BR112020022897A2 - anticorpos específicos para cd3 e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CD3 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente à CD3 e usos dos mesmos. A invenção também fornece métodos terapêuticos e diagnósticos que usam os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno fornecidos aqui.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CD3 E USOS DOS MESMOS".

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] O presente pedido está sendo depositado eletronicamente via EFS-Web e inclui uma listagem de sequências enviada eletronicamente em formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequências intitulada "PC72375- PRV2_SequenceListing_ST25_05132019.txt", criada em 13 de maio de 2019 e que tem um tamanho de 100 KB. A listagem de sequências contida neste arquivo .txt é parte do relatório descritivo e é incorporada aqui a título de referência na íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos os quais são específicos para CD3 e métodos de uso dos mesmos. A presente invenção também se refere a anticorpos multiespecíficos que se ligam à CD3 e um antígeno alvo e métodos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O grupamento de diferenciação 3 (CD3) é um antígeno homodimérico ou heterodimérico expresso em células T em associação com o complexo receptor de células T (TOR) e é necessário para a ativação de células T. A ativação de células T é um fenômeno complexo que depende da participação de uma variedade de moléculas na superfície celular expressas na população de células T respondedora. A CD3 funcional é formada pela associação dimérica de duas de quatro cadeias diferentes: épsilon, zeta, delta e gama. Por exemplo, o receptor de célula T específico para antígeno (TOR) é composto por um heterodímero ligado por dissulfeto que contém duas cadeias de glicoproteína da membrana integral distribuídas clonalmente, alfa e beta ( e ) ou gama e delta ( e ) associado de forma não covalente a um complexo de proteínas invariáveis de baixo peso molecular, comumente designada como CD3. As configurações diméricas de CD3 também incluem gama/épsilon, delta/épsilon e zeta/zeta.

[004] Foi mostrado que anticorpos contra CD3 agrupam a CD3 em células T, deste modo, causando a ativação de células T de uma maneira similar ao engajamento do TOR por moléculas do MHC carregadas com peptídeo. Assim, os anticorpos anti-CD3 podem ser úteis para fins terapêuticos que envolvem a ativação de células T.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam à CD3, bem como composições, tais como composições farmacêuticas, que compreendem um ou mais anticorpos anti-CD3. Os anticorpos de acordo com este aspecto da invenção são úteis, inter alia, para direcionar células T que expressam CD3 e estimular a ativação de células T, por exemplo, sob circunstâncias nas quais a morte mediada por células T é benéfica ou desejável. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser incluídos como parte de um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico, o qual controla a ativação de células T mediada por CD3 para tipos de células específicos, tais como células tumorais ou agentes infecciosos.

[006] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente à CD3, em que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade um de VH (CDR1 de VH), uma região determinante de complementaridade dois de VH (CDR2 de VH) e uma região determinante de complementaridade três de VH (CDR3 de VH) da sequência de VH mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 ou 35; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade um de VL (CDR1 de VL), uma região determinante de complementaridade dois de

VL (CDR2 de VL) e uma região determinante de complementaridade três de VL (CDR3 de VL) da sequência de VL mostrada em SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 ou 89.

[007] Em uma modalidade deste aspecto, o anticorpo anti-CD3 compreende: (a) uma região VH que compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 13, 14 ou 15; (ii) uma CDR2 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 18 ou 25; e/ou (b) uma região VL que compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 26, 29, 30, 32, 91 ou 92; (ii) uma CDR2 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 27 ou 31; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 28 ou 33.

[008] Em algumas de tais modalidades, a invenção fornece um anticorpo em que: (a) a região VH compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 ou 35; e/ou (b) a região VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 ou 89.

[009] Em outras modalidades, o anticorpo compreende um par de sequência de aminoácidos VL/VH selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 4; SEQ ID NOs: 3 e 5; SEQ ID NOs: 6 e 7; SEQ ID NOs: 8 e 7; SEQ ID NOs: 6 e 4; SEQ ID NOs: 8 e 4; SEQ ID NOs: 9 e 10; SEQ ID NOs: 9 e 7; SEQ ID NOs: 11 e 12; SEQ ID NOs: 34 e 35; SEQ ID NOs: 9 e 4; SEQ ID NOs: 87 e 4; e SEQ ID NOs: 89 e 4.

[0010] Em algumas modalidades de cada um dos anteriores, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv, um fragmento Fv com uma única cadeia, um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto, um anticorpo com uma única cadeia, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo triespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico biespecífico, uma IgG heterodimérica biespecífica, um anticorpo policlonal, um anticorpo marcado, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e fragmentos dos mesmos.

[0011] Em uma modalidade específica, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em algumas de tais modalidades, o anticorpo biespecífico se liga especificamente a um antígeno tumoral.

[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção compreende ainda uma região estrutural de VH humana ou humanizada e uma região estrutural de VL humana ou humanizada. Em algumas de tais modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[0013] A presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD3 da invenção, conforme adicionalmente aqui descrito, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0014] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de modulação de uma resposta imune mediada por células T em um indivíduo que precisa que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou da composição farmacêutica conforme descrito aqui, de modo que a resposta imune no indivíduo seja modulada.

[0015] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo um anticorpo biespecífico, anticorpo triespecífico, anticorpo multiespecífico, diacorpo heterodimérico biespecífico ou IgG heterodimérica biespecífica, conforme descrito aqui em uma quantidade eficaz para inibir o crescimento das células tumorais.

[0016] Em algumas de tais modalidades, as células tumorais são de um câncer. Em modalidades específicas, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão, bexiga, endometrial, cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e câncer do sistema digestivo.

[0017] Em uma modalidade, o câncer do sistema digestivo é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas.

[0018] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica que compreende tal anticorpo para uso em terapia.

[0019] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para uso em terapia. Em algumas de tais modalidades, a terapia compreende ativação de uma resposta de células T citolíticas.

[0020] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo conforme descrito aqui. Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende tal polinucleotídeo.

[0021] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira que compreende os vetores conforme descrito aqui. Em algumas de tais modalidades, a célula hospedeira produz de forma recombinante o anticorpo conforme descrito aqui. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em linhagens de células bacterianas, linhagens de células de mamíferos, linhagens de células de inseto, linhagens de células de levedura. Em uma modalidade particular, a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células CHO.

[0022] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo conforme descrito aqui que compreende a cultura de uma célula hospedeira sob condições que resultam na produção do anticorpo conforme descrito aqui e purificação do anticorpo a partir do sobrenadante da cultura.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-CD3, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula hospedeira, conforme descrito aqui, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um transtorno.

[0024] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso em um método de modulação de uma resposta imune mediada por células T em um indivíduo que precisa. Em modalidades específicas, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso em um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo.

[0025] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, opcionalmente em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão, bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e câncer do sistema digestivo.

[0026] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a resposta imune mediada por células T é modulada ou em que o crescimento de células tumorais é inibido. Outras modalidades se tornarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada. Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo de Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção abrange não apenas todo o grupo listado como um todo, mas também cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal e também o grupo principal na ausência de um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na invenção reivindicada. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS/DESENHOS

[0027] A Figura 1 fornece um esquema da arquitetura de um anticorpo biespecífico que tem um primeiro domínio promotor de heterodímero e um segundo domínio promotor de heterodímero que compreende uma cadeia Fc otimizada para se associar por meio de uma associação "knob-in-hole".

[0028] A Figura 2 representa os resultados de termogramas de calorimetria de varredura diferencial que mostram a capacidade térmica de anticorpos biespecíficos GUCY2c-H2B4 e GUCY2c-2B5 em função da temperatura.

[0029] A Figura 3 representa a ligação de anticorpos biespecíficos GUCY2c-H2B4 (GUCY2c-0247) e GUCY2c-2B5 (GUCY2c-0250) a células T humanas virgens usando ensaio de citometria de fluxo.

[0030] A Figura 4 representa os resultados de citotoxicidade in vitro mediada por anticorpos biespecíficos GUCY2c-H2B4 (GUCY2c-0247) e GUCY2c-2B5 (GUCY2c-0250) usando dados de viabilidade celular.

[0031] A Figura 5 representa a superfície de energia potencial (Potential Energy Surface, PES) da região Fv de H2B4 a partir da estrutura de cristal por raios X. Isto inclui 3 visualizações que destacam a região VH, a interface VH/VL e a região VL. As CDRs com excesso de carga positiva são indicadas na figura para referência. Preto representa carga positiva e branco representa carga negativa.

[0032] A Figura 6 representa a superfície de propensão de agregação espacial (Spatial Aggregation Propensity, SAP) da região Fv de H2B4. As regiões com resíduos hidrofóbicos concentrados são marcadas.

[0033] A Figura 7 representa a heterogeneidade nos anticorpos biespecíficos que contêm os domínios de ligação do anticorpo anti-CD3 H2B4, 2B5 e 2B5v6 usando eletroferograma em gel capilar.

[0034] A Figura 8 representa a capacidade térmica do anticorpo biespecífico GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) em função da temperatura usando um termograma de calorimetria de varredura diferencial (Differential Scanning Calorimetry, DSC).

[0035] A Figura 9 representa a ligação do anticorpo biespecífico GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) a células T virgens.

[0036] A Figura 10 descreve os dados de viabilidade celular para citotoxicidade in vitro mediada pelo anticorpo biespecífico GUCY2c- 1608 (GUCY2c-2B5v6).

[0037] As Figuras 11A a 11F representam medições de liberação de citocinas in vitro com GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) biespecífico. O anticorpo biespecífico recruta células T humanas virgens para células T84 que expressam GUCY2c para induzir à liberação de citocinas in vitro. O ensaio com base em Luminex mostrou regulação positiva de IFN-gama humana (Figura 11 A), IL10 (Figura 11 B), IL2 (Figura 11C), IL4 (Figura 11 D), IL6 (Figura 11 E) e TNF-alfa (Figura 11F).

[0038] A Figura 12 representa a inibição do crescimento tumoral dependente da dose pelo anticorpo biespecífico GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) em um xenoenxerto derivado de paciente com câncer colorretal, PDX-CRX-11201, em um sistema de transferência adotivo.

[0039] A Figura 13 representa a inibição do crescimento tumoral dependente da dose pelo anticorpo biespecífico GUCY2C-1608 (GUCY2C-2B5v6) em um xenoenxerto de linhagem de células de câncer colorretal, LS1034, em um sistema de transferência adotivo.

[0040] A Figura 14A representa os resultados dos dados de viabilidade celular que mostram a citotoxicidade in vitro mediada por anticorpos biespecíficos FLT3-2B5v6 em diferentes proporções de efetor para alvo (E:T) usando células MV4-11 que expressam Flt-3.

[0041] A Figura 14B representa os resultados dos dados de viabilidade celular que mostram a citotoxicidade in vitro mediada por anticorpos biespecíficos FLT3-2B5v6 em diferentes proporções de efetor para alvo (E:T) usando células EOL-1 que expressam Flt-3.

[0042] A Figura 15 representa a ligação de variantes 2B5v6 de baixa afinidade a células Jurkat que expressam CD3.

[0043] A Figura 16 representa um gráfico que resume os resultados de um estudo que mostra a citotoxicidade mediada por células T biespecíficas anti-GUCY2C com variantes anti-CD3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0044] A invenção descrita aqui fornece anticorpos que se ligam especificamente à CD3 (por exemplo, CD3 humana), incluindo anticorpos de comprimento total ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. A invenção também fornece polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, composições que compreendem tais anticorpos e métodos de produção e uso destes anticorpos. A invenção fornece ainda métodos para o tratamento de um transtorno usando os anticorpos conforme descrito aqui. Técnicas Gerais

[0045] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, as quais estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura, tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology

(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. , eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. , eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são definidos aqui para maior clareza e/ou pronta referência e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica.

[0046] A invenção será agora descrita em detalhes por meio de referência usando as definições e exemplos a seguir. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências descritas em tais patentes e publicações, citadas aqui são expressamente incorporadas a título de referência. Definições

[0047] Em geral, a menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia usados aqui se destinam a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica aos quais a presente invenção pertence. Por exemplo, o termo "e/ou", quando usado em uma frase como "A e/ou B" aqui, se destina a incluir A e B; A ou B; A (apenas); e

B (apenas). Da mesma forma, o termo "e/ou", quando usado em uma frase como "A, B e/ou C", de destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (apenas); B (apenas); e C (apenas).

[0048] Conforme usado aqui, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural correspondentes, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0049] Conforme usado aqui, as faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. Os termos "cerca de", "aproximadamente" e assim por diante, quando precedem uma lista de valores ou faixa numérica, se referem a cada valor individual na lista ou faixa de forma independente, como se cada valor individual na lista ou faixa fosse imediatamente precedido por aquele valor. Os termos significam que os valores aos quais os mesmos se referem são exatamente, próximos ou similares. Por exemplo, em algumas modalidades, cerca de ou aproximadamente um determinado valor pode indicar um valor de 99 %, 95 % ou 90 % deste valor. Como um exemplo, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores intermediários (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, etc.). Como outro exemplo, onde a temperatura é 70°C, "cerca de" ou "aproximadamente" 70°C pode ser igual a 69°C, 66°C ou 63°C. Deve ser entendido que estes são meramente exemplos.

[0050] Conforme usado aqui, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na direção 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente. Os profissionais são particularmente direcionados a Sambrook et al., 1989 e Ausubel F.M. et al., 1993 para definições e termos da técnica. Deve ser entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos, uma vez que estes podem variar.

[0051] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente aqui para se referir a cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, de preferência relativamente curtas (por exemplo, 10-100 aminoácidos). A cadeia pode ser linear ou ramificada, pode compreender aminoácidos modificados e/ou pode ser interrompida por não aminoácidos. Os termos também abrangem uma cadeia de aminoácidos que foi modificada naturalmente ou através de intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de marcação. Também incluídos na definição, estão, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Deve ser entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas. De preferência, são usados polipeptídeos de mamífero (polipeptídeos que foram originalmente derivados de um organismo de mamífero), mais preferivelmente aqueles que são diretamente secretados para o meio.

[0052] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento antigênico localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado aqui, o termo abrange um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo específico duplo, um anticorpo bifuncional, um anticorpo triespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico biespecífico, uma IgG heterodimérica biespecífica, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), um anticorpo com uma única cadeia (ScFv) e anticorpos de domínio (incluindo, por exemplo, anticorpos de tubarão e camelídeos), proteínas de fusão que compreendem um anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento antigênico. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse da mesma) e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular. Dependendo da sequência de aminoácidos do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias destas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas de alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. A invenção também inclui "análogo(s) de anticorpo", outras estruturas com base em proteína de molécula de não anticorpo, por exemplo, proteínas de fusão e/ou imunoconjugados que usam CDRs para conferir ligação antigênica específica. Os anticorpos da invenção podem ser derivados de qualquer espécie incluindo, porém sem limitações, camundongo, ser humano, camelo, lhama, peixe, tubarão, cabra, coelho, galinha, cavalo e bovino.

[0053] O termo "anticorpo" inclui ainda moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), interligadas por ligações de dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HC VR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pesada do anticorpo, individualmente ou em combinação. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Os domínios CH1 e CH2 são conectados por uma região de dobradiça. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LC VR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Regions, CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs arranjadas, a partir do terminal amino para o terminal carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-CD3 (ou porção de ligação a antígeno do mesmo) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente. Uma sequência de aminoácidos de consenso pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno dos anticorpos.

[0054] Os termos "fragmento de ligação a antígeno", "fragmento de anticorpo" ou "porção de ligação a antígeno", conforme usado aqui, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e/ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) ou um par de VH/VL derivado de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos, tais como um domínio VH e/ou um domínio VL; (ii) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (iii) um fragmento Fab', o qual é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (por exemplo, Fundamental Immunology, Paul ed., 3ª ed. 1993; (iv) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (v) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (vi) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vii) um fragmento Fv com uma única cadeia (scFv), uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85: 5879-5883); (viii) um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), um Fv com uma ligação de dissulfeto intermolecular concebida para estabilizar o par VH-VL; (ix) um único fragmento de anticorpo de domínio variável (sdAb ou dAb) (por exemplo, Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), o qual é composto por um domínio variável de cadeia pesada e desprovido de cadeia leve; (x) uma região determinante de complementaridade (CDR); e quaisquer derivados dos mesmos.

Conforme usado aqui, um "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo pode compreender pelo menos um domínio variável.

O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adjacente a ou está in-frame com uma ou mais sequências estruturais.

Conforme usado aqui, um "fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo" pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de região variável e domínio constante listadas abaixo em associação não covalente entre si e/ou com uma ou mais regiões VH ou VL monoméricas (por exemplo,

através de ligação(ões) de dissulfeto). Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. As configurações de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: VH-CH1; VH-CH2; VH-CH3; VH-CH 1-CH2; VH-CH1-CH2-CH3; VH-CH2-CH3; VH-VL-CL, VH-VL- CH1, VH-VL-CH2; VH-CL; VL-CH1; VL-CH2; VL- CH3; VL-CH1-CH2; VL-CH1-CH2-CH3; VL-CH2-CH3; e VL-CL. As regiões variáveis e os domínios constantes podem ser diretamente ligados entre si ou podem ser ligados através de uma região de dobradiça ou região de ligação completa ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre regiões variáveis adjacentes e/ou domínios constantes em uma única molécula polipeptídica.

[0055] Conforme usado aqui, um "domínio de ligação" compreende qualquer região de um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) que é responsável pela ligação seletiva a uma molécula de interesse (por exemplo, um antígeno, ligante, receptor, substrato ou inibidor). Domínios de ligação exemplificativos incluem uma região variável de anticorpo, domínio de ligação a receptor, domínio de ligação a ligante e um domínio enzimático.

[0056] Conforme usado aqui, o termo "região estrutural aceitadora humana" é uma região estrutural que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural variável de cadeia leve (VL) ou uma região estrutural variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humana, conforme definido abaixo. Uma região estrutural aceitadora humana "derivada de" uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma ou pode conter modificações na sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de modificações de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, a região estrutural aceitadora humana de VL tem uma sequência idêntica à sequência da região estrutural de imunoglobulina humana de VL ou sequência de região estrutural de consenso humana.

[0057] Conforme usado aqui, um anticorpo "amadurecido por afinidade" se refere a um anticorpo que tem uma ou mais modificações em uma ou mais regiões variáveis (as quais incluem as CDRs e FRs comparado com um anticorpo precursor que não possui tais modificações) e em que tais modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo por um antígeno.

[0058] Conforme usado aqui, o termo "região Fc", "domínio Fc", "cadeia Fc" ou termos análogos são usados para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de IgG. A região Fc de uma IgG compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3. O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humana geralmente se estende a partir dos aminoácidos 231 ao aminoácido 340 de acordo com o sistema de numeração do índice EU ou a partir do aminoácido 244 ao aminoácido 360 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. O domínio CH3 de uma região Fc de IgG humana normalmente se estende a partir dos aminoácidos 341 a 447 de acordo com o sistema de numeração do índice EU ou a partir do aminoácido 361 ao aminoácido 478 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. O domínio CH2 de uma região Fc de IgG humana (também denominado como domínio "Cy2") é único por não estar intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma IgG nativa intacta. A região Fc pode compreender sequências de Fc nativas ou variantes. Embora os limites da sequência de Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a sequência de Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácido próximo à posição Cys226 ou próximo à posição Pro230 até o terminal carboxila da sequência de Fc. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado de índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0059] Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc começa na região de dobradiça logo a montante do sítio de clivagem de papaína e termina no C-término do anticorpo. Consequentemente, uma cadeia Fc completa compreende pelo menos um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc compreende pelo menos um de: um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4 ou uma variante, porção ou fragmento do mesmo. Em determinadas modalidades, um domínio Fc compreende uma cadeia Fc completa (isto é, um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3). Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc compreende um domínio de dobradiça (ou parte do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou parte do mesmo). Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc compreende um domínio CH2 (ou parte do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou parte do mesmo). Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH3 ou parte do mesmo. Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio de dobradiça (ou parte do mesmo) e um domínio CH3 (ou parte do mesmo). Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH2 (ou parte do mesmo) e um domínio CH3. Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio de dobradiça (ou parte do mesmo) e um domínio CH2 (ou parte do mesmo). Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc carece de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Uma cadeia Fc aqui se refere, em geral, a um polipeptídeo que compreende toda ou parte da cadeia Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Isto inclui, porém sem limitações, polipeptídeos que compreendem os domínios CH1, de dobradiça, CH2 e/ou CH3 inteiros, bem como fragmentos de tais peptídeos que compreendem apenas, por exemplo, os domínios de dobradiça, CH2 e CH3. A cadeia Fc pode ser derivada de uma imunoglobulina de qualquer espécie e/ou qualquer subtipo incluindo, porém sem limitações, um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM humano. O domínio Fc abrange moléculas Fc nativas e variantes de Fc. Tal como acontece com as variantes de Fc e Fcs nativos, o termo cadeia de Fc inclui moléculas na forma monomérica ou multimérica, quer digeridas a partir do anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios. Em algumas modalidades, a cadeia Fc compreende as porções carbóxi terminais de ambas as cadeias pesadas mantidas juntas por ligações de dissulfeto. Em determinadas modalidades, uma cadeia Fc consiste em um domínio CH2 e um domínio CH3.

[0060] Conforme usado na técnica, "receptor Fc" e "FcR" descrevem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcRI, FcRII e Fcy FcRIII, incluindo variantes alélicas e formas de emenda (splicing) alternativa destes receptores. Os receptores FcRII incluem FcRIIA (um "receptor de ativação") e FcRIIB (um "receptor de inibição"), os quais têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente quanto aos seus domínios citoplasmáticos. Os FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41, 1995. "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587, 1976 ; e Kim et al., J. Immunol., 24: 249, 1994).

[0061] Uma "região Fc de sequência nativa" ou "região Fc de tipo selvagem" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Por Fc de IgG humana de "tipo selvagem" entenda-se uma sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente na população humana. Evidentemente, da mesma forma que a sequência de Fc pode variar ligeiramente entre os indivíduos, uma ou mais alterações podem ser feitas em uma sequência de tipo selvagem e ainda permanecer dentro do escopo da invenção. Por exemplo, a região Fc pode conter alterações adicionais que não estão relacionadas à presente invenção, tais como uma mutação em um sítio de glicosilação, inclusão de um aminoácido não natural ou uma mutação "knobs-in-holes".

[0062] Uma "região Fc variante" ou "cadeia Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido e ainda retém pelo menos uma função efetora da sequência da região Fc nativa. Em algumas modalidades, a cadeia Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com uma cadeia Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo precursor, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, de preferência, de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma cadeia Fc de sequência nativa ou na cadeia Fc do polipeptídeo precursor. A cadeia Fc variante aqui terá, de preferência, pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência com uma cadeia Fc de sequência nativa e/ou com uma cadeia Fc de um polipeptídeo precursor e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a mesma, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0063] Conforme usado aqui, o termo "funções efetoras" se refere às atividades biológicas atribuíveis à cadeia Fc (uma cadeia Fc de sequência nativa ou cadeia Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity, ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores na superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B. Estas funções efetoras geralmente requerem que a cadeia Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, uma região variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções efetoras de anticorpo. Uma medição exemplificativa da função efetora é através da ligação a Fc3 e/ou C1q. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na cadeia Fc; esta cadeia também é a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células.

[0064] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de Fc compreende parte ou a totalidade de uma sequência de dobradiça de tipo selvagem (geralmente em seu N-término). Em algumas modalidades, um polipeptídeo de Fc não compreende uma sequência de dobradiça funcional ou de tipo selvagem.

[0065] "Região de dobradiça", "sequência de dobradiça" e variações das mesmas, conforme usado aqui, incluem o significado conhecido na técnica o qual é ilustrado, por exemplo, em Janeway et al., Immunobiology: The Immuno System in Health and Disease, Elsevier Science Ltda., NY (4ª ed., 1999); Bloom et al., Protein Science, 6: 407-415, 1997; e Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209: 193- 202, 1997.

[0066] "Região de dobradiça similar à imunoglobulina", "sequência de dobradiça similar à imunoglobulina" ou variações das mesmas, conforme usado aqui, se refere à região de dobradiça e à sequência de dobradiça de uma molécula similar à imunoglobulina ou similar a um anticorpo (por exemplo, imunoadesinas). Em algumas modalidades, a região de dobradiça similar à imunoglobulina pode ser de ou derivada de qualquer subtipo lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 ou de IgA, IgE, IgD ou IgM, incluindo suas formas quiméricas, por exemplo, uma região de dobradiça quimérica de lgG1/2.

[0067] Em algumas modalidades, a região de dobradiça pode ser do subtipo IgG1 humano que se estende a partir do aminoácido 216 ao aminoácido 230 de acordo com o sistema de numeração do índice EU ou a partir do aminoácido 226 ao aminoácido 243 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Em algumas modalidades, a sequência pode ser EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 63). Aqueles versados na técnica podem diferir quais aminoácidos exatos correspondem aos vários domínios da molécula de IgG. Assim, o N- término ou C-término dos domínios delineados acima podem se estender ou ser encurtado em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mesmo 10 aminoácidos.

[0068] Em algumas modalidades, a região de dobradiça pode sofrer mutação em um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, a região de dobradiça pode ser truncada e conter apenas uma parte de toda a região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região de dobradiça pode conter apenas os últimos 5 aminoácidos da região de dobradiça, denominada aqui como a região de "dobradiça inferior". Em algumas modalidades, a região de dobradiça inferior pode ser composta pelos aminoácidos CPPCP (SEQ ID NO: 64) ou a partir do aminoácido 226 ao aminoácido 230 de acordo com o sistema de numeração do índice EU ou a partir do aminoácido 239 ao aminoácido 243 de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0069] Conforme usado aqui, o termo "modificação" se refere a uma substituição, inserção e/ou eliminação de aminoácido em uma sequência polipeptídica, uma alteração em uma porção quimicamente ligada a uma proteína ou uma modificação de uma função de uma proteína, por exemplo, um anticorpo. Por exemplo, uma modificação pode ser uma função alterada de um anticorpo ou uma estrutura de carboidrato alterada ligada a uma proteína. Conforme usado aqui, uma "modificação de aminoácido" se refere a uma mutação (substituição), inserção (adição) ou eliminação de um ou mais resíduos de aminoácido em um anticorpo. O termo "mutação de aminoácido" denota a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente por outro resíduo de aminoácido diferente (por exemplo, o resíduo de aminoácido substituto). O termo "eliminação de aminoácidos" denota a remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido em uma posição predeterminada em uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, a mutação L234A denota que o resíduo de aminoácido lisina na posição 234 em uma região Fc de anticorpo é substituído pelo resíduo de aminoácido alanina (substituição de lisina por alanina) (numeração de acordo com o sistema de numeração do índice EU). Um "resíduo de aminoácido de ocorrência natural" denota um resíduo de aminoácido a partir do grupo que consiste em alanina (código de três letras: Ala, código de uma letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico ( Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gin, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptofano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) e valina (Val, V).

[0070] O termo "agente" é usado aqui para denotar uma macromolécula biológica, um extrato feito de materiais biológicos, uma mistura de macromoléculas biológicas, um composto químico, uma mistura de compostos químicos e/ou uma mistura de compostos químicos e macromoléculas biológicas. O termo "agente terapêutico" se refere a um agente que tem atividade biológica.

[0071] Conforme usado aqui, "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, as quais normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante antigênico. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por meio do método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975 ou podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante, conforme descrito na Patente US N° 4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990, por exemplo.

[0072] Os anticorpos da presente invenção podem ser "anticorpos humanizados". Conforme usado aqui, anticorpo "humanizado" se refere a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, primata não humano ou outro mamífero) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antígeno de anticorpos) que contêm um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nos mesmos a partir de uma fonte que não é humana. Tais resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados como resíduos de "importação" os quais são, tipicamente, retirados de um domínio variável de "importação". Um resíduo, sequência ou anticorpo de importação tem uma afinidade e/ou especificidade desejada ou outra atividade biológica de anticorpo desejável, conforme discutido aqui.

[0073] De preferência, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho, que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências estruturais, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todas de pelo menos uma e, tipicamente, duas regiões variáveis, nas quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, de forma ideal, pelo menos uma parte de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquele de uma imunoglobulina humana. São preferidos anticorpos com cadeias Fc modificadas conforme descrito no documento WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 ou CDR H3) que são alteradas em relação ao anticorpo original, as quais também são denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original. Humanizado, conforme usado aqui, se destina a incluir anticorpos desimunizados.

[0074] Conforme usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi feito usando qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos conhecidas pelos versados na técnica ou descritas aqui. Consequentemente, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, se destina a incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos que compreendem pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humana ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humana. Um exemplo é um anticorpo que compreende polipeptídeos de cadeia leve de murino e de cadeia pesada humana. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando vários métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblioteca de fagos, onde tal biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci . (USA) 95: 6157-6162, 1998; Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581, 1991). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos através de imunização de animais nos quais os loci de imunoglobulina humana foram transgenicamente introduzidos em lugar dos loci endógenos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita nas Patente US Nos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825;

5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado ao imortalizar linfócitos B humanos que produzem um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou a partir da clonagem do cDNA de uma única célula ou podem ter sido imunizados in vitro). Consulte, por exemplo, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95, 1991; e Patente US N° 5.750.373.

[0075] Os anticorpos humanos da presente invenção podem existir em pelo menos duas formas que estão associadas à heterogeneidade de dobradiça. Por exemplo, a molécula de imunoglobulina compreende uma construção estável de quatro cadeias de aproximadamente 150-

160 kDa na qual os dímeros são mantidos juntos através de uma ligação de dissulfeto entre cadeias na cadeia pesada. Alternativamente, os dímeros não estão ligados através de ligações de dissulfeto entre cadeias e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composta por uma cadeia leve e uma cadeia pesada acopladas de forma covalente (semianticorpo).

[0076] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humano recombinante" se destina a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrito mais abaixo), anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória recombinante (descritos mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl . Acids Res. 20: 6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva emenda (splicing) de sequências de genes de imunoglobulinas humanas a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em determinadas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências as quais, embora derivadas de e relacionadas às sequências VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

[0077] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos

"quiméricos" nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada (Patente US N° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1984). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências de ligação a antígeno de região variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, Macaco, etc.) e sequências de região constante humana.

[0078] Um "anticorpo monovalente" compreende um sítio de ligação a antígeno por molécula (por exemplo, IgG ou Fab). Em alguns casos, um anticorpo monovalente pode ter mais de um sítio de ligação a antígeno, mas os sítios de ligação são de diferentes antígenos.

[0079] Um "anticorpo monoespecífico" se refere a um anticorpo ou preparação de anticorpos que compreende dois sítios de ligação a antígeno idênticos por molécula (por exemplo, IgG), de modo que os dois sítios de ligação se liguem a um epítopo idêntico no antígeno. Assim, eles competem uns com os outros quanto à ligação a uma molécula antigênica. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpos monoclonais". A maioria dos anticorpos encontrados na natureza são monoespecíficos. Em alguns casos, um anticorpo monoespecífico também pode ser um anticorpo monovalente (por exemplo, Fab).

[0080] Os termos "carga de mutação", "carga mutacional", "peso de mutação" ou "peso mutacional" são usados aqui indistintamente. A carga mutacional do tumor é uma medida do número de mutações dentro do genoma de um tumor, definido como o número total de mutações por área de codificação do genoma de um tumor. Há grande variabilidade na carga mutacional dentro dos tipos de tumor, variando de apenas algumas a milhares de mutações (Alexandrov L.B. et al., Nature 2013; 500 (7463): 415-421; Lawrence M.S. et al., Nature 2013; 499: 214-218; Vogelstein B. et al., Science, 2013; 339: 1546-1558. Um "resíduo de aminoácido original" é aquele que é substituído por um resíduo de "aminoácido de importação", o qual pode ter um volume de cadeia lateral menor ou maior do que o resíduo original. O resíduo de aminoácido de importação pode ser um resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou não natural, porém, de preferência é o primeiro. Resíduos de aminoácido de "ocorrência natural" são aqueles resíduos codificados pelo código genético. "Resíduo de aminoácido de ocorrência não natural significa um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de ligar de forma covalente a resíduo(s) de aminoácido adjacente(s) na cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácido de ocorrência não natural são norleucina, ornitina, norvalina, homoserina e outros tipos de resíduos de aminoácido, tais como aqueles descritos em Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Em algumas modalidades, o método da presente invenção envolve a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido original, porém, mais de um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não mais do que os resíduos totais na interface dos primeiro ou segundo polipeptídeo podem compreender resíduos de aminoácidos originais que são substituídos.

[0081] O termo "competir", conforme usado aqui em relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno (ou porção) do mesmo se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente similar à ligação de um segundo anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo ao seu epítopo cognato seja diminuída de forma detectável na presença do segundo anticorpo comparado com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também é diminuída de forma detectável na presença do primeiro anticorpo pode, mas não precisa ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem que este segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epítopo. No entanto, onde cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo ao seu epítopo ou ligante cognato, seja na mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são denominados de "competidores cruzados" quanto à ligação ao seu(s) respectivo(s) epítopo(s). Anticorpos competidores e de competição cruzada estão abrangidos pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual ocorre tal competição ou competição cruzada (por exemplo, impedimento estérico, variação conformacional ou ligação a um epítopo em comum ou parte do mesmo), aqueles versados na técnica reconhecerão, com base nos ensinamentos fornecidos aqui, que tais anticorpos competidores e/ou de competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos descritos aqui.

[0082] Conforme usado aqui, "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" se refere a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (Natural Killer, NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. A atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Patente US Nos 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) e células NK. Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele descrito em Clynes et al., PNAS (USA), 95: 652-656, 1998.

[0083] Conforme usado aqui, uma "citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" se refere à lise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163, 1996, pode ser realizado. Conforme usado aqui, os termos "se liga imunoespecificamente", "reconhece imunoespecificamente", "se liga especificamente", "reconhece especificamente" e termos análogos se referem a moléculas, por exemplo, domínios de ligação, que se ligam especificamente a um antígeno (por exemplo, epítopo ou complexo imune) e não se ligam especificamente a outra molécula. Uma molécula que se liga especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com menor afinidade, conforme determinado por meio de ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, imunoensaios, BIACORE™ ou outros ensaios. De preferência, as moléculas que se ligam especificamente a um antígeno não exibem reação cruzada com outras proteínas.

[0084] "Condições moderadamente rigorosas" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS a 0,5 %, EDTA a 1,0 mM (pH de 8,0); hibridização a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C durante 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC que contém SDS a 0,1 %.

[0085] Conforme usado aqui, "condições altamente rigorosas" ou "condições de alto rigor" são aquelas que: (1) empregam baixa intensidade iônica e alta temperatura para a lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) empregam, durante a hibridização, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1 %/Ficoll a 0,1 %/polivinilpirrolidona a 0,1 %/tampão de fosfato de sódio a 50 mM em um pH de 6,5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42 °C; ou (3) empregam formamida a 50 %, 5 x SSC (NaCl a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1 %, 5 x solução de Denhardt, DNA de espermatozoide de salmão sonicado (50 pg/ml), SDS a 0,1 % e sulfato de dextrana a 10 % a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50 % a 55 °C, seguido por uma lavagem de alto rigor que consiste em 0,1 x SSC que contém EDTA a 55 °C. Aqueles versados na técnica saberão como ajustar a temperatura, intensidade iônica, etc. conforme necessário para acomodar fatores tais como o comprimento da sonda e assim por diante.

[0086] As proteínas de ligação, domínios de ligação, CDRs ou anticorpos (conforme amplamente definido aqui) podem ser identificados de acordo com as definições de Kabat, Chothia, o compromisso entre Kabat e Chothia, AbM, Contact, North e definições conformacionais e/ou qualquer método de determinação de CDRs bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. (regiões hipervariáveis); Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989 (estruturas de loop estrutural). A identidade dos resíduos de aminoácidos em um anticorpo específico que constitui uma CDR pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na técnica. A definição AbM de CDRs é um compromisso entre Kabat e Chothia e usa o software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular (Accelrys). A definição "Contact" de CDRs é com base em contatos antigênicos observados, estabelecidos em MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732- 745, 1996. A definição "conformacional" de CDRs é com base em resíduos que fazem contribuições entálpicas para a ligação a antígeno (consulte, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156- 1166, 2008). North identificou conformações de CDR canônicas usando um conjunto preferido diferente de definições de CDRs (North et al., J. Mol. Biol. 406: 228-256, 2011). Em outra abordagem, denominada aqui como a "definição conformacional" de CDRs, as posições dos CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas para a ligação a antígeno (Makabe et al., J Biol. Chem. 283: 1156-1166, 2008). Ainda outras definições dos limite de CDRs podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, porém, no entanto, se sobreporão a pelo menos uma parte das CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou alongadas à luz da previsão ou descobertas experimentais de resíduos ou grupos de resíduos específicos ou mesmo CDRs inteiras que não afetam significativamente a ligação a antígeno. Conforme usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por meio de qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos usados aqui podem usar CDRs definidas de acordo com qualquer uma de tais abordagens. Para qualquer modalidade que contém mais de uma CDR, as CDRs (ou outro resíduo do anticorpo) podem ser definidas de acordo com qualquer um de Kabat, Chothia, estendido (combinação de Kabat e Chothia), North, AbM, Contact e/ou definições conformacionais.

[0087] Os resíduos em um domínio variável são numerados de acordo com Kabat, o qual é um sistema de numeração usado para regiões variáveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos. Consulte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ou inserção em uma FR ou CDR da variável região. Por exemplo, uma região variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão". Vários algoritmos para atribuição de numeração de Kabat estão disponíveis. O algoritmo implementado na versão 2.3.3 do Abysis (www.abysis.org) foi usado aqui para atribuir a numeração de Kabat às regiões variáveis CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH. As posições específicas dos resíduos de aminoácidos em um anticorpo também podem ser numeradas de acordo com Kabat.

[0088] Conforme usado aqui, o termo "biblioteca de apresentação em fago" se refere a uma população de bacteriófagos, cada um dos quais contém um cDNA estranho fundido de forma recombinante in- frame com uma proteína na superfície. O fago exibe a outra proteína codificada pelo cDNA em sua superfície. Após replicação em um hospedeiro bacteriano, tipicamente E. coli, o fago que contém o cDNA estranho de interesse é selecionado por meio de expressão da proteína estranha na superfície do fago.

[0089] O termo "epítopo" se refere àquela porção de uma molécula capaz de ser reconhecida, fazer contato e/ou ser ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação a antígeno do anticorpo conhecidas como paratopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos geralmente consistem em um agrupamento de moléculas na superfície quimicamente ativo, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Conforme usado aqui, os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos justapostos espacialmente de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epítopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em determinadas modalidades, um epítopo pode incluir porções sacarídicas, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno.

[0090] O termo "epítopo antigênico", conforme usado aqui, é definido como uma porção de um polipeptídeo ao qual um anticorpo pode se ligar especificamente, conforme determinado por meio de qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, através de imunoensaios convencionais. Um "epítopo não linear" ou "epítopo conformacional" compreende polipeptídeos não contíguos (ou aminoácidos) dentro da proteína antigênica à qual se liga um anticorpo específico para o epítopo. Uma vez que um epítopo desejado em um antígeno é determinado, é possível gerar anticorpos para este epítopo, por exemplo, usando as técnicas descritas aqui.

[0091] Os termos "ligação específica" ou "se liga especificamente", quando usados em referência à interação de um anticorpo e uma proteína ou peptídeo, se referem a uma interação que depende da presença de uma estrutura particular (isto é, o determinante antigênico ou epítopo) na proteína; em outras palavras, o anticorpo está reconhecendo e se ligando a uma estrutura de proteína específica, em vez de a proteínas em geral. Por exemplo, se um anticorpo é específico para o epítopo "A", a presença de uma proteína que contém o epítopo A (ou A livre, não marcado) em uma reação que contém "A" marcado e o anticorpo reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

[0092] Em determinadas modalidades, "se liga especificamente" significa, por exemplo, que um anticorpo se liga a uma proteína com uma KD de cerca de 0,1 nM ou menos, porém, mais geralmente menos do que cerca de 1 mM. Em determinadas modalidades, "se liga especificamente" significa que um anticorpo se liga a um alvo algumas vezes com uma KD de pelo menos cerca de 0,1 mM ou menos, em outras vezes pelo menos cerca de 0,01 pM ou menos e, em outras vezes, pelo menos cerca de 1 nM ou Menos. Em virtude da identidade de sequência entre proteínas homólogas em espécies diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que reconhece uma proteína em mais de uma espécie (por exemplo, proteína humana ou proteína de camundongo). Da mesma forma, em virtude da homologia dentro de determinadas regiões de sequências polipeptídicas de proteínas diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que reconhece mais de uma proteína. Deve ser entendido que, em determinadas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação que se liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva, isto é, ligação a um único alvo. Assim, um anticorpo pode, em algumas modalidades, se ligar especificamente a mais de um alvo. Em determinadas modalidades, vários alvos podem ser ligados através do mesmo sítio de ligação a antígeno no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode, em determinados casos, compreender dois sítios de ligação a antígeno idênticos, cada um dos quais se liga especificamente ao mesmo epítopo em duas ou mais proteínas. Em determinadas modalidades alternativas, um anticorpo pode ser multiespecífico e compreender pelo menos dois sítios de ligação a antígeno com especificidades diferentes. A título de exemplo não limitativo, um anticorpo biespecífico pode compreender um sítio de ligação a antígeno que reconhece um epítopo em uma proteína (por exemplo, CD3 humana) e compreende ainda um segundo sítio de ligação a antígeno diferente que reconhece um epítopo diferente em uma segunda proteína. Em geral, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação específica. Um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com menor afinidade, conforme determinado através de ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, imunoensaios, BIACORE ou outros ensaios. De preferência, o anticorpo que se liga especificamente a um antígeno não exibe reação cruzada com outras proteínas.

[0093] Os termos "ligação não específica" ou "ligação de fundo", quando usados em referência à interação de um anticorpo e uma proteína ou peptídeo, se referem a uma interação que não depende da presença de uma estrutura particular (isto é, o anticorpo se liga a proteínas em geral, em vez de uma estrutura particular, tal como um epítopo).

[0094] Os termos "kon" ou "ka", conforme usado aqui, se referem à constante de taxa para associação de um anticorpo a um antígeno. Especificamente, as constantes de taxa (kon/ka e koff/kd) e constantes de dissociação em equilíbrio são medidas usando o anticorpo inteiro (isto é, bivalente) e proteínas CD3 monoméricas.

[0095] Os termos "koff" ou "kd", conforme usado aqui, se referem à constante de taxa para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.

[0096] O termo "KD", como usado aqui, se refere à constante de dissociação em equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno.

[0097] Conforme usado aqui, o termo "afinidade de ligação" se refere, em geral à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme usado aqui, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode, em geral, ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode, em geral, ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, a Kd pode ser cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM ou maior. A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar facilmente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para fins da presente invenção. Em particular, o termo "afinidade de ligação" se destina a referir-se à taxa de dissociação de uma determinada interação antígeno-anticorpo. A KD é a proporção entre a taxa de dissociação, também denominada de "taxa de desaceleração (koff)", para a taxa de associação ou "taxa de ligação (kon)". Assim, a KD é igual a koff/kon e é expressa como uma concentração molar (M). Conclui-se que, quanto menor a KD, mais forte é a afinidade de ligação. Portanto, uma KD de 1 mM indica afinidade de ligação fraca comparado com uma KD de 1 nM. Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar a KD de um anticorpo é usar ressonância de plasmônio em superfície (Surface Plasmon Resonance, SPR), normalmente usando um sistema biossensor, tal como um sistema BIACORE™. A análise cinética BIACORE™ compreende análise da ligação e dissociação de um antígeno de chips com moléculas imobilizadas (por exemplo, moléculas que compreendem domínios de ligação de epítopo) em sua superfície. Outro método para determinar a KD de um anticorpo é usar interferometria de biocamada, normalmente usando a tecnologia OCTET (sistema Octet QKe, ForteBio).

[0098] "Biologicamente ativo", "atividade biológica" e "características biológicas" em relação a um anticorpo da presente invenção, tal como um anticorpo, fragmento ou derivado do mesmo, significa ter a capacidade de se ligar a uma molécula biológica, exceto onde especificado de outra forma.

[0099] Conforme usado aqui, os termos "ácidos nucleicos" e "sequências de nucleotídeos" incluem moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), combinações de moléculas de DNA e RNA ou moléculas híbridas de DNA/RNA e análogos de moléculas de DNA ou RNA. Tais análogos podem ser gerados usando, por exemplo, análogos de nucleotídeos os quais incluem, porém sem limitações, inosina ou bases tritiladas. Tais análogos também podem compreender moléculas de DNA ou RNA que compreendem estruturas modificadas que conferem atributos benéficos às moléculas tais como, por exemplo, resistência à nuclease ou uma capacidade aumentada de atravessar membranas celulares. Os ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos podem ser fita simples, fita dupla, podem conter porções de fitas simples e dupla e podem conter porções de fita tripla, porém, de preferência é DNA fita dupla.

[00100] A presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam os anticorpos da invenção, incluindo os polipeptídeos e regiões de ligação dos anticorpos. Os polinucleotídeos que codificam as moléculas da invenção podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada por meio de qualquer método conhecido na técnica.

[00101] Os polinucleotídeos que codificam os anticorpos da presente invenção podem incluir o seguinte: apenas a sequência codificadora para a variante, a sequência codificadora para a variante e sequências codificadoras adicionais, tal como um polipeptídeo funcional ou uma sequência sinalizadora ou secretora ou uma sequência de pró-proteína; a sequência codificadora para o anticorpo e a sequência não codificadora, tais como íntrons ou sequências não codificadoras 5' e/ou 3' da sequência codificadora para o anticorpo. O termo "polinucleotídeo que codifica um anticorpo" abrange um polinucleotídeo que inclui a sequência codificadora adicional para a variante, mas também um polinucleotídeo que inclui a sequência codificadora adicional e/ou não codificadora. É sabido na técnica que uma sequência polinucleotídica que é otimizada para uma célula hospedeira/sistema de expressão específico pode ser facilmente obtida a partir da sequência de aminoácidos da proteína desejada (consulte GENEART AG, Regensburg, Alemanha).

[00102] Os anticorpos da presente invenção podem ter substituições conservativas ou não essenciais de aminoácidos adicionais, as quais não têm um efeito substancial sobre as funções do polipeptídeo. Se uma substituição particular será tolerada ou não, isto é, não afetará adversamente as propriedades biológicas desejadas, tal como a atividade de ligação, pode ser determinado conforme descrito em Bowie, J.U. et al. Science 247: 1306-1310,1990 ou Padlan et al. FASEB J. 9: 133-139, 1995.

[00103] Conforme usado aqui, uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00104] Conforme usado aqui, um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem do agente de ligação, por exemplo, o anticorpo, sem abolir ou sem alterar substancialmente uma atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" resulta em tal mudança. Em um anticorpo, um resíduo de aminoácido essencial pode ser um resíduo determinante de especificidade (Specificity Determining Residue, SDR).

[00105] Conforme usado aqui, o termo "isolado" se refere ao material que é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ocorrer naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, porém, o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo que é separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural é isolado. Tal polinucleotídeo pode ser parte de um vetor e/ou tal polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser parte de uma composição, por exemplo, uma mistura, solução ou suspensão ou compreender uma célula isolada ou uma célula cultivada que compreende o polinucleotídeo ou polipeptídeo e ainda ser isolado, na medida em que o vetor ou composição não faz parte de seu ambiente natural. Por exemplo, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula da qual ele se origina naturalmente será "isolado" de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser tornada substancialmente isenta de componentes naturalmente associados através de isolamento usando métodos de purificação de proteínas bem conhecidos na técnica.

[00106] Um anticorpo "isolado" ou "purificado" é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou fonte tecidual ou meio do qual a proteína é derivada ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente. A expressão "substancialmente isento de material celular" inclui preparações de um anticorpos nas quais o polipeptídeo/proteína é separado dos componentes celulares das células a partir das quais o mesmo é isolado ou produzido de forma recombinante. Assim, um anticorpo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de anticorpos que têm menos de cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2,5 % ou 1 %, (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o anticorpo é produzido de forma recombinante, ele também é, de preferência, substancialmente isento de meio de cultura isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2,5 % ou 1 % do volume da preparação de proteínas. Quando o anticorpo é produzido por meio de síntese química, ele é, de preferência, substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos e reagentes, isto é, o anticorpo de interesse é separado dos precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Consequentemente, tais preparações de anticorpos têm menos do que cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % ou 1 % (em peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do anticorpo de interesse. Em uma modalidade preferida da presente invenção, os anticorpos são isolados ou purificados. Um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo ou de um tecido ou célula na qual o anticorpo existe naturalmente ou é produzido naturalmente é um "anticorpo isolado" para fins da presente invenção.

[00107] O termo "recuperação", conforme usado aqui, se refere ao processo de tornar uma espécie química, tal como um polipeptídeo, substancialmente isenta de componentes naturalmente associados através de isolamento, por exemplo, usando métodos de purificação de proteínas bem conhecidos na técnica.

[00108] Conforme usado aqui, o termo "replicon" se refere a qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, um cromossomo ou um vírus, que se comporta como uma unidade autônoma de replicação polinucleotídica dentro de uma célula.

[00109] Conforme usado aqui, o termo "operativamente ligado" se refere a uma situação na qual os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem da maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência de controle "operativamente ligada" a uma sequência codificadora é ligada de tal maneira que a expressão da sequência codificadora é alcançada sob condições adequadas ou compatíveis com a sequência de controle. Em geral, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em quadro de leitura. No entanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada através de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional. Conforme usado aqui, "vetor" significa uma construção que é capaz de distribuir e, de preferência, expressar, um ou mais genes ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém sem limitações, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, vetores de expressão de plasmídeo, cosmídeo ou fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas e determinadas células eucariotas, tais como células produtoras.

[00110] Conforme usado aqui, o termo "sequência de controle de expressão" ou "sequência de controle" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que é necessária para efetuar a expressão de uma sequência codificadora à qual ela está ligada. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Por exemplo, em procariotas, tais sequências de controle geralmente incluem um promotor, um sítio de ligação ribossômica e terminadores e, em alguns casos, intensificadores. O termo "sequência de controle", portanto, se destina a incluir no mínimo todos os componentes cuja presença é necessária para expressão e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líderes.

[00111] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou foi um recipiente para vetor(es) para incorporação de inserções de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (quanto à morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula-mãe original em virtude de mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com (um) polinucleotídeo(s) da presente invenção.

[00112] Conforme usado aqui, "células de mamífero" inclui referência a células derivadas de mamíferos, incluindo seres humanos, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, chimpanzés ou macacos. As células podem ser cultivadas in vivo ou in vitro. Conforme usado aqui, o termo "produto purificado" se refere a uma preparação do produto que foi isolado dos constituintes celulares aos quais o produto está normalmente associado e/ou outros tipos de células que possam estar presentes na amostra de interesse.

[00113] Conforme usado aqui, "substancialmente puro" se refere ao material que é pelo menos 50 % puro (isto é, isento de contaminantes), mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro e, mais preferivelmente, pelo menos 99 % puro.

[00114] Conforme usado aqui, os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para fins da presente invenção, o tratamento é definido como a administração de uma molécula de anticorpo anti-CD3 (por exemplo, anticorpo monoclonal, anticorpo biespecífico) a um indivíduo, por exemplo, um paciente, ou administração, por exemplo, através de aplicação, a um tecido ou célula isolada de um indivíduo que é retornada ao indivíduo. A molécula de anticorpo anti-CD3 pode ser administrada individualmente ou em combinação com um ou mais agentes. O tratamento pode ser para curar, cicatrizar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, paliar, amenizar ou afetar o transtorno, os sintomas do transtorno ou a predisposição para o transtorno, por exemplo, um câncer.

[00115] Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" se destina a incluir qualquer animal (por exemplo, um mamífero) incluindo, porém sem limitações, seres humanos, primatas não humanos, roedores e assim por diante, que deve ser o receptor de um determinado tratamento. Por exemplo, um indivíduo pode ser um paciente (por exemplo, um paciente humano ou um paciente veterinário) que tem câncer. Normalmente, os termos "indivíduo", "pessoa" e "paciente" são usados indistintamente aqui em referência a um ser humano.

[00116] O termo "animais não humanos" na invenção inclui todos os vertebrados não humanos, por exemplo, mamíferos não humanos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, camundongo, rato, coelho ou cabra, etc., a menos que indicado de outra forma.

[00117] Conforme usado aqui, o termo "farmaceuticamente aceitável" se refere a um produto ou composto aprovado (ou aprovável) por uma agência reguladora do governo federal ou de um governo estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, incluindo seres humanos.

[00118] Conforme usado aqui, os termos "excipiente, carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável" ou "carreador farmacêutico aceitável" se referem a um excipiente, carreador ou adjuvante que pode ser administrado a um indivíduo, juntamente com pelo menos um anticorpo da presente invenção e que não destrói a atividade do anticorpo. O excipiente, carreador ou adjuvante deve ser não tóxico quando administrado com um anticorpo em doses suficientes para conferir um efeito terapêutico.

[00119] Conforme usado aqui, o termo "melhorar" significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas comparado com a ausência da administração de uma molécula de anticorpo da invenção. "Melhorar" também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

[00120] Conforme usado aqui, os termos "prevenir", "prevenindo" e

"prevenção" se referem à prevenção da recorrência ou início de um ou mais sintomas de um transtorno em um indivíduo como um resultado da administração de um agente profilático ou terapêutico.

[00121] Conforme usado aqui, uma "quantidade eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz", "quantidade terapeuticamente suficiente" ou "dosagem eficaz" se refere àquela quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, anticorpo anti-CD3, individualmente ou como uma parte de um anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico)), que é eficaz ou suficiente, após administração de uma única dose ou múltiplas doses a um indivíduo, na prevenção, cura, melhora, tratamento ou gestão de uma doença, transtorno ou efeito colateral ou redução da taxa de avanço de uma doença ou transtorno ou no prolongamento da cura, alívio ou melhora da condição de um indivíduo que tem um transtorno conforme descrito aqui além do esperado na ausência de tal tratamento. O termo também inclui, em seu escopo, quantidades eficazes para melhorar a função fisiológica normal. Uma quantidade eficaz pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado como administrado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais de outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado.

[00122] Conforme usado aqui, o agente eficaz é capaz de direcionar células T efetoras para induzir à citotoxicidade mediada por células T de células associadas a uma doença, tal como câncer, doença autoimune ou doença infecciosa. O agente terapêutico da presente invenção introduz a uma resposta imune mediada por células T por meio da modulação de um antígeno CD3 na superfície das células T, particularmente CD3, mais particularmente CD3 épsilon.

[00123] Em relação ao câncer, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de agente terapêutico que inibe o crescimento de um tumor ou câncer ao retardar, interromper ou parar seu crescimento e/ou metástases.

[00124] A potência é uma medida da atividade de um agente terapêutico expressa em termos da quantidade necessária para produzir um efeito de determinada intensidade. Um agente altamente potente evoca uma resposta maior em baixas concentrações comparado com um agente de menor potência que evoca uma resposta menor em baixas concentrações. A potência é uma função da afinidade e eficácia. A eficácia se refere à capacidade do agente terapêutico de produzir uma resposta biológica ao se ligar a um ligante alvo e à magnitude quantitativa desta resposta. Conforme usado aqui, o termo "metade da concentração eficaz máxima (EC50)" se refere à concentração de um agente terapêutico que causa metade de uma resposta entre a linha de base e o máximo após um tempo de exposição especificado. O agente terapêutico pode causar inibição ou estimulação. O valor de EC50 é comumente empregado e é usado aqui como uma medida de potência.

[00125] Conforme usado aqui, "terapia combinada" ou administração "em combinação com" se refere ao uso de mais de um agente profilático e/ou terapêutico. O uso do termo "terapia combinada" ou "em combinação" não restringe a ordem na qual os agentes profiláticos e/ou terapêuticos são administrados a um indivíduo que tem um transtorno. Em outras palavras, a terapia combinada pode ser feita através de tratamento separado, sequencial ou simultâneo com os agentes terapêuticos. No caso de "administração sequencial", o primeiro agente administrado pode estar exercendo algum efeito fisiológico no indivíduo quando o segundo agente é administrado ou se torna ativo no indivíduo.

[00126] O termo "administração simultânea", conforme usado aqui em relação à administração de agente profilático e/ou terapêutico, se refere à administração de agentes de modo que os agentes individuais estejam presentes dentro de um indivíduo ao mesmo tempo. A administração simultânea pode ser realizada quando as moléculas são formuladas em uma única composição ou em composições separadas administradas ao mesmo tempo ou tempo similar. A administração sequencial pode ser em qualquer ordem conforme necessário.

[00127] O termo "grupamento de diferenciação 3" ou "CD3" se refere a um complexo de proteínas multimérico, conhecido historicamente como complexo T3, e é composto por quatro cadeias polipeptídicas distintas; épsilon (), gama (), delta () e zeta () que se reúnem e funcionam como três pares de dímeros (por exemplo, , ). O complexo CD3 serve como um correceptor de células T que se associa de forma não covalente ao receptor de células T (TCR) (Smith-Garvin et al. 2009) e gera um sinal de ativação em linfócitos T. O complexo da proteína CD3 é uma característica definidora da linhagem de células T, portanto, os anticorpos anti-CD3 podem ser usados efetivamente como marcadores de células T (Chetty e Gatter 1994). É bem sabido que os anticorpos anti-CD3 induzem à geração de células T citotóxicas através de ativação da produção de linfocinas endógenas e são capazes de matar seletivamente alvos tumorais (Yun et al., Cancer Research, 49: 4770-4774 (1989)).

[00128] As células T desempenham um papel central na imunidade mediada por células em seres humanos e animais. O reconhecimento e a ligação de um determinado antígeno são mediados pelos TCRs expressos na superfície das células T. O TCR de uma célula T é capaz de interagir com peptídeos imunogênicos (epítopos) ligados às moléculas do principal complexo de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex, MHC) e apresentados na superfície das células alvo. A ligação específica do TCR desencadeia uma cascata de sinais dentro da célula T, levando à proliferação e diferenciação em uma célula T efetora madura. Mais especificamente, as células T expressam complexos de TCR que são capazes de induzir a respostas imunes específicas para antígeno (Smith-Garvin et al., 2009). Os antígenos são peptídeos expressos por células tumorais e células infectadas por vírus capazes de estimular respostas imunes. Antígenos expressos intracelularmente são ligados às moléculas de classe I do complexo de histocompatibilidade (MHC classe I) e transportados para a superfície onde são expostos às células T. Se a afinidade de ligação do TCR à moléculas do MHC de classe I no complexo com o antígeno for suficiente, a formação de uma sinapse imune será iniciada. A sinalização através da sinapse imune é mediada pelos correceptores de CD3 que formam dímeros épsilon/delta, delta/gama e zeta/zeta. Tais dímeros se associam ao TCR e geram um sinal de ativação nos linfócitos T. Esta cascata de sinalização direciona a morte mediada por células T da célula que expressa o antígeno. A citotoxicidade é mediada pela liberação e transferência de granzima B e perforina da célula T para a célula alvo.

[00129] Conforme usado aqui, um "antígeno ativador de célula T" se refere a um determinante antigênico expresso na superfície de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir à ativação de células T mediante interação com uma molécula de ligação a antígeno. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação a antígeno com um antígeno ativador de célula T pode induzir à ativação de células T ao desencadear a cascata de sinalização do complexo receptor de células T. Em uma modalidade particular, o antígeno ativador de célula T é CD3, particularmente a subunidade épsilon de CD3 (consulte UniProt N° P07766 (versão 130), NCBI RefSeq N° NP_000724.1, SEQ ID NO: 66 para a sequência humana). Normalmente, uma variante alélica de ocorrência natural tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 %, 97 % ou 99 % idêntica à proteína descrita no Nº de Acesso GenBank: BAB71849.1.

[00130] "Ativação de células T", conforme usado aqui, se refere a uma ou mais respostas celulares de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionadas a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. As moléculas de ligação a antígeno biespecíficas ativadoras de células T da invenção são capazes de induzir à ativação de células T. Ensaios adequados para medir a ativação de células T são conhecidos na técnica descrita aqui.

[00131] Conforme usado aqui, um "anticorpo que se liga à CD3", um "anticorpo que reconhece a CD3", um "anticorpo anti-CD3" ou um "anticorpo contra a CD3" inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente uma única subunidade de CD3 (por exemplo, épsilon, delta, gama ou zeta), bem como anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente um complexo dimérico de duas subunidades de CD3 (por exemplo, dímeros gama/épsilon, delta/épsilon e zeta/zeta de CD3). A épsilon CD3 humana é indicada no N° de Acesso GenBank NM_000733. Os anticorpos da presente invenção podem se ligar à CD3 solúvel e/ou CD3 expressa na superfície celular. A CD3 solúvel inclui proteínas CD3 naturais, bem como variantes de proteína CD3 recombinantes tais como, por exemplo, construções monoméricas e diméricas de CD3 que carecem de um domínio transmembrana ou não estão associados a uma membrana celular.

[00132] Os anticorpos dirigidos contra CD3 são capazes de gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Outros ligantes de ativação de células T também podem ser usados incluindo, sem limitação, CD28, CD134, CD137 e CD27.

[00133] A presente invenção inclui anticorpos de um braço que se ligam à CD3. Conforme usado aqui, um "anticorpo de um braço"

significa uma molécula de ligação a antígeno que compreende uma única cadeia pesada de anticorpo e uma única cadeia leve de anticorpo. Os anticorpos de um braço da presente invenção podem compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos VL/VH ou CDR conforme apresentado nas Tabelas 1, 2 e 3 aqui.

[00134] Os anticorpos anti-CD3 descritos aqui podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácidos na região estrutural e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve comparado com as sequências de linhagem germinativa correspondentes a partir das quais os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser facilmente verificadas ao comparar as sequências de aminoácidos descritas aqui com as sequências de linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, bases de dados públicas de sequências de anticorpos. A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas aqui, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou regiões de CDR sofreram mutação para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado ou o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana ou uma substituição conservativa de aminoácido do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são denominadas aqui coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"). Aqueles versados na técnica, começando com as sequências da região variável de cadeias pesada e leve descritas aqui, podem produzir facilmente numerosos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que compreendem uma ou mais mutações individuais da linhagem germinativa ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, todos os resíduos da região estrutural e/ou regiões CDR dentro dos domínios VH e/ou VL sofrem mutação inversa para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em algumas modalidades, apenas determinados resíduos sofrem mutação inversa para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutantes encontrados nos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos de FR4 ou apenas os resíduos mutantes encontrados dentro da CDR1, CDR2 ou CDR3. Em algumas outras modalidades, um ou mais resíduos da região estrutural e/ou regiões CDR sofrem mutação para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado).

[00135] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro da região estrutural e/ou regiões CDR, por exemplo, onde determinados resíduos individuais sofrem mutação para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa particular, enquanto que os outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou sofrem mutação para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação aprimorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou antagonistas aprimoradas ou aumentadas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos obtidos desta maneira estão, de modo geral, incluídos na presente invenção.

[00136] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD3 que compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos VH, VL e/ou CDR descritas aqui que têm uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD3 que têm sequências de aminoácidos VH, VL e/ou CDR, por exemplo, com 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer das sequências de aminoácidos VH, VL e/ou CDR apresentadas na Tabela 1 aqui.

[00137] Conforme usado aqui, o termo "complexo" ou "em complexo" se refere à associação de duas ou mais moléculas que interagem entre si através de ligações e/ou forças (por exemplo, van der waals, forças hidrofóbicas, hidrofílicas) que não são ligações peptídicas. Em uma modalidade, o complexo é heteromultimérico. Deve ser entendido que o termo "complexo de proteína" ou "complexo de polipeptídeo", conforme usado aqui, inclui complexos que têm uma entidade não proteica conjugada a uma proteína no complexo de proteína (por exemplo incluindo, porém sem limitações, moléculas químicas, tais como uma toxina ou um agente de detecção).

[00138] Conforme usado aqui, o "anticorpo anti-CD3" inclui anticorpos monovalentes com uma especificidade única, bem como "anticorpo biespecífico", "anticorpo específico duplo", anticorpos triespecíficos", "anticorpo bifuncional", "heteromultímero", "complexo heteromultimérico", "diacorpo heterodimérico biespecífico", "polipeptídeo heteromultimérico" ou "IgGs heterodiméricas biespecíficas". Em algumas modalidades da invenção, os anticorpos anti-CD3 da invenção são anticorpos humanos ou humanizados.

[00139] Conforme usado aqui, um "anticorpo biespecífico" é uma molécula que compreende pelo menos um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o segundo polipeptídeo difere quanto à sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo em pelo menos um resíduo de aminoácido. Em alguns casos, o biespecífico é um anticorpo híbrido artificial que tem duas regiões de cadeia pesada e uma região de cadeia leve diferentes. De preferência, o anticorpo biespecífico tem especificidade de ligação por pelo menos dois ligantes, antígenos ou sítios de ligação diferentes. Consequentemente, os anticorpos biespecíficos podem se ligar simultaneamente a dois antígenos diferentes. Os dois sítios de ligação a antígeno de um anticorpo biespecífico se ligam a dois epítopos diferentes, os quais podem residir no mesmo ou em diferentes alvos de proteína, por exemplo, um alvo tumoral.

[00140] Conforme usado aqui, a primeira cadeia polipeptídica e a segunda cadeia polipeptídica do "anticorpo biespecífico" compreendem pelo menos uma região VL e uma região VH do anticorpo ou fragmento do mesmo, em que ambos os domínios de ligação do anticorpo estão compreendidos dentro de uma única cadeia polipeptídica na qual as regiões VL e VH em cada cadeia polipeptídica são de anticorpos diferentes.

[00141] Os anticorpos biespecíficos podem ser derivados de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, nos documentos EP404.097; W093/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444- 6448, 1993. Os anticorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv "cruzados" nos quais as regiões VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em cadeias polipeptídicas diferentes.

[00142] Conforme usado aqui, os termos "ligado", "fundido", "fusão", "ligado de forma covalente", "acoplado de forma covalente" e "geneticamente fundido" são usados indistintamente. Estes termos se referem à união de dois ou mais elementos ou componentes através de quaisquer meios, incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Conforme usado aqui, o termo "ligado de forma covalente" significa que as porções especificadas estão diretamente ligadas de forma covalente entre si ou então são indiretamente unidas de forma covalente entre si por meio de uma porção ou porções intermediárias, tal como um peptídeo ou porção de ligação. Em uma modalidade preferida, as porções são fundidas de forma covalente. Um tipo de ligação covalente é uma ligação peptídica. Métodos de conjugação química (por exemplo, usando agentes de reticulação heterobifuncionais) são conhecidos na técnica. Porções também podem ser geneticamente fundidas. Conforme usado aqui, o termo "geneticamente fundido", "geneticamente ligado" ou "geneticamente unido" se refere à ligação colinear, covalente ou ligação de duas ou mais proteínas, polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos por meio de suas estruturas peptídicas individuais, através da expressão genética de uma única molécula polinucleotídica que codifica tais proteínas, polipeptídeos ou fragmentos. Esta fusão genética resulta na expressão de uma única sequência genética contígua. As fusões genéticas preferidas estão in-frame, isto é, dois ou mais quadros de leitura aberta (Open Reading Frames, ORFs) são fundidos para formar um ORF contíguo mais longo de uma maneira que mantém o quadro de leitura correto dos ORFs originais. Assim, a proteína de fusão recombinante resultante é um único polipeptídeo que contém dois ou mais segmentos de proteína que correspondem aos polipeptídeos codificados pelos ORFs originais (segmentos cujos segmentos não são normalmente assim unidos na natureza). Neste caso, o único polipeptídeo é clivado durante o processamento para produzir moléculas diméricas que compreendem duas cadeias polipeptídicas.

[00143] Conforme usado aqui, o termo "ligado" ou "ligações" se refere a uma ligação peptídica direta entre uma primeira e segunda sequências de aminoácidos ou uma ligação que envolve uma terceira sequência de aminoácidos que é ligada por peptídeo a e entre primeira e segunda sequências de aminoácidos. Por exemplo, um peptídeo ligante ligado à extremidade C-terminal de uma sequência de aminoácidos e à extremidade N-terminal da outra sequência de aminoácidos. Conforme usado aqui, o termo "ligante" se refere a uma sequência de aminoácidos de dois ou mais aminoácidos de comprimento. O ligante pode consistir em aminoácidos neutros polares ou não polares. Um ligante pode ter, por exemplo, 2 a 100 aminoácidos de comprimento, tal como entre 2 e 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento. Um ligante pode ser "clivável", por exemplo, através de autoclivagem ou clivagem enzimática ou química. Os sítios de clivagem em sequências de aminoácidos e enzimas e produtos químicos que clivam em tais sítios são bem conhecidos na técnica e também são descritos aqui.

[00144] Conforme usado aqui, o termo "ligação de dissulfeto" ou "ligação dissulfeto de cisteína-cisteína" se refere a uma interação covalente entre duas cisteínas em que os átomos de enxofre das cisteínas são oxidados para formar uma ligação de dissulfeto. A energia média de ligação de uma ligação de dissulfeto é cerca de 60 kcal/mol comparado com 1-2 kcal/mol para uma ligação de hidrogênio. No contexto da presente invenção, as cisteínas que formam a ligação de dissulfeto estão dentro das regiões estruturais do anticorpo fita simples e servem para estabilizar a conformação do anticorpo. Os resíduos de cisteína podem ser introduzidos, por exemplo, por meio de mutagênese sítio-dirigida, de modo que ligações de dissulfeto estabilizantes possam ser feitas dentro da molécula.

[00145] A designação "knob-in-hole" é análoga à designação de "protuberância e cavidade" e pode ser usada de forma alternada.

[00146] Uma "protuberância" ou "knob" se refere a pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos que se projeta a partir da interface do primeiro polipeptídeo e é, portanto, posicionável em uma cavidade compensatória na interface adjacente (isto é, a interface do segundo polipeptídeo) de modo a estabilizar o heterodímero e, assim, favorecer a formação de heterodímero em relação à formação de homodímero, por exemplo.

A protuberância pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, ao alterar o ácido nucleico que codifica a interface). Tipicamente, o ácido nucleico que codifica a interface do primeiro polipeptídeo é alterado para codificar a protuberância.

Para conseguir isto, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "original" na interface do primeiro polipeptídeo é substituído por ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original.

O limite máximo para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do primeiro polipeptídeo.

Determinados resíduos de importação para a formação de uma protuberância são geralmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são, de preferência, selecionados a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). A protuberância ou "knob" é "posicionável" na cavidade ou "hole", o que significa que a localização espacial da protuberância e da cavidade na interface do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e da cavidade são tais que a protuberância pode ser posicionada na cavidade sem perturbar significativamente a associação normal dos primeiro e segundo polipeptídeos na interface.

Uma vez que protuberâncias tais como fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W) normalmente não se estendem perpendicularmente a partir do eixo da interface, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente depende da modelagem do par de protuberância/cavidade com base em uma estrutura tridimensional, tal como aquela obtida por meio de cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear (Nuclear Magnetic Resonance, NMR). Isto pode ser alcançado usando métodos amplamente aceitos na técnica.

[00147] Uma "cavidade" ou "hole" se refere a pelo menos uma cadeia lateral de aminoácidos que é rebaixada na interface do segundo polipeptídeo e, portanto, acomoda uma protuberância correspondente na interface adjacente do primeiro polipeptídeo. A cavidade pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, ao alterar o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para conseguir isto, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "original" na interface do segundo polipeptídeo é substituído por DNA que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original. O limite máximo para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Determinados resíduos de importação para a formação de uma cavidade são geralmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são, de preferência, selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V).

[00148] Um "antígeno alvo", um "antígeno celular alvo", um "antígeno tumoral" ou um "antígeno tumoral específico", conforme usado aqui, se refere a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, por exemplo, uma célula em um tumor, tal como uma célula cancerosa ou uma célula do estroma tumoral.

[00149] Conforme usado aqui, o termo "câncer" ou "canceroso" se refere a ou descreve uma condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado, uma neoplasia ou um tumor resultante de um crescimento anormal descontrolado de células. Em alguns aspectos, o câncer se refere a um tumor primário maligno sem metástase que permaneceu localizado. Em outros aspectos, o câncer se refere a um tumor maligno que invadiu e destruiu estruturas corporais vizinhas e se espalhou para locais distantes. Em alguns aspectos, o câncer está associado a um antígeno canceroso específico. Exemplos de câncer incluem, porém sem limitações, câncer da cavidade oral e faringe, do sistema digestivo (por exemplo, esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, fígado, vesícula biliar, dutos biliares e pâncreas), do sistema respiratório (por exemplo, laringe, pulmão e brônquio, incluindo carcinoma pulmonar de células não pequenas), ossos e articulações (por exemplo, metástases ósseas), tecidos moles, pele (por exemplo, melanoma), mama, sistema genital (por exemplo, colo uterino, corpo uterino, vulva, ovário, vagina, próstata e testículo), sistema urinário (por exemplo, bexiga urinária, rim, pelve renal e ureter), olhos e a órbita, o cérebro e o sistema nervoso (por exemplo, glioma), cabeça e pescoço ou o sistema endócrino (por exemplo, tireoide). O câncer também pode ser um linfoma (por exemplo, doença de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin), mieloma múltiplo ou leucemia (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica e assim por diante). Em determinadas modalidades, o câncer do sistema digestivo é um câncer de esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, fígado, vesícula biliar, dutos biliares e pâncreas.

[00150] Em relação ao câncer, o tratamento é útil em qualquer um ou mais dos seguintes: (a) tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de uma condição associada a células malignas em um indivíduo (por exemplo, câncer relacionado ao trato gastrintestinal, tal como câncer colorretal (ColoRectal Cancer, CRC)); (b) inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem um tumor maligno que expressa um antígeno tumoral; (c) inibir a metástase de células cancerosas (malignas) que expressam um antígeno tumoral em um indivíduo que tem uma ou mais células malignas que expressam um antígeno tumoral; (d) induzir à regressão (por exemplo, regressão de longo prazo) de um tumor que expressa um antígeno tumoral; (e) exercer atividade citotóxica sobre células malignas que expressam um antígeno tumoral; (f) aumentar a sobrevida sem progressão de um indivíduo que tem um transtorno associado ao antígeno tumoral; (g) aumentar a sobrevida global de um indivíduo que tem um transtorno associado ao antígeno tumoral; (h) reduzir o uso de agentes quimioterapêuticos ou citotóxicos adicionais em um indivíduo que tem um transtorno associado a antígeno tumoral; (i) reduzir a carga tumoral em um indivíduo que tem um transtorno associado ao antígeno tumoral; ou (j) bloquear a interação de um antígeno tumoral com outros fatores ainda não identificados. Embora não desejando ser limitado pela teoria, acredita-se que o tratamento causa a inibição, ablação ou morte de uma célula in vitro ou in vivo ou de outra forma reduz a capacidade de uma célula, incluindo uma célula aberrante, de mediar um transtorno, por exemplo, um transtorno conforme descrito aqui, tal como câncer.

[00151] Conforme usado aqui, o termo "célula maligna" ou "malignidade" se refere a tumores ou células tumorais que são invasivas e/ou capazes de sofrer metástases isto é, uma célula cancerosa. Embora quaisquer materiais e métodos similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem ou ensaio da presente invenção, materiais e métodos preferidos são agora descritos. Materiais e Métodos

[00152] Várias técnicas para a produção de anticorpos foram descritas, incluindo o método tradicional de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais, técnicas recombinantes para a produção de anticorpos (incluindo anticorpos quiméricos, por exemplo, anticorpos humanizados), produção de anticorpos em animais transgênicos e a tecnologia de exibição em fagos recentemente descrita para a preparação de anticorpos "totalmente humanos". Tais técnicas são brevemente descritas a seguir.

[00153] Os anticorpos policlonais para o antígeno de interesse geralmente podem ser produzidos em animais através de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno e um adjuvante. O antígeno (ou um fragmento que contém a sequência de aminoácidos alvo) pode ser conjugado a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugação por meio de resíduos de cisteína) ou N- hidroxissuccinimida (por meio de resíduos de lisina). Os animais são imunizados contra os conjugados imunogênicos ou derivados e, algumas semanas, depois os animais recebem um reforço através de injeção subcutânea em vários locais. 7 a 14 dias depois, o sangue dos animais é coletado e o soro é testado quanto à titulação de anticorpos. Os animais recebem reforços até que a titulação estabilize. De preferência, o animal recebe um reforço com o conjugado do mesmo antígeno, porém, conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, agentes agregadores, tal como alúmen, são usados para aumentar a resposta imune.

[00154] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler & Milstein, Nature 256: 495, 1975, ou podem ser feitos por meio de métodos de DNA recombinante (Cabilly et al., Patente US N° 4.816.567). No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é imunizado conforme descrito acima para induzir a linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são, então, fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986). As células de hibridoma assim preparadas. são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado o qual, de preferência, contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, Proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[00155] A expressão de anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo ou qualquer construção de anticorpos pode ser realizada em células hospedeiras procariotas ou eucariotas apropriadas, tais como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, células de levedura ou células de E. coli e o anticorpo secretado é recuperado e coletado das células (um sobrenadante de cultura de células, um sobrenadante de cultura de células condicionado, um lisato de células ou um volume clarificado). Métodos gerais para a produção de anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17: 183-202, 1999; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8: 271-282, 1986; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16: 151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48: 870-880, 1998. Em uma modalidade específica, a cultura de células é uma cultura de células de mamíferos, tal como uma cultura de células de ovário de hamster chinês (Chinese Hamster Ovary, CHO).

[00156] Em uma modalidade, o anticorpo pode ser recuperado ou isolado de uma fonte que o produz naturalmente. Em algumas de tais modalidades, os anticorpos isolados ou recuperados podem ser submetidos a etapas de purificação adicionais usando métodos convencionais de cromatografia conhecidos na técnica. Em particular, considera-se que os métodos de purificação incluem, porém sem limitações, cromatografia de afinidade (por exemplo, uma cromatografia de afinidade de Proteína A), cromatografia de permuta iônica (por exemplo, uma cromatografia de permuta aniônica ou uma cromatografia de permuta catiônica), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de filtração em gel e/ou diálise. Dentre estes, um método de purificação preferido é o uso de cromatografia em Proteína A. A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado é mais frequentemente agarose, porém, outras matrizes estão disponíveis.

[00157] Outros métodos de purificação de anticorpos, tal como fracionamento em uma coluna de permuta iônica, precipitação com etanol, cromatografia de fase reversa de alta pressão, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose™, cromatografia em resina de permuta catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), eletroforese usando SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio também são conhecidos na técnica. A lista de métodos de purificação acima é de natureza meramente exemplificativa e não se destina a ser uma citação limitativa.

[00158] Alternativamente, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e a linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana para tais camundongos mutantes para a linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após desafio com antígeno. Consulte, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255; 1993 e Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993).

[00159] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser humanizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter et al. (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239 : 1534-1536, 1988), substituindo CDRs de roedores ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Cabilly, supra), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR, e possivelmente alguns resíduos de FR, são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.

É importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina são familiares para aqueles versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do consenso e da sequência de importação, de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s) alvo, seja alcançada. Para obter mais detalhes, consulte o documento WO92/22653, publicado em 23 de dezembro de 1992.

[00160] Os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de exibição em fagos conhecidos na técnica. Em métodos de exibição em fagos, domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que as codificam. Em um aspecto particular, tal fago pode ser usado para exibir domínios de ligação a antígeno, tais como Fab e Fv ou Fv estabilizado por ligação de dissulfeto, expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatórios (por exemplo, humanos ou de murino). O fago que expressa um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou ligado ao antígeno ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo. O fago usado nestes métodos é, tipicamente, um fago filamentoso, incluindo fd e M13. Os domínios de ligação a antígeno são expressos como uma proteína fundida de forma recombinante ao gene III do fago ou à proteína do gene VIII. Exemplos de métodos de exibição em fagos que podem ser usados para produzir as imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkmann et al. "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments", J. Immunol. Methods, 182: 41-50,

1995.

[00161] As características funcionais dos múltiplos isotipos de IgG e seus domínios são bem conhecidas na técnica. As sequências de aminoácidos de lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4 são conhecidas na técnica. A seleção e/ou combinações de dois ou mais domínios de isotipos de IgG específicos para uso nos métodos da invenção podem ser com base em qualquer parâmetro conhecido dos isotipos precursores, incluindo afinidade pelo FcR. Por exemplo, o uso de regiões ou domínios de isotipos de IgG que exibem ligação limitada ou nenhuma ligação ao FcRIIB, por exemplo, IgG2 ou IgG4, pode encontrar uso particular onde se deseja conceber um anticorpo biespecífico para maximizar a ligação a um receptor de ativação e minimizar a ligação a um receptor inibidor. Da mesma forma, o uso de cadeias Fc ou domínios de isotipos de IgG conhecidos por se ligar preferencialmente ao C1q ou FcRIIIA, por exemplo, lgG3, pode ser combinado com modificações de aminoácidos em Fc conhecidas na técnica por aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (Complement Dependent Cytotoxicity, CDC) para conceber um anticorpo biespecífico de modo que a atividade da função efetora, por exemplo, ativação de complemento ou ADCC,

seja maximizada. De forma similar, mutações podem ser feitas nas cadeias Fc ou domínios de isotipos de IgG que minimizam ou eliminam a função efetora da cadeia Fc.

[00162] Durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir desta informação é possível, então, rastrear competitivamente os anticorpos quanto à ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para conseguir isto é conduzir estudos de competição e competição cruzada para encontrar anticorpos que competem ou competem de forma cruzada entre si, por exemplo, os anticorpos que competem pela ligação a antígeno. Um método é identificar o epítopo ao qual os anticorpos se ligam ou "mapeamento de epítopo". Há muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização de epítopos em proteínas, incluindo decompor a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento gênico e ensaios com base em peptídeos sintéticos conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopos pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo se liga. O mapeamento de epítopos está comercialmente disponível a partir de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação a antígeno, experimentos de troca de domínio e mutagênese por varredura de alanina podem ser realizados para identificar os resíduos necessários, suficientes e/ou necessários para ligação ao epítopo. A afinidade de ligação e a taxa de dissociação de uma interação de domínio de ligação a antígeno podem ser determinadas por meio de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio que compreende incubação do antígeno marcado e detecção da molécula ligada ao antígeno marcado. A afinidade da molécula da presente invenção por um antígeno e as taxas de desativação de ligação podem ser determinadas a partir dos dados de saturação através de análise de Scatchard.

[00163] As afinidades e propriedades de ligação dos anticorpos da presente invenção a um antígeno podem ser inicialmente determinadas usando ensaios in vitro (ensaios de base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica para o domínio de ligação a antígeno incluindo, porém sem limitações, ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA), ensaio de ressonância de plasmônio em superfície (SPR), interferometria de biocamada ou ensaios de imunoprecipitação. As moléculas da invenção podem ter propriedades de ligação similares em modelos in vivo (tais como aqueles descritos e divulgados aqui), tais como ensaios in vitro. No entanto, a presente invenção não exclui moléculas da invenção que não exibem o fenótipo desejado em ensaios com base in vitro, mas exibem o fenótipo desejado in vivo.

[00164] Uma vez que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica moléculas da invenção (isto é, domínios de ligação) foi obtida, o vetor para a produção das moléculas pode ser produzido por meio da tecnologia de DNA recombinante usando métodos bem conhecidos na técnica.

[00165] Os polinucleotídeos que codificam os domínios de ligação do anticorpo da presente invenção podem incluir uma sequência polinucleotídica de controle de expressão operativamente ligada às sequências codificadoras do anticorpo, incluindo regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas conhecidas na técnica. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucariotas em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucariotas, mas também podem ser usadas sequências de controle para hospedeiros procariotas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado na linhagem de células hospedeira apropriada, a célula hospedeira é propagada sob condições adequadas para expressar as sequências de nucleotídeos e, conforme desejado, para coleta e purificação dos anticorpos. Linhagens de células eucariotas incluem as linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células HeLa, linhagens de células de mieloma, células B transformadas ou linhagens de células de rim embrionário humano. Em uma modalidade, o DNA que codifica os anticorpos da invenção é isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão os quais são, então, transfectados em células hospedeiras, tais como células COS de símio, células CHO ou células de mieloma que não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinante. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, ao substituir a sequência codificadora pelos domínios constantes das cadeias pesada e leve humana em lugar das sequências homólogas de murino (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984). Deste modo, são preparados anticorpos quiméricos que possuem a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal anti-antígeno aqui.

[00166] Anticorpos Anti-CD3

[00167] Em um aspecto, a presente invenção fornece agentes que se ligam especificamente à CD3 (por exemplo, subunidade épsilon de CD3 humana de comprimento completo (por exemplo, número de acesso NP_000724 ou SEQ ID NO: 66)).

[00168] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-CD3 se liga especificamente à CD3 humana.

[00169] Os anticorpos anti-CD3 exemplificativos da presente invenção estão listados nas Tabelas 1, 2 e 3 aqui. A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões VH e regiões VL. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo que tem qualquer uma das sequências de cadeia leve parcial, conforme listado na Tabela 1 e/ou qualquer uma das sequências de cadeia pesada parcial, conforme listado na Tabela 1. Tabela 1

[00170] Na Tabela 1, as sequências sublinhadas são sequências de CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia.

[00171] A invenção fornece porções de CDR de anticorpos para CD3 (incluindo regiões de CDR de Chothia, Kabat CDRs e Contact). Métodos e técnicas para identificar CDRs nas sequências de aminoácidos VH e VL são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos VH e/ou VL especificadas descritas aqui. Convenções exemplificativas que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat se baseia na variabilidade da sequência, a definição de Chothia se baseia na localização das regiões do loop estrutural e a definição AbM é um meio-termo entre as abordagens de Kabat e Chothia. Consulte, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências de CDR dentro de um anticorpo. Deve ser entendido que, em algumas modalidades, as CDRs podem ser uma combinação das CDR de Kabat e Chothia (também denominadas "CDRs combinadas" ou "CDRs estendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs de Kabat. Em algumas outras modalidades, as CDRs são as CDRs de Chothia. Em outras palavras, em modalidades com mais de uma CDR, as CDRs podem ser qualquer uma das CDRs de Kabat, Chothia, combinação de CDRs ou combinações dos mesmos. As Tabelas 2 e 3 fornecem exemplos de sequências de CDR fornecidas aqui.

[00172] Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma sequência de aminoácidos que está listada na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % identidade de sequência com a mesma.

[00173] Em algumas de tais modalidades, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos das regiões VL listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00174] Em algumas outras modalidades, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos das regiões VH listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00175] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente à CD3, em que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade VH um (CDR1 VH), uma região determinante de complementaridade VH dois (CDR2 de VH) e uma região determinante de complementaridade três de VH (CDR3 de VH) da sequência de VH mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 ou 35; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade um de VL (CDR1 de VL), uma região determinante de complementaridade dois de VL (CDR2 de VL) e uma região determinante de complementaridade três de VL (CDR3 de VL) da sequência de VL mostrada em SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 ou 89. Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem um conjunto de seis CDRs (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH) contido em um par de sequência de aminoácidos VL/VH conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-CD3 exemplificativos listados na Tabela 1.

[00176] Em modalidades específicas, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem as sequências de aminoácidos CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH ou CDR3 de

VH contidas em um par de sequências de aminoácidos VL/VH selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 e 2 (por exemplo, 2B5-0001 (2B5)); SEQ ID NOs: 3 e 2 (2B5-0002); SEQ ID NOs: 3 e 4 (por exemplo, 2B5-0006 (2B5v6)); SEQ ID NOs: 3 e 5 (por exemplo, 2B5-0009); SEQ ID NOs: 6 e 7 (por exemplo, 2B5-0517); SEQ ID NOs: 8 e 7 (por exemplo, 2B5-0522); SEQ ID NOs: 6 e 4 (por exemplo, 2B5-0533); SEQ ID NOs: 8 e 4 (por exemplo, 2B5-0538); SEQ ID NOs: 9 e 10 (por exemplo, 2B5-0598); SEQ ID NOs: 9 e 7 (por exemplo, 2B5-0623); SEQ ID NOs: 1 1 e 12 (por exemplo, 2B5-0707); SEQ ID NOs: 34 e 35 (por exemplo, 2B5-0003); SEQ ID NOs: 85 e 2 (por exemplo, H2B4); SEQ ID NOs: 9 e 4 (por exemplo, 2B5-1038); SEQ ID NOs: 87 e 4 (por exemplo, 2B5-1039); e SEQ ID NOs: 89 e 4 (por exemplo, 2B5-1040).

[00177] A Tabela 2 apresenta as regiões CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de anticorpos anti-CD3 exemplificativos. Tabela 2

[00178] Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR1 de VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1 de VH listadas na Tabela 2 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00179] Em outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR2 de VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR2 de VH listadas na Tabela 2 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[00180] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR3 de VH que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR3 de VH listadas na Tabela 2 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[00181] A Tabela 3 apresenta CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL dos anticorpos anti-CD3 exemplificativos. Tabela 3

[00182] Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR1 de VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR1 de VL listadas na Tabela 3 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00183] Em outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR2 de VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR2 de VL listadas na Tabela 3 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00184] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos que compreendem uma CDR3 de VL que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR3 de VL listadas na Tabela 3 ou uma sequência substancialmente similar à mesma que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00185] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente à CD3, em que o anticorpo compreende: (a) uma região variável (VH) de cadeia pesada (HC) que compreende uma região determinante de complementaridade VH um (CDR1), uma região determinante de complementaridade de VH dois (CDR2 de VH) e uma região determinante de complementaridade de VH três (CDR3 de VH) de uma VH que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 e 35; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve (LC) (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade de VL um (CDR1 de VL), uma região determinante de complementaridade de VL dois (CDR2 de VL) e uma região determinante de complementaridade de VL três (CDR3 de VL) de uma VL que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 e 89.

[00186] Em modalidades específicas, o anticorpo compreende: (a) uma região VH que compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 13, 14 ou 15; (ii) uma CDR2 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende uma sequência de SEQ

ID NO: 18 ou 25; e/ou (b) uma região VL que compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 26, 29, 30, 32, 91 ou 92; (ii) uma CDR2 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 27 ou 31; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 28 ou 33.

[00187] Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga à CD3 e compete com o anticorpo conforme descrito aqui, incluindo 2B5-0001 (2B5), 2B5-0002, 2B5-0006 (2B5v6), 2B5-0009, 2B5 -0517, 2B5-0522, 2B5-0533, 2B5-0538, 2B5-0598, 2B5- 0623, 2B5-0707, 2B5-0003, 2B5-1038, 2B5-1039 e 2B5-1040.

[00188] Em algumas modalidades, a invenção também fornece porções de CDR de anticorpos anti-CD3 com base em regiões de contato de CDR. As regiões de contato de CDR são regiões de um anticorpo que conferem especificidade ao anticorpo por um antígeno. Em geral, as regiões de contato de CDR incluem as posições de resíduos nas zonas de CDR e Vernier que são restritas a fim de manter a estrutura de loop adequada para que o anticorpo se ligue a um antígeno específico. Consulte, por exemplo, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283: 1156-1166, 2007. A determinação das regiões de contato de CDR está bem ao alcance da perícia na técnica. Alguns dos anticorpos anti-CD3 fornecidos aqui podem ser denominados por mais de um nome. Por exemplo, 2B5-0001 pode ser denominado como 2B5 ou h2B5; e 2B5-0006 pode ser denominado como 2B5v6 ou h2B5v6. A Tabela 4 mostra o formato do anticorpo e a região do anticorpo anti-CD3 presente nos anticorpos conforme descrito aqui. Tabela 4 Região de anticorpo Sequência Descrição Formato anti-CD3 2B5-0001 (2B5) Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0001 2B5-0002 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0002 2B5-0003 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0003

2B5-0006 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0006 (2B5v6) 2B5-0009 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0009 2B5-0517 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0517 2B5-0522 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0522 2B5-0533 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0533 2B5-0538 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0538 2B5-0598 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0598 2B5-0623 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0623 2B5-0707 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-0707 2B5-1038 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-1038 2B5-1039 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-1039 2B5-1040 Anticorpo anti-CD3 IgG 2B5-1040 H2B4 Anticorpo anti-CD3 IgG H2B4 Anticorpo biespecífico CD3- CD3 GUCY2C-H2B4 H2B4 GUCY2c biespecífico Anticorpo biespecífico CD3- CD3 GUCY2C-2B5 2B5-0001 GUCY2c biespecífico Anticorpo biespecífico CD3- CD3 GUCY2C-2B5v6 2B5-0006 GUCY2c biespecífico

[00189] A afinidade de ligação (KD) dos anticorpos conforme descrito aqui para CD3 (tal como CD3 épsilon humana (por exemplo, SEQ ID NO: 40), pode ser cerca de 0,001 nM a cerca de 6500 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 4500 nM, 4000 nM, 3500 nM, 3000 nM, 2500 nM, 2000 nM, 1500 nM, 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5,5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, 0,002 nM ou 0,001 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é menor do que cerca de 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 5000 nM, 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 500 nM, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,01 nM ou menos. Em uma determinada modalidade, o anticorpo tem uma KD de cerca de 80 a cerca de 200 pM. Em uma modalidade particular, o anticorpo tem uma KD de cerca de 10 nm a 2000 nm.

[00190] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso em um método de modulação de uma resposta imune mediada por células T em um indivíduo que precisa. Em modalidades específicas, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso em um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo.

[00191] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, opcionalmente em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão, bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e câncer do sistema digestivo.

[00192] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer, em que a resposta imune mediada por células T é modulada ou em que o crescimento de células tumorais é inibido.

[00193] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam anticorpos anti-CD3 ou porções dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de VH ou VL listadas na Tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com as mesmas.

[00194] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH ou CDR3 de VH listadas na Tabela 2 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.

[00195] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL ou CDR3 de VL listadas na Tabela 3 ou uma sequência substancialmente similar às mesmas que tem pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[00196] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma HC VR, em que a VH compreende um conjunto de três CDRs (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH ou CDR3 de VH), em que o conjunto de sequências de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-CD3 exemplificativos listados na Tabela 2.

[00197] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma LC VR, em que a VL compreende um conjunto de três CDRs (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL ou CDR3 de VL), em que o conjunto de sequências de aminoácidos de CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-CD3 exemplificativos listados na Tabela 3.

[00198] A presente invenção também fornece moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma VH e uma VL, em que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de VH listadas na Tabela 1 e em que a VL compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos de VL listadas na Tabela 1.

[00199] A presente invenção também fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD3. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes que compreendem qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos supracitadas, isto é, moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências VH e VL apresentadas na Tabela 1 e/ou sequências de CDR conforme apresentado nas Tabelas 2 ou 3. Também incluídas no escopo da presente invenção estão células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção de anticorpos ou porções dos mesmos por meio de cultura das células hospedeiras sob condições que permitam a produção dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos e recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpos assim produzidos.

[00200] Em determinadas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do anticorpo 2B5-0001 (2B5), 2B5- 0002, 2B5-0006 (2B5v6), 2B5-0009, 2B5- 0517, 2B5-0522, 2B5-0533, 2B5- 0538, 2B5-0598, 2B5-0623, 2B5-0707, 2B5-0003, 2B5-1038, 2B5-1039 ou 2B5-1040, conforme listado na Tabela 4.

[00201] A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode, então, ser expandida e congelada para uso futuro. Vetores (incluindo vetores de expressão) e células hospedeiras são ainda descritos aqui.

[00202] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais sequências também estão incluídos na presente invenção. Em um aspecto, a invenção fornece um método de preparação de qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotídeos podem ser fita simples (codificadora ou antissenso) ou fita dupla e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, as quais contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de maneira um-para- um, e moléculas de mRNA, as quais não contêm íntrons. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

[00203] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou podem compreender uma variante de tal sequência. Variantes polinucleotídicas contêm uma ou mais substituições, adições, eliminações e/ou inserções, de modo que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não seja diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode, em geral, ser avaliado conforme descrito aqui. As variantes exibem, de preferência, pelo menos cerca de 70 % de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de identidade e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95 % de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma parte do mesmo.

[00204] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Aqueles versados na técnica podem usar as sequências fornecidas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.

[00205] Para a preparação de polinucleotídeos usando métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conforme discutido adicionalmente aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras através de qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno através de absorção direta, endocitose, transfecção, F-cruzamento ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al.,

1989.

[00206] Alternativamente, PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e está descrita nas Patente US Nos 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e

4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[00207] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode, então, ser isolado usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, conforme apresentado em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

[00208] Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira a ser usada, os vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones que contêm o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, tais como BioRad, Strategene e Invitrogen.

[00209] Os vetores de expressão geralmente são construções polinucleotídicas replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem, porém sem limitações, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adenoassociados, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT N° WO 87/04462. Os componentes do vetor podem, em geral, incluir, porém sem limitações, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinalizadora; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle de transcrição adequados (tais como promotores, intensificadores e terminadores). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle da tradução também são geralmente necessários, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de início de tradução e códons terminais.

[00210] Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira através de qualquer um de uma série de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como o vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos frequentemente dependerá das características da célula hospedeira.

[00211] A invenção também fornece células hospedeiras que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas com a finalidade de isolar genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos incluem, porém sem limitações, células COS, HeLa e CHO. Consulte também Publicação PCT N° WO 87/04462. Células hospedeiras que não são de mamíferos adequadas incluem células procariotas (tais como E. coli ou B. subtillis) e leveduras (tais como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). De preferência, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente 10 vezes maior, ainda mais preferivelmente 20 vezes maior do que aquele do anticorpo endógeno ou proteína CD3 ou um domínio CD3 correspondente (por exemplo, domínios 1-4) realizado por meio de um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

[00212] A invenção também abrange scFv de anticorpos da presente invenção. Os fragmentos de região variável com uma única cadeia são feitos ao ligar regiões variáveis de cadeias leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação curto (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Um exemplo de um peptídeo de ligação compreende a sequência de SEQ ID NO: 65. Em uma modalidade, o peptídeo de ligação constrói uma ponte de aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável e o terminal amino de outra região variável. Ligantes de outras sequências foram concebidos e usados (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Os ligantes devem ser polipeptídeos curtos e flexíveis e, de preferência, compostos por menos de cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, tal como fixação a fármacos ou fixação a suportes sólidos. Variantes com uma única cadeia podem ser produzidas de forma recombinante ou sintética. Para a produção sintética de scFv, um sintetizador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado que contém o polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, seja eucariota, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariotas, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos por meio de manipulações de rotina, tal como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando métodos padrão de purificação de proteínas conhecidos na técnica.

[00213] Em um aspecto, é fornecida uma sequência polinucleotídica que codifica qualquer uma das sequências de cadeia leve parciais e/ou qualquer uma das sequências de cadeia pesada parciais descritas aqui. Polinucleotídeos de CD3 exemplificativos que codificam as regiões VH e regiões VL dos anticorpos da presente invenção estão listados na Tabela 5. Tabela 5

[00214] Em um aspecto, a invenção fornece composições (tal como uma composição farmacêutica) que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos da invenção.

Em algumas modalidades, a composição pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos mostrados na Tabela 5. Em modalidades específicas, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos descritos aqui, por exemplo, qualquer um dos polinucleotídeos mostrados na Tabela 5.

[00215] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma destas sequências também estão abrangidos pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser fita simples (codificação ou antissenso) ou fita dupla e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. As moléculas de RNA incluem mRNAs maduros e imaturos, tais como mRNAs precursores (pré-mRNA) ou mRNAs nucleares heterogêneos (hnRNA) e mRNAs maduros. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

[00216] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou podem compreender uma variante de tal sequência. Variantes polinucleotídicas contêm uma ou mais substituições, adições, eliminações e/ou inserções, de modo que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não seja diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode, em geral, ser avaliado conforme descrito aqui. As variantes exibem, de preferência, pelo menos cerca de 70 % de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de identidade e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95 % de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma parte do mesmo.

[00217] Duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas são denominadas "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima, conforme descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são normalmente realizadas ao comparar as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", conforme usado aqui, se refere a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75 ou 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições após as duas sequências serem alinhadas de forma otimizada.

[00218] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no pacote Lasergene de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando parâmetros padrão. De preferência, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada ao comparar duas sequências alinhadas de forma otimizada ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção do polinucleotídeo ou sequência polipeptídica na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, geralmente 5 a 15 por cento ou 10 a 12 por cento, comparado com as sequências de referência (as quais não compreendem adições ou eliminações) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada ao determinar o número de posições nas quais bases de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácidos idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividir o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência ( isto é, o tamanho da janela) e multiplicar os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.

[00219] As variantes também podem ou, alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo ou uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes polinucleotídicas são capazes de hibridizar sob condições moderadamente rigorosas com uma sequência de DNA de ocorrência natural que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).

[00220] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como um resultado da degenerescência do código genético, há muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, conforme descrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos possuem homologia mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que variam em virtude de diferenças no uso de códons são especificamente considerados pela presente invenção. Além disso, os alelos dos genes que compreendem as sequências polinucleotídicas fornecidas aqui estão dentro do âmbito da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como eliminações, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequências em bancos de dados).

[00221] Em um aspecto, a invenção fornece um método de preparação de qualquer um dos polinucleotídeos descritos aqui. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Aqueles versados na técnica podem usar as sequências fornecidas aqui e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.

[00222] Para preparar polinucleotídeos usando métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conforme discutido adicionalmente aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras através de qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno através de absorção direta, endocitose, transfecção, F-cruzamento ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por meio de métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Sambrook et al., 1989).

[00223] Alternativamente, PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e está descrita na Patente US Nos 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e

4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[00224] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode, então, ser isolado usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica, conforme apresentado em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

[00225] Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira a ser usada, os vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones que contêm o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, tais como BioRad, Strategene e Invitrogen.

[00226] Os vetores de expressão geralmente são construções polinucleotídicas replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem, porém sem limitações, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adenoassociados, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT N° WO87/04462. Os componentes do vetor podem incluir, em geral, porém sem limitações, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinalizadora; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle de transcrição adequados (tais como promotores, intensificadores e terminadores). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle de tradução também são geralmente necessários, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de início de tradução e códons terminais.

[00227] Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira através de qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção emprego de cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos frequentemente dependerá das características da célula hospedeira.

[00228] Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressão de DNAs heterólogos podem ser usadas com a finalidade de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamíferos incluem, porém sem limitações, células COS, HeLa e CHO. Consulte também Publicação PCT N° WO87/04462. Células hospedeiras que não de mamíferos adequadas incluem células de procariotas (tais como E. coli ou B. subtillis) e leveduras (tais como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). De preferência, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente 10 vezes maior, ainda mais preferivelmente 20 vezes maior do que aquele do anticorpo endógeno ou proteína CD3 ou um domínio de CD3 correspondente (por exemplo, domínios 1-4) e é realizado através de um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

[00229] Em um aspecto, uma molécula de anticorpo anti-CD3 terá uma afinidade pela CD3, por exemplo, conforme medido por meio de ensaio de ligação direta ou ensaios de ligação competitiva na faixa de afinidade picomolar a micromolar, de preferência na faixa de picomolar a nanomolar baixa.

[00230] Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando as sequências descritas aqui. Métodos para a preparação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos era com base na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas tendo especificidades diferentes (Millstein e Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).

[00231] Em outra modalidade, o anticorpo conforme descrito aqui compreende um anticorpo humano de comprimento total, em que uma região variável de anticorpo da proteína heterodimérica é capaz de recrutar a atividade de uma célula imune humana efetora ao se ligar especificamente a um antígeno efetor (por exemplo, antígeno CD3) localizado na célula imune efetora humana e em que uma segunda região variável de anticorpo da proteína heterodimérica é capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo humano tem um isotipo lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em algumas modalidades, a proteína heterodimérica compreende uma cadeia de Fc imunologicamente inerte.

[00232] A célula imune efetora humana pode ser qualquer uma de uma variedade de células imunes efetoras conhecidas na técnica. Por exemplo, a célula imune efetora pode ser um membro da linhagem de células linfoides humanas incluindo, porém sem limitações, uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica), uma célula B e uma célula assassina natural (NK). A célula imune efetora também pode ser, por exemplo, sem limitação, um membro da linhagem mieloide humana incluindo, porém sem limitações, um monócito, um granulócito neutrofílico e uma célula dendrítica. Estas células imunes efetoras podem ter um efeito citotóxico ou apoptótico sobre uma célula alvo ou outro efeito desejado após ativação através de ligação de um antígeno efetor.

[00233] O antígeno efetor é um antígeno (por exemplo, uma proteína ou um polipeptídeo) que é expresso na célula imune efetora humana. Exemplos de antígenos efetores que podem ser ligados pela proteína heterodimérica (por exemplo, um anticorpo heterodimérico ou um anticorpo biespecífico) incluem, porém sem limitações, CD3, CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 e CD89 humanas.

[00234] A célula alvo pode ser uma célula nativa ou estranha aos seres humanos. Em uma célula alvo nativa, a célula pode ter sido transformada para ser uma célula maligna ou modificada patologicamente (por exemplo, uma célula alvo nativa infectada com um vírus, um plasmódio ou uma bactéria). Em uma célula alvo estranha, a célula é um patógeno invasor, tal como uma bactéria, um plasmódio ou um vírus.

[00235] Em algumas modalidades, o anticorpo útil na presente invenção é um Fab, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv, um fragmento Fv com uma única cadeia, um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto, um fragmento Fv com uma única cadeia anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo triespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico biespecífico, uma IgG heterodimérica biespecífica, um anticorpo policlonal, um anticorpo marcado, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou fragmentos dos mesmos.

[00236] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD3 conforme descrito aqui é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo anti- CD3 é um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal quimérico.

[00237] A presente invenção abrange um anticorpo que compreende uma cadeia ou domínio Fc ou porções dos mesmos. Em algumas modalidades, a cadeia Fc ou porção(ões) da mesma compreendem um ou mais domínios constantes da cadeia Fc de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 (por exemplo, um domínio CH2 ou CH3). Em outra modalidade, a invenção abrange moléculas que compreendem uma cadeia Fc ou porção da mesma em que a cadeia Fc ou porção da mesma compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição) em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem comparável ou porção da mesma. Regiões Fc variantes são bem conhecidas na técnica e são usadas principalmente para alterar o fenótipo do anticorpo que compreende a região Fc variante conforme testado em qualquer um dos ensaios de atividade de ligação ou função efetora bem conhecidos na técnica, por exemplo, ELISA, análise de SPR ou ADCC. Estas cadeias Fc variantes ou porções das mesmas podem prolongar a meia- vida e estabilidade plasmática exibida por um anticorpo biespecífico da invenção que compreende uma cadeia Fc ou uma porção da mesma. Em outra modalidade, a invenção abrange o uso de qualquer variante de Fc conhecida na técnica.

[00238] Em uma modalidade, uma ou mais modificações são feitas nos aminoácidos da cadeia Fc para reduzir a afinidade e avidez da cadeia Fc e, assim, o anticorpo biespecífico da invenção, por um ou mais receptores FcR. Em uma modalidade específica, a invenção abrange anticorpos biespecíficos que compreende uma cadeia Fc variante ou porção da mesma, em que a cadeia Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem, região Fc variante a qual se liga apenas a um FcR, em que o FcR é FcRIIIA. Em outra modalidade específica, a invenção abrange anticorpos biespecíficos que compreendem uma cadeia Fc variante ou porção da mesma, em que a cadeia Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem (WT) cuja região Fc variante se liga apenas a um FcR, em que o FcR é FcRIIA. Em outra modalidade específica, a invenção abrange anticorpos biespecíficos que compreende uma cadeia Fc variante ou porção da mesma, em que a cadeia Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma cadeia Fc de tipo selvagem, cuja cadeia Fc variante se liga apenas a um FcR, em que o FcR é FcRIIB. Em outra modalidade, a invenção abrange moléculas que compreendem uma cadeia Fc variante em que a variante confere ou media a atividade de ADCC diminuída (ou outra função efetora) e/ou uma ligação aumentada ao FcRIIB (CD32B), em relação a uma molécula que não compreende a cadeia Fc ou que compreende uma cadeia Fc de tipo selvagem, conforme medido usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos aqui.

[00239] A invenção também abrange o uso de uma região Fc que compreende domínios ou regiões de dois ou mais isotipos de IgG. Conforme conhecido na técnica, a modificação de aminoácidos da região Fc pode afetar profundamente a função efetora e/ou atividade de ligação mediada por Fc. No entanto, estas alterações nas características funcionais podem ser ainda mais refinadas e/ou manipuladas quando implementadas no contexto de isotipos de IgG selecionados. Da mesma forma, as características nativas do isotipo Fc podem ser manipuladas por uma ou mais modificações de aminoácidos. Os vários isotipos de IgG (isto é, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4) exibem diferentes propriedades físicas e funcionais, incluindo meia-vida sérica, fixação de complemento, afinidades de ligação ao FcR e atividades de função efetora (por exemplo, ADCC, CDC) em virtude de diferenças nas sequências de aminoácidos de suas regiões de dobradiça e/ou Fc.

[00240] Em uma modalidade, a modificação de aminoácidos e a região Fc de IgG são independentemente selecionadas com base em suas respectivas atividades de ligação e/ou função efetora distintas, a fim de conceber um anticorpo biespecífico com as características desejadas. Em uma modalidade particular, as modificações de aminoácidos e as regiões de dobradiça/Fc de IgG foram testadas separadamente quanto à atividade de ligação e/ou função efetora, conforme descrito aqui ou conhecido na técnica no contexto de uma IgG1. Em uma modalidade, a modificação de aminoácidos e a região de dobradiça/Fc de IgG exibem funcionalidade similar, por exemplo, atividade de ADCC diminuída (ou outra função efetora) e/ou uma ligação aumentada ao FcRIIB no contexto do anticorpo biespecífico ou outra molécula que contém Fc (por exemplo, imunoglobulina). Em outra modalidade, a invenção abrange regiões Fc variantes que compreendem combinações de modificações de aminoácidos conhecidas na técnica e regiões IgG selecionadas que exibem novas propriedades, propriedades tais que não foram detectáveis quando as modificações e/ou regiões foram independentemente testadas conforme descrito aqui.

[00241] Uma forma de determinar a afinidade de ligação de anticorpos à CD3 é medir a afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expresso de forma recombinante. A afinidade de um fragmento Fab de um anticorpo pela CD3 pode ser determinada por meio de ressonância de plasmônio em superfície (sistema de ressonância de plasmônio em superfície Biacore™ 3000™ (SPR), Biacore™, INC., Piscataway NJ) equipado com chips sensores de estreptavidina (SA) pré-imobilizados ou anti-Fc de rato ou anti-Fc humana usando tampão contínuo HBS-EP (HEPES a 0,01 M, pH de 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Surfactant P20 a 0,005 % v/v). A CD3 humana ou Fc de fusão biotinilada pode ser diluída em tampão HBS-EP em uma concentração de menos de 0,5 pg/mL e injetado através dos canais de chips individuais usando tempos de contato variáveis para atingir duas faixas de densidade antigênica, tanto 50-200 unidades de resposta (Response Unit, RU) para estudos cinéticos detalhados ou 800-1.000 RU para ensaios de triagem. Estudos de regeneração mostraram que NaOH a 25 mM em etanol a 25 % v/v remove efetivamente o Fab ligado, ao mesmo tempo em que mantém a atividade de CD3 no chip por mais de 200 injeções. Normalmente, diluições em série (abrangendo concentrações de 0,1-10x a KD estimada) de amostras de Fab purificadas são injetadas durante 1 min a 100 μL/minuto e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando uma concentração conhecida de Fab

(conforme determinado através de análise de aminoácidos) como padrão. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) cinéticas são obtidas simultaneamente ao ajustar os dados globalmente a um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6: 99-110) usando o programa BIAevaluation. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (KD) são calculados como k off/kon. Este protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo por qualquer CD3, incluindo CD3 humana, CD3 de outro mamífero (tal como CD3 de camundongo, CD3 de rato ou CD3 de primata), bem como diferentes formas de CD3 (por exemplo, CD3 glicosilada). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25 °C, mas também pode ser medida a 37 °C.

[00242] Os anticorpos conforme descritos aqui podem ser produzidos através de qualquer método conhecido na técnica. Para a produção de linhagens de células de hibridoma, a via e o cronograma de imunização do animal hospedeiro estão geralmente de acordo com técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação e produção de anticorpos, conforme descrito adicionalmente aqui. Métodos gerais para a produção de anticorpos humanos e de camundongo são conhecidos na técnica e/ou são descritos aqui.

[00243] Considera-se que qualquer indivíduo mamífero, incluindo seres humanos ou células produtoras de anticorpos dos mesmos, pode ser manipulado para servir como base para a produção de mamíferos, incluindo linhagens de células humanas e de hibridoma. Normalmente, o animal hospedeiro é inoculado intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutânea, intraplantar e/ou intradermicamente com uma quantidade de imunogênio, incluindo conforme descrito aqui.

[00244] Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e células de mieloma imortalizadas usando a técnica geral de hibridização de células somáticas de Kohler, B. e Milstein, C., Nature 256: 495-497, 1975 ou conforme modificado por Buck, DW, et al., In Vitro, 18: 377-381,

1982. Linhagens de mieloma disponíveis incluindo, porém sem limitações, X63-Ag8.653 e aquelas do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EUA, podem ser usadas na hibridização. Em geral, a técnica envolve a fusão de células de mieloma e células linfoides usando um fusogênio, tal como polietileno glicol ou meios elétricos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Após fusão, as células são separadas do meio de fusão e cultivadas em um meio de crescimento seletivo, tal como meio de hipoxantina-aminopterina- timidina (HAT), para eliminar as células precursoras não hibridizadas. Qualquer um dos meios descritos aqui, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para a cultura de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais. Como outra alternativa à técnica de fusão celular, células B imortalizadas por EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos monoclonais da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são testados quanto à atividade anti-imunogênica por meio de procedimentos de imunoensaio convencionais (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático ou imunoensaio de fluorescência).

[00245] Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos abrangem todos os derivados, células descendentes dos hibridomas precursores que produzem anticorpos monoclonais específicos para CD3 ou porções dos mesmos.

[00246] Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser cultivados in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos corporais por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como precipitação com sulfato de amônio, eletroforese em gel, diálise, cromatografia e ultrafiltração, se desejado. A atividade indesejada, se presente, pode ser removida, por exemplo, ao executar a preparação sobre adsorventes feitos do imunogênio ligado a uma fase sólida e eluir ou liberar os anticorpos desejados do imunogênio. A imunização de um animal hospedeiro com uma CD3 humana ou um fragmento que contém a sequência de aminoácidos alvo conjugada a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOC ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquila, pode produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).

[00247] Se desejado, o anticorpo de interesse pode ser sequenciado e a sequência polinucleotídica pode, então, ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode, então, ser expandida e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes em cultura de células pode ser realizada através da clonagem de genes de anticorpos a partir de células B por meios conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Tiller et al., J. Immunol. Methods, 329, 112, 2008; Patente US N° 7.314.622.

[00248] Em uma alternativa, a sequência polinucleotídica pode ser usada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser concebida para se parecer mais com regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em seres humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência do anticorpo para obter maior afinidade pela CD3 e maior eficácia terapêutica.

[00249] Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante modificada que remove ou reduz a ligação ao receptor Fc gama. Por exemplo, o Fc pode ser IgG2 humana que contém a mutação D265, em que os resíduos de aminoácidos são numerados com referência à sequência de IgG2 de tipo selvagem. Consequentemente, em algumas modalidades, a região constante tem uma região constante modificada com a sequência mostrada em SEQ ID NO: 80. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante modificada com a sequência mostrada em SEQ ID NO: 81.

[00250] Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinar as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos previstas das regiões variáveis leve e pesada do anticorpo inicial, (2) conceber o anticorpo humanizado isto é, decidir qual região estrutural do anticorpo usar durante o processo de humanização, (3) usar metodologias/técnicas de humanização reais e (4) transfectar e expressar o anticorpo humanizado. Consulte, por exemplo, Patente US Nos 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415;

5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.

[00251] Foi descrita uma série de moléculas de anticorpo humanizado que compreende um sítio de ligação antigênica derivado de uma imunoglobulina não humana, incluindo anticorpos quiméricos que têm regiões V de roedores ou de roedores modificados e suas CDRs associadas fundidas a regiões constantes humanas. Consulte, por exemplo, Winter et al. Nature 349: 293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138: 4534-4538, 1987 e Brown et al. Cancer Res. 47: 3577-3583, 1987. Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma região estrutural (FR) de suporte humana antes de fusão com uma região constante de anticorpo humano apropriada. Consulte, por exemplo, Riechmann et al. Nature 332: 323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536, 1988 e Jones et al. Nature 321: 522-525, 1986. Outra referência descreve CDRs de roedores suportadas por regiões estruturais de roedores concebidas de forma recombinante. Consulte, por exemplo, Publicação Europeia N° EP0519596. Estas moléculas "humanizadas" são concebidas para minimizar a resposta imune indesejada em relação às moléculas de anticorpos anti-humanos de roedores, o que limita a duração e a eficácia das aplicações terapêuticas destas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser concebida de modo a ser imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia a lise do complemento). Consulte, por exemplo, Pedido PCT N° PCT/GB99/01441; Pedido do Reino Unido N° 9809951.8. Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser usados são descritos por Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476, 1991 e nas Patente US Nos 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692;

6.210.671; e 6.350.861; e na publicação PCT N° W001/27160.

[00252] Os princípios gerais relacionados a anticorpos humanizados discutidos acima também são aplicáveis para personalizar anticorpos para uso, por exemplo, em outros mamíferos (por exemplo, ser humano, primata não humano, murino, burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho- da-índia, camelo, cavalo ou galinha). Além disso, um ou mais aspectos da humanização de um anticorpo descrito aqui podem ser combinados, por exemplo, enxertia de CDR, mutação de região estrutural e mutação de CDRs.

[00253] Em uma variação, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos usando camundongos comercialmente disponíveis que foram concebidos para expressar proteínas de imunoglobulina humana específicas. Animais transgênicos que são concebidos para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta também podem ser usados para a geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia são Xenomouse™ da Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb- Mouse e TC Mouse™ da Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

[00254] Em alternativa, os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante e expressos usando qualquer método conhecido na técnica. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante por meio da tecnologia de exibição em fagos. Consulte, por exemplo, Patente US Nos 5.565.332; 5.580.717; 5,733,743; e 6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433- 455, 1994. Alternativamente, a tecnologia de exibição em fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553, 1990) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir do gene de domínio variável (V) de repertórios de doadores de imunoglobulina não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados na estrutura em um gene de proteína de revestimento principal ou secundário de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA fita simples do genoma do fago, as seleções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe tais propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição em fagos pode ser executada em uma variedade de formatos; para revisão consulte, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571, 1993. Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição em fagos. Clackson et al., Nature 352: 624-

628, 1991, isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma variedade de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo essencialmente as técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991 ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734,

1993. Em uma resposta imune natural, os genes do anticorpo acumulam mutações em uma taxa elevada (hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas conferirão maior afinidade e as células B que exibem imunoglobulina na superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante o subsequente desafio com antígeno. Este processo natural pode ser imitado empregando a técnica conhecida como "shuffling de cadeias" (Marks et al., Bio/Technol. 10: 779-783, 1992). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos por meio de exibição em fagos pode ser melhorada ao substituir sequencialmente os genes da região V de cadeia pesada e leve por repertórios de variantes de ocorrência natural (repertórios) de genes de domínio V obtidos de doadores não imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de pM-nM. Uma estratégia para fazer repertórios de anticorpos de fago muito grandes (também conhecidos como "as bibliotecas mãe-de-todas") foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266, 1993. O shuffling gênico também pode ser usado para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com este método, o qual também é denominado como "impressão de epítopo", o gene do domínio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedor obtido pela técnica de exibição em fagos é substituído por um repertório de genes de domínio V humano, criando quimeras de roedor- humano. A seleção do antígeno resulta no isolamento de regiões variáveis humanas capazes de restaurar um sítio de ligação a antígeno funcional, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido para substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpo humano é obtido (consulte Publicação PCT N° WO93/06213). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores através de enxertia de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, os quais não possuem resíduos de região estrutural ou resíduos de CDR originários de roedor.

[00255] Os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante isolando primeiro os anticorpos e células produtoras de anticorpos de animais hospedeiros, obtendo a sequência do gene e usando a sequência do gene para expressar o anticorpo de forma recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência do anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Métodos para expressar anticorpos de forma recombinante em plantas ou leite foram descritos. Consulte, por exemplo, Peeters, et al. Vaccine 19: 2756, 2001; Lonberg, N. e D. Huszar, Int. Rev. Immunol 13: 65, 1995; e Pollock, et al., J Immunol Methods 231: 147, 1999. Métodos para preparar derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, fita simples, etc., são conhecidos na técnica.

[00256] Imunoensaios e técnicas de separação por citometria de fluxo, tal como separação de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS), também podem ser empregadas para isolar anticorpos que são específicos para CD3 ou antígenos de interesse.

[00257] Os anticorpos conforme descritos aqui podem ser ligados a muitos suportes ou transportadores de fase sólida diferentes. Tais suportes podendo ser ativos e/ou inertes. Suportes bem conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrana, náilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do suporte pode ser solúvel ou insolúvel para fins da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão outros suportes adequados para ligação de anticorpos ou serão capazes de averiguá-los usando experimentação de rotina. Em algumas modalidades, o suporte compreende uma porção que tem como alvo o miocárdio.

[00258] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (tais como vetores de expressão descritos na Publicação PCT N° WO87/04462) os quais são, então, transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símio, células CHO ou células de mieloma as quais, de outra forma, não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Consulte, por exemplo, Publicação PCT N° WO87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, ao substituir a sequência codificadora para as regiões constantes da cadeia pesada e leve humana em lugar das sequências homólogas de murino, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984 ou através de ligação covalente à toda ou parte da sequência codificadora da imunoglobulina por um polipeptídeo não imunoglobulina. Deste modo, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" que têm a especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal aqui.

[00259] A CD3 ou outros anticorpos de antígeno conforme descrito aqui podem ser identificados ou caracterizados usando métodos conhecidos na técnica, em que os níveis de expressão de antígeno são detectados e/ou medidos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD3 é identificado ao incubar um agente candidato com CD3 e monitorar a ligação e/ou redução dos níveis de expressão de CD3. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) de CD3 purificado(s) ou com células que expressam naturalmente ou são transfectadas para expressar polipeptídeo(s) de CD3. Em uma modalidade, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, em que a capacidade de um anticorpo candidato de competir com um anticorpo anti-CD3 conhecido pela ligação à CD3 é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA.

[00260] Após a identificação inicial, a atividade de um candidato a anticorpo ao antígeno CD3 ou outro antígeno pode ser posteriormente confirmada e refinada através de bioensaios conhecidos por testar as atividades biológicas direcionadas. Alternativamente, bioensaios podem ser usados para selecionar candidatos diretamente. Alguns dos métodos para identificar e caracterizar anticorpos são descritos em detalhes nos Exemplos.

[00261] CD3 ou outros anticorpos antigênicos podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual ele se liga ou mapeamento de epítopo. Há muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização de epítopos em proteínas, incluindo decompor a estrutura cristalina de um complexo anticorpo- antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento gênico e ensaios com base em peptídeos sintéticos conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, New York, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopos pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo liga.

O mapeamento de epítopos está comercialmente disponível a partir de várias fontes, por exemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um único trecho de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que pode não estar necessariamente contido em um único trecho.

Peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de forma recombinante) e usados para ensaios de ligação à CD3 ou outro anticorpo antigênico.

Em outro exemplo, o epítopo ao qual a CD3 ou outro anticorpo antigênico se liga pode ser determinado em uma triagem sistemática usando peptídeos sobrepostos derivados de CD3 ou outra sequência antigênica e determinar a ligação à CD3 ou outro anticorpo antigênico.

De acordo com os ensaios de expressão de fragmento gênico, a estrutura do quadro de leitura aberta que codifica CD3 ou outro antígeno é fragmentada aleatoriamente ou através de construções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos expressos de CD3 ou outro antígeno com o anticorpo a ser testado é determinada.

Os fragmentos gênicos podem, por exemplo, ser produzidos por PCR e depois transcritos e traduzidos em proteína in vitro na presença de aminoácidos radioativos.

A ligação do anticorpo anti-CD3 radioativamente marcado ou outros fragmentos antigênicos é, então, determinada por meio de imunoprecipitação e eletroforese em gel.

Determinados epítopos também podem ser identificados usando grandes bibliotecas de sequências peptídicas aleatórias exibidas na superfície de partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de fragmentos peptídicos sobrepostos pode ser testada quanto à ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, mutagênese de um domínio de ligação a antígeno, experimentos de troca de domínio e mutagênese por varredura de alanina podem ser realizadas para identificar resíduos necessários, suficientes e/ou requeridos para ligação do epítopo. Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser realizados usando uma CD3 mutante ou outro antígeno no qual vários fragmentos de CD3 ou outra proteína antigênica foram substituídos (trocados) por sequências de um antígeno de outra espécie (por exemplo, camundongo) ou uma proteína próxima relacionada, mas antigenicamente distinta (por exemplo, Trop-1). Ao avaliar a ligação do anticorpo à CD3 mutante ou outro antígeno, a importância da CD3 particular ou outro fragmento antigênico para a ligação do anticorpo pode ser avaliada.

[00262] Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar uma CD3 ou outro anticorpo antigênico é o uso de ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por se ligarem ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos na CD3 ou outro antígeno, para determinar se a CD3 ou outro anticorpo antígeno se liga ao mesmo epítopo que outros anticorpos, respectivamente. Ensaios de competição são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00263] Um vetor de expressão pode ser usado para dirigir a expressão de uma CD3 ou outro anticorpo antigênico. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com a administração de vetores de expressão para obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Consulte, por exemplo, Patente US Nos 6.436.908; 6.413.942; e

6.376.471. A administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, pistola de partículas ou administração cateterizada e administração tópica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco ou gânglio simpático ou em uma artéria coronária,

átrio, ventrículo ou pericárdio.

[00264] A distribuição direcionada de composições terapêuticas que contêm um vetor de expressão ou polinucleotídeos subgenômicos também pode ser usada. Técnicas de distribuição de DNA mediada por receptor são descritas, por exemplo, em Findeis et al., Trends Biotechnol., 11: 202, 1993; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 269: 542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3655,1990; e Wu et al., J. Biol. Chem., 266: 338, 1991. As composições terapêuticas que contêm um polinucleótido são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia genética. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 mg a cerca de 2 mg, cerca de 5 mg a cerca de 500 mg e cerca de 20 mg a cerca de 100 mg de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia genética. Os polinucleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser distribuídos usando veículos de distribuição gênica. O veículo de distribuição gênica pode ser de origem viral ou não viral (consulte, de modo geral, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1: 51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5: 845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1: 185, 1995; e Kaplitt, Nature Genetics, 6: 148, 1994). A expressão de tais sequências codificadoras pode ser induzida usando promotores de mamíferos endógenos ou heterólogos. A expressão da sequência codificadora pode ser constitutiva ou regulada.

[00265] Os vetores de base viral para distribuição de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são bem conhecidos na técnica. Veículos com base em vírus exemplificativos incluem, porém sem limitações, retrovírus recombinantes (consulte, por exemplo, Publicações PCT Nos WO90/07936; WO94/03622;

WO93/25698; WO93/25234; WO93/11230; WO93/10218; WO91/02805; Patente US Nos 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB N°

2.200.651; e Patente EP N° ER0 345 242), vetores com base em alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite equina Venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) e vetores virais adenoassociados (AAV) (consulte, por exemplo, Publicações PCT Nos WO94/12649, WO93/03769; WO93/19191; WO94/28938; WO95/11984 e WO95/00655). Administração de DNA ligado a adenovírus morto, conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147, 1992, também pode ser empregada.

[00266] Veículos e métodos de distribuição não virais também podem ser empregados incluindo, porém sem limitações, DNA condensado policatiônico ligado ou não adenovírus morto apenas (consulte, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147, 1992); DNA ligado a ligante (consulte, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem., 264: 16985, 1989); células de veículos para distribuição de células eucariotas (consulte, por exemplo, Patente US N° 5.814.482; Publicações PCT Nos WO95/07994; WO96/17072; WO95/30763; e WO97/42338) e neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. DNA nu também pode ser empregado. Métodos exemplificativos de introdução de DNA nu são descritos na Publicação PCT N° WO90/11092 e Patente US N° 5.580.859. Lipossomas que podem atuar como veículos de distribuição gênica são descritos na Patente US N°

5.422.120; Publicações PCT Nos WO95/13796; WO94/23697; WO91/14445; e Publicação Europeia EP 0524968. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol., 14: 2411, 1994 e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 1581, 1994.

[00267] Em algumas modalidades, a invenção abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem anticorpos da invenção conforme descrito aqui ou feitos por meio dos métodos e tendo as características descritas aqui. Conforme usado aqui, as composições farmacêuticas podem compreender um ou mais anticorpos que se ligam a um antígeno tumoral, um ou mais anticorpos biespecíficos que se ligam à CD3 e um antígeno tumoral e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem sequências que codificam um ou mais destes anticorpos. Estas composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, os quais são bem conhecidos na técnica.

[00268] Em uma modalidade, a presente invenção se caracteriza por uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-CD3 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-CD3. Agentes exemplificativos que podem ser vantajosamente combinados com um anticorpo anti-CD3 incluem, sem limitação, outros agentes que se ligam e/ou ativam a sinalização de CD3 (incluindo outros anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, etc.) e/ou agentes que não se ligam diretamente à CD3 mas, ainda assim, ativam ou estimulam a ativação de células imunes. A presente invenção inclui ainda terapias combinadas adicionais e coformulações que envolvem os anticorpos anti-CD3 da presente invenção. A invenção também fornece métodos de produção de qualquer um destes anticorpos. Os anticorpos da presente invenção podem ser feitos por meio de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo síntese de proteínas de novo e expressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação. As sequências de ácido nucleico desejadas podem ser produzidas por meio de métodos recombinantes (por exemplo, mutagênese por PCR de uma variante preparada anteriormente do polinucleotídeo desejado) ou através de síntese de DNA em fase sólida. Normalmente são usados métodos de expressão recombinante. Em um aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica uma VH e/ou VL de CD3. Em virtude da degenerescência do código genético, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codifica cada sequência de aminoácidos de imunoglobulina e a presente invenção inclui todos os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação descritas aqui.

[00269] Os anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos de química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou formando uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esta finalidade incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

[00270] Nos anticorpos humanizados recombinantes, a porção Fc pode ser modificada para evitar a interação com o receptor Fc e o complemento e os sistemas imunes. Técnicas para a preparação de tais anticorpos são descritas na Publicação PCT WO99/58572. Por exemplo, a região constante pode ser concebida para se assemelhar mais às regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos em seres humanos. Consulte, por exemplo, Patente US Nos 5.997.867 e

5.866.692.

[00271] Os anticorpos anti-CD3, conforme descrito aqui, podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácidos na região estrutural e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve comparado com as sequências de linhagem germinativa correspondentes a partir das quais os anticorpos foram derivados. Estas mutações podem ser facilmente verificadas ao comparar as sequências de aminoácidos descritas aqui com as sequências da linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, bases de dados públicas de sequências de anticorpos.

A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas aqui, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou de CDR sofreram mutação para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado ou o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linhagem germinativa humana ou uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são denominadas aqui coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Aqueles versados na técnica, começando com as sequências da região variável de cadeias pesada e leve descritas aqui, podem produzir facilmente numerosos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que compreendem uma ou mais mutações individuais da linhagem germinativa ou combinações das mesmas.

Em determinadas modalidades, todos os resíduos da região estrutural e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL sofrem mutação inversa para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado.

Em algumas modalidades, apenas determinados resíduos sofrem mutação inversa para a sequência de linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutantes encontrados nos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos de FR4 ou apenas os resíduos mutantes encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em algumas outras modalidades, uma ou mais resíduos da região estrutural e/ou resíduos de CDR sofrem mutação para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado).

[00272] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa dentro da região estrutural e/ou regiões CDR, por exemplo, em que determinados resíduos individuais sofrem mutação para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa particular, enquanto que outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou sofram mutação para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação aprimorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou antagonistas aprimoradas ou aumentadas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno obtidos desta maneira estão, em geral, incluídos na presente invenção.

[00273] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD3 que compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos HC VR, LC VR e/ou CDR descritas aqui que têm uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CD3 que têm sequências de aminoácidos HC VR, LC VR e/ou CDR, por exemplo, com 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos HC VR, LC VR e/ou CDR, conforme descrito aqui.

[00274] Consequentemente, a invenção abrange modificações nos anticorpos e polipeptídeos das variantes da invenção conforme descrito aqui, incluindo anticorpos funcionalmente equivalentes, que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que têm atividade e/ou afinidade aumentada ou diminuída. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode sofrer mutação para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada por um antígeno tumoral e/ou CD3. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e não precisa ser descrita em detalhes aqui. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou mais eliminações ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente a atividade funcional de forma deletéria ou que amadurecem (aumentam) a afinidade do polipeptídeo por seu ligante ou uso de análogos químicos.

[00275] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxi terminais que variam, quanto ao comprimento, de um resíduo a polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo que tem um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um marcador de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem fusão ao N- ou C-término do anticorpo de uma enzima ou polipeptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguínea.

[00276] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido na molécula de anticorpo e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os locais de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, porém, alterações de FR também são consideradas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 6 sob o título de "substituições conservativas". Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica, então, mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 6 ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos pesquisados. Tabela 6 Resíduo Original Substituições (aminoácido de Substituições exemplificativas conservativas ocorrência natural) Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (1) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) lie Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

[00277] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas ao selecionar substituições que diferem significativamente quanto ao seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades em comum da cadeia lateral: (1) Não polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Polares sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácidos (carga negativa): Asp, Glu; (4) Básicos (carga positiva): Lys, Arg;

[00278] (5) Resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.

[00279] Substituições não conservativas são feitas trocando um membro de uma destas classes por outra classe.

[00280] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.

[00281] As modificações de aminoácidos podem variar desde mudança ou modificação de um ou mais aminoácidos até remodelagem completa de uma região, tal como a região variável. Mudanças na região variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Em algumas modalidades, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR. Em algumas modalidades, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR. Em ainda outras modalidades, o domínio de CDR é CDR3 de VH e/ou CDR3 de VL.

[00282] As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-traducionais tais como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128, 1997; Wright e Morrison, TibTECH 15: 26-32, 1997). As cadeias laterais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318, 1996; Wittwe e Howard, Biochem. 29: 4175-4180, 1990) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, o que pode afetar a conformação e apresentar a superfície tridimensional da glicoproteína (Jefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416, 1996). Os oligossacarídeos também podem servir para direcionar uma dada glicoproteína a determinadas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. A glicosilação de anticorpos também foi relatada como afetando a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em particular, células CHO com expressão regulada por tetraciclina de (1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc bissectante, foi relatado como tendo atividade ADCC aprimorada (Umana et al., Mature Biotech. 17: 176-180, 1999).

[00283] A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O- ligada. N-ligada se refere à ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligada se refere à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.

[00284] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada ao alteraro a sequência de aminoácidos de modo que ela contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligada).

[00285] O padrão de glicosilação de anticorpos também pode ser alterado sem alterar a sequência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende muito da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Uma vez que o tipo de célula usado para a expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como potencial terapêutico raramente é a célula nativa, variações no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (consulte, por exemplo, Hse et al., J. Biol. Chem. 272: 9062-9070, 1997).

[00286] Além da escolha das células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção de anticorpos recombinantes incluem modo de crescimento, formulação de meio, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e assim por diante. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação alcançado em um organismo hospedeiro particular, incluindo a introdução ou superexpressão de determinadas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patente US Nos 5.047.335; 5.510.261 e

5.278.299). A glicosilação ou determinados tipos de glicosilação podem ser removidos enzimaticamente da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endoglicosidase F1,

endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente modificada para ser defeituosa no processamento de determinados tipos de polissacarídeos. Estas e outras técnicas similares são bem conhecidas na técnica.

[00287] Outros métodos de modificação incluem o uso de métodos de acoplamento conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitações, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para ligar marcadores para imunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados usando ensaios padrão conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo e nos Exemplos.

[00288] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que tem afinidade aumentada por um receptor Fc gama humano, é imunologicamente inerte ou parcialmente inerte, por exemplo, não desencadeia lise mediada pelo complemento, não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou não ativa macrófagos; ou tem atividades reduzidas (comparado com o anticorpo não modificado) em qualquer um ou mais dos seguintes: desencadear a lise mediada pelo complemento, estimular a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou ativar a microglia. Diferentes modificações da região constante podem ser usadas para atingir um nível ideal e/ou combinação de funções efetoras. Consulte, por exemplo, Morgan et al., Immunology 86: 319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157: 4963-9 157: 4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164: 4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; e Jefferis et al., Immunological Reviews 163: 59-76, 1998. Em algumas modalidades, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol., 29: 2613-2624, 1999; Pedido PCT N° PCT/GB99/01441; e/ou Pedido do Reino Unido N° 9809951.8. Em ainda outras modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação N-ligada. Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação N- ligada através de mutação do resíduo de aminoácido glicosilado ou resíduos de flanqueamento que fazem parte da sequência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Por exemplo, o sítio de N-glicosilação N297 pode sofrer mutação para A, Q, K ou H. Consulte, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; e Jefferis et al., Immunological Reviews 163: 59-76, 1998. Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação N- ligada. A região constante pode ser aglicosilada para glicosilação N- ligada enzimaticamente (tal como a remoção de carboidratos pela enzima PNGase) ou através de expressão em um lisato da célula hospedeira com deficiência de íons.

[00289] Outras modificações de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT N° WO99/58572. Estes anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direcionado à molécula alvo, um domínio efetor que tem uma sequência de aminoácidos substancialmente homóloga a toda ou parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Estes anticorpos são capazes de se ligar à molécula alvo sem desencadear uma lise dependente de complemento significativa ou destruição mediada por células do alvo. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente ao FcRn e/ou FcRIIb. Estes são, tipicamente, com base em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados desta maneira são particularmente adequados para uso em terapia crônica com anticorpos para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas à terapia convencional com anticorpos.

[00290] A invenção inclui modalidades de afinidade maturada. Por exemplo, anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169: 147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994- 2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154 (7): 3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889- 896, 1992; e Publicação PCT N° WO2004/058184).

[00291] Os seguintes métodos podem ser usados para ajustar a afinidade de um anticorpo e caracterizar uma CDR. Uma forma de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como melhorar) a afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominada "mutagênese por varredura de bibliotecas". Em geral, a mutagênese por varredura de bibliotecas funciona da seguinte maneira. Uma ou mais posições de aminoácidos na CDR são substituídas por dois ou mais (tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) aminoácidos usando métodos reconhecidos na técnica. Isto gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de aminoácido analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos forem substituídos em cada posição). Em geral, a biblioteca também inclui um clone que compreende o aminoácido nativo (não substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20-80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca são rastreados quanto à afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo de ligação) e candidatos com ligação aumentada, a mesma, diminuída ou nenhuma ligação são identificados. Métodos para determinar a afinidade de ligação são bem conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada usando análise de ressonância de plasmônio em superfície BIACORE™, a qual detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais. BIACORE™ é particularmente útil quando o anticorpo inicial já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, uma KD de cerca de 10 nM ou menos. A triagem usando ressonância de plasmônio em superfície BIACORE™ é descrita nos Exemplos aqui.

[00292] A afinidade de ligação pode ser determinada usando Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência de fluorescência e/ou exibição em levedura. A afinidade de ligação também pode ser rastreada usando um bioensaio adequado.

[00293] Em algumas modalidades, cada posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas modalidades, uma de cada vez) por todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidos na técnica (alguns dos quais são descritos aqui). Isto gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoácidos forem substituídos em todas as posições).

[00294] Em algumas modalidades, a biblioteca a ser rastreada compreende substituições em duas ou mais posições, as quais podem ser na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Assim, a biblioteca pode compreender substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A biblioteca pode compreender substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender substituição em 3, 4, 5 ou mais posições, as ditas posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando códons de baixa redundância. Consulte, por exemplo, Tabela 2 de Balint et al., Gene 137 (1): 109-18, 1993.

[00295] Os candidatos com ligação aprimorada podem ser sequenciados, deste modo, identificando um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade aprimorada (também denominada uma substituição "melhorada"). Os candidatos que se ligam também podem ser sequenciados, deste modo, identificando uma substituição de CDR que retém a ligação.

[00296] Vários ciclos de triagem podem ser conduzidos. Por exemplo, os candidatos (cada um compreendendo uma substituição de aminoácidos em uma ou mais posições de uma ou mais CDRs) com ligação aprimorada também são úteis para a concepção de uma segunda biblioteca que contém pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posição de CDR aprimorada ( isto é, a posição do aminoácido na CDR na qual um mutante de substituição mostrou ligação aprimorada). A preparação e triagem ou seleção desta biblioteca são discutidas mais adiante.

[00297] Mutagênese por varredura de bibliotecas também constitui um meio para caracterizar uma CDR, na medida em que a frequência de clones com ligação aprimorada, a mesma ligação, ligação diminuída ou nenhuma ligação também fornece informações relacionadas à importância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anticorpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando alterada para todos os 20 aminoácidos, esta posição é identificada como uma posição que é improvável de ser necessária para a ligação ao antígeno. Por outro lado, se uma posição da CDR retém a ligação em apenas uma pequena porcentagem de substituições, esta posição é identificada como uma posição que é importante para a função da CDR. Assim, os métodos de mutagênese por varredura de bibliotecas geram informações sobre as posições nas CDRs que podem ser alteradas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos) e as posições nas CDRs que não podem ser alteradas ou que só podem ser alteradas para alguns aminoácidos.

[00298] Os candidatos com afinidade aprimorada podem ser combinados em uma segunda biblioteca, a qual inclui o aminoácido aprimorado, o aminoácido original naquela posição e podem ainda incluir substituições adicionais naquela posição, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada ou permitida usando o método de triagem ou seleção desejado. Além disso, se desejado, a posição do aminoácido adjacente pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR mutante o que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um número maior de mutações de aprimoramento. A biblioteca também pode compreender substituição em posições que não mostraram afinidade aprimorada no primeiro ciclo de triagem.

[00299] A segunda biblioteca é rastreada ou selecionada quanto a membros da biblioteca com afinidade de ligação aprimorada e/ou alterada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo rastreio usando análise de ressonância de plasmônio em superfície BIACORE™ e seleção usando qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo exibição em fagos, exibição em leveduras e exibição em ribossomos.

[00300] Seguem técnicas para isolar anticorpos e preparar anticorpos. No entanto, será apreciado que os anticorpos podem ser formados a partir de ou incorporar outros polipeptídeos usando métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um ligante, receptor ou enzima) pode ser isolado de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que se acredita possuir o mRNA polipeptídico e expressá-lo em um nível detectável. As bibliotecas são rastreadas com sondas (tais como anticorpos ou oligonucleotídeos de cerca de 20-80 bases) concebidas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada pelo mesmo. A triagem do cDNA ou da biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser realizada usando procedimentos padrão, conforme descrito nos capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Anticorpos Anti-CD3 Para o Tratamento de um Transtorno Autoimune

[00301] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de um transtorno autoimune em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo que precisa uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos descritos aqui.

[00302] Conforme usado aqui, doenças autoimunes incluem, porém sem limitações, doença inflamatória intestinal, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, diabetes (Tipo I), esclerose múltipla, doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, encefalopatia de Hashimoto, miastenia gravis, artrite reativa, síndrome de Sjogren, alergia atópica, dermatite atópica, enteropatia autoimune, hepatite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, neuropatia periférica autoimune, pancreatite autoimune, síndrome poliendócrina autoimune, dermatite por progesterona autoimune, urticária autoimune, uveíte autoimune, doença de Bechet, doença de Castleman, doença de aglutinina fria, doença de Crohn, dermatomiosite, fasciíte eosinofílica, penfigoide gastrintestinal, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barré, hidradenite supurativa, narcolepsia, pênfigo vulgar, polimiosite, policondrite recidivante, febre reumática, mielite transversa, colite ulcerativa, doença indiferenciada do tecido conjuntivo, vasculite e granulomatose de Wegener.

Anticorpos Multiespecíficos e Usos dos Mesmos

[00303] Os anticorpos anti-CD3 da presente invenção podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação a antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Consulte, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Os anticorpos anti-CD3 da presente invenção podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir anticorpos multiespecíficos com uma segunda especificidade de ligação.

[00304] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo multiespecífico. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-CD3 é um anticorpo biespecífico que se liga especificamente à CD3 humana. Em algumas de tais modalidades, o anticorpo biespecífico se liga ainda mais especificamente a um antígeno tumoral. Em outra de tais modalidades, os anticorpos biespecíficos da presente invenção visam simultaneamente células T (CD3) e células tumorais e controlam e ativam com sucesso a citotoxicidade das células T para células tumorais que expressam um antígeno tumoral.

[00305] Em outras modalidades de cada um dos anteriores, o anticorpo biespecífico que se liga à CD3 é caracterizado por qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) tratar, prevenir, melhorar um ou mais sintomas de uma condição associada a células malignas que expressam um antígeno tumoral específico em um indivíduo (por exemplo, câncer relacionado às células B, tal como mieloma múltiplo); (b) inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo (que tem um tumor maligno que expressa um antígeno tumoral específico); (c) inibir a metástase de células cancerosas (malignas) que expressam um antígeno tumoral específico em um indivíduo (que tem uma ou mais células malignas que expressam um antígeno tumoral); (d) induzir à regressão (por exemplo, regressão de longo prazo) de um tumor que expressa um antígeno tumoral; (e) exercer atividade citotóxica em células malignas que expressam um antígeno tumoral; (f) aumentar a sobrevida sem progressão de um indivíduo que tem um transtorno associado a tumor; (g) aumentar a sobrevida global de um indivíduo que tem um transtorno associado a tumor; (h) reduzir o uso de agentes quimioterapêuticos ou citotóxicos adicionais em um indivíduo que tem um transtorno associado a tumor; (i) reduzir a carga tumoral em um indivíduo que tem um transtorno associado a tumor; ou (j) bloquear a interação do antígeno tumoral com outros fatores ainda não identificados.

[00306] Conforme usado aqui, o anticorpo biespecífico da presente invenção se refere a um complexo de duas ou mais cadeias polipeptídicas, cada uma compreendendo pelo menos uma região VL do anticorpo e uma região VH do anticorpo ou fragmento do mesmo, em que as regiões VL e VH em cada cadeia polipeptídica são de diferentes anticorpos. Em aspectos específicos, o anticorpo biespecífico inclui dímeros ou tetrâmeros de cadeias polipeptídicas que contêm uma região VL e VH. As cadeias polipeptídicas individuais que compreendem as proteínas multiméricas podem ser unidas de forma covalente a pelo menos um outro peptídeo do multímero através de ligações de dissulfeto entre cadeias.

[00307] Em algumas de tais modalidades, os anticorpos biespecíficos da presente invenção compreendem um primeiro domínio promotor de heterodímero na primeira cadeia polipeptídica e um segundo domínio promotor de heterodímero na segunda cadeia polipeptídica (Figura 1). Tomados em conjunto, os primeiro e segundo domínios promotores de heterodímero levam à heterodimerização e/ou estabilizam o anticorpo biespecífico (por exemplo, pela interação de um "knob-and-hole" em domínios promotores de heterodímero complementares) e/ou servem para estabilizar o anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o primeiro domínio promotor de heterodímero e o segundo domínio promotor de heterodímero compreendem, cada um, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que a sequência de aminoácidos de cada um dos domínios CH2 e/ou cada um dos domínios CH3 é modificada para conduzir a heterodimerização e/ou estabilizar o anticorpo biespecífico.

[00308] Em algumas modalidades, o primeiro domínio promotor de heterodímero pode compreender uma cadeia Fc que tem um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender um "knob" (protuberância) ou um "hole" (cavidade). Em algumas de tais modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio CH2 e/ou do domínio CH3 compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, em que: (a) o domínio CH3 do primeiro domínio promotor de heterodímero forma um "knob"; e (b) o domínio CH3 do segundo domínio promotor de heterodímero forma um "hole". Em outra de tais modalidades, o domínio CH3 do primeiro domínio promotor de heterodímero compreende as mutações Y349C e/ou T366W; e o domínio CH3 do segundo domínio promotor de heterodímero compreende mutações S354C, T366S, L368A e/ou Y407V, (numeração de acordo com o índice EU).

[00309] Em uma modalidade, o primeiro domínio promotor de heterodímero pode compreender um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender um "knob" (protuberância) que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 78 e o segundo domínio promotor de heterodímero compreender um CH2 e/ou domínio CH3 modificado para compreender um "hole" (cavidade). Em outra modalidade, o primeiro domínio promotor de heterodímero pode compreender um "hole" (cavidade) que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 79 e o segundo domínio promotor de heterodímero compreender um domínio CH2 e/ou CH3 modificado para compreender um "knob" (protuberância).

[00310] Cada cadeia polipeptídica do anticorpo biespecífico compreende uma região VL e uma região VH, as quais podem ser ligada por um ligantes de forma covalente através de glicina-serina que compreende resíduos de glicina e serina (Ligante 1 ou Ligante 2), de modo que os domínios de ligação do anticorpo sejam restringidos de automontagem. Além disso, cada cadeia polipeptídica compreende um domínio de heterodimerização que promove a heterodimerização e/ou estabilização das múltiplas cadeias polipeptídicas e reduz a probabilidade de homodimerização das diferentes cadeias polipeptídicas. O domínio de heterodimerização pode estar localizado no N-término da cadeia polipeptídica ou C-término. O domínio de heterodimerização pode compreender um ligante de cisteína (Ligante 3) que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos de aminoácidos de comprimento. A interação de duas das cadeias polipeptídicas pode produzir dois emparelhamentos VL/VH, formando dois domínios de ligação de epítopo, isto é, uma molécula bivalente. Nem a região VH ou VL está restrita a qualquer posição dentro da cadeia polipeptídica isto é, restrita ao terminal amino ou terminal carbóxi, nem as regiões são restritas em suas posições umas em relação às outras, isto é, a região VL pode ser N-terminal para a região VH e vice-versa. A única restrição é que uma cadeia polipeptídica complementar esteja disponível para formar um anticorpo biespecífico funcional. Quando as regiões VL e VH são derivadas de anticorpos específicos para diferentes antígenos, a formação de um anticorpo biespecífico funcional requer a interação de duas cadeias polipeptídicas diferentes, isto é, a formação de um heterodímero. Em contraste, onde duas cadeias polipeptídicas diferentes estão livres para interagir, por exemplo, em um sistema de expressão recombinante, uma compreendendo um VLA e um VHB (A sendo um primeiro epítopo e B sendo um segundo epítopo) e a outra compreendendo um VLB e um VHA, dois sítios de ligação diferentes podem se formar: VLA-VHA e VLB-VHB. Para todos os pares de cadeias polipeptídicas de anticorpo biespecífico, o desalinhamento ou a ligação incorreta das duas cadeias é uma possibilidade, por exemplo, a interação das regiões VL-VL ou VH-VH. No entanto, a purificação de anticorpos biespecíficos funcionais é facilmente gerenciada com base na imunoespecificidade do sítio de ligação adequadamente dimerizado usando qualquer método com base em afinidade conhecido na técnica ou exemplificado aqui, por exemplo, cromatografia de afinidade.

[00311] Em uma modalidade, as cadeias polipeptídicas do anticorpo biespecífico podem compreender vários ligantes e peptídeos. Os ligantes e peptídeos podem ter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos.

[00312] Em algumas modalidades, o Domínio 1 é ligado de forma covalente ao primeiro domínio promotor de heterodímero por meio de um ligante de cisteína e o Domínio 2 é ligado de forma covalente ao segundo domínio promotor de heterodímero por meio de um ligante de cisteína. Cada um dos ligantes de cisteína inclui pelo menos um resíduo de cisteína para permitir a ligação de dissulfeto intramolecular. Em outras modalidades de cada um dos anteriores, o ligante de cisteína (Ligante 3) compreende pelo menos cinco aminoácidos.

[00313] Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica é ligada de forma covalente à segunda cadeia polipeptídica através de pelo menos uma ligação de dissulfeto. Em algumas de tais modalidades, pelo menos uma ligação de dissulfeto se forma entre o Ligante 3 da primeira cadeia polipeptídica e o Ligante 3 da segunda cadeia polipeptídica. Em outra de tais modalidades, pelo menos uma ligação de dissulfeto é formada entre o primeiro domínio promotor de heterodímero e o segundo domínio promotor de heterodímero. Em modalidades específicas, cada ligação de dissulfeto é formada ao ligar dois resíduos de cisteína. Em um aspecto da presente invenção, um anticorpo biespecífico, conforme mostrado na Figura 1, compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica. Em algumas de tais modalidades, o Ligante 3 pode compreender uma região de dobradiça inferior de IgG1 humana truncada que tem a sequência de SEQ ID NO: 64 com pelo menos um resíduo de glicina precedendo a região de dobradiça inferior.

[00314] Os anticorpos biespecíficos da invenção podem ligar simultaneamente dois epítopos separados e distintos. Em determinadas modalidades, pelo menos um sítio de ligação ao epítopo é específico para o determinante CD3 expresso em uma célula imune efetora, por exemplo, expresso em linfócitos T. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico se liga ao determinante da célula efetora e também ativa a célula efetora.

[00315] Em um aspecto, a invenção fornece uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica. Em uma modalidade, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 36. Em outra modalidade, a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em uma ou mais de SEQ ID NO: 37 ou 38 (Tabela 7). Em uma modalidade preferida, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36; e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 37 ou 38. Em uma modalidade, a segunda cadeia polipeptídica é qualquer polipeptídeo que deve ser associado à primeira cadeia polipeptídica por meio de uma interface. A Tabela 7 mostra a sequências da primeira cadeia polipeptídica e da segunda cadeia polipeptídica para os anticorpos biespecíficos GUCY2c-H2B4 e GUCY2c-2B5. Tabela 7 Anticorpo Primeira cadeia polipeptídica Segunda cadeia polipeptídica biespecífico

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASESVDYYGTSLMQWYQQKP KSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK GKPPKLLIYAASNVESGVPSRFS PGQPPKLLISWASTRESGVPDR GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA YCQQTRKVYTFGQGTKLEI KGG VYYCKQSYDLFTFGSGTKLEI KG GSGGGGEVQLVESGGGLVQPG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQP GSLRLSCAASGFTFSDYYMTWV GGSLRLSCAASGYTFTSYWMH RQAPGKGLEWVAFIRNRARGYT WVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGL SDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY TNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYL LQMNSLRAEDTAVYYCARDRPS QMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTE

YYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPC GYWFFDVWGQGTLVTVSSGCP GUCY2c-H2B4

PAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLM PCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDT ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV NWYVDGVEVHNAKTKPREEQY KFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK QPREPQVCTLPPSREEMTKNQV GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQ SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

H EALH N H YTQKSLSLSPG MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ IN NO: 36) (SEQ IN NO: 37)

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASESVDYYGTSLMQWYQQKP TSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQK GKPPKLLIYAASNVESGVPSRFS PGKAPKLLIYWASTRESGVPSRF GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YCQQTRKVYTFGQGTKLEI KGG YYCKQSYDLFTFGGGTKVEI KG GSGGGGEVQLVESGGGLVQPG GGSGGGGEVQLVESGGGLVQP GSLRLSCAASGFTFSDYYMTWV GGSLRLSCAASGYTFTSYWMH RQAPGKGLEWVAFIRNRARGYT WVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGL

SDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLY TNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYL LQMNSLRAEDTAVYYCARDRPS QMNSLRAEDTAVYYCTRTI1 1 1E

YYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPC GYWFFDVWGQGTLVTVSSGCP GUCY2c-2B5

PAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLM PCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDT ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV NWYVDGVEVHNAKTKPREEQY KFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK QPREPQVCTLPPSREEMTKNQV GQPREPQVYTLPPCREEMTKNQ SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESN QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

H EALHNHYTQKSLSLSPG MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 38)

[00316] Em modalidades particulares, o anticorpo biespecífico da presente invenção (a) se liga ao domínio extracelular do antígeno tumoral humano; (b) demonstra uma meia-vida prolongada no soro e no tumor de 30 minutos a 100 dias; e/ou (c) demonstra um valor de EC50 inferior entre 0,0001 nM e 100 nM na presença de níveis de expressão tumorais aumentados ou níveis de densidade de receptor aumentados.

[00317] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao epítopo é capaz de se ligar a um antígeno associado a tumor que está associado ao câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, colo do útero, pulmão (incluindo, porém sem limitações, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de células pequenas), câncer de bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e do sistema digestivo. O câncer do sistema digestivo inclui, porém sem limitações,

câncer do esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas. Em modalidades específicas, a terapia ativa uma resposta de células T citolíticas. Mutações Efetoras Nulas em CH2-CH3 de lgG1 Humana

[00318] A cadeia Fc de IgG1 humana foi modificada para introduzir as mutações L234A, L235A e G237A (SEQ ID NO: 82, numeração de acordo com o índice EU) usando mutagênese por PCR iniciador-dirigida padrão para eliminar a função efetora em virtude de ligação ao FcRIII fornecendo um fenótipo de função efetora nula (Canfield et al., J. Exp. Med (1991) 173: 1483-1491; Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276: 6591-604). Mutações Knobs-in-Holes em CH2-CH3 de IgG1 Humana

[00319] Knobs-in-holes é uma estratégia de design eficaz conhecida na técnica para a engenharia de homodímeros de cadeia pesada de anticorpos para heterodimerização. Nesta abordagem, uma variante 'knob' foi obtida pela substituição de um pequeno aminoácido por um maior em uma cadeia da cadeia Fc de lgG1, por exemplo, Y349C e T366W (numeração de acordo com o índice EU). O 'knob' foi concebido para inserção em um 'hole' no domínio CH3 da cadeia complementar da cadeia Fc criada pela substituição de um grande resíduo por um menor, por exemplo, S354C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o Índice da UE).

[00320] Em algumas modalidades, mutações complementares foram introduzidas para derivar heterodimerização das cadeias Fc resultantes, de modo que cada cadeia Fc carregaria um conjunto de mutações, Y349C e T366W para a cadeia Fc do "knob" (ou protuberância) (SEQ ID NO: 78) ou S354C, T366S, L368A e Y407V para a cadeia Fc do "hole" (ou cavidade) (SEQ ID NO: 79), conforme fornecido na Tabela 8. Quando cotransfectado em um hospedeiro mamífero adequado, o DNA que codifica as sequências de aminoácidos, por exemplo, de SEQ ID NOs: 78 e 79, produzem um domínio Fc que é predominantemente um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia Fc de "knob" (ou protuberância) associada a uma cadeia Fc de um "hole" (ou cavidade). Tabela 8

APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF Mutações na cadeia Fc NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE do "knob" YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQV (SEQ ID NO: 78) SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF Mutações na cadeia Fc NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE do "hole" YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQV (SEQ ID NO: 79) SLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[00321] Os anticorpos biespecíficos do antígeno tumoral CD3 da presente invenção são estáveis contra agregação em estudos de estabilidade térmica e potentes fusões anticorpo-Fc biespecífico que alvejam tanto CD3 humana quanto um antígeno tumoral. O domínio Fc knob-in-hole permite expressão aprimorada em células CHO e purificação aprimorada, resultando em alta pureza do heterodímero desejado. As mutações concebidas dentro do domínio Fc anulam a ligação ao FcR, deste modo, evitando potencialmente a depleção de células T mediada por ADCC. Além disso, a incorporação do domínio Fc a um anticorpo biespecífico aumenta a estabilidade da molécula, conforme mostrado por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC).

[00322] O anticorpo biespecífico pode ser concebido para compreender pelo menos um resíduo de cisteína que pode interagir com um resíduo de cisteína de contraparte em outra cadeia polipeptídica da invenção para formar uma ligação de dissulfeto entre cadeias. As ligações de dissulfeto entre cadeias podem servir para estabilizar o anticorpo biespecífico ao melhorar a expressão e recuperação em sistemas recombinantes, resultando em uma formulação estável e consistente, bem como melhorar a estabilidade do produto isolado e/ou purificado in vivo. O resíduo ou resíduos de cisteína podem ser introduzidos como um único aminoácido ou como parte de uma sequência de aminoácidos maior, por exemplo, região de dobradiça, em qualquer porção da cadeia polipeptídica. Em um aspecto específico, pelo menos um resíduo de cisteína é manipulado para ocorrer no C- término da cadeia polipeptídica.

[00323] A invenção abrange métodos e composições para tratamento, prevenção ou gerenciamento de câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo manipulado de acordo com a invenção, molécula a qual se liga ainda a um antígeno canceroso. Os anticorpos da presente invenção podem ser particularmente úteis para a prevenção, inibição, redução do crescimento e/ou regressão de tumores primários e metástases de células cancerosas. Embora não pretendendo estar preso por um mecanismo de ação particular, os anticorpos da invenção podem mediar a função efetora que pode resultar na eliminação do tumor, redução do tumor ou uma combinação dos mesmos.

[00324] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento terapêutico para estimular a ativação de células T usando um anticorpo anti-CD3 da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da invenção a um indivíduo que precisa do mesmo. O transtorno tratado é qualquer doença ou condição que é melhorada, aliviada, inibida ou evitada pela estimulação da atividade ou sinalização à CD3. Em modalidades específicas, a presente invenção fornece moléculas de ligação a antígeno biespecíficas, por exemplo, anticorpos biespecíficos,

que se ligam à CD3 e um antígeno alvo.

[00325] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento de um tumor que compreendem contatar tumor com uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga à CD3, incluindo cada um dos anticorpos descritos aqui.

[00326] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para inibir o crescimento de um tumor em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga à CD3, incluindo cada um dos anticorpos descritos aqui.

[00327] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para modular a angiogênese em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga à CD3, incluindo cada um dos anticorpos descritos aqui.

[00328] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para reduzir a tumorigenicidade de um tumor em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga à CD3, incluindo cada um dos anticorpos descritos aqui.

[00329] Em um aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de uma condição associada à expressão de antígeno tumoral em um indivíduo. Consequentemente, um antígeno tumoral é obtido ao manipular o anticorpo biespecífico para reconhecer imunoespecificamente o antígeno tumoral e um antígeno CD3 nas células T. Os anticorpos biespecíficos que foram manipulados de acordo com a invenção são úteis para a prevenção ou tratamento do câncer, uma vez que eles têm uma atividade citotóxica por células T assassinas ativadas induzida pelo anticorpo anti-CD3.

[00330] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método de tratamento de câncer. Em modalidades específicas, o câncer é de câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão (incluindo, porém sem limitações, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de células pequenas), bexiga, endometrial, cabeça e pescoço, testicular, câncer de glioblastoma ou um câncer do sistema digestivo. Em determinadas modalidades, o câncer do sistema digestivo é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas.

[00331] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, um anticorpo biespecífico ou uma composição farmacêutica conforme descrito aqui para uso em terapia. Em uma modalidade particular, a invenção também fornece um anticorpo anti-CD3 biespecífico para uso no método de tratamento de câncer definido aqui. Em modalidades específicas, a terapia ativa uma resposta de células T citolíticas.

[00332] A presente invenção fornece ainda um anticorpo ou um anticorpo biespecífico, conforme descrito aqui, para uso na fabricação de um medicamento para uso em terapia. Em algumas modalidades, a terapia é um tratamento de um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão (incluindo, porém sem limitações, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de células pequenas), bexiga, endométrio, cabeça e pescoço, testicular, câncer de glioblastoma e um câncer do sistema digestivo. Em determinadas modalidades, o câncer do sistema digestivo é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas.

[00333] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um anticorpo biespecífico conforme descrito aqui. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor que compreende polinucleotídeos conforme descrito aqui. Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma célula hospedeira que compreende os vetores descritos aqui. Em algumas de tais modalidades, a célula hospedeira produz de forma recombinante o anticorpo ou o anticorpo biespecífico conforme descrito aqui. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em linhagens de células bacterianas, linhagens de células de mamíferos, linhagens de células de insetos, linhagens de células de leveduras e sistemas de síntese de proteínas isentos de células in vitro. Em uma modalidade particular, a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células CHO.

[00334] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de um câncer em um indivíduo que precisa que compreende a) administrar o anticorpo biespecífico conforme descrito aqui e b) administrar o dito anticorpo biespecífico ao dito indivíduo.

[00335] Em algumas modalidades, é fornecido um método para inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas que expressam um antígeno tumoral que compreende administrar ao indivíduo que precisa uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, é fornecido um método para inibir a metástase de células que expressam um antígeno tumoral em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo que precisa uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, é fornecido um método para induzir à regressão tumoral em células malignas em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo que precisa uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos conforme descrito aqui.

[00336] Em um aspecto específico, os anticorpos da invenção inibem ou reduzem o crescimento de células cancerosas em pelo menos 99 %, pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, pelo menos 50 %, pelo menos 45 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 35 %, pelo menos 30 %, pelo menos 25 %, pelo menos 20 % ou pelo menos pelo menos 10 % em relação ao crescimento de células cancerosas na ausência do anticorpo ou de um anticorpo biespecífico da invenção.

[00337] Em um aspecto específico, os anticorpos matam células ou inibem ou reduzem o crescimento de células cancerosas em pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95% ou pelo menos 100 % melhor do que na ausência do anticorpo ou anticorpos biespecíficos da invenção.

[00338] Em um aspecto, a invenção fornece uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende um anticorpo biespecífico conforme descrito aqui para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer) associada a uma expressão de antígeno tumoral em um indivíduo que precisa do mesmo.

[00339] Em outro aspecto, a invenção fornece os anticorpos conforme descrito aqui para uso no tratamento de uma condição (por exemplo, câncer) associada a uma expressão de antígeno tumoral em um indivíduo que precisa do mesmo. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos conforme descrito aqui para inibir o crescimento ou progressão tumoral em um indivíduo que tem células malignas que expressam um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos conforme descrito aqui para inibir a metástase de células malignas que expressam um antígeno tumoral em um indivíduo que precisa do mesmo. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos conforme descrito aqui para induzir à regressão do tumor em um indivíduo que tem células malignas que expressam um antígeno tumoral.

[00340] Em outro aspecto, a invenção fornece um uso dos anticorpos conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer) associada a uma expressão de antígeno tumoral. Em algumas modalidades, é fornecido um uso dos anticorpos conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para inibir o crescimento ou progressão tumoral. Em algumas modalidades, é fornecido um uso dos anticorpos conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para inibir a metástase de células malignas que expressam um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, é fornecido um uso dos anticorpos conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para induzir à regressão do tumor.

[00341] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui compreendem ainda uma etapa de tratamento de um indivíduo com uma forma adicional de terapia. Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia é uma terapia anticâncer adicional incluindo, porém sem limitações, quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou imunoterapia adicional.

[00342] A invenção abrange ainda a administração das moléculas da invenção em combinação com outras terapias conhecidas por aqueles versados na técnica para o tratamento ou prevenção de câncer incluindo, porém sem limitações, quimioterapias padrão e experimentais atuais, terapias biológicas, imunoterapias, radioterapia ou cirurgia. Em alguns aspectos, as moléculas da invenção podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes, anticorpos terapêuticos ou outros agentes conhecidos por aqueles versados na técnica para o tratamento e/ou prevenção de câncer.

[00343] Consequentemente, os métodos para o tratamento do câncer incluem administrar a um indivíduo que precisa uma quantidade eficaz de anticorpo multiespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico) da presente invenção em combinação com um agente quimioterapêutico. Tal tratamento combinado pode ser administrado separada, sequencial ou simultaneamente.

[00344] As quantidades de dosagem e frequências de administração fornecidas aqui são abrangidas pelos termos terapeuticamente eficaz e profilaticamente eficaz. A dosagem e frequência podem ainda variar de acordo com fatores específicos para cada indivíduo, dependendo dos agentes terapêuticos ou profiláticos específicos administrados, a gravidade e o tipo de câncer, a via de administração, bem como a idade, peso corporal, resposta e histórico médico do indivíduo. Os regimes adequados podem ser selecionados por aqueles versados na técnica considerando tais fatores e seguindo, por exemplo, dosagens relatadas na literatura e recomendadas no Physician's Desk Reference (56ª ed., 2002).

[00345] Consequentemente, além de redirecionar células T para antígenos específicos para tumor, as moléculas de acoplamento de células T biespecíficas também podem ser usadas para transportar outros compostos diagnósticos ou terapêuticos para células que expressam um tumor sobre sua superfície. Assim, uma molécula de acoplamento de células T biespecíficas pode ser ligada direta ou indiretamente, por exemplo, por meio de um ligante, a um fármaco de modo a ser distribuída diretamente às células que trazem um tumor. Os agentes terapêuticos incluem compostos tais como ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, aminoácidos ou derivados, glicoproteínas, radioisótopos, lipídeos, carboidratos ou vírus recombinantes. As porções terapêuticas e diagnósticas de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos antissenso, oligonucleotídeos derivatizados para reticulação covalente com DNA simples ou duplex e oligonucleotídeos formadores de triplex. Composições farmacêuticas

[00346] A presente invenção fornece ainda uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo descrito aqui e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00347] Os anticorpos da presente invenção podem estar na forma de uma composição farmacêutica para administração que é formulada para ser apropriada para o modo de administração selecionado e diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como tampões, tensoativos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes, carreadores e assim por diante. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18ª ed., 1995, fornece um compêndio de técnicas de formulação conforme geralmente conhecido pelos médicos.

[00348] Estas composições farmacêuticas podem ser administradas através de qualquer meio conhecido na técnica que atinja a finalidade geral pretendida para tratar o câncer. A via de administração pode ser parentérica, definida aqui como se referindo a modos de administração que incluem, porém sem limitações, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e intra-articular. O modo de administração e dosagem das moléculas de acordo com a invenção (por exemplo, anticorpos, composição farmacêutica) depende do tipo de doença a ser combatida, quando apropriado, o estágio da mesma, o antígeno a ser controlado, o tipo de tratamento simultâneo, se houver, frequência do tratamento, a natureza do efeito desejado e também o peso corporal, a idade, a saúde, a dieta e o sexo do indivíduo. Assim, o regime de dosagem realmente empregado pode variar amplamente e, portanto, pode se desviar dos regimes de dosagem fornecidos aqui.

[00349] Várias formulações dos anticorpos dos presentes anticorpos podem ser usadas para administração. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser administrados puros. Em algumas modalidades, o anticorpo e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, porém sem limitações, agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsificantes, sais para variar osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões e intensificadores de penetração na pele. Excipientes, bem como formulações para administração parentérica e não parentérica de fármacos, são apresentados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed. Mack Publishing, 2005.

[00350] Em algumas modalidades, tais agentes são formulados para administração através de injeção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). Consequentemente, tais agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e similares. O regime de dosagem específico isto é, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo específico e do histórico médico deste indivíduo.

[00351] Os anticorpos conforme descrito aqui podem ser administrados usando qualquer método adequado, incluindo através de injeção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). O anticorpo, por exemplo, anticorpo monoclonal ou anticorpo biespecífico, também pode ser administrado através de inalação, conforme descrito aqui. Em geral, para administração do anticorpo da presente invenção, a dosagem depende do hospedeiro tratado e do modo particular de administração.

Em uma modalidade, a faixa de dose do anticorpo da presente invenção será de cerca de 0,001 μg/kg de peso corporal a cerca de 20.000 μg/kg de peso corporal.

O termo "peso corporal" é aplicável quando um paciente está sendo tratado.

Quando as células isoladas estão sendo consideradas, "peso corporal", conforme usado aqui, se refere a um "peso corporal total da célula". O termo "peso corporal total" pode ser usado para se aplicar tanto à célula isolada quanto ao tratamento do paciente.

Todas as concentrações e níveis de tratamento são expressos como "peso corporal" ou simplesmente "kg" no presente pedido e também são considerados como abrangendo as concentrações análogas de "peso corporal total da célula" e "peso corporal total". No entanto, aqueles versados na técnica reconhecerão a utilidade de uma variedade de faixas de dosagem, por exemplo, 0,01 μg/kg de peso corporal a 20.000 μg/kg de peso corporal, 0,02 μg/kg de peso corporal a 15.000 μg/kg de peso corporal, 0,03 μg/kg de peso corporal a 10.000 μg/kg de peso corporal, 0,04 μg/kg de peso corporal a 5.000 μg/kg de peso corporal, 0,05 μg/kg de peso corporal a 2.500 μg/kg de peso corporal, 0,06 μg/kg de peso corporal a 1.000 μg/kg de peso corporal, 0,07 μg/kg de peso corporal a 500 μg/kg de peso corporal, 0,08 μg/kg de peso corporal a 400 μg/kg de peso corporal, 0,09 μg/kg de peso corporal a 200 μg/kg de peso corporal ou 0,1 μg/kg de peso corporal peso y para 100 μg/kg de peso corporal.

Além disso, aqueles versados na técnica reconhecerão que uma variedade de diferentes níveis de dosagem serão úteis, por exemplo, 0,0001 μg/kg, 0,0002 μg/kg, 0,0003 μg/kg, 0,0004 μg/kg, 0,005 μg/kg, 0,0007 μg/kg, 0,001 μg/kg, 0,1 μg/kg, 1,0 μg/kg, 1,5 μg/kg, 2,0 μg/kg, 5,0 μg/kg, 10,0 μg/kg, 15,0 μg/kg, 30,0 μg/kg, 50 μg/kg, 75 μg/kg, 80 μg/kg, 90 μg/kg, 100 μg/kg, 120 μg/kg, 140 μg/kg, 150 μg/kg, 160 μg/kg, 180 μg/kg, 200 μg/kg, 225μg/kg, 250 μg/kg, 275 μg/kg, 300 μg/kg, 325 μg/kg, 350 μg/kg, 375 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1 μg/kg, 5 μg/kg, 10 μg/kg, 12 μg/kg, 15 g/kg, 20 μg/kg e/ou 30 μg/kg. Todas estas dosagens são exemplificativas e qualquer dosagem entre estes pontos também será útil na invenção. Qualquer uma das faixas de dosagem ou níveis de dosagem acima pode ser empregado para um anticorpo da presente invenção. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exemplo, para inibir ou retardar o crescimento/progressão tumoral ou metástase de células cancerosas.

[00352] Outros regimes de dosagem também podem ser úteis, dependendo do padrão de degradação farmacocinética que o médico deseja atingir. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é administrado em uma dose inicial, seguido por uma dosagem mais elevada e/ou contínua substancialmente constante. Em algumas modalidades, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é considerada. Em algumas modalidades, dosagem uma vez por mês ou uma vez a cada dois meses ou a cada três meses é considerada. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem pode variar com o tempo.

[00353] Para fins da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo dependerá do anticorpo ou composições dos mesmos empregadas, o tipo e a gravidade dos sintomas a serem tratados, se o agente é administrado para fins terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao agente, a taxa de liberação do paciente para o agente administrado e a critério do médico que faz o atendimento. Normalmente, o médico administrará um anticorpo até que uma dosagem seja atingida e obtenha o resultado desejado. A dose e/ou frequência podem variar ao longo do tratamento. Considerações empíricas, tal como a meia-vida, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, tais como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e evitar que o anticorpo seja atacado pelo sistema imune do hospedeiro. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso da terapia e é geralmente, mas não necessariamente, com base no tratamento e/ou supressão e/ou melhoria e/ou retardo dos sintomas, por exemplo, inibição ou retardo do crescimento do tumor, etc. Alternativamente, formulações de anticorpos de liberação contínua sustentada podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar a liberação sustentada são conhecidos na técnica.

[00354] Em uma modalidade, as dosagens para um anticorpo podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações do anticorpo. Os indivíduos recebem dosagens incrementais de um anticorpo. Para avaliar a eficácia, um indicador da doença pode ser acompanhado.

[00355] Em determinadas modalidades, a administração de um anticorpo leva a pelo menos um efeito selecionado a partir do grupo que consiste em inibição do crescimento do tumor, regressão do tumor, redução no tamanho de um tumor, redução no número de células tumorais, retardo no crescimento tumoral, efeito abscopal, inibição de metástase tumoral, redução nas lesões metastáticas ao longo do tempo, uso reduzido de agentes quimioterapêuticos ou citotóxicos, redução na carga do tumor, aumento na sobrevida sem progressão, aumento na sobrevida geral, resposta completa, resposta parcial e doença estável.

[00356] A administração de um anticorpo de acordo com o método na presente invenção pode ser contínua ou intermitente dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se a finalidade da administração é terapêutica ou profilática e outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. A administração de um anticorpo pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré- selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas.

[00357] Em algumas modalidades, mais de um anticorpo pode estar presente. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes ou mais podem estar presentes. Em geral, tais anticorpos podem ter atividades complementares que não se afetam adversamente. Por exemplo, um ou mais dos seguintes anticorpos podem ser usados: um primeiro anticorpo anti-CD3 direcionado a um epítopo na CD3 e um segundo anticorpo anti-CD3 direcionado a um epítopo diferente na CD3.

[00358] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são particularmente úteis para administração parentérica, tal como administração intravenosa ou administração em uma cavidade corporal ou lúmen de um órgão.

[00359] As formulações terapêuticas do anticorpo usado de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento ao misturar um anticorpo que tem o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed. Mack Publishing, 2005), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações usadas e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais como cloreto de sódio; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[00360] Lipossomas que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688,1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030, 1980; e Patente US Nos

4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aprimorado são descritos na Patente US N° 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros com um tamanho de poro definido para produzir lipossomas que têm o diâmetro desejado.

[00361] Os ingredientes ativos também podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de (poli)metacrilato de metila, respectivamente, em sistemas de distribuição de fármaco coloidais (para exemplo, lipossomas, microesferas de albumina,

microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed. Mack Publishing, 2005.

[00362] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)metacrilato de 2-hidroxietila ou álcool (poli)vinílico, polilactídeos (Patente US N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L- glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[00363] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente obtido, por exemplo, por meio de filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições de anticorpos terapêuticos (por exemplo, anticorpo anti-CD3) são, em geral, colocadas em um recipiente com uma abertura de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00364] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitária, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões ou supositórios, para administração oral, parentérica ou retal ou administração através de inalação ou insuflação.

[00365] Para preparar composições sólidas, tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um carreador farmacêutico, por exemplo, ingredientes convencionais para comprimidos, tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida que contém uma mistura homogênea de um composto da presente invenção ou um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando de referência a tais composições de pré-formulação como homogêneas, entenda-se que o ingrediente ativo é disperso uniformemente por toda a composição, de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes, tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta composição de pré-formulação sólida é, então, subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima que contêm a partir de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou de outro modo compostos para fornecer uma forma de dosagem que confira a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, o último estando na forma de um envoltório sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para o duodeno, isto é, tenha a liberação retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo uma série de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

[00366] Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não iônicos, tais como polioxietileno sorbitanos (por exemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, Span™

20, 40, 60, 80 ou 85). As composições com um agente tensoativo compreenderão, convenientemente, entre 0,05 e 5 % do agente tensoativo e podem estar entre 0,1 e 2,5 %. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.

[00367] As composições dentro do escopo da invenção incluem todas as composições nas quais um anticorpo está presente em uma quantidade que é eficaz para atingir o efeito médico desejado para o tratamento de câncer. Embora as necessidades individuais possam variar de um paciente para outro, a determinação das faixas ideais de quantidades eficazes de todos os componentes está dentro da capacidade do médico de habilidade comum.

[00368] Exemplos de tais composições, bem como como formular, também são descritos em uma seção anterior e abaixo. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante que é capaz de desencadear uma resposta imune desejada, tal como lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante que não desencadeia uma resposta imune indesejada ou indesejável, tal como lise mediada por anticorpo ou ADCC.

[00369] Deve ser entendido que as composições podem compreender mais de um anticorpo, tal como uma mistura de anticorpos anti-CD3 que reconhecem diferentes epítopos da CD3 ou CD3 e um antígeno tumoral). Outras composições exemplificativas compreendem mais de um anticorpo que reconhece o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou diferentes espécies de anticorpos ou que se ligam a diferentes epítopos de CD3 e um antígeno tumoral (por exemplo, CD3 humana).

[00370] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser administrado em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Estes incluem, porém sem limitações, a administração de um agente bioterapêutico e/ou um agente quimioterapêutico tal como, porém sem limitações, uma vacina, uma terapia com base em células CAR-T, radioterapia, uma terapia com citocinas, um anticorpo anti-CD3 biespecífico, um inibidor de outras vias imunossupressoras, um inibidor de angiogênese, um ativador de células T, um inibidor de uma via metabólica, um inibidor de mTOR, um inibidor de uma via de adenosina, um inibidor de tirosina quinase incluindo, porém sem limitações, Inlyta, inibidores de ALK e sunitinibe, um inibidor de BRAF, um modificador epigenético, um inibidor de ID01, um inibidor de JAK, um inibidor de STAT, um inibidor de quinase dependente de ciclina, um agente bioterapêutico (incluindo, porém sem limitações, anticorpos contra VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, outros receptores de fator de crescimento, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1 BB, TIGIT e ICOS), um agente imunogênico (por exemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorais, células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas pulsadas com antígeno derivado de tumor ou ácidos nucleicos, citocinas imunoestimulantes (por exemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF) e células transfectadas com genes que codificam citocinas imunoestimulantes tal como, porém sem limitações, GM-CSF).

[00371] Exemplos de agentes bioterapêuticos incluem anticorpos terapêuticos, agentes moduladores imunes e células imunes terapêuticas.

[00372] Os anticorpos terapêuticos podem ter especificidade contra uma variedade de diferentes antígenos. Por exemplo, os anticorpos terapêuticos podem ser direcionados a um antígeno associado ao tumor, de modo que a ligação do anticorpo ao antígeno promova a morte da célula que expressa o antígeno. Em outro exemplo, os anticorpos terapêuticos podem ser direcionados a um antígeno (por exemplo, PD- 1) em uma célula imune, de modo que a ligação do anticorpo evite a regulação negativa da atividade da célula que expressa o antígeno (e, assim, promove a atividade da célula que expressa o antígeno). Em algumas situações, um anticorpo terapêutico pode funcionar por meio de vários mecanismos diferentes (por exemplo, pode tanto i) promover a morte da célula que expressa o antígeno como ii) impedir que o antígeno cause regulação negativa da atividade das células imunes em contato com a célula que expressa o antígeno).

[00373] Os anticorpos terapêuticos podem ser direcionados, por exemplo, aos antígenos listados a seguir. Para alguns antígenos, anticorpos exemplificativos direcionados ao antígeno também estão incluídos abaixo (entre colchetes/parênteses após o antígeno). Os antígenos a seguir também podem ser denominados como "antígenos alvo" ou similar aqui. Os antígenos alvo para anticorpos terapêuticos aqui incluem, por exemplo: 4-1BB (por exemplo, utomilumabe); 5T4; A33; receptor 1 de alfa-folato (por exemplo, mirvetuximabe soravtansina); Alk-1; BCMA [por exemplo PF-06863135 (consulte documento US9969809)]; BTN1A1 (por exemplo, consulte documento WO2018222689); CA-125 (por exemplo, abagovomabe); Carboanidrase IX; CCR2; CCR4 (por exemplo, mogamulizumabe); CCR5 (por exemplo, leronlimabe); CCR8; CD3 [por exemplo blinatumomabe (CD3/CD19 biespecífico), PF-06671008 (CD3/- caderina biespecífico), PF-06863135 (CD3/BCMA biespecífico), PF- 07062119 (CD3/GUCY2 biespecífico)] CD19 (por exemplo, blinatumomabe, MOR208); CD20 (por exemplo, ibritumomabe, tiuxetano, obinutuzumabe, ofatumumabe, rituximabe, ublituximabe); CD22 (inotuzumabe ozogamicina, moxetumomabe pasudotox); CD25; CD28; CD30 (por exemplo, brentuximabe vedotina); CD33 (por exemplo, gentuzumabe ozogamicina); CD38 (por exemplo,

daratumumabe, isatuximabe), CD40; CD-40L; CD44v6; CD47; CD52 (por exemplo, alentuzumabe); CD63; CD79 (por exemplo, polatuzumabe vedotina); CD80; CD123; CD276/ B7-H3 (por exemplo, omburtamabe); CDH17; CEA; C1hCG; CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe, tremelimumabe), CXCR4; desmogleína 4; DLL3 (por exemplo, rovalpituzumabe tesirina); DLL4; E-caderina; EDA; EDB; EFNA4; EGFR (por exemplo, cetuximabe, despatuxizumabe mafodotina, necitumumabe, panitumumabe); EGFRvlll; Endosialina; EpCAM (por exemplo, oportuzumabe monatox); FAP; Receptor Fetal de Acetilcolina; FLT3 (por exemplo, consulte documento WO2018/220584); GD2 (por exemplo, dinutuximabe, 3F8); GD3; GITR; GloboH; GM1; GM2; GUCY2C (por exemplo, PF-070621 19); HER2/neu [por exemplo, margetuximabe, pertuzumabe, trastuzumabe; ado-trastuzumabe entansina, trastuzumabe duocarmazina, PF-06804103 (consulte documento US8828401)]; HER3; HER4; ICOS; IL-10; ITG-AvB6; LAG-3 (por exemplo, relatlimabe); Lewis-Y; LG; Ly-6; M-CSF [por exemplo, PD- 0360324 (consulte documento US7326414)]; MCSP; mesotelina; MUC1; MUC2; MUC3; MUC4; MUC5AC; MUC5B; MUC7; MUC16; Notch1; Notch3; Nectina-4 (por exemplo, enfortumabe vedotina); 0X40 [por exemplo, PF-04518600 (consulte documento US7960515)]; - Cadereína [por exemplo, PF-06671008 (consulte documento WO2016/001810)]; PCDHB2; PD-1 [por exemplo, BCD-100, canrelizumabe, cemiplimabe, genolimzumabe (CBT-501), MEDI0680, nivolumabe, pembrolizumabe, RN888 (consulte documento WO2016/092419), sintilimabe, espartalizumabe, STI-A11 10, tislelizumabe, TSR-042]; PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, durvalumabe, BMS-936559 (MDX-1 105) ou LY3300054); PDGFRA (por exemplo, olaratumabe); Antígeno de células plasmáticas; PoliSA; PSCA; PSMA; PTK7 [por exemplo, PF-06647020 (consulte documento US9409995)]; Ror1; SAS; SCRx6; SLAMF7 (por exemplo,

elotuzumabe); SHH; SIRPa (por exemplo, ED9, Effi-DEM); STEAP; TGF-beta; TIGIT; TIM-3; TMPRSS3; Precursor de TNF-alfa; TROP-2 (por exemplo, sacituzumabe govitecano); TSPAN8; VEGF (por exemplo, bevacizumabe, brolucizumabe); VEGFR1 (por exemplo, ranibizumabe); VEGFR2 (por exemplo, ramucirumabe, ranibizumabe); Wue-1.

[00374] Os anticorpos terapêuticos podem ter qualquer formato adequado. Por exemplo, os anticorpos terapêuticos podem ter qualquer formato conforme descrito em outra parte aqui. Em algumas modalidades, um anticorpo terapêutico pode ser um anticorpo nu. Em algumas modalidades, um anticorpo terapêutico pode ser ligado a um fármaco/agente (também conhecido como um "conjugado de anticorpo- fármaco" (Antibody-Drug Conjugate, ADC)). Em algumas modalidades, um anticorpo terapêutico contra um antígeno particular pode ser incorporado em um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico).

[00375] Em algumas modalidades, um anticorpo direcionado a um antígeno pode ser conjugado a um fármaco/agente. As moléculas de anticorpo ligadas a fármaco também são denominadas de "conjugados de anticorpo-fármaco" (ADCs). Fármacos/agentes podem ser ligados a um anticorpo direta ou indiretamente por meio de um ligante. Mais comumente, os fármacos tóxicos estão ligados a um anticorpo, de modo que a ligação do ADC ao respectivo antígeno promova a morte de células que expressam o antígeno. Por exemplo, ADCs que estão ligados a fármacos tóxicos são particularmente úteis para direcionar antígenos associados a tumor, a fim de promover a morte de células tumorais que expressam os antígenos associados a tumor. Em outras modalidades, os agentes que podem estar ligados a um anticorpo podem ser, por exemplo, um agente imunomodulador (por exemplo, para modular a atividade de células imunes na proximidade do ADC),

um agente de imagiologia (por exemplo, para facilitar a imagiologia do ADC em um indivíduo ou uma amostra biológica do indivíduo) ou um agente para aumentar a meia-vida sérica ou bioatividade do anticorpo.

[00376] Métodos para conjugar o agente citotóxico ou outros agentes terapêuticos a anticorpos foram descritos em várias publicações. Por exemplo, a modificação química pode ser feita nos anticorpos através de aminas da cadeia lateral de lisina ou através de grupos sulfidrila de cisteína ativados pela redução de ligações de dissulfeto entre cadeias de modo que a reação de conjugação ocorra. Consulte, por exemplo, Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096, 2005 e Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15: 658-663, 2004. Resíduos de cisteína reativos manipulados em sítios específicos de anticorpos para conjugação de fármaco específica com estequiometria definida também foram descritos. Consulte, por exemplo, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26: 925-932, 2008. Conjugação usando um marcador que contém glutamina como doador de acila ou uma glutamina endógena tornada reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente como um doador de acila) através de manipulação polipeptídica na presença de transglutaminase e uma amina (por exemplo, um agente citotóxico que compreende ou está ligado a uma amina reativa) também é descrita nos Pedidos Internacionais WO2012/059882 e WO2015015448. Em algumas modalidades, um ADC pode ter qualquer uma das características ou elementos dos ADCs fornecidos no documento WO2016166629, o qual é incorporado a título de referência aqui para todas as finalidades. Os fármacos/agentes que podem ser ligados a um anticorpo no formato ADC podem incluir, por exemplo, agentes citotóxicos, agentes imunomoduladores, agentes de imagiologia, proteínas terapêuticas, biopolímeros ou oligonucleotídeos.

[00377] Agentes citotóxicos exemplificativos que podem ser incorporados em um ADC incluem uma antraciclina, uma auristatina,

uma dolastatina, uma combretastatina, uma duocarmicina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, um dímero de indolino-benzodiazepina, uma enodina, uma purdanamicina, uma maitansina, um taxano, um vinca alcaloide, uma camptotecina, uma tubulisina, uma hemiasterina, uma espliceostatina, uma pladienolida e estereoisômeros, isósteros, análogos ou derivados dos mesmos.

[00378] Agentes imunomoduladores exemplificativos que podem ser incorporados em um ADC incluem ganciclovier, etanercepte, tacrolímus, sirolímus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolgate mofetil, metotrextrato, citocortinas, fatores de crescimento de células-tronco, glucocorticoides e análogos dos mesmos, fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor, TNF), fatores hematopoiéticos, interleucinas (por exemplo, interleucina-1 (IL- 1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 e IL-21), fatores estimuladores de colônia (por exemplo, fator estimulador de colônia de granulócitos (Granulocyte-Colony Stimulating Factor, G-CSF) e fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, GM-CSF)), interferons (por exemplo, interferons-. Alfa., -.Beta e -.Gama), o fator de crescimento de células-tronco designado "fator S1", eritropoietina e trombopoietina ou uma combinação dos mesmos.

[00379] Agentes de imagiologia exemplificativos que podem ser incluídos em um ADC incluem fluoresceína, rodamina, fósforos de lantanídeos e derivados dos mesmos ou um radioisótopo ligado a um quelador. Exemplos de fluoroforos incluem, porém sem limitações, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por exemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por exemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor.RTM. (por exemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ou 750), carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (por exemplo, 5-TAMRA),

tetrametilrodamina (TMR) e sulforrodamina (SR) (por exemplo, SR101). Exemplos de quelantes incluem, porém sem limitações, ácido 1,4,7,10- tetra-azaciclododecano-N,N',N",N"'-tetra-acético (DOTA), ácido 1,4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1,4,7- triazaciclononano-glutárico, ácido 1,4,7-acético (deferoxamina), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA) e ácido 1,2- bis(o- aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetra-acético).

[00380] Proteínas terapêuticas exemplificativas que podem ser incluídas em um ADC incluem uma toxina, um hormônio, uma enzima e um fator de crescimento.

[00381] Polímeros biocompatíveis exemplificativos que podem ser incorporados em um ADC incluem polímeros solúveis em água, tais como polietileno glicol (PEG) ou derivados do mesmo e polímeros biocompatíveis que contêm zwiteríon (por exemplo, um polímero que contém fosforilcolina).

[00382] Polímeros biocompatíveis exemplificativos que podem ser incorporados em um ADC incluem oligonucleotídeos antissenso.

[00383] Em algumas modalidades, um anticorpo direcionado a um antígeno fornecido aqui pode ser incorporado em uma molécula de anticorpo biespecífico. Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidade de ligação por pelo menos dois antígenos diferentes.

[00384] Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico compreende um primeiro domínio variável de anticorpo e um segundo domínio variável de anticorpo, em que o primeiro domínio variável de anticorpo é capaz de recrutar a atividade de uma célula imune efetora humana ao se ligar especificamente à CD3 conforme fornecido aqui e em que o segundo domínio variável de anticorpo é capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo tem um isotipo lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc imunologicamente inerte. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou anticorpo humanizado.

[00385] O antígeno alvo é, tipicamente, expresso em uma célula alvo em uma condição patológica (por exemplo, uma célula cancerosa). Exemplos de antígenos alvo de interesse particular em anticorpos biespecíficos incluem, porém sem limitações, BCMA, EpCAM (Molécula de Adesão Epitelial), CCR5 (Receptor de Quimiocina de tipo 5), CD19, HER (Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico Humano)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico), PSMA, CEA, MUC-1 (Mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, C1hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliosídeo GD3, 9-0-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2, Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, Célula Plasmática Antigênica (ligada à membrana), IgE, MCSP (Proteoglicana de Sulfato de Condroitina de Melanoma), CCR8, TNF- alfa precursor, STEAP, mesotelina, Antígeno A33, PSCA (Antígeno de Células-Tronco de Próstata), Ly-6; desmogleína 4, neoepítopo de E- caderina, receptor fetal de acetilcolina, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e receptor MIS (substância inibitória de Mueller) de tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de ativação de fibroblastos), endosialina, EGFRvlll, LG, SAS, PD-L1, CD47, SIRPa e CD63.

[00386] Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico compreende um anticorpo humano de comprimento total, em que um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo biespecífico é capaz de recrutar a atividade de uma célula imune efetora humana ao se ligar especificamente à CD3 e em que um segundo o domínio variável do anticorpo da proteína heterodimérica é capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo (por exemplo, CD20, EpCAM ou -

caderina).

[00387] Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos foi com base na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas tendo especificidades diferentes (Millstein e Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).

[00388] De acordo com uma abordagem para a produção de anticorpos biespecíficos, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo- antígeno) são fundidos a sequências da região constante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isto permite grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção fornecem os rendimentos ideais. No entanto, é possível inserir as sequências codificadoras para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significado particular.

[00389] Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (que confere uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas. Esta abordagem é descrita na Publicação PCT N° WO 94/04690.

[00390] Em outra abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de modificação de aminoácidos na primeira região de dobradiça em um braço e o aminoácido substituído/trocado na primeira região de dobradiça tem uma carga oposta ao aminoácido correspondente na segunda região de dobradiça em outro braço. Esta abordagem é descrita no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

[00391] Em outra abordagem, a formação de uma proteína heteromultimérica ou heterodimérica desejada (por exemplo, anticorpo biespecífico) é aumentada pela alteração ou manipulação de uma interface entre uma primeira e uma segunda regiões Fc similar à imunoglobulina (por exemplo, uma região de dobradiça e/ou uma região CH3). Nesta abordagem, os anticorpos biespecíficos podem ser compostos de uma região CH3, em que a região CH3 compreende um primeiro polipeptídeo de CH3 e um segundo polipeptídeo de CH3 que interagem para formar uma interface de CH3, em que um ou mais aminoácidos dentro da interface de CH3 desestabilizam a formação de homodímero e não são eletrostaticamente desfavoráveis à formação de homodímero. Esta abordagem é descrita no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

[00392] Em outra abordagem, os anticorpos biespecíficos podem ser gerados usando uma etiqueta (tag) peptídica que contém glutamina manipulada ao anticorpo dirigido a um epítopo (por exemplo, BCMA) em um braço e outra etiqueta peptídica (por exemplo, uma etiqueta peptídica que contém Lys ou uma Lys endógena reativa) manipulada para um segundo anticorpo dirigido a um segundo epítopo em outro braço no presença de transglutaminase. Esta abordagem é descrita no Pedido de Patente Internacional N° PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882).

[00393] Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios variáveis de anticorpo do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos em posições nas quais os primeiro e segundo domínios variáveis de anticorpo do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos nas posições 223, 225 e 228 (por exemplo, (C223E ou C223R), (E225R) e (P228E ou P228R)) na região de dobradiça e na posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG2 humana.

[00394] Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios variáveis de anticorpo do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos nas posições 221 e 228 (por exemplo, (D221 R ou D221 E) e (P228R ou P228E)) na região de dobradiça e na posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG1 humana.

[00395] Em algumas modalidades, os primeiro e segundo domínios variáveis de anticorpo do anticorpo biespecífico compreendem modificações de aminoácidos nas posições 228 (por exemplo, (P228E ou P228R)) na região de dobradiça e na posição 409 ou 368 (por exemplo, R409 ou L368E (Esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG4 humana.

[00396] Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode ter qualquer uma das características ou elementos de qualquer um dos anticorpos biespecíficos fornecidos no documento WO2016166629, o qual é aqui incorporado a título de referência para todas as finalidades.

[00397] Os agentes de modulação imune incluem uma variedade de diferentes tipos de moléculas que podem estimular uma resposta imune em um indivíduo, tais como agonistas do receptor de reconhecimento de padrões (Pattern Recognition Receptors, PRR), citocinas imunoestimulantes e vacinas contra o câncer.

[00398] Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) são receptores que são expressos por células do sistema imune e que reconhecem uma variedade de moléculas associadas a patógenos e/ou danos ou morte celular. Os PRRs estão envolvidos tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Os agonistas de PRR podem ser usados para estimular a resposta imune em um indivíduo. Há várias classes de moléculas PRR, incluindo receptores Toll-like (TLRs), receptores RIG-1-like (RLRs), receptores do tipo domínio de oligomerização de ligação a nucleotídeos (Nucleotide Oligomerization Domain, NOD) (NLRs), receptores de lectina de tipo C (C-type Lectin Receptors, CLRs) e proteína Estimuladora de Genes de Interferon (STimulator of INterferon Genes, STING).

[00399] Os termos "TLR" e "receptor Toll-like" se referem a qualquer receptor de tipo Toll. Receptores de tipo Toll são receptores envolvidos na ativação de respostas imunes. Os TLRs reconhecem, por exemplo, padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) expressos em micróbios, bem como padrões moleculares associados a danos endógenos (Damage- Associated Molecular Patterns, DAMPs), que são liberados de células mortas ou em vias de morte.

[00400] Moléculas que ativam os TLRs (e, assim, ativam as respostas imunes) são denominadas aqui como "agonistas de TLR". Os agonistas de TLR podem incluir, por exemplo, pequenas moléculas (por exemplo, molécula orgânica com um peso molecular menor do que cerca de 1000 Daltons), bem como moléculas grandes (por exemplo, oligonucleotídeos e proteínas). Alguns agonistas de TLR são específicos para um único tipo de TLR (por exemplo, TLR3 ou TLR9), enquanto que alguns agonistas de TLR ativam dois ou mais tipos de TLR (por exemplo, tanto TLR7 como TLR8).

[00401] Agonistas de TLR exemplificativos fornecidos aqui incluem agonistas de TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 e TLR9.

[00402] Agonistas de TLR de pequenas moléculas exemplificativos incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Patente US Nos 4.689.338;

4.929.624; 5.266.575; 5.268.376; 5.346.905; 5.352.784; 5.389.640;

5.446.153; 5.482.936; 5.756.747; 6.110.929; 6.194.425; 6.331.539;

6.376.669; 6.451.810; 6.525.064; 6.541.485; 6.545.016; 6.545.017;

6.573.273; 6.656.938; 6.660.735; 6.660.747; 6.664.260; 6.664.264;

6.664.265; 6.667.312; 6.670.372; 6.677.347; 6.677.348; 6.677.349;

6.683.088; 6.756.382; 6.797.718; 6.818.650 e 7.7091.214; Publicações de Patente US N° 2004/0091491, 2004/0176367 e 2006/0100229; e Publicações Internacionais Nos WO 2005/18551, WO 2005/18556, WO 2005/20999, WO 2005/032484, WO 2005/048933, WO 2005/048945, WO 2005/051317, WO 2005/051324, WO 2005/066169, WO 2005/066170, WO 2005/066172, WO 2005/076783, WO 2005/079195, WO 2005/094531, WO 2005/123079, WO 2005/123080, WO 2006/009826, WO 2006/009832, WO 2006/026760, WO 2006/028451, WO 2006/028545, WO 2006/028962, WO 2006/029115, WO 2006/038923, WO 2006/065280, WO 2006/074003, WO 2006/083440, WO 2006/086449, WO 2006/091394, WO 2006/086633, WO 2006/086634, WO 2006/091567, WO 2006/091568, WO 2006/091647, WO 2006/093514 e WO 2006/098852.

[00403] Exemplos adicionais de agonistas de TLR de pequena molécula incluem determinados derivados de purina (tais como aqueles descritos nas Patente US Nos 6.376.501 e 6.028.076), determinados derivados de amida de imidazoquinolina (tais como aqueles descritos na Patente US N° 6.069.149), determinados derivados de imidazopiridina (tais como aqueles descritos na Patente US N°

6.518.265), determinados derivados de benzimidazol (tais como aqueles descritos na Patente US N° 6.387.938), determinados derivados de uma 4-aminopirimidina fundida a um anel heterocíclico que contém nitrogênio de cinco elementos (tais como aqueles derivados de adenina descritos nas Patente US Nos 6.376.501; 6.028.076 e

6.329.381; e no documento WO 02/08905) e determinados derivados de 3-beta.-D-ribofuranosiltiazolo[4,5-d]pirimidina (tais como aqueles descritos na Publicação US N° 2003/0199461) e determinados compostos imunointensificadores de pequenas moléculas, tais como aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Patente US N° 2005/0136065.

[00404] Agonistas de TLR de molécula grande exemplificativos incluem sequências de oligonucleotídeos. Algumas sequências de oligonucleotídeos agonistas de TLR contêm dinucleotídeos de citosina- guanina (CpG) e são descritas, por exemplo, nas Patente US Nos

6.194.388; 6.207.646; 6.239.116; 6.339.068; e 6.406.705. Alguns oligonucleotídeos que contêm CpG podem incluir motivos estruturais imunomoduladores sintéticos, tais como aqueles descritos, por exemplo, nas Patente US Nos 6.426.334 e 6.476.000. Outras sequências de nucleotídeos agonistas de TLR não têm sequências CpG e são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional N° WO 00/75304. Ainda outras sequências de nucleotídeos agonistas de TLR incluem RNA fita simples rico em guanosina e uridina (ssRNA), tais como aqueles descritos, por exemplo, em Heil et al., Science, vol. 303, pp. 1526-1529, 5 de março de 2004. Outros agonistas de TLR incluem moléculas biológicas, tais como fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGPs) e são descritos, por exemplo, nas Patente US Nos 6.113.918;

6.303.347; 6.525.028; e 6.649.172.

[00405] Os agonistas de TLR também incluem patógenos inativados ou porções dos mesmos que podem ativar vários tipos diferentes de receptor de TLR. Agonistas de TLR derivados de patógenos exemplificativos incluem BCG, extrato de Mycobacterium obuense, Talimogene laherparepvec (T-Vec) (derivado de HSV-1) e Pexa-Vec (derivado de vírus vacina).

[00406] Em algumas modalidades, um agonista de TLR pode ser um anticorpo agonista que se liga especificamente ao TLR.

[00407] A seguir, são fornecidas breves descrições de vários TLRs, bem como de agonistas de TLR.

[00408] A listagem de um agonista de TLR abaixo para TLRs em particular não deve ser interpretada como indicando que um determinado agonista de TLR ativa necessariamente apenas este TLR (por exemplo, determinadas moléculas podem ativar vários tipos de TLR ou mesmo várias classes de PRR). Por exemplo, algumas moléculas fornecidas abaixo como um agonista de TLR4 exemplificativo também podem ser um agonista de TLR5.

[00409] Os termos "TLR1" e "receptor Toll-like 1" se referem a qualquer forma do receptor TLR1, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR1. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR1 humano, TLR1 inclui todas as espécies Mammalia de TLR1 de sequência nativa, por exemplo, ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR1 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° Q15399.

[00410] "Agonista de TLR1", conforme usado aqui, significa qualquer molécula que, ao se ligar a TLR1, (1) estimula ou ativa o TLR1, (2)

aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR1 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR1. Os agonistas de TLR1 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e derivados dos mesmos que se ligam ao TLR1.

[00411] Exemplos de agonistas de TLR1 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e derivados das mesmas, tais como SPM-105 (derivado de micobactérias autoclavadas), OM-174 (derivado de lipídio A), OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OspA (de Borrelia burgdorferi), MALP-2 (lipopeptídeo ativador de macrófago micoplasmático-2kD), STF (fator de tuberculose solúvel), CU-T12 -9, Diprovocim e lipopeptídeos derivados de componentes da parede celular, tais como PAM2CSK4, PAM3CSK4 e PAM3Cys.

[00412] TLR1 pode formar um heterodímero com TLR2 e, consequentemente, muitos agonistas de TLR1 também são agonistas de TLR2.

[00413] Os termos "TLR2" e "receptor Toll-like 2" se referem a qualquer forma do receptor TLR2, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR2. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR2 humano, TLR2 inclui todas as espécies Mammalia de TLR2 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR2 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° 060603.

[00414] "Agonista de TLR2", conforme usado aqui, significa qualquer molécula que, ao se ligar a TLR2, (1) estimula ou ativa TLR2, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR2 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR2. Agonistas de TLR2 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas e derivados das mesmas que se ligam ao TLR2.

[00415] Exemplos de agonistas de TLR2 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipoproteínas bacterianas (por exemplo, lipoproteínas diaciladas) e derivados das mesmas, tais como SPM-105 (derivado de micobactérias autoclavadas), OM-174 (derivado de lipídeo A), OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OmpS1 (porina de Salmonella typhi), OspA (de Borrelia burgdorferi), MALP-2 (lipopeptídeo ativador de macrófago micoplasmático-2kD), STF (fator de tuberculose solúvel), CU-T12-9, Diprovocim, Amplivant e lipopeptídeos derivados de componentes da parede celular, tais como PAM2CSK4, PAM3CSK4 e PAM3Cys.

[00416] O TLR2 pode formar um heterodímero com TLR1 ou TLR6 e, consequentemente, muitos agonistas de TLR2 também são agonistas de TLR1 ou TLR6.

[00417] Os termos "TLR3" e "receptor Toll-like 3" se referem a qualquer forma do receptor TLR3, bem como variantes, isoformas e homólogos de espécies que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR3. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR3 humano, TLR3 inclui todas as espécies Mammalia de TLR3 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um TLR3 humano exemplificativo é fornecido sob a Entrada UniProt N° 015455.

[00418] "Agonista de TLR3", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, após ligação ao TLR3, (1) estimula ou ativa TLR3, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR3 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR3. Os agonistas de TLR3 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácidos nucleicos que se ligam ao TLR3.

[00419] Exemplos de agonistas de TLR3 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem ligantes de TLR3, tais como dsRNA sintético, ácido polinossínico- policitidílico ["poli(l:C)"] (disponível, por exemplo, a partir da InvivoGen em preparações de elevado peso molecular (HMW) e baixo peso molecular (LMW)), ácido poliadenílico-poliuridílico ["poli(A:U)"] (disponível, por exemplo, a partir da InvivoGen), poliICLC (consulte Levy et al., Journal of Infectious Diseases, vol. 132, N° 4, páginas 434-439, 1975), Ampligen (consulte Jasani et al., Vaccine, vol. 27, N° 25-26, páginas 3401-3404, 2009), Hiltonol, Rintatolimode e RGC100 (consulte Naumann et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, ID de Artigo 283649).

[00420] Os termos "TLR4" e "receptor Toll-like 4" se referem a qualquer forma do receptor TLR4, bem como variantes, isoformas e homólogos de espécies que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR4. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR4 humano, TLR4 inclui todas as espécies Mammalia de TLR4 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um TLR4 humano exemplificativo é fornecido sob a Entrada UniProt N° 000206.

[00421] "Agonista de TLR4", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar ao TLR4, (1) estimula ou ativa TLR4, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR4 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR4. Os agonistas de TLR4 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e derivados dos mesmos que se ligam ao TLR4.

[00422] Exemplos de agonistas de TLR4 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e derivados dos mesmos, tais como B:0111 (Sigma), monofosforil lipídio A (MPLA), 3DMPL (MPL 3-O-deacilado), GLA-AQ, G100, AS15, AS02, GSK1572932A (GlaxoSmithKline, Reino Unido).

[00423] Os termos "TLR5" e "receptor Toll-like 5" se referem a qualquer forma do receptor TLR5, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR5. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR5 humano, TLR5 inclui todas as espécies Mammalia de TLR5 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR5 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° 060602.

[00424] "Agonista de TLR5", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar ao TLR5, (1) estimula ou ativa TLR5, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR5 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR5. Agonistas de TLR5 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, flagelinas bacterianas e derivados das mesmas que se ligam ao TLR5.

[00425] Exemplos de agonistas de TLR5 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, flagelina bacteriana purificada de B. subtilis, flagelina purificada de P. aeruginosa, flagelina purificada de S. typhimurium e flagelina recombinante (todos disponíveis a partir da InvivoGen), entolimode (CBLB502; um derivado de flagelina otimizado farmacologicamente).

[00426] Os termos "TLR6" e "receptor Toll-like 6" se referem a qualquer forma do receptor TLR6, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR6. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR6 humano, TLR6 inclui todas as espécies Mammalia de TLR6 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR6 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° Q9Y2C9.

[00427] "Agonista de TLR6", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar a TLR6, (1) estimula ou ativa TLR6, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR6 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR6. Os agonistas de TLR6 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, lipopeptídeos bacterianos e derivados dos mesmos que se ligam ao TLR6.

[00428] Exemplos de agonistas de TLR6 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, muitos dos agonistas de TLR2 fornecidos acima, uma vez que TLR2 e TLR6 podem formar um heterodímero. TLR6 também pode formar um heterodímero com TLR4 e os agonistas de TLR6 podem incluir vários agonistas de TLR4 fornecidos acima.

[00429] Os termos "TLR7" e "receptor Toll-like 7" se referem a qualquer forma do receptor TLR7, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR7. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR7 humano, TLR7 inclui todas as espécies Mammalia de TLR7 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR7 humano é fornecido sob a Entrada UniProt

N° Q9NYK1.

[00430] "Agonista de TLR7", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar ao TLR7, (1) estimula ou ativa TLR7, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR7 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR7. Os agonistas de TLR7 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácido nucleico que se ligam ao TLR7.

[00431] Exemplos de agonistas de TLR7 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem RNA recombinante de fita simples ("ss"), compostos de imidazoquinolina, tais como imiquimode (R837), gardiquimode e resiquimode (R848); Loxoribina (7-alil-7,8-di-hidro-8-oxo-guanosina) e compostos relacionados; 7-tia-8-oxoguanosina, 7-deazaguanosina e análogos de guanosina relacionados; ANA975 (Anadys Pharmaceuticals) e compostos relacionados; SM-360320 (Sumimoto); 3M-01, 3M-03, 3M-852 e 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; uma molécula de 8-oxoadenina), AZD8848 (AstraZeneca; uma molécula de 8-oxoadenina), MEDI9197 (Medimmune; anteriormente 3M-052), ssRNA40 e análogos de adenosina, tal como UC-1V150 (Jin et al., Bioorganic Chem Lett (2006) 16: 4559-4563, composto 4). Muitos agonistas de TLR7 também são agonistas de TLR8.

[00432] Os termos "TLR8" e "receptor Toll-like 8" se referem a qualquer forma do receptor TLR8, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR8. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR8 humano, TLR8 inclui todas as espécies Mammalia de TLR8 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR8 humano é fornecido sob a Entrada UniProt

N° Q9NR97.

[00433] "Agonista de TLR8", conforme usado aqui, significa qualquer molécula que, ao se ligar a TLR8, (1) estimula ou ativa TLR8, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR8 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR8. Os agonistas de TLR8 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácidos nucleicos que se ligam ao TLR8.

[00434] Exemplos de agonistas de TLR8 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem ssRNA de fita simples recombinante, imiquimode (R837), gardiquimode, resiquimode (R848), 3M-01, 3M-03, 3M-852 e 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; uma molécula de 8- oxoadenina), AZD8848 (AstraZeneca; uma molécula de 8-oxoadenina), MEDI9197 (Medimmune; anteriormente 3M-052), Poly-G10, Motolimod e vários agonistas TLR7 fornecidos acima (conforme mencionado anteriormente, muitos agonistas de TLR7 também são agonistas de TLR8).

[00435] Os termos "TLR9" e "receptor Toll-like 9" se referem a qualquer forma do receptor TLR9, bem como variantes, isoformas e espécies homólogas que retêm pelo menos uma parte da atividade de TLR9. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica ao TLR9 humano, TLR9 inclui todas as espécies Mammalia de TLR9 de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato. Um exemplo de TLR9 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° Q9NR96.

[00436] "Agonista de TLR9", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar a TLR9, (1) estimula ou ativa TLR9, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de TLR9 ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de TLR9. Os agonistas de TLR9 úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácidos nucleicos que se ligam ao TLR9.

[00437] Exemplos de agonistas de TLR9 que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem DNA que contém CpG não metilado, oligodesoxinucleotídeos imunoestimuladores (ODN), tal como ODN que contém CpG, tal como CpG24555, CpG10103, CpG7909 (PF-3512676/agatolimode), CpG1018, AZD1419, ODN2216, MGN1703, SD-001, CpG10103, SD-

0018. Os agonistas de TLR9 também incluem sequências de nucleotídeos que contêm um dinucleotídeo citosina-fosfato-2'-desoxi-7- deazaguanosina sintético (CpR) (Hybridon, Inc.), dSLIM-30L1 e complexos de imunoglobulina-DNA. Agonistas de TLR9 exemplificativos são descritos nos documentos WO2003/015711, WO2004/016805, WO2009/022215, PCT/US95/01570, PCT/US97/19791 e Patente US Nos 8.552.165, 6.194.388 e 6.239.116 as quais são, cada uma, incorporada aqui a título de referência para todas as finalidades.

[00438] RLRs incluem vários PRRs citosólicos que detectam, por exemplo, dsRNAs. Exemplos de RLRs incluem, por exemplo, gene indutível por ácido retinoico 1 (RIG-1), gene 5 associado à diferenciação de melanoma (MDA-5) e Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2).

[00439] "Agonista de RLR", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar a um RLR, (1) estimula ou ativa o RLR, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença do RLR ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de RLR. Os agonistas de RLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ácidos nucleicos e derivados dos mesmos que se ligam a RLRs e anticorpos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especificamente a RLRs.

[00440] Exemplos de agonistas de RLRs que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, RNA fita dupla curta com 5' trifosfato não tamponado (agonista de RIG-I); poli I:C (agonista de MDA-5) e BO-112 (agonista de MDA-A).

[00441] Os NLRs incluem vários PRRs que detectam, por exemplo, moléculas de padrão molecular associado a dano (DAMP). Os NLRs incluem as subfamílias NLRA-A, NLRB-B, NLRC-C e NLRP-P. Exemplos de NLRs incluem, por exemplo, NOD1, NOD2, NAIP, NLRC4 e NLRP3.

[00442] "Agonista de NLR", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar a um NLR, (1) estimula ou ativa a NLR, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de NLR ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de NLR. Agonistas de NLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, DAMPs e derivados dos mesmos que se ligam a NLRs e anticorpos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especificamente a NLRs.

[00443] Exemplos de agonistas de NLR que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, tripeptídeo/mifamurtida muramil lipossômica (agonista de NOD2).

[00444] CLRs incluem vários PRRs que detectam, por exemplo, carboidratos e glicoproteínas. CLRs incluem CLRs transmembrana e CLRs secretados. Exemplos de CLRs incluem, por exemplo, DEC- 205/CD205, receptor de manose de macrófago (MMR), Dectina-1, Dectina-2, Mincle, DC-SIGN, DNGR-1 e lectina de ligação à manose

(MBL).

[00445] "Agonista de CLR", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar a um CLR, (1) estimula ou ativa o CLR, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de CLR ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de CLR. Os agonistas de CLR úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, carboidratos e derivados dos mesmos que se ligam a CLRs e anticorpos monoclonais agonísticos (mAb) que se ligam especificamente a CLRs.

[00446] Exemplos de agonistas de CLR que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, porção MD (um extrato de beta-glucano solúvel purificado de Grifola frondosa) e prime PGG (um beta 1,3/1, 6-glucano PAMP derivado de levedura).

[00447] A proteína STING funciona como um sensor de DNA citosólico e uma proteína adaptadora na sinalização de interferon Tipo

1. Os termos "STING" e "estimulador de genes de interferon" se referem a qualquer forma da proteína STING, bem como variantes, isoformas e homólogos de espécies que retêm pelo menos uma parte da atividade de STING. A menos que indicado de forma diferente, tal como referência específica à STING humana, STING inclui todas as espécies Mammalia de STING de sequência nativa, por exemplo, de ser humano, macaco e rato.

[00448] Um exemplo de TLR9 humano é fornecido sob a Entrada UniProt N° Q86WV6. STING também é conhecida como TMEM173. "Agonista de STING", conforme usado aqui, significa qualquer molécula a qual, ao se ligar ao TLR9, (1) estimula ou ativa STING, (2) aumenta, intensifica, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou presença de STING ou (3) aumenta, intensifica, promove ou induz à expressão de STING. Os agonistas de STING úteis em qualquer um dos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem, por exemplo, ligantes de ácidos nucleicos que se ligam a STING.

[00449] Exemplos de agonistas de STING que são úteis nos métodos de tratamento, medicamentos e usos da presente invenção incluem vários ácidos nucleicos imunoestimuladores, tais como DNA fita dupla sintético, di-GMP cíclico, GMP-AMP cíclico (cGAMP), dinucleotídeos cíclicos sintéticos (CDN), tais como MK-1454 e ADU-S100 (MIW815) e pequenas moléculas, tal como PO-424.

[00450] Outros PRRs incluem, por exemplo, ativador dependente de DNA de fatores reguladores de IFN (DAI) e ausente no melanoma 2 (AIM2).

[00451] As citocinas imunoestimuladoras incluem várias proteínas de sinalização que estimulam a resposta imune, tais como interferons, interleucinas e fatores de crescimento hematopoiéticos.

[00452] Citocinas imunoestimuladoras exemplificativas incluem GM- CSF, G-CSF, IFN-alfa, IFN-gama; IL-2 (por exemplo, denileucina difitox), IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 e TNF-alfa.

[00453] As citocinas imunoestimuladoras podem ter qualquer formato adequado. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser uma versão recombinante de uma citocina de tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser uma muteína que tem uma ou mais alterações de aminoácidos comparado com a citocina de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser incorporada em uma proteína quimérica que contém a citocina e pelo menos uma outra proteína funcional (por exemplo, um anticorpo). Em algumas modalidades, uma citocina imunoestimuladora pode ser ligada de forma covalente a um fármaco/agente (por exemplo, qualquer fármaco/agente conforme descrito em outra parte aqui como um possível componente de ADC).

[00454] As vacinas contra o câncer incluem várias composições que contêm antígenos associados ao tumor (ou que podem ser usadas para gerar o antígeno associado ao tumor no indivíduo) e, portanto, podem ser usadas para provocar uma resposta imune em um indivíduo que será direcionada às células tumorais que contêm o antígeno associado ao tumor.

[00455] Materiais exemplificativos que podem ser incluídos em uma vacina contra o câncer incluem células cancerosas atenuadas, antígenos tumorais, células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas pulsadas com antígenos derivados de tumor ou ácidos nucleicos que codificam antígenos associados a tumores. Em algumas modalidades, uma vacina contra o câncer pode ser preparada com células cancerosas do próprio paciente. Em algumas modalidades, uma vacina contra o câncer pode ser preparada com material biológico que não é das próprias células cancerosas do paciente.

[00456] As vacinas contra o câncer incluem, por exemplo, Sipuleucel-T e Talimogene Laherparepvec (T-VEC).

[00457] A terapia com células imunes envolve o tratamento de um paciente com células imunes que são capazes de direcionar as células cancerosas. A terapia de células imunes inclui, por exemplo, linfócitos infiltrantes de tumor (TLs) e células T receptoras de antígenos quiméricos (células CAR-T).

[00458] Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carbocona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;

acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos enodiína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama l e caliqueamicina Phil 1; consulte, por exemplo, Agnew, Chem.

Intl.

Ed.

Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bifosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como o cromoforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos relacionados a enodiína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5- oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxorrubicina), doxorrubicina lipossômica peguilada, tal como epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5- FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-

mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; gacitosina); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel e doxetaxel; clorambucil; gencitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

Também estão incluídos os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores, tais como anti-estrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) incluindo, por exemplo, tamoxifeno,

raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais tais como, por exemplo, 4(5)- imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestano, fadrozol, vorozol, letrozol e anastrozol; e anti-androgênios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; inibidoresde KRAS; inibidores de MCT4; inibidores de MAT2a; inibidores de tirosina quinase, tais como sunitinibe, axitinibe; inibidores de alk/c-Met/ROS, tais como crizotinibe, lorlatinibe; inibidores de mTOR, tais como temsirolímus, gedatolisibe; inibidores de src/abl, tal como bosutinibe; inibidores da quinase dependente de ciclina (CDK), tais como palbociclibe, PF-06873600; inibidores de erb, tal como dacomitinibe; inibidores de PARP, tal como talazoparibe; inibidores de SMO, tais como glasdegibe, PF-5274857; inibidores de EGFR T790M, tal como PF-06747775; inibidores de EZH2, tal como PF-06821497; Inibidores de PRMT5, como PF-06939999; inibidores de TQRRbM, tal como PF-06952229; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Em modalidades específicas, este agente terapêutico adicional é bevacizumabe, cetuximabe, sirolímus, panitumumabe, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabina, tivozanibe, irinotecano, oxaliplatina, cisplatina, trifluridina, tipiracil, leucovorina, gencitibocloreto ou hidroclorina, gencitiboclorina ou hidroclorina.

[00459] Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos direcionados a um modulador de ponto de verificação imune ou agente coestimulador tal como, por exemplo, sem limitação, um agente direcionado a CTLA- 4, LAG-3, B7- H3, B7- H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7- H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48,

CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM- 3, TIM4, VISTA (PD-H1), 0X40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4- 1 BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 ( CD2F), CD28, CEACAM1 (CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAMO1-4,, CCR2, via de adenosina CD39-CD73- (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CXCR4, CCR4, CCR8, CCR5, CSF-1 ou um modulador de resposta imune inata.

[00460] Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto, por exemplo, com um anticorpo antagonista anti-CTLA-4 tal como, por exemplo, ipilimumabe; um anticorpo antagonista anti-LAG-3, tal como BMS-986016 e IMP701; um anticorpo antagonista anti-TIM-3; um anticorpo antagonista anti-B7-H3 tal como, por exemplo, MGA271; um anticorpo antagonista anti-VISTA; um anticorpo antagonista anti- TIGIT; um anticorpo anti-CD80; um anticorpo anti-CD86; um anticorpo antagonista anti-B7-H4; um anticorpo agonista anti-ICOS; um anticorpo agonista anti-CD28; um modulador de resposta imune inata (por exemplo, TLRs, KIR, NKG2A) e um inibidor de IDO.

[00461] Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com um agonista de 0X40 tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti-OX-40. Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com um agonista de GITR tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti-GITR tal como, por exemplo, sem limitação, TRX518. Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com um inibidor de IDO. Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com uma terapia de citocinas tal como, por exemplo, sem limitação, IL-15, CSF-1, MCSF-1, etc.

[00462] Em algumas modalidades, um anticorpo é usado em conjunto com um ou mais outros anticorpos terapêuticos tais como, por exemplo, sem limitação, um anticorpo direcionado à CD19, CD22, CD40, CD52 ou CCR4.

[00463] Em determinadas modalidades, uma composição de anticorpo compreende pelo menos um agente adicional, tal como bevacizumabe, cetuximbe, sirolímus, panitumumabe, 5-fluorouracil (5- FU), capecitabina, tivozanibe, irinotecano, oxaliplatina, cisplatina, trifluridina, tipiracil, leucorinidina,, gencitabina e cloridrato de erlotinibe.

[00464] Em algumas modalidades, a terapia com anticorpos pode ser coadministrada ou administrada sequencialmente antes ou após o tratamento com outro agente em intervalos que variam de minutos a semanas. Nas modalidades nas quais os outros agentes e/ou proteínas ou polinucleotídeos são administrados separadamente, geralmente se assegura que um período de tempo significativo não expire entre cada administração, de modo que o agente e a composição da presente invenção ainda sejam capazes de exercer um efeito combinado vantajosamente sobre o indivíduo. Em tais casos, considera-se que se pode administrar ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24 h uma da outra e, mais preferivelmente dentro de cerca de 6-12 h uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para a administração significativamente, no entanto, há um lapso de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respectivas administrações.

[00465] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção é combinado com um regime de tratamento que compreende ainda uma terapia tradicional selecionada a partir do grupo que consiste em: cirurgia, radioterapia, quimioterapia, terapia direcionada, imunoterapia, terapia hormonal, inibição de angiogênese e cuidados paliativos.

[00466] A composição usada na presente invenção pode compreender ainda carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed., 2005, Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K.E. Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool benzílico ou butílico; alquilparabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextranas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são descritos adicionalmente aqui.

[00467] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de um anticorpo conforme descrito aqui que compreende cultura de uma célula hospedeira sob condições que resultem na produção de um anticorpo conforme descrito aqui e purificação do anticorpo ou anticorpo biespecífico da cultura.

[00468] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo, uma composição farmacêutica, um polinucleotídeo, um vetor ou uma célula hospedeira, conforme descrito aqui, na fabricação de um medicamento para detectar, diagnosticar e/ou tratar um transtorno associado a antígeno tumoral. Uso Diagnóstico

[00469] Em um aspecto, os anticorpos anti-CD3 da presente invenção podem ser usados para detectar e/ou medir CD3 ou células que expressam CD3 em uma amostra, por exemplo, para fins diagnósticos. Por exemplo, o anticorpo anti-CD3 pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de CD3. Ensaios de diagnóstico exemplificativos para CD3 podem compreender, por exemplo, contatar uma amostra, obtida de um indivíduo, com o anticorpo anti-CD3 da invenção, em que o anticorpo anti-CD3 é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-CD3 não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário que é, em si, marcado de forma detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal 14 3 125 32 35 como C, H, I, P ou S; uma unidade fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta- galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir CD3 em uma amostra incluem, porém sem limitações, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e assim por diante. As amostras que podem ser usadas em ensaios diagnósticos de CD3 de acordo com a presente invenção incluem qualquer tecido ou amostra de fluido obtida de um paciente que contenha quantidades detectáveis de proteína CD3 ou fragmentos da mesma em condições normais ou patológicas. Em geral, os níveis de CD3 em uma amostra específica obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afetado com uma doença ou condição associada a níveis ou atividade anormal de CD3) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de linha de base ou padrão de CD3. Este nível de linha de base de CD3 pode, então, ser comparado com os níveis de CD3 medidos em amostras obtidas de indivíduos com suspeita de ter uma doença ou condição relacionada à CD3.

[00470] Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar, diagnosticar e/ou monitorar uma condição associada à expressão de um antígeno tumoral. Por exemplo, os anticorpos multiespecíficos conforme descrito aqui podem ser marcados com uma porção detectável, tal como um agente de imagiologia e um marcador de substrato enzimático. Os anticorpos conforme descrito aqui também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo, tal como imagiologia in vivo (por exemplo, PET ou SPECT) ou um reagente de coloração. Kits

[00471] Um outro aspecto da invenção é um kit que compreende um anticorpo conforme descrito acima e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção descritos aqui. Em geral, tais instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo para os tratamentos terapêuticos descritos acima. Este kit compreende qualquer composição farmacêutica descrita aqui. As composições farmacêuticas e outros reagentes podem estar presentes nos kits em qualquer forma conveniente tal como, por exemplo, em uma solução ou em uma forma de pó.

[00472] Em outro aspecto, um kit compreende ainda um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de câncer, em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, o outro agente profilático ou terapêutico é um quimioterapêutico. Em outros aspectos, o agente profilático ou terapêutico é um produto terapêutico biológico ou hormonal.

[00473] Vários aspectos das composições farmacêuticas, agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são, de preferência, testados in vitro, em um sistema de cultura de células e em um organismo modelo animal, tal como um sistema modelo animal roedor, quanto à atividade terapêutica desejada antes do uso em seres humanos.

[00474] A toxicidade e eficácia dos protocolos profiláticos e/ou terapêuticos da presente invenção podem ser determinados por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50 % da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A proporção da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a proporção LD50/ED50. Os agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos.

[00475] Além disso, quaisquer ensaios conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica das terapias ou terapias combinadas descritas aqui para o tratamento ou prevenção do câncer.

[00476] As instruções relacionadas ao uso do anticorpo biespecífico, conforme descrito aqui, geralmente incluem informações quanto à dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidades. As instruções fornecidas nos kits da invenção normalmente são instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), porém, instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em um magnético ou disco de armazenamento) também são aceitáveis.

[00477] Os kits da presente invenção estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, porém sem limitações, frascos, ampolas, tubos, garrafas, vidros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico) e assim por diante para cada composição farmacêutica e outros reagentes incluídos, por exemplo, tampões, soluções salinas equilibradas, etc., para uso na administração de composições farmacêuticas a indivíduos. Também são consideradas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma abertura de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo. O recipiente pode ainda compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.

[00478] Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) em ou associada ao recipiente. Depósitos Biológicos

[00479] Os materiais representativos da presente invenção foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 IQ- 2209, EUA, em 13 de fevereiro de 2018. Vetor GUCY2C-1608 Cadeia A (VH-Hole SEQ ID NO: 94) que tem N° de Acesso ATCC PTA-124943 compreende uma inserção de DNA que codifica a cadeia VH-Hole do anticorpo biespecífico GUCY2C-1608 que compreende um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 70) que codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo anti-CD3 (SEQ ID NO: 3); e o vetor GUCY2C-1608 Cadeia B (VL-Knob SEQ ID NO: 93) que tem o N° de Acesso ATCC PTA-124944 compreende uma inserção de DNA que codifica a cadeia VL-Knob do anticorpo biespecífico GUCY2C-1608 que compreende um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 71) que codifica uma região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD3 (SEQ ID NO: 4).

[00480] Os depósitos foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Fins de Procedimentos e Regulamentos de Patentes (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Pfizer Inc. e a ATCC, o qual assegura a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante a emissão da Patente US pertinente ou aberta ao público de qualquer pedido de Patente US ou estrangeira, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie para a pessoa designada pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks com direito a isto de acordo com 35 U.S.C., Seção 122, e as regras do Comissário em conformidade com a mesma (incluindo 37 C.F.R. Seção 1.14 com referência particular a 886 OG 638).

[00481] O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais sob depósito morrer ou ser perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos, mediante notificação, por outro igual. A disponibilidade do material depositado não deve ser interpretada como uma licença para praticar a invenção em violação aos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patentes.

[00482] Os exemplos a seguir de aspectos específicos para a realização da presente invenção são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma. Exemplo 1 Geração de CD3ed Solúvel

[00483] A proteína com o nome CD3ed que representa domínios extracelulares de CD3 épsilon e subunidades delta fundidos em tandem por meio de um ligante curto (SEQ ID NO: 39) foi gerada usando técnicas padrão de biologia molecular, expressão de proteínas e purificação. O gene portador de plasmídeo que codifica o aminoácido mostrado na Tabela 9 (SEQ ID NO: 40) foi transitoriamente transfectado em células HEK293 em um volume de cultura de 20 L usando PEI como agente de transfecção. Após incubação durante 7 dias a 37°C, 20 L do material coletado foram ligados em lote a 50 ml de resina His60 (equilibrada com PBS) durante a noite. Em seguida, a resina ligada foi lavada com PBS, seguido por tampões de PBS que contêm imidazol a 10 mM (10-15 CV). Após a lavagem, a proteína foi eluída com tampão de fosfato que contém imidazol a 200 mM. As frações do eluato foram, então, analisadas por gel de SDS. As frações que contêm proteína pura foram reunidas e concentradas usando Ultra-Centricons Amicon de 3kDa. Glicerol a 5% foi mantido na amostra no momento da concentração para manter a proteína estável. O reservatório de His60 é ainda carregado na coluna Superdex200 de exclusão de tamanho. As frações que contêm heterodímero de CD3 épsilon/delta foram analisadas por SDS-PAGE e as frações relevantes foram reunidas e filtradas em um filtro de 0,22 μm. A Tabela 9 mostra a sequência das subunidades de CD3 épsilon/delta fundidas em tandem e usadas como antígeno para todo o trabalho de otimização. Tabela 9

SEQ ID Proteína Sequência NO:

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGG ITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDK

NIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYY Proteína de fusão CD3 40 VCYPRGSKPEDANFYLYLRARGGGGSGGGG épsilon/delta

SGGGGSPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGT LLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKES

TVQVHYRMCQSCVELDHHHHHH Exemplo 2 Otimização da Estrutura do Anticorpo anti-CD3 H2B4

[00484] O anticorpo protótipo CD3e (CD3 épsilon) H2B4 exibiu estabilidade térmica inferior quando usado no formato diacorpo-Fc biespecífico. Para melhorar a estabilidade, a estrutura da cadeia leve foi alterada de VK4 para VK1 (DPK9), embora deixando a estrutura da cadeia pesada como VH3 (DP54). A CDR1 de VL (SEQ ID NO: 26), CDR2 de VL (SEQ ID NO: 27) e CDR3 de VL (SEQ ID NO: 28) foram enxertadas na região estrutural DPK9 e expressas em combinação com as CDRs portadoras de cadeia pesada, CDR1 de VH (SEQ ID NO: 13), CDR2 de VH (SEQ ID NO: 16) e CDR3 de VH (SEQ ID NO: 18). Além de enxertar CDRs in-frame, determinadas mutações reversas também foram testadas. As mutações reversas introduzidas em estruturas de cadeia pesada e leve são mostradas na Tabela 10 com o número de resíduo no qual a mutação reversa foi realizada indicada.

[00485] Os cDNAs que contêm a região estrutural aceitadora humana, VH3 para cadeia pesada e VK1 para cadeia leve, com sequências de doadores de CDR relevantes foram sintetizados. Os produtos de cDNA sintetizados foram subclonados e fundidos in-frame com a região constante de IgG1 humana para a cadeia pesada e capa humana para a cadeia leve em vetores de expressão de mamíferos. Para diferenciar do anticorpo H2B4, estas variantes são denominadas de 2B5 e todas as moléculas otimizadas serão denominadas como 2B5 e suas variantes daqui em diante. Todos os mutantes 2B5 foram analisados quanto à ligação competitiva a células Jurkat com expressão endógena de CD3e.

[00486] Um FACS competitivo foi realizado para examinar se 2B5 humanizado manteve seu epítopo de ligação na superfície celular. Antes do experimento de competição FACS, cH2B4 quimérico foi biotinilado. A EC50 da ligação de cH2B4 biotinilado a células Jurkat foi determinada por meio de ligação direta usando FACS e determinada como sendo de 0,8 nM. Para FACS competitivo, variantes de anticorpos diluídas em série 3 vezes foram misturadas com uma quantidade constante de biotina-cH2B4 que representa a concentração de EC50 e 1,0E05 células/cavidade de células Jurkat. As misturas foram incubadas durante 1 hora em gelo, seguido por lavagem 3x com tampão para FACS. O anticorpo secundário, estreptavidina conjugada com PE (Ficoeritrina) (PE-SA) foi adicionado às células e incubado durante 30 minutos em gelo. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi, então, analisada por FACS em um FACS CANTO™ (BD Biosciences). Cálculo do eixo Y: % de ligação a Max = [MFI (cavidades com Ab diluídos em série) - MFI (2ª PE-SA)]/[MFI Max (células Jurkat com biotina-cH2B4 apenas) - MFI (2ª PE-SA)]. A Tabela 10 mostra o resultado dos valores de IC50 da ligação competitiva quando as mutações foram introduzidas no anticorpo anti-CD3 H2B4 para otimizar as estruturas. Com base nestes resultados, H2B4 1.0/1.0T mostrou características de ligação similares a H2B4 e é designado como domínio de ligação de anticorpo anti-CD3 2B5. Tabela 10 IC50 de ligação Anticorpo Cadeia pesada Cadeia leve competitiva h2B4 1.0/1.0T Enxertia de CDR Enxertia de CDR, R24T 1,27 (2B5) h2B4 1.0/1.1 vH1.0 Q13V, R24T, Y49S, L78V 1,68 h2B4 1.0/1.2 vH1.0 Q13V, R24T, Y49S Não testado h2B4 1.0/1.3 vH1.0 R24T, Y49S 1,309 c2B4 (2B4 vH de camundongo vK de camundongo 0,752 quimérico) Exemplo 3 Geração e Caracterização de Uma Molécula de Diacorpo-Fc Biespecífica Usando Sequências H2B4 e 2B5

[00487] Moléculas de diacorpo-Fc biespecíficas foram geradas usando anticorpos anti-CD3 2B5 ou H2B4 (Tabela 2 e 3) e sequências de anticorpos GUCY2c em uma das configurações mostradas na Figura 1 (esquemática) usando métodos de expressão e purificação padrão conhecidos na técnica. Os anticorpos biespecíficos resultantes (Tabela 7; SEQ ID NOs: 36-38) foram testados quanto à estabilidade usando calorimetria de varredura diferencial. Exemplo 4 Avaliação da Estabilidade de Anticorpo Biespecífico Usando Calorimetria de Varredura Diferencial

[00488] As proteínas foram diluídas em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 0,6 mg/ml em um volume de 400 μl. PBS foi usado como um tampão em branco na célula de referência. PBS continha NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 8,1 mM e KH2PO4 a 1,47 mM, pH de 7,2. As amostras foram dispensadas na bandeja de amostra de um MicroCal VP-Capillary DSC com Autosampler (Malvern Instruments Ltda., Malvern, Reino Unido). As amostras foram equilibradas durante 5 minutos a 10 °C e depois sofreram varredura até 110 °C em uma taxa de 100 °C por hora. Um período de filtragem de 16 segundos foi selecionado. Os dados brutos foram corrigidos na linha de base e a concentração de proteína foi normalizada. O Software Origin

7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) foi usado para ajustar os dados a um modelo MN2-State com um número apropriado de transições. Conforme ilustrado na Figura 2, GUCY2c-2B5 biespecífico mostrou 5 °C mais na primeira transição de fusão comparado com GUCY2c-H2B4 biespecífico. Isto indica que 2B5 que contém anticorpos biespecíficos exibe melhor estabilidade.

[00489] Os dois anticorpos biespecíficos foram verificados quanto à ligação a células T usando FACS empregando procedimentos padrão conhecidos na técnica e, conforme mostrado na Figura 3, ambos os anticorpos biespecíficos mostraram ligação similar a células T, indicando que a ligação é preservada após conversão de H2B4 em 2B5.

[00490] Ambos os anticorpos biespecíficos H2B4 e 2B5 também foram testados no ensaio de citotoxicidade para avaliar a atividade de redirecionamento de células T. Conforme mostrado na Figura 4, ambos os anticorpos biespecíficos mostraram citotoxicidade similar, indicando que 2B5 reteve a mesma atividade de H2B4. Exemplo 5 Mutagênese Racional com Base na Estrutura de 2B5

[00491] O domínio de ligação do anticorpo anti-CD3 H2B4 mostrou polirreatividade, conforme avaliado pela ligação ao DNA e insulina, apresentou propensão de autoassociação conforme indicado por altas pontuações AC-SINS e tem propensão de corte na posição R53 em CDR-H2 quando expresso em células hospedeiras CHO. Para reduzir a polirreatividade, a propensão de autoassociação e o corte em CDRH2, mutações nas CDRs de 2B5 foram concebidas para reduzir estas responsabilidades, mantendo a estabilidade e afinidade de ligação. Para este esforço, todas as previsões foram feitas usando a estrutura cristalina por raios X do anticorpo anti-CD3 H2B4 obtida em complexo com o peptídeo que representa o epítopo de ligação e derivado do N- término da subunidade épsilon de CD3. É bem conhecido na área que o excesso de carga positiva e/ou hidrofobicidade pode desempenhar um papel importante na polirreatividade. A calculadora DelPhi Poisson Boltzmann no Discovery Studio 4.01 foi usada para determinar a superfície eletrostática da região Fv de H2B4 a partir da estrutura cristalina. Na Figura 5, patches de carga positiva em excesso que não são divididos por cargas negativas podem ser observados. Isto sugere correlação com alta polirreatividade. Além disso, a ferramenta Spatial Aggregation Propensity (SAP) no Discovery Studio1 foi usada para determinar patches hidrofóbicos em excesso (Figura 6). Conforme mostrado na figura 6, o patches hidrofóbico parece pequeno e não substancial. Com base nesta observação, o foco foi mostrado na redução de cargas positivas ao remover cargas positivas ou adicionar cargas negativas para romper os patches.

[00492] Para determinar as posições adequadas para mutagênese, a previsão computacional de mutações para as alterações na afinidade e alterações na estabilidade foi feita usando o Discovery Studio e o FoldX. Mutações toleradas são aquelas que não têm um Q > 1 kcal/mol para os métodos Discovery Studio e FoldX. A partir destas previsões, um conjunto de resíduos que seriam previstos como tendo o mínimo de impacto sobre a ligação e estabilidade, ao mesmo tempo em que ainda rompem os patches para alteração foi identificado. Além disso, favorecemos mutações hidrofílicas sempre que possível para não aumentar a superfície hidrofóbica. Uma lista de possíveis mutações de CDR introduzidas no anticorpo anti-CD3 2B5 para otimizar as propriedades biofísicas é mostrada na Tabela 11. Isto inclui mutações que se prevê serem toleradas em cada posição e as quais reduzem a polirreatividade e o corte. Tabela 11 Resíduo* em relação a 2B5-0001 Aminoácido WT Aminoácidos sofreram mutação para (Kabat) Cadeia pesada H52 R Q H52B R Q

H53 R Q L E H65 K Q H96 R Q Cadeia leve L27F R T S L29 R Q N L30 K Q

[00493] Além disso, um conjunto de múltiplas mutações (em combinação) também foi concebido para a cadeia pesada e cadeia leve. Estas incluem R52Q/R52bQ/R53Q, R52Q/R52bQ/R53Q/R96Q, R52bQ/R53Q/R96Q e R52Q/R52bQ/R96Q para cadeia pesada e R29Q/K30Q/R54L/V27eE, R29Q_R54L_V27eE, R29Q_K30Q_R54L para a cadeia leve. Exemplo 6 Caracterização de Mutantes

[00494] Todos os mutantes foram gerados como moléculas de IgG usando métodos de expressão e purificação padrão bem conhecidos na técnica e testados quanto à ligação a CD3ed, polirreatividade (ligação a DNA e insulina) e AC-SINS. Ensaios de Ligação Para Avaliar as Variantes

[00495] Um ensaio Octet foi concebido e executado para examinar a taxa de ligação e dissociação a 10 μg/mL de antígeno CD3ed humano solúvel (SEQ ID NO: 40). Pontas de IgG anti-humana foram usadas para capturar os anticorpos anti-CD3 em uma concentração de 10 μg/ml durante 120 s, seguido por uma linha de base em PBS durante 30 s, então, imersos na concentração de 10 μg/ml de antígeno CD3ed humano solúvel durante 120 s e, finalmente, dissociados durante 300 s. Os sensorgramas foram examinados para determinar se o antígeno se ligou ou não ao anticorpo e o software Octet foi usado para calcular a kd (1/s) e o erro da kd. Vinte e seis mutações racionais retiveram a ligação ao antígeno hCD3ed. A cinética de ligação à CD3 solúvel para as vinte e seis variantes do anticorpo anti-CD3 que ainda se ligam ao antígeno foi, então, examinada por SPR, usando análise Biacore. Os anticorpos anti-CD3 foram capturados em Fc anti-humano e concentrações de 0, 3,7, 11,1, 33,3 e 100 nM de antígeno CD3 solúvel foram injetados sobre os anticorpos capturados para determinar a cinética de ligação. Vinte e três anticorpos anti-CD3 se ligaram ao antígeno CD3 solúvel com afinidade similar ao anticorpo precursor enxertado com CDR. ELISA de DNA e Insulina Para Medir a Polirreatividade

[00496] Placas para ELISA com 384 cavidades (Nunc Maxisorp) foram revestidas durante a noite a 4 °C com DNA (10 μg/ml) (Sigma- Aldrich, D1626) e insulina (5 μg/ml) (Sigma-Aldrich, 19278-5 mL) em PBS, pH de 7,5. O ELISA, adaptado a partir dos ensaios descritos em Tiller et al. (17), foi realizado em um robô de manuseio de líquidos PerkinElmer Janus Automated Workstation. As cavidades foram lavadas com água, bloqueadas com 50 µl de tampão ELISA de polirreatividade (PEB; PBS que contém Tween-20 a 0,05 %, EDTA a 1 mM) durante 1 hora em temperatura ambiente e enxaguadas três vezes com água. Os mAbs diluídos em série a 25 μl foram adicionados em quadruplicata às cavidades e incubados durante 1 h em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com água e 25 μl de IgG anti-humana de cabra a 10 ng/mL (específico para o fragmento Face) conjugada com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch, 109- 035-008) foram adicionados a cada cavidade. As placas foram incubadas durante 1 h em temperatura ambiente, lavadas três vezes com 80 mL de água e 25 μl de substrato TMB (Sigma-Aldrich, T-0440) adicionados a cada cavidade. As reações foram interrompidas após aproximadamente 7 minutos ao adicionar 25 μI de ácido orto-fosfórico a 0,18 M a cada cavidade e a absorbância lida a 450 nm. As pontuações de ligação ao DNA e à insulina foram calculadas como a proporção do sinal no ELISA do anticorpo a 10 μg/mL para o sinal de uma cavidade que contém tampão em vez do anticorpo primário. Pontuações menores que 8 foram consideradas ideais e representaram baixa polirreatividade. Ensaio AC-SINS para Medir a Propensão de Auto-Associação

[00497] O ensaio AC-SINS (Espectroscopia de Nanopartículas de Auto-Interação de Captura por Afinidade) foi padronizado em um formato de 384 cavidades em um robô de manipulação de líquidos Perkin-Elmer Janus. Nanopartículas de ouro de 20 nm (Ted Pella, Inc., #15705) foram revestidas com uma mistura de 80 % de anti-Fc humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. #109-005-098) e 20 % de anticorpos policlonais de cabra não específicos (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. #005-000-003) que foram trocados por tampão em acetato de sódio a 20 mM, pH de 4,3, e diluídos para 0,4 mg/ml. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, os locais não ocupados nas nanopartículas de ouro foram bloqueados com polietileno glicol tiolado (2 kD). As nanopartículas revestidas foram, então, concentradas 10 vezes usando um filtro de seringa e 10 μl foram adicionados a 100 μI de mAb a 0,05 mg/ml em PBS, pH de 7,2. As nanopartículas revestidas foram incubadas com o anticorpo de interesse durante 2 horas em uma placa de polipropileno com 96 cavidades e depois transferidas para uma placa de poliestireno com 384 cavidades e lidas em um espectrofotômetro Tecan M1000. A absorbância foi lida a 450-650 em incrementos de 2 nm e uma macro do Microsoft Excel foi usada para identificar a absorbância máxima, suavizar os dados e ajustar os dados usando um polinômio de segunda grandeza. A absorbância máxima suavizada a partir da média em branco (tampão de PBS apenas) foi subtraída da absorbância máxima suavizada da amostra de anticorpo para determinar a pontuação AC- SINS do anticorpo. Pontuações menores do que 8 foram consideradas ideais e representaram baixo grau de auto-associação. Avaliação de Variantes de Anticorpo Anti-CD3 2B5 Protótipo em

Formato Biespecífico de Diacorpo-Fc

[00498] A análise abrangente de dados de ensaios de ligação, AC- SINS e polirreatividade ajudou a restringir as variantes de ligação a cinco que foram reformatadas em moléculas de diacorpo-Fc biespecíficas usando sequências antitumorais e usando estratégias de clonagem padrão bem conhecidas na técnica. Estes anticorpos biespecíficos foram expressos transitoriamente e purificados usando métodos padrão bem conhecidos na técnica. Os anticorpos biespecíficos resultantes foram testados quanto à ligação a células Jurkat, citotoxicidade in vitro usando ensaio de redirecionamento de células T, polirreatividade, estabilidade térmica usando DSC e AC- SINS. De todos os cinco anticorpos biespecíficos, apenas um anticorpo anti-CD3 2B5 biespecífico que traz a variante 2B5v6 mostrou ligação potente e, como um resultado, mostrou citotoxicidade potente. Esta variante também mostrou polirreatividade reduzida, conforme avaliado pela ligação a DNA e insulina e pontuação AC-SINS. As pontuações para anticorpos biespecíficos 2B5v6 foram menores do que 8 comparado com maiores do que 8 para anticorpos biespecíficos H2B4. Com base nestes resultados, 2B5v6 foi escolhido como a variante 2B5 otimizada para liderança para posterior análise. Exemplo 7 Avaliação de Corte em CDR-H2

[00499] O corte em CDR2 de VH (SEQ ID NO: 16) na posição R53 foi observado no anticorpo anti-CD3 (H2B4 e 2B5) quando o anticorpo biespecífico é expresso em células CHO, mas não em células HEK293. Para eliminar este risco e assegurar uma melhor homogeneidade no produto em uma escala de fabricação, foi dada atenção à escolha de mutações na região de corte juntamente com outras mutações para eliminar o risco de outros cortes, conforme descrito nos exemplos anteriores. Para avaliar o corte, os anticorpos biespecíficos diacorpo-Fc foram gerados usando uma sequência de domínio variável de anticorpo de controle negativo e anticorpo anti-CD3 2B5 ou anticorpo anti-CD3 H2B4 ou anticorpo anti-CD3 2B5v6. Todas as moléculas de diacorpo- Fc biespecíficas foram preparadas usando um esquema similar de processos de expressão e purificação bem conhecidos na técnica.

As linhagens de células CHO SSI foram geradas usando procedimentos padrão.

As duas cadeias que codificam para o anticorpo biespecífico foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pRY19-GA-Q que contém um promotor duplo e um sítio de recombinação para integração de sítio único (SSI) (Zhang, L. et al.

Biotechnology Progress. 2015; 31: 1645-1656) no genoma da célula CHO.

O plasmídeo resultante foi transfectado em células CHO-K1 SV 10e9 por meio de eletroporação com o vetor pRY19 que contém o gene de interesse, seguido por pressão de seleção positiva e negativa usando higromicina-B e ganciclovir.

Tais reservatórios de células CHO passaram por uma fase de recuperação de 3 semanas.

Quando as viabilidades observadas foram superiores a 90 %, bancos de células foram gerados para futuros trabalhos.

Os conjuntos de células CHO estabelecido foi, então, submetido a um processo de expressão de plataforma em lote alimentado de 12 dias em meio CD-CHO (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) em escala de 1 L.

Colheitas de cultura do dia 12 foram capturadas em uma coluna de proteína A e eluídas em baixo pH.

O reservatório de proA foi imediatamente neutralizado para um pH de 8,1. As proteínas puras resultantes foram avaliadas usando eletroforese em gel capilar (cGE) usando protocolos padrão bem conhecidos na técnica.

Conforme mostrado na Tabela 12 e Figura 7, o anticorpo biespecífico 2B5 mostrou corte muito reduzido comparado com H2B4 e 2B5v6 não mostrou corte, enquanto que H2B4 mostrou corte ou fragmentação significativamente aumentada.

A Tabela 12 mostra os resultados da eletroforese em gel capilar que mostram a fragmentação de anticorpos biespecíficos CD3-GUCY2c. % POI indica o pico de interesse. Tabela 12 Amostra cGE reduzida % POI % de Fragmentação Controle negativo-H2B4 88,8 11,2 Controle negativo -2B5 98,9 1,1 Controle negativo -2B5v6 99,6 0,4 Exemplo 8 Anticorpos Biespecíficos GUCY2c-2B5v6: Expressão e Purificação de Anticorpos Biespecíficos CD3-GUCY2c Quiméricos Usando Anticorpo anti-CD3 2B5v6

[00500] Pares de construção complementar (12,5 μg de cada cadeia) foram cotransfectados em culturas de fase log de 25 μl que contêm 1 milhão de células/ml de células HEK 293 usando o kit ExpiFectamine™ 293 Transfection (Life Technologies). Vinte e quatro horas após a transfecção, foi adicionado ExpiFectamine Transfection Enhancer e as células foram deixadas crescer 4-5 dias adicionais antes de coleta. As culturas consumidas foram, então, coletadas, centrifugadas para remover os resíduos celulares e, em seguida, passadas por um filtro de 20 μm.

[00501] Os meios condicionados clarificados que contêm anticorpos biespecíficos de células T GUCY2c foram, então, purificados usando cromatografia de afinidade de Proteína A. As amostras foram carregadas em micro colunas de 0,45 μL (Repligen) pré-embaladas com resina de proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare) usando um manipulador de líquidos (Tecan). A proteína ligada foi lavada com PBS, pH de 7,2, depois eluída com ácido cítrico a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH de 3,5 e neutralizada com tris a 2M, pH de 8,0. As amostras foram, então, dessalinizadas em PBS, pH de 7,2, usando colunas de gotejamento Sephadex G25 (GE Healthcare) de acordo com os métodos do fabricante. As proteínas purificadas foram analisadas quanto à pureza usando cromatografia de exclusão por tamanho analítica com uma coluna Mab HTP (TOSOH) em um HPLC Agilent 1200 seguindo os protocolos do fabricante. As concentrações foram determinadas ao medir a OD280 nm usando um microespectrofotômetro (Trinean). Avaliação de Estabilidade de Anticorpo Biespecífico Usando Calorimetria de Varredura Diferencial

[00502] As proteínas foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 0,6 mg/ml em um volume de 400 μl. PBS foi usado como um tampão em branco na célula de referência. PBS continha NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 8,1 mM e KH2PO4 a 1,47 mM, pH de 7,2. As amostras foram dispensadas na bandeja de amostra de um MicroCal VP-Capillary DSC com um amostrador automático (Malvern Instruments Ltda., Malvern, Reino Unido). As amostras foram equilibradas durante 5 minutos a 10°C e depois sofreram varredura até 110°C em uma taxa de 100°C por hora. Um período de filtragem de 16 segundos foi selecionado. Os dados brutos foram corrigidos na linha de base e a concentração de proteína foi normalizada. O Software Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) foi usado para ajustar os dados a um modelo MN2- State com um número apropriado de transições. Conforme mostrado na Figura 8, o anticorpo biespecífico GUCY2c-2B5v6 mostrou excelente estabilidade térmica, com uma Tm1 de 70 °C. Ligação a Células T Virgens

[00503] Os anticorpos biespecíficos CD3 purificados foram titulados quanto à ligação da superfície celular à CD3 humana em células T humanas virgens purificadas a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) frescas usando métodos de citometria de fluxo padrão conhecidos na técnica empregando o analisador BD LSRII Fortessa. Conforme mostrado na Figura 9, o anticorpo GUCY2c-2B5v6 biespecífico se ligou muito bem às células T, com uma EC50 de ligação de 35,44 nM. Avaliação da Atividade de Células T Mediada por Anticorpos Biespecíficos

[00504] PBMCs humanas foram isoladas de sangue de doador saudável usando Histopaque-177 (Sigma). As células T virgens foram isoladas de PBMCs usando um kit de enriquecimento de células T da Stem Cell Technologies (seleção negativa de células T). GUCY2c que expressa células tumorais humanas T84 transfectadas com uma construção de expressão de Luciferase foram tratadas com diluições em série de anticorpos biespecíficos GUCY2c ou um controle negativo biespecífico CD3, juntamente com células T. A proporção de células efetoras para células alvo (E:T) foi de 10:1 ou 5:1. Células T e células tumorais foram incubadas a 37°C durante 48 horas, seguido por medição do sinal de Luciferase usando o reagente Neolite (Perkin Elmer). Os valores de EC50 foram calculados no Graphpad PRISM usando análise de regressão não linear de quatro parâmetros. Células HCT116 ou HT29 negativas para o alvo não mostraram qualquer citotoxicidade mediada por GUCY2c biespecífico. Conforme mostrado na Figura 10, o anticorpo biespecífico GUCY2c-2B5v6 mostrou potente citotoxicidade em um ensaio de redirecionamento de células T.

[00505] As células T84 foram tratadas com células T (proporção E:T de 5:1) e GUCY2c-1608 (GUCY2c- 2B5v6) em doses diferentes. Os sobrenadantes foram coletados em diferentes pontos de tempo (24h, 48h, 96h) e analisados usando um ensaio Lumninex Multiplex de acordo com as diretrizes do fabricante e lidos em um Luminex 200 com o software xPONENT. As citocinas medidas foram IFN-gama humana, IL10, IL2, IL4, IL6, TNF-alfa. A Figura 11 mostra a regulação positiva de citocinas TNF-alfa (11A), IFN-gama (11B), IL10 (11C), IL2 (11D), IL4 (11E) e IL6 (11F) após ativação de células T por GUCY2c-1608.

Avaliação In Vivo da Atividade Mediada por Anticorpo Biespecífico GUCY2c-2B5v6

[00506] Estudos de eficácia in vivo foram realizados usando o modelo de transferência adotiva. As linhagens de células tumorais/fragmentos de xenoenxertos derivados de pacientes foram implantados em camundongos NSG e deixados crescer para aproximadamente 200 mm3. Os camundongos foram dosados com compostos biespecíficos por via intravenosa (a menos que indicado de outra forma). Dois milhões de células T ativadas e expandidas (usando os kits de expansão e ativação de células T da Miltenyi Biotec) foram administradas IV, 24 horas após dosagem biespecífica. Os anticorpos biespecíficos fornecidos foram dosados semanalmente. Conforme mostrado na Figura 12 e Figura 13, o anticorpo biespecífico GUCY2c- 2B5v6 (GUCY2c-1608) mostrou excelentes regressões tumorais duráveis em modelos in vivo PDX CRX-11201 e na linhagem de células LS1034, os quais representam câncer colorretal. Exemplo 9 Anticorpos Biespecíficos FLT3-CD3 e Geração de IgGs Biespecíficas FLT3-2B5v6 Usando o Anticorpo Anti-CD3 Otimizado (2B5v6) e Citotoxicidade

[00507] O anticorpo FLT3 humano (xFLT3) e o anticorpo anti-CD3 humana (2B5v6) foram expressos separadamente como lgG2dA_D265A humano manipulado com EEEE em um braço e RRRR no outro braço para troca biespecífica nas posições 223, 225 e 228 (por exemplo, (C223E ou C223R), (E225E ou E225R) e (P228E ou P228R)) na região de dobradiça e na posição 409 ou 368 (por exemplo, K409R ou L368E (esquema de numeração EU)) na região CH3 de IgG2 humana. Os anticorpos também tinham a mutação de D para A na posição 265 (esquema de numeração EU). Cada braço de anticorpo individual foi purificado separadamente usando resina de Proteína A. 1 mg/mL de anticorpo xFLT3 purificado foi, então, trocado por 1 mg/mL de anticorpo 2B5v6 purificado na presença de glutationa reduzida a 2 mM. A reação de troca foi realizada a 37 °C durante 16 horas. Glutationa oxidada a 2 mM foi, então, adicionada às proteínas e a mistura foi incubada a 37 °C durante 30 min. A mistura foi, então, diluída a 1:5 em tampão de MES a 20 mM, pH de 5,4, sem NaCl. A amostra diluída foi carregada na coluna de troca iônica MonoS e lavada com tampão de MES a 20 mM, pH de 5,4, NaCl a 25 mM. O anticorpo biespecífico xFLT3-2B5v6 foi, em seguida, eluído com um gradiente de NaCl a 0- 500 mM em tampão de MES a 20 mM, pH de 5,4. Finalmente, o anticorpo biespecífico foi dialisado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o ensaio com base em células. Para os ensaios de citotoxicidade, células T humanas não estimuladas e células alvo que expressam Luciferase (E-01-1 ou MV411) foram coincubadas em proporções definidas em placas de fundo em U com 96 cavidades em 200 μI de RPMI + FBS a 10 %. Os anticorpos biespecíficos xFLT3- 2B5v6 foram diluídos em série em PBS e adicionados às cavidades. Após 24 horas, 100 μI da suspensão de células foram misturados com 100 μI de reagente One-GLO em placas de parede branca com 96 cavidades e a luminescência foi medida em um luminômetro Envision. Os valores de citotoxicidade foram determinados usando a seguinte fórmula: % de citotoxicidade = [1- (RLUamostra)/RLUcélula alvo apenas)] x 100 RLU: unidades de luz relativa

[00508] Conforme mostrado na Figura 14A e na Figura 14B, o anticorpo biespecífico xFLT3-2B5v6 que contém o anticorpo anti-CD3 otimizado (2B5v6) parece ser muito potente em um formato de IgG biespecífica alternativo quando testado tanto em células que expressam cópias superiores de FLT3 (EOL- 1) e cópias inferiores (MV4-11).

[00509] A Tabela 13 mostra as sequências das cadeias leve e pesada de FLT3 (EOL-1) e das cadeias leve e pesada dos anticorpos biespecíficos 2B5v6. Tabela 13 Exemplo 10 Eliminação do Risco de Epítopo de Célula T do Anticorpo Biespecífico 2B5v6

[00510] O clone 2B5v6 otimizado foi analisado quanto a epítopos de células T potenciais com a finalidade de diminuir o risco do potencial de imunogenicidade. A ferramenta Epivax para predição in silico de epítopos de células T potenciais foi usada para esta análise. Esta ferramenta prevê o número de peptídeos in-frame de 9 meros que se ligam a qualquer um dos 8 alelos de HLA diferentes. Um acerto é definido como aqueles com pontuação Z nos 5 % principais e um acerto forte no 1 % superior. Acertos em 4 ou mais alelos ou 1 acerto forte são considerados como epítopos de células T previstos. Com base nestes critérios, foram identificados 3 epítopos de células T não germinativos previstos na CDRH2, 2 na CDRL1 e 1 epítopo previsto da linhagem germinativa em L2 (Tabela 15). Além de pontuações de peptídeos individuais, o risco geral para uma sequência pode ser definido pelo número total de acertos ou pela Pontuação T-Regitope Adjusted Epivax, a qual foi otimizada para se correlacionar com a prevalência de ADA clínica. Aqui, para tais valores previstos, quanto menor a pontuação, menor é o risco esperado de ADA. Aqui, o domínio VH tem 70 acertos e uma pontuação de -42,82, o domínio VL tem 60 acertos e uma pontuação de -23,79.

[00511] Para reduzir o risco de imunogenicidade, mutações que reduziriam a pontuação geral deste clone, ao mesmo tempo em que removiam acertos e, de forma ideal, os epítopos de células T previstos foram identificados. Todas as possíveis alterações mutantes únicas em CDR-L1, CDR-L2 e CDR-H2 foram consideradas para identificar aquelas que reduziriam os acertos, diminuiriam a pontuação t-regitope adjusted EpiMatrix global e removeriam os epítopos de células T. Uma vez que estas mutações potenciais também podem afetar a ligação e a estabilidade, foi tomado cuidado para considerar os dados de estabilidade e afinidade previstos descritos acima, bem como identificar as mutações que foram toleradas. As Tabelas 14A, 14B e 14C mostram mutações concebidas para reduzir o risco de imunogenicidade de 2B5v6. Além disso, as mutações conforme mostrado em SEQ ID NOs 44-47, 51-57, 60 e 62 são previstas para reduzir o número de epítopos de células T. Tabela 14A Resíduo de VH CDR2 # em 2B5v6 Resíduo WT Mutação para Chothia Kabat H50 H50 F H H52A H52A N D H52B H52B Q D H52C H52C A D H55 H55 Y E

H56 H56 T P H57 H57 S D H60 H60 N Q Tabela 14B Resíduo de VL CDR1 # em 2B5v6 Resíduo WT Mutação para Chothia Kabat WT Mut L26 L26 S D L27 L27 Q E L28 L27A S D L30B L27E V E L30D L28 S T L30E L29 Q G L30F L30 K Q L31 L31 N E L34 L34 A N Tabela 14C Residuo de VL CDR2 # em 2B5v6 Resíduo WT Mutação para Chothia Kabat WT Mut L51 L51 A T L53 L53 T D L54 L54 R D L54 L54 R Q L56 L56 S D Linhagem Linhagem WASTRES AASSLQS germinativa germinativa (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 43)

[00512] A Tabela 15 mostra as regiões do domínio variável do anticorpo anti-CD3 (2B5v6) com epítopos de células T e que apresentam potencial risco de imunogenicidade.

Tabela 15 VH/VL Peptídeo Acertos Acertos Fortes VH VQPGGSLRL (SEQ ID NO: 44) 2 0 VH LRLSCAASG (SEQ ID NO: 45) 7 4 VH WVRQAPGKG (SEQ ID NO: 46) 4 3 VH VRQAPGKGL (SEQ ID NO: 47) 3 0 VH WVAFIRNQA (SEQ ID NO: 48) 2 1 VH FIRNQARGY (SEQ ID NO: 49) 5 2 VH YTSDHNPSV (SEQ ID NO: 50) 4 2 VH VKGRFTISR (SEQ ID NO: 51) 2 0 VH FTISRDNAK (SEQ ID NO: 52) 5 0 VH LYLQMNSLR (SEQ ID NO: 53) 6 2 VH YLQMNSLRA (SEQ ID NO: 54) 8 5 VH LQMNSLRAE (SEQ ID NO: 55) 2 0 VL IQMTQSPSS (SEQ ID NO: 56) 6 1 VL MTQSPSSLS (SEQ ID NO: 57) 7 0 VL ITCTSSQSL (SEQ ID NO: 58) 3 1 VL VRSQKNYLA (SEQ ID NO: 59) 8 5 VL WYQQKPGKA (SEQ ID NO: 60) 5 0 VL LLIYWASTR (SEQ ID NO: 61) 2 1 VL FTLTISSLQ (SEQ ID NO: 62) 7 5

[00513] Todos os mutantes foram gerados como anticorpos IgG monovalentes usando expressão transitória em HEK293 padrão, seguido de purificação usando coluna de proteína A. Os clones resultantes foram testados quanto à ligação a células Jurkat que expressam CD3 usando FACS e potencial de autoassociação usando AC-SINS, conforme descrito acima no Exemplo 7. Conforme mostrado na Tabela 16, cinco moléculas com melhor pontuação Epivax e epítopos de células T reduzidos e que retiveram a afinidade pela CD3 foram escolhidos para avançar e testagem no formato de diacorpo-Fc. As variantes 2B5v6 com as melhores pontuações Epivax foram comparadas com o 2B5v6 precursor. Os resultados mostram pontuações e AC-SINS de ligação comparável a células Jurkat que expressam CD3. Tabela 16 EC50 Variante (nM) AC-SINS Pontuação Epivax Células Jurkat 2B5v6-0453 11,1 0 -47,18 2B5v6-0517 9,9 1 -42,92 2B5v6-0522 8,6 0 -46,6 2B5v6-0533 6,1 1 -38,8 2B5v6-0538 9,2 0 -42,47 2B5v6 9,8 1 -33,67

[00514] Dentre os mutantes testados, vários mutantes exibiram menor ligação às células Jurkat comparado com 2B5v6. Destes mutantes, aqueles com todos os epítopos de células T eliminados e melhores pontuações Epivax foram levados adiante para gerar moléculas biespecíficas de tipo diacorpo-Fc com anticorpo GUCY2c como outro domínio de ligação. A Tabela 17 mostra as pontuações Epivax e a Figura 15 mostra a ligação reduzida para tais mutantes a células Jurkat. As variantes 2B5v6 do anticorpo anti-CD3 de baixa afinidade mostram as melhores pontuações Epivax. Tabela 17 Varianes de anticorpo anti-CD3 Pontuação Epivax (tReg-Ajustado 2B5v6-0598 -65,15 2B5v6-0623 -56,74 Exemplo 11 Três Variantes Anti-CD3 Mostram Afinidade e Citotoxicidade Aprimoradas em Anticorpos Biespecíficos GUCY2C-CD3

[00515] Três variantes anti-CD3, 2B5-1038 (SEQ ID NOs: 4 e 9),

2B5-1039 (SEQ ID NOs: 4 e 87) e 2B5-1040 (SEQ ID NOs: 4 e 89) que são derivadas de 2B5v6 foram reformatadas em moléculas de diacorpo- Fc biespecíficas emparelhadas com a sequência de anticorpo antitumoral GUCY2c em uma das configurações mostradas na Figura 1 usando técnicas de clonagem, expressão e purificação padrão descritas acima. Os anticorpos biespecíficos resultantes mostrados na Tabela 18 foram testados quanto à citotoxicidade in vitro usando um ensaio de redirecionamento de células T e afinidade de ligação usando ensaio de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) e não especificidade por AC-SINs. O risco de imunogenicidade foi avaliado pela ferramenta Epivax para previsão in silico de epítopos de células T potenciais. Os dados de espectroscopia de massa intactos indicam que todos os anticorpos biespecíficos têm emparelhamento correto e são 100 % heterodímeros.

[00516] A Tabela 18 demonstra que todos os três anticorpos biespecíficos (1) são cerca de 2 vezes mais potentes em um ensaio de citotoxicidade in vitro comparado com o controle biespecífico GUCY2C- 1608 que está emparelhado com anti-CD32B5v6 (Figura 16); (2) têm afinidade de ligação à CD3 humana recombinante por SPR que é consistente com a atividade de citotoxicidade; (3) têm pontuações de imunogenicidade que são aprimoradas em relação ao controle; e (4) pontuações AC-SINs mantidas conforme as mesmas que o controle biespecífico GUCY2C-1608. Estes resultados demonstram que os anticorpos biespecíficos anti-GUCY2c com diferentes variantes de CD3 recrutam células T humanas virgens para induzir à morte celular em células tumorais T84 (Figura 16). As três variantes anti-CD3 derivadas de 2B5v6 demonstraram atividade aproximadamente 2 vezes mais potente comparado com o controle biespecífico GUCY2C-1608. Tabela 18

Pontuação Citotoxicida Pontua- Variante de Epivax Espect. Massa de KD (nM, Bispecífico ção AC- CD3 (tReg- (intacto) in vitro SPR) SINs Ajustado) (nM) GUCY2C- 100 % 127,88 ± 2B5-0542 -33,7 3 0,772 1608 heterodímero 1,63 GUCY2C- 100 % 2B5-1038 -52,61 2 0,247 63,55 ± 0,49 1678 heterodímero GUCY2C- 100 % 2B5-1040 -47,58 3 0,194 72,02 ± 0,36 1679 heterodímero GUCY2C- 100 % 2B5-1039 -53,51 3 0,385 78,57 ± 0,9 1680 heterodímero

[00517] As sequências para os anticorpos biespecíficos são apresentadas na Tabela 19. Tabela 19

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga especificamente à CD3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: a. uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade VH um (CDR1 de VH), uma região determinante de complementaridade VH dois (CDR2 de VH) e uma região determinante de complementaridade três de VH (CDR3 de VH) da sequência de VH mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 ou 35; e/ou b. uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade um de VL (CDR1 de VL), uma região determinante de complementaridade dois de VL (CDR2 de VL) e uma região determinante de complementaridade três de VL (CDR3 de VL) da sequência VL mostrada em SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 ou 89.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: a. uma região VH que compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 13, 14 ou 15; (ii) uma CDR2 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 18 ou 25; e/ou b. uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma CDR1 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 26, 29, 30, 32, 91 ou 92; (ii) uma CDR2 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 27 ou 31; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 28 ou 33.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a. a região VH compreende uma sequência de SEQ ID NO:

2, 4, 5, 7, 10, 12 ou 35; e/ou b. a região VL compreende uma sequência de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 ou 89.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um par de sequência de aminoácidos VL/VH selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 4; SEQ ID NOs: 3 e 5; SEQ ID NOs: 6 e 7; SEQ ID NOs: 8 e 7; SEQ ID NOs: 6 e 4; SEQ ID NOs: 8 e 4; SEQ ID NOs: 9 e 10; SEQ ID NOs: 9 e 7; SEQ ID NOs: 11 e 12; SEQ ID NOs: 34 e 35; SEQ ID NOs: 9 e 4; SEQ ID NOs: 87 e 4; e SEQ ID NOs: 89 e 4.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv, um fragmento Fv com uma única cadeia, um fragmento Fv estabilizado por dissulfeto, um anticorpo com uma única cadeia, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo triespecífico, um anticorpo multiespecífico, um diacorpo heterodimérico biespecífico, uma IgG heterodimérica biespecífica, um anticorpo policlonal, um anticorpo marcado, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano e fragmentos dos mesmos.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

7. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um antígeno tumoral.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região estrutural de VH humana ou humanizada e uma região estrutural de VL humana ou humanizada.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

11. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ou um kit para a modulação de uma resposta imune mediada por células T em um indivíduo que precisa do mesmo.

12. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ou um kit para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células tumorais são de um câncer.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão, bexiga, endometrial, cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e câncer do sistema digestivo.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer do sistema digestivo é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de esôfago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, ânus, fígado, vesícula biliar, apêndice, dutos biliares e pâncreas.

16. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento.

17. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou de uma composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ou um kit para uso em terapia.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16 ou uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a terapia compreende ativação de uma resposta de células T citolíticas.

19. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

20. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 19.

21. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 20.

22. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que produz de forma recombinante o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em linhagens de células bacterianas, linhagens de células de mamíferos, linhagens de células de inseto e linhagens de células de levedura.

24. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a linhagem de células de mamífero é uma linhagem de células CHO.

25. Método de produção de um anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 sob condições que resultem na produção do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e purificação do anticorpo a partir do sobrenadante da cultura.

26. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, da composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, do polinucleotídeo como definido na reivindicação 19, do vetor como definido na reivindicação 20 ou da célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar um transtorno.

27. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento ou um kit para o tratamento de câncer, opcionalmente em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, ovário, tireoide, próstata, cervical, pulmão, bexiga, endometrial, de cabeça e pescoço, testicular, glioblastoma e câncer do sistema digestivo.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a resposta imune mediada por células T é modulada ou em que o crescimento de células tumorais é inibido.

29. Invenção, caracterizada pelo fato de que está sob qualquer forma das suas concretizações ou em qualquer categoria de reivindicação que se possa reivindicar, por exemplo, produto, ou processo, ou uso abrangido pelo objeto inicialmente descrito, revelado, ou ilustrado no pedido de patente, ou Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 10 e instruções para uso, opcionalmente compreendendo um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos; Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, da composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, do polinucleotídeo como definido na reivindicação 19, do vetor como definido na reivindicação 20 ou da célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para modulação de uma resposta imune mediada por células T em um indivíduo que precisa do mesmo; Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, da composição farmacêutica como definida na reivindicação 10, do polinucleotídeo como definido na reivindicação 19, do vetor como definido na reivindicação 20 ou da célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo.