BR112019025243A2 - anticorpos específicos para flt3 e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a FLT3 (Tirosina Cinase 3 do Tipo Fms). A invenção fornece ainda anticorpos biespecíficos que se ligam a FLT3 e outro antígeno (por exemplo, CD3). A invenção refere-se ainda a anticorpos que codificam ácidos nucléicos, e métodos para obter tais anticorpos (monoespecíficos e biespecíficos). A invenção refere-se ainda a métodos terapêuticos para uso destes anticorpos para o tratamento de patologias mediadas por FLT3, incluindo câncer tal como Leucemia Mieloide Aguda (AML).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA FLT3 E USOS DOS MESMOS".

CAMPO

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos, por exemplo, anticorpos de tamanho natural ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que especificamente se liga à tirosina cinase 3 similar a Fms (FLT3). A invenção também se refere a anticorpos heteromultiméricos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que compreende anticorpo FLT3 em uma subdivisão. Composições que compreendem os anticorpos FLT3, métodos para produzir e purificar tais anticorpos, e seu uso em diagnósticos e terapêuticas são também fornecidos.

ANTECEDENTES

[002] FIt3 (também conhecido como CD135, FLK3, STK1), um antígeno alvo bem caracterizado por Leucemia Mieloide Aguda (AML), é superexpresso em blastos de paciente de AML em comparação com as células saudáveis, e é expresso na maioria de células do paciente (Veja, por exemplo, Carow et al, Blood: 87(3) (Fevereiro de 1996); e Birg et al., Blood: 80(10) (Novembro de 1992)). Além disso, Flt3 é o gene mais frequentemente mutado em pacientes de AML, e mutações que resultam em ativação constitutiva do receptor estão associadas com mau prognóstico (Veja, por exemplo, Abu-Duhier et al. Br J Haematol., 111(1):190-5 (Oct 2000), Yamamoto et al., Blood: 97 (8) (abril de 2001)).

[003] A presença de um condutor oncogênico sobre a superfície blastos leucêmicos fornece uma oportunidade para o desenvolvimento de uma terapia direcionada. Inibidores FIt3 de molécula pequena mostraram atividade em experiências clínicas; entretanto, as respostas são geralmente transitórias, devido à aquisição de resistência. Adicionalmente, inibidores de cinase tratam apenas uma percentage de pacientes expressando a forma mutada de FIt3, ressaltando a urgente necessidade de terapias melhoradas.

[004] Anticorpo biespecífico de FIt3 na forma de Método biespecífico que envolve célula T foi também desenvolvido recentemente, visto que FIt3 tem expressão relativamente baixa sobre células de tumor, em comparação com outros antígenos de tumor. Entretanto, uma limitação de muitos formatos biespecíficos é o fato de que eles são de baixo peso molecular, de curta meia-vida, requerendo desse modo infusão contínua. Por consequência, permanence uma necessidade de anticorpos (por exemplo, monoespecíficos ou biespecíficos) para o tratamento de câncer, tal como AML com eficácia e perfil de segurança melhorados, e adequado para uso com pacientes humanos. Sumário

[005] A invenção descrita neste documento é direcionada a anticorpos (por exemplo, anticorpos monoespeciíficos ou biespecíficos) que especificamente se ligam a Tirosina Cinase 3 tipo Fms (FLT3). Em particular, os inventores da presente invenção descobriram que os anticorpos FLT3 como descrito aqui, no formado biespecífico de tamanho natural têm meia-vida maior, interação de Fc minimizada, e liberação de citocina não específica minimizada in vivo por meio de interação com células imunes. Além disso, domínio 4 alvejando anticorpos FLT3 da proteína FLT3 como descrito aqui, no formato biespecífico de tamanho natural é encontrado para ser mais eficaz em depleção celular de AML comparado com outros domínios, incluindo domínios 1, 2, 3, e 5 no formato biespecífico notado.

[006] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região um de determinação de complementaridade de VH (CDR1) que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246, ou 247; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253, ou 255; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71,77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250, ou 254; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273, ou 275; (ii) uma CDR?2 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266, ou 271; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272, ou 274.

[007] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada nas SEQ ID Nº: 2, 4,6,8,10,12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229, 231, ou 233; e/ou uma região VL que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada nas SEQ ID Nº: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222,

224, 226, 228, 230, ou 232. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região VH que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID NO. 229; e/ou uma região VL que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 228. Em algumas modalidades, a região VH como descrito aqui, compreende uma variante com uma ou diversas substituições de aminoácido conservativas em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou a região VL como descrito aqui, compreende uma variante com uma ou diversas substituições de aminoácidos que não estão dentro de uma CDR. Por exemplo, em algumas modalidades, a região VH ou VL pode compreender uma sequência de aminoácido descrita acima ou uma variante da mesma com não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 substituições conservativas em resíduos que não estão dentro de uma CDR.

[008] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 215, 229, ou 231; e/ou uma região VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 214, 228, ou 230. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 229; e/ou uma região VL que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 228.

[009] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo que especificamente se liga a FLT3 e compete com um anticorpo isolado fornecido aqui que especificamente se liga a FLT3.

[0010] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo biespecífico em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, que compreende um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico especificamente se ligando a um antígeno alvo, e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável de anticorpo se liga ao domínio 4 de FLT3 que compreende SEQ ID Nº: 279 ou domínio 5 de FLT3 que compreende SEQ ID Nº: 280.

[0011] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo biespecífico em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, que compreende um primeira domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico especificamente se ligando a um antígeno alvo (por exemplo, FLT3), e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor (por exemplo, Cluster de diferenciação 3 (CD3)) localizado na célula efetora imune humana. Em algumas modalidades, o primeiro domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada nas SEQ ID Nº: 2, 4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, ou 233; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada nas SEQ ID Nº: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, ou 232. Em algumas modalidades, o primeiro domínio variável de anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região um de determinação de complementaridade de VH (CDR1) que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72,73,

74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246, ou 247; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253, ou 255; e (ili) uma CDR3 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250, ou 254; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um CDR1 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273, ou 275; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266, ou 271; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272, ou 274.

[0012] Em algumas modalidades, o segundo domínio variável de anticorpo compreende as regiões VH e/ou VL específicas contra CD3. Por exemplo, o segundo domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº:282; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 281.

[0013] Em algumas modalidades, o primeiro domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº: 229; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 228; e um segundo domínio variável de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma CDR1 de VH, CDR?2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº:282; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 281.

[0014] Em algumas modalidades, o segundo domínio variável de anticorpo compreende (a) uma região VH que compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 285, 286, ou 287; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 288 ou 289; e (iii) uma CDR3 de VH compreedendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 290; e/ou uma região VL que compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 291; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 292; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 234.

[0015] Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma região constante. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento são da subclasse de IgG1, IgG2 ou IgG2Aa, I9G3, ou IgG4 humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma região constante glicosilada Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma região constante tendo afinidade de ligação reduzida a um ou mais receptores gama de Fc humano.

[0016] Em algumas modalidades, ambos: o primeiro e o segundo domínio variável de anticorpos do anticorpo biespecífico compreende modificações de aminoácidos nas posições 223, 225, e 228 (por exemplo, (C223E ou C223R), (E225R), e (P228E ou P228R)) na região de articulação e nas posições 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração da União Europeia)) na região CH3 de I9G2 humano (SEQ ID Nº: 290).

[0017] Em algumas modalidades, ambos: o primeiro e o segundo domínio variável de anticorpos do anticorpo biespecífico compreende modificações de aminoácido na posição 265 (por exemplo, D265A) do IgG2 humano.

[0018] Em algumas modalidades, ambos: o primeiro e o segundo domínio variável de anticorpos do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos em uma ou mais das posições 265 (por exemplo, D265A), 330 (por exemplo, A330S), e 331 (por exemplo, P331S) do IgG2 humano. Em algumas modalidades, ambos: o primeiro e o segundo domínio variável de anticorpos do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos em cada uma das posições 265 (por exemplo, D265A), 330 (por exemplo, A330S), e 331 (por exemplo, P331S) do IgG2 humano.

[0019] Em outras modalidades, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos descritos aqui.

[0020] A invenção também fornece linhagens celulares que produzem recombinantemente qualquer um dos anticorpos descritos aqui.

[0021] A invenção também fornece ácidos nucleicos codificando qualquer um dos anticorpos descritos aqui. A invenção também fornece ácidos nucleicos codificando região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos descritos aqui.

[0022] A invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou vetor fornecido aqui. Também é fornecido um método de produção de um anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespecífico) fornecido aqui, que compreende cultura de uma célula hospedeira fornecida aqui sob condições que resultam na produção do anticorpo, e isolamento do anticorpo da célula hospedeira ou cultura.

[0023] A invenção também fornece kits que compreendem uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos ou conjugados de anticorpos descritos aqui.

[0024] É também fornecido um anticorpo ou anticorpo biespeciífico fornecido aqui para uso como um medicamento.

[0025] A invenção também fornece métodos de tratamento de indivíduos em necessidade do mesmo que compreende fornecimento dos anticorpos isolados ou anticorpos biespecíficos descritos aqui, e administração de referidos anticorpos ao referido indivíduo.

[0026] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma condição associada com células malignas expressando FLT3 em um indivíduo que compreende administração a um indivíduo em necessidade da mesma quantidade eficaz da composição farmacêutica que compreende os anticorpos como descrito aqui. Em algumas modalidades, a condição é um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer relacionado a FLT3 (por exemplo, qualquer câncer com expressão de FLT3) selecionado do grupo consistindo em mieloma múltiplo, neoplasia maligna de célula plasmática, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin predominante de linfócito nodular, doença de Kahler e Mielomatose, leucemia de célula plasmática, plasmocitoma, leucemia prolinfocítica de célula B, leucemia de célula capilar, linfoma de não Hodgkin de célula B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de célula do manto, linfoma de célula grande, linfoma — precursor de linfoblastos B, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma de célula B grande difusa, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tecido linfático associado a mucosa, linfoma linfocítico de célula pequena, linfoma de célula do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de grandes células mediastinais (tímicas), linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma de célula B de zona marginal nodal, linfoma de zona marginal esplênico, linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de efusão primária, granulomatose linfomatoide, linfoma de célula B grande rico em histócitos e células T, linfoma de sistema nervoso central primário, linfoma de célula B grande difusa cutânea primário (tipo perna), linfoma de célula B grande difusa positivo de EBV de idosos, linfoma de célula B grande difusa associada com inflamação, linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de célula B grande de ALK positivo, linfoma plasmoblástico, linfoma de células grandes B que surge na doença de Castleman multicêntrica associada a HHVB8, Linfoma de célula B não classificado com características intermediárias entre linfoma de células B grandes difusas e linfoma de Burkitt, linfoma de célula B não classificado com características intermediárias entre linfoma de célula B grande difusa e linfoma de Hodgkin clássico, e outros cânceres relacionados a células hematopoiéticas.

[0027] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de inibição de crescimento ou progressão de tumor em um indivíduo que tem células malignas expressando FLT3, que compreende administração ao indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica que compreende os anticorpos isolados ou anticorpos biespecíficos, como descrito aqui.

[0028] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de inibição de metástase de células malignas expressando FLT3 em um indivíduo,

que compreende administração ao indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica que compreende os anticorpos isolados ou anticorpos biespecíficos, como descrito aqui.

[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de indução de regressão de tumor em um indivíduo que tem células malignas expressando FLT3, que compreende administração ao indivíduo em necessidade da mesma quantidade eficaz da composição farmacêutica da composição farmacêutica que compreende os anticorpos isolados ou anticorpos biespecíficos, como descrito aqui.

[0030] Em algumas modalidades, os métodos como descritos aqui, também compreendem administração de uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um agente bioterapêutico, por exemplo, um anticorpo.

[0031] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é uma citocina, TNFa (Fator de Necrose de Tumor alfa), um inibidor de PAP (ácido fosfatídico fosfatase), um vírus oncolítico, um inibidor de cinase, um inibidor de IDO (Indolamina-pirrol 2,3-dioxigenase), um inibidor de glutaminase GLS1, uma terapia de célula T ou célula T CAR (Receptor de Antígeno Quimérico), um agonista de TLR (receptor tipo Toll) (por exemplo, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9), ou uma vacina para tumor. Em algumas modalidades, a citocina é IL-15 (Interleucina- 15). Breve Descrição das Figuras/Desenhos

[0032] Figura 1 mostra que biespecíficos FLT3/CD3 (subdivisão de FLT3 é P5F7g, P5F791, P5F792, P5F793, ou P5F794) induzem citotoxidade em linhagem celular AML Eol1.

[0033] Figura 2 mostra que biespecíficos FLT3/CD3 (subdivisão de FLT3 é P1F1, P4A4, P4E5 ou P5F7) com epítopos de ligação a domínio

4 de FLT3 são altamente eficazes na indução de citotoxidade no modelo ortotópico Eol1.

[0034] Figura 3 mostra que biespecíficos FLT3/CD3 (subdivisão de FLT3 é 6B7 ou P8B6) direcionados para o domínio 4 da proteína FLT3 melhoraram a eficácia do tumor em um enxerto ortotópico na presença de células T humanas.

[0035] Figura 4A e Figura 4B demonstram valores ECs5o diminuídos para o anticorpo biespecífico FLT3/CD3 (P5F7) na ausência ou presença de IL15, respectivamente.

[0036] Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, e 5PF demonstram a morte de duas amostras de AML primárias na medula óssea aspira ex vivo induzida por concentrações crescentes de biespecífico FLT3 / CD3 (P5F7) na presença de células T autólogas. Um aumento dependente da concentração no total de células T e células T ativadas, como determinado pela percentagem de células CD25+, é descrito. Descrição Detalhada

[0037] A invenção descrita neste documento fornece anticorpos (por exemplo, monoespeciífico ou biespecífico) que especificamente se liga a FLT3 (por exemplo, FLT3 humano). A invenção também fornece polinucleotídeos codificando estes anticorpos, composições que compreendem estes anticorpos, e métodos de fabricação e uso destes anticorpos. A invenção também fornece métodos para tratamento de uma condição associada com patologias mediadas por FLT3 em um indivíduo, tal como câncer. Em particular, os inventores da presente invenção descobriram que os anticorpos FLT3 como descrito aqui, no formato biespecífico de tamanho natural têm meia-vida maior, interação de Fc minimizada, e liberação in vivo de citocina não específica minimizada por meio de interação com as células imunes. Além disso, os anticorpos FLT3 alvejando domínio 4 da proteína FLT3 como descrito aqui, no formato biespecífico de tamanho natural são encontrados para ser mais eficazes em depleção de célula AML comparados a outros domínios, incluindo domínios 1, 2, 3, e 5 no formato biespeciífico. Técnicas Gerais

[0038] A prática da presente invenção irá empregar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, imunologia, virologia, geração e engenharia de anticorpo monoclional, que estão dentro da técnica. Tais técnicas são explicadas inteiramente na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrooket a/., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Human Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (JE. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley e Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et a/l., eds., 1987); PCR: The Polimerase Chain Reaction, (Mullis et a/., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganet al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical method (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical method (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definições

[0039] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como, um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., por meio de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado em uma região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo abrange não apenas anticorpos monoclilonais ou policlonais intactos, porém também fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (tais como Fab, Fab”, F(ab')2, Fv), cadeia única (ScFv) e anticorpos de domínio (incluindo, por exemplo, anticorpos de tubarão e camelídeo), e proteínas de fusão que compreendem um anticorpo, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tais como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse do mesmo), e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe em particular. Dependendo da sequência de aminoácido do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes maiores de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas destas podem ser também divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, I9G3, I9gG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem à diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas de alfa, delta, epsilon, gama, e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensional de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0040] O termo "fragmento de ligação a antígeno" ou "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, como usado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retém a habilidade de especificamente se ligar a um determinado antígeno (por exemplo, FLT3). Funções de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação englobada dentro do termo "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem Fab; Fab'; F(ab'):; um fragmento de Fd consistindo nos domínios VH e CH1; um fragmento de Fv consistindo nos domínios VL e VH de uma única subdivisão de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb)(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR).

[0041] Um anticorpo ou um polipeptídeo que "preferivelmente se liga" ou "especificamente se liga" (usados alternadamente aqui) a um alvo (por exemplo, proteína FLT3) é um termo bem conhecido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial são também bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dita exibir "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade a uma célula ou substância particular do que ela faz com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "especificamente se liga" ou "preferivelmente se liga" a um alvo se ele liga-se com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que especificamente ou preferivelmente se liga a um epítopo FLT3 é um anticorpo que se liga a este epítopo com maior afinidade, avidez, mais facilmente, e/ou com maior duração do que ele se liga a outras epítopos FLT3 ou epítopos não FLT3. Entende-se também que de acordo com a leitura desta definição, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que especificamente ou preferivelmente se liga a um primeiro alvo pode ou não especificamente ou preferivelmente se ligar a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, porém não necessariamente, referência a ligação significa ligação preferencial.

[0042] Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pesada do anticorpo, sozinha ou em combinação. Como conhecido na técnica, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve cada qual consiste em quatro regiões de estrutura (FR) conectadas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinação de CDRs: (1) um método com base na variabilidade de sequência de espécies cruzadas (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a. Edição, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) um método com base nos estudos cristalográficos de complexos de antígeno-anticorpo (Al-lazikaniet al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). Como usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer um dos métodos ou por uma combinação de ambos os métodos.

[0043] Uma "CDR" de um domínio variável são resíduos de aminoácido dentro de uma região variável que são identificados de acordo com as definições da Kabat, Chothia, o acúmulo de ambos: Kabat e Chothia, ADM, contato, e/ou definições conformacionais ou qualquer método de determinação de CDR bem conhecido na técnica. CDRs de anticorpo podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis originalmente definidas por Kabat et al. Veja, por exemplo, Kabat et a/., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edição, Public Health Service, NIH, Washington D.C. As posições das CDRs podem também ser identificadas como as estruturas de alça estruturais originalmente descritas por Chothia e outros. Veja, por exemplo, Chothia et a/., Nature 342:877-883, 1989.

Outros métodos para identificação de CDR incluem a "definição de AbM," que é um compromisso entre Kabat e Chothia e é derivado usando software de modelagem de anticorpo ADM Oxford Molecular's (agora Accelrysº), ou a "definição de contato" de CDRs com base em contatos de antígeno observados, estabelecidos em MacCallumet al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. Em outro método, referido aqui como a "definição conformacional" de CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entalpicas para ligação a antígeno. Veja, por exemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Ainda outras definições de limite de CDR podem não estritamente seguir um dos métodos acima, porém, no entanto, se sobrepõem a pelo menos uma porção das CDRs de Kabat, embora eles possam ser encurtados ou alongados à luz de previsões ou achados experimentais que resíduos ou grupos particulares de resíduos ou ainda CDRs inteiras não impactam significantemente a ligação a antígeno. Como usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo combinações de métodos. Os métodos usados aqui podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um destes métodos. Para qualquer determinada modalidade contendo mais do que uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer um de Kabat, Chothia, extendido, AbM, contato, e/ou definições conformacionais.

[0044] Como usado aqui, "anticorpo monoclional" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreende a população são idênticos exceto para mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclionais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e Milstein, Nature 256:495, 1975, ou podem ser feitos pelos métodos de DNA recombinante tais como descritos na Patente Norte- Americana No. 4,816,567. Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados de bibliotecas de fago geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et a/., Nature 348:552-554, 1990, por exemplo.

[0045] Como usado aqui, anticorpo "humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina, ou fragmentos dos mesmos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação a antígeno) que contém sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Preferivelmente, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de recipiente) nas quais resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, ou coelho tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região de estrutura de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recipiente nem na CDR importada ou sequências de estrutura, porém estão incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo otimamente humanizado também irá compreender pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Anticorpos são preferidos tendo regiões Fc modificadas como descrito em WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados tem uma ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, ou CDR H3) que são alteradas com respeito ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[0046] Como usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpo tendo uma sequência de aminoácido correspondendo àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foram feitos usando qualquer uma das técnicas para fabricação de anticorpos humanos conhecidas por aqueles versados na técnica ou divulgados aqui. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos que compreendem pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humana ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um tal exemplo é um anticorpo que compreende polipeptídeos de cadeia pesada humanos e cadeia de leve murinos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fago, onde aquela biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan et a/., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol,

227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Anticorpos humanos podem também ser feitos por imunização de animais nos quais locais de imunoglobulina humana foram transgenicamente introduzidos no lugar dos locais endógenos, por exemplo, ratos no qual os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativadas. Este método é descrito na Patente Norte- Americana Nº, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; e 5,661,016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou de clonagem de célula única do cDNA, ou podem ser imunizados in vitro). Veja, por exemplo, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; e Patente Norte- Americana No. 5,750,373.

[0047] O termo "anticorpo quimérico" está destinado a se referir a anticorpos nos quais as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outras espécies, tais como um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano.

[0048] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para se referir às cadeias de aminoácidos de qualquer tamanho. Por exemplo, a cadeia pode ser relativamente curta (por exemplo, 10 a 100 aminoácidos), ou maior. À cadeia pode ser linear ou ramiíficada, ela pode compreender aminoácidos modificados, e/ou pode ser interrompida por não aminoácidos. Os termos também englobam uma cadeia de aminoácido que foi modificada naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação,

fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. São também incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais aminoácidos análogos (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica. Deve ser entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeia únicas ou cadeias associadas.

[0049] Um "anticorpo monovalente" compreende um sítio de ligação a antígeno por molécula (por exemplo, IgG ou Fab). Em alguns casos, um anticorpo monovalente pode ter mais do que um sítio de ligação a antígeno, porém os sítios de ligação são de diferentes antígenos.

[0050] Um "anticorpo monoespecífico" compreende dois sítios de ligações idênticos a antígeno por molécula (por exemplo, IgG) de modo que os dois sítios de ligação se ligam a epítopos idênticos no antígeno. Desse modo, eles competem um com o outro na ligação a uma molécula de antígeno. Mais anticorpos encontrados na natureza são monoespecíficos. Em alguns casos, um anticorpo monoespecífico pode também ser um anticorpo monovalente (por exemplo, Fab).

[0051] Um "anticorpo bivalente" compreende dois sítios de ligação a antígeno por molécula (por exemplo, IgG). Em alguns casos, os dois sítios de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. No entanto, anticorpos bivalentes podem ser específicos.

[0052] Um "biespecífico" ou "dual-específico" é um anticorpo híbrido tendo dois sítios de ligação a antígeno diferentes. Os dois sítios de ligação a antígeno de um anticorpo biespecífico se liga a dois diferentes epítopos, que podem residir no mesmo ou em diferentes alvos de proteína.

[0053] Um anticorpo "bifuncional" é um anticorpo tendo sítios de ligação a antígeno idênticos (isto é, sequências de aminoácido idênticas) nas duas subdivisões, porém cada sítio de ligação pode reconhecer dois antígenos diferentes.

[0054] Um "heteromultímero", "complexo heteromultimérico", ou "polipeptídeo heteromultimérico" é uma molécula que compreende pelo menos um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o segundo polipeptídeo difere em sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo por pelo menos um resíduo de aminoácido. O heteromultímero podem compreender um "heterodímero" formado pelo primeiro e segundo polipeptídeo ou pode formar estruturas terciárias de ordem superior onde polipeptídeos em adição ao primeiro e segundo polipeptídeo estão presentes.

[0055] Um "heterodímero," "proteína heterodimérica," "complexo heterodimérico," ou "polipeptídeo heteromultimérico" é uma molécula que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o segundo polipeptídeo difere em sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo por pelo menos um resíduo de aminoácido.

[0056] A "região de articulação," "sequência de articulação", e variações dos mesmos, como usado aqui, incluem o significado conhecido na técnica, que é ilustrado em, por exemplo, Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4º ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.

[0057] A "região de articulação tipo imunoglobulina," "sequência de articulação tipo imunoglobulina," e variações dos mesmos, como usado aqui, refere-se às regiões de articulação e sequências de articulação de uma molécula tipo imunoglobulina ou um tipo anticorpo (por exemplo, imunoadesinas). Em algumas modalidades, a região de articulação tipo imunoglobulina pode ser de ou derivada de qualquer subtipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, ou de IgA, IgE, IgD ou IgM, incluindo formas quiméricas dos mesmos, por exemplo, uma região de articulação de Ig9G1/2 quimérica.

[0058] O termo "celula efetora imune" ou "célula efetora" como usado aqui se refere a uma célula dentro do repertório natural de células no sistema imune humano que podem ser ativadas para afetar a viabilidade de uma célula alvo. A viabilidade de uma célula alvo pode incluir sobrevivência celular, proliferação, e/ou capacidade para interagir com outras células.

[0059] Anticorpos da invenção podem ser produzidos usando técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição de fago, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnologias prontamente conhecidas na técnica (Veja, por exemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 e Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40, 2007).

[0060] Como conhecido na técnica, "polinucleotídeo," ou "ácido nucleico," como usado alternadamente aqui, se refere a cadeias de nucleotídeos de qualquer tamanho, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxoribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em uma cadeia por DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificação para a estrutura de nucleotídeo pode ser concedida antes ou após da montagem da cadeia. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode também ser modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "coberturas", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos,

etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligantes modificados (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas dos polinucleotídeos.

Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos.

Os terminais OH 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por aminas ou porções de grupo de nivelamento orgânico de 1 a 20 átomos de carbono.

Outras hidroxilas podem também ser derivadas para grupos de proteção padrão.

Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxiribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'- O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa- ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos, tais como metil ribosídeo.

Um ou mais ligantes de fosfodiéster pode ser substituído por grupos de ligação alternativos.

Estes grupos de ligação alternativos incluem, porém não são limitados a, modalidades em que fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (ONR2 ("amidato"), P(O)JR, P(O)JOR, CO ou CH, ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) opcionalmente contendo um ligante éter (-O-), arila, alqguenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todos os ligantes em um polinucleotídeo precisam ser idênticos. À descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.

[0061] Como conhecido na técnica, uma "região constante" de um anticorpo se refere à região constante da cadeia leve de anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo, sozinha ou em combinação.

[0062] Como usado aqui, "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente, pelo menos 90% puro, mais preferivelmente, pelo menos 95% puro, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98% puro, e mais preferivelmente, pelo menos 99% puro.

[0063] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura celular que pode ser ou ter um recipiente para vetores para incorporação de inserções de polinucleotídeos. Células hospedeiras incluem progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula progenitora original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo desta invenção.

[0064] Como conhecido na técnica, o termo "região Fc" é usado para definir uma região de terminação C de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possa variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é geralmente definida para esticar de um resíduo de aminoácido em posição Cys226, ou de Pro230, à terminação carboxila do mesmo. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice da União Europeia como em Kabat. Kabat et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende duas regiões constantes, CH2 e cH3.

[0065] Como usado na técnica, "receptor de Fc" e "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FeyRII, e FeyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternadamente unidas destes receptores. Receptores de FeyRIl incluem FeyRIIA (um "receptor de ativação") e FCcyRIIB (um "receptor de inibição"), que tem sequências de aminoácidos similares que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capelet al., Inmunomethods, 4:25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" também inclui os recepetores neonatais, FcRn, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyeret a/., J. Inmunol., 117:587, 1976; e Kim et al., J. Inmunol., 24:249, 1994).

[0066] O termo "competir", como usado aqui em relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno (ou porção) do mesmo, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente similar à ligação de um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de modo que o resultado de ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato seja detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo comparado à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo a seu epítopo é também detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, porém não ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo a seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo a seu respectivo epítopo. No entanto, onde cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato ou ligante, seja na mesma, em maior, ou menor extensão, os anticorpos são ditos "competir cruzadamente" com cada um dos outros para ligação de seus respectivos epítopos. Ambos: anticorpos competindo e competindo cruzadamente — são —englobados pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual tal competição ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedimento estérico, alteração conformacional, ou ligação a um epítopo comum, ou porção do mesmo), o técnico versado deve apreciar, com base nos ensinamentos fornecidos aqui, que tais anticorpos competindo e/ou competindo cruzadamente são englobados e podem ser úteis para os métodos divulgados aqui.

[0067] Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação de C1qg; citotoxidade dependente de complemento; ligação de receptor de Fc; citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo; fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem região Fc para serem combinadas com um domínio de ligação (por exemplo um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo.

[0068] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica às sequências de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Em algumas modalidades, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com uma região de Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo principal, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácido, e preferivelmente, de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo principal. A região Fc variante aqui irá preferivelmente possuir pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo principal, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência.

[0069] O termo "função efetora" se refere às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem, porém não são limitados a, citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação a receptor de Fc, citotoxidade dependente de complemento (CDC), fagocitose, ligação de C1q, e regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR). Veja, por exemplo, Patente Norte- Americana No. 6,737,056. Tais funções efetoras geralmente requerem a região Fc a serem combinadas com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo. Uma medida exemplar de função efetora é por meio de ligação de Fcy3 e/ou C1q.

[0070] Como usado aqui "citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" se refere a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo células natural killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo de ligação em uma célula alvo e subsequentemente causa lise da célula alvo. Atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito em Patente Norte- Americana No. 5,500,362 ou 5,821,337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele divulgado em Clyneset a/., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

[0071] "Citotoxidade dependente de complemento" ou "CDC" se refere à lise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1lqg) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), pode ser realizado.

[0072] Como usado aqui, "tratamento" é um método para obtenção de resultados benéficos ou clínicos desejados. Para propósitos desta invenção, resultados benéficos ou clínicos desejados incluem, porém não são limitados a, um ou mais dos seguintes: redução da proliferação de (ou destruição) células neoplásicas ou cancerosas, inibindo metástase de células neoplásicas, encolhimento ou diminuição no tamanho de tumor expressando FLT3, remissão de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), diminuição de sintomas resultando de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer),

aumento da qualidade de vida daqueles sofrendo de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), diminuição da dose de outras medicações necessários para tratar uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), retardamento da progressão de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), curando uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), e/ou prolongando sobrevivência de pacientes tendo uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer).

[0073] "Melhora" significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas quando comparado com a não administração de um anticorpo FLT3 (monoespecífico ou biespecífico). "Melhora" também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

[0074] Como usado aqui, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para afetar qualquer um ou mais resultados desejados ou benéficos. Para uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem eliminação ou redução do risco, diminuição da severidade, ou atraso do início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentando durante desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tais como redução da incidência ou melhora de um ou mais sintomas de várias doenças ou condições associadas a FLT3 (tais como, por exemplo, mieloma múltiplo), diminuição da dose de outras medicações necessários para tratar a doença, melhoramento do efeito de outra medicação, e/ou retardamento da progressão da doença associada a FLT3 de pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para propósitos desta invenção, uma dosagem eficaz de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar tratamento profilático ou terapêutico diretamente ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançado em conjunto com outro fármaco, composto, ou composição farmacêutica. Desse modo, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado um agente único em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado.

[0075] Um "indivíduo (individual)" ou um "indivíduo (subject)" é um mamífero, mais preferivelmente, um humano. Mamíferos também incluem, porém não são limitados a primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.

[0076] Como usado aqui, "vetor" significa uma construção, que é capaz de liberar, e, preferivelmente expressando, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém não são limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nu, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associadas com agentes de condensação catiônica, vetores de expressão DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.

[0077] Como usado aqui, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor induzível, ou um realçador. À sequência de controle de expressão está operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico a ser transcrita.

[0078] Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que,

quando combinados com um ingrediente ativo, permitem que o ingrediente retenha atividade biológica e seja não reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, porém não são limitados a, quaisquer veículos farmacêuticos padrões tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como emulsão de óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferidos para administração aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou normal (0,9%). Composições que compreendem tais veículos são formulados pelos métodos convencionais bem conhecidos (Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21º Ed. Mack Publishing, 2005).

[0079] O termo "marcador contendo glutamina doadora de acila" ou "marcador de glutamina" como usado aqui se refere a um polipeptídeo ou uma proteína contendo um ou mais resíduos de Glnh que age como um aceitador de transglutaminase amina. Veja, por exemplo, WO?2012059882 e WO2015015448.

[0080] O termo "kKon" ou "ka", como usado aqui, se refere à constante de taxa para associação de um anticorpo a um antígeno. Especificamente, a constante de taxa (Kon/Ka € Kot/Ka) e constantes de dissociação de equilíbrio são medidas usando um anticorpo inteiro (isto é, bivalente) e proteínas FLT3 monoméricas (por exemplo, proteína de fusão FLT3 marcado com histidina).

[0081] O termo "kof" ou "ka", como usado aqui, se refere à constante de taxa para dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.

[0082] O termo "Kp", como usado aqui, se refere à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno.

[0083] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionada àquele valor ou parâmetro em si. Por exemplo, descrição se referindo a "cerca de X" inclui descrição de "X." Faixas numéricas incluem os números definindo a faixa. Geralmente falando, o termo "cerca de" se refere aos valores indicados da variável e a todos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 porcento do valor indicado, o que for maior. Onde o termo "cerca de" é usado dentro do contexto de um período de tempo (anos, meses, semanas, dias etc.), o termo "cerca de" significa que período de tempo mais ou menos uma quantidade do próximo período de tempo subordinado (por exemplo, cerca de 1 ano significa 11 a 13 meses; cerca de 6 meses significa 6 meses mais ou menos | semana; cerca de uma semana significa 6 a 8 dias; etc.), ou dentro de 10 por cento do valor indicado, qual for maior.

[0084] É entendido que sempre que modalidades são descritas neste documento com a linguagem "que compreende," de outro modo análoga, modalidades descritas em termo de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" são também fornecidas.

[0085] Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outros agrupamentos de alternativas, a presente invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, porém cada membro do grupo individualmente e todos os possíveis subgrupos do grupo principal, porém também o grupo principal ausenta um ou mais dos membros do grupo. A invenção presente também prevê a exclusão explícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na invenção reivindicada.

[0086] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem o mesmo significado como comumente por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, irá controlar. Ao longo desta especificação e reivindicações, a palavra "compreender," ou variações tais como, "compreende" ou "que compreende" deve ser entendida como implicando a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros, porém não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de números inteiros. A menos que de outro modo requirido por contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.

[0087] Métodos e materiais exemplares são descritos aqui, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam também ser usados na prática ou testes da presente invenção. Os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitantes. Anticorpos FLT3 e Métodos de Fabricação dos mesmos

[0088] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga a FLT3 [por exemplo, FLT3 humano (por exemplo, número de acesso: NP 004110 ou SEQ ID Nº: 235)] e caracterizado por qualquer um ou mais das seguintes características: (a) trata, previne, melhora um ou mais sintomas de uma condição associada com células malignas expressando FLT3 em um indivíduo (por exemplo, câncer, tal como AML de número de acesso); (b) inibe crescimento ou progressão de tumor em um indivíduo (que tem um tumor maligno expressando FLT3); (c) inibe a metástase de células de câncer (malignas) expressando FLT3 em um indivíduo (que tem uma ou mais células malignas expressando FLT3); (d) induz a regressão (por exemplo, regressão a longo prazo) de um tumor expressando FLT3; (e) exerce atividade citotóxica em células malignas expressando FLT3; (f) bloqueia interação de FLT3 com outros ainda a serem fatores identificados; e/ou (g) induz efeito espectador que mata ou inibe crescimento de células malignas expressando não FLT3 na proximidade.

[0089] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região um de determinação de complementaridade (CDR1) de VH que compreende a sequência mostrada em 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246, ou 247; (ii) uma CDR?2 de VH que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253, ou 255; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250, ou 254; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273, ou 275; (ii) uma CDR?2 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266, ou 271; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272, ou 274.

[0090] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que especificamente se liga a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada nas SEQ ID Nº: 2, 4,6,8,10,12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229, 231, ou 233; e/ou uma região VL que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência

VL mostrada nas SEQ ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, ou 232. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região VH que compreende uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID NO. 229; e/ou uma região VL que compreende CDR1 de VL, CDR2 de VL, e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 228.

[0091] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo que possui qualquer sequência de cadeia leve parcial como listado na Tabela 1 e/ou qualquer sequência de cadeia pesada parcial como listado na Tabela 1. Na Tabela 1, as sequências sublinhadas são sequências de CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia, exceto para as sequências de CDR2 de cadeia pesada de P4F6, P4C7, P3A1, PSA3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, e P7F9, a sequência de CDR de Chothia está sublinhado e a sequência de CDR de Kabat está em negrito.

Tabela 1 P4F6 | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASH | QVALVAOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFGS SVSSSYLAWYQQKPGOAPRLLIYGAS | YGISWVRQAPGQOGLEWMGGIIPIFGTVTYAQK SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FAGRVTITADESTRTAYMELSSLRSEDTAVYY PEDFAVYYCQQYGSPPRTFGQGTKV CARDSWSGATGASDTWGQGTLVTVSS (SEQ EIK (SEQ ID Nº: 1) 1D Nº: 2) P4C7 | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS YVSASLLAWYQQKPGQOAPRLLIYGAS | YTISWVRQOAPGOGLEWMGGIIPAFGIANYAQK TRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY PEDFAVYYCQQYARSSTFGQGTKVEI | CAKGGSYSLDYFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID K(SEQIDNº:3) Nº: 4) P3A1 | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRAS | QVAQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS

QOSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS YDISWVRQAPGQGLEWMGGIIPYSGRANYAQ SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL | KFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY QPEDFATYYCQQASYSTPLTFGOGTKV | YCARVRPTYWPLDYWGOQGTLVTVSS (SEQ ID EIK (SEQ ID Nº: 5) Nº: 6)

P5A3 | OSALTAPASVSGSPGOSITISCTGTSS | QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS DVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYE | YYIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPWFGTANYAQ VSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVS | KFAGRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVY

GLQAEDEADYYCSSYAGSNTVVFGG YCAADHHDSPSGYTSGGFDVWGQGTLVTVS GTKLTVL (SEQ ID Nº: 7) S(SEQIDNº: 8) P9B5 | ASVLTAPPSASGTPGQRVTISCSGSS | EVOLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFIFASY SNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIVRN | AMSWVRQAPGKGLEWVSEISSSGGSTTYADS NQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISG | VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY LRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGG | CARDRVMAGLGYDPFDYWGQGTLVTVSS GTKLTVL (SEQ ID Nº: 9) (SEQ ID Nº: 10) P9F1 | ASVLTAQPPSASGTPGORVTISCSGSG | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSF

SNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRN AMSWVRQAPGKGLEWVSDISGSGASTYYAD NQORPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISG | SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY LRSEDEADYYCAAWDGSLSRPVFGT | YCASASGGSGSYWPYMDPWGQGTLVTVSS GTKLTVL (SEQ ID Nº: 11) (SEQ ID Nº: 12) P1B4 | EIVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVALVAOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSR SVPNEQLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS | YALSWVRQOAPGQAQGLEWMGGIIPMLGFANYA SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | QKFAGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV PEDFAVYYCQQYGSPPLIFGOGTKV | YYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID EIK (SEQ ID Nº: 13) Nº: 14) P1B1 | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRS 1 SVSSSELAWYQQKPGQAPRLLIYDAS | FDISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGYANYAQK SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYY PEDFAVYYCQQYDSSPLTFGQGTKVE | CASDLGAPWAGYPFDPWGQGTLVTVSS IK(SEQ ID Nº: 15) (SEQ ID Nº: 16) P7H3 | ASVLTAQPPSVSVAPGKTARITCGGNNI | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS

GSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSD YAMHWVROAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYA RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV GDEADYYCQVWDSSTAWVFGGGTKL | YYCARGTRWWWGDAFDHWGQGTLVTVSS TVL (SEQ ID Nº: 17) (SEQ ID Nº: 18) P3E1 | EIVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS o SVPSSQLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS | YAIQWVRQAOAPGOAGLEWMGGIVGSWGLANYA SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | QGKFAGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAV PEDFAVYYCQQYGSSPLTFGOGTKV YYCATSAFGELASWGOQOGTLVTVSS (SEQ ID EIK (SEQ ID Nº: 19 ) Nº: 20) P1A5 | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVQLVAOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSR AVDSSDLAWYQQKPGQAPRLLIYDAY | YALSWVRQAPGQAGLEWMGGIIPMLGFANYA TRPSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | QKFAGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV PEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKLE | YYCATLDFGALDYWGOQGTLVTVSS (SEQ ID

[see e P5F7 | EIVLTASPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SVSSNLAWYQQKPGOAPRLLIYDTFT | YAMNWVROAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEI | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQOGTLVTVSS K(SEQ ID Nº: 23) (SEQ ID Nº: 24) P4H1 | EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSS 1 SVSNTYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTS | YAMNWVRQOAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV PEDFAVYYCQQYGSSLTFGQGTKVEI | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS K(SEQ ID Nº: 25) (SEQ ID Nº: 26) P15F | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRAS EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFNN 7 QSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIVAAS | YAMNWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYA NLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QPEDFATYYCQQSYSIPLTFGOGTKV | YYCASGIWDLRYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: EIK (SEQ ID Nº: 27) 28) P12B | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVQLVAOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFMS 6 IVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIVGAS | YAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQK SRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY PEDFAVYYCQQYGGSPYTFGQGTKV CARETLIYPIPFELWGOQGTLVTVSS (SEQ ID EIK (SEQ ID Nº: 29) Nº: 30) PBB6 | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS SVSHSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS | YAWVSWVROAPGOGLEWMGGIIPIFGIANYAQK FRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FAGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY PEDFAVYYCQQYGSDPYTFGQGTKV | CAIEGIGGDLRYDGYDAWGOGTLVTVSS EIK (SEQ ID Nº: 31) (SEQ ID Nº: 32) P14G | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRAS EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSN 2 QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDAS YVMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGATTYYA DLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV QPEDFATYYCQQASYNTPWIFGOGTK | YYCVSGLWAGGIWGOQOGTLVTVSS (SEQ ID VEIK (SEQ ID Nº: 33) Nº: 34) P7F9 | NEMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSS EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS GSIASNYVQWYQQKPGAQAPVLVVYD | YAMSWVRQAPGKGLEWVSAIGESGGESTYYA DSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISR | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAM

VEAGDEADYYCQVWDSSSDHWVFG YYCARDYYAFSDPAYGGMDVWGQGTLVTVS GGTKLTVL (SEQ ID Nº: 35) S (SEQ ID Nº: 36) PO8B | EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVOLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS O6EE | SVSHSYLAWYQQKPGQOAPRLLIYGAS | YAVSWVRQOAPGOGLEWMGGIIPIFGIANYAQK FRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | FQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY

PEDFAVYYCQQYGSEPYTFGQGTKV | CAIEGIGGDLRYEGYDAWGQGTLVTVSS EIK (SEQ ID Nº: 204) (SEGID Nº: 205)

PO4A | EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS

04 — | SVISSQLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS | YYITWVRQAPGAGLEWMGRIMPAFGWTNYA SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | QKFOGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAV PEDFAVYYCQQYGSSLLITFGQGTKV | YYCASDEFGAFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID EIK (SEQ ID Nº: 206) Nº: 207)

PO1A | EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSR

05 — | AVDSSDLAWYQHKPGQAPRLLIYDAY | YALSWVROAPGOGLEWMGGIIPMLGFANYAQ TRPSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLE | KFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY PEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKLE | YCATLDFGALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: IK (SEQ ID Nº: 208) 209)

Po8B | DIVMTOSPGTLSLSPGERATLSCRAS | QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSS

03 — | ASVSSNLAWYQOKPGQAPRLLIYDAY | YDISWVRQAPGQGLEWMGRIIPSFGAANYAQ TRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLE | KFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY PEDFAVYYCQQYGSPYTFGQGTKVEI | YCATDDGEGWTPPFGYWGOGTLVTVSS K(SEQ1D Nº: 210) (SEQ ID Nº: 211)

P5F7 | DIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRAS | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS QSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFE | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA TRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLE | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV PEDFAVYYCQQYGSSPPTFGOGTRL | YYcARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS EIK (SEQ ID Nº: 212) (SEQ ID Nº: 213)

P5F7 | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS

9 SVSSNLAWYQOQKPGQAPRLLIYDTFT | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEI | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS K(SEQID Nº: 214) (SEQ ID Nº: 215)

P10A | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS

029 | DVSDLLAWYQQKPGOAPRLLIYDAYT | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYASSPITFGOGTRLEIK | YYycCARDLSPSDVGWGYGFDIWGOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 216) (SEQ ID Nº: 217)

P10A | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS

049 | KVSDLLAWYQQKPGQAPRLLIYDAYT | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYTGSPITFGQGTRLEIK | YYycARDLSPSDVGWGYGFDIWGOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 218) (SEQ ID Nº: 219)

EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASL | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS

059 | SVSDLLAWYQOKPGOAPRLLIYDAYS | YAMNWVROAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYSSNPITFGOGTRLEIK | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 220) (SEQ ID Nº: 221) P10A | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASG | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS 079 SVSDLLAWYQQKPGQAPRLLIYDAYS | YAMNWVROAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYASYPITFGOGTRLEIK | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 222) (SEQ ID Nº: 223) P10B | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS 03g SVSDLLAWYQQKPGQAPRLLIYDAFS | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYGTPPITFGQGTRLEIK | YYcCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 224) (SEQ ID Nº: 225) P10B | EIVLTASPATLSLSPGERATLSCRASE | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSS 069 — | SVSDLLAWYQQOKPGOAPRLLIYDAYS | YAMNWVRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYA

RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYSASPITFGQGTRLEIK | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 226) (SEQ ID Nº: 227) P5F7 | EIVLTASPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFSS 92 SVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFT | YAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYA RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP | DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYGSSPPTFGQOGTRLEI | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS K(SEQ ID Nº: 228) (SEQ ID Nº: 229) P5F7 | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSS gs SVSSLLAWYQQKPGQAPRLLIYDAYT | YAMNWVROAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYA

RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYTGSPITFGQGTRLEIK | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 230) (SEQ ID Nº: 231) P5F7 | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQ | EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFSS gas SVSSLLAWYQQKPGQAPRLLIYDAYT | YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYA

RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV EDFAVYYCQQYTGSPITFGOGTRLEIK | YYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQOGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 232) (SEQ ID Nº: 233)

[0092] São também fornecidas aqui porções de CDR de ligação a domínios de antígeno de anticorpos a FLT3 (incluindo CDRs Kabat, Chothia, e regiões de contato com CDR). A determinação de regiões

CDR inclui-se bem na experiência da técnica.

Entende-se que em algumas modalidades, as CDRs podem ser uma combinação da CDR Kabat e Chothia CDR (também denominadas "CRs combinadas" ou "CDRs estendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs Kabat.

Em outras modalidades, as CDRs são as CDRs Chothia.

Em outras palavras, em modalidades com mais de uma CDR, as CDRs podem ser qualquer Kabat, Chothia, CDRs de combinação, ou combinações das mesmas.

A tabela 2 fornece exemplos de sequências de CDR fornecidas aqui.

Tabela 2 mao Teor Jerme Jere | PAF6 SYGIS (SEQ ID Nº: 37) (Kabat); GIIPIFGTVTYAQKFOG DSWSGATGASDT (SEQ ID Nº: 40) (Kabat; | (SEQID Nº: 42) GGTFGSY (SEQ ID Nº: 38) (Chothia); IPIFGT (SEQ ID Nº: 41) GGTFGSYGIS (SEQ ID Nº: 39) (Estendida) (Chothia P4c7 SYTIS (SEQ ID Nº: 43) (Kabat); GIIPAFGIANYAQKFOG — | GGSYSLDYFDI (SEQ ID Nº: 46) (Kabat); | (SEQIDNº:48) GGTFSSY (SEQ ID Nº: 44) (Chothia) IPAFGI (SEQ ID Nº: 47) GGTFSSYTIS (Estendida) (SEQ ID Nº: 45) (Chothia) P3A1 SYDIS (SEQ ID Nº: 49) (Kabat); GIIPVSGRANYAQKFOG | VRPTYWPLDY EQ ID Nº: 51) (K: ; EQ ID Nº GGTFSSY (SEQ ID Nº: 44) (Chothia); E S1) (abel; ) (SEQIDNSS) IPVSGR (SEQ ID Nº: 52) GGTFSSYDIS (SEQ ID Nº: 50) (Estendida) (Chothia) P5A3 SYYIG (SEQ ID Nº: 54) (Kabat); GIIPWFGTANYAQKFOG DHHDSPSGYTSG (SEQ ID Nº: 57) (Kabat); | GFDV (SEQ ID Nº: GGTFSSY (SEQ ID Nº: 55) (Chothia); 59) IPWFGT (SEQ ID Nº: 58) GGTFSSYYIG (SEQ ID Nº: 56) (Estendida) Chothia P9B5 SYAMS (SEQ ID Nº: 60) (Kabat); EISSSGGSTTYADSVKG DRVMAGLGYDPF (SEQ ID Nº: 63) (Kabat); | DY (SEQID Nº: 65) GFIFASY (SEQ ID Nº: 61) (Chothia); SSSGGS (SEQ ID Nº: 64) GFIFASYAMS (SEQ ID Nº: 62) (Estendida) (Chothia P9F1 SFAMS (SEQ ID Nº: 66) (Kabat); DISGSGASTYYADSVKG | ASGGSGSYWPYM EQ ID Nº K: ; DP (SEQ ID Nº: 71 GFIFSSF (SEQ ID Nº: 67) (Chothia); (EQ D Nº: 69) (Kabal) (sea ) AS (SEQ ID Nº: 7t GFIFSSFAMS (SEQ ID Nº: 68) (Estendida) SO seo Y P1B4 RYALS (SEQ ID Nº: 72) (Kabat); GIIPMLGFANYAQKFOG LDFGALDY (SEQ (SEQ ID Nº: 75) (Kabat); | IDNº:77) GGVFSRY (SEQ ID Nº: 73) (Chothia); IPMLGF (SEQ ID Nº: 76) GGVFSRYALS (SEQ ID Nº: 74) (Estendida) (Chothia) P1IB11 SFDIS (SEQ ID Nº: 78) (Kabat); RIIPILEYANYAQKFOG DLGAPWAGYPFD [SEQ ID Nº: 81) (Kabat); P(SEQID Nº: 83)

GGTFRSF (SEQ ID Nº: 79) (Chothia); IPILGY (SEQ ID Nº: 82) (Chothia) GGTFRSFDIS (SEQ ID Nº: 80) (Estendida) PTH SYAMH (SEQD Nº: 84) (Kabal); AISGSGGSTYYADSVKG | GTRWWWGDAFD (SEQIDNº: 87) (Kabat; | H(SEQID Nº: 89) GFTFSSY (SEQ ID Nº: 85) (Chothia); SGSGGS (SEQ ID Nº: 88) GFTFSSYAMH (SEQ ID Nº: 86) (Estendida) Chotia P3E10 SYAIQ (SEQ ID Nº: 90) (Kabat); GIVGSWGLANYAQKFOG | SAFGELAS (SEQ (SEQID Nº: 93) (Kabat; =| ID Nº:95) GGTFSSY (SEQ ID Nº: 91) (Chothia); VGSWGL (SEQ ID Nº: 94) GGTFSSYAIO (SEQ ID Nº: 92) (Estendida) Chothia PIAS RYALS (SEQ ID Nº: 96) (Kabal); GIPMLGFANYAQKFOG | LDFGALDY (SEQ SEQ ID Nº: 99) (Kabat; | IDNº: 101 GGVFSRY (SEQ ID Nº: 97) (Chothia); ( ) (aa) ) IPMLGF (SEQ ID Nº: 100) GGVFSRYALS (SEQ ID Nº: 98) (Estendida) Chothia) P5F7 SYAMN (SEQ ID Nº: 102) (Kabal); SISGGGRSTYYADSVKG | DLSPSDVGWGYG (SEQ ID Nº: 105) (Kabal): | FDI (SEQ ID Nº: GFTFSSY (SEQ ID Nº: 103) (Chothia); 1m SGGGRS (SEQ ID Nº GFTFSSYAMN (SEQ ID Nº: 104) (Estendida) — | 196 (chotnia Part SYAMN (SEQ ID Nº: 108) (Kabal); SISGGGRSTYYADSVKG | DLSPSDVGWGYG (SEQ ID Nº: 111) (Kabal); | FDI (SEQ ID Nº: GFTFSSY (SEQ ID Nº: 109) (Chothia); 13) . SGGGRS (SEQ ID Nº GFTFSSYAMN (SEQ ID Nº: 110) (Estendida) — | 112) (Chotnia P1SF7 NYAMN (SEQ ID Nº: 114) (Kabat); VISGSGGTTYYADSVKG | GMDLRY (SEQ ID (SEQ ID Nº: 117) (Kabal); | Nº: 119) GFTFNNY (SEQ ID Nº: 115) (Chothia); SGSGGT (SEQ ID Nº GFTFNNYAMN (SEQ ID Nº: 116) (Estendida) — | 118) (chotria P12B6 SYAIS (SEQ ID Nº: 120) (Kabal); GIIPIFGIANYAQKFOG — | ETLIVPIPFEL (SEQ ID Nº: 123) (Kabat); GGTFMSY (SEQ ID Nº: 121) (Chothia); (SEQID Nº: 125) IPIFGI (SEQ ID Nº: 124) GGTFMSYAIS (SEQ ID Nº: 122) (Estendida) Chothia) PBB6 SYAVS (SEQ ID Nº: 126) (Kabal); GIIPIFGIANYAQKFOG — | EGIGGDLRYDGYD (SEQ ID Nº: 129) (Kabal); | A(SEQIDNº: 131) GGTFSSY (SEQ ID Nº: 127) (Chothia); IPIFGI (SEQ ID Nº: 130) GGTFSSYAVS (SEQ ID Nº: 128) (Estendida) Chotria P1462 NYVMN (SEQ ID Nº: 132) (Kaba); AISGSGATTYYADSVKG | GLWAGGI (SEQ ID (SEQ ID Nº: 135) (Kabal); | Nº: 137) GFTFSNY (SEQ ID Nº: 133) (Chothia); SGSGAT (SEQID Nº: 136) GFTFSNYVMN (SEQ ID Nº: 134) (Estendida) Chothia P7Fo SYAMS (SEQ ID Nº: 138) (Kabal); AIGGSGGSTYYADSVKG | DYYAFSDPAYGG (SEQ ID Nº: 141) (Kabat); | MDV (SEQ ID Nº: GFTFSSY (SEQ ID Nº: 139) (Chothia); 143) GGSGGS (SEQ ID Nº GFTFSSYAMS (SEQID Nº: 140) (Estendida) — | 142) (chothia POSBOSEE — | SYAVS (SEQIDNº: 126) (Kabat); GIIPIFGIANYAQKFOG — | EGIGGDLRYEGYD SEQ ID Nº: 129) (Kabal); | A(SEQ ID Nº: 245 GGTFSSY (SEQ ID Nº: 127) (Chothia); ( ) (Kabal; | A( ) IPIFGI (SEQ ID Nº: 130) GGTFSSYAVS (SEQ ID Nº: 128) (Estendida) Chothia PO4A04 SYYIT (SEQ ID Nº: 247) RIMPAFGWTNYAQKFOG | DEFGAFDV (SEQ (SEQ ID Nº: 248) (Kabat) | ID Nº: 250) GGTFSSY (SEQ ID Nº: 127) (Chothia)

GGTFSSYYIT (SEQ ID Nº: 246) (Estendida) MPAFGW (SEQ ID Nº 249) (Chothia) PO1AOS RYALS (SEQ ID Nº: 72) (Kabal); IPMLGF (SEQ ID Nº: 100) | LOFGALDY (SEQ (Chothia) ID Nº: 77) GGVFSRY (SEQ ID Nº: 73) (Chothia);

GGIIPMLGFANYAQKFOG GGVFSRYALS (SEQ ID Nº: 74) (Estendida) AS EQ ID Nº: 257) (Wabel POBBO3 SYDIS (SEQ ID Nº: 49) (Kabal); RIPSFGAANYAQKFOG | DDGEGWIPPFGY (SEQ ID Nº: 253) (Kabat) | (SEQID Nº: 254) GGTFSSY (SEQ ID Nº: 44) (Chothia); IPSFGA (SEQ ID Nº: 252) GGTFSSYDIS (SEQ ID Nº: 50) (Estendida) (Chothia P5F79; SYAMN (SEQ ID Nº: 102) (Kabat); SISGGGRSTYYADSVKG DLSPSDVGWGYG (SEQ ID Nº: 105) (Kabal): | FDI (SEQ ID Nº: P1OA029; — | GFTFSSY (SEQ ID Nº: 103) (Chothia); 107) . SGGGRS (SEQ ID Nº P10A049; — | GFTFSSYAMN (SEQID Nº: 104) (Estendida) | 195 Crotnia) P10A059; P10A079; P10B03g; P10B06g PsF7o2: — | SYAMN(SEQID Nº: 102) (Kabal); AISGGGRSTYYADSVKG | DLSPSDVGWGYG [SEQ ID Nº: 255) (Kabat); | FDI (SEQ ID Nº: PSF793 GFTFSSY (SEQ ID Nº: 103) (Chothia); ( ) (Kabal) 107) ( SGGGRS (SEQ ID Nº GFTFSSYAMN (SEQ ID Nº: 104) (Estendida) — | 206) (Chotnia P5F794 SYAMS (SEQ ID Nº: 138) (Kabat); AISGGGRSTYYADSVKG DLSPSDVGWGYG (SEQ ID Nº: 255) (Kabal): | FDI (SEQ ID Nº: GFTFSSY (SEQ ID Nº: 139) (Chothia); 107) . SGGGRS (SEQ ID Nº GFTFSSYAMS (SEQ ID Nº: 140) (Estendida) 106) (Chothia mao — Jeoru CDRL2 CDRL3 o. GASSRAT(SEQIDNº: — | QQYGSPPRT (SEQ RASHSVSSSYLA (SEQ ID Nº: 144) o. GASTRAT (SEQ ID Nº: QQYARSST (SEQ RASQYVSASLLA (SEQ ID Nº: 147) . AASSLOS(SEQIDNº: — | aasYSTPLT (SEA Pam RASQSISSYLN (SEQ ID Nº: 150) en DN dEo . EVSKRPS (SEQIDNº: | ssvyaGSNTVW TGTSSDVGGYNYVS (SEQID Nº: 153) o. RNNQRPS (SEQ ID Nº: AAWDDSLSGVV o. RNNORPS (SEQ ID Nº: AAWDGSLSRPV SGSGSNIGSNYVY (SEQ ID Nº: 159) eo SEQION 16 o DASSRAT(SEQIDNº: — | aavesPPLT RASQSVPNEGLA (SEQ ID Nº: 162) . DASSRAT (SEQIDNº: | QQYDSSPLT RASQSVSSSELA (SEQ ID Nº: 165) o. YDSDRPS (SEQ ID Nº: QVWDSSTAWV GENNISSKSVA (SEQ ID N': 169) (SEQID Nº: 170 P3E1O RASQSVPSSQLA (SEQ ID Nº: 171 DASSRAT(SEQIDNº: — | QQYGSSPLT(SEQ

Lo 12 Jon | o. DAYTRPS (SEQ ID Nº: QQYGSSPLT RASQAVDSSDLA (SEQ ID Nº: 174) o. DTFTRAT (SEQ1ID Nº: QQYGSSPPT P5F7 RASQSVSSNLA (SEQ ID Nº: 177) 178) (SEQID Nº: 179) " DTSSRAT (SEQIDNº: | QOYGSSLT (SEQ RASQSVSNTYLA (SEQ ID Nº: 180) " AASNLOS (SEQ ID Nº: QQSYSIPLT (SEQ RASQSISTYLN (SEQ ID Nº: 183) o. GASSRAS (SEQ ID Nº: QQYGESPYT P12B6 RASQIVSSSYLA (SEQ ID Nº: 186) 187) (SEQID Nº: 188) o GASFRAA (SEQIDNº*: | QQYGSDPYT (SEQ RASQSVSHSYLA (SEQ ID Nº: 189) o. DASDLOR (SEQ ID Nº: QQSYNTPWT P146G2 RASQSISSYLN (SEQ ID Nº: 192) o. DDSDRPS (SEQ ID Nº: QVWDSSSDHWV PrFo TRSSGSIASNYVO (SEQ ID Nº: 195) 196) (SEQ ID Nº: 197) POBBOSEE — | RASQSVSHSYLA (SEQ ID Nº: 189) GASFRAA (SEQ ID Nº: | QQYGSEPYT (SEQ 190) 1D Nº: 256) PO4A04 RASQSVTSSQLA (SEQ ID Nº: 257) GASFRAA (SEQ ID Nº: | QQYGSSLLIT (SEQ 190) ID Nº: 258 PO1AO5 RASQAVDSSDLA (SEQ ID Nº: 174) DAYTRPS (SEQ ID Nº: | QQYGSSPLT (SEQ 175) ID Nº: 176 POBBO3 RASQSVSSNLA (SEQ ID Nº: 177) DAYTRAT (SEQ ID Nº: | QQYGSPYT (SEQ 259) 1D Nº: 260) P5F7g RASQSVSSNLA (SEQ ID Nº: 177) DTFTRAT (SEQ ID Nº: | QQOYGSSPPT 178) (SEQD Nº: 179) P10A029 RASQDVSDLLA (SEQ ID Nº: 261) DAYTRAT (SEQ |D Nº: | QQYASSPIT (SEQ 259) 1D Nº: 262) P10A04g RASQKVSDLLA (SEQ ID Nº: 263) DAYTRAT (SEQ ID Nº: | QOYTGSPIT (SEQ 259 ID Nº: 264) P10A05g RASLSVSDLLA (SEQ ID Nº: 265) DAYSRAT (SEQ ID Nº: | QOYSSNPIT (SEQ 266) 1D Nº: 267) P10A07g RASGSVSDLLA (SEQ ID Nº: 268) DAYSRAT (SEQ ID Nº: | QQYASYPIT (SEQ 266) 1D Nº: 269) P10B03g RASQSVSDLLA (SEQ ID Nº: 270) DAFSRAT (SEQ ID Nº: | QOYGTPPIT (SEQ 271 1D Nº: 272) P10B06g RASESVSDLLA (SEQ ID Nº: 273) DAYSRAT (SEQ ID Nº: | QOYSASPIT (SEQ 266) 1D Nº: 274) P5F7g2 RASQSVSSNLA (SEQ ID Nº: 177) DTFTRAT (SEQ ID Nº: | QQYGSSPPT 178) 1SEQ ID Nº: 179) P5F793; RASQSVSSLLA (SEQ ID Nº: 275) DAYTRAT (SEQ ID Nº: | QOYTGSPIT (SEQ 259) ID Nº: 264) P5F794

[0093] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a FLT3 e compete com o anticorpo como descrito neste documento, incluindo P4F6, P4C7, P3A, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, POS8BOGEE, PO4A04, PO1AOS5, PO8BO3, P5F7, P5F79g, P10A02g, P10A049, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g, P5F792, PS5F793 ou P5F794.

[0094] Em algumas modalidades, a invenção também fornece porções de CDR de anticorpos para anticorpos FLT3 com base nas regiões de contato de CDR. Regiões de contato CDR são regiões de um anticorpo que impregnam especificidade ao anticorpo para um antígeno. Em geral, as regiões de contato de CDR incluem as posições dos resíduos nas zonas CDRs e Vernier que são restritas a fim de manter uma estrutura de alça adequada para o anticorpo se ligar a um antígeno específico. Veja, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156 a 1166, 2007. A determinação das regiões de contato da CDR está bem dentro da técnica.

[0095] A afinidade de ligação (Kp) do anticorpo FLT3 como descrito neste documento, o FLT3 (tal como FLT3 humano (por exemplo, (SEQ ID Nº: 201)) pode ser de cerca de 0,001 a cerca de 5000 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é de cerca de qualquer dentre 5000 nM, 4500 nM, 4000 nM, 3500 nM, 3000 nM, 2500 nM, 2000 NM, 1789 nM, 1583 nM, 1540 nM, 1500 nM, 1490 nM, 1064 nM, 1000 NM, 933 nM, 894 nM, 750 nM, 705 nM, 678 nM, 532 nM, 500 nM, 494 NM, 400 nM, 349 nM, 340 nM, 353 nM, 300 nM, 250 nM, 244 nM, 231 NM, 225 nM, 207 nM, 200 nM, 186 nM, 172 nM, 136 nM, 113 nM, 104 NM, 101 nM, 100 nM, 90 nM, 83 nM, 79 nM, 74 NM, 54 NM, 50 nM, 45 NM, 42 nM, 40 nM, 35 nM, 32 nM, 30 nM, 25 nM, 24 nM, 22 nM, 20 nM, 19 nM, 18 NM, 17 NM, 16 NM, 15 NM, 12 nM, 10 AM, 9 AM, 8 nM, 7,5 AM, 7 NM, 6,5 NM, 6 NM, 5,5 NM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 NM, 1 NM, 0,5 NM, 0,3 NM, 0,1 nM, 0,01 nM, ou 0,001 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é menos do que cerca de qualquer dentre 5000 nM,

4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 250 nM, 200 NM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 NM, 6,5 NM, 6 NM, nM, 4,5 nM, 4 NM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 NM, 2 nM, 1,5 nM, 1 NM, ou 0,5 nM.

[0096] Anticorpos biespecíficos, monoclional anticorpos que possuam especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes, podem ser preparados usando os anticorpos aqui descritos. Os métodos para fabricar biespecíficos são conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos era baseada na coexpressão de dois pares de Cadeia Pesada-Cadeia Leve de imunoglobulina, com as duas Cadeias Pesadas com especificidades diferentes (Millstein e Cuello, Nature 305, 537 a 539, 1983). Por consequência, em um aspecto, é fornecido um anticorpo biespecífico em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo humano de tamanho natural, que compreende um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico que especificamente se liga a um antígeno alvo (por exemplo, FLT3), e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana.

[0097] A célula efetora imune humana pode ser qualquer de uma variedade de células efetoras imunes conhecidas na técnica. Por exemplo, a célula efetora imune pode ser um membro da linhagem de células linfóides humanas, incluindo, porém não limitado a, uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica), uma célula B e uma célula exterminadora natural (NK). A célula efetora imune também pode ser, por exemplo, sem limitação, um membro da linhagem mieloide humana, incluindo, porém não limitado a, um monócito, um granulócito neutrofílico e uma célula dendrítica. Tais células efetoras imunológicas podem ter um efeito citotóxico ou apoptótico em uma célula alvo ou outro efeito desejado após a ativação pela ligação de um antígeno efetor.

[0098] O antígeno efetor é um antígeno (por exemplo, uma proteína ou um polipeptídeo) expresso na célula efetora imune humana. Exemplos de antígenos efetores que podem ser ligados pela proteína heterodimérica (por exemplo, um anticorpo heterodimérico ou um anticorpo biespecífico) incluem, porém não estão limitados ao CD3 humano (ou complexo CD3 (Cluster de Diferenciação)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64, e CD8º9.

[0099] A célula alvo pode ser uma célula nativa ou estranha aos seres humanos. Em uma célula alvo nativa, a célula pode ter sido transformada para ser uma célula maligna ou modificada patologicamente (por exemplo, uma célula alvo nativa infectada com um vírus, um plasmódio ou uma bactéria). Em uma célula alvo estranha, a célula é um patógeno invasor, como uma bactéria, um plasmódio ou um vírus.

[00100] O antígeno alvo é expresso em uma célula alvo em uma condição doente (por exemplo, uma doença inflamatória, uma doença proliferativa (por exemplo, câncer), um distúrbio imunológico, uma doença neurológica, uma doença neodegenerativa, uma doença autoimune, uma doença infecciosa (por exemplo, uma infecção viral ou uma infecção parasitária), uma reação alérgica, uma doença do enxerto contra o hospedeiro ou uma doença do hospedeiro versus enxerto). Um antígeno alvo não é antígeno efetor. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é o FLT3.

[00101] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo biespecífico em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, que compreende um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico que especificamente se liga a um antígeno alvo, e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável de ligações de anticorpo ao domínio 4 de FLT3 que compreende SEQ ID Nº: 279.

[00102] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo biespecífico, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, que compreende um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico que especificamente se liga a um antígeno alvo, e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende um VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 da sequência VH mostrada em SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217,219,221,223, 225, 227, 229, 231, ou 233; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da sequência VL mostrada em SEQ ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, ou 232.

[00103] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo biespecífico, em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, que compreende um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico que especificamente se liga a um antígeno alvo, e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável de anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região de determinação de complementaridade VH um (CDR1) que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246, ou 247; (ii) um VH CDR2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253, ou 255; e iii) um VH CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250, ou 254; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um VL CDR1 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273, ou 275; (ii) um VL CDR2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266, ou 271; e (iii) uma VL CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272, ou 274.

[00104] Em algumas modalidades, o primeiro domínio variável de anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região de determinação de complementaridade VH um (CDR1) que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 102, 103, ou 104; (ii) um VH CDR2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 255 ou 106; e iii) um VH CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 107; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um VL CDR1 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 177; (ii) um VL CDR?2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 178; e (iii) uma VL CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 179.

[00105] Em algumas modalidades, o segundo domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende um VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 da sequência VH mostrada em SEQ ID Nº: 282; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da sequência VL mostrada em SEQ ID Nº: 281.

[00106] Em algumas modalidades, o primeiro domínio variável de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende um VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº: 229; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 228; e um segundo domínio variável de anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende um VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 da sequência VH mostrada em SEQ ID Nº:282; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende um VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 da sequência VL mostrada em SEQ ID Nº: 281.

[00107] Em algumas modalidades, o segundo domínio variável de anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende (i) uma região VH de determinação de complementaridade um (CDR1) que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 285, 286, ou 287; (li) um VH CDR2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 288 ou 289; e iii) um VH CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 290; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende (i) um VL CDR1 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 291; (ii) um VL CDR?2 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 292; e (iii) uma VL CDR3 que compreende a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 234.

[00108] A Tabela 3 mostra as sequências específicas de aminoácidos e ácidos nucleicos do segundo domínio variável do anticorpo, que é específico para CD3. Na Tabela 3, as sequências sublinhadas são CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia. Tabela 3 h2B4 H | DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOS | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSD NPS VL | LENVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIS | YYMTWVROAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSD OTK WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS | HNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT SLOAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKL | AVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS EIK (SEQ ID Nº: 281) (SEQ ID Nº: 282) h2B4 H | GACATTGTGATGACTCAATCCCCCGA | GAAGTCCAACTTGTCGAATCGGGAGGAGGC NPS VL | CTCCCTGGCTGTGTCCCTCGGCGAAC | CTTGTGCAACCOGGTGGATCCCTGAGGCTGE TK GCGCAACTATCAACTGTAAAAGCAGC | TCATGCGCGGCCTCGEGCTTCACCTTTTCC CAGTCCCTGTTCAACGTCCGGTCGAG | GATTACTACATGACCTGGGTCAGACAGGCC GAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGC | CCTGGAAMAGGGGTTGGAATGGGTGGCATTC AGAAACCTGGGCAGCCGCCGAAGCTT | ATCCGGAATAGAGCCCGCGGATACACTTCC CTGATCTCATGGGCCTCAACTCGGGA | GACCACAACCCCAGCGTGAAGGGGCEGTTC AAGCGGAGTGCCAGATAGATTCTCCG | ACCATTAGCCGCGACAACGCCAAGAACTCC GATCTGGCTCCGGAACCGACTTCACC | CTCTACCTCCAMATGAACAGCCTGCEGGCG CTGACGATTTCGAGCTTGCAAGCGGA | GAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCCGC GGATGTGGCCGTGTACTACTGCAAGC | GACCGGCCGTCCTACTATGTGCTGGACTAC AGTCCTACGACCTCTTCACCTTTGGTT | TEGGGCCAGGGTACTACGGTCACCGTCTCC CGGGCACCAAGCTGGAGATCAAA TCA (SEQ ID Nº: 284) (SEQ ID Nº: 283)

[00109] A Tabela4 mostra os exemplos de sequências de CDR do segundo domínio variável de anticorpo, que é específico para CD3.

Tabela 4 me Jem Je fam h2B4 HNP | SDYYMT (SEQ ID Nº: 285) RNRARGYT (SEQ ID Nº: 288) | DRPSYYVLDY SVLTK | (Kabal); (Kabat) (SEQ ID Nº: 290) GFTFSDY (SEQ ID Nº: 286) (Choithia); FIRNRARGYTSDHNPSVKG GFTFSDYYMT(SEQIDN': | s00 (p Nº: 289) (Estendida) 287) (Estendida) me fee eme fee h2B4 HNP | KSSOSLFNVRSRKNYLA WASTRES KOSYDLFT SVLTK | seQIDNº: 291) (SEQ ID Nº: 292) (SEQ ID Nº: 234)

[00110] Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico aqui fornecido que contém um domínio variável específico de CD3 com uma sequência anti-CD3, conforme fornecido na Publicação Norte- Americana No. 20160297885, que é aqui incorporado por referência para todos os propósitos.

[00111] De acordo com um método de preparação de anticorpos biespecíficos, domínio variável de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fundidas as sequências de região constante de imunoglobulina. A fusão é preferencialmente com uma região constante de Cadeia Pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da Cadeia Pesada (CH1), contendo o sítio necessário para a ligação de Cadeia Leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de Cadeia Pesada de imunoglobulina e, se desejado, a Cadeia Leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso proporciona uma grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos nas situações em que proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção fornecem os rendimentos ideais. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as relações não têm significado particular.

[00112] Em outro método, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma Cadeia Pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em uma subdivisão e um par de Cadeia Pesada - Cadeia Leve de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) na outra subdivisão. Esta estrutura assimétrica, com uma Cadeia Leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações indesejadas de cadeias de imunoglobulinas. Este método está descrito na Publicação PCT No. WO 94/04690.

[00113] Em outro método, os anticorpos biespecíficos são compostos de modificação de aminoácidos na primeira região de articulação de uma subdivisão, e o aminoácido substituído/reposto na primeira região de articulação tem uma carga oposta ao aminoácido correspondente na segunda região de articulação de outra subdivisão. Este método é descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

[00114] Em outro método, a formação de uma proteína heteromultimérica ou heterodimérica desejada (por exemplo, anticorpo biespecífico) é aprimorada alterando ou criando uma interface entre uma primeira região Fc do tipo imunoglobulina e um segundo (por exemplo, uma região charneira e/ou uma região CH3). Neste método, os anticorpos específicos podem ser compostos de uma região CH3, em que a região CH3 compreende um primeiro polipeptídeo CH3 e um segundo polipeptídeo CH3 que interagem em conjunto para formar uma interface CH3, em que um ou mais aminoácidos dentro da interface de CH3 desestabiiza a formação do homodímero e não é eletrostaticamente desfavorável à formação do homodímero. Este método é descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

[00115] Em outro método, os anticorpos biespecíficos podem se gerados usando um marcador de peptídeo contendo glutamina modificada para o anticorpo direcionado a um epítopo (por exemplo, FLT3) em uma subdivisão e outro marcador de peptídeo (por exemplo, um marcador de peptídeo contendo Lys ou um Lys endógeno reativo) modificado a um segundo anticorpo direcionado a um segundo epítopo em outra subdivisão na presença de transglutaminase. Esse método está descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882).

[00116] Em algumas modalidades, a proteína heterodimérica (por exemplo, anticorpo biespecífico) como descrito neste documento, compreende um anticorpo humano de tamanho natural, em que um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico que especificamente se liga a um antígeno alvo (por exemplo, FLT3), e que compreende um segundo domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana especificamente se ligando a um antígeno efetor (por exemplo, CD3) localizada na célula efetora imune humana, em que os primeiro e segundo domínios variáveis de anticorpo da proteína heterodimérica compreendem modificações de aminoácidos nas posições 223, 225, e 228 (por exemplo, (C223E ou C223R), (E225E ou E225R), e (P228E ou

P228R)) na região de articulação e uma posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG2 humana (SEQ ID Nº: 236).

[00117] Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios variáveis de vetores da proteína heterodimérica compreendem modificações de aminoácidos nas posições 221 e 228 (por exemplo, (D221R ou D221E) e (P228R ou P228E)) na região de articulação e na posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG1 humano (SEQ ID Nº: 237).

[00118] Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios variáveis de vetores da proteína heterodimérica compreendem modificações de aminoácidos nas posições 228 (por exemplo, (P228E ou P228R)) na região de articulação e na posição 409 ou 368 (por exemplo, R409 ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG4 humano (SEQ ID Nº: 238).

[00119] Os anticorpos úteis na presente invenção podem abranger anticorpos — monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia única (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento do antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos podem ser murinos, ratos, humanos ou qualquer outra origem (incluindo quiméricos ou humanizados).

[00120] Em algumas modalidades, o anticorpo monoespecífico FLT3 ou o anticorpo biespecífico FLT3 (por exemplo, FLT3-CD3) como descrito neste documento, é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo monoespecífico FLT3 é um anticorpo monoclonal humano. Em outro exemplo, a subdivisão FLT3 do anticorpo biespecífico FLT3-CD3 é um anticorpo monoclonal humano, e a subdivisão CD3 do anticorpo biespecífico FLT3-CD3 é um anticorpo monoclonal humanizado.

[00121] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modificada, como, por exemplo, sem limitação, uma região constante que tem potencial aumentado para provocar uma resposta imune. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para ter afinidade aumentada para um receptor gama Fc, tal como, por exemplo, FeyRI, FeyRIIA ou Fevylll.

[00122] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região — constante — modificada, como uma região constante imunologicamente inerte, ou seja, com um potencial reduzido para provocar uma resposta imune. Em algumas modalidades, a região constante é modificada como descrito em Eur. J. Immunol., 29:2613 a 2624, 1999; Publicação PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente do Reino Unido No. 98099518. O Fc pode ser IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana ou IgG4 humana. O Fc pode ser IgG2 humana contendo a mutação A330P331 a S330S331 (IgG2Aa), em que os resíduos de aminoácidos são numerados com referência à sequência de IgG2 do tipo selvagem. Eur. J. Immunol., 29:2613 - 2624, 1999. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de IgG, que compreende as seguintes mutações (Armour et al, Molecular Immunology 40 585 - 593, 2003): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG4Ac), em que o número de referência é referente ao IgG4 tipo selvagem. Em ainda outra modalidade, o Fc é I1g9G4 E233F234L235 humano a P233V234A235 com a deleção G236 (I9G4Ab). Em outra modalidade, o Fc é qualquer IgG4 Fc humana (I9G4, IGgG4Ab ou IgG4Ac) contendo mutação de estabilização da articulação S228 a P228 (Aalberse et al., Immunology 105, 9 - 19, 2002). Em outra modalidade, o Fc pode ser Fc aglicosilado.

[00123] Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada por mutação do resíduo de ligação de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou resíduos de flanqueamento que fazem parte da sequência de reconhecimento de glicosilação na região constante. Em algumas situações, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada ao N enzimaticamente. A região constante pode ser aglicosilada para glicosilação ligada a N enzimaticamente ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente em glicosilação.

[00124] Em algumas modalidades, a região constante tem uma região constante modificada que remove ou reduz a ligação ao receptor gama Fc. Por exemplo, o Fc pode ser IgG2 humana contendo a mutação D265, em que os resíduos de aminoácido são numerados com referência à sequência de IgG2 do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 236). Por consequência, em algumas modalidades, a região constante tem uma região constante modificada tendo a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 239:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVERKCRVRCPRCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTV VHQODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD

GSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK . E o ácido nucleico codificando a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 239 é apresentado na SEQ ID Nº: 240.

[00125] Em algumas modalidades, a região constante tem uma região constante modificada tendo a sequência mostrada em SEQ ID Nº: 241:

[00126] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVD HKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK. E o ácido nucleico que codifica a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 241 é mostrado na SEQ ID Nº: 242.

[00127] O aminoácido da região constante kappa humana é mostrado em SEQ ID Nº: 243:

[00128] GTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC. E o ácido nucleico que codifica a sequência da SEQ ID Nº: 243 é mostrado na SEQ ID Nº: 244.

[00129] “Uma maneira de determinar a afinidade de ligação do FLT3 é através da medição da afinidade de ligação do anticorpo bivalente à proteína FLT3 monomérica. A afinidade de um anticorpo FLT3 pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície (sistema de ressonância plasmônica de superfície Biacore'" 3000'Y (SPR), Biacore'Y, INC, Piscataway NJ) equipada com Fc anti-camundongo pré- imobilizado ou Fc anti-humano usando HBS-EP tampão de corrida (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 MM EDTA, 0,005% v/v tensoativo P20). O domínio extracelular FLT3 humano marcado com 8-histidina monomérica pode ser diluído no tampão HBS-EP a uma concentração inferior a 0,5 ug/mL e injetado através dos canais de chip individuais usando tempos de contato variáveis, para atingir duas faixas de densidade de antígeno, 50 a 200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados ou 800 a 1.000 RU para ensaios de análise. Estudos de regeneração mostraram que NaOH a 25 mM em etanol a 25% v/v remove efetivamente a proteína FLT3 ligada mantendo uma atividade de FLT3 ativada no chip por mais de 200 injeções. Tipicamente, diluições em série (abrangendo concentrações de 0,1 a 10x Kp estimado) de amostras de FLT3 marcadas com 8-histidina purificadas são injetadas por 1 min a 100 ul/minuto e são permitidos tempos de dissociação de até duas horas. As concentrações das proteínas FLT3 são determinadas por absorvância a 280 nm com base no coeficiente de extinção específico da sequência da proteína FLT3 marcada com 8-histidina. As taxas de associação cinética (Kon ou ka) e as taxas de dissociação (Kkor ou ka) são obtidas simultaneamente, ajustando os dados globalmente a um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. ( 1994). Methods Enzymology 6. 99 a 110) usando o programa BlAevaluation. Os valores da constante de dissociação do equilíbrio (Ko) são calculados como koff/kon. Este protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer FLT3 monomérico, incluindo FLT3 humano, FLT3 de outro mamífero (como FLT3 de camundongo, FLT3 de rato ou FLT3 primata), assim como diferentes formas de FLT3 (por exemplo, FLT3 glicosilado). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida em 25ºC, porém também pode ser medida em 37ºC.

[00130] Os anticorpos como descrito neste documento, podem ser feitos por qualquer método conhecido na técnica. Para a produção de linhagens celulares de hibridoma, a via e o cronograma de imunização do animal hospedeiro são geralmente de acordo com as técnicas convencionais e estabelecidas para estimulação e produção de anticorpos, conforme descrito neste documento mais adiante. As técnicas gerais para produção de anticorpos humanos e camundongos são conhecidas na técnica e/ou são descritas neste documento.

[00131] Está contemplado que qualquer indivíduo mamífero,

incluindo humanos ou células produtoras de anticorpos, pode ser manipulado para servir como base para a produção de mamíferos, incluindo linhagens celulares humanas e de hibridomas. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado por via intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutânea, intraplantar e/ou intradérmica com uma quantidade de imunógeno incluída como descrito neste documento.

[00132] Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e células de mieloma imortalizadas, usando a técnica geral de hibridação de células somáticas de Kohler, B. e Milstein, C., Nature 256: 495-497, 1975 ou como modificado por Buck, DW, et al., In Vitro, 18: 377-381,

1982. As linhas de mieloma disponíveis, incluindo porém não estão limitadas a X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, podem ser usadas na hibridação. Geralmente, a técnica envolve a fusão de células de mieloma e células linfóides utilizando um fusogênio, como o polietilenoglicol, ou por meios elétricos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e crescem em um meio de crescimento seletivo, como o meio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar células-mãe não hibridadas. Qualquer dos meios aqui descritos, suplementados com ou sem soro, pode ser usados para cultivar hibridomas que secretam veículo monoclonal. Como alternativa à técnica de fusão celular, células B imortalizadas por EBV podem ser usadas para produzir o monoclonal desencadeado da invenção em questão. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são analisados quanto à atividade anti-imunógena por procedimentos convencionais de imunoensaio (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático ou imunoensaio de fluorescência).

[00133] Os hibridomas que podem ser utilizados como fonte de anticorpos abrangem todos os derivados, células descendentes dos hibridomas parentais que produzem anticorpos monoclionais específicos para FLT3, ou porções dos mesmos.

[00134] Os hibridomas que produzem esses anticorpos podem ser cultivados in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os monocilonais podem ser isolados do meio de cultura ou dos fluidos corporais, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas, como precipitação com sulfato de amônio, eletroforese em gel, diálise, cromatografia e ultrafiltração, se desejado. A atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, executando a preparação sobre adsorventes feitos do imunógeno anexado a uma fase sólida e eluindo ou liberando os anticorpos desejados do imunógeno. Imunização de um animal hospedeiro com células que expressam FLT3 humano, uma proteína FLT3 humana, ou um fragmento contendo a sequência de aminoácidos alvo conjugada a uma proteína imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou RIÍN=C=NR, onde R e R' são grupos alquila diferentes, pode produzir uma população de anticorpos (por exemplo, monoclonal anticorpos).

[00135] Se desejado, o anticorpo (monoclonal ou policlonal) de interesse pode ser sequenciado e a sequência polinucleotídica pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. À sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode ser expandida e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes em cultura de células pode ser realizada através da clonagem de genes de anticorpos de células B por meios conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008; Patente Norte-Americana Nº. 7.314.622.

[00136] Em uma alternativa, a sequência polinucleotídica pode ser usada para manipulação genética para "humanizar" o anticorpo ou para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para se assemelhar mais às regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpos para obter maior afinidade ao FLT3 e maior eficácia na inibição do FLT3.

[00137] Existem quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São eles: (1) determinar a sequência de aminoácidos prevista para o nucleotídeo e os domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida (2) projetar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização (3) a humanização real metodologias/técnicas e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692;

6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.

[00138] Um número de moléculas de anticorpo "humanizado" que compreende uma ligação a um sítio de antígeno derivado de uma imunoglobulina não humana foi descrito, incluindo ensaios quiméricos com regiões V de roedores ou roedores modificados e suas CDRs associadas fundidas a regiões constantes humanas. Veja, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293 a 299, 1991, Lobuglio et a/. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220 a 4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534 a 4538, 1987, e Brown et al. Cancer Res. 47:3577 a 3583, 1987. Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertados em uma região de estrutura de suporte humano (FR) antes da fusão com uma região constante apropriada de anticorpo humano. Veja, por exemplo,

Riechmann et a/. Nature 332:323 a 327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534 a 1536, 1988, e Jones et al. Nature 321:522 a 525, 1986. Outra referência descreve CDRs de roedores suportados por regiões de estrutura de roedores recombinantemente modificada. Veja, por exemplo, a Pedido de patente europeia Nº. 0519596. Essas moléculas "humanizadas" são projetadas para minimizar a resposta imunológica indesejada contra moléculas de anticorpos anti-humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser modificada de modo que seja imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia a lise do complemento). Veja, por exemplo, Publicação PCT No. PCT/GB99/01441; Pedido de Patente do Reino Unido Nº. 9809951.8. Outros métodos de humanizar anticorpos que também podem ser utilizados são divulgados por Daugpherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471 a 2476, 1991, e na Patente Norte-Americana Nº. 6.180.377, 6.054.297, 5.997.867, 5.866.692,

6.210.671, e 6.350.861, e na Publicação PCT Nº. WO 01/27160.

[00139] Os princípios gerais relacionados aos anticorpos humanizados discutidos acima também são aplicáveis à personalização de filtros para uso, por exemplo, em cães, gatos, primatas, equinos e bovinos. Além disso, um ou mais aspectos da humanização de um anticorpo aqui descrito podem ser combinados, por exemplo, enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.

[00140] Emuma variação, os anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos usando camundongos disponíveis comercialmente que foram “modificados para expressar proteínas específicas de imunoglobulina humana. Animais transgênicos que são projetados para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta também podem ser usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos dessa tecnologia são Xenomouse'“ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb- Mouseº e TC Mouse" de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

[00141] Em alternativa, os controles podem ser feitos recombinantemente e expressos usando qualquer método conhecido na técnica. Em alternativa, os acessórios podem ser recombinantes pela tecnologia de exibição de fagos. Veja, por exemplo, Patentes Norte- Americanas Nos. 5.565.332, 5.580.717, 5.733.743, e 6.265.150; e Winter et al, Annu. Rev. Immunol. 12:433 a 455, 1994. Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552 a 553, 1990) pode ser usada para produzir in vitro fragmentos de anticorpos e anticorpos humanos a partir de repertórios de genes de domínio variável de imunoglobulina (V) de doadores não imunizados. De acordo com essa técnica, os genes do domínio do anticorpo V são clonados na estrutura em um gene da proteína de revestimento principal ou menor de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpo na superfície da partícula do fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada em uma variedade de formatos; para revisão veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564 a 571, 1993. Várias fontes de segmentos de genes V podem ser usadas para exibição de fagos. Clackson et al., Nature 352: 624 a 628, 1991, isolaram uma matriz diversificada de antioxazolona, de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos de um conjunto diverso de antígenos

(incluindo autoantígenos) pode ser isolado essencialmente seguindo as técnicas descritas por Mark et a/., J. Mol. Biol. 222: 581 a 597, 1991, ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725 a 734, 1993. Numa resposta imune natural, os genes de anticorpos acumulam mutações a uma taxa alta (hipermutação — somática). Algumas das alterações introduzidas conferem maior afinidade, e as células B que apresentam imunoglobulina superficial de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante subsequente desafio ao antígeno. Esse processo natural pode ser imitado empregando a técnica conhecida como "embaralhamento de cadeia." (Marks et al, Bio/Technol. 10:779 a 783, 1992). Nesse método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos pela exibição de fagos pode ser melhorada substituindo sequencialmente os genes da região V de cadeia pesada e Leve com repertórios de variantes (repertórios) de ocorrência natural dos genes do domínio V obtidos de doadores não imunizados. Essa técnica permite a produção de fragmentos de anticorpos e anticorpos com afinidades na faixa de pM-nM. Uma estratégia para produzir repertórios de anticorpos de fagos muito grandes (também identificados como "a mãe de todas as bibliotecas") foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21: 2265 a 2266,

1993. O embaralhamento gênico também pode ser utilizado para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com esse método, que também é chamado de "impressão de epítopo”", o gene do domínio V da cadeia pesada ou o nível de uso do óleo obtido pela técnica de exibição de fagos é substituído por um repertório de genes do domínio V humano, criando quimeras de roedor-humanos. A seleção no antígeno resulta no isolamento de regiões humanas variáveis capazes de restaurar uma ligação funcional do sítio do antígeno, ou seja, o epítopo governa

(impressões) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido para substituir o domínio do roedor V restante, é obtido um anticorpo humano (veja Publicação PCT Nº. WO 93/06213). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticopos completamente humanos, que não possuem estrutura ou resíduos de CDR de origem de roedores.

[00142] Os anticorpos podem ser feitos recombinantemente isolando primeiro os anticorpos e as células produtoras de anticorpos de animais hospedeiros, obtendo a sequência gênica, e usando a sequência gênica para expressar o anticorpo recombinantemente nas células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é o de expressar a sequência de anticorpos em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. “Métodos para expressar recombinantemente em plantas ou leite foram divulgados. Veja, por exemplo, Peeters, et al. Vacina 19: 2756, 2001; Lonberg, N. e D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; e Pollock, et al., J. Immunol Methods 231: 147, 1999. Os métodos para produzir derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, cadeia única, etc. são conhecidos na técnica.

[00143] Técnicas de classificação de imunoensaios e citometria de fluxo assim como classificação celular ativada por fluorescência (FACS) podem também ser empregadas a anticorpos isolados que são específicos para FLT3, ou antígenos tumorais de interesse.

[00144] Os anticorpos como descrito neste documento, podem ser ligados a muitos veículos diferentes. Os veículos podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de veículos bem conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão outros veículos adequados para ligação de anticorpos, capazes de averiguar isso,

utilizando experimentação de rotina. Em algumas modalidades, o portador compreende uma porção que atinge o miocárdio.

[00145] O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal). As células de hibridoma servem como fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (como os vetores de expressão divulgados na Publicação PCT Nº. WO 87/04462), que são então transfectados para células hospedeiras como células de E. coli, células COS símias, células ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de monoclonal ativado nas células hospedeiras recombinantes. Veja, por exemplo, Publicação PCT Nº. WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação por regiões constantes de cadeia pesada e leve humanas em vez das sequências murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984, ou por união covalente à sequência de codificação da imunoglobulina, toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Dessa maneira, são preparados "quiméricos" ou "híbridos" que possuem aqui a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal.

[00146] Os anticorposFLT3 como descritos neste documento podem ser identificados ou caracterizados por métodos conhecidos na técnica, nos quais a redução dos níveis de expressão do FLT3 é detectada e/ou medida. Em algumas modalidades, um anticorpo FLT3 é identificado incubando um agente candidato com FLT3 e monitorando a ligação e/ou a redução resultante dos níveis de expressão de FLT3. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) FLT3 purificado, ou com células que expressam naturalmente, ou transfectadas para expressar polipeptídeo(s) FLT3. Em uma modalidade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, em que é avaliada a capacidade de um anticorpo candidato para competir com um anticorpo FLT3 conhecido pela ligação a FLT3. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA.

[00147] Após a identificação inicial, uma atividade de um anticorpo FLT3 candidato pode ser confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos por testar as atividades biológicas alvo. Como alternativa, os bioensaios podem ser usados para analisar os candidatos diretamente. Alguns dos métodos para identificar e caracterizar anticorpos são descritos em detalhes nos Exemplos.

[00148] Anticorpos FLT3 podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual ele se liga, ou "mapeamento de epítopos". Existem muitos métodos conhecidos na arte para mapear e caracterizar a localização de epítopos nas proteínas, incluindo a resolução da estrutura cristalina de um complexo de anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos de genes e ensaios com base em peptídeos sintéticos, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodys, um Manual de Laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopo pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo liga-se O mapeamento de epítopo está disponível comercialmente em várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Baixos). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um único trecho de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que não podem ser contidos em um único trecho.

Peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, com pelo menos 4 a 6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente) e usados para ensaios de ligação com um anticorpo de antígeno tumoral FLT3 ou outro.

Em outro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo FLT3 se liga pode ser determinado em uma análise sistemática usando peptídeos sobrepostos derivados da sequência FLT3 e determinando a ligação pelo anticorpo FLT3. De acordo com os ensaios de expressão de fragmentos de genes, o quadro de leitura aberto que codifica FLT3 é fragmentado aleatoriamente ou por construções genéticas específicas e é determinada a reatividade dos fragmentos expressos de FLT3 com o anticorpo a ser testado.

Os fragmentos de genes podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e depois transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos.

A ligação do anticorpo ao FLT3 marcado radioativamente é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel.

Certos epítopos também podem ser identificados usando grandes bibliotecas de sequências peptídicas aleatórias exibidas na superfície de partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeo sobrepostos pode ser testada quanto à ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples.

Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação ao antígeno, experimentos de mutagênese por varredura de troca de domínio e alanina podem ser realizados para identificar os resíduos requeridos, suficientes e/ou necessários para a ligação ao epítopo.

Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser realizados usando um FLT3 mutante no qual vários fragmentos da proteína FLT3 foram substituídos (trocados) com sequências do FLT3 de outra espécie (por exemplo, camundongo), ou uma proteína antigenicamente distinta, intimamente relacionada.

Ao avaliar a ligação do anticorpo ao FLT3 mutante, pode ser avaliada a importância do fragmento FLT3 específico para a ligação do anticorpo. No caso de anticorpo específico de FLT3 (ou seja, anticorpo que não se liga a FLT3wt (tipo selvagem) ou qualquer outra proteína), o epítopo pode ser deduzido a partir do alinhamento de sequência de FLT3 a FLT3wt.

[00149] — Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um anticorpo FLT3 é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por se ligarem ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos no FLT3, para determinar se o anticorpo FLT3 se liga ao mesmo epítopo como outros anticorpos. Ensaios de competição são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00150] Um vetor de expressão pode ser usado para direcionar a expressão de um anticorpo FLT3. Alguém versado na técnica está familiarizado com a administração de vetores de expressão para obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 6.436.908, 6.413.942, e 6.376.471. A administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, pistola de partículas ou administração cateterizada e administração tópica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco simpático ou gânglio, dentro de uma artéria coronária, átrio, ventrículo ou pericárdio.

[00151] A liberação direcionada de composições terapêuticas contendo um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos também pode ser usada. As técnicas de liberação de DNA mediada por receptor são descritas em, por exemplo, Findeis et al, Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods e Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; e Wu et al., J.

Biol. Chem., 266:338, 1991. As composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia genética. Intervalos de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 ug a cerca de 2 mg, cerca de 5 ug a cerca de 500 ug, e cerca de 20 ug a cerca de 100 ug de DNA podem também ser usados durante um protocolo de terapia genética. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser liberados usando veículos de liberação de genes. O veículo de liberação de genes pode ser de origem viral ou não viral (veja geralmente, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1: 51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5: 845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1 : 185; e Kaplitt, Nature Genetics, 6: 148, 1994). A expressão de tais sequências de codificação pode ser induzida usando promotores endógenos de mamíferos ou heterólogos. A expressão da sequência de codificação pode ser constitutiva ou regulada.

[00152] Os vetores com base em vírus para a liberação de um polinucleotídeo e expressão desejada em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Veículos exemplares baseados em vírus incluem, porém não estão limitados a, retrovírus recombinantes (Veja, por exemplo, Publicação PCT Nº. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes Norte-Americanas Nº. 5.219,740 e 4,777,127; GB Pat. Nº.

2.200.651; e Patente EP Nº. 0.345.242), vetores baseados em alfavírus (por exemplo, vetores do vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR- 1246) e vírus da encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) e vetores de vírus adeno- associado (AAV) (Veja, por exemplo, Publicação PCT Nº. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e

WO 95/00655) A administração de DNA ligado ao adenovírus morto, como descrito em Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3: 147 também pode ser empregado.

[00153] Veículos e métodos de liberação não virais também podem ser empregados, incluindo, porém não se limitando a, DNA condensado policatiônico ligado ou não ligado apenas a adenovírus morto (Veja, por exemplo, Curiel, Humiel. Gene Ther,, 3: 147, 1992); DNA ligante-ligado (Veja, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem., 264: 16985, 1989); células de veículos de liberação de células eucarióticas (Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 5.814.482; Publicação PCT Nº. WO 95/07994; WO 96/17072, WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. DNA nu também pode ser empregado. Métodos de introdução de DNA nu exemplares são descritos na Publicação PCT Nº WO 90/11092 e Patente Norte-Americana Nº 5.580.859. Os lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de genes são descritos na Patente Norte-Americana Nº. 5.422.120; Publicação PCT Nº. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 0524968. Métodos adicionais são descritos em Philip, Mol. Cell Biol., 14: 2411, 1994 e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 1581, 1994.

[00154] Em algumas modalidades, a invenção abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem anticorpos aqui descritos ou feitos pelos métodos e com as características aqui descritas. Como usadas aqui, as composições compreendem um ou mais vetores que se ligam a FLT3, e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências que codificam uma ou mais dessas frases. Essas composições podem ainda compreender —excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica.

[00155] Ainvenção também fornece métodos para fazer qualquer um desses itens. Os anticorpos desta invenção podem ser feitos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos de fusão ou únicos) como descritos acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente os polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automatizado utilizando o método de fase sólida. Veja também, Patente Norte-Americana Nº.

5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.

[00156] Em alternativa, os controles podem ser feitos recombinantemente usando procedimentos que são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, um polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica as regiões variáveis da Cadeia Pesada e/ou da Cadeia Leve de anticorpo P4F6, P4C7, P3A', PSA3, P9B5, P9F1, P1BA4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, POS8BOGEE, PO4A04, PO1AOS5, PO8BO3, P5F7, P5F79, P10A02g, P10A049g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g, P5F792, P5F7g3 ou P5F7g4. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode ser expandida e congelada para uso futuro. Os vetores (incluindo vetores de expressão) e as células hospedeiras são descritas aqui.

[00157] Os anticorpos heteroconjugados, que compreendem dois anticorpos unidos covalentemente, também estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos têm sido utilizados para alvejar células do sistema imunológico para células indesejadas (Patente Norte

Americana No. 4.676.980), e para tratamento de infecção por HIV (Publicação PCT Nº. WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando qualquer método conveniente de reticulação. Agentes de reticulação adequados e técnicas são bem conhecidas na técnica e são descritas na Patente Norte-Americana Nº. 4.676.980.

[00158] Os quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos da química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esse fim incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato.

[00159] Nos vetores humanizados recombinantes, a porção Fcy pode ser modificada para evitar a interação com o receptor Fcy e os sistemas imunológico e complementar. As técnicas para a preparação de tais anticorpos estão descritas no documento WO 99/58572. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para se parecer mais com regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº. 5.997.867 e

5.866.692.

[00160] A invenção abrange modificações nos anticorpos e polipeptídeos da invenção, incluindo variantes mostrados na Tabela 5, incluindo equivalentes funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que aumentaram ou diminuíram a atividade e/ou afinidade. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser mutada para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada a FLT3. A modificação de polipeptídeos é uma prática rotineira na técnica e não precisa ser descrita em detalhes aqui.

Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente a atividade funcional de maneira prejudicial, ou que maturam (realçam) a afinidade do polipeptídeo para seu ligante, ou uso de análogos químicos.

[00161] As inserções da sequência de aminoácidos incluem fusões terminais amino- e/ou carboxil- com comprimento variando de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrassequentes de resíduos únicos ou múltiplos de aminoácido. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um marcador de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou de um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguínea.

[00162] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os locais de maior interesse para a mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, porém alterações no FR também são contempladas. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 5, sob o título "substituições conservadoras". Se tais substituições resultaraem em uma mudança na atividade biológica, poderão ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 5, ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos e os produtos selecionados. Em algumas modalidades, as variantes de substituição de anticorpos fornecidas aqui não têm mais do que 15, 14, 13, 12, 11, 10,9,8,7,6,5, 4, 3, 2, ou 1 substituição conservadora na região VH ou VL em comparação ao anticorpo parental de referência. Em algumas situações, as substituições não estão dentro de um CDR da região VH ou VL.

Tabela 5: Substituições de aminoácidos Resíduo Original (aminoácido de ocorrência natural) Substituições Conservadoras | Substituições Exemplares Norleucina ee e te Phe Norleucina

[00163] “Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas selecionando-se substituições que diferem significativamente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura da espinha dorsal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (bj) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) a maior parte da cadeia lateral. Os resíduos de aminoácido de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral:

[00164] Não polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle;

[00165] —Polarsem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

[00166] Ácido (carga negativa): Asp, Glu;

[00167] Básico (carga positiva): Lys, Arg;

[00168] Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e

[00169] Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

[00170] Substituições não conservadoras são feitas trocando um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00171] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir a reticulação aberrante. Por outro lado, as ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.

[00172] As modificações de aminoácidos podem variar de alterar ou modificar um ou mais aminoácidos até o redesenho completo de uma região, como uma região variável. Alterações em uma região variável podem alterar a especificidade da afinidade e/ou da ligação. Em algumas modalidades, não são feitas mais do que uma a cinco substituições de aminoácidos conservadores dentro de um domínio CDR. Em outras modalidades, não são feitas mais do que uma a três substituições de aminoácidos conservadores dentro de um domínio CDR. Ainda em outras classes, o domínio CDR é CDR H3 e/ou CDR L3.

[00173] As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, assim como polipeptídeos com outras modificações pós-traducionais, como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65:111 a 128, 1997; Wright e Morrison, TIbTECH 15:26 a 32, 1997) As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311 a 1318, 1996; Wittwe e Howard, Biochem. 29: 4175 a 4180, 1990) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, que pode afetar a conformação, apresentou superfície tridimensional da glicoproteína (Jefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409 a 416, 1996). Os oligossacarídeos também podem servir para direcionar uma dada glicoproteína para certas moléculas baseadas em estruturas de reconhecimento específicas. Também foi relatado que a glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em particular, foi relatado que as células CHO com expressão regulada por tetraciciha de B(1,4)N- acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIII), uma formação de catalização de glicosiltransferase de GICNAc em bissetriz, melhoraram a atividade do ADCC (Umana et al., Mature Biotech. 17:176 a 180, 1999).

[00174] A glicosilação dos anticorpos é tipicamente N-ligante ou O- ligante. N-ligante refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídeo asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral da asparagina. Desse modo, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um potencial sítio de glicosilação. A glicosilação O-ligante refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora também possa ser usada a 5-hidroxiprolina ou a 5-hidroxilisina.

[00175] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação de N-ligante). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligantes).

[00176] O padrão de glicosilação do veículo também pode ser alterado sem alterar a sequência nucleotídica subjacente. A glicosilação depende em grande parte da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula usado para a expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como potencial terapêutico é raramente a célula nativa, podem ser esperadas variações no padrão de glicosilação dos anticorpos (Veja, por exemplo, Hse et al., J. Biol. Chem 272: 9062 a 9070, 1997).

[00177] Além da escolha das células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de bloqueios incluem modo de crescimento, formulação de meios, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Foram propostos vários métodos para alterar o padrão de glicosilação alcançado em um organismo hospedeiro em particular, incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patentes Norte-Americanas Nº.

5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, podem ser removidos enzimaticamente da glicoproteína,

por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser modificada geograficamente para ser defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Essas e outras técnicas similares são bem conhecidas na técnica.

[00178] Outros métodos de modificação incluem o uso de técnicas de acoplamento técnico, incluindo, porém, não limitado a, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. Modificações podem ser usadas, por exemplo, para anexar marcadores para imunoensaio. Os polipeptídeos — modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser analisados usando ensaios padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo e nos Exemplos.

[00179] Outras modificações de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT No. WO 99/58572. Esses anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direcionado à molécula alvo, um domínio efetor com uma sequência de aminoácidos substancialmente homóloga a toda ou parte de uma região constante de uma imunoglobulina humana de cadeia pesada. Esses anticorpos são capazes de se ligar à molécula alvo sem desencadear lise significativa dependente do complemento ou destruir o alvo mediado por células. Em algumas situações, o domínio efetor é capaz de ligar FcRn e/ou FeyRilb. Estes são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios de Cadeia Pesada Cx2 de imunoglobulina humana. Os anticorpos modificados dessa maneira são particularmente adequados para uso em terapia de anticorpos crônica, para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas à terapia de anticorpos convencional.

[00180] A invenção inclui modalidades de afinidades amadurecidas.

Por exemplo, anticorpos de afinidade amadurecida podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al, Bio/Technology, 10:779 a 783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809 a 3813, 1994; Schier et al/., Gene, 169:147 a 155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994 a 2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889 a 896, 1992; e Publicação PCT Nº. WO2004/058184).

[00181] Os métodos a seguir podem ser usados para ajustar a afinidade de um anticorpo e para caracterizar uma CDR. Uma maneira de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como melhorar) a afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denomina-se "mutagênese por varredura de biblioteca". Geralmente, a mutagênese por varredura de biblioteca funciona da seguinte maneira. Uma ou mais posições de aminoácidos na CDR são substituídas por dois ou mais (como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) aminoácidos usando métodos reconhecidos na técnica. Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de aminoácido analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos forem substituídos em todas as posições). Geralmente, a biblioteca também inclui um clone que compreende o aminoácido nativo (não substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20 a 80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca, são analisados quanto à ligação de afinidade ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo de ligação), e candidatos com aumento, diminuição, iguais, ou nenhuma ligação é identificada. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são bem conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada usando a análise de ressonância plasmônica de superfície Biacore'Y, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de duas vezes ou mais. O Biacore"" é particularmente útil quando o anticorpo inicial já se liga a uma afinidade relativamente alta, por exemplo, um Kp de cerca de 10 nM ou menos. À análise usando ressonância plasmônica de superfície Biacore"" é descrita nos Exemplos, neste documento.

[00182] A afinidade de ligação pode ser determinada usando o Biocensor Kinexa, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), extinção por fluorescência, transferência de fluorescência, e/ou exibição de leveduras. A afinidade de ligação também pode ser analisada usando um bioensaio adequado.

[00183] Em algumas modalidades, toda posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas ocasiões, uma de cada vez) com todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidos na arte (alguns dos quais são descritos neste documento). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas ocasiões, uma para cada posição de aminoácido analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoácidos forem substituídos em todas as posições).

[00184] Em algumas modalidades, a biblioteca a ser analisada compreende substituições em duas ou mais posições, que podem estar na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Assim, a biblioteca pode compreender substituições em duas ou mais posições em uma CDR. À biblioteca pode compreender a substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender a substituição em 3, 4, 5 ou mais posições, posições mencionadas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando códons de baixa redundância. Veja, por exemplo, Table 2 of Balint et al., Gene 137(1):109 a 18, 1993.

[00185] O CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. O CDR pode ser um ou mais CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3. O CDR pode ser um CDR Kabat, um CDR Chothia ou um CDR estendido.

[00186] Os candidatos com ligação melhorada podem ser sequenciados, identificando assim um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade melhorada (também denominada substituição "melhorada"). Os candidatos que se ligam também podem ser sequenciados, identificando assim uma substituição de CDR que retém a ligação.

[00187] Múltiplas rodadas de análise podem ser realizadas. Por exemplo, candidatos (cada um que compreende uma substituição de aminoácidos em uma ou mais posições de uma ou mais CDR) com ligação aprimorada também são úteis para o design de uma segunda contendo pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posição CDR melhorada (isto é, posição de aminoácidos na CDR na qual um mutante de substituição mostrou ligação melhorada). À preparação, a análise ou a seleção desta biblioteca é descrita mais adiante.

[00188] A mutagênese por varredura de biblioteca também fornece um meio para caracterizar uma CDR, na medida em que a frequência de clones com ligação melhorada, a mesma ligação, ligação reduzida ou sem ligação também fornece informações relacionadas à importância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anticorpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando alterada para todos os 20 aminoácidos, essa posição é identificada como uma posição que dificilmente será necessária para ligação a antígeno. Por outro lado, se uma posição da CDR reter a ligação apenas em uma pequena percentagem de substituições, essa posição será identificada como uma posição importante para a função da CDR. Assim, os métodos de mutagênese por varredura de bibliotecas geram informações sobre posições nas CDRs que podem ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que não podem ser alteradas ou que só podem ser alteradas para alguns aminoácidos.

[00189] Candidatos com afinidade aprimorada podem ser combinados em uma segunda biblioteca, que inclui o aminoácido aprimorado, o aminoácido original nessa posição, e pode incluir ainda substituições adicionais nessa posição, dependendo da complexidade da biblioteca desejada, ou é permitido usando o método de análise ou seleção desejado. Além disso, se desejado, a posição adjacente de aminoácido pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR mutante, o que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um número maior de mutações melhoradas. A biblioteca também pode incluir substituição em posições que não mostraram afinidade aprimorada no primeiro ciclo de análise.

[00190] A segunda biblioteca é analisada ou selecionada para membros da biblioteca com afinidade de ligação alterada e/ou aprimorada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo a análise usando a análise de ressonância plasmônica de superfície Biacore'Y e a seleção usando qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo exibição de fagos, exibição de leveduras e exibição de ribossoma.

[00191] A invenção também abrange proteínas de fusão que compreendem um ou mais fragmentos ou regiões dos capítulos desta invenção. Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável de Cadeia Leve mostrada na SEQ ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, ou 232, e/ou pelo menos 10 aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID Nº: 2, 4,6,8,10,

12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211,213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, ou 233. Em outras modalidades, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25 ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região variável de cadeia leve e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região variável de Cadeia Pesada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s). Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 (VH CDR3) e/ou CDR L3 (VL CDR3). Para os fins desta invenção, uma proteína de fusão contém uma ou mais sequências de aminoácidos às quais não está ligada à molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região. Sequências heterólogas exemplares incluem, porém, não estão limitadas a um "marcador", como um marcador FLAG ou um marcador 6His. Marcadores são bem conhecidos na técnica.

[00192] Um polipeptídeo de fusão pode ser criado por métodos conhecidos na técnicaa por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão desta invenção são produzidas através da preparação de um polinucleotídeo que as codifica usando métodos recombinantes aqui descritos, embora elas também possam ser preparadas por outros métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, síntese química.

[00193] Esta invenção também fornece composições que compreende anticorpos conjugados (por exemplo, ligado) a um agente que facilita o acoplamento a um suporte sólido (como biotina ou avidina). Para simplicidade, será feita referência geralmente aos anticorpos com o entendimento de que esses métodos se aplicam a qualquer um dos anticorpos FLT3 descritos aqui. Conjugação geralmente refere-se à ligação desses componentes como descrito neste documento. A ligação (que geralmente fixa esses componentes em associação próxima pelo menos para administração) pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, como um grupo amino ou sulfidrila, em que um pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbornila, como um anidrido ou um halogeneto de ácido, ou o outro com um grupo alquila contendo um bom grupo de saída (por exemplo, um haleto).

[00194] A invenção também fornece polinucleotídeos isolados que codificam os vetores da invenção, vetores e células hospedeiras que compreendem o polinucleotídeo.

[00195] Por consequência, a invenção fornece polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas), que compreendem polinucleotídeos que codificam qualquer um dos seguintes: P4F6, P4C7, P3A, PS5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, POSBOGEE, PO4A0A, PO1AO5, PO8BO3, P5F7, P5F7g9, P1IOAO02g9, P1IOAO4g9, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10BO06g, P5F792, PS5F793, PSF794, ou qualquer fragmento ou parte dele com capacidade de se ligar a FLT3.

[00196] Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos que codificam qualquer dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos aqui descritos, tais como anticorpos e polipeptídeos que possuem função efetiva prejudicada. Polinucleotídeos podem ser produzidos e expressos por procedimentos conhecidos na técnica.

[00197] Em outro aspecto, a invenção fornece composições (como composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos da invenção. Em algumas combinações, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos descritos aqui.

[00198] Os vetores de expressão e administração de composições polinucleotídicas são ainda descritos aqui.

[00199] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos.

[00200] Os polinucleotídeos complementares a qualquer uma dessas sequências também são abrangidos pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificação ou antessentido) ou fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômica, cCcDNA ou sintética) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de uma maneira individual, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências de codificação ou não codificação adicionais podem estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, porém não necessita, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

[00201] —Polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou pode compreender uma variante de tal sequência. Variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções de modo que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída, com relação a uma molécula imunoreativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado como descrito neste documento. Variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de identidade para uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção do mesmo.

[00202] Duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas ser "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhadas para correspondência máxima como descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando-se as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação" como usado aqui, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguais, geralmente 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem idealmente alinhadas.

[00203] Alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no Lasergene suite of bioinformatics software (DNASTAR, Inc. Madison, WI), usando parâmetros padrão. Este programa incorpora diversos esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, EW. e Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

[00204] Preferiveimente, a "percentagem de identidade de sequência" é determinada comparando duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos, geralmente 5 a 15 por cento, ou a 12 por cento, quando comparado a sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A percentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais as bases de ácido nucleico idênticas ou resíduos de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (isto é o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência.

[00205] As variantes podem também, ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridar sob condições moderadamente rigorosas para uma sequência de DNA de ocorrência natural, codificando um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).

[00206] "Condições moderadamente rigorosas" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS a 0,5%, EDTA a 1,0 mM (pH 8,0); hibridando a 50ºC a 65ºC, 5 X SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65ºC durante 20 minutos com cada de 2X, 0,5X e 0,2XK SSC contendo SDS a 0,1%.

[00207] Como usado aqui, "condições altamente rigorosas" ou "condições de alta rigorosidade" são aquelas que: (1) empregam Baixa intensidade iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015 M / citrato de sódio a 0,0015 M / dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50ºC; (2) empregam durante hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v)

com albumina de soro bovino a 0,1% / Ficoll a 0,1% / polivinilpirrolidona a 0,1% / tampão de fosfato de sódio a 50 mM em pH 6,5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42ºC; ou (3) empregam formamida a 50%, 5 x SSC (NaCl a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão tratado com ondas sonoras (50 ug/ml), SDS a 0,1% SDS, e sulfato de dextrana a 10% a 42ºC, com lavagens a 42ºC em 0,2 x SSC (cloreto de sódio / citrato de sódio) e formamida a 50% a 55ºC, seguido por uma lavagem de alta rigorosidade que consiste em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55ºC. O técnico versado reconhecerá o quanto deve ajustar a temperatura, intensidade iônica, etc. quando necessário para acomodar fatores tal como comprimento da sonda e similares.

[00208] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como um resultado da degeneração do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo como descrito neste documento. Alguns destes polinucleotídeos apresentam homologia mínima com a sequência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, polinucleotídeos que variam devido a diferenças em uso do códon são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeo fornecidas aqui se incluem no escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mMRNA e proteína resultantes, podem, porém não necessitam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tal como hibridação, amplificação e/ou comparação de sequência da base de dados).

[00209] Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Métodos de síntese de polinucleotídeo químicos são bem conhecidos na técnica e não é necessário descrevê-los em detalhes aqui. Alguém versado na técnica pode usar as sequências fornecidas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.

[00210] Para preparar polinucleotidecos usando — métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, com também aqui descrito. Polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer método conhecido na técnica. Células são transformadas introduzindo um polinucleotídeo exógeno por captação direta, endocitose, transfecção, F-acasalamento ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo desse modo amplificado pode ser isolado da célula hospedeiro por métodos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et a/., 1989.

[00211] —Alternativamente, PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita nas Patentes Norte-Americanas Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, assim como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[00212] RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica-se e o DNA é transcrito no RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, como mencionado em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

[00213] Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão, ou podem ser selecionados de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado pode variar de acordo com a célula hospedeiro destinada a ser usada, vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de autorreplicar-se, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular, e/ou podem transportar genes para um marcador que podem ser usados na seleção de clones que contêm o vetor. — Exemplos adequados incluem plasmídeos e viroses bacterianas, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp119, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago, e vetores de transporte, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis de vendedores comerciais, tais como, BioRad, Strategene e Invitrogen.

[00214] Vetores de expressão geralmente são construções de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequadas incluem, porém não estão limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo — adenoviroses, viroses adenoassociadas, retroviroses, cosmídeos, e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT No. WO 87/04462. Os componentes de vetor podem geralmente incluir, porém não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal; uma origem de replicação; um ou mais marcadores de genes; elementos sde controle transcricional adequados (tais como promotores, realçadores e terminadores). Para expressão (isto é, translação), um ou mais elementos de controle translacional são também geralmente requeridos, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de iniciação de translação, e códons de interrupção.

[00215] Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer dentre vários métodos apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana, ou outras substâncias; bombardeio de microprojetil; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como o vírus da vacínia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos frequentemente dependerá de aspectos da célula hospedeira.

[00216] A invenção também fornece células hospedeiras compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas com o objetivo de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitados a células COS, HeLa e CHO. Veja também a Publicação PCT Nº WO 87/04462. As células hospedeiras não mamiíferas adequadas incluem procariotos (como E. coli ou B. subtillis) e leveduras (como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). De preferência, as células hospedeiras expressam os cDNAs a um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferencialmente, 10 vezes mais alto, ainda mais preferencialmente, 20 vezes mais alto que o do anticorpo ou proteína endógena correspondente de interesse, se presente, nas células hospedeiras. O rastreio das células hospedeiras quanto a uma ligação específica ao FLT3 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou a proteína de interesse pode ser identificada. Métodos de Uso dos Anticorpos FLT3

[00217] Os anticorpos da presente invenção são úteis em várias aplicações, incluindo, entre outros, métodos de tratamento terapêutico e métodos de tratamento de diagnóstico.

[00218] Os anticorpos (por exemplo, monoespecíficos e biespecíficos) obtidos pelos métodos descritos acima podem ser utilizados como um medicamento. Em algumas modalidades, esse medicamento pode ser usado para o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de origem hematopoiética, como um linfoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é neoplasia maligna de células plasmáticas maligna do mieloma, linfoma de Hodgkin, linfócito nodular predominante, linfoma de Hodgkin predominante, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma não-Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células de revestimento, linfoma de células grandes, linfoma precursor do linfócito B, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tecido linfático associado à mucosa, linfoma de células pequenas linfocíticas, linfoma de células de revestimento, linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes mediastinal primário (tímico), linfoma linfoplasmoctático, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênico, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células/histiócitos, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma cutâneo difuso cutâneo primário de grandes células (tipo perna), Linfoma difuso de células B grandes positivas para EBV dos idosos, linfoma de células B grandes difuso associado à inflamação, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de células B grandes ALK positivo, linfoma plasmático-plasmático, linfoma de células B grandes surgido em doença de Castleman multicêntrica associada a HHVB8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico ou outros cânceres relacionados a células hematopoiéticas. Em uma modalidade preferida, o câncer é AML. Em uma modalidade preferida, o câncer é ALL.

[00219] Em algumas modalidades, é fornecido um método para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas expressando FLT3, compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) como aqui descrito. Em outras modalidades, é fornecido um método para inibir a metástase de células que expressam FLT3 em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3), como aqui descrito. Em outras modalidades, é fornecido um método para induzir a regressão tumoral em células malignas em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3), como aqui descrito.

[00220] Em algumas modalidades, o anticorpo (por exemplo, anticorpo biespecífico FLT3-CD3) de acordo com a invenção pode ser usado na fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer em um paciente que dele necessite.

[00221] Em algumas modalidades, o tratamento pode estar em combinação com uma ou mais terapias contra um câncer selecionado do grupo que consiste em terapia com anticorpos, quimioterapia, terapia com citocinas, terapia direcionada, terapia com vacina, terapia com células dendríticas, terapia genética, terapia hormonal, ressecção cirúrgica, terapia com luz laser e radioterapia.

[00222] Em algumas modalidades, a citocina usada na terapia de citocinas é interleucina (IL) - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17. Em algumas modalidades, a citocina é IL-15, IL-12 ou IL-

2. Por exemplo, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção são administrados a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) com IL-15 do tipo selvagem (por exemplo, número de acesso:> sp|P40933/49-162 ou SEQ ID Nº: 293).

[00223] Em algumas modalidades, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção são administrados a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) tratamento com um agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo, incluindo mas não limitado a, um anticorpo anti- CTLA-4, um anticorpo anti-4-1BB (por exemplo, PF-04518600), um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, nivolumabe, pembrolizumabe ou PF- 06801591), um anticorpo anti -PD-L1 (por exemplo, avelumabe, atezolizumabe ou durvalumabe), um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-LAG3, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo IL-8, um anticorpo anti-HVEM, um anticorpo anti-BTLA, um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-CD40L, anticorpo anti-CD47, um anticorpo anti-CSF1IR, um anticorpo anti-cCSF1, um anticorpo anti- MARCO, um anticorpo anti-CXCRA4, um anticorpo anti-VEGFR1, um anticorpo anti-VEGFR2, um anticorpo anti-TNFR1, um anticorpo anti- MCSF (por exemplo, PD-0360324), um anticorpo anti-TNFR2, um anticorpo biespecífico anti-CD3, um anticorpo anti-CD19, um anti-CD20, um anticorpo anti-Her2, um anticorpo anti-EGFR, um anticorpo anti- ICOS, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD 52, um anticorpo anti-CCR4, um anti-CCR8, anticorpo anti-CD200R, anticorpo anti- VISGA, anticorpo anti-CCR2, anticorpo anti-LILRb2, anticorpo anti- CXCRA, anticorpo anti-CD206, anticorpo anti-CD163, anticorpo anti- KLRG1 anticorpo, um anticorpo anti-B7-H4, um anticorpo anti-B7-H3 ou um anticorpo anti-GITR.

[00224] Em algumas modalidades, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção são administrados a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) tratamento com um antagonista de CCR2 (por exemplo, INC-8761), um agente antiviral, cidofovir e interleucina-2, tratamento com citarabina (também conhecido como ARA-C) ou nataliziimabe para pacientes com EM ou tratamento com efaliztimabe para pacientes com psoríase ou outros tratamentos para pacientes com LMP. Em algumas modalidades, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção podem ser utilizados em combinação com quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores (como ciclosporina, azatioprinay metotrexato, micotenolato e FK506) ou outros agentes imunoablativos tais como CAMPATH, citotoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e/ou irradiação. Esses fármacos inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibem a p70S6 cinase que é importante para a sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina). Em outras modalidades, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção podem ser utilizados em combinação com inibidores de cinase, incluindo, mas não se limitando a, inibidores de mTOR, midostaurina, lestaurtinibe, sorafenibe,

sunitinibe, quizartinibe, ponatinibe, crenolanibe, palbociclibe e gilteritinibe.

[00225] Em algumas modalidades, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção também podem ser usados em combinação com moduladores epigenéticos, inibidores de proteassoma, agentes imunomoduladores (por exemplo, lenalidomida), inibidores de Hedgehog, TNFa (fator de necrose tumoral alfa), Inibidores de PAP (ácido fosfatídico fosfatase), vírus oncolíticos, inibidores de IDO (indoleamina-pirrole 2,3-dioxigenase), inibidores de glutaminase GLS1, vacinas tumorais, agonistas de TLR (receptor de tipo toll) (por exemplo, TLR3, TLR4, TLR5, TLR5, TLR5, ou TLR9) ou inibidores da isocitrato desidrogenase (IDH).

[00226] Em uma modalidade adicional, os anticorpos FLT3 (por exemplo, anticorpos biespecíficos FLT3-CD3) da presente invenção são administrados a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante de medula óssea, células CART (Receptor de Antígeno T Quimérico), Terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos como fludarabina, radioterapia por feixe externo (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos como OKT3 ou alemtuzumabe.

[00227] A administação dos anticorpos (por exemplo, monoespeciíficos ou biespecíficos) de acordo com a invenção pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação, injeção, ingestão, transfusão, implante ou transplante de aerossol. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intracraniana, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa ou intralinfática ou intraperitoneal. Em uma modalidade, as composições de anticorpos da invenção são preferencialmente administradas por injeção intravenosa.

[00228] Em algumas modalidades, a administração dos anticorpos

(por exemplo, monoespecíficos ou biespecíficos) pode compreender administração de, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg por kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros de mg por kg dentro desses intervalos. Em algumas modalidades, a administração dos anticorpos pode compreender a administração de cerca de 0,1 a 10 mg por kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros de mg por kg dentro desses intervalos. O anticorpo pode ser administrado em uma ou mais doses. Em algumas modalidades, a referida quantidade eficaz do anticorpo pode ser administrada como uma dose única. Em algumas modalidades, a referida quantidade eficaz de anticorpos pode ser administrada como mais de uma dose durante um período de tempo. O momento da administração está dentro do julgamento do médico responsável e depende da condição clínica do paciente. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de faixas ideais de quantidades efetivas de um determinado anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespecífico) para uma doença ou condições específicas, dentro dos conhecimentos da técnica. Uma quantidade eficaz significa uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático. A dosagem administrada dependerá da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simultâneo, se houver, frequência do tratamento e natureza do efeito desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de anticorpo ou composição heteromultimérica compreendendo esses anticorpos é administrada parentericamente. Em algumas modalidades, a administração pode ser uma administração intravenosa. Em algumas modalidades, a administração pode ser feita diretamente por injeção dentro de um tumor.

[00229] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-FLT3 aqui fornecidos podem ser utilizados para fins de diagnóstico, como em ensaios para identificar a proteína FLT3 em amostras (por exemplo, em ensaios imuno-histoquímicos) ou em pacientes.

Composições

[00230] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo (por exemplo, monoespeciífico ou biespecífico) da invenção ou porção da mesma como descrito acima em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, os polipeptídeos da invenção podem estar presentes em uma forma neutra (incluindo formas iônicas de zwitter) ou como uma espécie carregada positiva ou negativamente. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser complexados com um contraíon para formar um "sal farmaceuticamente aceitável", que se refere a um complexo compreendendo um ou mais polipeptídeos e um ou mais contraíons, em que os contraíons são derivados de ácidos orgânicos e inorgânicos e farmaceuticamente aceitáveis e bases.

[00231] O anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespeciífico) ou porções do mesmo, pode ser administrado sozinho ou em combinação com um ou mais outros polipeptídeos da invenção ou em combinação com um ou mais outros fármacos (ou como qualquer combinação dos mesmos). As composições farmacêuticas, métodos e usos da invenção também englobam modalidades de combinações (coadministração) com outros agentes ativos, conforme detalhado abaixo.

[00232] Quando aqui usados, os termos "coadministração", "coadministrado" e "em combinação com", referentes aos anticorpos da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos, pretendem significar e referem-se a e incluem o seguinte: (i) administração simultânea de tal combinação de um anticorpo aqui descrito e agente(s) terapêutico(s) a um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma forma de dosagem única que libera os referidos componentes substancialmente ao mesmo tempo para o referido paciente; (ii) administração substancialmente simultânea de tal combinação de um anticorpo descrito neste documento e agente(s) terapêutico(s) a um paciente em necessidade de tratamento, quando esses componentes são formulados separados um do outro em formas de dosagem separadas, que são tomadas substancialmente ao mesmo tempo por referido paciente, após o que os referidos componentes são libertados substancialmente ao mesmo tempo para o referido paciente; (iii) administração sequencial de tal combinação de um anticorpo aqui descrito e agente(s) terapêutico(s) a um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados separados um do outro em formas de dosagem separadas, que são tomadas em tempos consecutivos pelo referido paciente com um intervalo de tempo significativo entre cada administração, após o que os referidos componentes são liberados em momentos substancialmente diferentes para o referido paciente; e (iv) administração sequencial de tal combinação de um anticorpo descrito neste documento e agente(s) terapêutico(s) a um paciente necessitado de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma forma de dosagem única que libera os referidos componentes de uma maneira — controlada, quando eles são simultaneamente, consecutivamente e/ou sobrepostos, liberados no mesmo e/ou em momentos diferentes para o referido paciente, em que cada parte pode ser administrada pela mesma ou por uma via diferente.

[00233] Geralmente, o anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespecífico) descrito aqui ou porções do mesmo é adequado para ser administrado como uma formulação em associação com um ou mais excipiente (s) farmaceuticamente aceitável (s). O termo 'excipiente' é usado aqui para descrever qualquer ingrediente diferente do(s) composto(s) da invenção. A escolha do (s) excipiente (s) dependerá em grande medida de fatores como o modo particular de administração, do efeito do excipiente na solubilidade e estabilidade e da natureza da forma de dosagem. Quando aqui usado, "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e similares que são fisiologicamente — compatíveis. Alguns exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou eficácia do anticorpo.

[00234] As composições farmacêuticas da presente invenção e os métodos para a sua preparação serão facilmente evidentes para aqueles versados na técnica. Tais composições e métodos para a sua preparação podem ser encontrados, por exemplo, na Remington's Pharmaceutical Sciences, 19º edição (Mack Publishing Company, 1995). As composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições de GMP.

[00235] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser preparada, embalada ou vendida a granel, como uma dose unitária única ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Quando aqui usado, uma "dose unitária" é uma quantidade discreta da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada a um indivíduo ou a uma fração conveniente de tal dosagem, como, por exemplo, metade ou um terço dessa dose. Qualquer método para administrar peptídeos, proteínas ou anticorpos aceitos na técnica pode ser adequadamente empregado para as proteínas heterodiméricas e suas porções aqui descritas.

[00236] As composições farmacêuticas da invenção são tipicamente adequadas para administração parentérica. Quando aqui usado, "administração parenteral" de uma composição farmacêutica inclui qualquer via de administração caracterizada por violação física de um tecido de um indivíduo e administração da composição farmacêutica através da ruptura no tecido, resultando geralmente na administração direta na corrente sanguínea, no músculo ou em um órgão interno. À administração parentérica inclui assim, mas não está limitada a administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de uma ferida não cirúrgica que penetra nos tecidos e similares. Em particular, a administração parentérica é considerada incluir, mas não se limita a, injeção — subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraniana, intrassinovial ou infusões; técnicas de infusão dialítica renal. As modalidades preferidas incluem as vias intravenosa e subcutânea.

[00237] Asformulações de uma composição farmacêutica adequada para administração parentérica geralmente compreendem o ingrediente ativo combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, como água estéril ou solução salina isotônica estéril. Tais formulações podem ser preparadas, embaladas ou vendidas em uma forma adequada para administração em bolo ou para administração contínua. As formulações injetáveis podem ser preparadas, embaladas ou vendidas na forma de dosagem unitária, como em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas contendo um conservante. As formulações para administração parentérica incluem, mas não estão limitadas a suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e similares.

Tais formulações podem ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais, incluindo, entre outros, agentes de suspensão, estabilização ou dispersão.

Em uma modalidade de uma formulação para administração parenteral, o ingrediente ativo é fornecido na forma seca (isto é, em pó ou granular) para reconstituição com um veículo adequado (por exemplo, água livre de pirogênio estéril) antes da administração parentérica da composição reconstituída.

As formulações parentéricas também incluem soluções aquosas que podem conter excipientes, como sais, carboidratos e agentes tamponantes (preferencialmente a um pH de 3 a 9), mas, para algumas aplicações, elas podem ser mais adequadamente formuladas como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser usada em conjunto com um veículo adequado, como água estéril e livre de pirogênio.

Formas de administração parentérica exemplares incluem soluções ou suspensões em soluções aquosas estéreis, por exemplo, soluções aquosas de propileno glicol ou dextrose.

Tais formas de dosagem podem ser adequadamente tamponadas, se desejado.

Outras formulações administráveis pelos pais que são úteis incluem aquelas que compreendem o ingrediente ativo na forma microcristalina, ou em uma preparação lipossômica.

As formulações para administração parentérica podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada.

As formulações de liberação modificada incluem formulações de liberação controlada, retardada, prolongada, pulsada, direcionada e programada.

Por exemplo, em um aspecto, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando a proteína heterodimérica, por exemplo, anticorpo biespecífico, na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada anteriormente estéril do mesmo. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00238] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ideal desejada. Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, quando aqui usada, refere- se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes/indivíduos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é geralmente ditada e diretamente dependente (a) das características únicas do agente quimioterapêutico e do efeito terapêutico ou profilático específico a ser alcançado; e (b)

das limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

[00239] Assim, o técnico versado na técnica apreciaria, com base na descrição aqui fornecida, que o regime de dose e dosagem é ajustado de acordo com métodos bem conhecidos nas técnicas terapêuticas. Ou seja, a dose máxima tolerável pode ser facilmente estabelecida e a quantidade eficaz que fornece um benefício terapêutico detectável ao paciente também pode ser determinada, assim como os requisitos temporais para administrar cada agente para fornecer um benefício terapêutico detectável ao paciente. Por conseguinte, embora certos regimes de dose e administração sejam aqui exemplificados, esses exemplos de forma alguma limitam o regime de dose e administração que pode ser fornecido a um paciente na prática da presente invenção.

[00240] Deve-se notar que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada e podem incluir doses únicas ou múltiplas. Deve ser entendido ainda que, para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem aqui estabelecidos são exemplares apenas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada. Além disso, o regime de dosagem com as composições desta invenção pode ser baseado em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de doença, idade, peso, sexo, condição médica do paciente, gravidade da condição, via de administração, e o anticorpo particular empregado. Assim, o regime de dosagem pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente usando métodos padrão. Por exemplo, as doses podem ser ajustadas com base em parâmetros farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, que podem incluir efeitos clínicos, como efeitos tóxicos e/ou valores laboratoriais. Assim, a presente invenção abrange a escalada de dose intrapaciente como determinado pelo técnico versado na técnica. A determinação de dosagens e regimes apropriados é bem conhecida na técnica relevante e deve ser entendida como abrangida pelo técnico versado na técnica, uma vez fornecidos os ensinamentos aqui descritos.

[00241] Geralmente, para administração dos anticorpos descritos aqui (monoespecíficos ou biespecíficos), a dosagem candidata pode ser administrada diariamente, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas, a cada oito semanas, a cada dez semanas, a cada doze semanas ou mais do que a cada doze semanas. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exemplo, para reduzir os sintomas associados ao câncer. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo monoespecífico ou biespecífico anti- FLT usado) pode variar ao longo do tempo.

[00242] Em algumas modalidades, a dosagem candidata é administrada diariamente com uma dosagem variando entre cerca de 1 vg/kg a 30 pug/kg a 300 po/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem diária de cerca de 0,01 mg/Kg, cerca de 0,03 mg/Kg, cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg e cerca de 25 mg/kg pode ser utilizada.

[00243] Em algumas modalidades, a dosagem candidata é administrada todas as semanas com uma dosagem variando de 1 ug/Kkg a 30 ug/kg a 300 ug/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, uma dose semanal de cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 25 mg/kg e cerca de mg/kg pode ser utilizada.

[00244] Em algumas modalidades, a dosagem candidata é administrada a cada duas semanas, com a dosagem variando entre 1 ug/kg a 30 ug/kg a 300 ug/kg a 300 mg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, uma dose bissemanal de cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 25 mg/kg e cerca de 30 mg/kg pode ser utilizada.

[00245] Em algumas modalidades, a dosagem candidata é administrada a cada três semanas, com a dosagem variando de cerca de 1 ug/kg a 30 ug/kg a 300 ug/kg a 300 mg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, uma dosagem trissemanal de cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/Kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg e cerca de 50 mg/kg pode ser utilizada.

[00246] Em algumas modalidades, a dosagem candidata é administrada todos os meses ou a cada quatro semanas, com a dosagem variando de 1 ug/kg a 30 ug/kg a 300 upg/kg a 3 mg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, uma dosagem mensal de cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg,

cerca de 3 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg e cerca de 50 mg/kg pode ser utilizada.

[00247] Em outras modalidades, a dosagem candidata é administrada diariamente com a dosagem variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 1200 mg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem diária de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 1 mg, cerca de 10 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg ou cerca de 1200 mg pode ser utilizada.

[00248] Em outras modalidades, a dosagem candidata é administrada toda semana com a dosagem variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 2000 mg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem semanal de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 1 mg, cerca de 10 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg ou cerca de 2000 mg pode ser utilizada.

[00249] Em outras modalidades, a dosagem candidata é administrada a cada duas semanas com a dosagem variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 2000 mg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem bissemanal de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 1 mg, cerca de 10 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg ou cerca de 2000 mg pode ser utilizada.

[00250] Em outras modalidades, a dosagem candidata é administrada a cada três semanas com a dosagem variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 2500 mg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem trissemanal de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 1 mg, cerca de 10 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg ou cerca de 2500 mg pode ser utilizada.

[00251] Em outras modalidades, a dosagem candidata é administrada a cada quatro semanas ou mês, com a dosagem variando de cerca de 0,01 mg a cerca de 3000 mg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem mensal de cerca de 0,01 mg, cerca de 0,1 mg, cerca de 1 mg, cerca de 10 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg ou cerca de 3000 mg pode ser utilizada. Kits

[00252] A invenção também fornece kits para uso nos métodos instantâneos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo o anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespecífico), conforme descrito aqui e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos. Geralmente, estas instruções compreendem uma descrição da administração da proteína anticorpo para os tratamentos terapêuticos descritos acima.

[00253] As instruções relacionadas ao uso do anticorpo (por exemplo, monoespecífico ou biespecífico), como aqui descrito, geralmente incluem informações sobre dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens com múltiplas doses) ou doses de subunidades. As instruções fornecidas nos kits da invenção são geralmente instruções escritas em um rótulo ou encarte de embalagem (por exemplo, uma folha de papel incluída no Kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitável.

[00254] Os kits destainvenção estão em embalagens adequadas. À embalagem adequada inclui, mas não está limitada a frasconetes, garrafas, frascos, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico) e similares. Também são consideradas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, como um inalador, um dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo biespecífico. O recipiente pode ainda compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.

[00255] Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais, como tampões e informações interpretativas. Normalmente, O kit compreende um recipiente e um rótulo ou encarte de embalagem ou associados ao recipiente.

Depósito Biológico

[00256] Os materiais representativos da presente invenção foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, em 1º de junho de 2017. O vetor PS5F7g2-VL com o número de acesso ATCC PTA-124230 é um polinucleotídeo codificando a região variável da cadeia leve de P5F792 e o vetor PSF7g2-VH com o número de acesso ATCC PTA-124229 é um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada de P5F792. Os depósitos foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimentos e regulamentos de patentes (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e indivíduo a um acordo entre a Pfizer, Inc. e a ATCC, que garante disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante a emissão de a patente pertinente dos USA ou ao abrir ao público qualquer pedido de patente americano ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie para uma determinada pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks ter direito a isto de acordo com 35 USC $ 122 e as regras do Comissário nos termos do mesmo (incluindo 37 C.F.R. 8 1.14 com referência particular a 886 OG 638).

[00257] O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais depositados morrer ou for perdida ou destruídos quando cultivados em condições adequadas, os materiais serão imediatamente substituídos mediante notificação por outro dos mesmos. A disponibilidade do material depositado não deve ser interpretada como uma licença para praticar a invenção em violação dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo, de acordo com suas leis de patentes.

[00258] Também é feita referência a um material aqui descrito e depositado na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, em 1º de junho de 2017. Vetor PE310-VL com número de acesso ATCC PTA-124228 é um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia leve PE310,e o vetor P3E10-VH com o número de acesso ATCC. PTA-124227 é um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada do PE310. Os depósitos também foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, de acordo com os termos e condições do mesmo, conforme resumido acima.

[00259] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas neste documento, tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e se enquadram no escopo das reivindicações anexas. Exemplos Exemplo 1: Determinação da cinética e afinidade das interações de anticorpos humanos FLT3/FLT3 a 37 ºC

[00260] Este exemplo determina a cinética e a afinidade de vários anticorpos anti-FLT3 a 37ºC. Todas as experiências foram realizadas em um biossensor de ressonância de Plasmônio superficial Biacore T200 (GE Lifesciences, Piscataway NJ).

[00261] A preparação do chip sensor foi realizada a 25ºC com um tampão de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,05% (v/v) de Tween-20, pH 7,4. Um chip sensor anti-Fc humano foi produzido ativando todas as células de vazão de um chip sensor Biacore CM4 com uma mistura 1:1 (v/v) de EDC 400 mM e NHS 100 mM por 7 minutos, a uma taxa de vazão de 10 ul/min. Um reagente Fc anti-humano (IgG Fc humano anticabra, Southern Biotech Catálogo tt 2081-01) foi diluído para 30 upg/mL em acetato de sódio 10 mM pH 4,5 e injetado em todas as células de vazão por 7 minutos a 20 ul/min. Todas as células de vazão foram bloqueadas com etilenodiamina 100 mM em tampão borato 150 mM pH 8,5 por 7 minutos a 10 uL/min.

[00262] As experiências foram realizadas a 37ºC usando um tampão fluente de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 a 0,05% (v/v), Tween-20, pH 7,4, 1 mg/ml de BSA. Os anticorpos FLT3 foram capturados de sobrenadantes não diluídos nas células de vazão a jusante (células de vazão 2, 3 e 4) a uma taxa de vazão de 10 uL/min por 1 minuto. Diferentes anticorpos foram capturados em cada célula de vazão. A célula de vazão 1 foi usada como superfície de referência. Após a captura dos anticorpos FLT3, o analisado (tampão, hFLT3) foi injetado a 30 ul/min em todas as células de vazão por dois minutos. Após a injeção do analisado, a dissociação foi monitorada por 10 minutos, seguida pela regeneração de todas as células de vazão com três injeções de 1 minuto de ácido fosfórico 75 mM. Para cada anticorpo FLT3 capturado, foram realizadas as seguintes injeções de analisado: tampão, hFLT3 11 nM, hFLT3 33 NM, hFLT3 100 nM e hFLT3 300 NM. Os ciclos de tampão foram coletados para cada anticorpo FLT3 capturado para fins de dupla referência (dupla referência como descrito em Myszka, D.G. Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)). Os diagramas de sensor com dupla referência foram adaptados globalmente a um Langmuir 1:1 simples com modelo de ligação de transporte de massa.

[00263] Os parâmetros de cinética e afinidade para os anticorpos anti-FLT3 testados são mostrados nas Tabelas 6. Tabela 6 O ee Tee PO

1.9.99E-

1.40E+05 3.50E-03 |33 25 36.1 1.32E+05 03 5.8 151 [eeer | 4 [remos [1aeos dos dir [aaa Jannenos Íreeos dz = [196 | [em | 2 Josamos fooacos [199 fo | fronesos [neros [eso [mer | [es | a [1s0mos amem dos dir | Jazseos amem dos Jus | [ese | 4 frsnmos [sms 2 do | fixes ame (as [ma | [es | 4 [12eos [ssoecs dar das | James lasens das — [sos | [ema | 4 Joomecs 15050s [es 12 Jos foosesos reos er [or |

1.9.90E- P3E10 1.80E+05 | 02 106 1.72E+05 1.12E-02 |1 65.1

2.9.92E- fes [a Jens fem ls Jow | Tasens [8% To a fa 1a eos femea ls fo VÓ

2.9.92E- [eres [a formeros 1929 fo ae [eess [o [ramos [isto fr os Pg [esa | a [ssames | romas fre fog

1.9.97E- em | a fia fa fe for | Ts Ts TA [ese | so [nazesos fssonos [aa fa [etans | 5 [as0m0s oa dra dae [eras [so [rimos Ssaneos [aa re [eras | so [adeeses Jazanas far dr Lens | so fosemros fasonos fi fas [etca | 5 [uazeos fixocos [or de | fossemos Jsoen [aros [35 | less] 4 firms foco faso lo [198 Jannos bomens das = 1ory |

Exemplo 2: Morte mediada por células T de linhagens celulares AML usando o domínio de direcionamento 4 IgG biespecífico de FIt3-CD3 in vitro

[00264] Este exemplo ilustra a citotoxicidade in vitro do hlgG2AA D265A anti-FIt3/CD3 Biespecífico em células positivas para FIt3.

[00265] Os anticorpos anti-FIt3 humanos (P5F7p, P5F792, P5F792, P5F793, PSF794) e anti-CD3 humanos (h2B4-VH-hnps VL-TK ("H2B4")) foram expressos como IgG2dA D265A humano projetado com EEEE em RRR na outra subdivisão para troca biespecífica nas posições 223, 225 e 228 (por exemplo, (C223E ou C223R), (E225E ou E225R) e (P228E ou P228R)) na região da articulação e na posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração de EU)) na região CH3 da IgG2 humana (SEQ ID Nº: 236). O anticorpo biespecífico FLT3/CD3 também tem a mutação de D para A na posição 265 (esquema de numeração de EU).

[00266] As células T CD3+ da PBMC humana foram selecionadas negativamente usando o kit Pan T Cell Isolation, humano (Miltenyi, San Diego CA). As células que expressam o alvo (Eol1) e as células T CD3+ foram semeadas em de placas transparentes de base em U a 20000 e 100000 células/cavidade, respectivamente. As células foram tratadas com anticorpo biespeciífico diluído em série 8 vezes. A depleção de células AML foi determinada por análise de citometria de vazão 24 horas após o tratamento. A depleção celular foi medida em contraste com o controle de células tratadas, neste caso H2B4 apenas na Figura 1. À EC50 foi calculada pelo software Prism. Observou-se citotoxicidade nesta linhagem celular Eol1, como mostrado na Figura 1. Exemplo 3: IgG biespecífica de FIt3-CD3 induz ablação tumoral no modelo de xenoenxerto ortopédico de LMA

[00267] Este exemplo ilustra a regressão e inibição do tumor em um modelo ortotópico de xenoenxerto de Eol1.

[00268] Foirealizado um estudo de eficácia in vivo de biespecíficos de FIt3 com Eol1, expressando luciferase e GFP, modelo ortotópico. Trezentas mil células Eol1 LucGFP foram injetadas por via intravenosa através da veia da cauda em animais Nod/Scid/IL2Rg -/- (NSG) fêmeas com 6-8 semanas de idade. A injeção intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 uL por animal a 15 mg/mL), seguida de anestesia com isofluorano e subsequente imagiologia de bioluminescência do corpo inteiro (BLI) permitiu o monitoramento da carga do tumor. Os sinais bioluminescentes emitidos pela interação entre luciferase expressa pelas células tumorais e luciferina foram capturados por imagem usando um IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) e quantificados como vazão total (fótons/s) usando Living Image

4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Quando a vazão total atingiu uma média de 15E6 para todos os animais, os animais foram injetados na veia da cauda bolo com 20 milhões de células T expandidas da PBMC. Resumidamente, as células pan-T adquiridas de AllCells (Alameda, CA) foram ativadas com o Kit de Ativação/Expansão de Células T humanas (Miltenyi, San Diego, CA). Após três dias, 20 ng/ml de IL2 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany) foram adicionados a cada dois dias até o dia 11. As células foram colhidas, as esferas de ativação/expansão foram removidas magneticamente e as células foram lavadas e ressuspensas em PBS. Dois dias após a injeção das células T, os camundongos foram fotografados conforme descrito acima e os animais foram randomizados em grupos de sete camundongos: P1A5 10ug/kg (ug/kg), P4A4 10upk, P4E5 10upk, PS5F7 10upk, PS5F7 30upk e Stumpy (CD3 somente controle biespecífico a 30ug/kg). Três dias após o implante de células T, uma dose única de anti-FIt3/CD3 humano (anticorpo FLT3 conforme listado acima em uma subdivisão e o anticorpo CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) em outra subdivisão) biespecífico e negativo (NNC) o anticorpo biespecífico de controle foi administrado por injeção de veia da cauda em bolo. Os animais foram sacrificados quando exibiram paralisia dos membros posteriores, um desfecho para o modelo ortotópico de LMA. A Figura 2 mostra que uma dose única de anticorpo biespecífico anti-FIt3/CD3 humano resultou em regressão do tumor de uma maneira dependente da dose. Exemplo 4: IgGs biespecíficas de FIt3-CD3 que direcionam o domínio 4 é mais potente em comparação com às biespecíficas que direcionam o domínio 5 em um modelo de xenoenxerto ortotópico de LMA

[00269] Este exemplo ilustra a atividade tumoral melhorada dos anticorpos direcionados ao domínio 4 de FIt3 em comparação com os anticorpos direcionados ao domínio 5.

[00270] O modelo de xenoenxerto ortotópico Eol1 foi realizado como descrito no Exemplo 3. Neste caso, um 6B7 biespeciífico direcionado ao domínio 4 ou um P8b6 específico direcionado ao domínio 5 foi dosado em uma dose única de 10 upk. Stumpy representa CD3 que liga apenas o anticorpo biespecífico de controle. Na dose testada, P8B6 não apresentava atividade antitumoral, enquanto 6B7 era um tumor ablativo. Exemplo 5: Os valores de EC50 para o biespecífico de FIt3 são significativamente reduzidos na presença de IL15 em um ensaio de morte in vitro a longo prazo

[00271] Este exemplo ilustra a citotoxicidade in vitro do anticorpo biespecífico Anti-FIt3/CD3 P5F7 em células positivas FIt3i, em combinação com IL-15.

[00272] —Oslinfócitos Pan T humanos previamente congelados foram descongelados e recuperados em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro (Hyclone), Pen Strep 1% (Corning) e 15 unidades por mL de IL-2 humana (eBioscience) por um dia. Os linfócitos T humanos recuperados por 1 dia foram coletados e ressuspensos em 1 x 10º células/mlL em meio RPMI completo. As células EOL1 que expressam FIt3 foram semeadas em 50.000 células em 100 ul em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Cinquenta mil (50.000) linfócitos CD3+ humanos viáveis foram adicionados às células tumorais semeadas em ul de meio por cavidade. Foram preparadas diluições em série de 5 pontos e 5 vezes do anticorpo biespecífico FIt3/CD3 P5F7 (intervalo de doses 1x10* nM a 8 x 10º nM de concentração final). O ensaio de citotoxicidade foi iniciado adicionando anticorpo biespeciífico diluído às placas e incubando a 37 ºC por 2 dias, 5 dias ou 7 dias. Para testar o efeito de I1L15 na eficácia antitumoral de células T redirecionadas a anticorpos biespecíficos FIt3/CD3, as culturas celulares receberam 10 ng/ml de IL15 ou controle de veículo. A depleção de células AML foi determinada por análise da luciferase nos respectivos momentos. Os valores de EC50 foram determinados por gráfico de regressão não linear da citotoxicidade percentual específica versus a concentração Log10 de FIt3/CD3 P5F7 biespecífico usando o software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software). A Figura 4A e a Figura 4B ilustram a atividade antitumoral melhorada do FIt3/CD3 biespecífico na ausência ou presença de I|L15 em um ensaio de morte a longo prazo, respectivamente. Exemplo 6: Células T autólogas presentes em aspirados de medula óssea de pacientes com LMA são eficazes na morte de blastos de LMA na presença de FIt3/CD3 P5F7 biespecífico

[00273] Este exemplo ilustra que o anticorpo biespecífico anti- FIt3/CD3 P5F7 redireciona efetivamente células T autólogas para eliminar os blastos de AML ex vivo.

[00274] Para determinar a atividade citotóxica utilizando células T de pacientes e células AML, os aspirados de medula óssea frescos foram adquiridos no Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA). O número de células alvo (blastos de AML) e células efetoras (células T) foi determinado pela coloração de cada amostra com CD3 anti- humano PerCP-cy5.5 (BioLegend, San Diego, CA), anticorpo CD8 anti-

humano de BV 510 (BioLegend, San Diego, CA), CD4 anti-humano de BUV650 (BioLegend, San Diego, CA), CD33 anti-humano vermelho de PE-Texas (BioLegend, San Diego, CA), FIt3 antic-humano de APC (BD Biosciences, San Jose, CA). Duzentos e cinquenta mil (250.000) células totais da medula óssea de cada paciente foram semeadas em placas de 24 cavidades em 1 ml de meio e cultivadas a 37 ºC sob atmosfera de 5% de CO». O anticorpo biespecífico de FIt3/CD3 de P5F7 foi diluído para 10 nM em meio RPMI completo e foram preparadas diluições em série de 10 vezes em 5 pontos (intervalo de doses 10nM a 0,01nM). O ensaio de citotoxidade foi iniciado adicionando anticorpo biespecífico diluído às placas e incubando as células a 37 ºC por 4 dias.

[00275] Após 4 dias de incubação, a viabilidade das células dos pacientes com AML, a proliferação e a ativação das células T foram avaliadas contando o número de blastos de CD33+CD45dim AML, o número de células CD4+ CD8+ e a percentagem de células CD25+ CD4+ ou CD25+ CDB8+, respectivamente, em um instrumento de citometria de vazão LSRII usando o software FACS Diva (BD Biosciences). Os resultados demonstram morte eficaz de células AML primárias induzidas por concentrações crescentes de FLT3/CD3 biespecífico (PSF7) na presença de células T autólogas (veja, Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E e 5P).

[00276] Embora os ensinamentos descritos tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar dos ensinamentos aqui e da invenção reivindicada abaixo. Os exemplos anteriores são fornecidos para melhor ilustrar os ensinamentos descritos e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos aqui apresentados. Embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos em termos dessas modalidades exemplares, o técnico versado na técnica entenderá facilmente que inúmeras variações e modificações dessas modalidades exemplares são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modificações estão dentro do escopo dos ensinamentos atuais.

[00277] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patente, papéis, livros de texto e similares, e as referências citadas, na medida em que ainda não sejam, são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de um ou mais da literatura incorporada e de materiais similares diferirem ou contradizerem este aplicativo, incluindo, mas não se limitando a termos definidos, uso de termos, técnicas descritas ou similares, esse aplicativo controla.

[00278] A descrição e exemplos anteriores detalham certas modalidades específicas da invenção e descrevem o melhor modo considerado pelos inventores. Deverá ser apreciado, no entanto, que não importa o quão detalhado o exposto possa aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de várias maneiras e a invenção deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado, que se liga especificamente à tirosina cinase 3 do tipo Fms (FLT3), o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo (i) uma região determinante de complementaridade de VH (CDR1) compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 ou 247; (ii) uma CDR2 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 ou 255; e iii) uma CDR3 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 ou 254; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo (i) uma CDR1 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 ou 275; (ii) uma CDR2 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 ou 271; e (iii) uma CDR3 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 ou 274.

2. Anticorpo isolado que se liga especificamente à tirosina cinase 3 do tipo Fms (FLT3), o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende:

uma região VH compreendendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº: 2,4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 ou 233; e/ou uma região VL compreendendo CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 ou 232.

3. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao FLT3 e compete com o anticorpo de acordo com a reivindicação 1.

4. Anticorpo biespecífico em que o anticorpo biespecífico é um anticorpo de tamanho natural, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um antígeno alvo, e compreende um segundo domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana por ligação específica a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável do anticorpo se liga ao domínio 4 do FLT3 compreendendo a SEQ ID Nº: 279.

5. Anticorpo biespecífico, em que o anticorpo biespeciífico é um anticorpo de tamanho natural, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um antígeno alvo, e compreende um segundo domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana por ligação específica a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável do anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH da sequência VH mostrada na SEQ ID Nº: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221,223,225, 227, 229, 231 ou 233; e/ou uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL da sequência VL mostrada na SEQ ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 ou 232.

6. Anticorpo biespecífico, em que o anticorpo biespeciífico é um anticorpo de tamanho natural, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um antígeno alvo, e compreende um segundo domínio variável do anticorpo do anticorpo biespecífico capaz de recrutar a atividade de uma célula efetora imune humana por ligação específica a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune humana, em que o primeiro domínio variável do anticorpo compreende a uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo (i) uma região determinante de complementaridade de VH (CDR1) compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 ou 247; (li) uma CDR2 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 ou 255; e iii) uma CDR3 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 ou 254; e/ou b. uma região variável de cadeia leve (VL)

compreendendo (i) uma CDR1 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 ou 275; (ii) uma CDR2 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 ou 271; e (iii) uma CDR3 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 ou 274.

7. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio variável do anticorpo liga-se especificamente ao antígeno efetor CD3.

8. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio variável do anticorpo compreende a. uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo (i) uma região determinante complementar de VH (CDR1) compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 285, 286 ou 287; (ii) uma CDR2 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 288 ou 289; e iii) uma CDR3 de VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 290; e/ou b. uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo (i) uma CDR1 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 291; (ii) uma CDR2 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 292; e (iii) uma CDR3 de VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 234.

9. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo domínios variáveis de anticorpo da proteína heterodimérica compreendem modificações de aminoácidos nas posições 223, 225 e 228 na região de articulação e nas posições 409 ou 368 (esquema de numeração de UE) na região CH3 de uma IgG2 humana (SEQ ID Nº: 290).

10. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma modificação de aminoácidos em uma ou mais das posições 265, 330 e 331 da IgG2 humana.

11. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de codificar o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 11.

13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 11.

14. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser para preparar um medicamento ou kit.

15. Uso de um anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o medicamento ou kit é para uso no tratamento de um câncer relacionado ao FLT3 que seleciona do grupo que consiste em mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas maligno, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodkin predominante de linfócito nodular, doença de Kahler e Mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma não Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células de revestimento, linfoma de células grandes, linfoma limfoblástico B precursor, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma de células de revestimento, linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes mediastinal primário (tímico), linfoma linfoplasmaciítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênico, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusão primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células T/histiócitos, linfoma de sistema nervoso central primário, linfoma de células B difuso cutâneo primário (tipo perna), linfoma de células B grandes difuso positivo para EBV dos idosos, linfoma de células B grandes difuso associado à inflamação, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de células B grandes positivos para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grande surgindo na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHVB8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma de células B grandes difusos e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma de células B grandes difuso e linfoma de Hodgkin clássico e outro câncer relacionado às células hematopoéticas.

16. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser para preparar um medicamento ou kit a ser administrado para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

18. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado por ser para preparar uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 17, para tratar uma condição associada a células malignas que expressam FLT3 em um indivíduo.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é um câncer.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer relacionado ao FLT3 selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas maligno, linfoma de Hodgkin, linfoma nodular predominante de linfócitos Hodgkin, doença de Kahler e Mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosas, linfoma não-Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma da zona marginal, linfoma de células de revestimento, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma de células B grandes difuso, linfoma folicular, linfoma da zona marginal, linfoma de tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma de células de revestimento, linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes mediastinal primário (tímico), linfoma linfoplasmacítico, macroglobulinemia de Waldenstróm, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênico, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusão primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células T/histiócitos, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma de células B grandes difuso cutâneo primário (tipo perna), linfoma de células B grandes difuso positivo para EBV dos idosos, linfoma de células B grandes difuso associado a inflamação, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmátic, linfoma de células B grandes surgindo na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHVB8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma de células B grandes difuso e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre o linfoma de células B grandes difuso e linfoma de Hodgkin clássico, e outro câncer relacionado a células hematopoéticas.

21. Uso de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 17, caracterizado por ser para preparar um medicamento ou kit para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que tem células malignas que expressam FLT3.

22. Uso de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 17, caracterizado por ser para preparar um medicamento ou kit para inibir a metástase de células malignas que expressam FLT3 em um indivíduo.

23. Uso de uma composição farmacêutica de como definida na reivindicação 17, caracterizado por ser para preparar um medicamento ou kit para induzir a regressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas que expressam FLT3.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o uso compreende ainda a administração de uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é uma citocina, TNFa (Fator alfa de Necrose de Tumor), um inibidor de PAP (fosfatase de ácido fosfatídico), um vírus oncolítico, um inibidor de cinase, um inibidor de IDO (indoleamina-pirrol 2.3-dioxigenase), um inibidor de GLS1 de glutaminase, uma terapia com células T de CAR (Receptor de Antígeno Quimérico) ou de célula T, um Agonista de TLR (Receptor Tipo Dobre de Sino) ou uma vacina tumoral.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a citocina é I1L-15.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o inibidor de cinase é midostaurina, lestaurtinibe, sorafenibe, sunitinibe, quizartinibe, ponatinibe, crenolanibe, palbociclibe ou gilteritinibe.

28. Método de produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 13 sob condições que resultam na produção do anticorpo, e o isolamento do anticorpo da célula hospedeira ou cultura.