KR100651294B1 - 누클레오시드의 위치적 변형에 의한 올리고누클레오티드ＣｐＧ-매개된 면역 자극의 조절 - Google Patents

누클레오시드의 위치적 변형에 의한 올리고누클레오티드ＣｐＧ-매개된 면역 자극의 조절 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드에 의해 일어나는 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 통해 면역치료법 적용을 위한 면역자극 효과를 증가시키는 것 뿐만 아니라 안티센스 적용을 위한 면역자극 효과를 감소시키는 것 둘 모두가 가능하다.

Description

누클레오시드의 위치적 변형에 의한 올리고누클레오티드 ＣｐＧ-매개된 면역 자극의 조절{MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES}
본 발명은 안티센스 적용법에서, 및 면역자극제로서 올리고누클레오티드의 치료학적 용도에 관한 것이다.
올리고누클레오티드는 현대 분자생물학에서 필수적인 도구가 되었고, PCR을 위한 진단학적 프로빙 방법에서부터 PCR 및 유전자 발현의 안티센스 억제에 이르기 까지 매우 다양한 기술에 사용되고 있다. 올리고누클레오티드의 이러한 광범위한 용도는 올리고누클레오티드를 합성하기 위한 신속하고 저렴하고 능률적인 방법에 대한 요구를 증가시켰다.
안티센스 및 진단학적 적용을 위한 올리고누클레오티드의 합성은 현재 통상적으로 수행될 수 있다[참조: Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189(S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., 1991); and Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); and Antisense Research and Applications(Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)]. 초기의 합성법은 포스포디에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. 코라나(Khorana) 등의 문헌[참조: J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)]에는 올리고누클레오티드 합성을 위한 포스포디에스테르 화학이 기술되어 있다. 리세(Reese)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)]에는 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학이 기술되어 있다. 이러한 초기 접근법들은 주로 합성을 위해 더욱 능률적인 포스포라미디트 및 H-포스포네이트 접근법에 대한 방법을 제공하였다. 뷰케이지(Beaucage) 및 카루써스(Caruthers)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)]에는 폴리누클레오티드 합성에 있어서 데옥시누클레오시드 포스포라미디트의 용도가 기술되어 있다. 아그로월(Agrawal) 및 자메크닉(Zamecnik)의 미국 특허 제 5,149,798호(1992)에는 H-포스포네이트 접근법에 의한 올리고누클레오티드의 최적화된 합성법이 기술되어 있다.
이들 현대적 접근법 둘 모두는 다수의 변형된 누클레오티드간 결합을 가진 올리고누클레오티드를 합성하기 위해 사용되어 왔다. 아그로월 및 굿차일드(Goodchild)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)]에는 포스포라미디트 화학을 사용한 올리고누클레오티드 메틸포스포네이트의 합성이 교시되어 있다. 코놀리(Connolly) 등의 문헌[참조: Biochemistry 23: 3443 (1984)]에는 포스포라미디트 화학을 사용한 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트의 합성이 기술되어 있다. 제이거(Jager) 등의 문헌[참조: Biochemistry 27: 7237 (1988)]에는 포스포라미디트 화학을 사용한 올리고누클레오티드 포스포라미데이트 의 합성이 기술되어 있다. 아그로월 등의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)]에는 H-포스포네이트 화학을 사용한 올리고누클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 합성이 기술되어 있다.
더욱 최근에, 몇몇 연구자들은 질환의 치료학적 치료를 위한 안티센스 접근법의 유효성을 증명하였다. 크루크(Crooke)의 문헌[참조: Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii]에는 사람 사이토메갈로바이러스-유도된 망막염의 치료를 위해 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 성공적인 판매 승인이 기술되어 있다. 불행하게도, 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 사용은 처음에 예상했던 것 보다 더욱 복잡해졌다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 의해 일어나는 특정 효과는 예상된 안티센스 메카니즘에 의해 설명될 수 없었다. 예를 들어, 문헌[참조: McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)]은 "센스" 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 특이적인 면역 자극을 일으킨다고 교시하고 있다. 이러한 부작용 및 기타 부작용은 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 대한 상황을 복잡하게 하였다. 쟈오(Zhao) 등의 문헌[참조: Biochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996)]에는 하나는 HIV-1으로부터의 gag 유전자(5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3')와 상보적이고, 다른 하나는 HIV-1의 rev 유전자(5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC-3')와 상보적인 두 개의 CpG-함유 올리고누클레오티드에 의해 매개된 면역 자극이 기술되어 있다.
다른 한편으로는, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 면역 자극을 유도시킬 수 있다는 관찰은 치료학적 도구로서 이러한 부작용을 개발하는 데에 관심이 생기게 하였다. 이러한 노력은 디누클레오티드 CpG를 함유하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 초점을 맞추었다. 쿠라모토(Kuramoto)등의 문헌[참조: Jpn, J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)]에는 CpG 디누클레오티드를 포함하는 팔린드롬을 함유하는 포스포디에스테르 올리고누클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도하고 내츄럴 킬러 활성을 향상시킬 수 있다고 교시되어 있다. 크리에그(Krieg) 등의 문헌[참조: Nature 371: 546-549 (1995)]에는 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고누클레오티드가 면역자극성임이 기술되어 있다. 리앙(Liang) 등의 문헌[참조: J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)]에는 이들 올리고누클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킴이 기술되어 있다. 몰도베누(Moloveanu) 등의 문헌[참조: Vaccine 16: 1216-124 (1998)]에는 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 향상시킴이 교시되어 있다. 맥클러스키(McCluskie) 및 데이비스(Davis)의 문헌[참조: The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)]에는 CpG-함유 올리고누클레오티드가 강력한 면역자극제로서 작용하여, B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 면역 반응을 향상시켰음이 교시되어 있다. 아그로월의 미국 특허 제 5,968,909호에는 C 또는 G의 골격 변형이 이러한 효과를 억제시킴이 교시되어 있다.
이들 보고는 CpG-함유 올리고누클레오티드에 의해 일어나는 면역 반응을 조절할 필요가 있음을 명백히 하였다. 이상적으로, 이러한 조절은 면역치료 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시키는 것 뿐만 아니라, 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시키는 것을 포함해야 한다.
발명의 요약
본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드에 의해 일어나는 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역치료 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시키는 것 뿐만 아니라, 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시키는 것 둘 모두를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 어느 하나의 적용을 위해 최적 수준의 면역자극 효과를 갖는 올리고누클레오티드 및 이러한 올리고누클레오티드를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명자는 놀랍게도 CpG-함유 올리고누클레오티드의 위치적 변형이 이들의 면역자극 능력에 극적으로 영향을 미침을 발견하였다. 특히, CpG 디누클레오티드에 대한 5' 또는 3'쪽의 특정 위치에서 올리고누클레오티드의 2' 알킬화 또는 알콕시화는 이들의 면역자극 효과를 향상시키거나 감소시켰다.
첫번째 일면에서, 본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 일면에 따른 방법은 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함하며, 여기서 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다.
두번째 일면에서, 본 발명은 감소된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드를 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하고, 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다.
세번째 일면에서, 본 발명은 감소된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물의 유전자 발현을 안티센스 특이적으로 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하고, 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다.
네번째 일면에서, 본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 gag 또는 rev 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 본 발명의 본 일면에 따른 방법은 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함한다. 특정한 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 대안적인 구체예에서 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드일 수 있다.
다섯번째 일면에서, 본 발명은 증가된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드를 제공하며, 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하며, 여기서 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 gag 또는 rev 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 특정한 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다.
여섯번째 일면에서, 본 발명은 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하는 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 rev 또는 gag 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 특정한 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다.
도면의 간단한 설명
도 1은 올리고누클레오티드 부재(C), 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 다양한 올리고누클레오티드의 존재하에 마우스 비장 세포의 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 올리고누클레오티드를 투여하지 않거나 다양한 올리고누클레오티드를 투여한 마우스에서의 비장 팽창을 도시한 것이다.
도 3은 변형된 염기들의 바람직한 구체예를 도시한 것이다.
본 발명은 안티센스 접근법에서, 및 면역자극제로서 올리고누클레오티드의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본원에 인용된 특허 및 출판물들은 당분야의 지식의 수준을 반영하며 이에 이들 전체를 참조로 인용하였다. 본원에 인용된 임의의 참고문헌의 임의의 교시 및 본 명세서 사이의 대립되는 부분에 있어서는, 본 발명의 목적을 위해 본 명세서를 우선시 할 것이다.
본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드에 의해 일어나는 면역 반응을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역치료 적용을 위해 면역자극 효과를 증가시키는 것 뿐만 아니라 안티센스 적용을 위해 면역자극 효과를 감소시키거나 증가시키는 것 둘 모두를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 어느 한가지 적용을 위한 최적 수준의 면역자극 효과를 갖는 올리고누클레오티드 및 이러한 올리고누클레오티드를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명자는 CpG-함유 올리고누클레오티드의 위치적 변형이 이들의 면역자극 능력에 극적으로 영향을 미침을 발견하였다. 특히, CpG 디누클레오티드에 대한 5' 또는 3'쪽의 특정 위치에서 올리고누클레오티드의 알킬화 또는 알콕시화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 2' 치환은 이들의 면역자극 효과를 향상시키거나 감소시킨다.
첫번째 일면에서, 본 발명은 CpG-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 일면에 따른 방법은 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접하는 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함하며, 여기서 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다. 바람직한 구체예에서 상기 방법은 유전자 또는 유전자 전사체와 상보적인 올리고누클레오티드를 제조하기 위해 사용된다. 특정한 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 활성을 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드가 올리고누클레오티드에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 올리고누클레오티드내로 도입된다. 일부 바람직한 구체예에서, 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드가 올리고누클레오티드내로 도입된다.
본 발명의 처음 세 가지 일면을 위해 사용된 바와 같이, 용어 "상보적인"은 생리학적 조건하에서 게놈 영역, 유전자 또는 이의 RNA 전사체와 하이브리드화되는 능력을 가진 것을 의미한다. 이러한 하이브리드화는 보통 염기 스태킹(base stacking) 뿐만 아니라 그 밖의 수소결합 모드가 하이브리드화를 초래할 수 있지만, 바람직하게는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 휴그스틴(Hoogsteen) 염기쌍을 형성하기 위한 상보적인 가닥 사이의 염기-특이적 수소 결합의 결과이다. 실제로, 이러한 하이브리드화는 특정 유전자 발현 억제의 관찰로부터 추론될 수 있다.
본 발명의 처음 세 가지 일면을 위해 사용되는 바와 같이, "안티센스 활성"은 올리고누클레오티드가 세포 또는 동물내로 도입되는 경우, 이와 상보적인 RNA의 발현에 있어서 감소를 초래하는 것을 의미한다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 간단하게 CpG 디누클레오티드를 혼입시킨 직후 합성 과정 주기에서 적절한 2' 치환된 단량체 합성단위체를 사용함으로써 임의의 널리 공지된 합성 기술을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 바람직한 단량체에는 포스포라미디트, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트가 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, "CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것"은 간단하게 이러한 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 갖는 올리고누클레오티드를 합성하는 것을 의미한다.
두번째 일면에서, 본 발명은 감소된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드를 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하고, 여기서 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다. 바람직하게는, 상기 올리고누클레오티드는 약 12개 내지 약 50개의 누클레오티드, 가장 바람직하게는 약 12개 내지 약 35개의 누클레오티드를 가질 것이다. 본 발명의 본 일면에 따른 바람직한 올리고누클레오티드는 유전자 또는 유전자 전사체와 상보적이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 올리고누클레오티드는 안티센스 활성을 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드를 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드를 갖는다.
세번째 일면에서, 본 발명은 감소된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물의 유전자 발현을 안티센스 특이적으로 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5' 측 및 이에 인접한 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하고, 여기서 하나 이상의 누클레오시드는 2'-O-메틸리보누클레오시드가 아니고 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 gag 또는 rev 유전자와 상보적이지 않다. 일부 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드내에 존재하는 각각의 CpG 디누클레오티드에 대해 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드를 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 단 하나의 2' 치환된 누클레오시드를 갖는다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법에서, 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 투여는 비경구적, 경구적, 설하적, 경피적, 국소적, 비내적, 질내적, 호흡기, 초자체내 또는 직장내적이어야 한다. 치료 조성물의 투여는 증상을 감소시키거나 질환의 마커를 대신하기에 효과적인 투여량 및 기간 동안 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료 조성물은 바람직하게는 약 0.01 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 올리고누클레오티드의 혈중 레벨을 달성하기에 충분한 용량으로 투여된다. 국소 투여를 위해, 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있고, 훨씬 높은 농도는 관용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 전체 투여량은 1일 환자 1명 당 약 0.01 mg의 올리고누클레오티드 내지 1일 체중 1 kg 당 약 200 mg의 올리고누클레오티드의 범위일 것이다. 올리고누클레오티드는 제형화되거나 나출될 수 있다. 단일 치료 에피소드로서 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 치료 조성물을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 조성물을 투여한 후에, 보체 활성화, 유사분열생식 및 트롬빈 응괴 형성의 억제로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 효과에 대해 하나 이상의 측정이 수행된다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 질환 또는 유전자 발현에 대한 동물 모델에서 유용하고, 사람 질환의 치료적 처치를 위해 추가로 유용하다.
네번째 일면에서, 본 발명은 면역자극 모티프(예컨대, CpG)-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 gag 또는 rev 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 본 발명의 본 일면에 따른 방법은 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함한다. 특정한 바람직한 구체예에서, 상기 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 간단하게 CpG 디누클레오티드를 혼입시킨 직후 합성 과정 주기에서 적절한 2' 치환된 단량체 합성단위체를 사용함으로써 임의의 널리 공지된 합성 기술을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 바람직한 단량체에는 포스포라미디트, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트가 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, "CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오시드내로 도입시키는 것"은 간단하게 이러한 위치 또는 위치들에 2' 치환된 누클레오시드를 갖는 올리고누클레오티드를 합성하는 것을 의미한다.
본 발명의 네번째, 다섯번째 및 여섯번째 일면의 목적을 위해, "안티센스 올리고누클레오티드"는 유전자 또는 유전자 전사체와 정확하게 상보적이고, 정확하게 상보적인 유전자 또는 유전자 전사체의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고누클레오티드이다.
다섯번째 일면에서, 본 발명은 증가된 면역자극 효과를 갖는 면역자극 모티프(예컨대, CpG) 함유 올리고누클레오티드를 제공하며, 상기 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하고, 여기서 상기 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 gag 또는 rev 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 특정한 바람직한 구체예에서, 상기 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 본 발명의 네번째, 다섯번째 및 여섯번째 일면에 따른 바람직한 올리고누클레오티드는 길이가 약 6개 내지 약 50개인 누클레오티드이고, 안정성을 향상시키기 위해 변형된 누클레오티드간 결합 또는 변형된 당을 추가로 포함할 수 있다.
여섯번째 일면에서, 본 발명은 CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 2개의 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하는 면역자극 모티프(예컨대, CpG)-함유 올리고누클레오티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물의 면역 반응을 유도시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 올리고누클레오티드는 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 rev 또는 gag 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다. 본 발명의 본 일면의 특정한 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드는 안티센스 올리고누클레오티드가 아니다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법에서, 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 투여는 비경구적, 경구적, 설하적, 경피적, 국소적, 비내적, 초자체내 또는 직장내적이어야 한다. 치료 조성물의 투여는 증상을 감소시키거나 질환의 마커를 대신하기에 효과적인 용량 및 기간 동안 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료 조성물은 바람직하게는 약 0.01 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 올리고누클레오티드의 혈중 레벨을 달성하기에 충분한 용량으로 투여된다. 국소 투여를 위해, 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있고, 훨씬 높은 농도는 관용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 전체 투여량은 1일 환자 1명 당 약 0.01 mg의 올리고누클레오티드 내지 1일 체중 1 kg 당 약 200 mg의 올리고누클레오티드의 범위일 것이다. 단일 치료 에피소드로서 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 치료 조성물을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 상기 조성물을 투여한 후에, IL-12 유도 및 면역 세포 유사분열생식으로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 효과에 대해 하나 이상의 측정이 수행된다. 상기 올리고누클레오티드는 단독으로 투여되거나 특이적인 항원과 함께 투여될 수 있는데, 상기 항원은 상기 올리고누클레오티드에 물리적으로 결합될 수 있거나 결합될 수 없다. 이러한 투여는 임의적으로 애쥬번트의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 면역계의 모델 연구를 위해 유용하고, 사람 질환의 치료적 처치를 위해 추가로 유용하다.
본 발명의 모든 일면의 목적을 위해, 용어 "올리고누클레오티드"는 2'-할로-누클레오시드, 2'-O-치환된 누클레오시드 리보누클레오시드, 디아자누클레오시드 또는 이들의 조합물을 포함하여, 두 개 이상의 데옥시리보누클레오티드의 중합체, 또는 임의의 변형된 누클레오시드를 포함한다. 이들 단량체는 임의의 수많은 공지된 누클레오시드간 결합에 의해 서로 커플링될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에서, 이러한 누클레오시드간 결합은 비이온 결합, 붕소 결합, 포스포디에스테르 결합, 포스포트리에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포라미데이트 결합, 임의의 전술한 것들의 2'-5', 3'-5', 3'3' 결합 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한 용어 올리고누클레오티드는 친지성 그룹, 인터칼레이팅 작용제, 디아민 및 아다만탄을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 화학적으로 변형된 염기 또는 당을 갖고/갖거나 추가적인 치환기를 갖는 중합체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 용어 "2'-O-치환된"은 할로겐(바람직하게는, Cl, Br 또는 F) 또는 1-6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유하는 -O-저급 알킬기 또는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 가진 -O-아릴 또는 알릴기에 의한 오탄당 부분의 2' 위치의 치환을 의미하거나 (여기서 상기 알킬, 아릴 또는 알릴기는 예컨대, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카복실, 카브알콕실 또는 아미노기에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있다); 상기 2' 치환은 하이드록시기(리보누클레오시드를 생성하기 위한), 아미노 또는 할로기에 의해 일어날 수 있지만, 2'-H 그룹에 의해서는 그렇지 않다. 상기 올리고누클레오티드는 예컨대, 펩티드 핵산 및 락키드(locked) 핵산에서와 같이, 변형된 당(예컨대, 아라비노오스, 헥소오스) 및 기타 골격 변형을 갖는 올리고누클레오티드를 포함한다. 또한 이러한 올리고누클레오티드는 천연 발생 염기, 또는 도 3에 도시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형된 헤테로사이클릭 고리를 가질 수 있다. 본 발명의 모든 일면의 목적을 위해, 용어 "CpG" 또는 "CpG 디누클레오티드"는 디누클레오티드 5'-시티딘-구아니딘-3'을 의미하며, 여기서 p는 누클레오티드간 결합이고 디누클레오티드 데옥시리보오스의 당 골격 또는 변형된 당 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 처음 세 가지 일면의 바람직한 구체예에서, p는 상기한 것 중 어느 것의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 입체특이적(Rp 또는 Sp) 포스포로티오에이트 공유 결합으로부터 선택된다. 비-포스포디에스테르, 비-포스포로티오에이트 구체예는 면역자극 효과를 추가로 감소시킬 것이다. 본 발명의 마지막 세 가지 일면의 바람직한 구체예에서, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포르디티오에이트로부터 선택된다.
하기 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 구체예를 추가로 예증하고자 한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
시험관내에서 면역자극 효과의 조절
PS-올리고 함유 CpG 모티프의 화학적 변형 부위의 영향를 연구하기 위해, 두 개의 올리고누클레오티드를 선택하였다. 올리고 1은 하나의 CpG 모티프를 함유하고 있고 올리고 15는 두 개의 CpG 모티프를 함유하고 있다. 이들 올리고 둘 모두는 이전에 연구되었으며 면역자극성인 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 마우스 비장 세포 증식 검정을 사용하였다.
표 1 올리고데옥시누클레오티드 포스포로티오에이트 및 변형 부위
Figure 112002004047360-pct00001
마우스 비장 림프구를 0.1, 1 및 10 ㎍/mL의 농도로 올리고누클레오티드와 함께 배양시켰다. 올리고 1은 세포 증식에 대해 용량 의존적 효과를 유도하였다. 0.1 ㎍/mL에서, 증식 지수는 2.87이었다(도 1). 올리고 1의 CpG 모티프의 5'-플랭킹 GA 데옥시누클레오시드를 2'-OMe로 치환시키는 것(올리고 2)은 사용된 모든 농도에서 세포 증식의 완전한 억제를 초래하였다(도 1). 0.1 ㎍/mL에서, 세포 증식 지수는 배지 단독인 경우와 유사하였다. 올리고 1의 CpG 모티프의 3'-플랭킹 TT 데옥시누클레오시드를 2'-OMe로 치환시킨 것(올리고 6)은 세포 증식상에 이러한 영향을 받지 않았다. 올리고 6의 증식 지수는 2.07이었다(도 1). CpG 모티프로부터 멀리 떨어져 있는 5'-플랭킹 영역에서 두 개의 데옥시누클레오시드를 2'-OMe로 치환시키는 것이 유도된 세포 증식상에 영향을 미치는 지를 추가로 알아보기 위해, 본 발명자들은 올리고 3, 4 및 5를 합성하였다(표 1). 두 개의 데옥시누클레오시드를 2'-OMe로 치환하여 치환 부위와 CpG 모티프 사이에 각각 하나, 두 개 및 세 개의 데옥시누클레오시드가 남게 하였다. 올리고 3, 4 및 5의 증식 지수는 각각 3.42, 8.44 및 10.38이었는데 이것은 올리고 1에 비해 각각 29, 297 및 400 퍼센트가 증가된 것이었다(도 1). 올리고 5에서 보다 5'-말단쪽의 남아있는 데옥시누클레오시드를 추가로 치환하는 것은 더 이상 증식 지수의 증가를 나타내지 않았다(데이터 제시 안함).
유사한 치환을 올리고 1의 CpG 모티프의 3'-플랭킹 영역에서 수행하였다. 올리고 7, 8, 9, 10 및 11을 두 개의 데옥시누클레오시드가 2'-OMe로 치환되어 GpG 모티프 및 2'-OMe 치환 사이에 각각 하나, 두 개, 세 개, 네 개 및 다섯 개의 데옥시누클레오시드가 남아있도록 합성하였다. 올리고 7, 8, 9, 10 및 11의 증식 지수는 각각 3.63, 7.22, 7.01, 8.85 및 9.24였다. 올리고 1에 비해, 올리고 7, 8, 9, 10 및 11에 대한 증식 지수의 증가는 각각 39, 231, 221, 317 및 338 퍼센트였다.
이들 결과로부터, CpG 모티프의 5'-말단 또는 3'-말단에서 두 개의 데옥시누클레오티드의 치환(예컨대, 올리고 5 또는 9)이 면역자극 활성을 증가시킴이 명백해졌다. 올리고 5 및 올리고 9에서 이루어진 치환이 면역자극 활성을 추가로 증가시키는 데 부가적인 영향을 미칠 수 있는 지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 3'-말단 및 5'-말단 둘 모두에서 2'-OMe로 치환된 두 개의 데옥시누클레오시드를 갖는 올리고 12를 합성하였다. 올리고 12는 올리고 5와 비교할 때 증식 지수에 있어서 추가적인 증가를 나타내지 않았지만, 올리고 9에 비해 증가된 증식 지수를 가졌다.
올리고 3 내지 5 및 올리고 7 내지 11을 사용하여 수행된 상기 결과가 서열 특이적인지 일반적인지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 두 개의 CpG 모티프를 함유하는 올리고 15에 동일한 변형을 가하였다. 올리고 15는 0.1 g/mL의 농도에서 5.83의 증식 지수를 가졌다. 개개의 CpG 모티프의 5'-말단에서 두 개의 데옥시누클레오시드를 치환하여 CpG 모티프 및 2'-OMe을 사용한 치환 사이에 두 개의 데옥시누클레오시드가 남게 하는 것(올리고 16 및 17)은 각각 7.34 및 7.13의 증식 지수를 나타냈으며, 이것은 올리고 15에 비해 단지 20 퍼센트의 증가였다. CpG 모티프 둘 모두의 5'-플랭킹 영역에서 두 개의 데옥시누클레오시드의 치환(올리고 18)은 더 높은 증식 지수 10.62를 나타냈으며, 이것은 올리고 15에 비해 약 50 퍼센트의 증가였다.
실시예 2
면역자극 활성에 대한 누클레아제 안정성의 효과
부위 특이적 치환에 추가적으로, 본 발명자들은 PS-올리고 함유 CpG 모티프의 증가된 대사 안정성이 세포 증식 증가를 초래할 수 있는 지의 여부 및 세포 증식 활성을 추가로 증가시키기 위해 5'-치환과 조합될 수 있는 지의 여부를 연구하였다. 올리고 13을 올리고 1의 3'-말단에서 4개의 연속적인 데옥시누클레오시드가 2'-OMe로 치환되도록 합성하였고, 이것은 누클레아제에 대한 안정성의 현저한 증가를 초래하였다. 올리고 13은 11.92의 증식 지수를 가졌으며, 이것은 올리고 1에 비해 약 480%의 증가였다(도 1). 5'-말단에서 두 개의 데옥시누클레오시드의 치환에 의한 올리고 13의 추가적인 변형(올리고 14)은 증식 지수를 추가로 증가시키지 않았다.
PS-올리고에서의 상기 치환이 세포 배양 검정에 기초한 이의 면역자극 활성을 조절함을 관찰한 후에, 본 발명자들은 표 1에 기재된 올리고누클레오티드를 마우스에 복강내적으로 투여하고 비장 무게를 측정하여 치환이 생체내에서 동일한 효과를 갖는 지를 확정하였다. 올리고 1의 투여는 비장 무게에 있어서 약 50 퍼센트 증가를 초래하였다(도 2). 세포 배양 검정에서 면역자극 활성을 나타내지 않은 올리고 2는 비장 무게에서 증가를 나타내지 않았다(도 2). 5'-말단 방향으로 CpG 모티프로부터 떨어진 두 개의 데옥시누클레오티드의 치환(올리고 3, 4 및 5)은 올리고 1로 처리된 마우스와 비교하여 비장 무게에 있어서 각각 67, 95 및 157 퍼센트의 점진적 증가를 나타내었고 (도 2), 이는 이들의 면역자극 활성의 증가를 확인시켜준다. CpG 모티프의 3'-말단 방향의 2'-OMe를 사용한 두 개의 데옥시누클레오시드의 치환은 일반적으로 비장 무게에 있어서 덜 현저한 증가를 가졌다. 단지 올리고 6 및 11만이 비장 무게에 있어서 올리고 1에 비해 97 및 95 퍼센트의 증가를 초래하였다. 3'-말단 및 5'-말단 둘 모두에서 이루어진 치환을 지닌 올리고 12는 올리고 1에 비해 비장 무게에 있어서 95 퍼센트의 증가를 나타내었다(도 2).
두 개의 CpG 모티프를 함유하는 올리고 15, 16, 17 및 18은 5 mg/kg의 용량을 투여한 후에 비장 무게에 있어서 증가를 나타내었다. 올리고 15는 비처리 마우스에 비해 비장 무게의 175 퍼센트 증가를 초래하였다. 5'-말단 CpG 모티프 중 두 개가 2'-OMe로 치환된 올리고 16은 올리고 15에 비해 비장 무게에 있어서 93 퍼센트 증가를 초래하였다(도 2). 하나의 CpG의 5'-말단(그러나 다른 CpG 모티프의 3'-말단에서)에 치환을 갖는 올리고 17은 비장 무게에 있어서 더 이상의 증가를 나타내지 않았다. 양 CpG 모티프 둘 모두의 5'-말단에서의 치환은 올리고 16에 비해 비장 무게에 있어서 추가적인 증가를 일으키지 않았지만, 올리고 15에 비해 단지 약 60 퍼센트 증가를 나타냈다(도 2).
올리고 1에 비해 대사적으로 안정한 올리고 13은 올리고 1에 비해 비장 무게에 있어서 114 퍼센트 증가를 나타내었고, 이는 세포 증식 데이터와 일치하였다. 유사한 결과가 대사적 안정성이 증가되고 CpG 모티프의 5'-말단에서 치환된 올리고 14에서 관찰되었다 (도 2).

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  16. CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치, 또는 CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 7 내지 제 10 누클레오시드의 네 개의 연속적인 누클레오시드에서 2' 치환된 누클레오시드를 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함하여, CpG-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 증가시키는 방법으로서, 올리고누클레오티드가 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 gag 또는 rev 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아닌, CpG-함유 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 증가시키는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 올리고누클레오티드가 안티센스 올리고누클레오티드가 아님을 특징으로 하는 방법.
  18. CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드 5', CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치, 또는 CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 7 내지 제 10 누클레오시드에서 네 개의 연속적인 누클레오시드에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하는, 증가된 면역자극 효과를 갖는 CpG-함유 올리고누클레오티드.
  19. 제 18항에 있어서, 올리고누클레오티드가 안티센스 올리고누클레오티드가 아님을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  20. 제 18항에 있어서, 올리고누클레오티드의 길이가 6개 내지 50개의 누클레오티드임을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  21. 제 18항에 있어서, 올리고누클레오티드가 변형된 누클레오티드간 결합, 변형된 염기 또는 변형된 당을 추가로 포함함을 특징으로 하는 올리고누클레오티드.
  22. CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 5'쪽의 제 6 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 1 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 2 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 3 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 4 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 5 누클레오시드, CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 6 누클레오시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 위치, 또는 CpG 디누클레오티드의 3'쪽의 제 7 내지 제 10 누클레오시드에서 네 개의 연속적인 누클레오시드에 2' 치환된 누클레오시드를 포함하는 올리고누클레오티드를 포함하며, 올리고누클레오티드가 사람 면역결핍 바이러스 타입 1의 Ha-ras 또는 rev 또는 gag 유전자와 상보적인 안티센스 올리고누클레오티드가 아닌, 포유동물에서 면역증강제로서 유용한 약제 조성물.
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