JP2023100255A - 治療用抗体およびそれらの使用 - Google Patents

治療用抗体およびそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023100255A
JP2023100255A JP2022205035A JP2022205035A JP2023100255A JP 2023100255 A JP2023100255 A JP 2023100255A JP 2022205035 A JP2022205035 A JP 2022205035A JP 2022205035 A JP2022205035 A JP 2022205035A JP 2023100255 A JP2023100255 A JP 2023100255A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
chain comprises
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022205035A
Other languages
English (en)
Inventor
リーザナー アプガー ジェームズ
Riizanaa Apgar James
テレーズ フーパー アンドレア
Therese Hooper Andrea
アグニエシュカ ノクラ‐ルゴウスカ マウゴジャータ
Agnieszka Nocula Lugowska Malgorzata
ウー レイ
Wu Lei
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Publication of JP2023100255A publication Critical patent/JP2023100255A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Abstract

【課題】乳がん、卵巣がん、及び他の種類のがんの細胞に特異的に結合することができる分子及び／又は前記分子を含有するがん治療用医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明は、Ｂ７－Ｈ４（遺伝子ＶＴＣＮ１によりコードされるＢ７ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ４）に特異的に結合する抗体ならびにＢ７－Ｈ４およびＣＤ３（分化クラスター３）の両方に特異的に結合する二重特異性抗体、ならびにポリヌクレオチド、医薬組成物ならびにその方法および使用を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｂ７－Ｈ４（Ｂ７ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ４）に特異的に結合する抗体、Ｂ７－Ｈ４抗体を含む組成物ならびにその方法および使用に関する。本発明はまた、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３（分化クラスター３）に特異的に結合する二重特異性抗体、二重特異性Ｂ７－Ｈ４抗体を含む組成物、ならびにＢ７－Ｈ４を発現する細胞と関連する状態（例えば、がんまたは自己免疫疾患）を処置するために二重特異性Ｂ７－Ｈ４抗体を使用する方法に関する。そのような二重特異性抗体を産生および精製する方法、ならびに診断および治療におけるそれらの使用もまた提供される。
Ｂ７－Ｈ４（遺伝子ＶＴＣＮ１によりコードされるＢ７ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ４）は、Ｂ７ｘ、Ｂ７Ｓ１またはＶＴＣＮ１としても公知であり、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｂ７ファミリータンパク質のメンバーである。Ｂ７－Ｈ４は、１５年以上前に最初に同定された（Ｓｉｃａ ＧＬら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２００３；１８：８４９～８６１）。それ以来、Ｂ７－Ｈ４は、乳がんおよび卵巣がん（Ｓａｌｃｅｄａ Ｓら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００５；３０６：１２８～１４１）ならびに多くの他のがん細胞において過剰発現されることが見出されている。腫瘍内のＢ７－Ｈ４タンパク質発現は、より短い平均余命および疾患重症度に関することも見出されている（Ｐｏｄｏｊｉｌ，Ｊ．Ｒ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１７；２７６：４０～５１）。Ｂ７－Ｈ４はＢ７ファミリー分子であるが、公知のＢ７ファミリー受容体、すなわちＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１またはＣＤ２８のいずれにも結合しない。Ｂ７－Ｈ４特異的な受容体を同定するための努力は、そのような受容体は、活性化されたＴ細胞上に発現されることを明らかにしており、Ｔ細胞上のその推定上の受容体へのＢ７－Ｈ４融合タンパク質の結合は、Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマ、およびＩＬ１７）産生を有意に阻害することが見出された。（Ｐｏｄｏｊｉｌ，Ｊ．Ｒ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１７；２７６：４０～５１）。
乳がん、卵巣がん、および他の種類のがんの細胞を特異的に標的化してそれに特異的に結合することができる分子および／または組成物に対する必要性が依然として存在する。がんを患っていることが疑われる個体を処置する改善された方法に対する必要性が存在する。
Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体、ならびにＢ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体（以下、「Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体」）が提供される。二重特異性抗体を含む、本明細書に開示される抗体の一部は、がんを予防および／または処置するためにｉｎ ｖｉｖｏで有効性を有することが実証される。
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号２３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＣＤＲ１）、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３；ならびに（Ｂ）配列番号２７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９および配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）ＶＨが配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１６７のアミノ酸配列を有するか；（ｂ）ＶＨが配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｃ）ＶＨが配列番号１５５のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｄ）ＶＨが配列番号１５６のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｅ）ＶＨが配列番号１５７のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；（ｆ）ＶＨが配列番号１５５のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；（ｇ）ＶＨが配列番号１５６のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；（ｈ）ＶＨが配列番号１５９のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号２７のアミノ酸配列を有するか；（ｉ）ＶＨが配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号２７のアミノ酸配列を有するか；（ｊ）ＶＨが配列番号１６３のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号２７のアミノ酸配列を有するか；（ｋ）ＶＨが配列番号１６５のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号２７のアミノ酸配列を有するか；（ｌ）ＶＨが配列番号２３のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１６７のアミノ酸配列を有するか；（ｍ）ＶＨが配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；（ｎ）ＶＨが配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１４１のアミノ酸配列を有するか；（ｏ）ＶＨが配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｐ）ＶＨが配列番号１７３のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｑ）ＶＨが配列番号１７４のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｒ）ＶＨが配列番号１７５のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するか；（ｓ）ＶＨが配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１６８のアミノ酸配列を有するか；（ｔ）ＶＨが配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１６９のアミノ酸配列を有するか；（ｕ）ＶＨが配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１７０のアミノ酸配列を有するか；または（ｖ）ＶＨが配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号１３９のアミノ酸配列を有するようなものである。
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｂ）配列番号２０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｃ）配列番号２０６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｅ）配列番号１９９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｆ）配列番号２００のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；または（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
１つの態様では、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｄ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｅ）配列番号１５７のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｆ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨ；配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｇ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｈ）配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｊ）配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｋ）配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｌ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｍ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｏ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｐ）配列番号１７３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｑ）配列番号１７４のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｒ）配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｓ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６８のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｔ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｕ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＶＬ；または（ｖ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
１つの態様では、本発明は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
１つの態様では、本発明は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ２のアイソタイプである。一部の実施形態では、抗体は、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むヒトＩｇＧ２であり、番号付けは、ヒトＩｇＧ２野生型およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである。一部の実施形態では、抗体は、置換Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅを含む。
１つの態様では、本発明は、配列番号１９０のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１９１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
１つの態様では、本発明は、配列番号１８６のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１８７のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７７９の下で寄託されたポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む重鎖、およびＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８１と共に寄託されたポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３の各々は、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、または接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に従って定義される。
１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｆ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６０のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｊ）配列番号７４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｋ）配列番号８０のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号８４のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｌ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９０のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｎ）配列番号９４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９６のアミノ酸配列を有するＶＬ；（ｏ）配列番号１００のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ；または（ｐ）配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む第２の抗体とＢ７－Ｈ４との結合について競合する、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された第１の抗体であって、約１マイクロモル濃度～０．１ナノモル濃度のヒトＢ７－Ｈ４に対するＫＤを有する、第１の抗体を提供する。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の各々は全長ＩｇＧ１定常領域を含む。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の両方はＦ（ａｂ’）２断片抗体である。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＢ７－Ｈ４細胞外ドメインのＬ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または少なくとも１２個のアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。一部の実施形態では、エピトープは、Ｌ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０およびＬ５１からなる群から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個または少なくとも７個のアミノ酸残基、ならびにＥ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは、Ｌ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１のアミノ酸残基を含むかまたはからなる。
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＢ７－Ｈ４細胞外ドメインのＶ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６、Ｌ１３８、Ｖ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体を提供する。一部の実施形態では、エピトープは、Ｖ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６およびＬ１３８からなる群から選択される少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個のアミノ酸残基、ならびにＶ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７からなる群からの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個または少なくとも７個のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは、アミノ酸残基Ｖ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６、Ｌ１３８、Ｖ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７を含むかまたはからなる。
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のＢ７－Ｈ４抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のＢ７－Ｈ４抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）本発明のＢ７－Ｈ４抗体の重鎖可変領域または（ｉｉ）本発明のＢ７－Ｈ４抗体のいずれかの軽鎖可変領域をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）本発明のＢ７－Ｈ４抗体の重鎖または（ｉｉ）本発明のＢ７－Ｈ４抗体のいずれかの軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体を組換えにより産生する単離された宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のＢ７－Ｈ４抗体を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を、抗体の産生を結果としてもたらす条件下で培養すること、および宿主細胞または培養物から抗体を単離することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象においてＢ７－Ｈ４を発現する細胞と関連する状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、状態はがんである。一部の実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮がんまたは胆管がんである。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍成長または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象においてＢ７－Ｈ４を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、第１の重鎖および第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のアームを形成し、第２の重鎖および第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のアームを形成し、（ａ）第１の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｂ）第１の重鎖が、配列番号２０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｃ）第１の重鎖が、配列番号２０６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｄ）第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｅ）第１の重鎖が、配列番号２００のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｆ）第１の重鎖が、配列番号１９９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｇ）第１の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｈ）第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；または（ｉ）第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体を提供する。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｂ）第１の重鎖は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｃ）第１の重鎖は、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｄ）第１の重鎖は、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｅ）第１の重鎖は、配列番号１５７のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｆ）第１の重鎖は、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｇ）第１の重鎖は、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｈ）第１の重鎖は、配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｉ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｊ）第１の重鎖は、配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｋ）第１の重鎖は、配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｌ）第１の重鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｍ）第１の重鎖は、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｎ）第１の重鎖は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｏ）第１の重鎖は、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｐ）第１の重鎖は、配列番号１７３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｑ）第１の重鎖は、配列番号１７４のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｒ）第１の重鎖は、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｓ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１６８のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｔ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｕ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；または（ｖ）第１の重鎖は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号２０２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｃ）第２の重鎖は、配列番号２０３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｄ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；（ｅ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；または（ｆ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第２の重鎖は、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；（ｃ）第２の重鎖は、配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；または（ｄ）第２の重鎖は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第１の重鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖は、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第１の重鎖は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第１の軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第１の重鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、（ａ）第１の重鎖は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第１の軽鎖は、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含み；（ｂ）第２の重鎖は、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域はＩｇＧ１である。一部の実施形態では、定常領域は、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むヒトＩｇＧ２であり、番号付けは、ヒトＩｇＧ２野生型およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである。
二重特異性抗体の一部の実施形態では、第１のアームは、置換Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅを有するｈＩｇＧ２ΔＡ定常領域をさらに含み、第２のアームは、置換Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒを有するヒトＩｇＧ２ΔＡ定常領域をさらに含み、番号付けは、ヒト野生型ＩｇＧ２およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである。
１つの態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、第１の重鎖および第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、第２の重鎖および第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、（ａ）第１の重鎖が配列番号１９０のアミノ酸配列を有し、第１の軽鎖が配列番号１９１のアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２の重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖が配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、第１の重鎖および第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、第２の重鎖および第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、（ａ）第１の重鎖が配列番号１８６のアミノ酸配列を有し、第１の軽鎖が配列番号１８７のアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２の重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖が配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、第１の重鎖および第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、第２の重鎖および第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、（ａ）第１の重鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７７９の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第１の軽鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８１の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み；（ｂ）第２の重鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８０の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８２の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１のＢ７－Ｈ４アミノ酸配列のＬ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｓ６３、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。一部の実施形態では、エピトープは、Ｌ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０およびＬ５１からなる群からの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個または少なくとも７個のアミノ酸残基、ならびにＳ６３、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群からの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは、Ｌ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｓ６３、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１のアミノ酸残基を含むかまたはからなる。
別の態様では、本発明は、配列番号１のＢ７－Ｈ４アミノ酸配列のＶ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６、Ｌ１３８、Ｖ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７からなる群からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。一部の実施形態では、エピトープは、Ｖ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６およびＬ１３８からなる群からの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個のアミノ酸残基、ならびにＶ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７からなる群からの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは、Ｖ１２９、Ｙ１３１、Ｎ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３５、Ｅ１３６、Ｌ１３８、Ｖ１８９、Ｉ１９１、Ｖ２１２、Ｅ２１４、Ｓ２１５、Ｅ２１６およびＩ２１７のアミノ酸残基を含むかまたはからなる。
別の態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）本発明の二重特異性抗体の重鎖または（ｉｉ）本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための本明細書に開示される二重特異性抗体を提供する。一部の実施形態では、医薬は、がんの処置のためのものであり得る。
別の態様では、本発明は、必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に本明細書に開示される二重特異性抗体を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、対象においてＢ７－Ｈ４を発現する悪性細胞と関連する状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬の製造における、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
一部の実施形態では、状態はがんである。一部の実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がんまたは胆管がんである。一部の実施形態では、方法または使用は、有効量の第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはパルボシクリブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はＲＮ８８８である。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍成長または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍成長または進行の阻害における使用のための、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍成長または進行を阻害するための医薬の製造における、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
一部の実施形態では、方法または使用は、有効量の第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはパルボシクリブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はＲＮ８８８である。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮の誘導における使用のための、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、二重特異性抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍退縮を誘導するための医薬の製造における、本明細書に開示されているＢ７－Ｈ４抗体、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
一部の実施形態では、方法または使用は、有効量の第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはパルボシクリブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はＲＮ８８８である。
一部の実施形態では、本発明の抗体または二重特異性抗体は、増加したＢ７－Ｈ４受容体密度レベルの存在下でのより低いＥＣ５０値を実証する。好ましくは、ＥＣ５０値は、０．０００１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０００１ｎＭ～１０ｎＭ、０．０００１ｎＭ～１ｎｍ、０．０００１ｎＭ～０．１ｎｍ、０．０００１ｎＭ～０．００１０ｎＭ、０．００１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、０．００１ｎＭ～１０ｎＭ、０．００１ｎＭ～１ｎＭ、０．０１ｎＭ～１ｎＭ、または０．００１ｎＭ～０．１ｎＭである。好ましくは、ＥＣ５０値は、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０１ｎＭ未満または０．００１ｎｍ未満である。
一部の実施形態では、本発明の抗体または二重特異性抗体は、細胞溶解性Ｔ細胞応答を活性化させる能力を有する。
定常領域内の様々な位置に改変を有する、本明細書に提供される二重特異性抗体の例示的なＩｇＧ２定常領域のアミノ酸配列を、ＥＵ番号付けスキームを用いてヒトＩｇＧ２野生型配列に従い番号付けしたものを示す図である。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４の野生型配列および番号付けもまた図１に提供する。 図２Ａ：Ｂ７－Ｈ４抗体００５２ ｓｃＦｖおよびヒトＢ７－Ｈ４細胞外ドメインの共結晶構造を示す図である。 図２Ｂ：Ｂ７－Ｈ４抗体００５８ ＦａｂおよびヒトＢ７－Ｈ４細胞外ドメインの共結晶構造を示す図である。 図２Ｃ：Ｂ７－Ｈ４抗体１１１４ ＦａｂおよびヒトＢ７－Ｈ４細胞外ドメインの共結晶構造を示す図である。
本明細書に開示されるのは、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体（「Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体」）を含む、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体、そのような抗体を作製する方法、ならびに腫瘍進行を阻害するためならびにがんを処置および／または予防するためを含む、そのような抗体を使用する方法である。
一般技術
本発明の実施は、他に指し示されなければ、当技術分野の技術的範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８） Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）において十分に説明されている。
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、該用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖（ＳｃＦｖ）ならびにドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科動物抗体を含む）など、抗体を含む融合タンパク質（例えば限定なく、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または抗体－サイトカイン融合タンパク質を含む）、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成も包含する。抗体は、任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体を含み、抗体はいかなる特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は周知である。
「単離された抗体」は、他のタンパク質および細胞材料を実質的に含まない抗体を指す。
抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、所与の抗原（例えば、Ｂ７－Ｈ４またはＣＤ３）に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により行われ得る。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例は、限定なく、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６、１９８９）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
標的（例えば、Ｂ７－Ｈ４タンパク質またはＣＤ３タンパク質）に「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において交換可能に使用される）抗体、抗体コンジュゲート、またはポリペプチドは、当技術分野においてよく理解されている用語であり、そのような特異的なまたは優先的な結合を決定する方法もまた当技術分野において周知である。分子は、代替的な細胞または物質とよりも特定の細胞または物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続期間でおよび／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を呈するといわれる。抗体は、他の物質に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続期間で結合する場合に、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、Ｂ７－Ｈ４エピトープまたはＣＤ３エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが他のＢ７－Ｈ４エピトープ、非Ｂ７－Ｈ４エピトープ、ＣＤ３エピトープ、または非ＣＤ３エピトープに結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続期間でこのエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもよいし、またはそうでなくてもよいこともまた、この定義を読むことにより理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも要求しない（但し、それを含むことができる）。必ずしもそうではないが、一般に、結合への言及は優先的結合を意味する。
抗体の「可変領域」は、単独または組み合わせのいずれかでの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野において公知のように、重鎖および軽鎖の可変領域の各々は、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各々の鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより近接状態に保持されており、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術がある：（１）種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（５ｔｈ ｅｄ．、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；および（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７～９４８）。本明細書において使用される場合、ＣＤＲは、いずれかのアプローチまたは両方のアプローチの組み合わせにより定義されるＣＤＲを指し得る。
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触、ならびに／またはコンフォメーション定義（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｓ）または当技術分野において周知のＣＤＲ決定の任意の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、元々はＫａｂａｔらにより定義された超可変領域として同定されてもよい。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．を参照。ＣＤＲの位置はまた、元々はＣｈｏｔｈｉａおよび他の者により記載された構造ループ構造として同定されてもよい。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３、１９８９を参照。ＣＤＲ同定のための他のアプローチは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導出される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２～７４５、１９９６に記載されている、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」を含む。本明細書においてＣＤＲの「コンフォメーション定義」と称される別のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー的に寄与する残基として同定されてもよい。例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６～１１６６、２００８を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記のアプローチの１つに厳密には従わないことがあるが、それにもかかわらずＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも部分とオーバーラップし、但し、それらは、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはＣＤＲ全体は抗原結合に重大に影響しないという予測または実験的発見に照らして短縮または延長されてもよい。本明細書において使用される場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において公知の任意のアプローチにより定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書において使用される方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができる。１つより多くのＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態のために、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンフォメーション定義のいずれかに従って定義されてもよい。
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられている。さらには、異なる決定因子（エピトープ）に対して方向付けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子に対して方向付けられている。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を指し示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されている組換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５４、１９９０に記載されている技術を使用して生成されたファージライブラリーから単離されてもよい。
本明細書において使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギのＣＤＲからの残基により置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも移入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されないが、抗体性能をさらに精密化および最適化するために含められる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つの、典型的には２つの、可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、最適にはまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分を含む。好ましいものは、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに記載されているように改変されたＦｃ領域を有する抗体である。ヒト化抗体の他の形態は、元々の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも称される、元々の抗体に関して変更された１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、またはＣＤＲ Ｈ３）を有する。
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、および／または当業者に公知のもしくは本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。１つのそのような例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して産生され得る。１つの実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９～３１４、１９９６；Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６１５７～６１６２、１９９８；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座位が内因性座位の代わりにトランスジェニックに導入されている動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスの免疫化により調製され得る。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；および同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原に対して方向付けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することにより調製されてもよい（そのようなＢリンパ球は、個体からもしくはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収されてもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化されていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６～９５、１９９１；および米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
「Ｂ７－Ｈ４」という用語は、名詞としておよび単独で使用される場合、遺伝子ＶＴＣＮ１によりコードされる任意の形態のＢ７ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ４タンパク質、およびＢ７ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ４タンパク質の活性の少なくとも部分を保持するそのバリアントを指す。１つの例示的なヒトＢ７－Ｈ４配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｑ７Ｚ７Ｄ３－１の下で提供される。Ｑ７Ｚ７Ｄ３－１において提示される配列は、成熟形態にさらにプロセシングされる。
「Ｂ７－Ｈ４抗体」という用語は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体を指す。
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において交換可能に使用され、任意の長さの、好ましくは、相対的に短い（例えば、１０～１００アミノ酸）、アミノ酸の鎖を指す。鎖は、直鎖状または分岐鎖状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、および／または非アミノ酸を差し挟まれていてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入により修飾されている；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他のマニピュレーションもしくは修飾、例えば標識化成分とのコンジュゲーションをされているアミノ酸鎖を包含する。定義に含まれるのはまた、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の他に、当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは単一の鎖または会合した鎖として存在できることが理解される。
「一価抗体」は、分子（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）当たり１つの抗原結合部位を含む。一部の事例では、一価抗体は、１つより多くの抗原結合部位を有することができるが、結合部位は異なる抗原からのものである。
「単一特異性抗体」は、分子（例えばＩｇＧ）当たり２つの同一の抗原結合部位を含み、その結果、２つの結合部位が抗原上の同一のエピトープに結合するようなものである。そのため、それらは、１つの抗原分子への結合に関して互いと競合する。天然に見出されるほとんどの抗体は単一特異性である。一部の事例では、単一特異性抗体はまた一価抗体（例えばＦａｂ）であり得る。
「二価抗体」は、分子（例えば、ＩｇＧ）当たり２つの抗原結合部位を含む。一部の事例では、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は二特異性であってもよい。
「二特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる、２つの異なる結合特異性、例えば、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアを有するハイブリッド抗体を指す。
「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびこれらのバリエーションは、本明細書において使用される場合、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、６：４０７～４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３～２０２において説明されている、当技術分野において公知の意味を含む。
「免疫グロブリン様ヒンジ領域」、「免疫グロブリン様ヒンジ配列」、およびこれらのバリエーションは、本明細書において使用される場合、免疫グロブリン様または抗体様分子（例えば、イムノアドヘシン）のヒンジ領域およびヒンジ配列を指す。一部の実施形態では、免疫グロブリン様ヒンジ領域は、任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭ、例えばこれらのキメラ形態、例えば、キメラＩｇＧ１／２ヒンジ領域からのものであるかまたはそれに由来することができる。
「免疫エフェクター細胞」または「エフェクター細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、活性化されて標的細胞の生存に影響し得るヒト免疫系における細胞の天然のレパートリー内の細胞を指す。標的細胞の生存は、細胞生存、増殖、および／または他の細胞と相互作用する能力を含むことができる。
当技術分野において公知のように、「ポリヌクレオチド」、または本明細書において交換可能に使用される「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびそれらのアナログを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、鎖のアセンブリーの前または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分を差し挟まれていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識化成分とのコンジュゲーションにより、さらに修飾されてもよい。他の種類の修飾は、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の、アナログでの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電性連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅｓ）、カルバメートなど）を用いたものおよび荷電性連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いたものなど、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いたもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を用いたものの他に、非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。さらに、糖中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基により置き換えられてもよく、標準的な保護基により保護されてもよく、または活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製してもよく、または固体支持体にコンジュゲートされてもよい。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１～２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野において一般に公知の類似の形態のリボースまたはデオキシリボース糖を含有し得、これは、例えば、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－または２’－アジド－リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ－またはベータ－アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドを含む。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的な連結基により置き換えられてもよい。これらの代替的な連結基は、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置き換えられている実施形態を含むが、これらに限定されず、ここで各々のＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、または、エーテル（－Ｏ－）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有してもよい置換されているかもしくは置換されていないアルキル（１～２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において参照されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
当技術分野において公知のように、抗体の「定常領域」は、単独または組み合わせのいずれかでの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋な（すなわち、夾雑物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋な、より好ましくは、少なくとも９５％純粋な、さらにより好ましくは、少なくとも９８％純粋な、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋な材料を指す。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組み込み用のベクターのレシピエントであり得るかまたは該レシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または故意的な突然変異に起因して元々の親細胞と必ずしも完全に同一（形態またはゲノムＤＮＡ相補体において）でなくてもよい。宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトされた細胞を含む。
当技術分野において公知のように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端まで伸長するように定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、２つの定常領域、ＣＨ２およびＣＨ３を一般に含む。
当技術分野において使用されるように、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これは、これらの受容体のアレルバリアントおよび選択的にスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７～９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５～３４、１９９４；ならびにｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０～４１、１９９５において総説されている。「ＦｃＲ」はまた新生児受容体、ＦｃＲｎを含み、これは、胎児への母親ＩｇＧの移動の原因となる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７、１９７６；およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９、１９９４）。
「競合する」という用語は、抗体に関して本明細書において使用される場合、第１の抗体、またはその抗原結合断片（もしくは部分）が、第２の抗体、またはその抗原結合部分の結合に十分に類似した方式でエピトープに結合し、その結果、そのコグネイトエピトープとの第１の抗体の結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して第２の抗体の存在下で検出可能に減少していることを意味する。そのエピトープへの第２の抗体の結合もまた、第１の抗体の存在下で検出可能に減少している選択肢も該当することができるが、その必要はない。すなわち、第１の抗体は、そのエピトープへの第２の抗体の結合を、その第２の抗体がそのそれぞれのエピトープへの第１の抗体の結合を阻害することなく阻害することができる。しかしながら、同じ、より大きい、またはより小さい程度のいずれであれ、各々の抗体がそのコグネイトエピトープまたはリガンドとの他の抗体の結合を検出可能に阻害する場合、抗体は、それらのそれぞれのエピトープの結合について互いと「交差競合する」といわれる。競合性抗体および交差競合性抗体の両方は本発明により包含される。そのような競合または交差競合が起こる機序（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または共通のエピトープ、もしくはその部分への結合）にかかわらず、本明細書において提供される教示に基づいて、そのような競合性および／または交差競合性抗体が包含され、本明細書に開示される方法のために有用であり得ることを当業者は理解する。
「機能的なＦｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節などを含む。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせられるＦｃ領域を一般に要求し、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において公知の様々なアッセイを使用して評価され得る。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然において見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変を理由としてネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、それと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰せられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃ受容体結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、ファゴサイトーシス、Ｃ１ｑ結合、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節を含むが、これらに限定されない。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書を参照。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせられるＦｃ領域を一般に要求し、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において公知の様々なアッセイを使用して評価され得る。エフェクター機能の例示的な測定は、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑ結合を通じてなされる。
本明細書において使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号明細書または同第５，８２１，３３７号明細書に記載されるものを使用して評価され得る。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞を含む。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデル、例えばＣｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２～６５６において開示されるものにおいて評価されてもよい。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体化した分子（例えば抗体）への補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイが行われてもよい。
本明細書において使用される場合、「処置」は、有益なまたは所望される臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望される臨床結果は、以下：新生物性もしくはがん性細胞の増殖の低減（もしくは破壊）、新生物性細胞の転移の阻害、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）の軽快、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）の結果としてもたらされる症状の減少、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）を患っている者の生活の質の増加、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）を処置するために要求される他の医薬品の用量の減少、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）の進行の遅延、Ｂ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）の治癒、および／またはＢ７－Ｈ４関連疾患（例えば、がんもしくは自己免疫疾患）を有する患者の生存の長期化の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
「寛解」は、Ｂ７－Ｈ４抗体またはＢ７－Ｈ４抗体コンジュゲートを投与しない場合と比較した１つまたは複数の症状の減少または改善を意味する。「寛解」はまた、症状の持続期間における短縮または低減を含む。
本明細書において使用される場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投薬量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望される結果をもたらすために十分な量である。予防的使用のために、有益なまたは所望される結果は、疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の減少、または始まりの遅延を含み、該疾患は、疾患、その合併症および疾患の発生の間に現れる中間的な病的表現型の生化学的、組織学的および／または行動的な症状を含む。治療的使用のために、有益なまたは所望される結果は、臨床結果、例えば様々なＢ７－Ｈ４関連疾患もしくは状態（例えばがん）の１つもしくは複数の症状の発生率の低減もしくは寛解、疾患を処置するために要求される他の医薬品の用量の減少、別の医薬品の効果の増強、および／または患者のＢ７－Ｈ４関連疾患の進行の遅延を含む。有効投薬量は、１つまたは複数の投与において投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、直接的または間接的のいずれかで予防的または治療的処置を達成するために十分な量である。臨床的状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されてもよいし、またはそうでなくてもよい。そのため、「有効投薬量」は、１つまたは複数の治療剤を投与する文脈において考慮することができ、単一の薬剤は、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて、望ましい結果が達成され得るかまたは達成される場合に、有効量で与えられると考えることができる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物はまた、農用動物、競技動物、愛玩動物、霊長動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を宿主細胞中に送達する、および好ましくは発現させる能力を有する構築物を意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指令する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的もしくは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結している。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合に該成分が生物学的活性を保持することを可能とし、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例は、標準的な薬学的担体のいずれか、例えばリン酸緩衝溶液、水、エマルション、例えば油／水エマルション、および様々な種類の湿潤剤を含むが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または生理（０．９％）食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５を参照）。
「ｋｏｎ」または「ｋａ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の会合についての速度定数を指す。特に、速度定数（ｋｏｎ／ｋａおよびｋｏｆｆ／ｋｄ）ならびに平衡解離定数は、全体抗体（すなわち二価）および単量体Ｂ７－Ｈ４タンパク質を使用して測定される。
「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての速度定数を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体へと方向付けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。
実施形態が「含む」という表現と共に本明細書において記載される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という観点で記載される、他には類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または選択肢の他のグループ化の観点において記載される場合、本発明は、列記される群全体を全体として包含するだけでなく、個々に群の各々のメンバーおよび主群のすべての可能な部分群、そしてまた主群において群メンバーの１つまたは複数が存在しないものもまた包含する。本発明はまた、クレームされた発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明示的な除外を想定する。
他に定義されなければ、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含めて、本明細書が優先される。本明細書および請求項の全体を通じて、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という語またはバリエーション、例えば「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）もしくは「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、記載される整数または整数の群の包含を含意するが、任意の他の整数または整数の群の除外を含意しないことが理解される。文脈により他に要求されなければ、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料もまた本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法、および例は実例的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。
抗体の作製における一般的方法
標的抗原、例えば本発明においてＢ７－Ｈ４に特異的に結合するヒトおよびマウス抗体の産生のための一般技術は当技術分野において公知であり、および／または本明細書に記載されている。
ファージディスプレイ：
一部の実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術により調製および選択されてもよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書；および同第６，２６５，１５０号明細書；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３～４５５、１９９４を参照。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５３、１９９０）を使用して、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子はインフレームで糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子にクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択もまた、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択を結果としてもたらす。そのため、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットにおいて行われ得る；総説のために、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４～５７１、１９９３を参照。Ｖ－遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４～６２８、１９９１は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築可能であり、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体が、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１～５９７、１９９１、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５～７３４、１９９３により記載された技術に本質的に従って単離され得る。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は高い速度で突然変異を蓄積させる（体細胞超突然変異）。導入される変化の一部はより高い親和性を付与し、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原負荷の間に優先的に複製および分化を受ける。この天然のプロセスは、「鎖シャッフリング」として公知の技術を用いることにより模倣され得る。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ、１０：７７９～７８３、１９９２）。この方法において、ファージディスプレイにより得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアント（レパートリー）のレパートリーで逐次的に置き換えることにより改善され得る。この技術は、ｐＭ～ｎＭの範囲内の親和性を有する抗体および抗体断片の産生を可能とする。非常に大きいファージ抗体レパートリー（「マザー・オブ・オール（ｍｏｔｈｅｒ－ｏｆ－ａｌｌ）ライブラリー」としても公知）を作るための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５～２２６６、１９９３により記載されている。遺伝子シャッフリングもまた、齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために使用可能であり、ここでヒト抗体は出発齧歯動物抗体と類似した親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られる齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子はヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられて、齧歯動物－ヒトキメラを作り出す。抗原における選択は、機能的な抗原結合部位を回復させる能力を有するヒト可変領域の単離を結果としてもたらし、すなわち、エピトープはパートナーの選択を支配（インプリント）する。残存する齧歯動物Ｖドメインを置き換えるためにプロセスが繰り返される場合、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照）。ＣＤＲグラフト化による齧歯動物抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、齧歯動物起源のフレームワーク残基もＣＤＲ残基も有しない完全ヒト抗体を提供する。
ハイブリドーマ技術：
一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して作製されてもよい。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそれからの抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の産生のための基礎として役立つようにマニピュレートされ得ることが企図される。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、本明細書にさらに記載されるように、抗体刺激および産生のための確立されたおよび従来の技術に一般に従う。典型的には、宿主動物は、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、皮下に、足底内に、および／または皮内に、本明細書に記載されているものを含む、ある量の免疫原を接種される。
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化された骨髄腫細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５～４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７～３８１、１９８２により改変された一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して調製され得る。Ｘ６３－Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡからのものを含むがこれらに限定されない、利用可能な骨髄腫株がハイブリダイゼーションにおいて使用されてもよい。一般に、技術は、融合因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）、例えばポリエチレングリコールを使用して、または当業者に周知の電気的手段により、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合することを伴う。融合後に、細胞は融合培地から分離され、選択増殖培地、例えばヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地中で増殖され、非交雑の親細胞が排除される。血清の補充のありまたはなしの、本明細書に記載される任意の培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用され得る。細胞融合技術の別の代替として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本発明のＢ７－Ｈ４モノクローナル抗体を産生してもよい。ハイブリドーマまたは他の不死化されたＢ細胞は、拡大増殖され、所望される場合にサブクローニングされ、上清は、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性についてアッセイされる。
抗体の供給源として使用され得るハイブリドーマは、標的抗原、例えばＢ７－Ｈ４に特異的なモノクローナル抗体、またはその部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を包含する。
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖されてもよい。モノクローナル抗体は、所望される場合、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過により培養培地または体液から単離されてもよい。望ましくない活性が存在する場合、それは、例えば、固相に取り付けられた免疫原から作られた吸着剤の上に調製物を流し、所望される抗体を免疫原から溶出または放出させることにより除去され得る。抗原、例えばＢ７－Ｈ４ポリペプチド、または、二機能性もしくは誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じたコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通じて）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートされた標的アミノ酸配列を含有する断片での宿主動物の免疫化は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団をもたらすことができる。
組換え抗体
所望される場合、目的の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、例えば、ハイブリドーマ技術の下で生成される抗体は、シークエンシングされてもよく、ポリヌクレオチド配列は次に発現または増殖のためにベクターにクローニングされてもよい。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中でベクター中に維持されてもよく、宿主細胞は次に拡大増殖され、および将来的な使用のために凍結され得る。細胞培養における組換えモノクローナル抗体の産生は、当技術分野において公知の手段によりＢ細胞から抗体遺伝子のクローニングを通じて実行され得る。例えばＴｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９、１１２；米国特許第７，３１４，６２２号明細書を参照。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化する」ためまたは抗体の親和性、もしくは他の特徴を改善するための遺伝子マニピュレーションのために使用されてもよい。抗体はまた、例えば、イヌ、ネコ、霊長動物、ウマ科動物およびウシ科動物における使用のためにカスタマイズされてもよい。
一部の実施形態では、完全ヒト抗体は、特有のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された商業的に入手可能なマウスを使用することにより得られてもよい。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはより堅牢な免疫応答を生成するように設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化またはヒト抗体の生成のために使用されてもよい。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）からのＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
抗体は、最初に宿主動物から抗体および抗体産生細胞を単離し、遺伝子配列を得、ならびに遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で組換えにより抗体を発現させることにより組換えにより作製されてもよい。用いられてもよい別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物またはミルク中で組換えにより抗体を発現させる方法が開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６、２００１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５、１９９５；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７、１９９９を参照。抗体の誘導体、例えば、ドメイン、単鎖などを作製する方法は当技術分野において公知である。
イムノアッセイおよびフローサイトメトリー選別技術、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）もまた、標的抗原、例えばＢ７－Ｈ４に特異的な抗体を単離するために用いられ得る。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を使用して容易に単離およびシークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡが単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクター（例えばＰＣＴ国際公開第８７／０４４６２号パンフレットに開示される発現ベクター）に入れられてもよく、発現ベクターは次に、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、ＰＣＴ国際公開第８７／０４４６２号パンフレットを参照。ＤＮＡはまた、例えば、相同的なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコーディング配列を代用することにより（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１：６８５１、１９８４）、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのためのコーディング配列の全体もしくは部分を共有結合的に接合することにより改変されてもよい。その方式において、標的抗原、例えばＢ７－Ｈ４に対する結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
抗体断片は、抗体のタンパク質分解または他の分解により、上記されている組換え法（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）により、または化学合成により産生され得る。抗体のポリペプチド、特に約５０個までのアミノ酸のより短いポリペプチドは、好都合には化学合成により作製される。化学合成の方法は当技術分野において公知であり、商業的に利用可能である。例えば、抗体は、固相方法を用いる自動化されたポリペプチド合成装置により産生され得る。米国特許第５，８０７，７１５号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；および同第６，３３１，４１５号明細書も参照。
組換え抗体 － 親和性成熟
抗体は、親和性成熟として一般に公知の方法により改変され得る。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順により産生され得る（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９～７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ ９１：３８０９～３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７～１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４～２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０～９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９～８９６；およびＰＣＴ国際公開第２００４／０５８１８４号パンフレット）。
以下の方法は、抗体の親和性を調整するためおよびＣＤＲを特徴付けるために使用されてもよい。抗体のＣＤＲを特徴付けるおよび／またはポリペプチド、例えば抗体の結合親和性を変更（例えば改善）する１つの仕方は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と称される。一般に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は以下のように機能する。ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置は、当技術分野において認められる方法を使用して２つまたはより多く（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）のアミノ酸で置き換えられる。これは、クローンの小さいライブラリー（一部の実施形態では、分析されるあらゆるアミノ酸位置について１つ）を生成し、各々は、２つまたはより多くのメンバーの複雑性を有する（２つまたはより多くのアミノ酸があらゆる位置において置換される場合）。一般に、ライブラリーはまた、ネイティブな（非置換の）アミノ酸を含むクローンを含む。各々のライブラリーからの少数のクローン、例えば、約２０～８０個のクローン（ライブラリーの複雑性に依存する）が標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングされ、増加した、同じ、減少した、または無結合を伴う候補が同定される。結合親和性を決定する方法は当技術分野において周知である。結合親和性は、例えば、約２倍もしくはより大きい結合親和性における差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標） Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）イムノアッセイ、蛍光クエンチ、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して決定されてもよい。結合親和性はまた、好適なバイオアッセイを使用してスクリーニングされてもよい。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、出発抗体が相対的に高い親和性、例えば約１０ｎＭまたはより低いＫＤで既に結合する場合に特に有用である。
一部の実施形態では、ＣＤＲ中のあらゆるアミノ酸位置は、当技術分野において認識される突然変異誘発方法（その一部は本明細書に記載されている）を使用して２０個すべての天然アミノ酸で置き換えられる（一部の実施形態では、１回に１つ）。これは、クローンの小さいライブラリー（一部の実施形態では、分析されるあらゆるアミノ酸位置について１つ）を生成し、各々は、２０個のメンバーの複雑性を有する（２０個すべてのアミノ酸があらゆる位置において置換される場合）。
一部の実施形態では、スクリーニングされるライブラリーは、同じＣＤＲ中または２つもしくはより多くのＣＤＲ中にあってもよい２つまたはより多くの位置において置換を含む。そのため、ライブラリーは、１つのＣＤＲ中の２つまたはより多くの位置において置換を含んでもよい。ライブラリーは、２つまたはより多くのＣＤＲ中の２つまたはより多くの位置において置換を含んでもよい。ライブラリーは、３、４、５、またはより多くの位置において置換を含んでもよく、前記位置は、２、３、４、５または６個のＣＤＲ中に見出される。置換は、低冗長性コドンを使用して調製されてもよい。例えば、Ｂａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ １３７（１）：１０９～１８のＴａｂｌｅ ２を参照。
ＣＤＲは、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３であってもよい。ＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３の１つまたは複数であってもよい。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、拡張ＣＤＲ、ＡｂＭ ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、またはコンフォメーションＣＤＲであってもよい。
改善された結合を有する候補はシークエンシングされてもよく、それにより、改善された親和性を結果としてもたらすＣＤＲ置換突然変異体（「改善型」置換とも称される）が同定され得る。結合する候補もまたシークエンシングされてもよく、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換が同定され得る。
複数ラウンドのスクリーニングが実行されてもよい。例えば、改善された結合を有する候補（各々は１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置においてアミノ酸置換を含む）はまた、各々の改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）において少なくとも元々のおよび置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリーの設計のために有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択は、以下においてさらに議論される。
ライブラリースキャニング突然変異誘発はまたＣＤＲを特徴付けるための手段を提供し、これは、改善された結合、同じ結合、減少した結合または無結合を有するクローンの頻度が、抗体－抗原複合体の安定性のための各々のアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りにおいて該当する。例えば、ＣＤＲの位置が、２０個すべてのアミノ酸に変更された場合に結合を保持する場合に、その位置は、抗原結合のために要求される可能性が低い位置として同定される。反対に、ＣＤＲの位置が低いパーセンテージの置換においてのみ結合を保持する場合に、その位置は、ＣＤＲ機能にとって重要な位置として同定される。そのため、ライブラリースキャニング突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０個すべてのアミノ酸を含む）に変更され得るＣＤＲ中の位置、および変更され得ないかまたは数個のアミノ酸にのみ変更され得るＣＤＲ中の位置に関する情報を生成する。
改善された親和性を有する候補は第２のライブラリーにおいて組み合わせられてもよく、第２のライブラリーは、改善されたアミノ酸、その位置における元々のアミノ酸を含み、所望されるか、または所望されるスクリーニングもしくは選択方法を使用して許容されるライブラリーの複雑性に依存して、その位置における追加の置換をさらに含んでもよい。追加的に、所望される場合、隣接するアミノ酸位置は、少なくとも２つまたはより多くのアミノ酸に無作為化され得る。隣接するアミノ酸の無作為化は、突然変異体ＣＤＲにおける追加のコンフォメーション柔軟性を許容することがあり、それは次いで、より多くの数の改善性突然変異の導入を許容または促進し得る。ライブラリーはまた、第１ラウンドのスクリーニングにおいて改善された親和性を示さなかった位置において置換を含んでもよい。
第２のライブラリーは、Ｋｉｎｅｘａ（商標）バイオセンサー分析を使用するスクリーニング、ならびに、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む、選択のための当技術分野において公知の任意の方法を使用する選択を含む、当技術分野において公知の任意の方法を使用して改善および／または変更された結合親和性を有するライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
本発明の抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片が、上記される方法のいずれかを使用して最初に得られ得る。様々な改変、例えば突然変異、欠失、および／または付加もまた、当業者に公知の標準的な方法を使用してＤＮＡ配列に導入され得る。例えば、突然変異誘発は、標準的な方法、例えばＰＣＲ媒介突然変異誘発を使用して実行可能であり、その場合、突然変異型ヌクレオチドがＰＣＲプライマーに組み込まれ、その結果、ＰＣＲ生成物は、所望される突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有する。
抗体のアミノ酸配列は、抗体の他に、増強または減少された活性および／または親和性を有するバリアントの特性に重大に影響しない機能的に同等の可変領域および／またはＣＤＲを含むように改変され得る。そのような改変の例は、アミノ酸残基の保存的置換、抗体の機能的活性を重大に有害に変化させないか、またはその標的抗原に対する抗体の親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つまたは複数の欠失または付加を含む。
アミノ酸配列挿入は、１個の残基から１００個またはより多くの残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲に及ぶアミノおよび／またはカルボキシル末端融合の他に、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、血液循環中での抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの、抗体のＮまたはＣ末端への融合を含む。
置換バリアントは、除去された抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発のための最大の関心対象となる部位は超可変領域を含むが、フレームワーク変更もまた企図される。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表１に示される。そのような置換が生物学的活性における変化を結果としてもたらす場合、表１において「例示的な置換」と命名されているか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されているより実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされてもよい。
Figure 2023100255000001
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の区画におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、β－シートもしくはらせん状コンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に関する効果において重大に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷を有しない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負荷電性）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正荷電性）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することによりなされる。
例えば、なされ得る置換の１つの種類は、化学的に反応性であってもよい、抗体中の１つまたは複数のシステインを別の残基、例えば、限定なく、アラニンまたはセリンに変化させることである。例えば、非カノニカルなシステインの置換を行うことができる。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または抗体の定常領域中でなされ得る。一部の実施形態では、システインはカノニカルものである。抗体の適正なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を予防するために、一般にセリンで置換されてもよい。反対に、特には抗体が抗体断片、例えばＦｖ断片の場合に、その安定性を改善するために、システイン結合が抗体に付加されてもよい。
抗体はまた、例えば、抗体の結合特性を変更するために、例えば重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて改変されてもよい。可変領域中の変化は、結合親和性および／または特異性を変更することができる。一部の実施形態では、１～５個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内でなされる。他の実施形態では、１～３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内でなされる。例えば、突然変異は、Ｂ７－Ｈ４に対する抗体のＫＤを増加もしくは減少させるため、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を変更するためにＣＤＲ領域の１つまたは複数においてなされてもよい。部位特異的突然変異誘発における技術は当技術分野において周知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上掲を参照。
改変または突然変異はまた、Ｂ７－Ｈ４抗体の半減期を増加させるためにフレームワーク領域または定常領域中でなされてもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開第００／０９５６０号パンフレットを参照。フレームワーク領域または定常領域中の突然変異はまた、抗体の免疫原性を変更するため、別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体固定、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性のような特性を変更するためになされ得る。一部の実施形態では、１～５個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内でなされる。他の実施形態では、１～３個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内でなされる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のいずれか１つもしくは複数においてまたは定常領域において突然変異を有してもよい。
組換え抗体 － グリコシル化修飾：
本明細書において提供される抗体の改変はまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドの他に、他の翻訳後修飾、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などを有するポリペプチドを含む。抗体は、それらの定常領域中の保存された位置においてグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６５：１１１～１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６～３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：１３１１～１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９：４１７５～４１８０）および糖タンパク質の部分の間の分子内相互作用に影響し、後者は、糖タンパク質のコンフォメーションおよび提示される３次元表面に影響し得る（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上掲；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７：４０９～４１６）。オリゴ糖はまた、特有の認識構造に基づいて所与の糖タンパク質をある特定の分子に標的化するために役立ち得る。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響することが報告されている。特に、二分岐ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を有するＣＨＯ細胞により産生される抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６～１８０）。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の取り付けを指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、およびアスパラギン－Ｘ－システイン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的取り付けのための認識配列である。そのため、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの取り付けを指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を、それが上記されるトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するように変更することにより達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。変更はまた、元々の抗体の配列における１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれによる置換によりなされてもよい（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。
抗体のグリコシル化パターンはまた、基礎となるヌクレオチド配列を変更することなく変更されてもよい。グリコシル化は、概しては、抗体を発現させるために使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現のために使用される細胞タイプがネイティブな細胞であることはめったにないので、抗体のグリコシル化パターンにおけるバリエーションは予想され得る（例えばＨｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：９０６２～９０７０を参照）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響する要因は、増殖モード、培地処方、培養密度、酸素添加、ｐＨ、および精製スキームなどを含む。オリゴ糖生成に関与するある特定の酵素の導入または過剰発現を含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号明細書；同第５，５１０，２６１号明細書および同第５，２７８，２９９号明細書）。グリコシル化、またはある特定の種類のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ－グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去され得る。追加的に、組換え宿主細胞は、ある特定の種類の多糖の処理において欠陥性であるように遺伝子操作され得る。これらのおよび類似した技術は当技術分野において周知である。
修飾の他の方法は、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の連結技術を使用することを含む。修飾は、例えば、イムノアッセイ用の標識の取り付けのために使用され得る。修飾されたポリペプチドは、当技術分野において確立された手順を使用して作製され、その一部が以下および実施例において記載される、当技術分野において公知の標準的なアッセイを使用してスクリーニングされ得る。
組換え抗体 － 生殖系列化：
「生殖系列化」（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）として公知のプロセスにおいて、ＶＨおよびＶＬ配列中のある特定のアミノ酸は、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中に天然に見出されるものにマッチするように突然変異され得る。特に、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体が投与された場合の免疫原性のリスクを低減させるために生殖系列配列にマッチするように突然変異され得る。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は当技術分野において公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６～７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：８２７～８３６も参照）。
組換え抗体 － 易分解性部位の除去：
なされ得る別の種類のアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または定常領域中に存在してもよい。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物における不均質性のリスクを減少させ、そのためその均質性を増加させ得る。別の種類のアミノ酸置換は、残基の１つまたは両方を変更することにより、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン－グリシンペアを排除することである。別の例において、本発明の抗体の重鎖のＣ末端リジンは切断され得る。本発明の様々な実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を含んでもよい。
組換え抗体 － 様々な形態：
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらにマニピュレートされ得る。これらのマニピュレーションにおいて、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば抗体定常領域または柔軟性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」という用語は、この文脈において使用される場合、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように接合されることを意味することが意図される。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られ得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体の間で起こることが既知である様々なアレルまたはアロタイプ、例えばＧｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）のいずれかであり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を表す。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれに由来してもよい。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られ得る。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。カッパ定常領域は、異なる個体の間で起こることが既知である様々なアレル、例えばＩｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）のいずれかであってもよい。ラムダ定常領域は、３つのラムダ遺伝子のいずれに由来してもよい。
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結され、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟性リンカーにより接合された、連続する一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５４を参照）。連結ペプチドの例は（ＧＧＧＧＳ）３であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍをブリッジする。他の配列のリンカーが設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上掲）。リンカーは次いで、追加の機能、例えば薬物の取り付けまたは固体支持体への取り付けのために改変され得る。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合に、一価、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合に、二価、または２つより多くのＶＨおよびＶＬが使用される場合に、多価であってもよい。標的抗原、例えばＢ７－Ｈ４、および別の分子に特異的に結合する二特異性または多価抗体が生成されてもよい。単鎖バリアントは、組換えまたは合成のいずれかにより産生され得る。ｓｃＦｖの合成的産生のために、自動合成装置が使用され得る。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドが、真核性、例えば酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞、または原核性、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれかの、好適な宿主細胞に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、常用のマニピュレーション、例えばポリヌクレオチドのライゲーションにより作製され得る。結果的なｓｃＦｖは、当技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離され得る。
他の形態の単鎖抗体、例えばダイアボディもまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、該ドメインが別の鎖の相補的なドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作り出すことを強制する、二価、二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３を参照）。
２つの共有結合的に接合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。そのような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号明細書）、ならびにＨＩＶ感染症の処置（ＰＣＴ国際公開第９１／００３６０号パンフレットおよび国際公開第９２／２００３７３号パンフレット；欧州特許第０３０８９号明細書）のために使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製されてもよい。好適な架橋剤および技術は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記載されている。
キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学の公知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されてもよい。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成させることにより構築されてもよい。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル－４－メルカプトブチルイミデートを含む。
別のポリペプチドに連結されたモノクローナル抗体の全体または部分を含む融合抗体が作製されてもよい。一部の実施形態では、抗体の可変ドメインのみが他のポリペプチドに連結される。別の実施形態では、抗体のＶＨドメインは第１のポリペプチドに連結されると共に、抗体のＶＬドメインは第２のポリペプチドに連結され、ＶＨおよびＶＬドメインが互いと相互作用して抗原結合部位を形成できるような方式において第２のポリペプチドは第１のポリペプチドと会合する。別の好ましい実施形態では、ＶＨドメインは、リンカーによりＶＬドメインから分離されており、その結果、ＶＨおよびＶＬドメインは互いと相互作用することができる。ＶＨ－リンカー－ＶＬ抗体は次に、目的の他のポリペプチドに連結される。追加的に、２つ（またはより多く）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体が作り出され得る。単一のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出すことを望む場合、または二重特異性抗体を作り出すことを望む場合に、これは有用である。
融合抗体は、当技術分野において公知の方法により、例えば、合成的にまたは組換えにより、作り出され得る。典型的には、融合抗体は、本明細書に記載される組換え法を使用してそれらをコードするポリヌクレオチドを調製し、発現させることにより作製されるが、それらはまた、例えば、化学合成を含む、当技術分野において公知の他の手段により調製されてもよい。
他の実施形態では、他の改変された抗体は、抗体をコードする核酸分子を使用して調製されてもよい。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０：９４９～５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ． １３：５３０３～９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上掲）、または「ジャヌシン」（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５－３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．） ７：５１～５２）は、標準的な分子生物学技術を使用して本明細書の教示に従って調製されてもよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照）。例えば、二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結により産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５～３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７～１５５３を参照。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの共発現に基づくものであった（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７～５３９）。追加的に、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン」として形成されてもよい。
二重特異性抗体を作製するための１つのアプローチによれば、所望される結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域とでなされる。軽鎖結合のために必要な部位を含有する、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合物の少なくとも１つにおいて存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、所望される場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これは、構築において使用される等しくない比の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する実施形態では３つのポリペプチド断片の相互の割合の調整における大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率を結果としてもたらす場合または比が特に重大性を持たない場合に２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のためのコーディング配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体は、１つのアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペア（第２の結合特異性を提供する）から構成される。二特異性分子の１つの半分においてのみ免疫グロブリン軽鎖を有する、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望される二特異性化合物の分離を促す。このアプローチは、ＰＣＴ国際公開第９４／０４６９０号パンフレットに記載されている。
固体支持体に連結するための薬剤にコンジュゲートされた抗体
本発明はまた、固体支持体への連結を促す薬剤（例えばビオチンまたはアビジン）にコンジュゲート（例えば、連結）された抗体を含む組成物を提供する。簡便性のために、これらの方法は本明細書に記載される抗体の実施形態のいずれにも適用されるという理解と共に、参照は一般に抗体に対してなされる。コンジュゲーションは、本明細書に記載されているこれらの成分を連結することを一般に指す。連結（これらの成分を少なくとも投与のために近接した会合状態において一般に固定することである）は、多数の仕方で達成され得る。例えば、薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応する能力を有する置換基を有する場合に可能である。例えば、一方における求核基、例えばアミノまたはスルフヒドリル基は、他方におけるカルボニル含有基、例えば無水物もしくは酸ハロゲン化物、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応する能力を有し得る。
抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は活性および／または不活性であり得る。周知の担体の例は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびにマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者は、抗体に結合するための他の好適な担体を知っているか、または、常用の実験を使用して、それを確認することができる。一部の実施形態では、担体は、肺、心臓、または心臓弁を標的化する部分を含む。
本発明の抗体またはポリペプチドは、標識化剤、例えば蛍光分子、放射性分子または当技術分野において公知の任意の他の標識に連結されてもよい。シグナルを一般に（直接的または間接的のいずれかで）提供する標識は当技術分野において公知である。
Ｂ７－Ｈ４抗体
本発明は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体（「Ｂ７－Ｈ４抗体」）を提供する。本発明のＢ７－Ｈ４抗体は、以下の特徴：（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてプレートに結合したＢ７－Ｈ４に結合すること；（ｂ）細胞ベースのアッセイにおいてＢ７－Ｈ４発現腫瘍細胞に結合すること；（ｃ）腫瘍細胞がＢ７－Ｈ４を発現する場合にＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅における活性を呈すること；（ｄ）Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性腫瘍を有する対象において腫瘍成長または進行を阻害すること；（ｅ）対象においてＢ７－Ｈ４を発現する悪性細胞と関連する状態の１つまたは複数の症状を処置し、予防し、寛解させることのいずれか１つを呈するべきである。
Ｂ７－Ｈ４抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により作製されてもよい。表２は、例示的な本発明のＢ７－Ｈ４抗体を記載する。表２に列記されるＶＨ ＣＤＲ１（重鎖可変領域ＣＤＲ１）の各々はＡｂＭ ＣＤＲ定義によるものである。表２に列記されるＶＨ ＣＤＲ２（重鎖可変領域ＣＤＲ２）、ＶＨ ＣＤＲ３（重鎖可変領域ＣＤＲ３）、ＶＬＣＤＲ１（軽鎖可変領域ＣＤＲ１）、ＶＬ ＣＤＲ２（軽鎖可変領域ＣＤＲ２）、ＶＬＣＤＲ３（軽鎖可変領域ＣＤＲ３）配列の各々はＫａｂａｔ ＣＤＲ定義によるものである。
よって、一部の実施形態では、本発明は、表２に記載されるＢ７－Ｈ４抗体のいずれか１つを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４抗体、またはＢ７－Ｈ４に結合するそのバリアント、またはＢ７－Ｈ４に結合するその抗原結合断片であって、Ｂ７－Ｈ４抗体が、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬを含むものを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４抗体、またはＢ７－Ｈ４に結合するそのバリアント、またはＢ７－Ｈ４に結合するその抗原結合断片であって、Ｂ７－Ｈ４抗体が、
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３であって、６つのＣＤＲの各々が、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲと同じアミノ酸配列を有するもの、
（ｉｉ）表２に記載される抗体のいずれかのＶＨの３つのＣＤＲ、または
（ｉｉｉ）表２に記載される抗体のいずれかのＶＬの３つのＣＤＲ
を含み、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組み合わせ（「組み合わせＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも称される）に従って定義されるものを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４抗体、またはＢ７－Ｈ４に結合するそのバリアント、またはＢ７－Ｈ４に結合するその抗原結合断片であって、Ｂ７－Ｈ４抗体が、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらの各々が、表２に記載される抗体のいずれかの表２に列記される対応するＣＤＲと同じアミノ酸配列を有するものを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、表２に記載される抗体のいずれか１つとＢ７－Ｈ４への結合について競合するＢ７－Ｈ４抗体を提供する。
Figure 2023100255000002
Figure 2023100255000003
表３は、表２に列記されるＢ７－Ｈ４抗体、表４に列記されるＣＤ３抗体および表５に列記されるＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含む、本発明の例示的な抗体の配列を、対応する配列識別子と共に、ならびに本発明の抗体を生成または試験するために使用されたＢ７－Ｈ４細胞外ドメインの配列を示す。いくつかのＶＨおよびＶＬ配列、すなわち、配列番号１０６、１０８、１３９、１６１、１６７および１７２のＫａｂａｔ ＣＤＲは、下線を引いたアミノ酸配列として標識されており、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは太字のアミノ酸配列として標識されている。表２、表４および表５に記載される配列の他に、以下は、表３に含まれる一部の追加の配列の説明である。
配列番号１はヒトＢ７－Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２はカニクイザルＢ７－Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３はマウスＢ７－Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４はラットＢ７－Ｈ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
抗体１１５６および抗体１１６７はＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体であり；両方は表５に記載されている。
配列番号１８６および１８７のそれぞれは、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）の全長重鎖および全長軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１８８および１８９のそれぞれは、二重特異性抗体１１５６、および二重特異性抗体１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）のそれぞれ全長重鎖および全長軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１９０および１９１のそれぞれは、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のそれぞれ全長重鎖および全長軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１９２は、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）の全長重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９３は、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）の全長軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９４は、二重特異性抗体１１５６および１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）の全長重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９５は、二重特異性抗体１１５６および１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）の全長軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９６は、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）の全長重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９７は、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）の全長軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９８は、本明細書における抗体を作製する一般的方法において記載される（ＧＧＧＧＳ）３ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号１９９は、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＫａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２００は、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２０１は、二重特異性抗体１１５６の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２の配列である。
配列番号２０２は、二重特異性抗体１１５６および二重特異性抗体１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）のＫａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２０３は、二重特異性抗体１１５６および二重特異性抗体１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２０４は、二重特異性抗体１１５６および二重特異性抗体１１６７の第２のアーム（ＣＤ３アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２の配列である。
配列番号２０５は、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＫａｂａｔ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２０６は、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ１の配列である。
配列番号２０７は、二重特異性抗体１１６７の第１のアーム（Ｂ７－Ｈ４アーム）のＣｈｏｔｈｉａ ＶＨ ＣＤＲ２の配列である。
配列番号２０８は、ヒトＩｇＧ２野生型ＩＧＨＧ２＊０１の定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号２０９は、ヒトＩｇＧ１野生型ＩＧＨＧ１＊０１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号２１０は、ヒトＩｇＧ４野生型ＩＧＨＧ４＊０１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸配列である。
ＩＧＨＧ２＊０１、ＩＧＨＧ１＊０１およびＩＧＨＧ４＊０１は、ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅ－ＤＢのヒトＩＧＨＣ群によるものである（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３：Ｄ２５６～Ｄ２６１（２００５））。
Figure 2023100255000004
Figure 2023100255000005
Figure 2023100255000006
Figure 2023100255000007
Figure 2023100255000008
Figure 2023100255000009
Figure 2023100255000010
Figure 2023100255000011
Figure 2023100255000012
Figure 2023100255000013
Figure 2023100255000014
Figure 2023100255000015
Figure 2023100255000016
Figure 2023100255000017
一部の実施形態では、本発明はまた、ＣＤＲ接触領域に基づくＢ７－Ｈ４抗体のＣＤＲ部分を提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する抗体の特異性をもたらす抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域は、ＣＤＲ中、および、抗体が特異的な抗原に結合するための適正なループ構造を維持するために制約されているベルニエゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅｓ）中の残基位置を含む。例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８３：１１５６～１１６６、２００７を参照。ＣＤＲ接触領域の決定は十分に当技術分野の技術的範囲内である。
Ｂ７－Ｈ４、例えばｈＢ７－Ｈ４の細胞外ドメインに対する本明細書に記載されているＢ７－Ｈ４抗体の結合親和性（ＫＤ）は約０．００２ｎＭ～約６５００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、おおよそ、６５００ｎｍ、６０００ｎｍ、５９８６ｎｍ、５５６７ｎｍ、５５００ｎｍ、４５００ｎｍ、４０００ｎｍ、３５００ｎｍ、３０００ｎｍ、２５００ｎｍ、２１３４ｎｍ、２０００ｎｍ、１５００ｎｍ、１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎＭ、１９３ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎｍ、１８ｎｍ、１７ｎｍ、１６ｎｍ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００２ｎＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、おおよそ、約６５００ｎｍ、６０００ｎｍ、５５００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍ、２０００ｎｍ、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭのいずれかより低い。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４抗体は全長ヒト抗体である。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４抗体は単鎖可変領域抗体（ｓｃＦｖ）である。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４抗体はダイアボディまたはミニボディである。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４抗体は、Ｂ７－Ｈ４に結合する抗原結合部分を含む融合タンパク質であって、抗原結合部分が、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、６つのＣＤＲの各々が、表２に記載される抗体の対応するＣＤＲと同じアミノ酸配列を有するものである。
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する細胞外ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む単鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）を含み、６つのＣＤＲの各々は、表２に記載される抗体の対応するＣＤＲと同じアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、本明細書に開示される抗体のいずれかを作製する方法を提供する。本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知の手順により作製されてもよい。
Ｂ７－Ｈ４抗体コンジュゲート
本発明はまた、本明細書に記載されているＢ７－Ｈ４抗体、またはその抗原結合断片のコンジュゲート（またはイムノコンジュゲート）であって、抗体または抗原結合断片が、直接的にまたはリンカーを介して間接的に標的化された免疫療法のための薬剤（例えば、細胞傷害剤）にコンジュゲートされているもの（例えば、抗体－薬物コンジュゲート）を提供する。例えば、細胞傷害剤は、腫瘍（例えば、Ｂ７－Ｈ４発現腫瘍）への細胞傷害剤部分の標的化された局所送達のために本明細書に記載されているＢ７－Ｈ４抗体またはその抗原結合断片に連結またはコンジュゲートされ得る。
抗体に細胞傷害剤または他の治療剤をコンジュゲートする方法は様々な刊行物に記載されている。例えば、化学修飾は、リジン側鎖アミンを通じて、またはコンジュゲーション反応が起こるように鎖間ジスルフィド結合を還元することにより活性化されたシステインスルフヒドリル基を通じて抗体においてなされ得る。例えば、Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２０９２～２０９６、２００５、およびＧｅｎｔｌｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １５：６５８～６６３、２００４を参照。定義された化学量論での特有の薬物コンジュゲーションのために抗体の特有の部位において操作された反応性システイン残基もまた記載されている。例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６：９２５～９３２、２００８を参照。トランスグルタミナーゼおよびアミン（例えば、反応性アミンを含むかまたはそれに取り付けられた細胞傷害剤）の存在下でポリペプチド操作により反応性（すなわち、アシルドナーとして共有結合を形成する能力）とされたアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンを使用するコンジュゲーションもまた国際公開第２０１２／０５９８８２号パンフレットおよび国際公開第２０１５０１５４４８号パンフレットに記載されている。
本発明のＢ７－Ｈ４抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされ得る薬剤は、細胞傷害剤、免疫調節剤、イメージング剤、治療用タンパク質、バイオポリマー、またはオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
Ｂ７－Ｈ４抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされ得る細胞傷害剤の例は、アントラサイクリン、アウリスタチン、ドラスタチン、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノ－ベンゾジアゼピン二量体、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、チューブリシン、ヘミアスタリン、スプリセオスタチン、プラジエノライド、およびこれらの立体異性体、アイソスター、アナログ、または誘導体を含むが、これらに限定されない。
Ｂ７－Ｈ４抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされ得る免疫調節剤の例は、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メソトレキセート、グルココルチコイドおよびそのアナログ、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン－α、－βおよび－γ）、「Ｓ１因子」と呼称される幹細胞増殖因子、エリスロポエチンならびにトロンボポエチン、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
Ｂ７－Ｈ４抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされ得るイメージング剤（例えば、フルオロフォアまたはキレーター）の例は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ランタニドリン光体、およびそれらの誘導体、またはキレーターに結合した放射性同位体である。フルオロフォアの例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば、５－ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば、５－ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば、５－ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えば、ＳＲ１０１）を含むが、これらに限定されない。キレーターの例は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（デフェロキサミン）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸）（ＢＡＰＴＡ）を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、薬剤は、毒素、ホルモン、酵素、および増殖因子を含むが、これらに限定されない、治療用タンパク質である。
毒素タンパク質（またはポリペプチド）の例は、ジフテリア（例えば、ジフテリアＡ鎖）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシンおよびエンドトキシン、リシン（例えば、リシンＡ鎖）、アブリン（例えば、アブリンＡ鎖）、モデシン（例えば、モデシンＡ鎖）、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン－Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア菌毒素、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、トリコテセン、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えば、セラトトキシン）、ならびにコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、薬剤は生体適合性ポリマーである。本明細書に記載されているＢ７－Ｈ４抗体または抗原結合断片は、血清半減期および生物活性を増加させるため、ならびに／またはｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するために生体適合性ポリマーにコンジュゲートされ得る。生体適合性ポリマーの例は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体および双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）を含む。
一部の実施形態では、薬剤は、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ＣＤ３抗体
本発明はさらに、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に結合する抗体を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する単離された抗体であって、
ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１７８のアミノ酸配列の重鎖定常領域（ＣＨ）および配列番号１２のアミノ酸配列の軽鎖定常領域（ＣＬ）；
ｂ）配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１８０のアミノ酸配列のＣＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列のＣＬ；
ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１８０のアミノ酸配列のＣＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列のＣＬ；
ｄ）配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１８２のアミノ酸配列のＣＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列のＣＬ；
ｅ）配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１８４のアミノ酸配列のＣＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列のＣＬ；または
ｆ）配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨ、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬ、配列番号１７８のアミノ酸配列のＣＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列のＣＬ
を含む、抗体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を含み、各々が、表４に列記される抗体のいずれか１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体であって、表４に列記される抗体のいずれか１つのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を各々が有するＶＨおよびＶＨを含む、抗体を提供する。
表４は、本発明の例示的なＣＤ３抗体を記載する。
Figure 2023100255000018
Ｂ７－Ｈ４二重特異性抗体
本発明はまた、Ｂ７－Ｈ４および第２の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
第２の抗原
一部の実施形態では、第２の抗原は、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原である。ヒトエフェクター細胞上のエフェクター抗原の概念は当技術分野において周知である。例示的なエフェクター抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ－４６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ６４、およびＣＤ８９を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、第２の抗原はＣＤ３である。
一部の実施形態では、第２の抗原は、標的細胞上の標的抗原（Ｂ７－Ｈ４以外）であり得、標的細胞は、ヒトにとってネイティブなまたは外来的な細胞であり得る。ネイティブな標的細胞において、細胞は、悪性細胞に形質転換されているか、または病的に改変されている（例えば、ウイルス、プラスモジウム、もしくは細菌に感染したネイティブな標的細胞）ものであってもよい。外来的な標的細胞において、細胞は、侵入病原体、例えば細菌、プラスモジウム、またはウイルスである。
標的抗原は、疾患状態（例えば、炎症性疾患、増殖性疾患（例えば、がん）、免疫学的障害、神経学的疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患（例えば、ウイルス感染症または寄生生物感染症）、アレルギー性反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病）にある標的細胞上に発現される。標的抗原はエフェクター抗原ではない。標的抗原の例は、Ｂ７－Ｈ４、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＣＣＲ５（ケモカイン受容体５型）、ＣＤ１９、ＨＥＲ（ヒト上皮増殖因子受容体）－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＣＩｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９－Ｏ－アセチル－ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｈｈ（ソニックヘッジホッグ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ－アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカーおよびＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアル酸付加Ｔｎ抗原；ＴＡＧ－７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳならびにＣＤ６３を含むが、これらに限定されない。
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体
以下の表５は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する例示的な本発明の二重特異性抗体（「Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体」）の第１のアームおよび第２のアームの両方のＣＤＲ、定常領域および可変領域の配列番号を提供する。
Figure 2023100255000019
Figure 2023100255000020
Figure 2023100255000021
Figure 2023100255000022
Figure 2023100255000023
表５における二重特異性抗体の各々は、２つのアーム：Ｂ７－Ｈ４に結合する第１のアーム、およびＣＤ３に結合する第２のアームを含む。第１のアームおよび第２のアームの両方の、重鎖ＣＤＲ（ＶＨ ＣＤＲ）、軽鎖ＣＤＲ（ＶＬ ＣＤＲ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）の各々のアミノ酸配列の配列番号が表５に示されている。（表５に列記される配列番号の各々のアミノ酸配列は、本明細書における先行するセクションにおける表３に記載されている。）表５におけるＶＨ ＣＤＲ１配列の各々はＡｂＭ定義によるものであり、表５に列記されるＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３配列の各々はＫａｂａｔ定義によるものである。
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第１の軽鎖および第１の重鎖、ならびに第２の軽鎖および第２の重鎖を含み、第１の軽鎖および第１の重鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のアームを形成し、第２の軽鎖および第２の重鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のアームを形成する、二重特異性抗体を提供する。
一部の実施形態では、第１の重鎖はＶＨおよびＣＨを含み、第１の軽鎖はＶＬおよびＣＬを含み、第２の重鎖はＶＨおよびＣＨを含み、第２の軽鎖はＶＬおよびＣＬを含み、第１および第２の重鎖ＶＨおよびＣＨならびに第１および第２の軽鎖ＶＬおよびＣＬは、表５に列記される二重特異性抗体のいずれかのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１の軽鎖はＶＬを含み、第１の重鎖はＶＨを含み、第２の軽鎖はＶＬを含み、第２の重鎖はＶＨを含み、第１および第２の重鎖ならびに第１および第２の軽鎖のＶＨおよびＶＬの各々は、表５に列記される二重特異性抗体のいずれか１つのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、第１の軽鎖は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、第１の重鎖は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、第２の軽鎖は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、第２の重鎖は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、本発明の二重特異性抗体の第１のアームおよび第２のアームのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３の各々は、表５に記載される二重特異性抗体のいずれか１つのそれぞれ第１のアームおよび第２のアームのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組み合わせ（「組み合わせＣＤＲ」もしくは「拡張ＣＤＲ」とも称される）に従って定義される。
Ｂ７－Ｈ４抗体、ＣＤ３抗体およびＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体の定常領域
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は１つまたは複数の定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、例えば、全長ヒト抗体であり得る。一部の実施形態では、全長ヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性のＦｃ領域を含むことができる。
他に指定されなければ、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の定常領域の本明細書におけるすべての番号付けは、ＥＵ番号付けスキームによるものであり、それぞれ野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に関する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２領域の番号付けは、図１に記載および例示される通りである。ＩｇＧ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４について図１において使用される配列は、ＩＭＧＴ／Ｇｅｎｅ－ＤＢ（ＩＭＧＴ／遺伝子－ＤＢ：Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３：Ｄ２５６～Ｄ２６１（２００５）． ＰＭＩＤ：１５６０８１９１）のヒトＩＧＨＣ群からのＩＧＨＧ２＊０１、ＩＧＨＧ１＊０１およびＩＧＨＧ４＊０１のＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３領域である。
一部の実施形態では、ＦｃはヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５への突然変異（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０ ５８５～５９３）を含むＩｇＧ４（ＩｇＧ４Δｃ）の定常領域を含むことができる。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、欠失Ｇ２３６を有するＥ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へのヒトＩｇＧ４（ＩｇＧ４Δｂ）であり得る。一部の実施形態では、Ｆｃは、Ｓ２２８からＰ２２８へのヒンジ安定化突然変異を含有する任意のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ΔｂまたはＩｇＧ４Δｃ）であり得る（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５、９～１９）。
一部の実施形態では、ＦｃはヒトＩｇＧ２ Ｆｃである。一部の実施形態では、Ｆｃは、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異を含有するヒトＩｇＧ２（ＩｇＧ２Δａ）であり、ここでおよび本段落の残りにおいて、アミノ酸残基は、野生型ヒトＩｇＧ２配列を参照しておよびＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされる。（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３～２６２４）。一部の実施形態では、Ｆｃは、Ｄ２６５Ａの置換を有するヒトＩｇＧ２Δａ Ｆｃである。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域中の２２３、２２５、および２２８位（例えば、（Ｃ２２３ＥまたはＣ２２３Ｒ）、（Ｅ２２５Ｒ）、および（Ｐ２２８ＥまたはＰ２２８Ｒ））ならびにＦｃ中、ＣＨ３領域中の４０９または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ）における突然変異をさらに含有する。図１は、ＥＵ番号付けスキームを組み込んだ、本明細書において使用されるヒトＩｇＧ２定常領域の特有の番号付けを示す。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体に対する増加もしくは減少した結合親和性を有するか、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解をトリガーしないか、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しないか、もしくはミクログリアを活性化させないか；または以下：補体媒介性溶解をトリガーすること、ＡＤＣＣを刺激すること、もしくはミクログリアを活性化させることのいずれか１つもしくは複数において（非改変抗体と比較して）低減した活性を有する、改変された定常領域を含む。定常領域の異なる改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組み合わせを達成してもよい。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９～３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３～４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８～４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５～２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９～７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３～２６２４；ＰＣＴ国際公開第９９／０５８５７２号パンフレットに記載されるように改変されている。
一部の実施形態では、本発明の抗体の定常領域は、Ｆｃガンマ受容体および補体および免疫系との相互作用を回避するために改変され得る。そのような定常領域を有する抗体の調製のための技術は、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに記載されている。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置において使用される場合に免疫応答を回避するためにヒト定常領域により似るように操作されてもよい。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号明細書および同第５，８６６，６９２号明細書を参照。
一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合グリコシル化のために非グリコシル化される。一部の実施形態では、定常領域は、オリゴ糖取り付け残基および／または定常領域中のＮ－グリコシル化認識配列の部分である隣接残基を突然変異させることによりＮ結合グリコシル化のために非グリコシル化される。例えば、Ｎ－グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えば、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異されてもよい。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５～２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９～７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合グリコシル化のために非グリコシル化される。定常領域は、酵素的に（例えば酵素ＰＮＧａｓｅによる炭水化物の除去）、またはグリコシル化欠損宿主細胞中での発現によりＮ結合グリコシル化のために非グリコシル化されてもよい。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＰＣＴ国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに記載されている定常領域改変を含む。これらの抗体は、標的分子に方向付けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域の全体または部分に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の重大な補体依存性溶解、または細胞媒介性分解をトリガーすることなく標的分子に結合する能力を有する。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する能力を有する。これらは、典型的には、２つまたはより多くのヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この方式において改変された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症性のおよび他の有害な反応を回避するために、慢性抗体療法における使用のために特に好適である。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、非改変の抗体と比較して増加したＦｃＲｎに対する結合親和性および／または増加した血清半減期を有する改変された定常領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、および配列番号１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１２または配列番号１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体は、第１の重鎖および第２の重鎖を含み、重鎖の各々はヒンジ領域を含有する。一部の実施形態では、重鎖のうちの１つのヒンジ領域はアミノ酸改変を含有し、置換するアミノ酸は、二重特異性抗体の他の重鎖のヒンジ領域中の対応するアミノ酸と反対の電荷を有する。このアプローチは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレット）に記載されている。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体は、第１および第２の免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含み、二重特異性抗体は、第１および第２の免疫グロブリン様Ｆｃ領域の間のインターフェース（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）を変更または操作することにより増強される。このアプローチにおいて、二重特異性抗体はＣＨ３領域から構成されていてもよく、ＣＨ３領域は、一緒になるように相互作用してＣＨ３インターフェースを形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、ＣＨ３インターフェース内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体形成を不安定化させ、ホモ二量体形成にとって静電気的に不都合ではない。このアプローチは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレット）に記載されている。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ７－Ｈ４に対して方向付けられた抗体アームに対して操作されたグルタミン含有ペプチドタグおよび第２の抗原に対して方向付けられた抗体アームに対して操作された別のペプチドタグ（例えば、Ｌｙｓ含有ペプチドタグまたは反応性の内因性Ｌｙｓ）を含む。このアプローチは、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８９９（国際公開第２０１２／０５９８８２号パンフレット）に記載されている。
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第１の軽鎖および第１の重鎖、ならびに第２の軽鎖および第２の重鎖を含む、全長ヒト抗体を含み、第１の軽鎖および第１の重鎖は、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、第２の軽鎖および第２の重鎖は、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成する第２の抗体アームを形成する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は全長ヒトＩｇＧ２である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異を含有する全長ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Δａ）である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Ｄ２６５Ａの突然変異をさらに含むヒトＩｇＧ２Δａである。一部の実施形態では、第１の重鎖は、２２３、２２８および／または３６８位におけるアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、第１の重鎖の２２３、２２８および３６８位におけるアミノ酸改変は、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅおよび／またはＬ３６８Ｅである。一部の実施形態では、第２の重鎖は、２２３、２２５、２２８および／または４０９位におけるアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、第２の重鎖の２２３、２２５、２２８および４０９位におけるアミノ酸改変は、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒおよび／またはＫ４０９Ｒである。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、全長ヒトＩｇＧ２Δａ Ｄ２６５Ａであり、第１の重鎖は、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅのアミノ酸改変をさらに含み、第２の重鎖は、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８ＲおよびＫ４０９Ｒのアミノ酸改変をさらに含む。本明細書におけるすべてのアミノ酸番号付けは、ヒトＩｇＧ２野生型およびＥＵ番号付けスキーム（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３～２６２４）によるものであり、図１に示される通りである。図１は、第１の重鎖定常領域（Ｂ７－Ｈ４結合アーム、上）、第２の重鎖定常領域（ＣＤ３結合アーム、中央）（両方はこの段落に記載されている）、およびヒトＩｇＧ２野生型定常領域（下）のアミノ酸配列のアライメントを描写する。
一部の実施形態では、二重特異性抗体の第１の重鎖は、配列番号１８１または配列番号１７７のアミノ酸配列を含む定常領域を含み、二重特異性抗体の第２の重鎖は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む定常領域を含む。
一部の実施形態では、二重特異性抗体の第１の重鎖および第２の重鎖は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域中の２２１および２２８位（例えば、（Ｄ２２１ＲまたはＤ２２１Ｅ）および（Ｐ２２８ＲまたはＰ２２８Ｅ））ならびにＣＨ３領域中の４０９または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けスキーム））におけるアミノ酸改変を含む。
一部の実施形態では、二重特異性抗体の第１の重鎖および第２の重鎖は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域中の２２８位（例えば、（Ｐ２２８ＥまたはＰ２２８Ｒ））およびＣＨ３領域中の４０９または３６８位（例えば、Ｒ４０９またはＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けスキーム））におけるアミノ酸改変を含む。
Ｂ７－Ｈ４抗体、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体、およびＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含む、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含む、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成を包含する。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であってもよい。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
ポリヌクレオチド
本発明は、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体および本発明のＣＤ３抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞もまた提供する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物などの組成物もまた提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号１９６および配列番号１９７に示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号１９２および配列番号１９３に示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む。さらに一部の実施形態では、組成物は、配列番号１９４および配列番号１９５に示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む。
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子と一対一対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質と連結している場合があるが、その必要はない。
ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、抗体もしくはその部分をコードする内因性配列）を含む場合があり、また、このような配列のバリアントを含む場合がある。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性がネイティブな免疫反応性分子と比べて減少しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書に記載されるように評価され得る。バリアントは、ネイティブな抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列と、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、なおより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大の対応のためにアラインされる場合に同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたり配列を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」は、本明細書に使用する場合、少なくとも約２０個の、通常は３０～約７５または４０～約５０個の連続する位置のセグメントを指し、ここで、配列は、２つの配列が最適にアラインされた後に、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトのパラメーターを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェアＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献中に記載されるいくつかのアラインメントスキームを具体化している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ ５巻、補遺３、３４５～３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ６２６～６４５頁 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１～１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１～１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６～４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６～７３０。
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０個の位置の比較ウインドウにわたって、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５～１５パーセント、または１０～１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を、参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）によって除算し、結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって、計算される。
バリアントは、同様にまたは代替的に、ネイティブ遺伝子、またはその一部分もしくは相補体に対して実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチドバリアントは、ネイティブ抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的な配列）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予洗すること；５０℃～６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイズすること；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×のＳＳＣの各々により６５℃で２０分間、２回洗浄することを含む。
本明細書に使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシーの条件」は、（１）洗浄のために、低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを採用するもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４２℃で、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と共に採用するもの；または（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を採用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃および５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄し、続いて、５５℃でＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を行うもの、である。当業者は、プローブ長さなどの要因に合わせるために必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識している。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つまたは複数の突然変異、例えば、欠失、付加および／または置換の結果として変更された内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を使用して同定され得る。
本発明のポリヌクレオチドを、化学的合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用することができる。
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、本明細書にさらに述べるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクター中に挿入することができ、このベクターを次いで、複製および増幅のために適切な宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接的取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ因子接合（Ｆ－ｍａｔｉｎｇ）またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入された後、外因性ポリヌクレオチドを、非組込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持することができ、または宿主細胞ゲノム中に組込むことができる。そうして増幅されたポリヌクレオチドを、当該分野で周知の方法によって、宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。
あるいは、ＰＣＲが、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを適切な宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、このＲＮＡを、次いで例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されるように、当業者に周知の方法を使用して単離することができる。
ベクター
適切なクローニングベクターは、標準的な技術により構築される場合、または当該分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択される場合がある。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞により変動し得、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、および／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用することができるマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの業者から入手可能である。
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの統合された一部として、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが含意される。適切な発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示される発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ベクター構成成分には、一般に、以下のうち１つまたは複数が含まれ得るが、これらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）。発現（すなわち、翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および終止コドンもまた、通常必要とされる。
目的のポリヌクレオチドを有するベクターを、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を採用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含むいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に依存する場合が多い。
宿主細胞
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞もまた提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することが可能な任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／０４４６２もまた参照のこと。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））および酵母（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、存在する場合、宿主細胞中の目的の対応する内因性抗体またはタンパク質のｃＤＮＡよりも、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。Ｂ７－Ｈ４またはＢ７－Ｈ４ドメイン（例えばドメイン１～４）への特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによってもたらされる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
タンパク質の発現および／または送達
発現ベクターを、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体の発現を指示するために使用することができる。当業者は、外因性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照のこと。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル投与、および外用投与を含む局所または全身投与が含まれる。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に直接、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に投与される。
発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達もまた使用することができる。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６２１、１９８８；Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：５４２、１９９４；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：３６５５、１９９０；およびＷｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：３３８、１９９１に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルにおいて局所投与用ＤＮＡが約１００ｎｇ～約２００ｍｇの範囲で投与される。ＤＮＡの濃度範囲約５００ｎｇ～約５０ｍｇ、約１μｇ～約２ｍｇ、約５μｇ～約５００μｇ、および約２０μｇ～約１００μｇもまた、遺伝子療法プロトコルの間に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起原であり得る（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５１、１９９４；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：８４５、１９９４；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：１４８、１９９４を参照のこと）。このようなコード配列の発現を、内因性哺乳動物または異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞内での発現のためのウイルスベースのベクターは、当技術分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルには、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；ＧＢ特許第２，２００，６５１号；ならびにＥＰ特許第０３４５２４２号を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－６７；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ－９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ－１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ－５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載されているように、死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も採用することができる。
死滅アデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７、１９９２を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５、１９８９を参照のこと）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）および核電荷中和または細胞膜との融合を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達ビヒクルおよび方法も採用することができる。ネイキッドＤＮＡもまた採用することができる。例示的なネイキッドＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４：２４１１、１９９４およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：１５８１、１９９４に記載されている。
ＡＴＣＣ寄託
本発明の代表的な材料は、２０２０年６月１９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託された。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７７９を有するベクターは、二重特異性抗体１１６７の完全長第１重鎖（Ｂ７－Ｈ４アーム）をコードするポリヌクレオチドを含有する。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８１を有するベクターは、二重特異性抗体１１６７の完全長第１軽鎖（Ｂ７－Ｈ４アーム）をコードするポリヌクレオチドを含有する。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８０を有するベクターは、二重特異性抗体１１６７の完全長第２重鎖（ＣＤ３アーム）をコードするポリヌクレオチドを含有する。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８２を有するベクターは、二重特異性抗体１１６７の完全長第２軽鎖（ＣＤ３アーム）をコードするポリヌクレオチドを含有する。
寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下で行われた。これは、寄託の日から３０年間にわたって寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物は、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間での同意を条件として、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣによって入手可能にされ、これは、関連する米国特許の発行の際、または任意の米国もしくは外国の特許出願の公衆への公開の際のいずれか早い方の時点における、公衆への寄託物の培養物の子孫の恒久的かつ無制限の入手可能性を保証し、米国特許商標庁長官が米国特許法１２２条およびそれに従う長官規則（特に８８６ ＯＧ ６３８と関連した米国特許規則１．１４を含む）に従って資格ありと決定した者への子孫の入手可能性を保証する。
本出願の譲受人は、寄託にかかる材料の培養物が、適切な条件下で培養した場合に万一死んだり失われたり破壊されたりしたときには、通知があり次第それらの材料が同一物の別のもので速やかに置き換えられることに同意している。寄託された材料の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限の下で与えられた権利に違反して本発明を実施することの許諾として解釈すべきではない。
本発明の抗体を作製する方法
本発明の抗体は、当技術分野において公知の、および本明細書に記載される、任意の方法によって作製され得る。
例えば、本明細書に記載されるＢ７－Ｈ４抗体は、Ｂ７－Ｈ４への結合が検出および／または測定される、当技術分野において公知の方法を使用して同定または特徴付けすることができる。一部の実施形態では、Ｂ７－Ｈ４抗体は、Ｂ７－Ｈ４を用いて候補薬剤の結合アッセイを行うことによって同定される。結合アッセイは、精製Ｂ７－Ｈ４ポリペプチドを用いて、またはＢ７－Ｈ４ポリペプチドを自然に発現するもしくは発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実行され得る。一実施形態では、結合アッセイは、候補抗体がＢ７－Ｈ４の結合を公知のＢ７－Ｈ４抗体と競合する能力が評価される競合結合アッセイである。アッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含む様々なフォーマットで実行され得る。
最初の同定の後、標的付けられた生物学的活性を試験することが知られているバイオアッセイによって候補Ｂ７－Ｈ４抗体の活性をさらに確認し、精密化することができる。あるいは、バイオアッセイを使用して、候補を直接スクリーニングすることができる。抗体を同定および特徴付けするための方法の一部は、実施例に詳細に記載されている。
Ｂ７－Ｈ４抗体を、当技術分野において周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、一方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９の第１１章に記載されているように、抗体－抗原複合体の結晶構造を解析すること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための当技術分野において公知の多くの方法がある。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給業者、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープは、線状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一ストレッチ内に含有されるもの、または単一ストレッチ内に必ずしも含有されない場合があるアミノ酸の三次元相互作用によって形成されるコンフォメーションエピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４～６アミノ酸長）のペプチドを単離または合成（例えば、組換え的に）し、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体による結合アッセイのために使用することができる。別の例では、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体を用いた結合を決定することによる系統的スクリーニングで、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体が結合するエピトープを決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによると、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原をコードするオープンリーディングフレームが、ランダムに、または特異的な遺伝的構造によって断片化され、発現された、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原の断片の被験抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えばＰＣＲによって産生され、次いで転写され、放射性アミノ酸の存在下でタンパク質にｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳され得る。抗体の放射性標識Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原断片への結合は、次いで、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。ある特定のエピトープをまた、ファージ粒子表面にディスプレイされたランダムペプチド配列の大規模ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって同定することができる。あるいは、重複ペプチド断片の規定ライブラリーを、試験抗体との結合について単純な結合アッセイで試験することができる。さらなる例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメインスワッピング実験およびアラニンスキャニング突然変異誘発を行って、エピトープ結合に要求される、十分な、および／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験を、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原タンパク質の様々な断片が、別の種（例えばマウス）からのＢ７－Ｈ４または近縁であるが抗原的に別個のタンパク質（例えばＢ７－Ｈ３）からの配列と置換（スワップ）されている突然変異型Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原を使用して行うことができる。抗体の突然変異型Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原への結合を評価することによって、特定のＢ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原断片の抗体結合への重要性を評価することができる。
Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体を特徴付けるために使用することができるなお別の方法は、同じ抗原、すなわちＢ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原の様々な断片に結合することが公知である他の抗体を用いた競合アッセイを使用して、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ３、または他の腫瘍抗原抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかを決定することである。競合アッセイは、当業者に周知である。
医薬組成物および製剤
本発明は、本発明の有効量のＢ７－Ｈ４抗体またはＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、様々な製剤の状態であり得る。
本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の様々な製剤は、投与のために使用され得る。一部の実施形態では、抗体は、ニートで投与され得る。一部の実施形態では、抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤の状態であり得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野において公知である。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩類、封入剤、緩衝剤、および皮膚透過促進剤が含まれるが、これらに限定されない。賦形剤ならびに非経口および経口（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５に示されている。一部の実施形態では、これらの薬剤（賦形剤）は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。従って、これらの薬剤を、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の医療歴に依存する。
本発明の方法により使用される、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を随意の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５）と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存のために調製される。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用された投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。
本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含有するリポソームは、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８、１９８５；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０、１９８０；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される方法によって調製される。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法によって生成することができる。所望の直径のリポソームを得るために、リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出される。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に内封される場合がある。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５に開示されている。
徐放性製剤が調製される場合がある。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩から構成される注射用マクロスフェア）、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用すべき製剤は、無菌でなければならない。これは例えば、無菌濾過メンブランを通した濾過によって容易に達成される。治療用抗体、例えば本発明の組成物のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって刺通可能なストッパーを有するバイアル中に入れられる。
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹入による投与のためのユニット投薬剤形、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐剤の状態であり得る。
錠剤などの固体組成物を調製するために、活性主成分が薬学的担体、例えば従来の錠剤化成分、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の医薬希釈剤、例えば水と混合されて、本発明の化合物、またはその無毒の薬学的に許容できる塩の均一混合物を含有する固体事前製剤組成物を形成する。これらの事前製剤組成物を均一と称する場合、活性成分が組成物全体に均等に分散しており、その結果、組成物が、錠剤、丸剤およびカプセル剤などの等しく有効なユニット投薬剤形に容易に細分され得ることが意味される。次いで、この固体事前製剤組成物は、本発明の活性成分を０．１～約５００ｍｇ含有する上記の種類のユニット投薬剤形に細分される。新規な組成物の錠剤または丸剤をコーティングして、または他の方法で配合して、長期作用の利点を与える投薬剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投薬および外側投薬構成成分を含み、後者は、前者の外被の形態であってもよい。これら２つの構成成分は、胃内での崩壊に耐え、内側構成成分が十二指腸へとインタクトで通過するまたは放出を遅らせるように機能する腸溶層によって隔てられていてもよい。多様な材料をそのような腸溶層またはコーティングのために使用でき、そのような材料には、いくつかのポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
適切な界面活性剤には、特に、非イオン性薬剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が含まれる。界面活性剤を有する組成物は、０．０５と５％との間の界面活性剤を好都合に含み、０．１と２．５％との間であり得る。必要ならば、他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルが添加され得ることが認識されよう。
適切なエマルションは、市販の脂肪エマルション、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、予混されたエマルション組成物中に溶解される場合があり、またはその代わりに油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油または扁桃油）ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水と混合したときに形成されるエマルション中に溶解される場合がある。エマルションの張性を調整するために他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースが添加され得ることが認識される。適切なエマルションは、典型的には油を最大２０％、例えば、５と２０％との間で含有する。脂肪エマルションは、０．１と１．０μｍとの間、特に０．１と０．５μｍとの間の脂肪滴を含み、５．５～８．０の範囲のｐＨを有し得る。
エマルション組成物は、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されたものであり得る。
吸入または吹入のための組成物には、薬学的に許容できる水性もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が含まれる。液体または固体組成物は、上記のような適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所または全身効果のために経口または経鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、気体の使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接呼吸される場合があり、または、噴霧装置は、フェースマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸器に装着される場合がある。溶液、懸濁液または粉末組成物は、製剤を適切な方法で送達する装置から、好ましくは経口または経鼻滴に投与され得る。
本発明の抗体を使用する方法
本発明の抗体は、治療的処置方法および診断的処置方法を含むが、これらに限定されない様々な適用に有用である。
治療的処置：
一態様では、本発明は、対象においてＢ７－Ｈ４発現と関連する状態を処置するための方法を提供する。別の態様では、本発明は、対象においてＢ７－Ｈ４発現と関連する状態を処置するための、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体、または本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、対象においてＢ７－Ｈ４発現と関連する状態を処置する方法は、それを必要とする対象に、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、状態はがんである。本明細書に使用される場合、がんには、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸がん、食道がん、胃がん、神経膠芽腫、神経膠腫、脳腫瘍、頭頸部がん、腎がん、肺がん、口腔がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、肝がん、子宮がん、骨がん、白血病、リンパ腫、肉腫、血液がん、甲状腺がん、胸腺がん、眼がん、および皮膚がんが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、乳がん、膀胱がん、子宮がんまたは卵巣がんである。
一部の実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、（１）Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の成長もしくは進行を阻害する、（２）対象においてＢ７－Ｈ４を発現する転移細胞を阻害する、または（３）対象において悪性細胞での腫瘍退縮を誘導する、方法、およびそのためのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体、または医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載される、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象において自己免疫障害を処置する方法、およびそのためのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体または医薬組成物が提供される。本明細書に用いられる場合、自己免疫障害には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、糖尿病（Ｉ型）、多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、橋本脳症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、シェーグレン症候群、急性散在性脳脊髄炎、無ガンマグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗シンテターゼ症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、キャッスルマン病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、リウマチ熱、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。
診断的処置：
別の態様では、Ｂ７－Ｈ４発現と関連する状態を検出、診断、および／またはモニタリングする方法が提供される。例えば、本明細書に記載される、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を、イメージング剤および酵素－基質標識などの検出可能部分で標識することができる。本明細書に記載される抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング（例えば、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴ）、または染色試薬のようにｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイのために使用することができる。あるいは、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ診断アッセイのために使用され得る。
一態様では、診断に使用するための、好ましくはＢ７－Ｈ４発現と関連する状態の診断に使用するための、本明細書に記載される、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体が提供される。
送達経路：
本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を、任意の適切な経路を介して個体に投与することができる。したがって、一部の実施形態では、抗体は、静脈内投与、例えば、ボーラスとしての、もしくはある期間にわたる持続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液嚢内経路により、吹入、くも膜下腔内、経口、吸入または外用経路を介してなどの公知の方法により個体に投与される。投与は、全身、例えば、静脈内投与、または局所であり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販の噴霧器は、投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末を再構成後に噴霧することができる。あるいは、抗体は、フルオロカーボン製剤および定量噴霧式吸入器を使用してエアロゾル化することができ、または、凍結乾燥され、粉砕された粉末として吸入することができる。
一実施形態では、抗体は、部位特異的または標的局所送達技術を介して投与される。部位特異的または標的局所送達技術の例には、抗体の様々な埋め込み可能デポー源または局所送達カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテル、人工血管、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の埋込み可能装置、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。
投薬量：
本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）を含む任意の適切な方法を使用して投与することができる。抗体はまた、本明細書に記載されるように吸入を介して投与することができる。一般に、抗体の投与のために、最初の候補投薬量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明のために、典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、およそ、３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかまでの範囲であり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投薬量が使用され得る。数日以上にわたる繰り返し投与について、状態に応じて、処置は、症状の所望の抑制が起きるまで、または例えば、腫瘍成長／進行もしくはがん細胞の転移を阻害もしくは遅延させるために、十分な治療レベルが達成されるまで持続される。例示的な投与レジメンは、抗体の初回用量約２ｍｇ／ｋｇを投与し、毎週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇが続く、または隔週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇが続くことを含む。他の例示的な投与レジメンは、漸増用量を投与することを含む（例えば、初回用量は１ｍｇ／ｋｇであり、毎週またはより長い期間毎に１つまたは複数のより高い用量へと徐々に増加させる）。開業医が達成を望む薬物動態学的崩壊パターンに応じて、他の投薬レジメンもまた有用であり得る。例えば、一部の実施形態では、週に１～４回の投与が企図される。他の実施形態では、月１回または隔月１回または３か月毎の投与が企図される。この治療法の進歩は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。抗体の投与レジメンは、時間と共に変動し得る。
本発明のために、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の適切な投薬量は、処置すべき症状の種類および重症度、薬剤が治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、投与された薬剤に対する患者のクリアランス速度、ならびに担当医の判断に依存する。典型的に、臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまで抗体を投与する。用量および／または頻度は、処置の経過にわたり変動し得る。経験的考慮事項、例えば半減期は、一般に、投薬量の決定に貢献する。例えば、ヒト免疫系と適合性の抗体、例えばヒト化抗体または完全ヒト抗体が、抗体の半減期を延長するため、および抗体が宿主免疫系によって攻撃されることを防止するために使用され得る。投与頻度は、治療の経過にわたり決定され、調整される場合があり、一般に、症状の処置および／または抑制および／または改善および／または遅延、例えば、腫瘍成長阻害または遅延などに基づくが、その必要はない。あるいは、抗体の連続徐放製剤が適切であり得る。徐放を達成するための様々な製剤および装置が、当技術分野において公知である。
一実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体についての投薬量は、抗体の１つまたは複数の投与を与えられている個体において経験的に決定され得る。個体に、抗体の漸増的な投薬量を与えることができる。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。
本発明の方法による本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療であるかそれとも予防であるか、および当業者に公知の他の要因に依存して、連続的または間欠的であり得る。抗体の投与は、事前選択された期間にわたり本質的に連続的である場合があり、または一連の間隔の空いた用量の場合がある。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含む１種よりも多いＢ７－Ｈ４抗体が存在し得る。少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、またはそれよりも多い、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含む異なるＢ７－Ｈ４抗体が、存在し得る。一般に、それらの抗体は、相互に不利に影響しない相補活性を有し得る。例えば、以下の抗体のうち１種または複数種が使用され得る：Ｂ７－Ｈ４またはＣＤ３上の１つのエピトープに対する第１のＢ７－Ｈ４またはＣＤ３抗体およびＢ７－Ｈ４またはＣＤ３上の別のエピトープに対する第２のＢ７－Ｈ４またはＣＤ３抗体。
組合せ
一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、１種または複数種のさらなる治療剤の投与と組み合わせて投与され得る。さらなる治療剤には、非限定的に、ワクチン、ＣＡＲ－Ｔ細胞ベース療法、放射線療法、サイトカイン療法、ＣＤ３二重特異性抗体、他の免疫抑制経路の阻害薬、血管新生阻害薬、Ｔ細胞活性化物質、代謝経路阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬、アデノシン経路阻害薬、インライタ、ＡＬＫ阻害薬およびスニチニブを含むが、これらに限定されないチロシンキナーゼ阻害薬、ＢＲＡＦ阻害薬、エピジェネティック修飾物質、ＩＤＯ１阻害薬、ＪＡＫ阻害薬、ＳＴＡＴ阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、生物学的治療剤（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、他の成長因子受容体、ＣＤ４０、ＣＤ－４０Ｌ、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳに対する抗体を含むが、これらの限定されない）、免疫原（例えば、弱毒化がん細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、および非限定的にＧＭ－ＣＳＦなどの免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞などの、生物製剤および／または化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
生物学的治療剤の例には、治療用抗体、免疫調節剤、および治療用免疫細胞が含まれる。
治療用抗体は、多様な異なる抗原に対して特異性を有し得る。例えば、治療用抗体は、腫瘍関連抗原に対する場合があり、それにより、抗体の抗原への結合は、抗原を発現する細胞の死滅を促進する。他の例では、治療用抗体は、免疫細胞上の抗原（例えばＰＤ－１）に対する場合があり、それにより、抗体の結合は、抗原を発現する細胞の活性のダウンレギュレーションを防止する（それにより、抗原を発現する細胞の活性を促進する）。いくつかの状況では、治療用抗体は、複数の異なるメカニズムにより機能し得る（例えば、それは、ｉ）抗原を発現する細胞の死滅を促進する、およびｉｉ）抗原が、抗原を発現する細胞と接触している免疫細胞の活性のダウンレギュレーションを引き起こすことを防止する、両方の場合がある）。
治療用抗体は、例えば、以下に記載される抗原に対する場合がある。一部の抗原について、抗原に対する例示的な抗体も下に含まれる（抗原の後の角カッコ／丸カッコ内）。以下のような抗原はまた、本明細書において「標的抗原」などと称され得る。本明細書における治療用抗体についての標的抗原には、例えば、４－１ＢＢ（例えばウトミルマブ）；５Ｔ４；Ａ３３；アルファ－葉酸受容体１（例えばミルベツキシマブ ソラブタンシン）；Ａｌｋ－１；Ｂ７－Ｈ４［例えばＰＦ－０６８６３１３５（ＵＳ９９６９８０９参照）］；ＢＴＮ１Ａ１（例えばＷＯ２０１８２２２６８９参照）；ＣＡ－１２５（例えばアバゴボマブ）；炭酸脱水酵素ＩＸ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ４（例えばモガムリズマブ）；ＣＣＲ５（例えばレロンリマブ）；ＣＣＲ８；ＣＤ３［例えばブリナツモマブ（ＣＤ３／ＣＤ１９二特異性）、ＰＦ－０６６７１００８（ＣＤ３／Ｐ－カドヘリン二特異性）、ＰＦ－０６８６３１３５（ＣＤ３／Ｂ７－Ｈ４二特異性）、ＣＤ１９（例えばブリナツモマブ、ＭＯＲ２０８）；ＣＤ２０（例えばイブリツモマブチウキセタン、オビヌツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ウブリツキシマブ）；ＣＤ２２（イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブ パスドトクス）；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０（例えばブレンツキシマブベドチン）；ＣＤ３３（例えばゲムツズマブオゾガマイシン）；ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ）、ＣＤ４０；ＣＤ－４０Ｌ；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４７；ＣＤ５２（例えばアレムツズマブ）；ＣＤ６３；ＣＤ７９（例えばポラツズマブ ベドチン）；ＣＤ８０；ＣＤ１２３；ＣＤ２７６／Ｂ７－Ｈ３（例えばオンブルタマブ）；ＣＤＨ１７；ＣＥＡ；ＣｌｈＣＧ；ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）、ＣＸＣＲ４；デスモグレイン４；ＤＬＬ３（例えばロバルピツズマブ テシリン）；ＤＬＬ４；Ｅ－カドヘリン；ＥＤＡ；ＥＤＢ；ＥＦＮＡ４；ＥＧＦＲ（例えばセツキシマブ、デパツキシズマブ マホドチン、ネシツムマブ、パニツムマブ）；ＥＧＦＲｖＩＩＩ；エンドシアリン；ＥｐＣＡＭ（例えばオポルツズマブ モナトックス）；ＦＡＰ；胎児アセチルコリン受容体；ＦＬＴ３（例えばＷＯ２０１８／２２０５８４参照）；ＧＤ２（例えばジヌツキシマブ、３Ｆ８）；ＧＤ３；ＧＩＴＲ；グロボＨ；ＧＭ１；ＧＭ２；ＧＵＣＹ２Ｃ（例えばＰＦ－０７０６２１１９）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ［例えばマルゲツキシマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ；アドトラスツズマブ エムタンシン、トラスツズマブ デュオカルマジン、ＰＦ－０６８０４１０３（ＵＳ８８２８４０１参照）］；ＨＥＲ３；ＨＥＲ４；ＩＣＯＳ；ＩＬ－１０；ＩＴＧ－ＡｖＢ６；ＬＡＧ－３（例えばレラトリマブ）；Ｌｅｗｉｓ－Ｙ；ＬＧ；Ｌｙ－６；Ｍ－ＣＳＦ［例えばＰＤ－０３６０３２４（ＵＳ７３２６４１４参照）］；ＭＣＳＰ；メソセリン；ＭＵＣ１；ＭＵＣ２；ＭＵＣ３；ＭＵＣ４；ＭＵＣ５ＡＣ；ＭＵＣ５Ｂ；ＭＵＣ７；ＭＵＣ１６；Ｎｏｔｃｈ１；Ｎｏｔｃｈ３；ネクチン－４（例えばエンホルツマブ ベドチン）；ＯＸ４０［例えばＰＦ－０４５１８６００（ＵＳ７９６０５１５参照）］；Ｐ－カドヘリン［例えばＰＦ－０６６７１００８（ＷＯ２０１６／００１８１０参照）］；ＰＣＤＨＢ２；ＰＤ－１［例えばＢＣＤ－１００、カムレリズマブ、セミプリマブ、ゲノリムズマブ（ＣＢＴ－５０１）、ＭＥＤＩ０６８０、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ササンリマブ（ＷＯ２０１６／０９２４１９参照）、シンチリマブ、スパルタリズマブ、ＳＴＩ－Ａ１１１０、チスレリズマブ、ＴＳＲ－０４２］；ＰＤ－Ｌ１（例えばアテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、またはＬＹ３３０００５４）；ＰＤＧＦＲＡ（例えばオララツマブ）；形質細胞抗原；ポリＳＡ；ＰＳＣＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＫ７［例えばＰＦ－０６６４７０２０（ＵＳ９４０９９９５参照）］；Ｒｏｒ１；ＳＡＳ；ＳＣＲｘ６；ＳＬＡＭＦ７（例えばエロツズマブ）；ＳＨＨ；ＳＩＲＰａ（例えばＥＤ９、Ｅｆｆｉ－ＤＥＭ）；ＳＴＥＡＰ；ＴＧＦ－ベータ；ＴＩＧＩＴ；ＴＩＭ－３；ＴＭＰＲＳＳ３；ＴＮＦ－アルファ前駆物質；ＴＲＯＰ－２（例えばサシツズマブ ゴビテカン）；ＴＳＰＡＮ８；ＶＥＧＦ（例えばベバシズマブ、ブロルシズマブ）；ＶＥＧＦＲ１（例えばラニビズマブ）；ＶＥＧＦＲ２（例えばラムシルマブ、ラニビズマブ）；Ｗｕｅ－１が含まれる。
免疫調節剤には、対象において免疫応答を刺激し得る多様な異なる分子型、例えばパターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニスト、免疫刺激サイトカイン、およびがんワクチンが含まれる。
パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、免疫系の細胞によって発現される受容体であって、病原体および／または細胞損傷もしくは死滅と関連する多様な分子を認識する受容体である。ＰＲＲは、自然免疫応答および適応免疫応答の両方に関与する。ＰＲＲアゴニストは、対象において免疫応答を刺激するために使用され得る。ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質を含む、複数のクラスのＰＲＲ分子がある。
「ＴＬＲ」および「ｔｏｌｌ様受容体」という用語は、任意のｔｏｌｌ様受容体を指す。ｔｏｌｌ様受容体は、活性化免疫応答に関与する受容体である。ＴＬＲは、例えば、微生物に発現された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）のみならず、死んだまたは瀕死の細胞から放出される内因性損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識する。
ＴＬＲを活性化（し、それにより免疫応答を活性化）する分子は、本明細書において「ＴＬＲアゴニスト」と称される。ＴＬＲアゴニストには、例えば、低分子（例えば、約１０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子）のみならず、高分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質）が含まれ得る。一部のＴＬＲアゴニストは、単一種類のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ３またはＴＬＲ９）に特異的であるのに対し、また一部のＴＬＲアゴニストは、２種類以上のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方）を活性化する。
本明細書に提供される例示的なＴＬＲアゴニストには、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のアゴニストが含まれる。
例示的な低分子ＴＬＲアゴニストには、例えば、米国特許第４，６８９，３３８号；同第４，９２９，６２４号；同第５，２６６，５７５号；同第５，２６８，３７６号；同第５，３４６，９０５号；同第５，３５２，７８４号；同第５，３８９，６４０号；同第５，４４６，１５３号；同第５，４８２，９３６号；同第５，７５６，７４７号；同第６，１１０，９２９号；同第６，１９４，４２５号；同第６，３３１，５３９号；同第６，３７６，６６９号；同第６，４５１，８１０号；同第６，５２５，０６４号；同第６，５４１，４８５号；同第６，５４５，０１６号；同第６，５４５，０１７号；同第６，５７３，２７３号；同第６，６５６，９３８号；同第６，６６０，７３５号；同第６，６６０，７４７号；同第６，６６４，２６０号；同第６，６６４，２６４号；同第６，６６４，２６５号；同第６，６６７，３１２号；同第６，６７０，３７２号；同第６，６７７，３４７号；同第６，６７７，３４８号；同第６，６７７，３４９号；同第６，６８３，０８８号；同第６，７５６，３８２号；同第６，７９７，７１８号；同第６，８１８，６５０号；および同第７，７０９１，２１４号；米国特許出願公開第２００４／００９１４９１号、同第２００４／０１７６３６７号、および同第２００６／０１００２２９号；ならびに国際公開番号ＷＯ２００５／１８５５１、ＷＯ２００５／１８５５６、ＷＯ２００５／２０９９９、ＷＯ２００５／０３２４８４、ＷＯ２００５／０４８９３３、ＷＯ２００５／０４８９４５、ＷＯ２００５／０５１３１７、ＷＯ２００５／０５１３２４、ＷＯ２００５／０６６１６９、ＷＯ２００５／０６６１７０、ＷＯ２００５／０６６１７２、ＷＯ２００５／０７６７８３、ＷＯ２００５／０７９１９５、ＷＯ２００５／０９４５３１、ＷＯ２００５／１２３０７９、ＷＯ２００５／１２３０８０、ＷＯ２００６／００９８２６、ＷＯ２００６／００９８３２、ＷＯ２００６／０２６７６０、ＷＯ２００６／０２８４５１、ＷＯ２００６／０２８５４５、ＷＯ２００６／０２８９６２、ＷＯ２００６／０２９１１５、ＷＯ２００６／０３８９２３、ＷＯ２００６／０６５２８０、ＷＯ２００６／０７４００３、ＷＯ２００６／０８３４４０、ＷＯ２００６／０８６４４９、ＷＯ２００６／０９１３９４、ＷＯ２００６／０８６６３３、ＷＯ２００６／０８６６３４、ＷＯ２００６／０９１５６７、ＷＯ２００６／０９１５６８、ＷＯ２００６／０９１６４７、ＷＯ２００６／０９３５１４、およびＷＯ２００６／０９８８５２に開示されたものが含まれる。
低分子ＴＬＲアゴニストのさらなる例には、ある特定のプリン誘導体（例えば、米国特許第６，３７６，５０１号および同第６，０２８，０７６号に記載されているもの）、ある特定のイミダゾキノリンアミド誘導体（例えば、米国特許第６，０６９，１４９号に記載されているもの）、ある特定のイミダゾピリジン誘導体（例えば、米国特許第６，５１８，２６５号に記載されているもの）、ある特定のベンゾイミダゾール誘導体（例えば、米国特許第６，３８７，９３８号に記載されているもの）、五員環窒素含有複素環と縮合されたある特定の４－アミノピリミジン誘導体（例えば、米国特許第６，３７６，５０１号；同第６，０２８，０７６号、および同第６，３２９，３８１号；ならびにＷＯ０２／０８９０５に記載されたアデニン誘導体）、およびある特定の３－ベータ－Ｄ－リボフラノシルチアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン誘導体（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９９４６１号に記載されているもの）、ならびにある特定の低分子免疫賦活化合物、例えば米国特許出願公開第２００５／０１３６０６５号に記載されているものが含まれる。
例示的な高分子ＴＬＲアゴニストには、オリゴヌクレオチド配列が含まれる。一部のＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチド配列は、シトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有し、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０６８号；および同第６，４０６，７０５号に記載されている。一部のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，４２６，３３４号および同第６，４７６，０００号に記載されているものなどの合成免疫調節構造モチーフを含み得る。他のＴＬＲアゴニストヌクレオチド配列は、ＣｐＧ配列を欠如し、例えば、国際公開番号ＷＯ００／７５３０４に記載されている。なお他のＴＬＲアゴニストヌクレオチド配列には、例えば、Ｈｅｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻、１５２６～１５２９頁、２００４年３月５日に記載されたものなどの、グアノシンおよびウリジンに富む一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）が含まれる。
他のＴＬＲアゴニストには、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩（ＡＧＰ）などの生体分子が含まれ、それらは、例えば、米国特許第６，１１３，９１８号；同第６，３０３，３４７号；同第６，５２５，０２８号；および同第６，６４９，１７２号に記載されている。
ＴＬＲアゴニストにはまた、複数の異なる種類のＴＬＲ受容体を活性化し得る不活性化病原体またはその部分が含まれる。例示的な病原体由来ＴＬＲアゴニストには、ＢＣＧ、ミコバクテリウムオブエンス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｂｕｅｎｓｅ）抽出物、タリモジーンラハーパレプベック（Ｔ－Ｖｅｃ）（ＨＳＶ－１由来）、およびＰｅｘａ－Ｖｅｃ（ワクシニアウイルス由来）が含まれる。
一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲに特異的に結合するアゴニスト抗体であり得る。
ＲＬＲには、例えばｄｓＲＮＡを検出する様々なサイトゾルＰＲＲが含まれる。ＲＬＲの例には、例えば、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）、および遺伝学生理学研究室２（ＬＧＰ２）が含まれる。
「ＲＬＲアゴニスト」は、本明細書に用いられる場合、ＲＬＲに結合すると、（１）ＲＬＲを刺激もしくは活性化する、（２）ＲＬＲの活性、機能、もしくは存在を強化、増加、促進、誘導、もしくは延長する、または（３）ＲＬＲの発現を強化、増加、促進、もしくは誘導する、任意の分子を意味する。本発明の処置方法、医薬および使用のいずれかに有用なＲＬＲアゴニストには、例えば、ＲＬＲに結合する核酸およびその誘導体ならびにＲＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が含まれる。
本発明の処置方法、医薬、および使用に有用なＲＬＲアゴニストの例には、例えば、無キャップ５’三リン酸を有する低分子二本鎖ＲＮＡ（ＲＩＧ－Ｉアゴニスト）；ポリＩ：Ｃ（ＭＤＡ－５アゴニスト）、およびＢＯ－１１２（ＭＤＡ－Ａアゴニスト）が含まれる。
ＮＬＲには、例えば、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子を検出する様々なＰＲＲが含まれる。ＮＬＲには、サブファミリーＮＬＲＡ－Ａ、ＮＬＲＢ－Ｂ、ＮＬＲＣ－Ｃ、およびＮＬＲＰ－Ｐが含まれる。ＮＬＲの例には、例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＡＩＰ、ＮＬＲＣ４、およびＮＬＲＰ３が含まれる。
「ＮＬＲアゴニスト」は、本明細書に用いられる場合、ＮＬＲに結合すると、（１）ＮＬＲを刺激もしくは活性化する、（２）ＮＬＲの活性、機能、もしくは存在を強化、増加、促進、誘導、もしくは延長する、または（３）ＮＬＲの発現を強化、増加、促進、もしくは誘導する、任意の分子を意味する。本発明の処置方法、医薬および使用のいずれかに有用なＮＬＲアゴニストには、例えば、ＮＬＲに結合するＤＡＭＰおよびその誘導体ならびにＮＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が含まれる。
本発明の処置方法、医薬、および使用に有用なＮＬＲアゴニストの例には、例えば、リポソーム型ムラミルトリペプチド／ミファムルチド（ＮＯＤ２アゴニスト）が含まれる。
ＣＬＲには、例えば、炭水化物および糖タンパク質を検出する様々なＰＲＲが含まれる。ＣＬＲには、膜貫通ＣＬＲおよび分泌ＣＬＲの両方が含まれる。ＣＬＲの例には、例えば、ＤＥＣ－２０５／ＣＤ２０５、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、デクチン－１、デクチン－２、ミンクル、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＮＧＲ－１、およびマンノース結合性レクチン（ＭＢＬ）が含まれる。
「ＣＬＲアゴニスト」は、本明細書に用いられる場合、ＣＬＲに結合すると、（１）ＣＬＲを刺激もしくは活性化する、（２）ＣＬＲの活性、機能、もしくは存在を強化、増加、促進、誘導、もしくは延長する、または（３）ＣＬＲの発現を強化、増加、促進、もしくは誘導する、任意の分子を意味する。本発明の処置方法、医薬および使用のいずれかに有用なＣＬＲアゴニストには、例えば、ＣＬＲに結合する炭水化物およびその誘導体ならびにＣＬＲに特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が含まれる。
本発明の処置方法、医薬、および使用に有用なＣＬＲアゴニストの例には、例えば、ＭＤ－画分（マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）から抽出された精製可溶性ベータグルカン）およびｉｍｐｒｉｍｅ ＰＧＧ（酵母由来ベータ１，３／１，６－グルカンＰＡＭＰ）が含まれる。
ＳＴＩＮＧタンパク質は、１型インターフェロンシグナル伝達においてサイトゾルＤＮＡセンサーおよびアダプタータンパク質の両方として機能する。用語「ＳＴＩＮＧ」および「インターフェロン遺伝子刺激因子」は、任意の形態のＳＴＩＮＧタンパク質のみならず、ＳＴＩＮＧの活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、および種相同体を指す。別に、例えばヒトＳＴＩＮＧへの具体的参照により、示さない限り、ＳＴＩＮＧには、すべての哺乳類種、例えばヒト、サル、およびマウスのネイティブ配列ＳＴＩＮＧが含まれる。例示的な１つのヒトＴＬＲ９は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｑ８６ＷＶ６に提供される。ＳＴＩＮＧはまた、ＴＭＥＭ１７３として知られている。
「ＳＴＩＮＧアゴニスト」は、本明細書に用いられる場合、ＴＬＲ９に結合すると、（１）ＳＴＩＮＧを刺激もしくは活性化する、（２）ＳＴＩＮＧの活性、機能、もしくは存在を強化、増加、促進、誘導、もしくは延長する、または（３）ＳＴＩＮＧの発現を強化、増加、促進、もしくは誘導する、任意の分子を意味する。本発明の処置方法、医薬および使用のいずれかに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、例えば、ＳＴＩＮＧに結合する核酸リガンドが含まれる。
本発明の処置方法、医薬、および使用に有用なＳＴＩＮＧアゴニストの例には、様々な免疫刺激核酸、例えば合成二本鎖ＤＮＡ、サイクリックジ－ＧＭＰ、サイクリック－ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、合成サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、例えばＭＫ－１４５４およびＡＤＵ－Ｓ１００（ＭＩＷ８１５）、ならびに低分子、例えばＰ０－４２４が含まれる。
他のＰＲＲには、例えば、ＤＮＡ依存性ＩＦＮ調節因子活性化因子（ＤＡＩ）およびメラノーマ非存在２（ＡＩＭ２）が含まれる。
免疫刺激サイトカインには、免疫応答を刺激する様々なシグナル伝達タンパク質、例えば、インターフェロン、インターロイキン、および造血成長因子が含まれる。
例示的な免疫刺激サイトカインには、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ；ＩＬ－２（例えばデニロイキン ジフチトクス）、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、およびＴＮＦ－アルファが含まれる。
免疫刺激サイトカインは、任意の適切なフォーマットを有し得る。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカインは、組換え版の野生型サイトカインであり得る。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカインは、対応する野生型サイトカインと比較して１つまたは複数のアミノ酸変化を有するムテインであり得る。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカインは、サイトカインおよび少なくとも１つの他の機能性タンパク質（例えば抗体）を含有するキメラタンパク質に組み入れられ得る。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカインは、薬物／薬剤（例えば、可能性のあるＡＤＣ構成成分として本明細書における他の箇所に記載される任意の薬物／薬剤）と共有結合的に連結され得る。
がんワクチンには、腫瘍関連抗原を含有する（または、対象において腫瘍関連抗原を生成するために使用することができる）様々な組成物が含まれ、したがって、がんワクチンを、腫瘍関連抗原を含有する腫瘍細胞に対する免疫応答を対象において誘発するために使用することができる。
がんワクチン中に含まれ得る材料の例には、弱毒化がん性細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば、腫瘍由来抗原または腫瘍関連抗原をコードする核酸をパルスされた樹状細胞が含まれる。一部の実施形態では、がんワクチンは、患者自身のがん細胞を用いて調製され得る。一部の実施形態では、がんワクチンは、患者自身のがん細胞由来ではない生体材料を用いて調製され得る。
がんワクチンには、例えば、シプロイセル－Ｔおよびタリモジーンラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ）が含まれる。
免疫細胞療法は、がん細胞を標的付けることが可能な免疫細胞で患者を処置することを伴う。免疫細胞療法には、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれる。
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン、（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンファイＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３～１８６（１９９４）参照；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、例えばミトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体が含まれる。抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、およびアナストラゾール；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ＫＲＡＳ阻害薬；ＭＣＴ４阻害剤；ＭＡＴ２ａ阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬、例えば、スニチニブ、アキシチニブ；ａｌｋ／ｃ－Ｍｅｔ／ＲＯＳ阻害薬、例えば、クリゾチニブ、ロルラチニブ；ｍＴＯＲ阻害薬、例えば、テムシロリムス、ゲダトリシブ；ｓｒｃ／ａｂｌ阻害薬、例えばボスチニブ；サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬、例えば、パルボシクリブ、ＰＦ－０６８７３６００；ｅｆｂ阻害薬、例えばダコミチニブ；ＰＡＲＰ阻害薬、例えばタラゾパリブ；ＳＭＯ阻害薬、例えば、グラスデギブ、ＰＦ－５２７４８５７；ＥＧＦＲ
Ｔ７９０Ｍ阻害薬、例えばＰＦ－０６７４７７７５；ＥＺＨ２阻害薬、例えばＰＦ－０６８２１４９７；ＰＲＭＴ５阻害薬、例えばＰＦ－０６９３９９９９；ＴＧＦＲβｒ１阻害薬、例えばＰＦ－０６９５２２２９；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、または誘導体もまた含まれる。具体的な実施形態では、このようなさらなる治療剤は、ベバシズマブ、セツキシマブ、シロリムス、パニツムマブ、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、チボザニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、トリフルリジン、チピラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン、レゴラフェニブまたはエルロチニブ塩酸塩である。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、例えば、非限定的に、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ８、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ４、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ－Ｈ１）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、４－ＢＢＬ、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ）、ＳＬＡＭＣＦ７（ＣＳ１）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＡＭＦ９（ＣＤ２Ｆ）、ＣＤ２８、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１－３ＡＳ、ＣＥＡＣＡＭ３Ｃ２、ＣＥＡＣＡＭ１－１５、ＰＳＧ１－１１、ＣＥＡＣＡＭ１－４Ｃ１、ＣＥＡＣＡＭ１－４Ｓ、ＣＥＡＣＡＭ１－４Ｌ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＣＲ２、ＣＤ３９－ＣＤ７３－アデノシン経路（Ａ２ＡＲ）、ＢＴＫ、ＴＩＫ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ５、ＣＳＦ－１、または自然免疫応答調節物質を標的付ける薬剤などの、免疫チェックポイント調節物質または共刺激剤を標的付ける１つまたは複数の他の治療剤と共に使用される。
一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、例えば、抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体、例えばイピリムマブ；抗ＬＡＧ－３アンタゴニスト抗体、例えばＢＭＳ－９８６０１６およびＩＭＰ７０１；抗ＴＩＭ－３アンタゴニスト抗体；抗Ｂ７－Ｈ３アンタゴニスト抗体、例えばＭＧＡ２７１；抗ＶＩＳＴＡアンタゴニスト抗体；抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体；抗ＣＤ８０抗体；抗ＣＤ８６抗体；抗Ｂ７－Ｈ４アンタゴニスト抗体；抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アゴニスト抗体；自然免疫応答調節物質（例えば、ＴＬＲ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）、およびＩＤＯ阻害薬と共に使用される。
一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、抗ＯＸ－４０アゴニスト抗体と共に使用される。一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば非限定的にＴＲＸ５１８と共に使用される。一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、ＩＤＯ阻害薬と共に使用される。一部の実施形態では、ＧＵＣＹ２ｃ抗体またはＣＤ３－ＧＵＣＹ２ｃ二重特異性抗体は、サイトカイン療法、例えば非限定的にＩＬ－１５、ＣＳＦ－１、ＭＣＳＦ－１などと共に使用される。
一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、１つまたは複数の他の治療用抗体、例えば非限定的に、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ５２、またはＣＣＲ４を標的付ける抗体と共に使用される。
ある特定の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の組成物は、少なくとも１つのさらなる薬剤、例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、シロリムス、パニツムマブ、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、チボザニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、トリフルリジン、チピラシル、ロイコボリン、ゲムシタビンおよびエルロチニブ塩酸塩を含む。
一部の実施形態では、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体は、他の薬剤処置と同時に投与される場合、またはその前もしくは後に数分～数週間の範囲の間隔で順次投与される場合がある。他の薬剤および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別々に投与される実施形態では、一般に、この薬剤および本発明の組成物が対象に有利な併用効果を依然として発揮できるように、各送達の合間に重大な期限が切れないことが保証される。そのような場合、両方の様式を互いに約１２～２４時間以内に、より好ましくは互いに約６～１２時間以内に投与し得ることが企図される。しかし一部の状況では、投与期間を顕著に延長することが望ましい場合があり、その場合、それぞれの投与の合間に数（２、３、４、５、６または７）日～数（１、２、３、４、５、６、７または８）週間が経過する。
一部の実施形態では、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の処置レジメンは、手術、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害および緩和ケアからなる群から選択される従来療法をさらに含む処置レジメンと組み合わされる。
キット
本発明はまた、本方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体を含む１つまたは複数の容器、および本明細書に記載される本発明の方法のいずれかにより使用するための説明書を含む。一般に、これらの説明書は、上記治療的処置のための本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の投与の説明を含む。
本発明の、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体の使用に関する説明書は、本明細書に記載される場合、一般に、意図される処置のための投薬量、投与計画、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチドーズパッケージ）または下位単位用量であり得る。本発明のキット中に供給される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）上の書面の説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気または光記憶ディスクで運ばれる説明書）もまた許容できる。
本発明のキットは、適切なパッケージング中にある。適切なパッケージングには、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば、封着されたマイラーまたはプラスチックバッグ）、その他が含まれるが、これらに限定されない。特定の装置、例えばインヘラー、鼻腔投与装置（例えばアトマイザー）または輸液装置、例えばミニポンプと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、無菌アクセスポートを有する場合がある（例えば、容器は、皮下注射針により刺通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器はまた、無菌アクセスポートを有する場合がある（例えば、容器は、皮下注射針により刺通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を含むＢ７－Ｈ４抗体である。容器はさらに、第２の薬学的活性薬剤を含み得る。
キットは、緩衝液および説明に役立つ情報などのさらなる構成要素を場合により提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。
以下の例は、単に例示的目的で述べられており、本発明の範囲を限定することを全く意図しない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
（実施例１）
Ｂ７－Ｈ４抗体およびＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体の高スループット発現および精製
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｂ７－Ｈ４ホモ二量体抗体の相補的構築物対（重鎖および軽鎖各１２．５μｇ）を、ＨＥＫ２９３細胞を１００万個／ｍｌ含有する対数期培養物２５ｍＬに共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションエンハンサーを添加し、細胞をさらに４～５日成長させ、その後回収した。次いで、培養済み培養物を収集し、遠心分離して、細胞片を除去し、次いで２０μｍフィルターに通過させた。
次いで、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用してＢ７－Ｈ４ホモ二量体を含有する清澄化馴化培地を精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を予め充填した０．４５ｍＬマイクロカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）に、液体取扱い機（Ｔｅｃａｎ）を使用して試料をロードした。結合したタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで、これを２０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出し、２Ｍトリス（ｐＨ８．０）で中和した。分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、Ａｇｌｉｅｎｔ１２００ ＨＰＬＣに取り付けたＭａｂ ＨＴＰカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により製造業者のプロトコルに従ってタンパク質の純度を分析した。微量分光光度計（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用してＯＤ２８０ｎｍを測定することによって濃度を決定した。
上記と同様にＣＤ３ホモ二量体抗体を調製し、実施例２に記載されたように培養物２Ｌからこの抗体を精製した。簡潔には、製造業者のプロトコルに従って、ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２Ｌに０．５μｇ／ｍｌの重鎖および軽鎖を各々トランスフェクトした。５日目に馴化培地を回収し、ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ樹脂（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕獲した。
等モル量のＢ７－Ｈ４ホモ二量体とＣＤ３ホモ二量体とを混合し、それらを１ｍＭ ＧＳＨと３７℃で２４時間インキュベートすることによって二重特異性抗体を形成した。次いで、Ｇ２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘドリップカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造業者の方法に従って使用して、試料をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中になるように脱塩した。ＷＣＸカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩い塩勾配（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．４）、０～１Ｍ ＮａＣｌ）をかけて、制御されたＦａｂアーム交換（ヘテロ二量体の形成）の効率を分析した。
本発明の方法により表２のＢ７－Ｈ４抗体および表５のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体を作製した。
（実施例２）
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体１１６７および１１５６の産生
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体１１６７の抗Ｂ７－Ｈ４アーム重鎖（配列番号１９６）、抗Ｂ７－Ｈ４軽鎖（配列番号１９７）、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体１１５６の抗Ｂ７－Ｈ４アーム重鎖（配列番号１９２）、抗Ｂ７－Ｈ４軽鎖（配列番号１９３）、抗ＣＤ３アーム重鎖（配列番号１９４）および抗ＣＤ３軽鎖（配列番号１９５）をコードするｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにクローニングした。Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅの３つのさらなる置換（まとめて「ＥＥＥ」）を有する抗Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧ２ ｄＡ Ｄ２６５Ａ重鎖および４つのさらなる置換Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｋ４０９Ｒ（まとめて「ＲＲＲ」）を有する抗ＣＤ３ ＩｇＧ２ ｄＡ Ｄ２６５Ａを対応する軽鎖と一緒にトランスフェクトし、製造業者のプロトコルによりｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２Ｌを使用して「ＥＥＥ」および「ＲＲＲ」アーム全体を別々に発現させた。トランスフェクションのための重鎖と軽鎖とのＤＮＡ重量比は、１：１（１μｇ／ｍｌ培養物、総ＤＮＡ）であった。両方のホモ二量体（ＲＲＲおよびＥＥＥ）についての馴化培地を５日目に回収し、ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ樹脂（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって別々に捕獲した。ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ樹脂からの溶出液を使用して二特異性分子のヘテロ二量体化をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施した。簡潔には、それぞれ二重特異性抗体１１５６および１１６７について、２０倍および１０倍モル過剰のシステインの存在下でＲＲＲおよびＥＥＥホモ二量体を１：１のモル比で混合した。混合溶液を室温、ｐＨ８．０で１８時間インキュベートした。二重特異性抗体１１５６および１１６７についてＰｏｓｔ－ＲｅｄＯｘを５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６）でそれぞれ１：４および１：９希釈し、次いで、室温でＭｏｎｏ－Ｓカラム（ＣＥＸ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。勾配をかけた陽イオン交換溶出緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．６）でタンパク質をカラムから溶出させた。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＰＢＳ－ＣＭＦ（リン酸緩衝溶液；カルシウムおよびマグネシウム不含）への最終的な緩衝液交換を行った。アミノ酸配列から計算されたモル吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度を測定することによってタンパク質の定量化を達成した。
（実施例３）
プレート結合ｈｕＢ７－Ｈ４に対するＩＣ５０を試験するための競合ＥＬＩＳＡ
下の表７に記載された生殖系列および最適化バリアントの結合強度を、ＥＬＩＳＡで、親Ｂ７－Ｈ４抗体００５２または００５８との競合により評価した。優しく揺らしながらＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；３８４ウェル）にＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍＬ（２５μｇ／ウェル）のＢ７－Ｈ４細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）（６ｘｈｉｓ Ｆ２９－Ａ２５８）を４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を捨て、プレートを５０μＬ／ウェルのＰＢＳ－１％ ＢＳＡにより室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、プレートをＴＢＳＴで４回洗浄した。分析されたｍＡｂの２倍希釈系列を調製し、ビオチン化Ｂ７－Ｈ４抗体００５２（２８Ｄ１０の最適化系列について）またはＢ７－Ｈ４抗体００５８（３７Ｄ４の最適化系列について）のＥＣ８０に対応する濃度と混合した。希釈された被験ｍＡｂとビオチン化親ｍＡｂとの１：１混合物２５ｕｌを２つの繰り返しでプレートに添加した。プレートをゆっくりと揺らすことによって室温で２時間インキュベートした。プレートを１００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ）で４回洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中に１：４０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート２０μＬと共に１時間インキュベートした。以前のようにプレートを７回洗浄し、ＴＮＢ基質２０μＬと共に１０分間インキュベートした。０．１８Ｍ硫酸を添加することによって反応を終了させた。次いで、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。上記のように調製されたヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤをコーティングされたプレートと共に、室温でビオチン化００５２および００５８をインキュベートすることによって、親抗体００５２および００５８のＥＣ８０を決定した。抗体の２倍希釈系列を調製し、ウェルに２５μｌを添加した。２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中に１：４０００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートし、続いて、上記のように洗浄し、ＴＮＢ基質を添加した。０．１８Ｍ硫酸で反応を終了させ、次いで、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭで４パラメーター非線形回帰分析を使用してＥＣ８０値を計算した。
表２および表５で選択された抗体を本方法により試験し、得られたデータを表７に示す。
（実施例４）
親和性捕獲自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ）
抗体および抗体様タンパク質は、特に高い濃度では、それら自体で相互作用する潜在性を有する。この自己相互作用は、創薬の間に製剤化と関連する粘度の難題のみならず、クリアランスの高いリスクにつながる可能性がある。（Ａｖｅｒｙら、ＭＡｂｓ．２０１８；１０（２）：２４４～２５５）。ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイは自己相互作用を測定し、高い粘度および劣った薬物動態特性の潜在性を予想することを助けるために使用される。
ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｊａｎｕｓ液体取扱いロボットを用いた３８４ウェルフォーマットで標準化した。２０ｎｍ金ナノ粒子（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．、＃１５７０５）に、８０％ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃１０９－００５－０９８）と２０％非特異的ヤギポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃００５－０００－００３）との混合物をコーティングし、金ナノ粒子を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）中になるよう緩衝液交換し、０．４ｍｇ／ｍｌになるよう希釈した。室温で１時間インキュベーション後、金ナノ粒子上の占有されていない部位を、チオール化ポリエチレングリコール（２ｋＤ）でブロッキングした。次いで、コーティングされたナノ粒子を、シリンジフィルターを使用して１０倍濃縮し、１０μｌを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中０．０５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ １００μｌに添加した。コーティングされたナノ粒子を９６ウェルポリプロピレンプレート中で目的の抗体と共に２時間インキュベートし、次いで、３８４ウェルポリスチレンプレートに移し、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００分光光度計で読み取った。４５０から６５０ｎｍへと２ｎｍ刻みで吸光度を読み取り、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌマクロを使用して最大吸光度を同定し、データをスムージングし、二次多項式を使用してデータをフィッティングした。平均ブランク（ＰＢＳ緩衝液単独）のスムージングされた最大吸光度を、抗体試料のスムージングされた最大吸光度から差し引いて、抗体ＡＣ－ＳＩＮＳスコアを決定した。
表２および表５で選択された抗体を本方法により試験し、得られたデータを表７に示す。
（実施例５）
ＤＮＡおよびインスリン多特異性ＥＬＩＳＡ
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にＰＢＳ（ｐＨ７．５）中のＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）およびインスリン（５μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩コーティングした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｎｕｓ液体取扱いロボットで、Ｔｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９、１１２、２００８；米国特許第７，３１４，６２２号に記載されたアッセイから適応されたＥＬＩＳＡを実行した。ウェルを水で洗浄し、Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＥＢ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）５０μｌにより室温で１時間ブロッキングし、水で３回すすいだ。系列希釈したｍＡｂ ２５μｌをウェルに４つ組で添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、西洋ワサビペルオーケーシダーゼとコンジュゲートした１０ｎｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）２５μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、水８０μｌで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２５μｌを各ウェルに添加した。６分５０秒後に０．１８Ｍオルトリン酸２５μｌを各ウェルに添加することによって反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＤＮＡおよびインスリン結合スコアを、緩衝液含有ウェルのＥＬＩＳＡシグナルに対する１０μｇ／ｍｌ抗体のシグナルの比として計算した。表２および表５中の選択された抗体を試験して、本明細書に記載されるＤＮＡおよびインスリン結合ＥＬＩＳＡ手順によりそこに示される多特異性スコアを得た。データを表７に示す。
Figure 2023100255000024
Figure 2023100255000025
Figure 2023100255000026
（実施例６）
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析
体積４００μｌ中０．６ｍｇ／ｍｌとなるように抗体をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に希釈した。ＰＢＳを参照細胞における緩衝液ブランクとして使用した。ＰＢＳは、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、および１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）を含有していた。オートサンプラーを備えるＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－キャピラリーＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）の試料トレイ内に試料を分注させた。試料を１０℃で５分間平衡化し、次いで１００℃／時間の速度で１１０℃まで走査した。フィルタリング時間１６秒を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を規準化した。Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、データを適切な数の転移を有するＭＮ２－Ｓｔａｔｅモデルにフィッティングした。ＩｇＧ１フォーマットの最適化抗Ｂ７－Ｈ４結合ドメインの示差走査熱量測定の結果を表８に示す。
Figure 2023100255000027
（実施例７）
Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧ１ ｍＡｂの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ハイブリドーマから得られたＩｇＧ１ ｍＡｂフォーマットの抗Ｂ７－Ｈ４クローンを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によって２５℃でヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤ（細胞外ドメイン）との結合について評価した。製造業者のプロトコルに従って抗ヒトＦｃ（ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）をＣＭ５センサーチップ上に最初にコーティングした。チップ上に０．７５μｇ／ｍＬヒト抗Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧ１ ｍＡｂをハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中５０μＬ／分で２０秒間流した。次に、９００ｎＭ（クローン：７Ｈ７、３３Ｇ４、１１Ｆ１２、３３Ａ４、１３Ｆ４、３７Ｄ４、１９Ｄ３、２７Ｃ１２、４２Ｅ２、２８Ｄ１０、４６Ｅ１０および３２Ｆ３の場合）から開始して、および１００ｎＭ（クローン：２９Ｇ６および４７Ａ１の場合）から開始して、３倍希釈していった５つの異なる濃度のヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを、５０μＬ／分で６０秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで３００秒間解離させた。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。各運転の合間に３×３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いてチップを再生した。結果を表９－Ａに示す。
Figure 2023100255000028
ＩｇＧ１ ｍＡｂフォーマットの最適化された抗Ｂ７－Ｈ４抗体および対応する親抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によって３７℃でヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの結合について試験した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．７５μｇ／ｍＬのヒト抗Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧ１ ｍＡｂを５０μＬ／分で３０秒間チップ上に流した。次に、３００ｎＭから開始して３倍希釈していった５つの異なる濃度のヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で６５秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで６００秒間解離させた。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。各運転の合間に３×３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて５０μＬ／分で３０秒間チップを再生した。結果を表９－Ｂに示す。
Figure 2023100255000029
ＩｇＧ１ ｍＡｂフォーマットの最適化された抗Ｂ７－Ｈ４抗体および対応する親抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によって３７℃でイヌおよびマウスＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの交差反応性について試験した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．７５μｇ／ｍＬのヒト抗Ｂ７－Ｈ４ ＩｇＧ１ ｍＡｂを５０μＬ／分で３０秒間チップ上に流した。次に、９００ｎＭから開始して３倍希釈していった５つの異なる濃度のイヌおよびマウスＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で６５秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで６００秒間解離させた。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。各運転の間に３×３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて５０μＬ／分で３０秒間チップを再生した。結果を表９－Ｃに示す。
Figure 2023100255000030
（実施例８）
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
親ハイブリドーマクローンのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒト、イヌおよびマウスＢ７－Ｈ４ ＥＣＤに対する結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃または３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて決定した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．５μｇ／ｍＬのＢ７－Ｈ４－ＣＤ３ ＩｇＧ２ ＥＥＥ／ＲＲＲ二重特異性抗体を５０μＬ／分で２０～２５秒間チップ上に流した。ヒト、イヌおよびマウスＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で６５秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで３００秒間解離させた。イヌ抗原の場合４００ｎＭから開始して、ならびにヒトおよびマウス抗原の場合９００ｎＭから開始して、３倍希釈していった５つの異なる濃度の抗原を使用した。解離を６００秒間モニタリングし、３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて表面を５０μＬ／分で３０秒間３回再生した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ａに示す。
Figure 2023100255000031
親ハイブリドーマクローンのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒトおよびイヌＣＤ３に対する結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で収集速度１０Ｈｚを用いて決定した。抗Ｈｉｓ（ＧＥ １０２６０１２５）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．５０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３（デルタ／イプシロンヘテロ二量体）を１０μＬ／分で３０秒間チップ上に流した。１５０ｎＭ～５，６ｎＭの範囲の濃度を有するＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性タンパク質の３倍希釈系列を流速５０μｌ／分で７２秒間センサー表面に注入した。解離を３００秒間モニタリングし、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いて表面を５０μＬ／分で２０秒間再生した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ｂに示す。
Figure 2023100255000032
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒト、イヌおよびマウスＢ７－Ｈ４ ＥＣＤに対する結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて決定した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．７５μｇ／ｍＬのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３ ＩｇＧ２ ＥＥＥ／ＲＲＲ二重特異性抗体を５０μＬ／分で３０秒間チップ上に流した。ヒト、イヌ、マウスおよびラットＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で６０秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで３００秒間解離させた。ヒトおよびイヌ抗原の場合２７０ｎＭから開始し、ラットおよびマウス抗原の場合２１００ｎＭから開始して、３倍希釈していった５つの異なる濃度の抗原を使用した。解離を６００秒間モニタリングし、３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて表面を５０μＬ／分で３０秒間３回再生した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ｃに示す。
Figure 2023100255000033
Ｂ７－Ｈ４－ＣＤ３二重特異性抗体のヒトおよびイヌＣＤ３に対する結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて決定した。抗Ｈｉｓ（ＧＥ １０２６０１２５）を製造業者のプロトコルによりＣＭ５センサーチップに最初にコーティングした。ハンクス緩衝溶液（ＨＢＳ）－ＥＰ＋（ｐＨ＝７．４）中０．５０μｇ／ｍＬのヒトおよびイヌＣＤ３（デルタ／イプシロンヘテロ二量体）を１０μＬ／分で３６秒間チップ上に流した。３００ｎＭ～３．７ｎＭの範囲の濃度を有する３倍希釈系列のＢ７－Ｈ４－ＣＤ３二特異性タンパク質を流速５０μｌ／分でセンサー表面に７２秒間注入した。解離を２００秒間モニタリングし、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いて表面を５０μＬ／分で２０秒間再生した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ｄに示す。
Figure 2023100255000034
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて、二重特異性抗体を一過性ｅｘｐｉ２９３または安定ＣＨＯ細胞から産生した場合のＣＤ３－Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒトＢ７－Ｈ４およびＣＤ３に対する結合親和性の比較を行った。Ｂ７－Ｈ４の結合を試験するために、類似実験を上記のように行ったが、０．５μｇ／ｍＬ Ｂ７－Ｈ４－ＣＤ３ ＩｇＧ２ ＥＥＥ／ＲＲＲ二重特異性抗体を５０μＬ／分で３６秒間チップ上に流し、ヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で７２秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで、２００秒間解離させた。同じセットの濃度を使用した。ＣＤ３の結合を試験するために、同じパラメーターを用いて類似の実験を上記のように行った。結果を表１０－Ｅに示す。
Figure 2023100255000035
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて、様々なＣＤ３バリアントを含有する二特異性薬について、ＣＤ３－Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒトＢ７－Ｈ４およびＣＤ３に対する結合親和性の比較を行った。ＣＤ３の結合を試験するために、以下の変更を行って上記と類似の実験を行った。９００ｎＭ～３．７ｎＭの範囲の濃度を有する３倍希釈系列のＢ７－Ｈ４－ＣＤ３二特異性タンパク質を流速５０μｌ／分でセンサー表面に６０秒間注入した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ｆに示す。
Figure 2023100255000036
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で収集速度１０Ｈｚを用いて、ＩｇＧ２またはＩｇＧ１ ＥＥＥ／ＲＲＲ足場に基づく二特異性薬についてＣＤ３－Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のヒトＢ７－Ｈ４およびＣＤ３に対する結合親和性の比較を行った。Ｂ７－Ｈ４の結合を試験するために上記と類似の実験を行ったが、０．７５μｇ／ｍＬ Ｂ７－Ｈ４－ＣＤ３ ＩｇＧ２ ＥＥＥ／ＲＲＲ二重特異性抗体を１０μＬ／分で４０秒間チップ上に流し、ヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤを５０μＬ／分で６５秒間チップ上に流すことによって会合させ、次いで、６００秒間解離させた。濃度範囲３００ｎＭ～１１ｎＭを使用した。ＣＤ３の結合を試験するために、以下の変更を行って上記と類似の実験を行った。９００ｎＭ～３．７ｎＭの範囲の濃度を有する３倍希釈系列のＢ７－Ｈ４－ＣＤ３二特異性タンパク質を流速５０μｌ／分でセンサー表面に６０秒間注入した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、得られたセンサーグラムのデータを１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって結合親和性および速度定数を決定した。結果を表１０－Ｇに示す。
Figure 2023100255000037
（実施例９）
抗体のＢ７－Ｈ４およびＣＤ３への細胞ベースの結合
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子について細胞ベースの結合を行った。濃度７００ｎＭのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子から開始する１２段階の系列希釈を、ＭＸ１、ＨＣＣ１９５４－Ｌｕｃ、Ｔ４７Ｄ、およびＨＥＫ２９３－ｈｕＢ７－Ｈ４を含む複数のヒトＢ７－Ｈ４発現細胞株、カニクイザルＢ７－Ｈ４発現細胞株ＣＨＯ－ｃｙＢ７－Ｈ４、ならびにマウスＢ７－Ｈ４発現細胞株ＨＥＫ２９３－ｍｓＢ７－Ｈ４と共にインキュベートした。
さらに、健康ドナーＰＢＭＣから単離されたＣＤ３発現初代ヒトＴ細胞、およびカニクイザルＰＢＭＣから単離されたＣＤ３発現細胞のみならず、ラット脾臓ならびにＣ５７およびＢａｌｂＣマウス脾臓からのＣＤ３発現細胞を用いて結合を行った。ヒト汎Ｔ細胞を、Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する負の選択によってＰＢＭＣから単離した。ラットおよびマウスの脾臓を、機械的均質化、赤血球溶解（Ｒｏｃｈｅ）および濾過段階により処理した。
ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中、１％ ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．０１％アジ化ナトリウム（Ｒｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を含有するフロー緩衝液によりすべての細胞を２回洗浄し、フロー緩衝液中に細胞１０万個／ウェルの密度で播種した。すべての遠心分離段階を３００ｇで５分間実行した。
抗体インターナリゼーションを阻害するように機能するアジ化ナトリウムと共にインキュベーションを３７℃で２時間行った。未結合のＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子を２ラウンドの３７℃のフロー緩衝液洗浄／遠心分離段階で洗浄除去した。結合したＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子を、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。二次抗体のインキュベーションを、１：２００希釈して、３７℃で３０分間実行した。未結合の二次抗体を、２ラウンドの３７℃のフロー緩衝液洗浄／遠心分離段階で洗浄除去した。フロー緩衝液を含有する７－ＡＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ溶液（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）中に細胞を再懸濁し、データをフローサイトメータで獲得した。結合飽和の測定されたＥＣ５０を下の表１１－Ａおよび表１１－Ｂに記載する。細胞上で、二重特異性抗体１１６７は、ヒトＢ７－Ｈ４にヒトＣＤ３よりも高い親和性で結合し、これは、ヒトＢ７－Ｈ４に類似した親和性でカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合し、マウスまたはラットＢ７－Ｈ４とは結合しない。
ＨＣＣ１８０６－Ｌｕｃ、ＨＥＫ２９３、およびＣＨＯ細胞を含む、Ｂ７－Ｈ４（またはＣＤ３）を発現しない陰性細胞株は結合を示さなかった。
Figure 2023100255000038
Figure 2023100255000039
（実施例１０）
最適化ＣＤ３－Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介性細胞死滅活性
Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して健康なドナー血液からヒトＰＢＭＣを単離した。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＴ細胞濃縮キットを使用して汎Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した（Ｔ細胞の負の選択）。ルシフェラーゼ発現構築物、ＨＣＣ１９５４－Ｌｕｃ、ＯＶＣＡＲ３－ＬｕｃまたはＨＣＴ１１６－ＬｕｃをトランスフェクトされたＢ７－Ｈ４発現ヒト腫瘍細胞を、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、４５％グルコース３ｍｌ）中に再懸濁した。Ｔ細胞をＲ１０培地中にも再懸濁し、これを５：１または２．５：１のいずれかのエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）で腫瘍細胞に添加した。段階希釈したＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体または陰性対照ＣＤ３二特異性薬で細胞を処理し、２５０×ｇで４分間遠心沈殿して、接触を開始し、３７℃で４８時間インキュベートした。
ルシフェラーゼアッセイについて、Ｖｉｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するｎｅｏｌｉｔｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭで４パラメーター非線形回帰分析を使用してＥＣ５０値を計算した。
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイについて、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）およびＶｉｃｔｏｒマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、傷ついた標的細胞から放出されたＬＤＨ。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭで４パラメーター非線形回帰分析を使用してＥＣ５０値を計算した。
結果を表１２に示す。これらの結果は、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体が、ヒトＢ７－Ｈ４をｉｎ ｖｉｔｒｏ発現する様々な細胞株の細胞傷害性Ｔ細胞死滅作用を再方向付けしたことを実証している。これらの細胞株には、卵巣がん細胞株に加えて、ＨＲ＋ＨＥＲ２－、ＨＥＲ２＋、およびＴＮＢＣサブタイプの乳がん細胞株が含まれる。さらに、抗体１１５６および１１６７は、カニクイザルにも交差反応性であることが示されている。
Figure 2023100255000040
Figure 2023100255000041
（実施例１１）
Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体媒介活性のｉｎ ｖｉｖｏ評価 － 養子移入またはＰＢＭＣモデル
無血清ＰＢＭＣ解凍溶液（ＣＴＬ ＃ＡＡ－００５）を補充した、５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００－３１８）、１％ Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．０１ｍＭ ２－メルカプトエタノール含有培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）中で細胞約１０００万個／ｍｌのヒトＰＢＭＣを解凍した。細胞を室温で５分間インキュベーション後に細胞を遠心沈殿し、細胞５０００万個／ｍｌの濃度でＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴ細胞を単離した。Ｔ細胞を活性化させ、ヒトＴ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して増殖させた。２日目に増殖のためにＴ細胞をＧ－Ｒｅｘ細胞培養装置に移し、ＩＬ－２（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を培地に添加し、３日後に補充した。活性化／増殖の１週間後にＴ細胞を回収した。回収時に、ビーズを磁石で除去し、ｉｎ ｖｉｖｏ接種のために細胞をＤＰＢＳ中に１ｘ１０７または１．５ｘ１０７個／ｍＬで再懸濁した。
異種移植研究のために、ＮＳＧマウスに、乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ４６８、ＨＣＣ１９５４、ＭＸ１－Ｌｕｃ、ＺＲ７５－１、およびＴ４７Ｄ）または患者由来異種移植片（ＰＤＸ－ＢＲＸ－１１３８０、ＰＤＸ－ＢＲＸ－１２３５１、ＰＤＸ－ＢＲＸ－２４３０１、ＰＤＸ－ＢＲＸ－２４３０５、ＰＤＸ－ＢＲＸ－２６３０２、ＰＤＸ－ＢＲＸ－２６３０５、ＰＤＸ－ＢＲＸ－２６３６０、ＰＤＸ－ＯＶＸ－２４４０９）断片のいずれかを側腹部に皮下接種した。デジタルＶｅｒｎｉｅｒノギスを使用して腫瘍測定値を収集し、修正楕円式１／２×長さ×幅２の使用によって体積を計算した。腫瘍サイズ２００～４００ｍｍ３でマウスを無作為化し、ステージ分けした。
ヒトＰＢＭＣ生着実験（「ＰＭＢＣモデル」）について、５００万個のヒトＰＢＭＣを初回投与の６日前に静脈内注射した。
ヒトＴ細胞養子移入実験について、初回投与の１日後に２５０万個の培養ヒトＴ細胞を接種した。マウスに、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子または対照を１週間に最大３回の０．２ｍＬボーラス注射として投薬した。
移植片対宿主応答の徴候についての連続モニタリングと共に、腫瘍の測定値を週２回収集した。すべてのＢ７－Ｈ４ｘＣＤ３二特異性分子は、細胞株異種移植および患者由来異種移植モデルの両方で用量依存的Ｔ細胞媒介抗腫瘍活性を示した。下の表は、本明細書において実施された様々な実験の用量、腫瘍体積、ＳＥＭ（標準誤差）および腫瘍成長阻害率（ＴＧＩ）を示す。
結果を下の表１３Ａ～Ｎに記載する。これらの結果は、Ｂ７－Ｈ４ｘＣＤ３二重特異性抗体が乳がんのｉｎ ｖｉｖｏヒト細胞株異種移植および患者由来異種移植モデルにおいて静脈内および皮下投薬の両方で用量依存的に殺腫瘍活性を誘導したことを実証している。これらのモデルは、ＨＲ＋ＨＥＲ２－、ＨＥＲ２＋、およびＴＮＢＣ分子サブタイプの乳がんを含む。
Figure 2023100255000042
Figure 2023100255000043
Figure 2023100255000044
Figure 2023100255000045
Figure 2023100255000046
Figure 2023100255000047
Figure 2023100255000048
Figure 2023100255000049
Figure 2023100255000050
Figure 2023100255000051
Figure 2023100255000052
Figure 2023100255000053
Figure 2023100255000054
Figure 2023100255000055
（実施例１２）
Ｂ７－Ｈ４についての受容体密度アッセイ
ヒト腫瘍細胞を発現するＢ７－Ｈ４を回収し、抗体－ＰＥの１：１コンジュゲート抗Ｂ７－Ｈ４抗体および陰性対照抗体の連続希釈物により染色した。ＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）フィコエリトリン（ＰＥ）定量キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４０４９５）と共にＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０を使用して染色細胞を獲得した。Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ＰＥキットからの標準曲線を使用して抗体の飽和濃度での細胞あたりのＢ７－Ｈ４の平均受容体密度を計算した。
結果を表１４に示す。結果は、腫瘍細胞上のＢ７－Ｈ４密度と、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞死滅作用の再方向付けの誘導における抗体１１６７のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力との間に強い相関があること、およびＢ７－Ｈ４密度が高いほど、小さなＥＣ５０値から示されるように効力が高いことを実証している。
Figure 2023100255000056
（実施例１３）
Ｂ７－Ｈ４抗体のエピトープビニング
ＯｃｔｅｔＲＥＤ ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いるタンデムビニングアッセイを使用して、モノクローナルＩｇＧ１形態のＢ７－Ｈ４抗体を、ヒトＢ７－Ｈ４に対する競合および非競合結合について評価した。Ｏｃｔｅｔアッセイを室温で行った。第一に、アミン反応性第二世代センサー（ＡＲ２Ｇ）をＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびｓ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）で３００秒間活性化した。次いで、予備活性化センサーに、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に希釈した抗Ｂ７－Ｈ４抗体の第１セット（ｍＡｂ １）を３００秒間コーティングし、次いでエタノールアミンによりさらに３００秒間クエンチした。動態緩衝液中でセンサーを６０秒間平衡化した後、捕獲されたｍＡｂ １にヒトＢ７－Ｈ４を３００秒間結合させた。次いで、センサーを動態緩衝液中に６０秒間浸し、続いて第２抗体（ｍＡｂ ２）と共に３００秒間インキュベートした。この対組合せで各抗体を試験した。ヒトＢ７－Ｈ４ ＥＣＤ上の同じ結合領域を競合するｍＡｂを単一のビンにグループ分けした。抗Ｂ７－Ｈ４抗体の８つ組（Ｏｃｔｅｔ）によるエピトープビニングは、Ｂ７－Ｈ４抗体によって認識される２つの独特なエピトープ群を実証している（表１５）。
Figure 2023100255000057
（実施例１４）
Ｂ７－Ｈ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と複合体化した抗Ｂ７－Ｈ４抗体００５２ ｓｃＦｖ、抗Ｂ７－Ｈ４抗体００５８ Ｆａｂおよび抗体１１１４ Ｆａｂの結晶化および構造決定
抗体００５２ ｓｃＦｖおよびＢ７－Ｈ４ ＥＣＤの共結晶構造：結晶化試行のために、Ｂ７－Ｈ４抗体００５２ ｓｃＦｖとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの間に１：１．２のモル比で複合体を形成させ、これをＴＢＳ（ｐＨ７．５）を含有するタンパク質溶液中で１５．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ硫酸リチウム、２５％ ＰＥＧ３３５０を含有する条件から懸滴蒸気拡散法によって結晶を得た。結晶は、格子パラメーターａ＝５９．３３Å；ｂ＝１６９．６０Å；ｃ＝２１３．９８Åで結晶学的非対称ユニット中にＢ７－Ｈ４抗体００５２ ｓｃＦｖとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの複合体の２つのコピーを有する斜方晶系空間群＝Ｐ２１２１２１に一致する対称性を有した。結晶を液体窒素中で急速冷凍した。Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）のＩＭＣＡビームライン１７－ＩＤで２．６Å分解能のデータセットを単一凍結結晶から収集した。データを処理し、ａｕｔｏＰＲＯＣを使用してスケーリングし、最終データセットは６０．３％完了であった。
ＰＨＡＳＥＲを用いて分子置換により構造を解析した。手作業の調整とＣＯＯＴを使用するモデル再構築とのいくつかの反復ラウンドおよびａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用する結晶学的精密化により、結晶学的Ｒｗｏｒｋ２２．２％およびＲｆｒｅｅ２５．０％を有する抗体００５２ ｓｃＦｖ＋Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤの最終モデルがもたらされた。ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜－｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと同等であるが、精密化工程から省略された、ランダムに選択された５％の反射について計算された。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤと複合体化したＢ７－Ｈ４抗体００５２ ｓｃＦＶの結晶構造を図２Ａに示す。図２Ａに示されるように、Ｂ７－Ｈ４抗体００５２は、Ｂ７－Ｈ４ Ｖ１ドメインの前方ベータシートから離れてＢ７－Ｈ４ ＥＣＤのＶ２ドメインに結合する。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤ上のエピトープアミノ酸残基は、３．８オングストローム以下の抗体００５２のアミノ酸残基と接触しているアミノ酸残基として同定される。表１６－Ａは、抗体００５２によって認識されるエピトープに含まれるＢ７－Ｈ４ ＥＣＤのアミノ酸残基を記載する。これらのうち、（１）対応する抗体アミノ酸残基と水素結合を形成する、または（２）標的－抗体相互作用を受けて埋もれた、Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤエピトープアミノ酸残基が、さらに表に注記される。
Figure 2023100255000058
抗体００５８ ＦａｂとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの共結晶構造：同様に、Ｂ７－Ｈ４抗体００５８ ＦａｂとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの間の複合体を１：１．２のモル比で形成させ、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）を含有するタンパク質溶液中に９．１ｍｇ／ｍｌとなるように濃縮した。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１５％ ＰＥＧ６０００を含有する条件から懸滴蒸気拡散法によって結晶を得た。結晶は、格子パラメーターａ＝８１．０７Å；ｂ＝９６．９９Å；ｃ＝１１６．０８Å、α＝９０．００°；β＝１０３．１９°；γ＝９０．００°で結晶学的非対称ユニット中にＢ７Ｈ４抗体００５８ Ｆａｂ－Ｂ７－Ｈ４複合体の２つのコピーを有する単斜晶系空間群＝Ｐ２１に一致する対称性を有した。２０％エチレングリコールを含有するリザーバ溶液を使用して結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷凍した。Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）のＩＭＣＡビームライン１７－ＩＤで２．２Å分解能へのデータセットを単一凍結結晶から収集した。データを処理し、ａｕｔｏＰＲＯＣを使用してスケーリングし、最終データセットは５２．９％完了であった。
ＰＨＡＳＥＲを用いて分子置換により構造を解析した。手作業の調整とＣＯＯＴを使用するモデル再構築とのいくつかの反復ラウンドおよびａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用する結晶学的精密化により、結晶学的Ｒｗｏｒｋ２１．６％およびＲｆｒｅｅ２３．７％を有するＢ７Ｈ４抗体００５８ Ｆａｂ ＋ Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤの最終モデルがもたらされた。ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜－｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと同等であるが、精密化工程から省略された、ランダムに選択された５％の反射について計算された。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤと複合体化したＢ７－Ｈ４抗体００５８ Ｆａｂの結晶構造を図２Ｂに示す。図２Ｂに示されるように、Ｂ７－Ｈ４抗体００５８は、Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤのＶ１ドメインの前方ベータシートおよびその周辺でＢ７－Ｈ４ ＥＣＤに結合する。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤ上のエピトープアミノ酸残基は、３．８オングストローム以下の抗体００５８のアミノ酸残基と接触しているアミノ酸残基として同定される。表１６－Ｂは、抗体００５８によって認識されるエピトープに含まれるＢ７－Ｈ４ ＥＣＤのアミノ酸残基を記載する。これらのうち、（１）対応する抗体アミノ酸残基と水素結合を形成する、または（２）標的－抗体相互作用を受けて埋もれた、Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤエピトープアミノ酸残基が、さらに表に注記される。
抗体１１１４ ＦａｂとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの共結晶構造：Ｂ７Ｈ４抗体１１１４ ＦａｂとＢ７－Ｈ４ ＥＣＤとの複合体を１：１のモル比で形成させ、ＴＢＳ（ｐＨ７．５）を含有するタンパク質溶液中に９．２７ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１５％ ＰＥＧ ６０００を含有する条件から懸滴蒸気拡散法によって結晶を得た。結晶は、格子パラメーターａ＝９６．４３Å；ｂ＝７８．１９Å；ｃ＝１１６．２１、α＝９０．００；β＝９０．１３．１９；γ＝９０．００Åで結晶学的非対称ユニット中にＢ７－Ｈ４抗体１１１４ ＦａｂとＢ７－Ｈ４ ＥＤＣとの複合体の２つのコピーを有する単斜晶系空間群＝Ｐ２１に一致する対称性を有した。２０％グリセロールを含有するリザーバ溶液を使用して結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷凍した。Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）のＩＭＣＡビームライン１７－ＩＤで２．３２Å分解能のデータセットを単一凍結結晶から収集した。データを処理し、ａｕｔｏＰＲＯＣを使用してスケーリングし、最終データセットは４７．６％完了であった。
ＰＨＡＳＥＲを用いて分子置換により構造を解析した。手作業の調整とＣＯＯＴを使用するモデル再構築とのいくつかの反復ラウンドおよびＰｈｅｎｉｘを使用する結晶学的精密化により、結晶学的Ｒｗｏｒｋ２２．４％およびＲｆｒｅｅ２７．６％を有するＢ７－Ｈ４抗体１１１４ Ｆａｂ＋Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤの最終モデルがもたらされた。ここで、Ｒｗｏｒｋ＝｜｜Ｆｏｂｓ｜－｜Ｆｃａｌｃ｜｜／｜Ｆｏｂｓ｜であり、ＲｆｒｅｅはＲｗｏｒｋと同等であるが、精密化工程から省略された、ランダムに選択された５％の反射について計算された。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤと複合体化したＢ７－Ｈ４抗体１１１４ Ｆａｂの結晶構造を図２Ｃに示す。図２Ｃに示すように、Ｂ７－Ｈ４抗体１１１４は、Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤのＶ１ドメインの前方ベータシートおよびその周辺でＢ７－Ｈ４ ＥＣＤに結合する。
Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤ上のエピトープアミノ酸残基を、３．８オングストローム以下の抗体１１１４のアミノ酸残基と接触しているアミノ酸残基として同定する。表１６－Ｂは、抗体１１１４によって認識されるエピトープに含まれるＢ７－Ｈ４ ＥＣＤのアミノ酸残基を記載する。これらのうち、（１）対応する抗体アミノ酸残基と水素結合を形成する、または（２）標的－抗体相互作用を受けて埋もれた、Ｂ７－Ｈ４ ＥＣＤエピトープアミノ酸残基が、さらに表に注記される。
Figure 2023100255000059

Claims (43)

  1. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、
    （ａ）配列番号２３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５および配列番号１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＣＤＲ１）、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３；ならびに
    （ｂ）配列番号２７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９および配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、医薬組成物。
  2. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｂ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｃ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｄ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｅ）配列番号１５７のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｆ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｇ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｈ）配列番号１５９のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｊ）配列番号１６３のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｋ）配列番号１６５のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｌ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｍ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｏ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｐ）配列番号１７３のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｑ）配列番号１７４のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｒ）配列番号１７５のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｓ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１６８のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｔ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１６９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；
    （ｕ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１７０のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ；または
    （ｖ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有する前記ＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有する前記ＶＬ
    を含む抗体からのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｂ）配列番号２０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｃ）配列番号２０６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｅ）配列番号１９９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｆ）配列番号２００のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    （ｈ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；または
    （ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、
    配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、医薬組成物。
  5. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｂ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｃ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｄ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｅ）配列番号１５７のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｆ）配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨ；配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｇ）配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｈ）配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｊ）配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｋ）配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｌ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｍ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｎ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｏ）配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｐ）配列番号１７３のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｑ）配列番号１７４のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｒ）配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｓ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６８のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｔ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｕ）配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＶＬ；または
    （ｖ）配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬ
    を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、医薬組成物。
  7. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨ；および配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、医薬組成物。
  8. 前記抗体が定常領域をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 前記定常領域がＩｇＧ１またはＩｇＧ２のアイソタイプである、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記抗体が、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むヒトＩｇＧ２であり、番号付けが、ヒトＩｇＧ２野生型およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 前記抗体が、置換Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８ＥおよびＬ３６８Ｅを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記抗体が、置換Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１ＳおよびＤ２６５Ａを含む、請求項１０または請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、配列番号１９０のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１９１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、医薬組成物。
  14. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、配列番号１８６のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１８７のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、医薬組成物。
  15. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７７９の下で寄託されたポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む重鎖、およびＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８１と共に寄託されたポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、医薬組成物。
  16. 前記抗体の前記ＶＨ ＣＤＲ１、前記ＶＨ ＣＤＲ２、前記ＶＨ ＣＤＲ３、前記ＶＬ ＣＤＲ１、前記ＶＬ ＣＤＲ２および前記ＶＬ ＣＤＲ３の各々が、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、または接触定義に従って定義される、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
  17. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された第１の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該第１の抗体が、第２の抗体とＢ７－Ｈ４との結合について競合し、該第２の抗体が、
    （ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｃ）配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｆ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６０のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７０のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｊ）配列番号７４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｋ）配列番号８０のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号８４のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｌ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９０のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｍ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｎ）配列番号９４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号９６のアミノ酸配列を有するＶＬ；
    （ｏ）配列番号１００のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号７７のアミノ酸配列を有するＶＬ；または
    （ｐ）配列番号１０４のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６７のアミノ酸配列を有するＶＬ
    を含む抗体であって、
    該第１の抗体が、約１マイクロモル濃度～０．１ナノモル濃度のヒトＢ７－Ｈ４に対するＫＤを有する、医薬組成物。
  18. Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と,、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、該抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有するＢ７－Ｈ４細胞外ドメインのＬ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、医薬組成物。
  19. 対象における、Ｂ７－Ｈ４を発現する細胞と関連する状態を処置するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 前記状態ががんである、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記がんが、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮がんまたは胆管がんである、請求項２１に記載の医薬組成物。
  22. Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、該二重特異性抗体が第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、前記第１の重鎖および前記第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のアームを形成し、前記第２の重鎖および前記第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のアームを形成し、
    （ａ）前記第１の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｂ）前記第１の重鎖が、配列番号２０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｃ）前記第１の重鎖が、配列番号２０６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｄ）前記第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｅ）前記第１の重鎖が、配列番号２００のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２０１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｆ）前記第１の重鎖が、配列番号１９９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｇ）前記第１の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｈ）前記第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；または
    （ｉ）前記第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、医薬組成物。
  23. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｂ）前記第１の重鎖が、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｃ）前記第１の重鎖が、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｄ）前記第１の重鎖が、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｅ）前記第１の重鎖が、配列番号１５７のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｆ）前記第１の重鎖が、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｇ）前記第１の重鎖が、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｈ）前記第１の重鎖が、配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｉ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｊ）前記第１の重鎖が、配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｋ）前記第１の重鎖が、配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｌ）前記第１の重鎖が、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｍ）前記第１の重鎖が、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｎ）前記第１の重鎖が、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｏ）前記第１の重鎖が、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｐ）前記第１の重鎖が、配列番号１７３のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｑ）前記第１の重鎖が、配列番号１７４のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｒ）前記第１の重鎖が、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｓ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６８のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｔ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｕ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；または
    （ｖ）前記第１の重鎖が、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、配列番号２０２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｃ）前記第２の重鎖が、配列番号２０３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２０４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｄ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；
    （ｅ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含むか；または
    （ｆ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、
    請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第２の重鎖が、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；
    （ｃ）前記第２の重鎖が、配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＶＬを含むか；または
    （ｄ）前記第２の重鎖が、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
    請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
  26. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第１の重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
  27. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第１の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第１の軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
  28. 前記二重特異性抗体において、
    （ａ）前記第１の重鎖が、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＶＬを含み；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
  29. 前記二重特異性抗体において、
    （ｃ）前記第１の重鎖が、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第１の軽鎖が、配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含み；
    （ｄ）前記第２の重鎖が、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
  30. 前記二重特異性抗体が定常領域をさらに含む、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 前記二重特異性抗体の前記定常領域がＩｇＧ１である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記二重特異性抗体の前記定常領域が、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むヒトＩｇＧ２であり、番号付けが、ヒトＩｇＧ２野生型およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. 前記二重特異性抗体の前記第１のアームが、置換Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅを有するヒトＩｇＧ２ΔＡ定常領域をさらに含み、前記第２のアームが、置換Ｄ２６５Ａ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒを有するヒトＩｇＧ２ΔＡ定常領域をさらに含み、番号付けが、ヒト野生型ＩｇＧ２およびＥＵ番号付けスキームに従い、図１に示される通りである、請求項２２から３０および３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  34. Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、該二重特異性抗体が、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、前記第１の重鎖および前記第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、前記第２の重鎖および前記第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、
    （ａ）前記第１の重鎖が配列番号１９０のアミノ酸配列を有し、前記第１の軽鎖が配列番号１９１のアミノ酸配列を有し；
    （ｂ）前記第２の重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖が配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、医薬組成物。
  35. Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、該二重特異性抗体が、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、前記第１の重鎖および前記第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、前記第２の重鎖および前記第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、
    （ａ）前記第１の重鎖が配列番号１８６のアミノ酸配列を有し、前記第１の軽鎖が配列番号１８７のアミノ酸配列を有し；
    （ｂ）前記第２の重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖が配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、医薬組成物。
  36. Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、該二重特異性抗体が、第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、前記第１の重鎖および前記第１の軽鎖が、Ｂ７－Ｈ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１の抗体アームを形成し、前記第２の重鎖および前記第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインを形成し、
    （ａ）前記第１の重鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７７９の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、前記第１の軽鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８１の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）前記第２の重鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８０の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、前記第２の軽鎖が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ－１２６７８２の下で寄託されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされる全長ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
  37. Ｂ７－Ｈ４およびＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、該二重特異性抗体が、配列番号１のＢ７－Ｈ４アミノ酸配列のＬ４４、Ｋ４５、Ｅ４６、Ｇ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｇ５０、Ｌ５１、Ｓ６３、Ｅ６４、Ｄ６６、Ｍ６８、Ｔ９９およびＫ１０１からなる群からの少なくとも２つのアミノ酸残基を含むヒトＢ７－Ｈ４上のエピトープに結合する、医薬組成物。
  38. 必要とする対象においてがんを処置するための、請求項２２から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  39. 対象における、Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞と関連する状態を処置するための請求項２２から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  40. 前記状態ががんである、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がんまたは胆管がんである、請求項４０に記載の医薬組成物。
  42. Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍成長または進行を阻害するための請求項２２から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  43. Ｂ７－Ｈ４を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍退縮を誘導するための請求項２２から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
JP2022205035A 2022-01-05 2022-12-22 治療用抗体およびそれらの使用 Pending JP2023100255A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022000366 2022-01-05
JP2022000366 2022-01-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023100255A true JP2023100255A (ja) 2023-07-18

Family

ID=87200715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022205035A Pending JP2023100255A (ja) 2022-01-05 2022-12-22 治療用抗体およびそれらの使用

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2023100255A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11155630B2 (en) Therapeutic antibodies and their uses
JP7234142B2 (ja) Ｆｌｔ３に特異的な抗体およびその使用
US11613581B2 (en) Antibodies and antibody-drug conjugates specific for CD123 and uses thereof
TWI793325B (zh) 對cd3具特異性之抗體及其用途
JP2020510435A (ja) 抗ｇｉｔｒ抗体およびその使用方法
US20240018244A1 (en) Therapeutic antibodies and their uses
JP2023100255A (ja) 治療用抗体およびそれらの使用
KR20230107478A (ko) 치료 항체 및 그의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230420