JP2003526628A - ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調 - Google Patents

ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることの両者を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、アンチセンス法における、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレ
オチドの治療学的使用に関する。
【０００２】 （背景技術） オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において不可欠の手段となっており、
診断プローブ法から、ＰＣＲ、遺伝子発現のアンチセンス抑制に及ぶ極めて多岐
にわたる技術に用いられている。このような広範なオリゴヌクレオチドの使用は
、オリゴヌクレオチドを合成するための迅速、安価かつ有効な方法に対する需要
の増大をもたらしている。
【０００３】 アンチセンスおよび診断への応用のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在
、ルーチンに行うことができる。たとえば、Methods in Molecular Biology, Vo
l. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, pp.165-189（S. Agrawa
l編、ヒューマナ・プレス、１９９３）；Oligonucleotides and Analogues: A P
ractical Approach, pp.87-108（F. Eckstein編、１９９１）；およびUhlmannお
よびPeyman、上掲、AgrawalおよびIyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995)
；およびAntisense Research and Applications（CrookeおよびLebleu編、ＣＲ
Ｃプレス、ボカ・ラトン、１９９３）を参照。
【０００４】 初期の合成法には、ホスホジエステル化学およびホスホトリエステル化学が含
まれていた。Khoranaら（J. Molec. Biol. 72: 209 (1972）はオリゴヌクレオチ
ドの合成のためのホスホジエステル化学を開示している。Reese（Tetrahedron L
ett. 34: 3143-3179 (1978)）はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの
合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これら初期のアプローチ
は、さらに有効なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート合成法への道を大
きく切り開いた。BeaucageおよびCaruthers（Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862
(1981)）はポリヌクレオチド合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミ
ダイトの使用を開示している。AgrawalおよびZamecnik（米国特許第５,１４９,
７９８号（１９９２年））は、Ｈ−ホスホネート法によるオリゴヌクレオチドの
最適化合成を開示している。
【０００５】 これら現代の両アプローチは、様々な修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴ
ヌクレオチドを合成するのに用いられている。AgrawalおよびGoodchild（Tetrah
edron Lett. 28: 3539-3542 (1987)）は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリ
ゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。Connollyら（Bioche
mistry 23: 3443 (1984)）は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオ
チドホスホロチオエートの合成を開示している。Jagerら（Biochemistry 27: 72
37 (1988)）は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホル
アミダイトの合成を開示している。Agrawalら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 7079-7083 (1988)）は、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホ
スホルアミダイトおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【０００６】 さらに最近では、何人かの研究者が疾患の治療に対するアンチセンス法の有効
性を示している。Crooke（Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii）は
、サイトメガロウイルスによって誘発されたヒトの網膜炎の治療に対するホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドの市場売買の承認が得られたことを開示してい
る。残念なことに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は当初予想さ
れていたよりも複雑なものとなってきた。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドによって引き起こされるある種の作用は、予想されるアンチセンスのメカニズ
ムでは説明できなかった。たとえば、McIntyreら（Antisense Res. Dev. 3: 309
-322 (1993)）は、「センス」のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特定
の免疫刺激を引き起こすことを教示している。この副作用や他の副作用は、ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの概念を複雑なものにしている。Zhaoら（Bi
ochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996)）は、２つのＣｐＧ含有オリゴヌ
クレオチド［一つはＨＩＶ−１からのｇａｇ遺伝子に相補的なものであり（
【化１】 ）、他はＨＩＶ−１のｒｅｖ遺伝子に相補的なものである（
【化２】 ）］によって媒体される免疫刺激を開示している。
【０００７】 一方、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドが免疫刺激を誘発しうるという観察は、この副作用を治療用の手段
として開発することへの関心をもたらした。これら努力は、ジヌクレオチドＣｐ
Ｇを含有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに着目している。Kuramoto
ら（Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)）は、ＣｐＧジヌクレオチドを
包含するパリンドローム含有ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インター
フェロンαおよびγの合成を誘発し、ナチュラルキラーの活性を高めうることを
教示している。Kriegら（Nature 371: 546-549 (1995)）は、ホスホロチオエー
トＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Lian
gら（J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)）は、そのようなオリゴヌクレオ
チドがヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanuら（Vaccine 16 : 1216-124 (1998)）は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが
インフルエンザウイルスに対する免疫応答を高めることを教示している。McClus
kieおよびDavis（The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998)）は、Ｃ
ｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力な免疫刺激剤として作用し、Ｂ型肝炎表面抗
原に対する免疫応答を高めることを教示している。Agrawal（米国特許第５,９６
８,９０９号）は、ＣまたはＧの骨格の修飾がこの作用を抑制することを教示し
ている。
【０００８】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） これら報告は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応
答を変調しうる必要性があることを明らかにしている。理想的には、そのような
変調は、アンチセンスの応用に対しては免疫刺激作用を低減させること、および
免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用を増大させることを含むものでなければ
ならない。
【０００９】 （その解決方法） 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を
変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては
免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用
を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応
用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびその
ようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。 本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾（
positional modification）が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響
を及ぼすことを見出した。とりわけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側
の特定の位置でのオリゴヌクレオチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該
オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を高めるかまたは低下させる。
【００１０】 第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用
を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオ
チド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを
導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１
型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。 第二の側面において、本発明は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌ
クレオチドを提供する。その際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチ
ドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌク
レオシドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス
１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない。
【００１１】 第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス
特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含
有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌク
レオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシド
を含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドで
はなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではな
いことを特徴とする。
【００１２】 第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１
型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは
ないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法を提供する
。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチ
ドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジ
ヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の
５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
の３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、
ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
の３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選
ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様
において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
別の態様では該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであって
よい。
【００１３】 第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌ
クレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'
側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目
のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側
の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
チドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目の
ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側
の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位
置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス
１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで
はない。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドではない。
【００１４】 第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を
提供する。該方法は、哺乳動物にオリゴヌクレオチドを投与することを含み、そ
の際、該オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドの５'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、
ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
の３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレ
オシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、Ｃ
ｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの
３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレ
オシド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌ
クレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまた
はｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴
とする。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドではない。
【００１５】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、アンチセンス法において、および免疫刺激剤としてのオリゴヌクレ
オチドの治療学的使用に関する。本明細書に引用する特許および公報は当該技術
分野における知見のレベルを反映するものであり、その全体を参照のため本明細
書に引用する。本明細書に引用した参照文献の教示と本明細書とで矛盾がある場
合は、本発明の目的のために後者が優先する。
【００１６】 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって引き起こされる免疫応答を
変調する方法を提供する。本発明による方法は、アンチセンスの応用に対しては
免疫刺激作用を低減させること、および免疫療法の応用に対しては免疫刺激作用
を増大させることの両者を可能にする。それゆえ、本発明はさらに、いずれの応
用に対しても免疫刺激作用の最適レベルを有するオリゴヌクレオチドおよびその
ようなオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。 本発明者らは驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾が
該オリゴヌクレオチドの免疫刺激能に劇的な影響を及ぼすことを見出した。とり
わけ、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側または３'側の特定の位置でのオリゴヌクレ
オチドの２'アルキル化またはアルコキシ化が該オリゴヌクレオチドの免疫刺激
作用を高めるかまたは低下させる。
【００１７】 第一の側面において、本発明はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用
を低下させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌクレオ
チド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを
導入することを含み、その際、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌクレオチドはヒト免疫不全ウイルス１
型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする。好ましい態
様において、この方法は遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチ
ドを製造するのに用いる。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは
アンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチ
ド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだ
け導入する。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチド中に２'置換
ヌクレオシドを１つだけ導入する。
【００１８】 本発明の最初の３つの側面で使用する「相補的」なる語は、生理条件下でゲノ
ム領域、遺伝子、またはそのＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力を意味する
。そのようなハイブリダイゼーションは、通常、相補的な鎖の間で好ましくはワ
トソン−クリックまたはフーグスティーン型の塩基対を形成する塩基特異的な水
素結合の結果であるが、他の水素結合様式および塩基スタッキングもまたハイブ
リダイゼーションに導くことができる。実際問題として、そのようなハイブリダ
イゼーションは特定の遺伝子発現の抑制を観察することにより推論できる。 本発明の最初の３つの側面において使用する「アンチセンス活性」なる語は、
オリゴヌクレオチドを細胞または動物に導入したときに該オリゴヌクレオチドが
相補的なＲＮＡの発現の低減を引き起こすことを意味する。
【００１９】 本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入
直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソン（synthon）を用いさえすれば
、よく知られた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましい
モノマーとしては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホ
ネートが挙げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチ
ド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを導
入する」とは、単にそのような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌク
レオチドを合成することを意味する。
【００２０】 第二の側面において、本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位
置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシドが２'−Ｏ−メ
チルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅ
ｖ遺伝子に相補的ではない、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオ
チドを提供する。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは約１２〜約５０
のヌクレオチド、最も好ましくは約１２〜約３５のヌクレオチドを有するであろ
う。本発明のこの側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝
子転写物に相補的である。さらに好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは
アンチセンス活性を有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオ
チドは該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'
置換ヌクレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴ
ヌクレオチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２１】 第三の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス
特異的に低減させる方法を提供し、該方法は、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含
有オリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌク
レオチドはＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシド
を含み、少なくとも一つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドで
はなく、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではな
いことを特徴とする。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドは
該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌ
クレオシドを１つだけ有する。幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレ
オチドは２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する。
【００２２】 本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましく
は非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内
でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が
現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用する（surrogate）のに有効な投与
量および期間行う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マ
イクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で
治療組成物を投与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに
低い濃度で有効であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴ
ヌクレオチドの全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチ
ドから体重１ｋｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲
であろう。
【００２３】 オリゴヌクレオチドは製剤化してもよいし、そのままであってもよい。１また
はそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療エピソー
ドとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様において、
組成物を投与後、補体の活性化、有糸分裂生起およびトロンビンクロットの生成
よりなる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。 本発明のこの側面による方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルにおいて
有用であり、さらにヒト疾患の治療に有用である。
【００２４】 第四の側面において、本発明は、Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１
型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは
ない、免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドの免疫刺
激作用を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、オリゴヌ
クレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側
の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
チドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジ
ヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の
４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
ドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこ
れらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入
することを含む。ある好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２５】 本発明のこの側面による方法は、合成プロセスでＣｐＧジヌクレオチドの導入
直後のサイクルに適当な２'置換モノマーシンソンを用いさえすれば、よく知ら
れた合成法のいずれにおいても都合よく行うことができる。好ましいモノマーと
しては、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートが挙
げられる。それゆえ、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド中のＣｐ
Ｇジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'
側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番目
のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側
の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
チドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目の
ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせよ
りなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入する」とは、単にそ
のような位置に２'置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを合成するこ
とを意味する。
【００２６】 本発明の第四、第五および第六の側面の目的のためには、「アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド」は遺伝子または遺伝子の転写物に正確に相補的なオリゴヌクレ
オチドであり、該オリゴヌクレオチドが正確に相補的な該遺伝子または遺伝子の
転写物の発現を低減しうるものである。
【００２７】 第五の側面において、本発明は、免疫刺激作用の増大した免疫刺激モチーフ（
たとえば、ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチド
は、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
チドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目の
ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側
の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
ドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジ
ヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の
４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み
合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒ
ａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドではない。ある好ましい態様において、該オリゴ
ヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。本発明の第四、第五
および第六の側面による好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０ヌ
クレオチドであり、安定性を向上させるため修飾したヌクレオチド間結合または
修飾した糖をさらに含んでいてよい。
【００２８】 第六の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を
提供する。該方法は、哺乳動物に免疫刺激モチーフ（たとえば、ＣｐＧ）含有オ
リゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドは、Ｃ
ｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの
５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目のヌクレ
オシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'
側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目
のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組み合わせ
よりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−ｒａｓま
たはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする。本発明のこの側面のある好
ましい態様において、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド
ではない。
【００２９】 本発明のこの側面による方法において、オリゴヌクレオチドの投与は好ましく
は非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻内、膣内、吸入、硝子体内または直腸内
でなければならない。治療組成物の投与は、知られた手順を用い、疾患の兆候が
現れるのを防ぎまたは疾患のマーカーを代用するのに有効な投与量および期間行
う。全身投与する場合には、約０.０１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオ
リゴヌクレオチドの血中レベルが達成されるのに充分な投与量で治療組成物を投
与するのが好ましい。局所投与の場合には、これよりもはるかに低い濃度で有効
であり、はるかに高い濃度でも許容し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの
全投与量は、患者１日当たり約０.０１ｍｇのオリゴヌクレオチドから体重１ｋ
ｇ当たり１日あたりで約２００ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲であろう。
【００３０】 １またはそれ以上の本発明の治療組成物の治療学的有効量を患者に単一の治療
エピソードとして同時にまたは連続的に投与するのが望ましい。好ましい態様に
おいて、組成物を投与後、ＩＬ−１２の誘発および免疫細胞の有糸分裂生起より
なる群から選ばれた生物学的作用を１またはそれ以上測定する。オリゴヌクレオ
チドは単独または特定の抗原とともに投与してよく、該特定の抗原は該オリゴヌ
クレオチドに物理的に結合していても結合していなくてもよい。 本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究において有用であり、さ
らにヒト疾患の治療に有用である。
【００３１】 本発明のすべての側面の目的のために、「オリゴヌクレオチド」なる語は、デ
オキシリボヌクレオチド、または２'−ハロ−ヌクレオシド、２'−Ｏ−置換ヌク
レオシド、リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはそれらの組み合わせを
含む修飾ヌクレオシドを２またはそれ以上からなるポリマーを包含する。そのよ
うなモノマーは、多数の知られたヌクレオシド間結合によって互いに結合されて
いてよい。ある好ましい態様において、これらヌクレオシド間結合は、非イオン
結合、ホウ素結合、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロ
チオエート結合、またはホスホルアミデート結合、これらの２'−５'結合、３'
−５'結合、３'−３'結合、またはこれらの組み合わせであってよい。オリゴヌ
クレオチドなる語はまた、化学的に修飾した塩基または糖を有するおよび／また
は脂肪親和性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む（これらに限られ
るものではない）置換基をさらに有するそのようなポリマーをも包含する。
【００３２】 本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置換」なる語は、ペントース残基２'位
のハロゲン（好ましくは、Ｃｌ、ＢｒまたはＦ）による、または１〜６の飽和ま
たは不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、または２〜６の炭素原
子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（その際、そのようなアルキル、アリ
ールまたはアリル基は置換されていないか、またはたとえば、ハロ、ヒドロキシ
、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、
カルボキシル、カルブアルコキシル、またはアミノ基で置換されていてよい）に
よる置換を意味し、あるいはそのような２'置換は、ヒドロキシ（リボヌクレオ
シドを生成する）、アミノもしくはハロ基によものであってよいが、２'−Ｈ基
によるものであってはならない。
【００３３】 そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばペプチド核酸や固定化（locked）
核酸におけるように、修飾した糖（たとえば、アラビノース、ヘキソース）およ
び他の骨格修飾を有するオリゴヌクレオチドを包含する。そのようなオリゴヌク
レオチドはまた、図３に示すものを含む（これらに限られるものではない）天然
に存在する塩基または修飾したへテロ環を有していてもよい。本発明のすべての
側面の目的のため、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」なる語はジヌク
レオチドの５'−シチジン−グアニジン−３'を意味し、式中のｐはヌクレオチド
間結合を示し、該ジヌクレオチド中の糖骨格はデオキシリボースまたは修飾した
糖またはその組み合わせである。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様にお
いて、ｐは上記いずれかのホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、立体特異的な（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエート共有結合から
選ばれる。非ホスホジエステルで非ホスホロチオエートの態様は免疫刺激作用を
さらに低減させるであろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様では、ｐ
はホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選ば
れる。
【００３４】 下記実施例は本発明のある種の好ましい態様をさらに説明することを意図する
ものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。実施例１ インビトロでの免疫刺激作用の変調 ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの化学修飾の位置の影響を調べるため
、本発明者らは２つのオリゴヌクレオチドを選んだ。オリゴ１は一つのＣｐＧモ
チーフを含み、オリゴ２は２つのＣｐＧモチーフを含む。これら２つのオリゴは
いずれも以前に調べられており、免疫刺激性であることが示されている。本試験
においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するため、本発明者らはマウ
スの脾臓細胞増殖アッセイを用いた。
【００３５】表１：オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートおよび修飾部位
【表１】
【００３６】 マウス脾臓リンパ球を、０.１、１および１０μｇ／ｍＬの濃度のオリゴヌク
レオチドとともに培養した。オリゴ１は細胞増殖に対して用量依存的な作用を誘
発した。０.１μｇ／ｍＬでは増殖指標は２.８７であった（図１）。オリゴ１の
ＣｐＧモチーフの５'フランキングＧＡデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置
換すると（オリゴ２）、使用したすべての濃度で細胞増殖の完全な抑制という結
果となった（図１）。０.１μｇ／ｍＬでは細胞増殖指標は培地単独の場合と同
様であった。オリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキングＴＴデオキシヌクレ
オシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ６）、細胞増殖に対するそのような
影響はなかった。オリゴ６の増殖指標は２.０７であった（図１）。
【００３７】 ＣｐＧモチーフからさらに離れた位置で５'フランキング領域中の２つのデオ
キシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換することが誘発細胞増殖に影響を及ぼす
か否かをさらに理解するため、本発明者らはオリゴ３、４および５を合成した（
表１）。置換部位とＣｐＧモチーフとの間でそれぞれ１つ、２つおよび３つのデ
オキシヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−
ＯＭｅで置換した。オリゴ３、４および５の増殖指標はそれぞれ３.４２、８.４
４および１０.３８であり、これはオリゴ１と比較するとそれぞれ２９％、２９
７％および４００％の増大である（図１）。オリゴ５におけるよりもさらに５'
末端側の残りのデオキシヌクレオシドを置換しても増殖指標の増大は示されなか
った（データは示していない）。
【００３８】 同様の置換をオリゴ１のＣｐＧモチーフの３'フランキング領域で行った。オ
リゴ７、８、９、１０および１１を合成したが、これらはＣｐＧモチーフと２'
−ＯＭｅ置換部位との間でそれぞれ１つ、２つ、３つ、４つおよび５つのデオキ
シヌクレオシドだけ離れた位置にある２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭ
ｅで置換したものである。オリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標はそれ
ぞれ３.６３、７.２２、７.０１、８.８５および９.２４であった。オリゴ１と
比較するとオリゴ７、８、９、１０および１１の増殖指標の増大は、それぞれ３
９％、２３１％、２２１％、３１７％および３３８％の増大であった。
【００３９】 これらの結果から、ＣｐＧモチーフの５'末端または３'末端のいずれかでの２
つのデオキシヌクレオチドの置換（たとえば、オリゴ５または９）は免疫刺激活
性を増大させることが明らかである。オリゴ５またはオリゴ９に施した置換が免
疫刺激活性をさらに増大させるうえで付加的な効果を有することが可能であろう
か？本発明者らは、３'末端および５'末端の両者で２つのデオキシヌクレオシド
が２'−ＯＭｅで置換されたオリゴ１２を合成した。オリゴ１２はオリゴ５と比
較すると増殖指標をさらに増大させることはなかったが、オリゴ９と比較すると
増殖指標を増大させた。
【００４０】 オリゴ３〜５およびオリゴ７〜１１を用いた上記観察が配列特異的なものであ
るか一般的なものであるかを調べるため、本発明者らはオリゴ１５（２つのＣｐ
Ｇモチーフを含む）に同様の修飾を施した。オリゴ１５は０.１μｇ／ｍＬの濃
度で５.８３の増殖指標を有していた。ＣｐＧモチーフと置換部位との間で２つ
のデオキシヌクレオシドだけ離れた位置にある、個々のＣｐＧモチーフの５'末
端の２つのデオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換すると（オリゴ１６およ
び１７）、それぞれ７.３４および７.１３の増殖指標が示されたが、これはオリ
ゴ１５と比較すると２０％の増大にすぎない。両ＣｐＧモチーフの５'フランキ
ング領域での２つのデオキシヌクレオシドの置換（オリゴ１８）は１０.６２の
一層高い増殖指標を示したが、これはオリゴ１５と比較すると約５０％の増大で
ある。
【００４１】実施例２ 免疫刺激活性に及ぼすヌクレアーゼ安定性の効果 部位特異的な置換に加えて、本発明者らはまた、ＣｐＧモチーフを含有するＰ
Ｓ−オリゴの代謝安定性の増大が細胞増殖の増大という結果となるか否か、およ
びそのような代謝安定性の増大を５'置換と組み合わせて細胞増殖活性をさらに
増大させることができるか否かを調べた。オリゴ１の３'末端の４つの連続した
デオキシヌクレオシドを２'−ＯＭｅで置換した（これはヌクレアーゼに対する
安定性の有意の増大という結果となる）オリゴ１３を合成した。オリゴ１３は１
１.９２という増殖指標を有していたが、これはオリゴ１と比較すると約４８０
％の増大である（図１）。５'末端の２つのデオキシヌクレオシドの置換による
オリゴ１３のさらなる修飾（オリゴ１４）は、増殖指標のさらなる増大という結
果とはならなかった。
【００４２】 上記のようなＰＳ−オリゴ中の修飾が免疫刺激活性を変調することを細胞培養
アッセイに基づいて観察した後、本発明者らは表１に列挙したオリゴヌクレオチ
ドをマウスに腹腔内投与して脾臓重量を測定し、置換がインビボでも同様の作用
を有するか否かを確認した。オリゴ１の投与は脾臓重量の約５０％の増大を引き
起こした（図２）。オリゴ２は細胞培養アッセイでは免疫刺激活性を示さなかっ
たものであるが、脾臓重量の増大を示さなかった（図２）。ＣｐＧモチーフから
５'末端側へ２つのデオキシヌクレオチドを置換したオリゴ３、４および５は脾
臓重量の漸進的な増大を示し、これはオリゴ１で処置したマウスと比較してそれ
ぞれ６７％、９５％および１５７％の増大であり（図２）、免疫刺激活性の増大
が確認された。ＣｐＧモチーフの３'末端側での２つのデオキシヌクレオシドの
２'−ＯＭｅによる置換は、一般に一層有意でない脾臓重量の増大をもたらした
。オリゴ６および１１だけが、オリゴ１と比較して９７％および９５％の脾臓重
量の増大を引き起こした。３'末端および５'末端の両者で置換を施したオリゴ１
２は、オリゴ１と比較して９５％の脾臓重量の増大を示した（図２）。
【００４３】 オリゴ１５、１６、１７および１８はすべて２つのＣｐＧモチーフを含むが、
５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した後に脾臓重量の増大を示した。オリゴ１５は未
処置のマウスと比較して１７５％の脾臓重量の増大を引き起こした。オリゴ１６
はＣｐＧモチーフの５'末端が２つとも２'−ＯＭｅで置換したものであるが、オ
リゴ１５と比較して９３％の脾臓重量の増大を引き起こした（図２）。オリゴ１
７は一つのＣｐＧの５'末端に置換を有するものであるが（しかし、他のＣｐＧ
モチーフの３'末端に置換を有する）、脾臓重量のさらなる増大を示さなかった
。両ＣｐＧモチーフの５'末端での置換はオリゴ１６と比較して脾臓重量のさら
なる増大という結果とならなかったが、オリゴ１５と比較すると約６０％だけの
増大であった（図２）。
【００４４】 オリゴ１３はオリゴ１と比較して代謝的に安定しているものであるが、オリゴ
１と比較して脾臓重量の１１４％の増大を示し、細胞増殖データと一致していた
。同様の結果は、代謝安定性が増大し、ＣｐＧモチーフの５'末端で置換されて
いるオリゴ１４でも観察された（図２）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 オリゴヌクレオチドの不在下（Ｃ）、リポ多糖の存在下（ＬＰＳ
）、または種々のオリゴヌクレオチドの存在下でのマウス脾臓細胞の増殖アッセ
イの結果を示す。
【図２】 オリゴヌクレオチドを投与しないまたは種々のオリゴヌクレオチ
ドを投与したマウスでの脾臓肥大を示す。
【図３】 修飾塩基の好ましい態様を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２日（２００２．５．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】 さらに最近では、何人かの研究者が疾患の治療に対するアンチセンス法の有効
性を示している。Crooke（Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii）は
、サイトメガロウイルスによって誘発されたヒトの網膜炎の治療に対するホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドの市場売買の承認が得られたことを開示してい
る。残念なことに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は当初予想さ
れていたよりも複雑なものとなってきた。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドによって引き起こされるある種の作用は、予想されるアンチセンスのメカニズ
ムでは説明できなかった。たとえば、McIntyreら（Antisense Res. Dev. 3: 309
-322 (1993)）は、「センス」のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが特定
の免疫刺激を引き起こすことを教示している。この副作用や他の副作用は、ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの概念を複雑なものにしている。Zhaoら（Bi
ochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996)）は、２つのＣｐＧ含有オリゴヌ
クレオチド［一つはＨＩＶ−１からのｇａｇ遺伝子に相補的なものであり（５'-
CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-３'（配列番号１））、他はＨＩＶ−１のｒｅｖ遺
伝子に相補的なものである（５'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC-３'（配列番号
２））］によって媒体される免疫刺激を開示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】表１：オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートおよび修飾部位
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA06 HA17 4C057 BB02 DD01 MM05 4C084 AA13 NA14 ZB082 ZC552 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB08 ZC55

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を低下させる
    方法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側に隣接
    した位置に２'置換ヌクレオシドを導入することを含み、その際、少なくとも一
    つのヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、該オリゴヌク
    レオチドはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的では
    ないことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを
    製造するのに用いる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチド
    について２'置換ヌクレオシドを１つだけ導入する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該オリゴヌクレオチド中に２'置換ヌクレオシドを１つだけ
    導入する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 第二の側面において、本発明は、ＣｐＧジヌクレオチドの５
    '側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つのヌクレオシ
    ドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウイルス１型の
    ｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではない、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含
    有オリゴヌクレオチドを提供する。
  7. 【請求項７】 長さが約８〜約５０ヌクレオチドである、請求項６に記載の
    オリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 長さが約１２〜約３５ヌクレオチドである、請求項７に記載
    のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 遺伝子または遺伝子転写物に相補的である、請求項６に記載
    のオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 アンチセンス活性を有する、請求項６に記載のオリゴヌク
    レオチド。
  11. 【請求項１１】 該オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチ
    ドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する、請求項６に記載のオリゴヌ
    クレオチド。
  12. 【請求項１２】 ２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する、請求項７に記載
    のオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 哺乳動物において遺伝子発現をアンチセンス特異的に低減
    させる方法であって、免疫刺激作用の低減したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを
    哺乳動物に投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌク
    レオチドの５'側に隣接した位置に２'置換ヌクレオシドを含み、少なくとも一つ
    のヌクレオシドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドではなく、ヒト免疫不全ウ
    イルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的ではないことを特徴とする方法
    。
  14. 【請求項１４】 該オリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチド中に存在す
    る各ＣｐＧジヌクレオチドについて２'置換ヌクレオシドを１つだけ有する、請
    求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該オリゴヌクレオチドが２'置換ヌクレオシドを１つだけ
    有する、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 Ｈａ−ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇま
    たはｒｅｖ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドではない、ＣｐＧ
    含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を増大させる方法であって、該オリゴヌ
    クレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
    ジヌクレオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側
    の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシ
    ド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
    チドの５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌ
    クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジ
    ヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の
    ４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌ
    クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこ
    れらの組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを導入
    することを含む方法。
  17. 【請求項１７】 該オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド
    ではない、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 免疫刺激作用の増大したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドで
    あって、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
    レオチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの
    ５'側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
    オチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目
    のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
    Ｇジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'
    側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの
    組み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含むことを
    特徴とするオリゴヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドではない、請求項１８に
    記載のオリゴヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 長さが約６〜約５０ヌクレオチドである、請求項１８に記
    載のオリゴヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 修飾したヌクレオチド間結合、修飾した塩基または修飾し
    た糖をさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、哺乳
    動物にオリゴヌクレオチドを投与することを含み、その際、該オリゴヌクレオチ
    ドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の１番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
    オチドの５'側の２番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の３番目
    のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'側の４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
    Ｇジヌクレオチドの５'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの５'
    側の６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の２つのヌクレオシ
    ド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオ
    チドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
    ジヌクレオチドの３'側の５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側
    の４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の６番目のヌクレオシ
    ド、ＣｐＧジヌクレオチドの３'側の４番目のヌクレオシド、およびこれらの組
    み合わせよりなる群から選ばれた位置にて２'置換ヌクレオシドを含み、Ｈａ−
    ｒａｓまたはヒト免疫不全ウイルス１型のｇａｇまたはｒｅｖ遺伝子に相補的な
    アンチセンスオリゴヌクレオチドではないことを特徴とする、方法。
  23. 【請求項２３】 該オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド
    ではない、請求項２２に記載の方法、
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