KR100681470B1 - 면역반응 증진용 올리고뉴크레오타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역반응 증진용 올리고뉴크레오타이드에 대한 발명으로, 더욱 상세하게는 면역반응 증강에 관여하는 세 개의 CpG 모티프(motif)를 갖는 올리고뉴크레오타이드에 대한 발명으로 본 발명의 올리고뉴크레오티드는 면역기능 증진제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

면역반응 증진용 올리고뉴크레오타이드{Oligonucleotides for stimulating immune response}

도 1은 보바인 DNase I에 의해 생산된 박테리아 DNA 절편을 보여주는 그림. 도 1의 lane 1과 lane 7은 1 Kb plus DNA ladder marker (GibcoBRL) 와 10 bp DNA ladder marker (GibcoBRL)이고, lane 2부터 각각 0 분 (intact DNA;EC DNA1), 레인3, 5 분(1 kbp 이상;EC DNA2), 레인4, 20 분(100 bp 에서 1 kbp;EC DNA3), 레인5, 40 분(50 bp 에서 200 bp;EC DNA4), 레인 6, 2 시간 (50 bp 이하;EC DNA5) 반응시킨 EC DNA 이다.

도 2는 EC DNA 처리된 RAW264.7 세포의 시간 경과 및 여러 사이즈에서 IL-8 프로모터 활성화를 보여 주는 그림. 도 2a는 EC DNA 조각의 크기에 따른 대식세포의 IL-8 프로모터 활성화 정도를 비교하여 본 결과를 나타내는 그림이고, 도 2b는 EC DNA 조각의 처리 시간에 따른 대식세포의 면역 반응 유도 실험을 보여주는 그림.

도 3은 24시간 동안 여러 크기의 EC DNA 처리된 RAW264.7 세포의 IL-12 프로모터 활성화를 보여주는 그림. 그림에서 EC DNA1은 intact E. coli chromosomal DNA; EC DNA2는 > 1 Kbp; EC DNA3는 100 bp~1 Kbp; EC DNA4는 50~200 bp; EC DNA5는 10~50 bp.

도 4는 EC DNA과 hen egg lysozyme (HEL)에 의해 복강 면역화된 Balb/c mice의 체액 반응을 보여주는 그림.

도 5는 EC DNA 자극에 의한 NF-kB의 핵 위치를 보여주는 그림. Raw 264.7 세포를 EC DNA4 (1.5 mg/ml)로 20분 처리 후 세포들을 고정한 다음 NF-kB p65-specific antisera로 간접 면역형광법을 수행하고, 핵을 보기 위하여 Hoechst NO.33258로 염색.

도 6은 is suppressed by IkBaSR (IkBa super repressor)에 의해 억제된 IL-8 프로모터 활성을 보여주는 그림. 그림에서 IkB-0은 0 ng; IkB50은 50 ng; IkB-100은 100 ng; IkB-200은 200 ng; IkB-500은 500 ng을 나타냄.

도 7은 합성 올리고뉴크레오타이드로 IL-8 프로모터 루시퍼레이즈 분석을 한 결과를 보여주는 그림. 그림 a)는 Screening of synthetic nucleotide by luciferase assay using promoter-reporter constructs를 이용한 루시퍼레이즈 분석법에 의한 합성 뉴크레오타이드의 스크리닝을 나타내고, b)의 oligo-4는 5′-GTCGCACGTTGCCGAACTTC-3′, oligo-4S는 그것의 phosphorothioester 형태를 oligo-4short는 5′-GTCGCACGTTGCCGAA-3′를 나타낸다.

본 발명은 면역반응 증진용 올리고뉴크레오타이드에 대한 발명으로, 더욱 상세하게는 면역반응 증강에 관여하는 세 개의 CpG 모티프(motif)를 갖는 올리고뉴크 레오타이드에 대한 발명이다.

일반적으로 병원성 미생물의 침입에 대한 척추동물의 면역반응은 미생물의 특이형태의 분자 구조를 인식하는 면역 세포들에 의해 일어난다(Medzhitov, R., and Janeway, C. A. Jr. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9, 4-9). 이러한 병원성 미생물 침입 초기에 면역세포가 이들을 인식하여 특이 획득 면역 (acquired immunity)이 일어나게 하는 것이 선천성 면역(innate immunity)의 중요한 역할중 하나이다. 선천성 면역에는 이밖에도 피부, 점막과 같은 구조적 방어벽과 체온, pH, 산소압 등과 같은 생리적 방어벽, 그리고 세포 외부의 거대분자들을 엔도사이토시스 와 phagocytosis를 통해 세포 내부로 끌어들여 분해하는 작용을 포함한다. 이러한 선천성 면역에 비하여 획득 면역은 특이성, 다양성, 기억, 그리고 자기와 비자기의 인식등의 특징을 가지며, B 세포에 의해 만들어지는 항체에 의한 혈액성 면역과 T 세포가 관여하는 세포성 면역으로 세분되어진다.

획득 면역이 작용하기 위해서는 수상세포나 대식세포와 같은 선천성 면역세포의 활성화가 필요하다. 획득 면역에 관여하는 T 세포나 B 세포에는 침입한 외부물질을 특이적으로 인식하는 다양성 (diversity) 을 가진 수용체가 존재하지만 병원균의 감염 자체를 인식하지는 못한다. 반면에 병원균 침입시 초기 면역반응을 작동시키는 중요한 기능을 하는 선천성 면역 세포들은 병원균에 존재하는 일정한 분자구조 병원균 관련 분자 패턴(pathgen associated molecular patterns (PAMPs))들을 인식하는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors (PRRs))가 존재하여 외부물질을 비자기로 인식한다. 초파리의 유전자 Toll 과 유사성을 가지는 Toll- like-receptor (TLR)가 병원균에 존재하는 lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycan, lipoprotein등의 PAMP들에 대한 수용체임이 밝혀졌다(Dempsey, P. W., Allison, M. E., Akkaraju, S., Goodnow, C. C., and Fearon, D. T.(1996) Science 271, 348-350). TLR의 자극에 의한 선천성 면역세포의 활성화 메커니즘이 최근에 많이 연구되었다(Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P., and Janeway, C. A. Jr. (1997) Nature 388, 394-397). TLR 의 유전자는 10개의 family가 보고되어 있으며, TLR-4 는 LPS의 수용체로, TLR-2 는 lipoprotein, peptidoglycan (PGN), 그리고 lipoteichoic acid 의 수용체로, TLR-9 는 박테리아 DNA 의 수용체로 알려졌다. TLR 을 통한 신호전달은 myeloid differentiation marker 88 (MyD88)라는 어댑터 단백질과 IL-1-receptor-associated kinase (IRAK)를 통해TNF-receptor-associated factor 6 (TRAF6)로 전해지고, 이는 IkB-kinase (IKK)를 활성화시킨다. 활성화된 IKK에 의해 IkB가 인산화되고, 인산화된 IkB 는 프로테오좀에서 분해된다. IkB가 분리된 NF-kB는 핵으로 이동하게 되고 NF-kB 반응성 유전자 (NF-kB responsive gene)들의 전사가 일어난다.

척추동물이 진화하는 과정에서 면역체계는 몇 종류의 특징적인 미생물의 분자들을 인식하여 미생물의 침입에 대하여 면역활성이 빠르게 일어나도록 발달하였다. 여러 발명자들의 보고에 의하면 박테리아 DNA 는 척추동물의 DNA에는 존재하지 않는 여러가지 구조 결정인자가 존재한다고 밝혔으며, 이 인자가 면역세포를 활성화시킨다고 알려졌다(Gilkeson, G.. S., Pippen, A. M., and Pisetsky, D. S. (1995) J. Clin. Invest. 95, 1398-1402). 척추동물과 박테리아 DNA의 특징적인 차 이점은 척추동물의 유전체는 CpG suppression되어 있다는 것과 CpG 모티프 dinucleotide의 cytosine에 70%가 methylation되어 있다는 것이다(Krieg, A. M., Yi, A. -K., Matson, S., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A., Teasdale, R., Koretzky, G. A., and Klinman, D. M.(1995) Nature 374, 546-549). CpG suppression이란 유전체에서 확률적으로 나타날 수 있는 CpG 보다 30~50% 정도 더 적게 CpG가 나타나는 것을 말한다. Plasmodium falciparun, Entamoeba histolytica 와 같은 intracellular parasite들과 Mycobacterium jannaschii, Mytobacterium genitaliuj, Borrelia burgdorferi 등의 박테리아의 유전체에서 CpG suppression이 보고되었으며 이들 intracellular parasite들과 박테리아는 척추동물에 침입하였을 때 CpG suppression 을 통해 척추동물의 유전체와 유사하게 보임으로써 면역회피를 유도하는 것으로 알려졌다( Karlin, S., Ladunga, I., and Blaisdell, B. E.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 837-841). 선천성 면역을 가장 잘 활성화시키는 CpG 모티프를 찾는 연구결과에 따르면 쥐와 토끼에서는 일반적으로 purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine 의 염기서열이가장 면역활성화를 증강시키고, 그 중에서도 GACGTT가 가장 최적이라고 밝혔다(Yi. A. -K., Chang, M., Peckham, D. W., and Krieg, A. M.(1998) J. Immunol. 160, 5898-5906). 반면에 사람에서는 GTCGTT 가 가장 최적의 CpG 모티프로 알려져 있다(Hartmann, G.., and Krieg, A. M. (2000) J. Immunol. 164, 944-953). 다른 연구에서 사람의 T 세포와 natural killer (NK) 세포에서는 다른 CpG 모티프가 작용하는 것으로 알려져 있다(Iho, S., Yamamoto, T., Takahashi, T., and Yamomoto, S. (1999) J. immunol. 163, 3642-3652). 사람의 최적 CpG 모티프인 GTCGTT 는 사람 이외에도 소, 양, 고양이, 개, 염소, 말, 돼지, 닭 등의 척추동물에서도 최적 CpG 모티프인 것으로 발표되었다(Brown, W. C., Estes, D.M., Chantler, S. E., Kegerreis, K. A., and Suarez C. E. (1998) Infect. Immun. 66, 5423-5432). 최근에는 박테리아 DNA에 존재하는 CpG 모티프가 polyclonal B 세포를 빠르게 활성화시켜 IgM 분비를 촉진하며(Yi, A. -K., Hornbeck, P., Lafrenz, D. E. and Krieg, A. M.(1996) J. Immunol. 157, 4918-4925;. Yi, A. -K., Klinman, D. M., Martin, T. L., Matson, S., and Krieg, A. M. (1996) J. Immunol. 157, 5394-5402), CpG 모티프가 직접 B 세포를 활성화시켜 짧은 시간 안에 IL-6 와 IL-12 분비를 촉진시킨다고 알려졌다(Yamamoto, S., Yamamoto, T., Shimada, S., Kuramoto, E., Yano, O., Kataoka, T., and Tokunaga, T. (1992) Microbiol. Immunol. 36, 983-997). 또한 CpG 모티프는 NK 세포에 작용하여 CD4+ 세포에서 IFN-γ를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Stacey, K. J., Sweet, M. J., and Hume, D. A. (1996) J. Immunol, 157, 2116-2122;. Cowdery, J. S., Chace, J. H., Yi, A. -K., and Krieg, A. M. (1996) J. Immunol. 156, 4570-4575;. Shimada, S., Yano, O., and Tokunaga, T. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77, 808-816).

E. coli 크로모조말 DNA (이하, "EC DNA"라 함) 에 존재하는 CpG 모티프가 선천성 면역반응을 활성화 시킨다는 사실은 많은 연구자들에 의해서 밝혀 졌다(Ballas, Z. K., Rasmussen, W. L., and Krieg, A. M. (1996) J. Immunol. 157, 1840-1845). 그러나 EC DNA는 크기가 크고 복잡한 구조를 이루고 있어 CpG 모 티프가 표면에 노출되어 존재하지 않으면 면역세포에 직접적으로 작용할 수 없는 문제점이 존재한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 면역증강에 관여하는 올리고뉴크레오타이드를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5′-RYCGYRCGYYRCGRR-3′(서열정보 1)를 포함하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드를 제공한다. 여기서 R은 아데닌 또는 구아닌과 같은 푸린 뉴크레오타이드이고, Y는 시토신 또는 티민과 같은 피리미딘 뉴크레오타이드인 것이 바람직하며, 5′-GTCGCACGTTGCCGAA-3′(서열정보 2)인 것이 가장 바람직하다.

또 본 발명은 서열정보 1의 올리고뉴크레오타이드의 3′말단부에 YYYY를 더욱 포함하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드를 제공한다. 여기서 Y는 Y는 시토신 또는 티민과 같은 피리미딘 뉴크레오타이드인 것이 바람직하며, 5′-GTCGCACGTTGCCGAACTTC-3′(서열정보 3)인 것이 가장 바람직하다.

또한 본 발명은 상기에서 언급한 올리고뉴크레오타이드에 있어서 뉴크레오타이드 간의 결합이 포스포다이에스터 결합에서 포스포로싸이오에이트 결합으로 치환된 것을 특징으로 하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드를 제공한다. 본 발명에서 각각의 뉴클레오타이드 연결부위 모두를 phosphorothioate 결합으로 치환한 것이고, 이때 non-bridging oxygen을 sulfur로 치환하였다. 이와 같은 방법은 Antisense RNA를 연구하는 팀에서 많이 사용하는 것으로 대부분의 올리고 합성을 해주는 용역회사에서 가능하다. 본 발명에서는 (주)제노텍 (대전)에서 주문한 올리고뉴크레오타이드를 사용하였다.

이하, 본 발명을 간단하게 설명한다.

본 발명에서는 대장균(E. coli) 크로모조말 DNA (EC DNA)를 소 (bovine)의 DNase I 으로 분해하여 생성된 EC DNA 조각들이 선천성 면역반응에 미치는 영향을 관찰하였다. EC DNA 조각들을 생쥐에 hen egg lysozyme (HEL)과 함께 주사하였을 때 HEL에 대해 특이적으로 생성되는 항체의 양이 증가함을 확인하였다. 사람의 전혈에 EC DNA 조각들을 처리하여 분비되는싸이토카인 들을 분석하였고, IL-12의 분비를 통해 EC DNA가 세포성 면역을 유도함을 추정할 수 있었다. CpG 모티프 에 의한 면역 세포의 활성화 과정에는 NF-kB 신호전달 경로를 통한 다양한 면역조절 단백질의 전사조절이 중요한 것으로 보고되고 있다. 쥐의 대식세포 RAW264.7 세포주에서 luciferase assay를 이용하여 EC DNA 조각들이 NF-kB 결합 sequence를 가진 프로모터의 활성화를 유도함을 확인하였고, NF-kB를 면역 형광법으로 염색한 후 confocal microscopy 방법을 이용하여 활성화된 NF-kB가 핵으로 이동함을 관찰하여 EC DNA가 NF-kB 활성화에 작용함을 확인하였다. EC DNA 조각들 중 어떠한 염기서열에 의해 면역증강이 이루어지는지 확인하기 위해 EC DNA 조각들을 클로닝하여 염기서열을 결정하고, 이렇게 결정된 염기서열들을 분석하였다. EC DNA 조각들의 염기서열 분석결과를 토대로 20mer의 염기서열 중 CpG 모티프 특히 세 개의 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴크레오타이드를 설계하고 합성하여, 각각을 스크리닝하였다. Luciferase assay 방법을 통해 합성 올리고뉴크레오타이드들을 스크리닝하여 NF-kB 활성화를 통한 면역 증강에 관여하는 염기서열의 특이성과 CpG 모티프들의 구조적 특성을 규명하였다.

이하, 비 한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: E. coli 크로모조말 DNA (EC DNA) 분리

대장균 (E. coli)의 크로모조말 DNA를 추출하기 위하여 대장균을 3 ml 액상 LB (50 mg/ml ampicillin)에 넣어 8 시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양하고, 배양한 대장균을 1 L 액상 LB (50 mg/ml ampicillin)에 넣어 37℃ 진탕배양기에서 16 시간 배양하였다. 배양한 대장균을 원심 분리하여 회수 (15 g)하고 Tris-EDTA pH 7.4 (10 mM Tris, 25 mM EDTA)용액으로 세척하였다. Lysis A 용액 (Tris- EDTA pH 7.4, 100 mg/ml lysozyme)을 75 ml 넣어주고 37℃에서 한 시간 반응 후, Lysis B 용액 (Tris-EDTA pH 7.4, 1% SDS, 25 mg/ml RNase A)을 75 ml 넣고 역시 37℃에서 한 시간 반응시켰다. Proteinase K (100 mg/ml)를 첨가하여 준 다음 50℃에서 4 시간 반응시켜 대장균을 파쇄하였다. 원심분리하여 상층액을 추출하였다. Phenol/chloroform/ isoamylalcohol (25:24:1)를 상층액과 동량으로 넣고, 원심분리하여 상층액을 추출하고, 이 과정을 4 회 반복하였다. Chloroform를 상층액과 동량으로 넣고, 4℃에서 4 시간 반응시켰다. 원심분리하여 상층액을 추출하고 이를 ethanol 침전방법을 통해 EC DNA (3 mg/ml)를 획득하였다.

실시예 2: DNase I 효소활성을 이용한 EC DNA 조각 생산 및 endotoxin 제거

대장균으로부터 획득한 크로모조말 DNA를 bovine DNase I의 효소활성을 이용 하여 EC DNA 조각을 생산하였다. 일반적으로 박테리아의 세포막에는 endotoxin으로 작용하는 LPS 가 존재하여 크로모조말 DNA를 추출하는 중에 LPS 오염이 뒤따른다. 이를 제거하기 위하여 Triton X-114를 사용하였다. 20 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl₂ , 1 mM CaCl₂ , EC DNA 200 mg, DNase I 0.02 unit의 반응 조성하에 37℃에서 0 분, 5 분, 10 분, 40 분, 2 시간 반응시켰다. Phenol/chloroform/ isoamylalcohol (25:24:1) 10 ml을 넣고 원심분리하여 상층액을 추출하였다. 상층액과 동일한 양의 chloroform을 넣고 4℃에서 4 시간 반응시킨 후, 원심분리하여 다시 상층액을 추출하였다. Ethanol 침전방법으로 DNA를 침전시키고, 1.5 ml tube로 옮겨 다시 ethanol 침전시켰다. 70% ethanol로 침전물을 씻어 준 뒤 말렸다. 1 ml의 증류수로 침전물을 녹인 후, Triton X-114를 최종 농도 0.5%가 되도록 넣고 4℃에서 4 시간 반응시켰다. 37℃에서 5 분간 방치하고 상온에서 원심분리하여 상층액을 추출하였다. 상층액과 동일양의 phenol/ chloroform/isoamylalcohol (25:24:1)을 넣고 원심분리하여 상층액을 추출한 다음, chloroform을 상층액과 동량을 넣어 4℃에서 4 시간 반응시켰다. Ethanol 침전방법으로 DNA를 침전시키고, 70% ethanol로 씻어 침전물을 건조하였다. 침전물을 200 ml의 증류수로 녹여 EC DNA 조각을 획득하였다.

본 발명에서는 효소 처리 시간에 차이를 두어 크기를 달리하는 DNA 조각들을 회수하였다. 반응 시간은 각각 0 분, 5 분, 20 분, 40 분, 2 시간씩 처리하였다(도 1). 도 1의 lane 1과 lane 7은 1 Kb plus DNA ladder marker (GibcoBRL) 와 10 bp DNA ladder marker (GibcoBRL)이고, lane 2 부터 각각 0 분 (intact DNA), 5 분(1 kbp 이상 ), 20 분(100 bp 에서 1 kbp), 40 분(50 bp 에서 200 bp), 2 시간 (50 bp 이하) 반응시킨 EC DNA 이다. Gram negative bacteria 균체는 상당한 LPS 층을 가지고 있어 통상적으로 EC DNA 를 얻기 위해 대장균을 파쇄할 때 LPS의 오염이 뒤따르고 있다. LPS는 대식세포를 활성화시키고 활성화된 대식세포는 TNF와 IL-12를 분비한다(Hartmann, G., and Krieg, A. M.(1999) Gene Ther. 6, 893-903). IL-12는 NK 세포와 T 세포에 작용하여 IFN-γ의 분비를 유도하고(Wu, G. D., Lai, E. J., Huang, N., and Wen, X. (1997) J. Biol. Chem. 272, 2396-2403; Cowdery, J. S., Boerth, N. J., Norian, L. A., Myung, P. S., and Koretzky, G. A. (1999) J.Iimmunol. 162, 6770-6775) IFN-γ는 다시 TNF 의 분비를 증가시킨다. LPS 를 제거하지 않을 경우 LPS에 의해 유도되는 면역반응 때문에 대식세포주에서 EC DNA 조각에 의한 프로모터 활성화와 싸이토카인 의 분비등에 영향을 미친다. LPS를 제거하기 위하여 Triton X-114를 처리한 후 4℃에서 4 시간동안 반응하여 LPS를 detergent 층으로 용해시킨 다음 상층액을 분리하였다. Endotoxin의 양을 측정할 수 있는 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test kit (BioWhittaker)를 통해 각각의 EC DNA 조각시료에 포함된 LPS가 0.075 EU/ml 이하로 검출되었음을 확인하였다. 이와 같은 LPS의 제거과정을 거친 EC DNA 조각 시료를 사용하여 실험을 수행하였다.

실시예 3: EC DNA 조각의 면역 반응 유도

1) 쥐의 대식 세포주 배양

쥐의 대식 세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection ([ATCC] Rockville, MD)에서 구입하였다. 세포는 열처리한 fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL) 10%를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL) 배지에서 1 ml 당 4~5x10⁵ 개의 세포수를 유지하면서 배양하였다. 세포배양은 37℃에서 5% CO₂를 함유한 배양기 (Forma)에서 수행하였다. 세포수와 세포배양 중 생존률은 hemocytometer를 이용하여 trypan blue exclusion 방법으로 주기적으로 측정하였다. 모든 실험에서 세포의 생존률은 95% 이상을 유지시켰다.

2) Luciferase 리포터 프라즈미드

IL-8 프로모터 부분( 135 bp 에서 +46 bp 까지)을 human genomic DNA (Clontech)에서 다음과 같은 primer를 사용, PCR하여 증폭하였다.

5' primer(서열정보 4)	5'GTGAGATCTGAAGTGTGATGACTCAGG3'
3' primer(서열정보 5)	5'GTGAAGCTTGAAGCTTGTGTGCTCTGC3'

pGL3-Basic 프라즈미드 (Promega)를 제한효소 Bgl II 와 Hind III 를 사용하여 자르고, 증폭시킨 IL-8 프로모터 부분을 연결하여 IL-8-Luc 리포터 construct를 제조하였다(Wu, G. D., Lai, E. J., Huang, N., and Wen, X. (1997) J. Biol. Chem. 272, 2396-2403). IL-12 프로모터 부분 ( 373 bp 에서 +52 bp 까지)을 human genomic DNA (Clontech)에서 다음과 같은 primer를 사용, PCR하여 증폭하였다.

5' primer(서열정보 6)	5'CATGAGCTCAGCCTCCCGTCTGACC3'
3' primer(서열정보 7)	5'CTGGGCTCGAGGGAGAGTCCAATGG3'

pGL3-Basic 프라즈미드 (Promega)를 제한효소 Sac I과 Xho I을 사용하여 자르고, 증폭시킨 IL-12 프로모터 부분을 연결하여 IL-12-Luc리포터 construct를 제 조하였다(Plevy, S., Gemberling, J. M., Su, S., Dorner, A. J., and Smale, S. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 4572-4588).

3) Transfection

12 웰 프레이트에 RAW264.7 세포를 5x10⁵ 세포/웰 씩 넣고 24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 걷어내어 phosphate buffered saline (PBS)로 씻은 후 새로운 DMEM 배양액을 1 ml씩 넣어 한 시간동안 37℃에서 다시 배양하였다. FuGene 6 transfection reagent (Roche) 1.5 ml/웰, Luc리포터 프라즈미드 0.2 mg/웰, pRL-null 프라즈미드 20 ng/웰, serum free DMEM 50 ml/웰을 혼합하여 RAW264.7 세포에 리포터 프라즈미드를 transfaction시키고 37℃에서 24 시간동안 배양하였다.

4) EC DNA 조각에 의한 IL-8, IL-12 프로모터 활성화 확인

IL-8 프로모터 리포터 constrct를 transfection시킨 RAW264.7 세포에 EC DNA 조각 (50 bp~200 bp)을 각각 3 mg/웰 씩 처리하였다. 37℃에서 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 동안 배양하였다. 배양액을 걷어 내고 Dual-Luciferase 리포터 assay system (Promega)의 passive lysis buffer를 100 ml/웰 씩 넣고 RAW264.7 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 얻은 상층액 (15 ml)을 사용하여 luciferase assay를 수행하였다. Luciferase 활성은 TD-20/20 (Turner designs) luminometer를 사용하여 측정하였다. 같은 방법으로 IL-8 프로모터 활성화를 측정하기 위해EC DNA 조각을 크기별로 각각 3 mg/웰 씩 처리하여 6 시간동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 반응시킨 후 프로모터 활성화를 측정하였다. IL-12 프로모터 활성화 실험에서는 EC DNA 조각 처리후 24 시간 동안 반응시킨 후 활성화를 측정하였다.

EC DNA 조각의 크기에 따른 대식세포의 면역 반응 유도를 보기 위하여 NF-kB 결합 서열을 가진 프로모터(IL-8 프로모터)의 활성화를 luciferase assay 방법으로 측정하였다. 도 2a에서와 같이 EC DNA 조각의 크기에 따른 대식세포의 IL-8 프로모터 활성화 정도를 비교하여 본 결과 크기가 작아 질수록 프로모터 활성화가 더 높게 일어남을 알 수 있었다. 그러나 DNase I에 의해 mononucleotide 수준으로 분해된 조각에서는 프로모터 활성화가 현저히 감소하였다. 이 결과는 수용체가 10~20 개 정도의 염기를 갖는 DNA 조각을 인식하기 때문인 것으로 사료된다. 도 2b에서와 같이 EC DNA 조각의 처리 시간에 따른 대식세포의 면역 반응 유도 실험에서는, 8 시간 동안 EC DNA 조각을 처리하였을 때 IL-8 프로모터가 가장 활성화되었고, 그 시간 이상 반응시켰을 때에는 활성화가 감소되는 양상을 보였다. 최근 발명에 따르면 LPS 와 CpG 모티프 모두 NF-kB 신호전달을 통해 면역세포를 활성화시키는데, CpG 모티프에 노출시킨 대식세포에 다시 LPS를 처리하면 이 대식세포는 LPS에 의한 활성화가 일어나지 않는 것으로 보고되었다(Jin, L., Raymond, D. P., Crabtree, T. D., Pelletier, S. J., Rudy, C. K., Pruett, T. L., and Sawyer, R.G. (2002) Surgery 132, 245-251). NF-kB는 세포질에서 IkB와 결합하고 있어 비활성 상태로 존재하다가 수용체를 통한 신호전달을 통해 활성화된 IKK에 의해 IkB에 인산화가 일어나 proteosome에서 분해되면 NF-kB가 활성화 되고 활성화된 NF-kB는 핵으로 이동하여 target 유전자를 전사한다. 따라서 활성화된 NF-kB를 다시 비활성 상태로 되돌리기 위해서는 시간이 필요하다. 즉 IL-8 프로모터의 활성화가 8 시간 이후에 둔화되는 것은 활성화 되었던 NF-kB가 비활성 상태로 돌아가기 때문일 것으로 추정된다. 또한 NF-kB 활성화 결과 IL-10과 같은 regulatory 싸이토카인들이 생성된다고 보고된 바 있다(Anitescu, M., Chace, J. H., Tuetken, R., Yi, A. -K., Berg, D. J., Krieg, A. M., and Cowdery, J. S. (1997) J. Interferon cytokine Res. 17, 781-788). 따라서 8 시간 이후에 IL-8 프로모터 활성화가 감소되는 것은 이와 같은 regulatory 싸이토카인의 분비에 의한 효과일 가능성도 배제할 수 없다. 그림 3은 대식세포에서 IL-12 p40 프로모터를 사용하여 동일한 방법으로 프로모터 활성화 실험을 수행한 결과이며 IL-8 프로모터 활성화 실험결과와 마찬가지로 EC DNA 조각의 크기가 작아질수록 활성화가 높게 나타났다. IL-12 p40 프로모터의 경우, IL-8 프로모터가 NF-kB에 의한 신호전달로 활성화 되는 것 뿐만 아니라 대식세포의 활성화로 인하여 생성되는 싸이토카인에 의한 2차 활성화가 이루어지기 때문에 24시간 이후에 활성화 정도를 관찰하였다. 활성화가 이루어 지는 시간적 차이는 존재하지만, EC DNA 조각에 의한 대식세포에서의 IL-12 p40 프로모터의 활성화가 IL-8 프로모터 활성화와 같은 결과를 보이는 것은 EC DNA 조각에 대한 수용체가 동일하며, 이 수용체 (TLR-9)를 통한 NF-kB 신호전달에 의해 대식세포가 활성화되기 때문이라고 사료된다.

실시예 4: EC DNA 조각의 혈액성 면역 반응 유도

1) Immunization

4주령의 Balb/c mouse에 hen egg lysozyme (HEL,50 mg/마리)과 EC DNA 크기별조각 (100 mg/마리) 혼합물을 복강내 투여하였다. 1 주일 경과 후 동량의 HEL과 EC DNA 크기별 조각 혼합물을 두 번째 투여하였다. 1 주일 경과 후, heart punching방법으로 혈액을 채취하고 원심분리하여 혈구를 침전시키고 혈청을 획득하였다. 획득한 혈청으로부터 anti-HEL 항체 (total IgG)의 역가를 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다.

2) ELISA

획득한 혈청에 PBS/0.2% sodium azide를 사용하여 1:10으로 dilution 하여 -20℃에 보관하였다. 96 웰 이무노프레이트 (Nunc)에 HEL (10 mg/ml sodium bicarbonate 버퍼 pH 9.6)을 넣어 4℃에서 16 시간 동안 방치하여 프레이트 바닥에 HEL을 붙였다. PBST (PBS/0.05% Tween 20)를 사용하여 프레이트를 씻고, blocking하기 위해 1% 소serum albumin (BSA)을 넣고 실온에서 1 시간 방치하였다. 혈청을 PBS 를 사용하여 1:3으로 연속 희석하여 프레이트에 순서대로 넣고 4℃에서 16 시간 동안 방치한 후 PBST로 씻었다. Alkaline phosphatase-conjugated detecting 항체를 PBST에 섞어 프레이트에 넣고 실온에서 2 시간 방치하였다. Total Ig 검출을 위해 1:2,000 goat anti-mouse Ig(H+L) (Southern Biotechnology Associates) 항체를 사용하였다. 발색을 위해 1-StepTM ABTS (PIERCE)를 넣고, ELISA 리더(Labsystems)를 사용하여 405 nm에서 흡광을 측정하였다(Chu, R. S., Targoni, O. S., Krieg, A. M., Lehmann, P. V., and Harding, C. V.(1997) J. Exp. Med. 186, 1623-1631).

EC DNA 조각을 마우스 복강내에 hen egg lysozyme (HEL)과 함께 주사하여 혈액성 면역반응을 조사하였다. 100 bp에서 1 kbp정도의 크기를 가진 EC DNA 조각을 함께 투여하였을 때 IgG 역가가 가장 높게 나타났다(도 4). HEL 만을 단독으로 주사하는 것에 비하여 EC DNA 조각과 함께 주사한 HEL에 대한 항체의 양이 증가하므로 EC DNA 조각이 혈액성 면역에서 면역 보조제 효과가 있음을 확인하였다. Mycobacteria의 추출물을 파라핀 oil과 혼합한 약제인 Freund's adjuvant는 60년 전부터 현재까지 사용되고 있는 대표적인 면역보조제 중 하나이다. 그러나 이 면역보조제의 문제점은 세포성 면역증강이 이루어 지지 않는다는 점이다. EC DNA는 혈액성 면역을 증가시키는 면역보조제로의 역할 뿐 아니라 면역세포를 자극하여 세포성 면역을 유도하기 때문에 새로운 면역보조제로의 활용이 가능하다는 결과를 얻었다.

실시예 5: EC DNA 조각 처리에 의한 NF-kB 활성화

24 웰 프레이트에 cover glass를 넣고 Raw 264.7 세포를 5x10⁵ 세포/ml씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. EC DNA 조각 (50bp~200bp)을 각각 1.5 mg/웰 씩 처리하였다. 20 분 경과 후 세포를 고정시키기 위해 3.7% formaldehyde를 포함한 PBS 를 200 ml/웰 넣고 실온에서 10 분 방치 후 PBS로 씻었다. 세포를 permeabilize하게 만들기 위해 0.2% Triton-X 100을 포함한 PBS를 200 ml/웰 넣고, 실온에서 10 분간 방치 후 다시 PBS로 씻었다. 0.2% Tween 20을 포함 한 PBS (PBST)에 1% donkey serum을 넣은 용액을 200 ml/웰 넣어 30 분간 blocking한 후, PBST에 mouse anti-p65 (titer 1: 500) 항체를 0.5 ml/웰 넣어 2 시간 동안 상온에 방치하였다. PBST를 200 ml/웰 넣어 씻고 이를 3~4 회 반복하였다. Donkey-anti-mouse-IgG-FITC (titer 1:250) 항체를 0.5 ml/웰 넣고, 2 시간동안 방치하였다. PBST로 3~4 회 반복하여 씻고, PBS 로 1 회, 물로 1 회 씻고 건조하였다. Confocal microscopy를 이용하여 NF-kB의 핵으로 이동을 관찰하였다(Lee, Y., Gotoh, A., Kwon, H. J., You, M., Kohli, L., Mantel, C., Cooper, S., Hangoc, G., Miyazawa, K., Ohyashiki, K.,and Broxmeyer, H. E. (2002) Blood 99, 4307-4317).

도 5는 NF-kB를 면역 염색법으로 염색하여 confocal microscopy를 사용하여 NF-kB가 핵으로 이동하는 현상을 관찰한 그림이다. LPS는 NF-kB 신호전달을 통한 면역세포의 활성화를 유도하는 대표적인 물질로 알려져 있다. 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 NF-kB가 세포질에 위치하였다. 대식세포에 LPS를 처리하면 20분 후 NF-kB가 핵 안쪽으로 이동함을 확인하였다. 대식세포에 EC DNA 조각을 처리한 경우에도 LPS와 마찬가지로 NF-kB가 핵으로 이동하였다. 또 대식세포의IL-8 프로모터 활성화 실험에서 IL-8 프로모터 리포터 프라즈미드와 IkBa Super Rerepressor (SR) 프라즈미드를 cotransfection시켜 관찰한 결과에서도 IkBa SR 프라즈미드의 양이 증가할수록IL-8 프로모터 활성화 정도가 현저히 감소하는 경향을 확인하였다(도 6). 이는 EC DNA 조각 처리에 의한 면역세포 활성화에 NF-kB 신호전달이 관여함을 보여준다. IkBa SR은 IKK에 의해 IkB가 인산화되는 ser32와 ser36을 알라닌으 로 돌연변이시킨 것으로 IKK에 의해 인산화되지 않아 IkB는 분해되지 않고 NF-kB 와 계속 결합하여 NF-kB가 활성화되는 과정을 억제한다. LPS 에 대한 수용체인(5) TLR-4와 CpG 모티프에 대한 수용체인 TLR-9 모두 이러한 NF-kB 신호전달을 통해 면역세포를 활성화시켜, 싸이토카인과 코-스티무레이토리 분자 들의 생산을 유도한다. LPS와 DNA를 인식하는 초기수용체는 각각 다르지만 신호전달과정에서는 공통적으로 NF-kB 매개에 의해 전사가 일어남에도 불구하고 외부의 리간드 종류에 따라 서로 다른 싸이토카인과 코-스티무레이토리 분자의 전사가 이루어 짐으로 미루어 NF-kB 신호전달이 동일한 메커니즘에 의한 것이 아닌 것으로 해석될 수 있다. 최근 발표된 논문에 의하면(Brockman, J. A., Scherer, D. C., McKinsey, T. A., Hall, S. M., Qi, X., Lee, W. Y., and Ballard, D.W. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2809-2818) 대식세포의 경우 LPS 수용체인 TLR-4의 신호전달의 경우 어댑터 단백질인 myeloid 분화 마커 88(MyD88)이 세포표면의 수용체로 모여 신호가 전달되는 반면, CpG DNA의 수용체인 TLR-9의 경우 엔도사이토시스에 의해 endosome이 형성되고, 엔도좀 안에서 CpG DNA의 endosomal 성숙이 이루어진 다음 신호전달이 이루어진다고 보고되었다. 박테리아의 세포벽을 구성하는 LPS나 리포프로틴 등의 수용체인 TLR-4와 TLR-2는 대식세포의 겉표면에 존재하여 외부 물질을 잡아내지만, 박테리아 DNA의 경우 패고사이토시스를 통해 박테리아를 대식세포 안으로 끌어들인 후, 리조좀에서 endosomal 성숙 과정이 일어난 이후에 TLR-9에 의한 신호전달이 이루어 지는 것으로 알려져 있다.

실시예 6: EC DNA 조각의 서열 분석

1) EC DNA 조각의 효소 처리

EC DNA 조각 (100~1000bp)을 에탄올 침전시켰다. 침전물을 증류수로 녹이고, 갭-휠링하기 위하여 Klenow 효소를 이용하여 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 7.5 mM dithiothreitol (pH 7.5, 25℃), 1 mM dNTP, Klenow (NEB) 5 units, EC DNA 10mg의 조성으로 25℃에서 20 분간 반응하였다. 20 분 후 0.5 M EDTA를 1 ml 넣어 반응을 중지시키고, nucleotide removal kit (Qiagen)를 이용하여 EC DNA를 회수하였다. EC DNA를 인산화하기 위해 70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM dithiothreitol (pH 7.6, 25℃), T4 Polynucleotide Kinase (NEB) 10 units, EC DNA 5 mg의 조성으로 37℃에서 1 시간 동안 폴리뉴크레오타이드 키나제로 반응하고 0.5 M EDTA를 1 ml 넣어 반응을 중지하였다.

2) pGEM-T easy 벡터의 효소 처리

pGEM-T easy 벡터 (promega)를 자르기 위해 50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 0.025% Triton X-100( pH 7.5, 25℃), EcoRI (NEB) 20 units, pGEM-T easy 벡터 (promega) 2.5 mg의 조성으로 37℃에서 2 시간 동안 반응하였다. 0.5 M EDTA를 1 ml 넣어 반응을 중지시키고, nucleotide removal kit (Qiagen)를 이용하여 벡터를 회수하였다. 회수한 벡터를 갭-휠링(filling)하기 위하여 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 7.5 mM dithiothreitol(pH 7.5, 25℃), 1 mM dNTP, Klenow (NEB) 5 units, 벡터 1 mg의 조성으로 25℃에서 20 분간 반응하였다. 0.5 M EDTA를 1 ml 넣어 반응을 중지시키고, nucleotide removal kit (Qiagen)를 이용하여 벡터 를 회 수하였다. 회수한 벡터에서 인산을 제거하기 위하여 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25℃), 캘프 Intestinal alkaline Phosphatase (CIP) 2.5 units, 벡터 0.5 mg의 조성으로 37℃에서 1 시간동안 반응하였다. 벡터와 EC DNA 조각을 2% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각 밴드를 절단하여 gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 각각 회수하였다. 인산이 제거된 벡터와 인산화된 EC DNA 조각과 라이게이션하기 위해 25℃에서 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 mg/ml BSA pH 7.5, 벡터 0.5 mg, EC DNA 2 mg, T4 DNA ligase (NEB) 400 units의 조성으로 16℃에서 16 시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 라이게이트를 CaCl₂ 방법으로 제조한 대장균 XL-1 blue competent 세포를 사용하여 트랜스포메이션하여 12 시간 동안 37℃에서 배양한 후, LB 프레이트에 깔아 37℃에서 16 시간 동안 배양하여 white 콜로니 들을 선별하였다.

3) 인저트(Insert) 확인과 염기서열 확인

Blue-white 콜로니선별에서 얻은 white 콜로니들을 각각 액상 LB(50 mg/ml ampicillin)에 배양하고 원심분리하여 회수한 대장균들을 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)를 사용하여 프라즈미드 DNA를 획득하였다. 획득한 프라즈미드 DNA를 제한효소 Nco I (NEB)과 Pst I (NEB)로 잘라, insert를 확인하였다. Insert 확인된 EC DNA 조각들의 염기서열을 확인하고, 이를 분석하여 20 개의 염기내에 3 개의 CpG 모티프를 가진 부분을 선택하여 이들을 나열하였다. 이들 중 3개의 CpG 모티프 간의 간격이 서로 다르게 배열된 부분을 선택하여 34 개의 올리고뉴크레오타이드를 합성하였다.

실시예 7: 합성 올리고뉴크레오타이드의 면역 반응 조사

12 웰 프레이트에 Raw 264.7 세포를 5x10⁵ 세포/웰 깔고 24 시간동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. IL-8 프로모터 리포터 프라즈미드와 pRL-null 프라즈미드를 tranfection시킨 후 24 시간동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 합성 올리고뉴크레오타이드를 10 mg/웰 씩 처리하고 6 시간 동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액을 걷어내고 Dual-Luciferase 리포터 assay system (Promega)의 passive lysis 버퍼를 100 ml/웰씩 넣고 Raw 264.7 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액를 원심분리하여 얻은 상층액 (15 ml)을 사용하여 luciferase assay를 수행하였다. 루시퍼레이즈 활성은 TD-20/20 (Turner designs) luminometer를 사용하여 측정하였다. 마찬가지 방법으로 12 웰 프레이트에 배양한 RAW 264.7 세포에 IL-8 프로모터 리포터 프라즈미드와 pRL-null 프라즈미드 그리고 IkBa SR 프라즈미드를 co-transfection시켜 합성 올리고뉴크레오타이드 에 대한 면역반응을 조사하였다.

EC DNA 조각들을 pGEM-T-easy 벡터에 클로닝하여 각각의 염기서열을 결정하였다. 100 bp ~ 800 bp 크기의 117 종류 DNA 조각에 대한 총연장 34,173 bp의 염기서열을 분석하였다. 이는 E. coli K-12 strain의 크로모조말 DNA 크기 (4,639,221 bp)의 0.7%에 해당한다. 이 염기서열을 컴퓨터 프로그램을 사용하여 무작위로 20 개 염기로 제한하여 그 안에 CpG 모티프가 두 개 이상 포함된 염기서열들을 나열하 였다(표 1A). 본 발명에서는 이들 염기들 중 CpG 모티프를 세 개 포함한 염기서열들만을 선택하였다. 또 세 개의 CpG 모티프를 가진 염기들 중에서 모티프간에 다른 염기가 존재하지 않는 것들은 배제하였다. 이렇게 정리한 20 개 염기로 구성된 118 개의 염기서열들 중, CpG 모티프가 위치한 모양이 같은 순서로 정리하여, 34 개를 선택하여 합성하였다(표 1B). 어떤 염기서열을 가진 합성 올리고뉴크레오타이드가 대식세포의 IL-8 프로모터를 활성화시키는지 루시퍼레이즈 분석 방법으로 활성화를 측정한 결과, 5′-GTCGCACGTTGCCGAACTTC-3′의 염기서열을 가진 올리고뉴크레오타이드가 대조군에 비하여 8 배 이상 IL-8 프로모터 를 활성화 시켰다(도 7a). 다른 합성 올리고뉴크레오타이드의 경우 대조군과 같이 IL-8 프로모터 활성화를 보이지 않았다. Il-8 프로모터를 활성화시킨 올리고뉴크레오타이드에서 CpG 모티프가 아닌 부분인 3′끝의 4 개 염기 CTTC를 제거한 5′-GTCGCACGTTGCCGAA-3′를 합성하여 IL-8 프로모터의 활성화를 측정하여 본 결과, 대조군에 비해 10 배 정도 활성화시켰다. 이를 통해 CpG 모티프 부분이 아닌 염기서열은 프로모터를 활성화시키는데 관여치 않음을 알 수 있었다. 또 phosphodiester 결합을 phosphorothioate 결합으로 바꾸어 합성한 경우 대조군에 비하여 11 배 정도 IL-8 프로모터 활성화를 보였다(도 7b).

[표 1A] 20 개 염기로 구성된 CpG 모티프가 두 개 이상 포함된 모든 염기서열

[표 1B]세 개의 CpG 모티프를 가진 염기들 중 최종 합성된 34 개 서열

상기와 같은 구성을 갖는 본 발명을 통하여 EC DNA 조각은 HEL 항체 형성에 있어서 면역보조제로서의 역할을 수행하여 혈액성 면역에 관여하고, 대식세포의IL-8 프로모터 활성화 발명에서 IL-8 프로모터가 활성화됨을 통해 선천성 면역세포의 활성화에 관여함을 알았다. 특히 EC DNA 조각에서 면역반응을 일으키는 특정부위를 알아보기 위해 세 개의 CpG 모티프를 가진 20mer의 합성 올리고뉴크레오타이드를 스크리닝하였고, 그 중 5′-GTCGCACGTTGCCGAA 및 5′-GTCGCACGTTGCCGAACTTC-3′의 CpG 모티프가 대식세포의 IL-8 프로모터 활성화를 가장 효과적으로 유도하는 DNA 조각 서열임을 확인하여 본 발명의 올리고뉴크레오티드는 혈액성 면역을 증가시키는 면역보조제로의 역할 뿐 아니라 면역세포를 자극하여 세포성 면역을 유도하기 때문에 새로운 면역보조제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

<110> KIM, DOO SIK <120> Oligonucleotides for stimulating immune response <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for stimulating immune response <400> 1 rycgyrcgyy rcgrr 15 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for stimulating immune response <400> 2 gtcgcacgtt gccgaa 16 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for stimulating immune response <400> 3 gtcgcacgtt gccgaacttc 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for IL-8 promoter <400> 4 gtgagatctg aagtgtgatg actcagg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for IL-8 promoter <400> 5 gtgaagcttg aagcttgtgt gctctgc 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer for IL-12 promoter <400> 6 catgagctca gcctcccgtc tgacc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer for IL-12 promoter <400> 7 ctgggctcga gggagagtcc aatgg 25

Claims (5)

1. 5′-RYCGYRCGYYRCGRR-3′(서열정보 1)를 포함하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드, 여기서 R은 아데닌 또는 구아닌과 같은 푸린 뉴크레오타이드이고, Y는 시토신 또는 티민과 같은 피리미딘 뉴크레오타이드를 의미한다.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기의 올리고뉴크레오타이드는 3′말단부에 YYYY를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드, 여기서 Y는 시토신 또는 티민과 같은 피리미딘 뉴크레오타이드를 의미한다.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기의 뉴크레오타이드는 5′-GTCGCACGTTGCCGAA-3′(서열정보 2)인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드.
4. 제 2 항에 있어서,

   상기의 뉴크레오타이드는 5′-GTCGCACGTTGCCGAACTTC-3′(서열정보 3)인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기의 뉴크레오타이드 간의 결합이 포스포다이에스터 결합에서 포스포로싸이오에이트 결합으로 치환된 것을 특징으로 하는 면역 증강용 올리고뉴크레오타이드.

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