti-PDL1. Exemplo 4: Atividade antagonista de PDL1 de moléculas de fusão anti-PDL1- 17

[00121] Para avaliar o antagonista de PDL1, ensaios de PDI/PDL1 Jurkat foram realizados. O super antígeno de Enterotoxina Estafilocócica (SEE) estimulou a produção de IL2 pelas células T Jurkat na presença de células Raji através da ligação de MHCII nas moléculas Raji e TCR em Jurkat. PDL1 exógena expressa nas células Raji ligaram à PD1 superexpressa pelas células T Jurkat e inibiu a produção de IL2 pela Jurkat. O anticorpo monoclonal (mAb) anti-PDL1 reverteu a produção de IL2 suprimida pelo caminho de PDI/PDL1. Como mostrado na FIG. 6, as moléculas de fusão anti-PDL1-IL7 e anti-PDL1-IL7Y!*ºA mostraram função antagonista de PDL] comparável com mAb anti-PDL1. Exemplo 5: A ligação biespecífica de moléculas de fusão anti-PDL1-IL7

[00122] Para verificar as moléculas de fusão com propriedades de ligação biespecíficas com receptor alfa PDL1 e IL7 (IL7Ra), este exemplo usou Interferometria de BioCamada (BLI) medindo as ligações biespecíficas. Em resumo, IL7Ra rotulado com biotina foi primeiramente capturada pelo sensor de estreptavidina. A molécula de fusão anti-PDL1-IL7 foi capturada pela IL7Ra. A concentração saturada (100 nM) de his-PDL1 foi usada para a ligação de PDL1 avaliada. Todas as moléculas de fusão mostraram ligação biespecífica de PDL1 e IL7Ra (FIG. 7). Além disso, anti-PDL1-IL7W!42A mostrou ligação reduzida ao IL7Ra, o que foi compatível com a sua potência de IL7 reduzida (FIG. 7). Exemplo 6: Estimulação sinergística de molécula de fusão anti-PDL1-IL7 sobre a função de célula T humana

[00123] Para avaliar a função in vitro de moléculas de fusão, a resposta de células T humanas foi avaliada em um cenário de reação de linfócito misto. As DCs humanas foram diferenciadas de monócitos CDI14* na presença de GM-CSF e IL-4 durante 7 dias. As células T CD4* isoladas de um outro doador foram depois cocultivadas com as DCs e diluições em série das moléculas de fusão.

[00124] No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante de cultura foi ensaiado quanto à produção de IFN7. Os resultados indicaram que anti-PDL1- IL7 e anti-PDL1I-IL7Y!%A mostraram eficácia superior do que o mAb anti- PDLI1 ou IL7 no realce da função de célula T humana (FIG. 8). Anti-PDL1- IL7WW2A com potência IL7 reduzida, mostrou potência comparável como LII7 sobre a resposta de célula T humana. Portanto, as moléculas de fusão tiveram efeito sinergístico de antagonismo de PDLI e efeito de IL7 e atividade de IL7 completa como não necessária para o efeito sinergístico. As moléculas anti-PDL1-IL7 com atividade IL7 reduzida e efeito sinergístico forte sobre a estimulação imune podem ter melhor perfil de segurança nas clínicas futuras. Exemplo 7: Rastreamento in vivo de anti-PDL1-IL7

[00125] Para avaliar a distribuição de molécula de fusão anti-PDL1-

46 / 48 IL7 in vivo, o ensaio de rastreamento in vivo foi conduzido. Em resumo, mAb anti-PDL1 rotulado com ICG, anti-PDL1-IL7 ou Fc-IL7 foram injetados dentro de camundongos humanizados com células tronco hematopoiéticas CD34* transplantadas com HCC827 (HSC) intravenosamente quando o tamanho do tumor atingiu 500 mmº?. Os sistemas de imageamento foram usados para capturar o sinal de fluorescência em intervalos de tempo diferentes. Como mostrado na FIG. 9, similar ao mAb anti-PDL1, anti-PDL1- IL7 significantemente enriqueceu no sítio de tumor ao passo que o Fc-IL7 foi amplamente espalhado especialmente no Dia 1 depois da administração. Estes dados coletivamente mostraram a distribuição seletiva e específica de anti- PDL1-IL7, demonstrando o efeito sistêmico reduzido de IL7 na molécula de fusão. Exemplo 8: Eficácia in vivo de anti-PDL1I-IL7 em modelo de camundongo BI16FI1O resistente à terapia com PDL]

[00126] Para avaliar a eficácia in vivo de anti-PDL1-IL7, modelo de camundongo singênico de melanoma B16FI10 resistente ao anticorpo PDL1 foi utilizado com anti-PDL1-IL7 substituto, uma molécula compreendida de duas IL7 de camundongo fundidas com um anticorpo anti-PDL1 que foram reativas cruzadas com PDL1 de camundongo. Neste ponto de tempo, duas isoformas de IZG com (hIgG1Nº7%) ou sem (mIgG2a) função ADCC foram usadas para avaliar a contribuição de ADCC para a eficácia. Em resumo, combinação equimolar de anti-PDL1, mIL7-Fc, destas duas moléculas ou moléculas de fusão foi administrada s.c. ao camundongo C57/BI6 no dia do transplante de célula de tumor B16F10 e repetidamente a cada quatro dias.

[00127] Como mostrado na FIG. 10, a monoterapia com mIL7-Fc e anti-PDL1-hIgG1NºA desativados por ADCC mostrou eficácia extremamente fraca na inibição do crescimento de tumor (ÚÁndice de Crescimento de Tumor (TGD) = 22,5% e 21%, respectivamente). Ao contrário, anti-PDL1-mIgG2a com função ADCC desativada mostrou atenuação moderada do crescimento de tumor (TGI = 52,0%). A combinação de mAb anti-PDL1 e mIL7 mostrou efeito sinergístico comparado com a sua respectiva monoterapia nos grupos tanto desativados quanto ativados em ADCC, com inibição mais severa de crescimento de tumor nos grupos desativados em ADCC (TGI = 42,3% e 73,4%). Mais importantemente, ambas as moléculas de fusão (com e sem função ADCC) mostraram melhor eficácia na prevenção do crescimento de tumor comparado com o grupo combinado (TGI = 82,0% e 86,3%), indicando um benefício mecanístico de molécula bifuncional no controle específico de sítio de desenvolvimento de tumor. No final do experimento, os pesos de tumor de cada um dos animais foram medidos. A tendência da variação de pesos de tumor foi similar àquela da mudança do volume de tumor (FIG. 11). Estes dados indicaram a contribuição de ADCC para o controle do crescimento de tumor de moléculas anti-PDL1-IL7.

[00128] Em seguida, números absolutos de células T CD4* e T CD8* esplênicas e infiltrantes de tumor foram analisados pelo FACS. Aumento de células T CD4* e T CD8* esplênicas e infiltrantes de tumor foi observado nos grupos relacionados com o tratamento com mIL-7, não importando tratamento com monoterapia, terapia combinada ou molécula de fusão, indicando que IL7 desempenhou um papel no realce da proliferação de célula T tanto no ambiente periférico quanto no intratumoral (FIG. 12). Estes dados indicaram que a molécula de fusão anti-PDL1-IL7 exibiu eficácia superior através da combinação do efeito de antagonismo de PDL1 com proliferação de célula T derivada de IL7, resultando em um microambiente antitumor revigorado. A ** *

[00129] A presente descrição não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas que são intencionadas como ilustrações únicas de aspectos individuais da descrição e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta descrição. Estará evidente para aqueles versados na técnica que várias

48 / 48 modificações e variações podem ser feitas nos métodos e composições da presente descrição sem divergir do espírito ou escopo da descrição. Assim, é pretendido que a presente descrição abranja as modificações e variações desta descrição contanto que estejam dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00130] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação individual ou pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicados ser incorporados por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um inibidor de PD-L1 fundido a uma proteína IL-7 humana ou um fragmento da mesma capaz de ligar um receptor de IL-7, através de um ligador peptídico.

2. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico tem de 5 a 100 resíduos de aminoácido.

3. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico tem de 10 a 75 aminoácidos.

4. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos 20% dos resíduos de aminoácido de ligador peptídico são resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em alanina, glicina, cisteína e serina.

5. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos 40% dos resíduos de aminoácido de ligador peptídico são resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em alanina, glicina, cisteína e serina.

6. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1 a 5.

7. Molécula de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 6, caracterizada pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é uma proteína PD-1 isca ou um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação de antígeno da mesma.

8. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína PD-1 isca é uma PD-1 inativa que liga PD-L1.

9. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno do anticorpo anti-PD-L1 é um fragmento de cadeia única, um fragmento Fab ou um par de fragmentos Fab.

10. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-LI é um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico que tem adicionalmente uma especificidade secundária.

11. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1I é desativado em ADCC.

12. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDRI, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos dos resíduos 31 a 35, resíduos 50 a 66 e resíduos 99 a 108 da SEQ ID NO: 6 respectivamente e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos dos resíduos 24 a 34, resíduos 50 a 56 e resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 7 respectivamente.

13. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação a antígeno da mesma compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.

14. Molécula de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a proteína IL-7 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9 enquanto capaz de ligar receptor alfa de IL-7.

15. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9 tem afinidade de ligação reduzida ao receptor alfa de IL-7 quando comparada com a proteína IL-7 humana do tipo selvagem.

16. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a proteína IL-7 tem um resíduo de aminoácido selecionado de G, A, V, C, LI, Me F na posição 142 de acordo com a SEQ ID NO: 9.

17. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a proteína IL-7 tem um resíduo de aminoácido selecionado de A, V, L, I, Me F na posição 142 de acordo com a SEQ ID NO: 9.

18. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a proteína IL-7 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.

19. Molécula de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende um fragmento da proteína IL-7, em que o fragmento inclui pelo menos os quatro motivos de hélice alfa.

20. Molécula de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal C do inibidor de PD-L1 e fundido ao resíduo de terminal N da proteína IL-7 do fragmento da mesma.

21. Molécula de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N do inibidor de PD-L1 e fundido ao resíduo de terminal C da proteína IL-7.

22. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N de uma cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento da mesma.

23. Molécula de fusão de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o ligador peptídico é fundido ao resíduo de terminal N de uma cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento da mesma.

24. Proteína isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou um peptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9, em que o peptídeo é capaz de ligar o receptor alfa de IL-7 mas tem afinidade de ligação reduzida ao receptor alfa de IL-7 quando comparada com a proteína IL-7 humana do tipo selvagem.

25. Proteína de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o peptídeo tem um resíduo de aminoácido outro que não Trp no local 142.

26. Proteína de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o peptídeo tem, no local 142, um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em G, A, V, C, L, LI, MeF.

27. Proteína de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o peptídeo tem, no local 142, um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em A, V, LI, MeF.

28. Proteína de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o peptídeo tem, no local 142, alanina.

29. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 28 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

30. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos codificando a molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 28.

31. Método para tratar um câncer em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma molécula como definida em qualquer uma das reivindicações | a 23.

32. Método para tratar um câncer em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 28.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao paciente um inibidor de PD-L1.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a proteína e o inibidor de PD-L1 têm razão molar de cerca de 2:1a1:2.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer hepático, câncer colônico, câncer retal, câncer endométrico, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer mamário, câncer uretral, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer estomacal, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer prostático e câncer tireóidico.