KR102405104B1 - 치료 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 BCMA (B세포 성숙 항원) 및 CD3 (분화 클러스터 3)에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 전장 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BCMA 항체를 포함하는 항체 접합체 (예를 들어, 항체약물접합체), BCMA 항체를 포함하는 조성물, 및 BCMA를 발현하는 세포와 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)를 치료하기 위해 BCMA 항체 및 그의 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 CD3 및 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 이종다량체 항체 (예를 들어, CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)에 관한 것이다. 이러한 이종다량체 항체를 포함하는 조성물, 이러한 이종이량체 항체를 생산 및 정제하는 방법, 및 진단제 및 치료제에서의 그의 용도가 또한 제공된다.

Description

치료 항체 및 그의 용도{THERAPEUTIC ANTIBODIES AND THEIR USES}
본 발명은 BCMA (B-세포 성숙 항원) 및/또는 CD3 (분화 클러스터 3)에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 전장 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BCMA 항체를 포함하는 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물-접합체), BCMA 항체를 포함하는 조성물, 및 BCMA를 발현하는 세포와 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)를 치료하기 위해 BCMA 항체 및 그의 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 CD3 및 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 이종다량체 항체 (예를 들어, CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)에 관한 것이다. 이러한 이종다량체 항체를 포함하는 조성물, 이러한 이종이량체 항체를 생산 및 정제하는 방법, 및 진단제 및 치료제에서의 그의 용도가 또한 제공된다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA, CD269, 또는 TNFRSF17)은 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA는 t(4;16) 전위를 함유하는 악성 인간 T 세포 림프종에서 확인되었다. 유전자는 B-세포 계열에서 선택적으로 발현되며, 항체 분비 세포인 형질 모세포 및 형질 세포에서 최고로 발현된다. BCMA는 2종의 리간드인 B-세포 활성화 인자 (BAFF) (또한 B-림프구 자극자 (BLyS) 및 APOL-관련 백혈구 발현된 리간드 (TALL-1)로도 불림) 및 증식-유도 리간드 (APRIL)에 각각 1uM 및 16nM의 친화도로 결합한다. BCMA에의 APRIL 또는 BAFF의 결합은 NF-카파 B, Elk-1, c-Jun N-말단 키나제 및 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제를 수반하는 신호전달 캐스케이드를 촉진하며, 이는 세포 생존 및 증식을 위한 신호를 생성한다.
BCMA는 또한 악성 B 세포, 및 다발성 골수종, 형질세포종, 호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병을 포함한, B 림프구를 수반하는 여러 암에서 발현된다. 형질모세포가 수반되는 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 류마티스 관절염에서, BCMA 발현 항체-생산 세포는 자기를 공격하는 자가항체를 분비한다.
다발성 골수종의 경우에, 매년 약 24,000건의 새로운 사례가 미국에서 새롭게 진단되고, 이 수는 미국에서 새롭게 진단된 혈액암의 약 15%를 나타낸다. 매년 평균 11,000건의 사망이 다발성 골수종으로부터 발생하고, 평균 5-년 생존율은 약 44%이며 중앙 생존기간은 50-55개월이다. 다발성 골수종에 대한 현행 치료는 형질 세포 아폽토시스 및/또는 파골세포 활성 감소에 초점이 맞춰져 있다 (예를 들어, 화학요법, 탈리도미드, 레날리도미드, 비스포스포네이트, 및/또는 프로테아솜 억제제, 예컨대 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®) 또는 카르필조밉). 그러나, 다발성 골수종은 치유할 수 없는 질환으로 남아있고, 거의 모든 환자는 이들 작용제에 대한 저항성이 발생하여 결국 재발한다. 따라서, 다발성 골수종에 대한 대체 치료, 예컨대 항체 및 다른 면역요법제 (예를 들어 이중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체)를 포함한 항-BCMA 길항제를 사용하는 것은 우수한 치료제를 만들 것이다.
본원에 개시된 발명은 BCMA 및/또는 CD3에 결합하는 치료 항체에 관한 것이다. BCMA를 포함하는 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물 접합체)가 또한 제공된다. 추가로, CD3 및 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 이종다량체 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) (예를 들어, CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)가 또한 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 (a) (i) 서열 SYX1MX2 (여기서 X1은 A 또는 P이고; X2는 T, N, 또는 S임) (서열식별번호(SEQ ID NO): 301), GFTFX1SY (여기서 X1은 G 또는 S임) (서열식별번호: 302), 또는 GFTFX1SYX2MX3 (여기서 X1은 G 또는 S이고, X2는 A 또는 P이고; X3은 T, N, 또는 S임) (서열식별번호: 303)을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG (여기서 X1은 I, V, T, H, L, A, 또는 C이고; X2는 S, D, G, T, I, L, F, M, 또는 V이고; X3은 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X4는 S, Q, T, A, F, 또는 W이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, W, 또는 F이고; X7은 S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, 또는 C이고; X8은 F, Y, P, W, H, 또는 G이고; X9는 V, R, 또는 L이고; X10은 G 또는 T임) (서열식별번호: 305), 또는 X1X2X3X4X5X6 (여기서 X1은 S, V, I, D, G, T, L, F, 또는 M이고; X2는 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X3은 S, G, F, 또는 W이고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, 또는 W임) (서열식별번호: 306)을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 VSPIX1X2X3X4 (여기서 X1은 A 또는 Y이고; X2는 A 또는 S이고; X3은 G, Q, L, P, 또는 E임) (서열식별번호: 307), 또는 YWPMX1X2 (여기서 X1은 D, S, T, 또는 A이고; X2는 I, S, L, P, 또는 D임) (서열식별번호: 308)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (b) (i) 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (여기서 X1은 R, G, W, A, 또는 C이고; X2는 A, P, G, L, C, 또는 S이고; X3은 S, G, 또는 R이고; X4는 Q, C, E, V, 또는 I이고; X5는 S, P, G, A, R, 또는 D이고; X6은 V, G, I, 또는 L이고; X7은 S, E, D, P, 또는 G이고; X8은 S, P, F, A, M, E, V, N, D, 또는 Y이고; X9는 I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, R, 또는 F이고; X10은 Y 또는 F이고; X11은 L, W, 또는 P이고; X12는 A, S, 또는 G임) (서열식별번호: 309)를 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열 X1ASX2RAX3 (여기서 X1은 G 또는 D이고; X2는 S 또는 I이고; X3은 T 또는 P임) (서열식별번호: 310)을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QQYX1X2X3PX4T (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K, 또는 C이고; X3은 W, F, 또는 S이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 311), 또는 QQYX1X2X3PX4 (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F, 또는 Y이고; X3은 W, S, 또는 F이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 312)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 125, 127, 313, 314, 363, 또는 365에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315, 316, 또는 364에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 (i) 서열식별번호: 150, 151, 152, 156, 또는 157을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열식별번호: 169, 154, 194, 159, 195, 196, 162, 158, 198, 177, 178, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 207, 208, 172, 203, 또는 204를 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 155, 161, 197, 205, 또는 164를 포함하는 VH CDR3을 포함하고/거나; VL 영역은 (i) 서열식별번호: 209, 271, 273, 275, 251, 277, 260, 279, 245, 283, 285, 287, 290, 292, 235, 297, 또는 299를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열식별번호: 221을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 225, 272, 274, 276, 278, 280, 281, 282, 284, 286, 288, 289, 291, 293, 294, 229, 296, 298, 또는 300을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 서열식별번호: 112에 제시된 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에서 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고/거나 VL 영역은 서열식별번호: 38에 제시된 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에서 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 357에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호: 358에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-122094를 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VH 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-122093을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VL 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 BCMA 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 태그는 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호: 318), LLQG (서열식별번호: 454), LSLSQG (서열식별번호: 455), GGGLLQGG (서열식별번호: 456), GLLQG (서열식별번호: 457), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 458), GLLQGGG (서열식별번호: 459), GLLQGG (서열식별번호: 460), GLLQ (서열식별번호: 461), LLQLLQGA (서열식별번호: 462), LLQGA (서열식별번호: 463), LLQYQGA (서열식별번호: 464), LLQGSG (서열식별번호: 465), LLQYQG (서열식별번호: 466), LLQLLQG (서열식별번호: 467), SLLQG (서열식별번호: 468), LLQLQ (서열식별번호: 469), LLQLLQ (서열식별번호: 470), LLQGR (서열식별번호: 471), LLQGPP (서열식별번호: 472), LLQGPA (서열식별번호: 473), GGLLQGPP (서열식별번호: 474), GGLLQGA (서열식별번호: 475), LLQGPGK (서열식별번호: 476), LLQGPG (서열식별번호: 477), LLQGP (서열식별번호: 478), LLQP (서열식별번호: 479), LLQPGK (서열식별번호: 480), LLQAPGK (서열식별번호: 481), LLQGAPG (서열식별번호: 482), LLQGAP (서열식별번호: 483), 및 LLQLQG (서열식별번호: 484)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 변형에서, 본 발명은 본 발명의 BCMA 항체의 위치 222, 340, 또는 370에서 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 아미노산 변형을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 리신에서 아르기닌으로의 치환이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 BCMA 항체는 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 Ac-Lys-Gly (아세틸-리신-글리신), 아미노카프로산, Ac-Lys-β-Ala (아세틸-리신-β-알라닌), 아미노-PEG2 (폴리에틸렌 글리콜)-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, 푸트레신, 및 Ac-Lys-푸트레신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 작용제에 접합되며, 여기서 작용제는 세포독성제, 면역조정제, 영상화제, 치료 단백질, 생체중합체, 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 안트라시클린, 아우리스타틴, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 메이탄신, 퓨로마이신, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 탁산, 빈카 알칼로이드, 튜부리신, 헤미아스텔린, 스플라이세오스타틴, 플라디에놀리드, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포독성제이다. 예를 들어, 세포독성제는 MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D), 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드), 0131 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), 또는 0121(2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음 식을 포함하는 접합체를 제공한다: 항체-(아실 공여자 글루타민-함유 태그)-(링커)-(세포독성제). 일부 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 LLQG (서열식별번호: 319) 및/또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 339)를 포함하고, 여기서 링커는 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 또는 아미노-PEG6-C2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 1) 항체-GGLLQGPP (서열식별번호: 339)-(아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (AcLys-VC-PABC))-0101; 2) 항체-LLQG (서열식별번호: 319)-아미노-PEG6-C2-0131; 및 3) 항체-LLQG (서열식별번호: 319)-아미노-PEG6-C2-3377로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 항체 위치 222에서 리신에서 아르기닌으로의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 항체 위치 N297Q 또는 N297A에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 숙주 세포를 BCMA 항체가 생산되도록 하는 조건 하에 배양하는 것, 및 BCMA 항체를 숙주 세포 또는 배양물로부터 단리하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 장애)를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, BCMA를 발현하는 악성 세포의 전이를 억제하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양 퇴행을 유도하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체의 용도가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 또는 400에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및/또는 서열식별번호: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 또는 399에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 324 또는 388에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및/또는 서열식별번호: 323 또는 387에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 (i) 서열식별번호: 331, 332, 333, 401, 402, 403, 407, 408, 415, 416, 418, 419, 420, 424, 425, 426, 446, 447, 또는 448에 제시된 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열식별번호: 334, 336, 337, 338, 339, 404, 405, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 427, 428, 449, 또는 450에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열식별번호: 335, 406, 423, 429, 또는 451에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 (VL) 영역은 (i) 서열식별번호: 340, 343, 430, 431, 435, 또는 440, 441에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열식별번호: 341, 433, 452, 또는 436에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342, 432, 434, 437, 438, 439, 446, 또는 453에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 (i) 서열식별번호: 331, 332, 333, 401, 407, 또는 408에 제시된 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열식별번호: 336, 404, 405, 또는 417에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열식별번호: 335 또는 406에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 (VL) 영역은 (i) 서열식별번호: 343 또는 441에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열식별번호: 341 또는 436에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342 또는 439에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-122513을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VH 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 수탁 번호 PTA-122512를 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VL 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하고 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항-CD3 항체와 경쟁하는 단리된 항체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공하며, 여기서 이중특이적 항체는 인간 면역 이펙터 세포 상에 위치하는 이펙터 항원에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 동원할 수 있는 이중특이적 항체의 제1 항체 가변 도메인을 포함하고 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체의 제2 항체 가변 도메인을 포함하는 전장 인간 항체이며, 여기서 제1 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 또는 400에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 또는 399에 제시된 경쇄 가변 (VL) 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 331, 332, 333, 401, 402, 403, 407, 408, 415, 416, 418, 419, 420, 424, 425, 426, 446, 447, 또는 448에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; (ii) 서열식별번호: 334, 336, 337, 338, 339, 404, 405, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 427, 428, 449, 또는 450에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열식별번호: 335, 406, 423, 429, 또는 451에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (i) 서열식별번호: 340, 343, 430, 431, 435, 또는 440, 441에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열식별번호: 341, 433, 452, 또는 436에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342, 432, 434, 437, 438, 439, 446, 또는 453에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 324 또는 388에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 323 또는 387에 제시된 경쇄 가변 (VL) 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 제2 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 112에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 38에 제시된 경쇄 가변 (VL) 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 항체 가변 도메인은 (a) (i) 서열 SYX1MX2 (여기서 X1은 A 또는 P이고; X2는 T, N, 또는 S임) (서열식별번호: 301), GFTFX1SY (여기서 X1은 G 또는 S임) (서열식별번호: 302), 또는 GFTFX1SYX2MX3 (여기서 X1은 G 또는 S이고, X2는 A 또는 P이고; X3은 T, N, 또는 S임) (서열식별번호: 303)을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG (여기서 X1은 I, V, T, H, L, A, 또는 C이고; X2는 S, D, G, T, I, L, F, M, 또는 V이고; X3은 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X4는 S, Q, T, A, F, 또는 W이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, W, 또는 F이고; X7은 S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, 또는 C이고; X8은 F, Y, P, W, H, 또는 G이고; X9는 V, R, 또는 L이고; X10은 G 또는 T임) (서열식별번호: 305), 또는 X1X2X3X4X5X6 (여기서 X1은 S, V, I, D, G, T, L, F, 또는 M이고; X2는 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X3은 S, G, F, 또는 W이고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, 또는 W임) (서열식별번호: 306)을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 VSPIX1X2X3X4 (여기서 X1은 A 또는 Y이고; X2는 A 또는 S이고; X3은 G, Q, L, P, 또는 E임) (서열식별번호: 307), 또는 YWPMX1X2 (여기서 X1은 D, S, T, 또는 A이고; X2는 I, S, L, P, 또는 D임) (서열식별번호: 308)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (b) (i) 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (여기서 X1은 R, G, W, A, 또는 C이고; X2는 A, P, G, L, C, 또는 S이고; X3은 S, G, 또는 R이고; X4는 Q, C, E, V, 또는 I이고; X5는 S, L, P, G, A, R, 또는 D이고; X6은 V, G, 또는 I이고; X7은 S, E, D, 또는 P이고; X8은 S, P, F, A, M, E, V, N, D, 또는 Y이고; X9는 I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, 또는 R이고; X10은 Y 또는 F이고; X11은 L, W, 또는 P이고; X12는 A, S, 또는 G임) (서열식별번호: 309)를 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열 X1ASX2RAX3 (여기서 X1은 G 또는 D이고; X2는 S 또는 I이고; X3은 T 또는 P임) (서열식별번호: 310)을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QQYX1X2X3PX4T (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K, 또는 C이고; X3은 W, F, 또는 S이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 311), 또는 QQYX1X2X3PX4 (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F, 또는 Y이고; X3은 W, S, 또는 F이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 312)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항체 가변 도메인은 (i) 서열식별번호: 150, 151, 152, 156, 157, 348, 349, 353, 354, 또는 355에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) CDR1; (ii) 서열식별번호: 169, 154, 194, 159, 195, 196, 162, 158, 198, 177, 178, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 207, 208, 172, 203, 204, 350, 351, 356 또는 357에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 155, 161, 197, 205,164, 또는 352, 또는 358에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (i) 서열식별번호: 209, 271, 273, 275, 251, 277, 260, 279, 245, 283, 285, 287, 290, 292, 235, 297, 299, 또는 361에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열식별번호: 221, 359 또는 362에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 211, 225, 272, 274, 276, 278, 280, 281, 282, 284, 286, 288, 289, 291, 293, 294, 229, 296, 298, 300 또는 360에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, (a) 제1 항체 가변 도메인은 (i) 서열식별번호: 331, 332, 333, 401, 407, 또는 408에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열식별번호: 336, 417, 404, 또는 405에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열식별번호: 335 또는 406에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (i) 서열식별번호: 343 또는 441에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열식별번호: 341 또는 436에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342 또는 439에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 및 (b) 제2 항체 가변 도메인은 (i) 서열식별번호: 151, 156, 또는 157에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) CDR1; (ii) 서열식별번호: 158 또는 159에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 155를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 중쇄 VH 영역; 및/또는 (i) 서열식별번호: 209에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열식별번호: 221에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 225에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 항체 가변 도메인 둘 다는 인간 IgG2 (서열식별번호: 493)의 힌지 영역 내 위치 223, 225 및 228, 및 CH3 영역 내 위치 409 또는 368 (EU 넘버링 스킴)에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체는 인간 IgG2의 위치 265에 아미노산 변형을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 중 임의의 것 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이체) 또는 그의 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 중 임의의 것 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이체) 또는 그의 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)를 재조합적으로 생산하는 세포주를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 중 임의의 것 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이체) 또는 그의 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 이들 항체 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 중 임의의 것 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이체) 또는 그의 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)의 유효량을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 단리된 항체 (예를 들어, BCMA) 또는 결합 단편, 이중특이적 항체 (BCMA-CD3 이중특이체), 또는 그의 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)를 제공하는 것, 및 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 항체 또는 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상태를 치료하는 방법 (예를 들어, BCMA를 발현하는 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 /진행 억제; BCMA를 발현하는 악성 세포의 전이 억제; 종양 퇴행 유도)을 제공한다.
종양 항원을 발현하는 악성 세포와 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 항원을 발현하는 악성 세포와 연관된 상태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 상태는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 여포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종성 육아종증, T 세포/조직구-풍부 대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 대 B-세포 림프종 (하지 유형), 고령자의 EBV 양성 미만성 대 B-세포 림프종, 염증과 연관된 미만성 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK-양성 대 B-세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8-연관된 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특색을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종과 전형적 호지킨 림프종 사이의 중간 특색을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 다른 B-세포 관련된 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 B-세포 관련된 암이다. 일부 실시양태에서, 상태는 자가면역 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 또는 류마티스 관절염이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG2Δa, IgG3, 또는 IgG4 하위부류를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 글리코실화 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 1개 이상의 인간 Fc 감마 수용체(들)에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 불변 영역을 포함한다.
도 1a - 도 1d는 본 발명의 선택된 항-BCMA 항체와 인간 BCMA 사이의 상호작용에 대한 피트 곡선을 갖는 이중-참조 센소그램을 도시한다.
도 2는 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 P6E01_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5A2_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5C1_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P4G4-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; 및 P1A11-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101을 포함한 다양한 항-BCMA ADC의 생체내 효능 연구를 도시한다. NNC는 음성 대조군 비-BCMA 항체이다. "LCQ05" 및 "LCQ04"는 각각 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열식별번호: 474 및 475에 상응한다.
도 3은 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-0101, 4) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 및 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101과 접합된 L3.PY/P6E01 항체를 포함한 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 도시한다. NNC는 대조군 비-BCMA 항체이다. "LCQ05" 및 H7c는 각각 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열식별번호: 474 및 서열식별번호: 454에 상응한다.
도 4는 또한 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 및 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101과 접합된 L3.PY/P6E01 항체를 포함하는 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 도시한다. NNC는 대조군 비-BCMA 항체 (항체-N297Q/K222R-AcLys-VC-PABC-0101)이다. "LCQ05" 및 H7c는 각각 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열식별번호: 474 및 서열식별번호: 454에 상응한다.
도 5는 또한 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 도시한다. 항-BCMA 항체 COMBO_Rd4_0.6nM-C29 ("Combo C29 DI)는, 3 mg/kg의 NNC인 대조군 비-BCMA 항체 (항체-N297Q/K222R-AcLys-VC-PABC-0101)와 비교하여, 0.1 mg/kg, 0.38 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1.5 mg/kg 범위의 용량으로 H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-131에 접합된다. H7c는 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열식별번호: 454에 상응한다.
도 6a - 도 6f는 시노몰구스 원숭이에서 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체의 생체내 효능을 도시한다. 이중특이적 항체의 단일 용량 후 B 세포 고갈이 사전연구 카운트의 백분율로서 제시된다.
도 7a - 도 7f는 시노몰구스 원숭이에서 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체의 생체내 효능을 도시한다. CD8+ T 세포 동역학을 이중특이적 항체의 단일 용량 후 추적하였다.
도 8a 및 도 8b는 시노몰구스 원숭이에서 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체의 생체내 효능을 도시한다. T 세포 동역학 및 증식에 대한 1가 CD3 항체의 효과를 분석하였다.
도 9a - 도 9d는 시노몰구스 원숭이에서 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체의 생체내 효능을 도시한다. B 세포 고갈에 대한 항-CD3 아암 친화도의 효과를 분석하였다.
도 10a 및 10b는 선택된 항-CD3 항체가 인간 및 시노몰구스 PBMC에 대한 티미딘 혼입 판독치를 가졌다는 것을 제시한다.
도 11a - 도 11d는 모든 인간 항-EpCam_h2B4 이중특이적 항체가 시험관내 세팅에 대해 세포 사멸 활성을 갖는다는 것을 제시한다.
도 12는 인간 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 단일 용량이 동소 MM1.S 골수종 모델에서 용량-의존성 방식으로 종양 퇴행을 발생시켰다는 것을 제시한다.
도 13은 인간 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 2회 용량이 동소 Molp8 골수종 모델에서 증가된 종양 퇴행을 발생시켰다는 것을 제시한다.
도 14는 단독 또는 다발성 골수종에 대한 표준 관리 (레날리도미드 또는 보르테조밉)와 조합된 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체가 동소 Molp8 종양 모델에서 레날리도미드 및 보르테조밉 조합보다 더 효과적이라는 것을 제시한다.
도 15a - 도 15c는 각각 카르필조밉, 레날리도미드 및 독소루비신이 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체 단독과 비교하여 OPM2 세포에 대한 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 기능에 대해 부정적 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
도 16은 각각의 분자 단독과 비교하여 카르필조밉 및 레날리도미드와 조합되었을 때 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 기능에 대한 상승작용적 효과를 제시한다.
본원에 개시된 발명은 BCMA (예를 들어, 인간 BCMA)에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물 접합체)를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 항체 및 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 항체 및 접합체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체 및 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 본원에 개시된 발명은 CD3 (예를 들어, 인간 CD3)에 특이적으로 결합하는 항체, 뿐만 아니라 CD3 및 종양 항원 (예를 들어, BCMA)에 특이적으로 결합하는 이종이량체 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이적 항체) 또는 그의 접합체 (BCMA 항체-약물 접합체)를 사용하여 대상체에서 악성 BCMA 발현과 연관된 상태, 예컨대 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 하기 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에서 상세하게 설명되어 있다.
정의
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체를 포함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포괄한다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 주어진 항원 (예를 들어, BCMA 또는 CD3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
표적 (예를 들어, BCMA 단백질 또는 CD3 단백질)에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)하는 항체, 항체 접합체 또는 폴리펩티드는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 더 큰 지속기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응 또는 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, BCMA 에피토프 또는 CD3 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 이것이 다른 BCMA 에피토프, 비-BCMA 에피토프, CD3 에피토프 또는 비-CD3 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게 및/또는 더 큰 지속기간으로 이러한 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각 쇄 내의 CDR은 FR에 의해 함께 매우 근접하여 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2종의 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성을 기초로 한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 한 접근법 (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). 본원에 사용된 CDR은 어느 하나의 접근법에 의해 또는 둘 다의 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
가변 도메인의 "CDR"은 카바트, 코티아의 정의, 카바트 및 코티아 둘 다의 복합, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 코티아 등에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989]을 참조한다. CDR 확인을 위한 다른 접근법은 카바트 및 코티아의 절충안인, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 사용하여 유래된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 제시된, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여를 이루는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008]을 참조한다. 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있을지라도, 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법의 조합을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 연장형, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득됨에 따른 항체의 특징을 나타내며, 어떠한 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 사용된 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)인, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 이것은 항체 성능이 추가로 정밀화되고 최적화되도록 포함된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인의 적어도 일부 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 바람직한 것은 WO 99/58572에 기재된 바와 같은 변형된 Fc 영역을 갖는 항체이다. 다른 형태의 인간화 항체는 본래 항체와 관련하여 변경된 1개 이상의 CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 또는 CDR H3)을 갖고, 이는 또한 본래 항체로부터의 1개 이상의 CDR"로부터 유래된" 1개 이상의 CDR로 지칭된다.
본원에 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 본원에 개시된 인간 항체의 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 적어도 1개의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 적어도 1개의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 이러한 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 그러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). 인간 항체는 또한 내인성 유전자좌 대신 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 도입한 동물, 예를 들어 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시킨 마우스를 면역화함으로써 제조할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 또는 cDNA의 단세포 클로닝으로부터 회수될 수 있거나 또는 시험관내 면역화될 수 있음). 예를 들어 문헌 [Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991]; 및 미국 특허 번호 5,750,373을 참조한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 바람직하게는 비교적 짧은 (예를 들어, 10-100개 아미노산) 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다. 또한, 예를 들어 아미노산의 1개 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
"1가 항체"는 분자당 1개의 항원 결합 부위를 포함한다 (예를 들어, IgG 또는 Fab). 일부 경우에, 1가 항체는 1개 초과의 항원 결합 부위를 가질 수 있지만, 결합 부위는 상이한 항원으로부터의 것이다.
"단일특이적 항체"는 2개의 결합 부위가 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하도록 분자당 2개의 동일한 항원 결합 부위를 포함한다 (예를 들어 IgG). 따라서, 이는 1개의 항원 분자에의 결합에 대해 서로 경쟁한다. 천연에서 발견되는 대부분의 항체는 단일특이적이다. 일부 경우에, 단일특이적 항체는 또한 1가 항체일 수 있다 (예를 들어 Fab).
"2가 항체"는 분자당 2개의 항원 결합 부위를 포함한다 (예를 들어, IgG). 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이중-특이적"은 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체의 2개의 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.
"이관능성"은 항체가 2개의 아암에 동일한 항원 결합 부위 (즉, 동일한 아미노산 서열)를 갖지만, 각각의 결합 부위는 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있는 항체이다.
"이종다량체", "이종다량체 복합체" 또는 "이종다량체 폴리펩티드"는 적어도 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자이며, 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열과 적어도 1개의 아미노산 잔기만큼 상이하다. 이종다량체는 제1 및 제2 폴리펩티드에 의해 형성된 "이종이량체"를 포함할 수 있거나, 또는 제1 및 제2 폴리펩티드에 더하여 폴리펩티드가 존재하는 보다 고차의 3차 구조를 형성할 수 있다.
"이종이량체", "이종이량체 단백질", "이종이량체 복합체" 또는 "이종다량체 폴리펩티드"는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 분자이며, 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열과 적어도 1개의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
본원에 사용된 "힌지 영역", "힌지 서열", 및 그의 변경은 예를 들어 문헌 [Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 예시된, 관련 기술분야에 공지된 의미를 포함한다.
본원에 사용된 "이뮤노글로불린-유사 힌지 영역", "이뮤노글로불린-유사 힌지 서열" 및 그의 변경은 이뮤노글로불린-유사 또는 항체-유사 분자 (예를 들어, 이뮤노어드헤신)의 힌지 영역 및 힌지 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린-유사 힌지 영역은 그의 키메라 형태, 예를 들어 키메라 IgG1/2 힌지 영역을 포함하여, 임의의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형으로부터, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 형성되거나 또는 그로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포" 또는 "이펙터 세포는 활성화되어 표적 세포의 생존율에 영향을 미칠 수 있는, 인간 면역계 내 세포의 천연 레퍼토리 내의 세포를 지칭한다. 표적 세포의 생존율은 세포 생존, 증식 및/또는 다른 세포와 상호작용하는 능력을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술의 조합 또는 관련 기술분야에 용이하게 공지된 다른 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 및 Fellouse, F.A., et al., J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007] 참조).
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 쇄의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 추가로 중합 후에, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 자연 발생 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 히드록실 기 중 임의의 것이, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 포함한 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일한 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 포함한, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물이 없는), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 (형태학적 또는 게놈 DNA 상보성에서) 반드시 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 스트레치로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 영역인 CH2 및 CH3을 포함한다.
관련 기술분야에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이고 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995]에서 검토되어 있다. "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; 및 Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (또는 부분)이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소된다는 것을 의미한다. 제2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 대안적인 것도 이러한 경우일 수 있지만, 반드시 필요하지는 않다. 즉, 제2 항체가 제1 항체의 그의 각각의 에피토프에 대한 결합을 억제하지 않으면서, 제1 항체가 제2 항체의 그의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 보다 큰 정도, 또는 보다 적은 정도와 관계없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에의 결합)과 관계없이, 통상의 기술자는 본원에 제공된 교시에 기초하여, 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되고 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 1종의 이펙터 기능을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 적어도 1종의 이펙터 기능은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 그와 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 그와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 보유할 것이다.
용어 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에서 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), Fc 수용체 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 식세포작용, C1q 결합, 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056을 참조한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되며, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이펙터 기능의 예시적인 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통한다.
본원에 사용된 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성은 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예컨대 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 제1 성분 (C1q)이, 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어, 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 "치료"는 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 신생물성 또는 암성 세포의 증식의 감소 (또는 파괴), 신생물성 세포의 전이의 억제, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)의 완화, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)으로부터 발생한 증상의 감소, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)을 앓고 있는 자의 삶의 질 증가, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)의 진행 지연, BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)의 치유, 및/또는 BCMA 연관 질환 (예를 들어, 암 또는 자가면역 질환)을 갖는 환자의 생존 연장.
"개선"은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체를 투여하지 않는 경우와 비교하여 1종 이상의 증상의 감소 또는 향상을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 목적하는 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 경감, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 질환의 발달 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함한 질환의 개시의 지연을 포함한다. 치료적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 다양한 BCMA 연관 질환 또는 상태 (예컨대 다발성 골수종)의 1종 이상의 증상의 발생률 감소 또는 호전, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, 또 다른 의약의 효과의 증진, 및/또는 환자의 BCMA 연관 질환의 진행의 지연과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 문맥에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 유효량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사시키고자 하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 통상 (0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참조).
본원에 사용된 용어 "아실 공여자 글루타민-함유 태그" 또는 "글루타민 태그"는 트랜스글루타미나제 아민 수용자로서 작용하는 1개 이상의 Gln 잔기(들)를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, WO2012059882 및 WO2015015448을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "kon" 또는 "ka"는 항원에 대한 항체의 회합에 대한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수 (kon/ka 및 koff/kd) 및 평형 해리 상수는 전체 항체 (즉, 2가) 및 단량체 BCMA 단백질을 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 용어 "koff" 또는 "kd"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한다.
실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 그룹화의 면에서 기재되는 경우에, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군, 뿐만 아니라 상기 군의 개별적인 각각의 구성원, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 1개 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 1개 이상의 명확한 배제를 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
BCMA 항체 및 그의 제조 방법
본 발명은 BCMA, 예를 들어 인간 BCMA (예를 들어, 서열식별번호: 353 또는 수탁 번호: Q02223-2)에 결합하고, 하기 특징 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 항체를 제공한다: (a) 대상체에서 BCMA를 발현하는 악성 세포와 관련된 상태 (예를 들어, B-세포 관련된 암 예컨대 다발성 골수종)의 1종 이상의 증상을 치료, 예방, 개선함; (b) 대상체 (BCMA를 발현하는 악성 종양을 가짐)에서 종양 성장 또는 진행을 억제함; (c) 대상체 (BCMA를 발현하는 1개 이상의 악성 세포를 가짐)에서 BCMA를 발현하는 암 (악성) 세포의 전이를 억제함; (f) BCMA를 발현하는 종양의 퇴행 (예를 들어, 장기간 퇴행)을 유도함; (d) BCMA를 발현하는 악성 세포에서 세포독성 활성을 발휘함; 및 (e) BCMA와 아직 확인되지 않은 인자의 상호작용을 차단함.
한 측면에서, B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 (a) (i) 서열 SYX1MX2 (여기서 X1은 A 또는 P이고; X2는 T, N, 또는 S임) (서열식별번호: 301), GFTFX1SY (여기서 X1은 G 또는 S임) (서열식별번호: 302), 또는 GFTFX1SYX2MX3 (여기서 X1은 G 또는 S이고, X2는 A 또는 P이고; X3은 T, N, 또는 S임) (서열식별번호: 303)을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG (여기서 X1은 I, V, T, H, L, A, 또는 C이고; X2는 S, D, G, T, I, L, F, M, 또는 V이고; X3은 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X4는 S, Q, T, A, F, 또는 W이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, W, 또는 F이고; X7은 S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, 또는 C이고; X8은 F, Y, P, W, H, 또는 G이고; X9는 V, R, 또는 L이고; X10은 G 또는 T임) (서열식별번호: 305), 또는 X1X2X3X4X5X6 (여기서 X1은 S, V, I, D, G, T, L, F, 또는 M이고; X2는 G, Y, L, H, D, A, S, 또는 M이고; X3은 S, G, F, 또는 W이고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G 또는 T이고; X6은 N, S, P, Y, 또는 W임) (서열식별번호: 306)을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 VSPIX1X2X3X4 (여기서 X1은 A 또는 Y이고; X2는 A 또는 S이고; X3은 G, Q, L, P, 또는 E임) (서열식별번호: 307), 또는 YWPMX1X2 (여기서 X1은 D, S, T, 또는 A이고; X2는 I, S, L, P, 또는 D임) (서열식별번호: 308)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 (i) 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (여기서 X1은 R, G, W, A, 또는 C이고; X2는 A, P, G, L, C, 또는 S이고; X3은 S, G, 또는 R이고; X4는 Q, C, E, V, 또는 I이고; X5는 S, P, G, A, R, 또는 D이고; X6은 V, G, I, 또는 L이고; X7은 S, E, D, P, 또는 G이고; X8은 S, P, F, A, M, E, V, N, D, 또는 Y이고; X9는 I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, R, 또는 F이고; X10은 Y 또는 F이고; X11은 L, W, 또는 P이고; X12는 A, S, 또는 G임) (서열식별번호: 309)를 포함하는 경쇄 가변 (VL) CDR1; (ii) 서열 X1ASX2RAX3 (여기서 X1은 G 또는 D이고; X2는 S 또는 I이고; X3은 T 또는 P임) (서열식별번호: 310)을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QQYX1X2X3PX4T (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K, 또는 C이고; X3은 W, F, 또는 S이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 311), 또는 QQYX1X2X3PX4 (여기서 X1은 G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K, 또는 Y이고; X2는 S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F, 또는 Y이고; X3은 W, S, 또는 F이고; X4는 L 또는 I임) (서열식별번호: 312)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, BCMA에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는: 서열식별번호: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313, 314, 363, 또는 365에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315, 316, 또는 364에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 1에 열거된 바와 같은 부분적 경쇄 서열 중 어느 1개 및/또는 표 1에 열거된 바와 같은 부분적 중쇄 서열 중 어느 1개를 갖는 항체가 제공된다.
표 1
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표 1에서, 밑줄표시된 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고 볼드체는 코티아에 따른 것이며, 단 하기 중쇄 CDR2 서열은 코티아 CDR 서열이 밑줄표시되고 카바트 CDR 서열은 볼드체이다: P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09, A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27, C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, 및 COMBO_Rd4_0.6nM_C11.
본 발명은 또한 BCMA에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다 (코티아, 카바트 CDR, 및 CDR 접촉 영역 포함). CDR 영역의 결정은 충분히 관련 기술분야의 기술범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 및 코티아 CDR의 조합 ("조합된 CR" 또는 "확장된 CDR"로도 불림)일 수 있다는 것이 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다시 말해서, 1개 초과의 CDR이 존재하는 실시양태에서, CDR은 카바트, 코티아, 조합 CDR, 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다. 표 2는 본원에 제공된 CDR 서열의 예를 제공한다.
표 2
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일부 실시양태에서, 본 발명은 BCMA에 결합하고, 하기를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다: P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ, L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA, L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT, L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ, L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09, A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27, C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, P4G4, 또는 P1A11.
일부 실시양태에서, 본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 112에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 38에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열
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을 포함하는 경쇄 및 서열
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을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 2, 32, 42 또는 78에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 6, 16, 43 또는 85에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 CDR 접촉 영역에 기초하여 BCMA 항체에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 접촉 영역은 항체에게 항원에 대한 특이성을 부여하는 항체의 영역이다. 일반적으로, CDR 접촉 영역은 CDR 및 버니어 구역에서의 잔기 위치를 포함하며, 이는 특정 항원에 결합하는 항체에 대해 적절한 루프 구조를 유지시키기 위해 제약된다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007]을 참조한다. CDR 영역의 결정은 충분히 관련 기술분야의 기술범위 내에 있다.
BCMA 예컨대 인간 BCMA (예를 들어, 서열식별번호: 353)에 대한 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체의 결합 친화도 (KD)는 약 0.002 nM 내지 약 6500 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 6500 nm, 6000 nm, 5986 nm, 5567 nm, 5500 nm, 4500 nm, 4000 nm, 3500 nm, 3000 nm, 2500 nm, 2134 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 193 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5.5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 또는 0.002 nM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 6500 nm, 6000 nm, 5500 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 또는 0.5 nM 중 임의의 것 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재되거나 방법에 의해 제조되고, 본원에 기재된 특징을 갖는 항체를 포함하는, 제약 조성물을 포함한 조성물을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 BCMA에 결합하는 1종 이상의 항체, 및/또는 1종 이상의 이들 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 추가로 관련 기술분야에 널리 공지된 적합한 부형제, 예컨대 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이들 항체 중 임의의 것의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체로부터의 1개 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 80, 315, 36, 또는 364에 제시된 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접 아미노산, 및/또는 서열식별번호: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 112, 125, 127, 313, 314, 363, 또는 365에 제시된 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 1 및 2, 1 및 3, 4 및 2, 5 및 2, 6 및 2, 4 및 7, 4 및 8, 4 및 3, 9 및 8, 9 및 3, 10 및 7, 10 및 8, 10 및 3, 11 및 7, 11 및 8, 11 및 3, 12 및 3, 13 및 7, 13 및 8, 14 및 3, 15 및 2, 16 및 2, 17 및 2, 18 및 2, 19 및 2, 20 및 2, 21 및 2, 22 및 2, 23 및 2, 16 및 24, 16 및 25, 16 및 26, 16 및 27, 16 및 28, 16 및 29, 16 및 30, 16 및 31, 16 및 3, 16 및 32, 16 및 2, 18 및 24, 18 및 25, 18 및 26, 18 및 27, 18 및 28, 18 및 29, 18 및 30, 18 및 31, 18 및 3, 18 및 32, 19 및 24, 19 및 25, 19 및 26, 19 및 27, 19 및 28, 19 및 29, 19 및 30, 19 및 31, 19 및 3, 19 및 32, 20 및 24, 20 및 25, 20 및 26, 20 및 27, 20 및 28, 20 및 29, 20 및 30, 20 및 31, 20 및 3, 20 및 32, 21 및 24, 21 및 28, 21 및 31, 21 및 3, 21 및 32, 22 및 24, 22 및 25, 22 및 26, 22 및 27, 22 및 28, 22 및 29, 22 및 30, 22 및 32, 23 및 25, 23 및 26, 23 및 27, 23 및 29, 23 및 30, 23 및 31, 23 및 3, 23 및 32, 34 및 33, 36 및 35, 38 및 37, 40 및 39, 41 및 33, 43 및 42, 45 및 44, 47 및 46, 49 및 48, 51 및 50, 53 및 52, 55 및 54, 57 및 56, 59 및 58, 61 및 60, 63 및 62, 65 및 64, 67 및 66, 69 및 68, 71 및 70, 73 및 72, 75 및 74, 77 및 76, 79 및 78, 317 및 78, 79 및 78, 81 및 78, 82 및 78, 84 및 83, 85 및 78, 86 및 78, 88 및 87, 89 및 78, 90 및 78, 91 및 78, 93 및 92, 94 및 78, 96 및 95, 98 및 97, 38 및 78, 102 및 101, 103 및 78, 105 및 104, 107 및 106, 108 및 78, 109 및 78, 111 및 110, 38 및 112, 113 및 112, 115 및 114, 116 및 76, 117 및 112, 119 및 118, 121 및 120, 123 및 122, 124 및 112, 126 및 125, 128 및 127, 80 및 363, 또는 364 및 365 중에서 선택된 서열 쌍 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDR H3 (VH CDR3) 및/또는 CDR L3 (VL CDR3)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 1개 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그" 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 태그는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ, L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA, L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT, L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ, L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09, A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27, C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, P4G4, 또는 P1A11의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 scFv를 포괄한다. 단일 쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시켜 제조된다 (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). 연결 펩티드의 예는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 대략 3.5 nm을 가교하는 (GGGGS)3 (서열식별번호: 498)이다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되고 있다 (상기 문헌 [Bird et al., 1988]). 링커는 짧은 가요성 폴리펩티드이어야 하고 바람직하게는 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성되어야 한다. 이어서, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 진핵, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)의 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 상용 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디 또는 미니바디가 또한 포괄된다. 디아바디는 2가의, 이중특이적 항체이고, 여기서 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일 쇄 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용할 수 없는 링커를 사용하여 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 하고, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994] 참조). 미니바디는 이뮤노글로불린 분자의 힌지 영역 및 CH3 도메인에 융합된 천연 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, US5,837,821을 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 항체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열식별번호: 486 및 서열식별번호: 485에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
COMBO_Rd4_0.6nM_C29 중쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00069
COMBO_Rd4_0.6nM_C29 경쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00070
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열식별번호: 488 및 서열식별번호: 487에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
L3.PY/H3TAQ 중쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00071
L3.PY/H3TAQ 중쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00072
또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열식별번호: 490 및 서열식별번호: 489에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
A02_Rd4_0.6nM_C01 중쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00073
A02_Rd4_0.6nM_C01 경쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00074
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열식별번호: 492 및 서열식별번호: 491에 제시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
A02_Rd4_0.6nM_C16 중쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00075
A02_Rd4_0.6nM_C16 경쇄 가변 영역
Figure 112020046425759-pat00076
발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여는 본원에 추가로 기재된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 DNA 분자에 1-대-1 방식으로 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일한 경우에 "동일"하다고 언급된다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개의 인접 위치의 절편을 지칭하고, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어 (디엔에이스타, 인크.(DNASTAR, Inc.), 위스콘신주 매디슨)의 레이저진 스위트 내의 메갈라인 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 스킴을 구현한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 통상적으로 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 그의 부분 또는 상보체에 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세척하고; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화한 후; 0.1 % SDS를 함유하는 각각의 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 50℃에서 사용하거나, (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드 (pH 6.5)를 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트과 함께 42℃에서 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 세척하면서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 42℃에서, 및 50% 포름아미드를 55℃에서 사용하고, 이어서 55℃에서 0.1 x SSC 함유 EDTA로 이루어진 고-엄격도 세척을 행하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공되는 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-정합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 세포가 형질전환된다. 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 의도되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트 (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNAs, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 상업적 판매업체, 예컨대 바이오라드(BioRad), 스트라테진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해서는 또한 통상적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 필요하다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염원 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특색에 의존할 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과다-발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 목적에 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한 PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물 (예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모 (예컨대, 에스. 세레비지아에(S. cerevisae), 에스. 폼베(S. pombe); 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내에 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질이 존재하는 경우에, 그보다 약 5배 더 높은 수준, 보다 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. BCMA 또는 BCMA 도메인 (예를 들어, 도메인 1-4)에 대한 특이적 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포가 확인될 수 있다.
본 발명의 대표적인 물질은 2015년 4월 15일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁하였다. ATCC 수탁 번호 PTA-122094를 갖는 벡터는 인간화 BCMA 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 수탁 번호 PTA-122093을 갖는 벡터는 인간화 BCMA 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여 시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개 시에, 이중 빠른 시점에, 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양시에 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 이용가능성은 그의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 해석되지 않는다.
BCMA 항체 접합체
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 접합체 (또는 면역접합체)를 제공하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 표적화된 면역요법 (예를 들어, 항체-약물 접합체)을 위한 작용제 (예를 들어, 세포독성제)에 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 예를 들어, 세포독성제는 종양 (예를 들어, BCMA 발현 종양)에 대한 세포독성제 모이어티의 표적화된 국부 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 연결 또는 접합될 수 있다.
세포독성제 또는 다른 치료제를 항체에 접합시키는 방법은 다양한 공개물에 기재되어 있다. 예를 들어, 접합 반응이 발생하도록 쇄간 디술피드 결합을 환원시킴으로써 활성화된 시스테인 술프히드릴 기를 통해 또는 리신 측쇄 아민을 통해 항체에서 화학적 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005, 및 Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004]을 참조한다. 규정된 화학량론을 갖는 특정 약물 접합을 위해 항체의 특정 부위에서 조작된 반응성 시스테인 잔기가 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008]을 참조한다. 트랜스글루타미나제 및 아민 (예를 들어, 반응성 아민을 포함하거나 또는 이에 부착된 세포독성제)의 존재 하에 폴리펩티드 조작함으로써 반응성으로 만든 (즉, 아실 공여자로서 공유 결합을 형성할 수 있음) 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 내인성 글루타민을 사용한 접합이 또한 국제 출원 WO2012/059882 및 WO2015015448에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위 (예를 들어, 카르복실 말단, 아미노 말단, 또는 BCMA 항체 내의 또 다른 부위)에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그는 아미노산 글루타민 (Q) 또는 아미노산 서열 LQG, LLQGG (서열식별번호: 318), LLQG (서열식별번호: 454), LSLSQG (서열식별번호: 455), GGGLLQGG (서열식별번호: 456), GLLQG (서열식별번호: 457), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 458), GLLQGGG (서열식별번호: 459), GLLQGG (서열식별번호: 460), GLLQ (서열식별번호: 461), LLQLLQGA (서열식별번호: 462), LLQGA (서열식별번호: 463), LLQYQGA (서열식별번호: 464), LLQGSG (서열식별번호: 465), LLQYQG (서열식별번호: 466), LLQLLQG (서열식별번호: 467), SLLQG (서열식별번호: 468), LLQLQ (서열식별번호: 469), LLQLLQ (서열식별번호: 470), LLQGR (서열식별번호: 471), LLQGPP (서열식별번호: 472), LLQGPA (서열식별번호: 473), GGLLQGPP (서열식별번호: 474), GGLLQGA (서열식별번호: 475), LLQGPGK (서열식별번호: 476), LLQGPG (서열식별번호: 477), LLQGP (서열식별번호: 478), LLQP (서열식별번호: 479), LLQPGK (서열식별번호: 480), LLQAPGK (서열식별번호: 481), LLQGAPG (서열식별번호: 482), LLQGAP (서열식별번호: 483), 및 LLQLQG (서열식별번호: 484)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하며, 여기서 태그는 BCMA 항체의 경쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 GGLLQGPP (서열식별번호: 474) 또는 GGLLQGA (서열식별번호: 475)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하며, 여기서 태그는 BCMA 항체의 중쇄 내 잔기 T135 다음에서 조작된 아미노산 서열 LLQG (서열식별번호: 454)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하고, 여기서 태그는 BCMA 항체의 중쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 LLQGA (서열식별번호: 463) 또는 LLQGPP (서열식별번호: 472)를 포함하고, 여기서 중쇄 카르복실 말단에서 리신 잔기는 결실된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체의 위치 297 (EU 넘버링 스킴)에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 아스파라긴 (N)는 BCMA 항체의 위치 297에서 글루타민 (Q) 또는 알라닌 (A)으로 치환될 수 있다.
또한, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222, 340, 또는 370 (EU 넘버링 스킴)에서 아미노산 변형을 포함하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 그의 임의의 조합이다. 따라서, 일부 실시양태에서, BCMA 항체의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단, 또 다른 중쇄 내 잔기 T135, 또는 또 다른 부위)에 접합된 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, Q, LQG, LLQGG (서열식별번호: 318), LLQG (서열식별번호: 454), LSLSQG (서열식별번호: 455), GGGLLQGG (서열식별번호: 456), GLLQG (서열식별번호: 457), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 458), GLLQGGG (서열식별번호: 459), GLLQGG (서열식별번호: 460), GLLQ (서열식별번호: 461), LLQLLQGA (서열식별번호: 462), LLQGA (서열식별번호: 463), LLQYQGA (서열식별번호: 464), LLQGSG (서열식별번호: 465), LLQYQG (서열식별번호: 466), LLQLLQG (서열식별번호: 467), SLLQG (서열식별번호: 468), LLQLQ (서열식별번호: 469), LLQLLQ (서열식별번호: 470), LLQGR (서열식별번호: 471), LLQGPP (서열식별번호: 472), LLQGPA (서열식별번호: 473), GGLLQGPP (서열식별번호: 474), GGLLQGA (서열식별번호: 475), LLQGPGK (서열식별번호: 476), LLQGPG (서열식별번호: 477), LLQGP (서열식별번호: 478), LLQP (서열식별번호: 479), LLQPGK (서열식별번호: 480), LLQAPGK (서열식별번호: 481), LLQGAPG (서열식별번호: 482), LLQGAP (서열식별번호: 483), 및 LLQLQG (서열식별번호: 484)) 및 항체의 위치 222, 340, 또는 370 (EU 넘버링 스킴)에서 아미노산 변형을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 리신으로부터 아르기닌으로의 치환 (예를 들어, K222R, K340R, 또는 K370R)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체 경쇄의 C-말단에서 조작된 서열 GGLLQGPP (서열식별번호: 474)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체 경쇄의 C-말단에서 조작된 서열 GGLLQGA (서열식별번호: 475)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체 중쇄의 C-말단에서 조작된 서열 LLQGA (서열식별번호: 463)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 중쇄 카르복실 말단에서 리신 잔기는 결실된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체의 중쇄 내 잔기 T135 다음에서 조작된 서열 LLQG (서열식별번호: 454)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 위치 297에서 조작된 글루타민을 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 위치 297에서의 아스파라긴 (N)으로부터 BCMA 항체 내 또 다른 아미노산으로의 아미노산 치환 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체 경쇄의 C-말단에서 조작된 서열 GGLLQGPP (서열식별번호: 474)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그, BCMA 항체의 위치 297에서의 아스파라긴 (N)으로부터 글루타민 (Q)으로의 아미노산 치환, 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 접합체는 BCMA 항체의 중쇄 내 잔기 T135 다음에서 조작된 서열 LLQG (서열식별번호: 454)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그, BCMA 항체의 위치 297에서의 아스파라긴 (N)으로부터 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환, 및 항체의 위치 222 (EU 넘버링 스킴)에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 BCMA 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있는 작용제는 세포독성제, 면역조정제, 영상화제, 치료 단백질, 생체중합체 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포독성제의 예는 안트라시클린, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 콤브레타스타틴, 두오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, 캄프토테신, 튜부리신, 헤미아스텔린, 스플라이세오스타틴, 플라디에놀리드 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
안트라시클린은 박테리아 스트렙토미세스로부터 유래되고, 광범위한 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 유방, 자궁, 난소, 및 폐암을 치료하는데 사용되어 왔다. 예시적인 안트라시클린은 다우노루비신, 독소루비신 (즉, 아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
돌라스타틴 및 그의 펩티드성 유사체 및 유도체, 아우리스타틴은 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 제시된 바 있는 고도로 강력한 항유사분열제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,663,149 및 문헌 [Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D 또는 모노메틸 돌라스타틴 10), MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌), MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-노르에페드린), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB) 및 다른 신규 아우리스타틴 (예컨대 미국 공개 번호 2013/0129753에 기재된 것)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112020046425759-pat00077
일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112020046425759-pat00078
일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0131-OMe (N,2-디메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸L-발린아미드)이다:
Figure 112020046425759-pat00079
다른 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0131 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112020046425759-pat00080
다른 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0121 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112020046425759-pat00081
캄프토테신은 효소 토포이소머라제 I을 억제하는 세포독성 퀴놀린 알칼로이드이다. 캄프토테신 및 그의 유도체의 예는 토포테칸 및 이리노테칸 및 그의 대사물, 예컨대 SN-38을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
콤브레타스타틴은 종양에서 혈관 파괴 특성을 갖는 천연 페놀이다. 예시적인 콤브레타스타틴 및 그의 유도체는 콤브레타스타틴 A-4 (CA-4) 및 옴브라불린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
두오카르마이신 및 CC-1065는 세포독성 효력을 갖는 DNA 알킬화제이다. 문헌 [Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995)]을 참조한다. 예시적인 두오카르마이신 및 CC-1065는 (+)-두오카르마이신 A 및 (+)-두오카르마이신 SA, (+)-CC-1065, 및 하기 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(5-{[(1S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일]카르보닐}티오펜-2-일)카르보닐]-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드:
Figure 112020046425759-pat00082
하기 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(클로로메틸)-6-[(3-{[(1S)-1-(클로로메틸)-8-메틸-5-(포스포노옥시)-1,6-디히드로피롤로[3,2-e]인돌-3(2H)-일]카르보닐}비시클로[1.1.1]펜트-1-일)카르보닐]-1-메틸-3,6,7,8-테트라히드로피롤로[3,2-e]인돌-4-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드:
Figure 112020046425759-pat00083
하기 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(클로로메틸)-6-[(4-{[(1S)-1-(클로로메틸)-8-메틸-5-(포스포노옥시)-1,6-디히드로피롤로[3,2-e]인돌-3(2H)-일]카르보닐}펜타시클로[4.2.0.0~2,5~. 0~3,8~.0~4,7~]옥트-1-일)카르보닐]-1-메틸-3,6,7,8-테트라히드로피롤로[3,2-e]인돌-4-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드
Figure 112020046425759-pat00084
를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 국제 출원 PCT/IB2015/050280에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
에네디인은 9- 및 10-원 고리 또는 접합된 삼중-이중-삼중 결합의 시클릭계의 존재를 특징으로 하는 항종양 박테리아 생성물 부류이다. 예시적인 에네디인은 칼리케아미신, 에스페라미신, 운시알라미신, 디네미신 및 그의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
겔다나마이신은 Hsp90 (열 쇼크 단백질 90)에 결합하고, 항종양 약물로 사용되어 온 벤조퀴논 안사마이신 항생제이다. 예시적인 겔다나마이신은 17-AAG (17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신) 및 17-DMAG (17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
헤미아스텔린 및 그의 유사체 (예를 들어, HTI-286)는 튜불린에 결합하고, 정상적인 미세관 역학을 파괴하며, 화학양론적 양으로 미세관을 탈중합시킨다.
메이탄신 또는 그의 유도체 메이탄시노이드는 튜불린의 중합 억제를 통해 유사분열 동안 미세관 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다. 문헌 [Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975]을 참조한다. 예시적인 메이탄신 및 메이탄시노이드는 메르탄신 (DM1) 및 그의 유도체, 뿐만 아니라 안사미토신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD) 및 인돌리노-벤조디아제핀 이량체 (IGN)는 듀플렉스 DNA에 결합하는, 1개 이상의 이민 관능기 또는 그의 등가물을 함유하는 항-종양제이다. PBD 및 IGN 분자는 천연 생성물 안트라마이신을 기초로 하고, 퓨린-구아닌-퓨린 서열을 선호하는 서열-선택 방식으로 DNA와 상호작용한다. 예시적인 PBD 및 그의 유사체는 SJG-136을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
스플라이세오스타틴 및 플라디에놀리드는 스플라이싱을 억제하고 스플라이세오솜, SF3b와 상호작용하는 항종양 화합물이다. 스플라이세오스타틴의 예는 스플라이세오스타틴 A, FR901464, 및
Figure 112020046425759-pat00085
의 구조를 갖는 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 플라디에놀리드의 예는 플라디에놀리드 B, 플라디에놀리드 D, 또는 E7107을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
탁산은 항튜불린제 또는 유사분열 억제제로서 작용하는 디테르펜이다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀 (예를 들어, 탁솔(TAXOL)®) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
튜부리신은 미세관을 탈중합시키고 유사분열 정지를 유도하는 것으로 제시된 바 있는 믹소박테리아 균주로부터 단리된 천연 생성물이다. 예시적인 튜부리신은 튜부리신 A, 튜부리신 B, 및 튜부리신 D를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
빈카 알킬로이드도 또한 항튜불린제이다. 예시적인 빈카 알킬로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 세포독성제는 MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D), 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드), 0131 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), 0131-OMe (N,2-디메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸L-발린아미드), 0121(2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 작용제는 면역조정제이다. 면역조정제의 예는 강시클로비에르, 에타네르셉트, 타크롤리무스, 시롤리무스, 보클로스포린, 시클로스포린, 라파마이신, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 미코페놀게이트 모페틸, 메토트렉스트레이트, 글루코코르티코이드 및 그의 유사체, 시토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈 인자, 인터류킨 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 및 IL-21), 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-α, -β 및 -γ), "S 1 인자"로 지정된 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 영상화제 (예를 들어, 형광단 또는 킬레이트화제), 예컨대 플루오레세인, 로다민, 란타나이드 인광체 및 그의 유도체 또는 킬레이트화제에 결합된 방사성동위원소이다. 형광단의 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (예를 들어, 5-FITC), 플루오레세인 아미다이트 (FAM) (예를 들어, 5-FAM), 에오신, 카르복시플루오레세인, 에리트로신, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® (예를 들어, 알렉사 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 또는 750), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA) (예를 들어, 5,-TAMRA), 테트라메틸로다민 (TMR), 및 술포로다민 (SR) (예를 들어, SR101)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 킬레이트화제의 예는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 (NOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산 (데페록사민), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 및 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산) (BAPTA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
형광단의 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (예를 들어, 5-FITC), 플루오레세인 아미다이트 (FAM) (예를 들어, 5-FAM), 에오신, 카르복시플루오레세인, 에리트로신, 알렉사 플루오르® (예를 들어, 알렉사 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 또는 750), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA) (예를 들어, 5,-TAMRA), 테트라메틸로다민 (TMR), 및 술포로다민 (SR) (예를 들어, SR101)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 치료 또는 진단 방사성동위원소 또는 다른 표지 (예를 들어, PET 또는 SPECT 표지)는 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 항원 결합 단편에의 접합을 위한 작용제에 혼입될 수 있다. 방사성동위원소 또는 다른 표지의 예는 3H, 11C, 13N, 14C, 15N, 15O, 35S, 18F, 32P, 33P, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Se, 76Br, 77Br, 86Y, 89Zr, 90Y, 94Tc, 95Ru, 97Ru, 99Tc, 103Ru, 105Rh, 105Ru, 107Hg, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 121Te, 122Te, 123I, 124I, 125I, 125Te, 126I, 131I, 131In, 133I, 142Pr, 143Pr, 153Pb, 153Sm, 161Tb, 165Tm, 166Dy, 166H, 167Tm, 168Tm, 169Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 197Pt, 198Au, 199Au, 201Tl, 203Hg, 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 224Ac, 또는 225Ac를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 독소, 호르몬, 효소, 및 성장 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 단백질이다.
독소 단백질 (또는 폴리펩티드)의 예는 디프테리아 (예를 들어, 디프테리아 A 쇄), 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 및 내독소, 리신 (예를 들어, 리신 A 쇄), 아브린 (예를 들어, 아브린 A 쇄), 모데신 (예를 들어, 모데신 A 쇄), 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 스타필로코쿠스 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테센, 억제제 시스틴 knot (ICK) 펩티드 (예를 들어, 세라토톡신), 및 코노톡신 (예를 들어, KIIIA 또는 SmIIIa)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 생체적합성 중합체이다. 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 혈청 반감기 및 생물활성을 증가시키고/거나 생체내 반감기를 연장하기 위해 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 생체적합성 중합체의 예는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 그의 유도체, 및 쯔비터이온-함유 생체적합성 중합체 (예를 들어, 포스포릴콜린 함유 중합체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 접합체는 식: 항체-(아실 공여자 글루타민-함유 태그)-(링커)-(세포독성제)을 포함하고, 여기서 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 또는 항원 결합 단편의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단, 항체 중쇄 내 잔기 T135 다음, 또는 또 다른 부위)에서 조작되고, 여기서 태그는 링커 (예를 들어, 1개 이상의 반응성 아민 (예를 들어, 1급 아민 NH2)을 함유하는 링커)에 접합되고, 여기서 링커는 세포독성제 (예를 들어, MMAD 또는 다른 아우리스타틴 예컨대 0101, 0131 또는 3377)에 접합된다.
1개 이상의 반응성 아민을 함유하는 링커의 예는 Ac-Lys-Gly (아세틸-리신-글리신), 아미노카프로산, Ac-Lys-β-Ala (아세틸-리신-β-알라닌), 아미노-PEG2 (폴리에틸렌 글리콜)-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2 (또는 아미노 PEG6-프로피오닐), Ac-Lys-Val-Cit-PABC (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, 푸트레신 또는 Ac-Lys-푸트레신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 접합체는 1) 항체-GGLLQGPP (서열식별번호: 474)- AcLys-VC-PABC-0101; 2) 항체-AcLys-VC-PABC-0101, N297Q 포함; 3) 항체-GGLLQGPP (서열식별번호: 474)-AcLys-VC-PABC-0101, N297Q 포함; 4) 항체-LLQG (서열식별번호: 454)-아미노-PEG6-C2-0131, N297A 포함; 5) 항체-LLQG (서열식별번호: 454)-아미노-PEG6-C2-3377, N297A 포함; 6) 항체-GGLLQGA (서열식별번호: 475)-AcLys-VC-PABC-0101이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 GGLLQGPP (서열식별번호: 474) 또는 GGLLQGA (서열식별번호: 475)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체의 경쇄의 C-말단에서 조작된다. 다른 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, LLQGA (서열식별번호: 463) 또는 LLQGPP (서열식별번호: 472))는 항체의 중쇄의 C-말단에서 조작되며, 여기서 C-말단에서 리신 잔기는 결실된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 LLQG (서열식별번호: 454)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 중쇄 내 잔기 T135 다음에서 조작되거나, 또는 항체 중쇄 내 아미노산 잔기 E294-N297을 대체한다. 항체의 예는 P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ, L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA, L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT, L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ, L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09, A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27, C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, P4G4, 또는 P1A11을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 변경에서, 접합체는 추가로 위치 222에서 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 접합체는 1) 항체-GGLLQGPP (서열식별번호: 474)- AcLys-VC-PABC-0101, K222R 포함; 2) 항체-AcLys-VC-PABC-0101, N297Q 및 K222R 포함; 3) 항체- GGLLQGPP (서열식별번호: 474)-AcLys-VC-PABC-0101, N297Q 및 K222R 포함; 4) 항체-LLQG (서열식별번호: 454)-아미노-PEG6-C2-0131, N297A 및 K222R 포함; 5) 항체-LLQG (서열식별번호: 454)-아미노-PEG6-C2-3377, N297A 및 K222R 포함; 및 6) 항체-GGLLQGA (서열식별번호: 475)-AcLys-VC-PABC-0101, K222R 포함이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 GGLLQGPP (서열식별번호: 474) 또는 GGLLQGA (서열식별번호: 475)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체의 경쇄의 C-말단에서 조작된다. 다른 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, LLQGA (서열식별번호: 473) 또는 LLQGPP (서열식별번호: 472))는 항체의 중쇄의 C-말단에서 조작되며, 여기서 C-말단에서 리신 잔기는 결실된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 LLQG (서열식별번호: 454)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 중쇄 내 잔기 T135 다음에서 조작되거나, 또는 항체 중쇄 내 아미노산 잔기 E294-N297을 대체한다. 항체의 예는 P6E01/P6E01, P6E01/H3.AQ, L1.LGF/L3.KW/P6E01; L1.LGF/L3.NY/P6E01, L1.GDF/L3.NY/P6E01, L1.LGF/L3.KW/H3.AL, L1.LGF/L3.KW/H3.AP, L1.LGF/L3.KW/H3.AQ, L1.LGF/L3.PY/H3.AP, L1.LGF/L3.PY/H3.AQ, L1.LGF/L3.NY/H3.AL, L1.LGF/L3.NY/H3.AP, L1.LGF/L3.NY/H3.AQ, L1.GDF/L3.KW/H3.AL, L1.GDF/L3.KW/H3.AP, L1.GDF/L3.KW/H3.AQ, L1.GDF/L3.PY/H3.AQ, L1.GDF/L3.NY/H3.AL, L1.GDF/L3.NY/H3.AP, L1.GDF/L3.NY/H3.AQ, L3.KW/P6E01, L3.PY/P6E01, L3.NY/P6E01, L3.PY/L1.PS/P6E01, L3.PY/L1.AH/P6E01, L3.PY/L1.FF/P6E01, L3.PY/L1.PH/P6E01, L3.PY/L3.KY/P6E01, L3.PY/L3.KF/P6E01, L3.PY/H2.QR, L3.PY/H2.DY, L3.PY/H2.YQ, L3.PY/H2.LT, L3.PY/H2.HA, L3.PY/H2.QL, L3.PY/H3.YA, L3.PY/H3.AE, L3.PY/H3.AQ, L3.PY/H3.TAQ, L3.PY/P6E01, L3.PY/L1.PS/H2.QR, L3.PY/L1.PS/H2.DY, L3.PY/L1.PS/H2.YQ, L3.PY/L1.PS/H2.LT, L3.PY/L1.PS/H2.HA, L3.PY/L1.PS/H2.QL, L3.PY/L1.PS/H3.YA, L3.PY/L1.PS/H3.AE, L3.PY/L1.PS/H3.AQ, L3.PY/L1.PS/H3.TAQ, L3.PY/L1.AH/H2.QR, L3.PY/L1.AH/H2.DY, L3.PY/L1.AH/H2.YQ, L3.PY/L1.AH/H2.LT, L3.PY/L1.AH/H2.HA, L3.PY/L1.AH/H2.QL, L3.PY/L1.AH/H3.YA, L3.PY/L1.AH/H3.AE, L3.PY/L1.AH/H3.AQ, L3.PY/L1.AH/H3.TAQ, L3.PY/L1.FF/H2.QR, L3.PY/L1.FF/H2.DY, L3.PY/L1.FF/H2.YQ, L3.PY/L1.FF/H2.LT, L3.PY/L1.FF/H2.HA, L3.PY/L1.FF/H2.QL, L3.PY/L1.FF/H3.YA, L3.PY/L1.FF/H3.AE, L3.PY/L1.FF/H3.AQ, L3.PY/L1.FF/H3.TAQ, L3.PY/L1.PH/H2.QR, L3.PY/L1.PH/H2.HA, L3.PY/L1.PH/H3.AE, L3.PY/L1.PH/H3.AQ, L3.PY/L1.PH/H3.TAQ, L3.PY/L3.KY/H2.QR, L3.PY/L3.KY/H2.DY, L3.PY/L3.KY/H2.YQ, L3.PY/L3.KY/H2.LT, L3.PY/L3.KY/H2.HA, L3.PY/L3.KY/H2.QL, L3.PY/L3.KY/H3.YA, L3.PY/L3.KY/H3.TAQ, L3.PY/L3.KF/H2.DY, L3.PY/L3.KF/H2.YQ, L3.PY/L3.KF/H2.LT, L3.PY/L3.KF/H2.QL, L3.PY/L3.KF/H3.YA, L3.PY/L3.KF/H3.AE, L3.PY/L3.KF/H3.AQ, L3.PY/L3.KF/H3.TAQ, P5A2_VHVL, A02_Rd4_0.6nM_C06, A02_Rd4_0.6nM_C09, A02_Rd4_6nM_C16, A02_Rd4_6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C26, A02_Rd4_6nM_C25, A02_Rd4_6nM_C22, A02_Rd4_6nM_C19, A02_Rd4_0.6nM_C03, A02_Rd4_6nM_C07, A02_Rd4_6nM_C23, A02_Rd4_0.6nM_C18, A02_Rd4_6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C05, A02_Rd4_0.6nM_C10, A02_Rd4_6nM_C04, A02_Rd4_0.6nM_C26, A02_Rd4_0.6nM_C13, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C08, P5C1_VHVL, C01_Rd4_6nM_C24, C01_Rd4_6nM_C26, C01_Rd4_6nM_C10, C01_Rd4_0.6nM_C27, C01_Rd4_6nM_C20, C01_Rd4_6nM_C12, C01_Rd4_0.6nM_C16, C01_Rd4_0.6nM_C09, C01_Rd4_6nM_C09, C01_Rd4_0.6nM_C03, C01_Rd4_0.6nM_C06, C01_Rd4_6nM_C04, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, COMBO_Rd4_6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C10, COMBO_Rd4_0.6nM_C04, COMBO_Rd4_6nM_C25, COMBO_Rd4_0.6nM_C21, COMBO_Rd4_6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C20, COMBO_Rd4_6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C08, COMBO_Rd4_0.6nM_C19, COMBO_Rd4_0.6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C23, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, COMBO_Rd4_0.6nM_C09, COMBO_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C30, COMBO_Rd4_0.6nM_C14, COMBO_Rd4_6nM_C07, COMBO_Rd4_6nM_C02, COMBO_Rd4_0.6nM_C05, COMBO_Rd4_0.6nM_C17, COMBO_Rd4_6nM_C22, COMBO_Rd4_0.6nM_C11, COMBO_Rd4_0.6nM_C29, 또는 P4G4, 또는 P1A11을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CD3 항체 및 그의 제조 방법
본 발명은 CD3 (예를 들어, 인간 CD3)에 결합하는 항체 (서열식별번호: 502; 또는 수탁 번호: NM_000733.3)를 추가로 제공한다.
한 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체는 서열식별번호: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 또는 400에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3; 및/또는 서열식별번호: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 또는 399에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 VH 영역은 (i) 서열식별번호: 331, 332, 333, 401, 402, 403, 407, 408, 415, 416, 418, 419, 420, 424, 425, 426, 446, 447, 또는 448에 제시된 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열식별번호: 334, 336, 337, 338, 339, 404, 405, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 427, 428, 449, 또는 450에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열식별번호: 335, 406, 423, 429, 또는 451에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고/거나; 경쇄 가변 (VL) 영역은 (i) 서열식별번호: 340, 343, 430, 431, 435, 또는 440, 441에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열식별번호: 341, 433, 452, 또는 436에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342, 432, 434, 437, 438, 439, 446, 또는 453에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 3에 열거된 바와 같은 부분적 경쇄 서열 중 어느 1개 및/또는 표 3에 열거된 바와 같은 부분적 중쇄 서열 중 어느 1개를 갖는 항체가 제공된다.
표 3
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표 3에서, 밑줄표시된 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고 볼드체는 코티아에 따른 것이다.
본 발명은 또한 CD3에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다 (코티아, 카바트 CDR, 및 CDR 접촉 영역 포함). CDR 영역의 결정은 충분히 관련 기술분야의 기술범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 및 코티아 CDR의 조합 ("조합된 CR" 또는 "확장된 CDR"로도 불림)일 수 있다는 것이 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다시 말해서, 1개 초과의 CDR이 존재하는 실시양태에서, CDR은 카바트, 코티아, 조합 CDR, 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다. 표 4는 본원에 제공된 CDR 서열의 예를 제공한다.
표 4
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본 발명은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 h2B4, h2B4-VH-wt VL_TK, h2B4-VH-hnps VL_TK, h2B4-VH-yaes VL_TK, h2B4-VH-yads VL_TK, h2B4-VH-yaps VL_TK, h2B4-VH-hnps VL_TK-S55Y, h2B4-VH-hnps VL_TK-S105Q, h2B4-vH-hnps VL_TK-S55Y/S105Q, 2B4, h2B4-11, 1C10, 1A4, 7A3, 25A8, 16G7, h25A8-B5, h25A8-B8, h25A8-B12, h25A8-B13, h25A8-C5, h25A8-C8, h25A8-D13, h25A8-E13, h25A8-F13, 또는 h25A8-G13의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체로부터의 1개 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 445, 352, 355, 443, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 또는 399에 제시된 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 인접 아미노산, 및/또는 서열식별번호: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 354, 356, 444, 442, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 또는 400에 제시된 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 319 및 320, 321 및 322, 323 및 324, 325 및 326, 327 및 328, 329 및 330, 344 및 345, 346 및 347, 348 및 349, 350 및 351, 445 및 444, 352 및 354, 355 및 356, 443 및 442, 377 및 378, 379 및 380, 381 및 382, 383 및 384, 385 및 386, 387 및 388, 389 및 390, 391 및 392, 393 및 394, 395 및 396, 397 및 398, 또는 399 및 400 중에서 선택된 서열 쌍 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDR H3 (VH CDR3) 및/또는 CDR L3 (VL CDR3)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 1개 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그" 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 태그는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
융합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 사용하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것에 의해 제조되지만, 예를 들어 화학적 합성을 포함한 관련 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명의 CD3 항체의 대표적인 물질은 2015년 9월 11일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁하였다. ATCC 수탁 번호 PTA-122513를 갖는 벡터는 인간화 CD3 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 수탁 번호 PTA-122512을 갖는 벡터는 인간화 CD3 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여 시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개 시에, 이중 빠른 시점에, 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양시에 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 이용가능성은 그의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 해석되지 않는다.
이중특이적 항체 및 제조 방법
적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체인 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하였고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).
이중특이적 항체를 제조하기 위한 하나의 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은, 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역과 함께 이루어진다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 1개 내에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동형질감염된다. 이는, 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 동등하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서, 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 동등한 비에서의 발현이 고수율을 발생시키거나 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 있는 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다. 이러한 접근법은 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암의 제1 힌지 영역에서의 아미노산 변형으로 구성되고, 제1 힌지 영역의 치환/대체된 아미노산은 또 다른 아암에서의 제2 힌지 영역의 상응하는 아미노산에 대해 반대 전하를 갖는다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 목적하는 이종다량체 또는 이종이량체 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 형성은 제1 및 제2 이뮤노글로불린-유사 Fc 영역 사이의 계면 (예를 들어, 힌지 영역 및/또는 CH3 영역)을 변경하거나 조작하는 것에 의해 증진된다. 이러한 접근법에서, 이중특이적 항체는 CH3 영역으로 구성될 수 있으며, 여기서 CH3 영역은 CH3 계면을 형성하기 위해 함께 상호작용하는 제1 CH3 폴리펩티드 및 제2 CH3 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 CH3 계면 내의 1개 이상의 아미노산은 동종이량체 형성을 불안정하게 하고, 동종이량체 형성에 대해 정전기적으로 바람직하지 않다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에서 에피토프 (예를 들어, BCMA)에 대해 지시된 항체에 대해 조작된 글루타민-함유 펩티드 태그 및 트랜스글루타미나제의 존재 하에 또 다른 아암에서 제2 에피토프에 대해 지시된 제2 항체에 대해 조작된 또 다른 펩티드 태그 (예를 들어, Lys-함유 펩티드 태그 또는 반응성 내인성 Lys)를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882)에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체)은 전장 인간 항체를 포함하며, 여기서 이종이량체 단백질의 제1 항체 가변 도메인은 인간 면역 이펙터 세포 상에 위치한 이펙터 항원에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 동원할 수 있고, 여기서 이종이량체 단백질의 제2 항체 가변 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질은 면역학적으로 불활성인 Fc 영역을 포함한다.
인간 면역 이펙터 세포는 관련 기술분야에 공지된 다양한 면역 이펙터 세포 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), B 세포, 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 림프성 세포 계열의 구성원일 수 있다. 면역 이펙터 세포는 또한, 예를 들어 비제한적으로, 단핵구, 호중구성 과립구, 수지상 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 골수계의 구성원일 수 있다. 이러한 면역 이펙터 세포는 이펙터 항원의 결합에 의한 활성화 시, 표적 세포에 대한 세포독성 또는 아폽토시스 효과 또는 다른 목적하는 효과를 가질 수 있다.
이펙터 항원은 인간 면역 이펙터 세포 상에서 발현되는 항원 (예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드)이다. 이종이량체 단백질 (예를 들어, 이종이량체 항체 또는 이중특이적 항체)에 의해 결합될 수 있는 이펙터 항원의 예는 인간 CD3 (또는 CD3 (분화 클러스터) 복합체), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 및 CD89를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표적 세포는 인간에 대해 천연이거나 외래인 세포일 수 있다. 천연 표적 세포에서, 세포는 악성 세포로 형질전환되거나 또는 병리학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 바이러스, 플라스모디움 또는 박테리아에 의해 감염된 천연 표적 세포). 외래 표적 세포에서, 세포는 침입 병원체, 예컨대 박테리아, 플라스모디움, 또는 바이러스이다.
표적 항원은 질환 상태 (예를 들어, 염증성 질환, 증식성 질환 (예를 들어, 암), 면역 장애, 신경계 질환, 신경변성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환 (예를 들어, 바이러스 감염 또는 기생충 감염), 알레르기 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환)의 표적 세포 상에서 발현된다. 표적 항원은 이펙터 항원이 아니다. 표적 항원의 예는 BCMA, EpCAM (상피 세포 부착 분자), CCR5 (케모카인 수용체 유형 5), CD19, HER (인간 표피 성장 인자 수용체)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (표피 성장 인자 수용체), PSMA, CEA, MUC-1 (뮤신), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, 루이스-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보 H, 푸코실 GM1, 폴리 SA, GD2, 카르보안히드라제 IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (소닉 헷지호그), Wue-1, 형질 세포 항원, (막-결합된) IgE, MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린, A33 항원, PSCA (전립선 줄기 세포 항원), Ly-6; 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 마커, CA-125 마커 및 MIS (뮐러 억제 물질) 수용체 유형 II, sTn (시알릴화 Tn 항원; 태그-72), FAP (섬유모세포 활성화 항원), 엔도시알린, EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체)은 전장 인간 항체를 포함하며, 여기서 이종이량체 단백질의 제1 항체 가변 도메인은 인간 면역 이펙터 세포 상에 위치한 이펙터 항원 (예를 들어, CD3 항원)에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 동원할 수 있고, 여기서 이종이량체 단백질의 제2 항체 가변 도메인은 표적 항원 (예를 들어, CD20 항원 또는 EpCAM)에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 이종이량체 단백질의 제1 및 제2 항체 가변 도메인은 인간 IgG2 (서열식별번호: 493)의 힌지 영역 내 위치 223, 225 및 228 (예를 들어, (C223E 또는 C223R), (E225R), 및 (P228E 또는 P228R)) 및 CH3 영역 내 위치 409 또는 368 (예를 들어, K409R 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에서 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질의 제1 및 제2 항체 가변 도메인은 인간 IgG1 (서열식별번호: 494)의 힌지 영역 내 위치 221 및 228 (예를 들어, (D221R 또는 D221E) 및 (P228R 또는 P228E)) 및 CH3 영역 내 위치 409 또는 368 (예를 들어, K409R 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에서 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 단백질의 제1 및 제2 항체 가변 도메인은 인간 IgG4 (서열식별번호: 495)의 힌지 영역 내 위치 228 (예를 들어, (P228E 또는 P228R)) 및 CH3 영역 내 위치 409 또는 368 (예를 들어, R409 또는 L368E (EU 넘버링 스킴))에서 아미노산 변형을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이종이량체 단백질의 제1 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 320, 322, 324, 326, 328, 330, 345, 347, 349, 351, 444, 354, 356, 378, 442, 380, 382, 384 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 또는 400에 제시된 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 319, 321, 323, 325, 327, 329, 344, 346, 348, 350, 352, 355, 377, 443, 445, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 또는 399에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고, 이종이량체 단백질의 제2 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 2, 3, 7, 8, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 83, 87, 92, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 110, 112, 114, 118, 120, 122, 125, 127, 313, 314, 363, 또는 365에 제시된 VH 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 1, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 317, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 100, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 126, 128, 315, 또는 364에 제시된 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 324 또는 388에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 323 또는 387에 제시된 경쇄 가변 (VL) 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하고; 및 제2 항체 가변 도메인은 서열식별번호: 112에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열식별번호: 38에 제시된 경쇄 가변 (VL) 서열의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 도메인 항체), 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형된 항체를 포함한 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 이뮤노글로불린 분자를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 또는 CD3 항체는 모노클로날 항체이다. 예를 들어, BCMA 또는 CD3 항체는 인간화 모노클로날 항체 또는 키메라 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 예를 들어 비제한적으로, 면역 반응을 유발하는 증가된 잠재력을 갖는 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 불변 영역은 Fc 감마 수용체, 예컨대 예를 들어 FcγRI, FcγRIIA 또는 FcγIII에 대한 증가된 친화도를 갖도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 불활성인, 즉 면역 반응을 유발하는 감소된 잠재력을 갖는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 98099518에 기재된 바와 같이 변형된다. Fc는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4일 수 있다. Fc는 A330P331에서 S330S331로의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG2 (IgG2Δa)일 수 있고, 여기서 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열에 관하여 넘버링된다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999]. 일부 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이 (Armour et al., Molecular Immunology 40 585-593, 2003): E233F234L235에서 P233V234A235 (IgG4Δc)를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함하며, 여기서 넘버링은 야생형 IgG4에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 인간 IgG4 E233F234L235에서 결실 G236을 갖는 P233V234A235 (IgG4Δb)이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228에서 P228을 함유하는 임의의 인간 IgG4 Fc (IgG4, IgG4Δb 또는 IgG4Δc)이다 (Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002). 또 다른 실시양태에서, Fc는 비-글리코실화된 Fc일 수 있다.
일부 실시양태에서, 불변 영역은 올리고사카라이드 부착 잔기 (예컨대, Asn297) 및/또는 불변 영역 내 글리코실화 인식 서열의 일부인 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 효소적으로 비-글리코실화된다. 불변 영역은 N-연결된 글리코실화에 대해 효소적으로 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 비-글리코실화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 불변 영역은 Fc 감마 수용체 결합을 제거하거나 감소시킨 변형된 불변 영역을 갖는다. 예를 들어, Fc는 돌연변이 D265를 함유하는 인간 IgG2일 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열 (서열식별번호: 493)에 관하여 넘버링된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 불변 영역은 서열식별번호: 496에 제시된 서열을 갖는 변형된 불변 영역을 갖는다:
Figure 112020046425759-pat00099
일부 실시양태에서, 불변 영역은 서열식별번호: 497에 제시된 서열을 갖는 변형된 불변 영역을 갖는다:
Figure 112020046425759-pat00100
BCMA 또는 CD3에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 하나의 방법은 항체의 단일기능적 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것에 의한다. 단일기능적 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체 (예를 들어, IgG)를 파파인으로 절단시키거나 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 항체의 BCMA Fab 단편의 친화도는 HBS-EP 구동 완충제 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)를 사용하여 사전-고정된 스트렙타비딘 센서 칩 (SA) 또는 항-마우스 Fc 또는 항-인간 Fc가 장착된 표면 플라즈몬 공명 (비아코어(Biacore)™3000™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템, 비아코어™, 인크, 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 결정할 수 있다. 비오티닐화 또는 Fc 융합 인간 BCMA를 HBS-EP 완충제에 0.5 μg/mL 미만의 농도로 희석시키고, 가변 접촉 시간을 사용하여 개별 칩 채널을 통해 주입함으로써 2종의 범위의 항원 밀도, 상세한 동역학적 연구의 경우에 50-200 반응 단위 (RU) 또는 스크리닝 검정의 경우에 800-1,000 RU를 달성할 수 있다. 재생 연구는 200회 주입에 걸쳐 칩 상에서 BCMA의 활성을 유지하면서 25% v/v 에탄올 중 25 mM NaOH가 결합된 Fab를 효과적으로 제거하는 것을 나타내었다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물 (0.1-10x 추정 KD의 스패닝 농도)을 100 μL/분으로 1분 동안 주입하고, 최대 2시간의 해리 시간을 허용한다. Fab 단백질의 농도는 공지된 농도 (아미노산 분석에 의해 결정된 바와 같음)의 Fab를 표준물로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정한다. 동역학적 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 비아이밸루에이션 프로그램을 사용하여 데이터를 1:1 랭뮤어 결합 모델에 전반적으로 피팅시킴으로써 동시에 수득한다 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110). 평형 해리 상수 (KD) 값은 koff/kon으로 계산한다. 이러한 프로토콜은 인간 BCMA, 또 다른 포유동물의 BCMA (예컨대 마우스 BCMA, 래트 BCMA 또는 영장류 BCMA) 뿐만 아니라 상이한 형태의 BCMA (예를 들어, 글리코실화된 BCMA)를 포함한 임의의 BCMA에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는데 사용하기에 적합한다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정하지만, 37℃에서도 또한 측정할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 세포주의 생산을 위해, 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케줄은 일반적으로 본원에 추가로 기재된 바와 같은 항체 자극 및 생산을 위한 확립된 통상적인 기술에 따라 유지된다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고/거나 본원에 기재되어 있다.
인간을 포함한 임의의 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포는, 인간을 포함한 포유동물 및 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서 제공되도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 것을 포함한 면역원의 양이 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내로, 및/또는 피내로 접종된다.
하이브리도마는 문헌 [Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975]의 일반적 체세포 혼성화 기술을 사용하거나 또는 문헌 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653, 및 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트, 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)로부터의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 입수가능한 골수종 세포주가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합생성제를 사용하거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프성 세포를 융합시키는 것을 수반한다. 융합 후, 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 선택적 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장되며 비혼성화된 모 세포는 제거된다. 혈청으로 보충되거나 보충되지 않은 본원에 기재된 배지 중 임의의 것이 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 원하는 경우에 하이브리도마는 확장 및 서브클로닝되고, 상청액은 통상적인 면역검정 절차 (예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 BCMA, CD3에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 부분을 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다.
이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 모노클로날 항체는 원하는 경우에, 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 원하지 않는 활성은, 존재하는 경우에, 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 위로 제제를 구동시키고, 면역원으로부터 목적 항체를 용리 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이중기능적 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화하고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 인간 BCMA 또는 CD3, 또는 단편으로 숙주 동물을 면역화하는 것은, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단을 생성할 수 있다.
원하는 경우에, 관심 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열분석할 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 세포 배양물 중에서 재조합 모노클로날 항체를 생산하는 것은 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자를 클로닝하는 것을 통해 수행할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008]; 미국 특허 번호 7,314,622를 참조한다.
대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 항체의 친화도 또는 다른 특징을 개선시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에, 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더욱 거의 유사하도록 조작될 수 있다. BCMA 또는 CD3에 대한 보다 큰 친화도 및 BCMA를 억제하는데 있어서 보다 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
모노클로날 항체를 인간화하는 4개의 일반적 단계가 존재한다. 이들은 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측되는 아미노산 서열 결정 (2) 인간화 항체 설계, 즉 인간화 과정 동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역 결정 (3) 실제 인간화 방법론/기술 및 (4) 형질감염 및 인간화 항체의 발현이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370을 참조한다.
인간 불변 영역에 융합된 설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 그의 회합된 CDR을 갖는 키메라 항체를 포함한, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 다수의 "인간화" 항체 분자가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987, 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987]을 참조한다. 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 영역과의 융합 전 인간 지지 프레임워크 영역 (FR)으로 그라프팅된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988, 및 Jones et al. Nature 321:522-525, 1986]을 참조한다. 또 다른 참고문헌은 재조합적으로 조작된 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 번호 0519596을 참조한다. 이러한 "인간화" 분자는 인간 수용자에서의 그러한 모이어티의 지속시간 및 치료 용도의 유효성을 제한하는 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역학적으로 불활성이도록 (예를 들어, 보체 용해를 촉발하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들어 PCT 공개 번호 PCT/GB99/01441; UK 특허 출원 번호 9809951.8을 참조한다. 또한 사용될 수 있는 항체를 인간화하는 다른 방법이 문헌 [Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991], 및 미국 특허 번호 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861; 및 PCT 공개 번호 WO 01/27160에 개시되어 있다.
상기 논의된 인간화 항체에 관한 일반적 원리는 또한 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하기 위한 맞춤화 항체에 적용가능하다. 또한, 본원에 기재된 항체를 인간화하는 하나 이상의 측면, 예를 들어 CDR 그라프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이는 조합될 수 있다.
한 변형에서, 특정 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 완전 인간 항체를 수득할 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) (캘리포니아주 프리몬트)로부터의 제노마우스(Xenomouse)™ 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터의 HuMAb-마우스® 및 TC 마우스™이다.
한 대안에서, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 항체를 재조합적으로 제조하고 발현시킬 수 있다. 또 다른 대안에서, 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994]을 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990)을 사용하여, 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 발생시킨다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 검토를 위해 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자기-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 돌연변이를 높은 비율로 축적한다 (체성 과다돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고-친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 챌린지 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "쇄 셔플링"으로 공지된 기술을 사용함으로써 이러한 천연 과정을 모방할 수 있다. (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체함으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 기술은 친화도가 pM-nM 범위인 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 어머니"로 또한 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링이 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리에 의해 대체되어, 설치류-인간 키메라가 생성된다. 항원에 기초한 선택은 기능적 항원 결합 부위를 회복시킬 수 있는 인간 가변 영역의 단리를 발생시키고, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 남아있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 과정이 반복되는 경우에, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 번호 WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
항체는, 먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생산 세포를 단리하고, 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 항체를 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 항체를 재조합적으로 발현시키는 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. 및 D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; 및 Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999]을 참조한다. 항체의 유도체, 예를 들어 인간화, 단일 쇄 등의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
면역검정 및 유동 세포측정법 분류 기술 예컨대 형광 활성화 세포 분류 (FACS)가 또한 BCMA, CD3, 또는 관심 종양 항원에 특이적인 항체를 단리하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 널리-공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적상 가용성 또는 불용성일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체 결합에 적합한 다른 항체를 알 것이거나, 또는 상용 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 심근을 표적화하는 모이어티를 포함한다.
통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내에 배치할 수 있고, 이후에 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 대체하거나 (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 대해 공유 연결하는 것에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원의 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
본원에 기재된 바와 같은 관심 항체의 BCMA 또는 종양 항원은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 확인 또는 특징화될 수 있으며, 이에 의해 BCMA 또는 다른 종양 항원 발현 수준의 감소가 검출되고/거나 측정된다. 일부 실시양태에서, BCMA 항체는 BCMA와 후보 작용제를 인큐베이션하고, 결합 및/또는 BCMA 발현 수준의 부수적 감소를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 검정은 정제된 BCMA 폴리펩티드(들)를 사용하거나 BCMA 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하거나 이를 발현하도록 형질감염된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 BCMA 결합에 대해 공지된 BCMA 항체와 경쟁하는 후보 항체의 능력을 평가하는 경쟁적 결합 검정이다. 검정은 ELISA 포맷을 포함한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
초기 확인에 이어, 후보 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정밀화될 수 있다. 대안적으로, 생물검정을 사용하여 후보를 직접 스크리닝할 수 있다. 항체를 확인하고 특징화하는 일부 방법이 실시예에 상세하게 기재되어 있다.
BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 규명, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급업체, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems) (네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트벡 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유된 것일 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 내에 함유된 것은 아닐 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체를 사용한 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체가 결합하는 에피토프는 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하여 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체에 의한 결합을 결정하는 것에 의한 체계적 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라, BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전적 구축에 의해 단편화하고, BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원의 발현된 단편과 시험하고자 하는 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은 예를 들어 PCR에 의해 생산된 후, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 방사성 표지된 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 단편에 대한 항체의 결합이 이어서 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용하여 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 규정된 라이브러리를 간단한 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험할 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 교체 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 단백질의 다양한 단편이 또 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 BCMA 또는 밀접하게 관련되지만 항원적으로 구별되는 단백질 (예를 들어, Trop-1)로부터의 서열로 대체 (교체)된 돌연변이체 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원을 사용하여 도메인 교체 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 단편의 중요성을 평가할 수 있다.
BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체를 특징화하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원, 즉 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 사용하여, BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
발현 벡터는 BCMA, CD3 또는 다른 종양 항원 항체의 직접 발현에 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 수득하기 위해 발현 벡터를 투여하는 것에 친숙하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471을 참조한다. 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국소 투여를 포함한 국부 또는 전신 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 관상 동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접 투여된다.
발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술이 예를 들어 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; 및 Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994] 참조). 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 이러한 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적일 수 있거나, 또는 조절될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5, 219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터 (예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스강(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
사멸된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합된 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 추가의 접근법이 문헌 [Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재되거나 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고, 본원에 기재된 특징을 갖는 항체를 포함하는, 제약 조성물을 포함한 조성물을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 CD3 및 종양 항원 (예를 들어 BCMA)에 결합하는 1종 이상의 항체, 및/또는 1종 이상의 이들 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 추가로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 적합한 부형제, 예컨대 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이들 항체 중 임의의 것의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.
2개의 공유 연결된 항체를 포함하는 이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 항체는 원치않는 세포에 대해 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하는데 (PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 사용되어 왔다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 기재되어 있다.
가교제를 수반하는 것을 포함한 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 사용하여 키메라 또는 하이브리드 항체를 또한 시험관내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
재조합 인간화 항체에서, Fcγ 수용체 및 보체계 및 면역계와의 상호작용을 피하기 위해 Fcγ 부분을 변형할 수 있다. 이러한 항체를 제조하는 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 불변 영역이 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692를 참조한다.
본 발명은 그의 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 기능적 등가 항체 및 활성 및/또는 친화도가 증진되거나 감소된 변이체를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 변이체의 항체 및 폴리펩티드에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 BCMA 및/또는 CD3에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하기 위해 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 관련 기술분야에서의 상용 실시이며, 본원에 상세히 기재될 필요가 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의하게 유해하게 변화시키지 않거나 또는 그의 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도를 성숙 (증진)시키는 아미노산의 1개 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
치환 변이체는, 항체 분자 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환이 "보존적 치환"의 표제 하에 표 5에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 변화를 야기하는 경우에, 표 5에서의 또는 아미노산 부류를 참조하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은 "예시적인 치환"으로 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 그 생성물이 스크리닝될 수 있다.
표 5: 아미노산 치환
Figure 112020046425759-pat00101
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 아미노산 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 분류된다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하 없이 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성 (양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 1개의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것에 의해 이루어진다.
또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있고, 이는 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 그러하다.
아미노산 변형은 1개 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서 가변 영역과 같은 영역을 완전히 재설계하는 것까지의 범위일 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이하 내지 5개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 이하 내지 3개의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에서 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.
변형은 또한 글리코실화 및 비글리코실화 폴리펩티드 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대 예를 들어 상이한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997). 이뮤노글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능 (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990), 및 당단백질의 부분 사이의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 입체형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 (Jefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996). 올리고사카라이드는 또한 특정 인식 구조에 기초하여 주어진 당단백질을 특정 분자로 표적화하는 역할을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다. 특히, 양분성 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다 (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180, 1999).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에의 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
항체에의 글리코실화 부위의 부가는 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 1개 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래의 항체의 서열에의 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 또한 근본적인 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수 있다. 글리코실화는 주로 항체의 발현에 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 유형은 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변형이 예상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997] 참조).
숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생산에 수반되는 특정 효소의 도입 또는 과다발현을 포함하여 특정한 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 다양한 방법이 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드를 프로세싱하는데 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 및 유사 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 확립된 절차를 사용하여 변형된 폴리펩티드가 제조되고, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있으며, 그 중 일부가 이하 및 실시예에 기재된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 인간 Fc 감마 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 불변 영역과 같은 변형된 불변 영역을 포함하거나, 면역학적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성이거나, 예를 들어 보체 매개 용해를 촉발하지 않거나, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 대식세포를 활성화하지 않거나; 또는 하기 중 어느 하나 이상에서 (비변형된 항체와 비교하여) 감소된 활성을 갖는다: 보체 매개 용해의 촉발, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 자극, 또는 소교세포 활성화. 불변 영역의 상이한 변형을 사용하여 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 다른 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331에서 S330S331 (야생형 IgG2 서열에 관한 아미노산 넘버링)을 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]. 또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 불변 영역 내 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의한 탄수화물 제거), 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화될 수 있다.
다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합 도메인에 더하여, 인간 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역 모두 또는 일부와 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 유의한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 촉발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 이뮤노글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증성 및 다른 유해 반응을 피하기 위해 만성 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명은 친화도 성숙 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992]; 및 PCT 공개 번호 WO2004/058184).
하기 방법은 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특징화하는데 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징화하고/거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경하는 (예컨대 개선시키는) 하나의 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 수행된다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치가 관련 기술분야에서 인식되는 방법을 사용하여 2개 이상 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이는 클론의 소형 라이브러리를 생성하고 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 2개 이상의 구성원의 복잡성을 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 모든 위치에서 치환된 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연 (비치환) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복잡성에 따라 달라짐)이 표적 폴리펩티드 (또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝되고, 결합이 증가되었거나 동일하거나 감소되었거나 또는 없는 후보가 확인된다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 이는 약 2-배 이상의 결합 친화도의 차이를 검출한다. 비아코어™는 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우에 특히 유용하다. 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명을 사용한 스크리닝이 본원의 실시예에 기재되어 있다.
결합 친화도는 키넥사(Kinexa) 바이오센서, 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN) 면역검정 (이겐(IGEN)), 형광 켄칭, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치는 관련 기술분야에서 인식되는 돌연변이유발 방법 (일부는 본원에 기재됨)을 사용하여 모든 20종의 천연 아미노산으로 대체된다 (일부 실시양태에서, 한 번에 하나씩). 이는 클론의 소형 라이브러리를 생성하고 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 20종 구성원의 복잡성을 갖는다 (모든 20종의 아미노산이 모든 위치에서 치환된 경우).
일부 실시양태에서, 스크리닝될 라이브러리는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 내 또는 2개 이상의 CDR 내일 수 있다. 따라서, 라이브러리는 1개의 CDR 내 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견되는 3, 4, 5개 또는 그 초과의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 치환은 낮은 중복 코돈을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Balint et al., Gene 137(1):109-18, 1993]의 표 2를 참조한다.
CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, 및/또는 CDRH3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 또는 확장된 CDR일 수 있다.
결합이 개선된 후보를 서열분석함으로써, 개선된 친화도 ("개선된" 치환으로도 불림)가 생성된 CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있다. 결합하는 후보를 또한 서열분석함으로써, 결합을 보유하는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
다중 라운드의 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 결합이 개선된 후보 (각각 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함함)는 또한 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 원래의 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리를 설계하는데 유용하다. 이러한 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 하기에 추가로 논의된다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 또한, 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합, 또는 비 결합을 갖는 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제공하는 한, CDR을 특징화하는 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20종의 아미노산으로 변화된 경우에도 결합을 보유한다면, 그러한 위치는 항원 결합에 있어서 필요하지 않을 수 있는 위치로서 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 단지 적은 백분율의 치환에서만 결합을 보유한다면, 그러한 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은, 많은 상이한 아미노산 (모든 20종의 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 단지 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.
친화도가 개선된 후보는 그러한 위치에서 개선된 아미노산, 원래의 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 중에 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 사용하여 목적하거나 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라 그러한 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 원하는 경우에, 인접한 아미노산 위치는 적어도 2개 이상의 아미노산에 대해 무작위화될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에 추가의 입체형태적 유연성을 허용할 수 있고, 이는 차례로 보다 많은 수의 돌연변이를 개선시키는 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 제1 라운드의 스크리닝에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서 치환을 포함할 수 있다.
제2 라이브러리는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하는 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함한, 선택을 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하는 선택을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 개선된 및/또는 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원에 대해 스크리닝되거나 선택된다.
본 발명은 또한 고체 지지체 (예컨대, 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 단순성을 위해, 이들 방법은 본원에 기재된 BCMA 항체 실시양태 중 임의의 것에 적용된다는 이해 하에 항체에 대한 언급이 일반적으로 이루어질 것이다. 접합은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 이들 성분을 연결하는 것을 지칭한다. 연결 (일반적으로, 적어도 투여를 위해 이들 성분을 근접하게 회합시켜 고정시킴)은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 작용제 및 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 보유하는 경우에, 이들 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는, 다른쪽의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드, 또는 우수한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 DNA 분자에 1-대-1 방식으로 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일한 경우에 "동일"하다고 언급된다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개의 인접 위치의 절편을 지칭하고, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어 (디엔에이스타, 인크., 위스콘신주 매디슨)의 레이저진 스위트 내의 메갈라인 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 스킴을 구현한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 통상적으로 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 그의 부분 또는 상보체에 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세척하고; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화한 후; 0.1 % SDS를 함유하는 각각의 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 50℃에서 사용하거나, (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드 (pH 6.5)를 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트과 함께 42℃에서 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 세척하면서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 42℃에서, 및 50% 포름아미드를 55℃에서 사용하고, 이어서 55℃에서 0.1 x SSC 함유 EDTA로 이루어진 고-엄격도 세척을 행하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공되는 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-정합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 세포가 형질전환된다. 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 의도되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트 (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNAs, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 상업적 판매업체, 예컨대 바이오라드, 스트라테진 및 인비트로젠으로부터 입수가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해서는 또한 통상적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 필요하다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염원 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특색에 의존할 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과다-발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 목적에 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한 PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물 (예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스) 및 효모 (예컨대, 에스. 세레비지아에, 에스. 폼베; 또는 케이. 락티스)를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내에 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질이 존재하는 경우에, 그보다 약 5배 더 높은 수준, 보다 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. BCMA 또는 BCMA 도메인 (예를 들어, 도메인 1-4)에 대한 특이적 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포가 확인될 수 있다.
이중특이적 항체를 사용하는 방법 [치료 용도]
본 발명의 항체 (예를 들어, BCMA, CD3, 또는 이중특이체) 및 항체 접합체 (예를 들어, BCMA 항체-약물 접합체)는 치유적 치료 방법 및 진단상 치료 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 용도에 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 BCMA 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 BCMA 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. BCMA 발현과 연관된 상태는 비정상적 BCMA 발현, 변경된 또는 이상 BCMA 발현, BCMA를 발현하는 악성 세포, 및 증식성 장애 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B-세포 관련된 암 또는 종양 항원을 발현하는 악성 세포를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, a) 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 제공하는 것, 및 b) B-세포 관련된 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 이중특이적 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 B-세포 관련된 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양 항원을 발현하는 악성 세포와 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 항원을 발현하는 악성 세포와 연관된 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA, 또는 CD3-BCMA 이중특이적 항체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 여포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 변연부 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종성 육아종증, T 세포/조직구-풍부 대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 대 B-세포 림프종 (하지 유형), 고령자의 EBV 양성 미만성 대 B-세포 림프종, 염증과 연관된 미만성 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK-양성 대 B-세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8-연관된 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특색을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종과 전형적 호지킨 림프종 사이의 중간 특색을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 다른 B-세포 관련된 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 B-세포 관련된 암일 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체, 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, BCMA 발현 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체, 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 BCMA 발현 세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 악성 세포에서 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체, 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 악성 세포에서 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체, 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 사용된 자가면역 장애는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 당뇨병 (제I형), 다발성 경화증, 애디슨병, 복강 질환, 피부근염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 하시모토 뇌병증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 반응성 관절염, 쇼그렌 증후군, 급성 파종성 뇌척수염, 무감마글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 항신테타제 증후군, 아토피성 알레르기, 아토피성 피부염, 자가면역 장병증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 말초 신경병증, 자가면역 췌장염, 자가면역 다발내분비 증후군, 자가면역 프로게스테론 피부염, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 두드러기, 자가면역 포도막염, 베체트병, 캐슬만병, 저온 응집소 질환, 크론병, 피부근염, 호산구성 근막염, 위장 유천포창, 굿패스쳐 증후군, 길랑-바레 증후군, 화농성 한선염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 기면증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 다발근염, 원발성 담도 간경변증, 재발성 다발연골염, 류마티스성 열, 측두 동맥염, 횡단성 척수염, 궤양성 결장염, 미분화 결합 조직 질환, 혈관염 및 베게너 육아종증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 장애)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 상태를 치료하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에서 그의 억제를 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 장애)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 상태를 치료하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에서 그의 억제를 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA 발현 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암 또는 자가면역 장애)를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, BCMA를 발현하는 악성 세포의 전이를 억제하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 퇴행을 유도하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, BCMA 발현과 연관된 상태를 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체)는 검출가능한 모이어티 예컨대 영상화제 및 효소-기질 표지로 표지될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는 또한, 생체내 진단 검정, 예컨대 생체내 영상화 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체를 추가의 형태의 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 및/또는 추가의 면역요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 항암 요법이다.
일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체에 더하여 1종 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 1종 이상의 치료제는 제2 항체 (예를 들어, 항-VEGF (혈관 내피 성장 인자) 항체 (예를 들어, 아바스틴(AVASTIN)®), 항-HER2 항체 (예를 들어, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®), 항-CD25 항체, 항-CD33 항체, 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭산(RITUXAN)®), 항-뮤신-유사 당단백질 항체, 항-TNF 항체, 및/또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항체 (예를 들어, 에르비툭스(ERBITUX)®)), 혈관신생 억제제, 세포독성제 (예를 들어, 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 및 미톡산트론), 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 돌라스타틴, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴), 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 에토포시드), 튜부리신, 피리미딘 유사체 (예를 들어, 플루오로우라실), 백금-함유 작용제 (예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴), 알킬화제 (예를 들어, 멜팔란, 시클로포스파미드, 또는 카르무스틴) 및 헤미아스텔린), 면역조정제 (예를 들어, 프레드니손 및 레날리도미드 (레블리미드(REVLIMID)®)), 항염증제 (예를 들어, 덱사메타손), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸, 보로졸, 포르메스탄, 또는 테스토락톤), 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉 예컨대 벨케이드(VELCADE)® ([(1R)-3-메틸-1-[[(2S)-1-옥소-3-페닐-2-[(피라지닐카르보닐)아미노]프로필]아미노]부틸]보론산 또는 카르필조밉), 및 다른 작용제 예컨대 타목시펜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학요법제일 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 및 1종 이상의 다른 치료제 예컨대 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 또는 카르필조밉) 또는 탈리도미드 또는 그의 유도체 (예를 들어, 레날리도미드 (레블리미드®))를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 다른 치료제는 보르테조밉 (예를 들어, 벨케이드®), 멜팔란, 프레드니손, 독소루비신, 레날리도미드, 탈리도미드, 프레드니손, 카르무스틴, 에토포시드, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 카르필조밉 및 빈크리스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 보르테조밉 (예를 들어, 벨케이드®), 멜팔란, 레날리도미드 (레블리미드®), 카르필조밉, 독소루비신 또는 프레드니손이다. 따라서, 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 및 보르테조밉, 레날리도미드, 카르필조밉 및 독소루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 다른 치료제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자는 선행 다발성 골수종 요법에 대해 재발성 또는 불응성이다.
항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 예는 사용가능한 기술을 제한하는 것이 아니라 그의 예시라는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 두개내, 경피, 피하, 관절내, 설하로, 활막내, 취입을 통해, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 개체에게 투여된다. 투여는 전신, 예를 들어 정맥내 투여이거나 또는 국재화될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술의 예는 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국부 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참조한다.
항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 다양한 제제가 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 순수하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 및 제약상 허용되는 부형제는 다양한 제제로 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수 있거나 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 다양한 오스몰농도를 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증진제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부형제 뿐만 아니라 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 제제가 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 이들 작용제는 주사에 의한 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등의) 투여를 위해 제제화된다. 따라서, 이들 작용제는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정한 투여 요법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 그러한 개체의 병력에 따라 달라질 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 주사에 의한 것 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)을 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 또한 본원에 기재된 바와 같이 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 및 BCMA 항체 접합체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적상, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 그 초과 중 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 및 약 25 mg/kg의 투여량이 사용될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 증상의 목적하는 억제가 나타날 때까지 또는 예를 들어 종양 성장/진행 또는 암 세포의 전이를 억제 또는 지연시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 초기 용량 약 2 mg/kg에 이어 매주 유지 용량 약 1 mg/kg을 투여하거나, 또는 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg을 투여하는 것을 포함한다. 다른 예시적인 투여 요법은 증가하는 용량 (예를 들어, 1 mg/kg의 초기 용량 및 매주 또는 보다 긴 기간마다 하나 이상의 보다 높은 용량으로의 점진적 증가)을 투여하는 것을 포함한다. 진료의가 달성하기를 원하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1주 1 내지 4회 투여하는 것이 고려된다. 다른 실시양태에서, 1개월 1회 또는 격월 또는 3개월마다 1회 투여하는 것이 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 포함)은 시간의 경과에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 목적상, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 적절한 투여량은 사용된 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 (또는 그의 조성물), 치료될 증상의 유형 및 중증도, 작용제가 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 투여된 작용제에 대한 환자의 클리어런스율, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 임상의는 투여량이 목적하는 결과를 달성하는 것에 이를 때까지 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 따라 달라질 수 있다. 경험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용가능한 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 사용하여 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법의 과정에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로, 증상의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연, 예를 들어 종양 성장 억제 또는 지연 등에 기초한다. 대안적으로, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 투여량은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 1회 이상의 투여(들)를 제공받은 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체는 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 증분 투여량을 제공받는다. 효능을 평가하기 위해, 질환의 지표를 추적할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지의 여부, 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 이격된 투여로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 초과의 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체가 존재할 수 있다. 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5종 또는 그 초과의 상이한 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 그러한 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체는 서로 유해하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 항체 중 1종 이상이 사용될 수 있다: BCMA 또는 CD3 상의 하나의 에피토프에 대해 지시된 제1 BCMA 또는 CD3 항체 및 BCMA 또는 CD3 상의 상이한 에피토프에 대해 지시된 제2 BCMA 또는 CD3 항체.
본 발명에 따라 사용된 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체의 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체와 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합하여 저장을 위해 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 제조된다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 염 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 소듐; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 함유하는 리포솜은 관련 기술분야에 공지된, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어, 목적하는 직경을 갖는 리포솜으로 생성된다
활성 성분은 또한, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용하기 위한 제제는 멸균이어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제일 수 있다.
고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어 통상적인 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성한다. 이들 예비제제 조성물이 균질한 것으로서 지칭되는 경우에, 이는 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 고르게 분산되어 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 고체 예비제제 조성물을, 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500 mg 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분한다. 신규 조성물의 정제 또는 환제를 코팅하거나 또는 달리 배합하여, 지속 작용의 장점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 후자는 전자 상의 외피의 형태일 수 있다. 2개의 성분은 위에서의 붕해에 저항하는 작용을 하고 내부 성분이 무손상 상태로 십이지장을 통과하도록 하거나 또는 방출 지연될 수 있도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는 특히, 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성 작용제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면-활성 작용제를 포함할 것이고, 이는 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 필요한 경우에 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분을 사전-혼합된 에멀젼 조성물에 용해시킬 수 있거나 또는 대안적으로 이를 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일)에 용해시킬 수 있고, 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합 시 에멀젼이 형성된다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 첨가하여 에멀젼의 장성을 조정할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하는 것에 의해 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 그의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무되는 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 분무 장치를 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착할 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터, 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
조성물
본 발명의 방법에 사용된 조성물은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함한다. 이러한 조성물의 예, 뿐만 아니라 제제화하는 방법이 또한 이전 섹션 및 하기에 기재된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체를 포함한다. 예를 들어, BCMA 항체 또는 CD3-BCMA 이중특이적 항체는 인간 BCMA 또는 CD3-BCMA를 인식한다. 일부 실시양태에서, BCMA 또는 CD3-BCMA 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, BCMA 항체 또는 CD3-BCMA 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, BCMA 항체 또는 CD3-BCMA 항체는 원치않거나 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다.
조성물은 1종 초과의 항체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3-BCMA 이중특이체) 또는 BCMA 항체 접합체 (예를 들어, BCMA 또는 CD3 및 BCMA의 상이한 에피토프를 인식하는 BCMA 항체 또는 CD3-BCMA 이중특이적 항체의 혼합물)를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 1종 초과의 BCMA 항체, CD3-BCMA 항체, 또는 BCMA 항체 접합체, 또는 BCMA (예를 들어, 인간 BCMA) 또는 CD3 및 BCMA (인간 CD3 및 BCMA)의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체, 또는 BCMA 항체 접합체를 포함한다.
본 발명에 사용된 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 추가로 포함할 수 있다 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams 및 Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 소듐; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈)™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
키트
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체 또는 BCMA 항체 접합체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 상기 기재된 치유적 치료를 위해 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체 또는 BCMA 항체 접합체를 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체 또는 BCMA 항체 접합체의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도한 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에서 공급되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 지침서)가 또한 허용된다.
본 발명의 키트는 적합한 포장에 담긴다. 적합한 포장은 바이알, 병, 자르, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장이 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 BCMA 항체, CD3-BCMA 이중특이적 항체 또는 BCMA 항체 접합체이다. 용기는 추가로 제2 제약 활성제를 포함할 수 있다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예
실시예 1: 25℃ 및/또는 37℃에서의 hBCMA/인간 IgG 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정
본 실시예는 25℃ 및 37℃에서의 다양한 항-BCMA 항체의 동역학 및 친화도를 결정한다.
모든 실험을 바이오-라드(Bio-Rad) 프로테온 XPR36 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 (바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 수행하였다. 문헌 [Abdiche, et al., Anal. Biochem. 411, 139-151 (2011)]에 기재된 것과 유사한 바이오-라드 GLC 센서 칩 상에서의 아민-커플링 방법을 사용하여 항-BCMA 항체의 어레이를 제조하였다. 고정화를 위한 분석 온도는 25℃이고, 구동 완충제는 HBS-T+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, pH 7.4)였다. 1 mM ECD 및 0.25 mM NHS의 혼합물을 3분 동안 30 μL/분의 유량으로 주사함으로써 분석물 (수평) 방향으로 채널을 활성화시켰다. IgG를 10 mM 아세테이트 pH 4.5 완충제 중 20 μg/mL로 1.5분 동안 30 μg/mL로 리간드 (수직) 방향으로 주사함으로써 이들을 활성화된 스팟 상에 고정화시켰다. 1M 에탄올아민, pH 8.5를 분석물 방향으로 3분 동안 30 μL/분으로 주사함으로써 활성화된 표면을 차단하였다.
hBCMA 결합 분석을 위한 분석 온도는 1 mg/mL BSA가 보충된 HBS-T+의 구동 완충제 중에서 37℃ 또는 25℃였다. 동역학적 적정 방법을 문헌 [Abdiche, et al.]에 기재된 바와 같이 상호작용 분석을 위해 사용하였다. hBCMA (인간 BCMA) 분석물을 저농도에서 고농도로의 일련의 주사를 사용하여 분석물 방향으로 주사하였다. 사용된 농도는 0.08 nM, 0.4 nM, 2 nM, 10 nM 및 50 nM이었다 (5-배 희석 배율 및 상위 농도 50 nM인 5-원 시리즈). 주어진 분석물 희석물에 대한 회합 시간은 2분이었다. 50 nM hBCMA 주사 직후에, 해리를 2시간 동안 모니터링하였다. hBCMA 분석물 주사 전에, 완충제를 hBCMA 분석물 사이클에서의 동일한 회합 및 해리 시간을 사용하여 5회 주사하여 이중-참조 목적을 위한 완충제 블랭크 센소그램을 제조하였다 (문헌 [Myszka, J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)]에 기재된 바와 같은 이중 참조).
센소그램을 이중-참조하고, 비아이밸루에이션 소프트웨어 버전 4.1.1 (지이 라이프사이언시스(GE Lifesciences), 뉴저지주 피스카타웨이)에서 질량 수송 동역학적 적정 모델로 1:1 랭뮤어에 피팅하였다. 센소그램 및 피트는 도 1에 제시되고, 본 발명의 다양한 항-BCMA 항체에 대한 동역학 및 친화도 파라미터는 표 6A-6C에 제시된다.
표 6A
Figure 112020046425759-pat00102
표 6B
Figure 112020046425759-pat00103
Figure 112020046425759-pat00104
Figure 112020046425759-pat00105
Figure 112020046425759-pat00106
표 6C*
Figure 112020046425759-pat00107
Figure 112020046425759-pat00108
*결합 분석은 37℃에서 수행하였다.
실시예 2: BCMA 양성 종양 세포에 대한 인간 항-BCMA 항체의 유동 세포측정법
본 실시예는 본 발명의 다양한 BCMA 항체에 의한 BCMA 양성 종양 세포의 결합을 입증한다.
마우스 IgG2a에서 발현된 인간 항-hBCMA의 결합을 유동 세포측정법에 의해 BCMA-발현 세포 (KMS12BM, L363, MM1S 및 KMS12PE)에 대해 평가하였다. 250,000개 세포를 100uL 결합 완충제 (PBS (포스페이트 완충 염수) + 0.2% BSA (소 혈청 알부민)) 중 0.5 ug 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 알렉스 플루오르 647 접합된 항-마우스 IgG (바이오레전드(Biolegend))와 함께 인큐베이션하였다. 표 7은 다양한 BCMA 항체 (예를 들어, Combo_Rd4_0.6nM_C29, A02_Rd4_6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, 및 P6E01/H3TAQ)에 의한 BCMA 양성 종양 세포에 대한 MFI (평균 형광 강도)를 제시한다.
표 7
Figure 112020046425759-pat00109
실시예 3: BCMA 양성 세포에서의 항-BCMA ADC의 세포독성
본 실시예는 BCMA 양성 세포에서의 항-BCMA ADC의 효능을 예시한다.
인간 항-BCMA (L3.PY/P6E01, L3.PY/H3.TAQ, Combo_Rd4_0.6nM_C29, A02_Rd4_6nM_C01, 및 A02_Rd4_6nM_C16) 항체를 약물 항체 비 (DAR) 2, 4, 및 6을 위해 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 ("Q") 태그 (예를 들어 LCQ05, H7c, N297A, N297Q, N297A/H7c, N297Q/LCQ05)로 조작된 인간 IgG1 하위유형으로서 발현하였다. TG17은 서열식별번호: 472 (LLQGPP)에 상응하고, LCQ05는 서열식별번호: 474 (GGLLQGPP)에 상응하고, H7c는 서열식별번호: 454 (LLQG)에 상응하고, 각각, 표 8에 나타난 바와 같이 AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101 (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노-PEG6-C2-Aur3377, 또는 아미노-PEG6-C2-Aur0131과 접합된다. 한 경우에서, 트랜스글루타미나제 태그는 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄의 조합에서 조작될 수 있다. 다른 경우에서, 트랜스글루타미나제 태그 (예를 들어, Q)는 항체의 부위, 예컨대 인간 IgG의 위치 297 (EU 넘버링 스킴)에서 조작된다. 예를 들어, 야생형 아미노산 아스파라긴 (N)은 본 발명의 BCMA 항체의 위치 297에서 글루타민 또는 알라닌으로 치환된다 (N297Q 또는 N297A). 이어서, 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 또는 아미노 말단, 위치 297, 또는 항체의 또 다른 부위)에서 표적화된 글루타민 또는 글루타민 태그를 보유하는 항-BCMA 항체와 페이로드의 아민-함유 유도체 (예를 들어, MMAD, Aur0101, Aur3377, 또는 Aur0131) 사이의 미생물 트랜스글루타미나제-촉매된 아미드교환 반응을 통해 Aur0101, Aur3377, 및 Aur0131에 대한 항-BCMA 항체 접합을 달성하였다. 일부 경우에, 위치 222, 340, 또는 370 (EU 넘버링 스킴에 따름)에서의 야생형 아미노산 리신을 아미노산 아르기닌으로 대체하였다 ("K222R", "K340R", 또는 "K370R"). 예를 들어, K222R 치환은 보다 균질한 항체 및 페이로드 접합체, 항체와 페이로드 사이의 보다 우수한 분자간 가교, 및/또는 항체 경쇄의 C 말단 상의 글루타민 태그와의 쇄간 가교의 유의한 감소를 발생시키는 놀라운 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
아미드교환 반응에서, 항체 상의 글루타민은 아실 공여자로서 작용하고, 아민-함유 화합물은 아실 수용자 (아민 공여자)로서 작용하였다. 1 - 150 μM의 농도의 정제된 항-BCMA 항체를 10 - 1000 mM NaCl, 및 25 mM MES, HEPES [4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산] 또는 트리스 HCl 완충제 (pH 범위 6.2 - 8.8) 중 0.23 - 0.55% (w/v) 스트렙토베르티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense) 트랜스글루타미나제 (악티바(ACTIVA)™, 일본 아지노모토)의 존재 하에 5 μM - 15 mM 범위의 5 - 100 몰 과량의 아실 수용자와 함께 인큐베이션하였다. 개별 아실 수용자 유도체에 대해 반응 조건을 조정하였고, 75 mM NaCl, 25 mM 트리스 HCl, pH 8.5 중 33 μM 항체, 0.67 mM 유도체, 및 0.378% (w/v) 트랜스글루타미나제에 대해 전형적으로 최적의 효율 및 특이성이 관찰되었다. 20-37℃에서 1-24시간 동안 인큐베이션한 후에, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 크로마토그래피 방법, 예컨대 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터의 상업용 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 부틸 세파로스 고성능 (부틸 HP) 수지 (지이 헬스케어, 위스콘신주 워케샤) 상에서 항체를 정제하였다.
이어서, 표적 발현 (MM1.S, KMS12BM 및 L363) 세포를 투명한 바닥 플레이트 상에 3000개 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 4-배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 96 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로서 결정하였다. EC50을 프리즘 소프트웨어에 의해 계산하였다. 표 8은 트랜스글루타미나제 태그 및 링커를 통해 세포독성제 0101, 3377, 및 0131에 접합된 본 발명의 모든 인간 항-BCMA 항체가 BCMA 발현 세포에서 강력한 세포 사멸 활성을 발휘한다는 것을 제시한다.
표 8
Figure 112020046425759-pat00110
실시예 4: 항-BCMA ADC는 동소 다발성 골수종 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
본 실시예는 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 예시한다.
BCMA ADC의 생체내 효능 연구를 동소 모델에서 루시페라제 및 GFP (녹색 형광 단백질)를 발현하는 다발성 골수종 세포주 MM1.S로 수행하였다. 천만개의 MM1.S LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 CB17/SCID 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스(Regis Technologies), 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences), 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 1-3E6에 도달하였을 때, 동물을 군으로 무작위화하고, 항체 경쇄의 C-말단에서 LCQ05/K222R-vc0101과 접합된 인간 항-BCMA 항체 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. MM1.S 동소 모델에 대한 종점인 동물이 뒷다리 마비를 나타낼 때 이들을 종결시켰다. 도 2는 P6E01/P6E01-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5A2_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P5C1_VHVL-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; P4G4-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101; 및 P1A11-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101을 포함한 다양한 인간 항-BCMA ADC의 3mg/kg의 단일 용량이 음성 대조군 (NNC)과 비교하여 종양 진행을 억제한다는 것을 제시한다.
이 연구는 BCMA-ADC를 사용한 처리가 다발성 골수종의 진행을 억제한다는 것을 입증한다.
실시예 5: 항-BCMA ADC는 동소 다발성 골수종 모델에서 종양 퇴행 및 억제를 유도한다
본 실시예는 또한 MM1.S 동소 다발성 골수종 모델에서 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 예시한다.
BCMA ADC의 생체내 효능 연구를 동소 모델에서 루시페라제 및 GFP를 발현하는 다발성 골수종 세포주 MM1.S로 수행하였다. 천만개의 MM1.S LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 CB17/SCID 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 1-3E6에 도달하였을 때, 동물을 다음 군으로 무작위화하였다; 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 및 6) 대조군 접합체 LCQ04/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101. 인간 항-BCMA ADC 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. MM1.S 동소 모델에 대한 종점인 동물이 뒷다리 마비를 나타낼 때 이들을 종결시켰다. 도 3은 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131 및 2) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377과 접합된 인간 항-BCMA L3.PY/P6E01 항체의 단일 용량이 종양 퇴행을 발생시켰다는 것을 제시한다. 1) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 2) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 및 3) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101과 접합된 인간 항-BCMA L3.PY/P6E01 항체의 단일 용량은 종양 억제를 발생시켰다.
따라서, 이 연구는 BCMA-ADC를 사용한 처리가 다발성 골수종의 퇴행을 유도하고 그의 진행을 억제한다는 것을 입증한다.
실시예 6: 항-BCMA ADC는 동소 다발성 골수종 모델에서 종양 억제를 유도한다
본 실시예는 또한 KMS12BM 동소 다발성 골수종 모델에서 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 예시한다.
BCMA ADC의 생체내 효능 연구를 동소 모델에서 루시페라제 및 GFP를 발현하는 다발성 골수종 세포주 KMS12BM으로 수행하였다. 6-8주령 암컷 NSG 동물에게 100cGy를 조사하고, 조사 24시간 후에, 천만개의 KMS12BM LucGFP 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 5E6에 도달하였을 때, 동물을 다음 군으로 무작위화하였다; 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur010, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 및 6) 대조군 접합체 LCQ04/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101. 인간 항-BCMA ADC 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. KMS12BM 동소 모델에 대한 종점인 동물이 총 체중의 15% 초과 감소가 있을 때 이들을 종결시켰다. 도 4는 1) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-3377, 2) N297Q/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 3) LCQ05/K222R-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101, 4) H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 및 5) N297Q/K222R/LCQ05-AcLys-Val-Cit-PABC-Aur0101과 접합된 인간 항-BCMA L3.PY/P6E01 항체의 단일 용량이 종양 억제를 발생시켰다는 것을 제시한다.
따라서, 이 연구는 BCMA-ADC를 사용한 처리가 다발성 골수종의 퇴행을 유도하고 그의 진행을 억제한다는 것을 추가로 입증한다.
실시예 7: MM1S 동소 모델에서의 항-BCMA ADC의 용량 반응 곡선
본 실시예는 MM1S 동소 다발성 골수종 모델에서 항-BCMA ADC의 생체내 효능을 추가로 예시한다.
BCMA ADC의 생체내 효능 연구를 동소 모델에서 루시페라제 및 GFP를 발현하는 다발성 골수종 세포주 MM1.S로 수행하였다. 천만개의 MM1.S LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 CB17/SCID 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 1.2E6에 도달하였을 때, 동물을 다음 군으로 무작위화하였다; 1) 0.1 mg/kg H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 2) 0.38mg/kg H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 3) 0.75 mg/kg H7c/N297A/K222-아미노-PEG6-C2-0131, 4) 1.5mg/kg H7c/N297A/K222R-아미노-PEG6-C2-0131, 및 5) 3 mg/kg 대조군 접합체 N297Q/K222R-AcLys-VC-0101. 인간 항-BCMA ADC 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. MM1.S 동소 모델에 대한 종점인 동물이 뒷다리 마비를 나타낼 때 이들을 종결시켰다. 도 5는 상기 군 1)-4)와 접합된 인간 항-BCMA COMBO_Rd4_0.6nM_C29 항체의 단일 용량이 0.1mg/kg에서 시작하여 종양 퇴행을 발생시키고 0.75mg/kg에서 시작하여 최대 100일까지 종양 억제를 발생시켰다는 것을 제시한다.
따라서, 이 연구는 BCMA-ADC를 사용한 처리가 다발성 골수종에서 종양 퇴행 및 종양 억제를 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 8: 이종이량체 항체의 생성 및 정제
본 실시예는 본 출원의 이종이량체 항체의 생성 및 정제를 기재한다.
인간 특이적 항-CD3 항체의 가변 영역을, 각각 하기 돌연변이 221R, 228R, 및 K409R; 또는 223R, 225R, 228R, 및 K409R을 함유하는 인간 IgG1 또는 IgG2ΔA 내로 클로닝하고, hIgG1 RRR 또는 IgG2ΔA-RRRR로서 지칭하였다.
항-표적 항체의 가변 영역을, 각각 하기 돌연변이 221E, 228E, L368E 또는 223E, 225E, 228E 및 L368E를 함유하는 인간 IgG1 또는 IgG2ΔA 내로 클로닝하고, hIgG1EEE 또는 hIgG2ΔA-EEEE로서 지칭하였다.
국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재된 바와 같이 hIgG1 RRR 또는 IgG2ΔA-RRRR 돌연변이를 갖는 항-CD3 IgG1 또는 IgG2ΔA를 37℃에서 24시간 동안 1 mM 또는 2 mM GSH를 갖는 PBS 중에서 hIgG1EEE 또는 hIgG2ΔA-EEEE 돌연변이를 갖는 항-표적 항체와 인큐베이션하여 이종이량체를 제조하였다. 이종이량체를 하기 기재된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
모든 이종이량체를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, Fc-이종이량체 및 Fc-동종이량체의 분석적 이온 교환 분리를 약양이온 교환 디오넥스 프로팍 WCX-10G (4x50mm) 칼럼이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 사원 펌프 LC 시스템 (애질런트 인크, 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 수행하였다. 단백질을 5% 완충제 A (20 mM MES pH 5.4) 중에 주사하고, 1ml/분 유량으로 20분 기간에 걸쳐 25%에서 75% 완충제 B (20 mM MES pH 5.4 및 500 mM NaCl)로의 구배로 용리시켰다. 보다 큰 규모의 Fc-이종이량체 정제를 약양이온 교환 디오넥스 프로팍 WCX-10G (4x250mm) 칼럼이 구비된 아크타 익스플로러 (지이) 상에서 수행하였다. 단백질을 5% 완충제 A (20 mM MES pH 5.4) 중에 주사하고, 1ml/분 유량으로 60분 기간에 걸쳐 15%에서 75% 완충제 B (20 mM MES pH 5.4 및 500 mM NaCl)로의 구배로 용리시켰다.
실시예 9: 25℃ 및/또는 37℃에서의 hCD3/인간 IgG 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정
본 실시예는 25℃ 내지 37℃에서의 다양한 항-CD3 항체의 동역학 및 친화도를 결정한다.
모든 실험을 바이오-라드 프로테온 XPR36 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 (바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 수행하였다. 문헌 [Abdiche, et al., Anal. Biochem. 411, 139-151 (2011)]에 기재된 것과 유사한 바이오-라드 GLC 센서 칩 상에서의 아민-커플링 방법을 사용하여 항-CD3 항체의 어레이를 제조하였다. 고정화를 위한 분석 온도는 25℃이고, 구동 완충제는 HBS-T+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, pH 7.4)였다. 1 mM ECD 및 0.25 mM NHS의 혼합물을 3분 동안 30 μL/분의 유량으로 주사함으로써 분석물 (수평) 방향으로 채널을 활성화시켰다. IgG를 10 mM 아세테이트 pH 4.5 완충제 중 20 μg/mL로 1.5분 동안 30 μg/mL로 리간드 (수직) 방향으로 주사함으로써 이들을 활성화된 스팟 상에 고정화시켰다. 1M 에탄올아민, pH 8.5를 분석물 방향으로 3분 동안 30 μL/분으로 주사함으로써 활성화된 표면을 차단하였다.
hCD3 결합 분석을 위한 분석 온도는 1 mg/mL BSA가 보충된 HBS-T+의 구동 완충제 중에서 37℃ 또는 25℃였다. 동역학적 적정 방법을 문헌 [Abdiche, et al.]에 기재된 바와 같이 상호작용 분석을 위해 사용하였다. hCD3 (인간 CD3) 분석물을 저농도에서 고농도로의 일련의 주사를 사용하여 분석물 방향으로 주사하였다. 사용된 농도는 0.08 nM, 0.4 nM, 2 nM, 10 nM 및 50 nM이었다 (5-배 희석 배율 및 상위 농도 50 nM인 5-원 시리즈). 주어진 분석물 희석물에 대한 회합 시간은 2분이었다. 50 nM hCD3 주사 직후에, 해리를 2시간 동안 모니터링하였다. hCD3 분석물 주사 전에, 완충제를 hCD3 분석물 사이클에서의 동일한 회합 및 해리 시간을 사용하여 5회 주사하여 이중-참조 목적을 위한 완충제 블랭크 센소그램을 제조하였다 (문헌 [Myszka, J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)]에 기재된 바와 같은 이중 참조).
센소그램을 이중-참조하고, 비아이밸루에이션 소프트웨어 버전 4.1.1 (지이 라이프사이언시스, 뉴저지주 피스카타웨이)에서 질량 수송 동역학적 적정 모델로 1:1 랭뮤어에 피팅하였다. 본 발명의 다양한 항-CD3 항체에 대한 동역학 및 친화도 파라미터는 표 9에 제시된다.
표 9
Figure 112020046425759-pat00111
실시예 10: B 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 인간 항-CD3 이중특이적 항체의 유동 세포측정법
본 실시예는 CD20+ 세포에서 항-CD3-항-CD20 이중특이적 항체의 효능을 입증한다.
시노몰구스 원숭이 연구를 동물 실험 윤리 위원회에 따라 찰스 리버 래보러토리즈, 프리클리니칼 서비시즈 네바다에서 수행하였다. 동물 (n=2)에게 500 ug/kg, 100 ug/kg, 20 ug/kg, 2 ug/kg, 0.2 ug/kg 또는 0.02 ug/kg 용량의 이중특이적 항-CD20/h2B4 항체를 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여하였다. 동물을 1일 2회 및 각각의 혈액 수집 시점에 관찰하였다. 유동 세포측정법 및 시토카인 분석을 위한 혈액을 i.v. 투여에 사용되지 않은 말초 혈관으로부터 K2EDTA 튜브 내로 수집하였다.
유동 세포측정법에 의해 말초 혈액에서 B 세포 및 T 세포를 측정함으로써 효능을 결정하였다. 전혈을 나타낸 시점에서 수집하고, 분석까지 4℃에서 보관하였다. 적혈구를 실온에서 5분 동안 ACK 완충제 (깁코(Gibco))로 용해시키고, 백혈구를 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포를 PBS + 2% FBS 중에서 시노 CD19 (베크만 쿨터(Beckman Coulter)), CD45, CD4, CD8, Ki67 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 인식하는 형광 표지된 항체를 함유하는 칵테일로 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. Ki67 분석을 위해, 세포를 먼저 CD4 및 CD8로 염색한 다음, BD 시토픽스/시토펌 키트 (비디 바이오사이언시스)로 제조업체의 지침에 따라 고정/투과화한 후에, Ki67에 대해 세포내 염색하였다. 염색 직후에 BD LSRII 유동 세포측정기 상에서 세포의 획득을 수행하였다.
생성된 B 세포 카운트를 도 6a - 6f에서 사전연구 B 세포 카운트의 백분율로서 그래프화하였다. 단일 용량 후 연장된 B 세포 고갈을 낮게는 2 ug/kg 용량으로 달성하였다. B 세포 고갈은 모든 용량에서 관찰되었다. 고갈 효과의 지속기간은 용량 의존성이었다.
생성된 CD8+ T 세포 카운트를 도 7a - 7f에서 사전연구 CD8+ T 세포 카운트의 백분율로서 그래프화하였다. 초기 재국재화 후에, T 세포 수준은 연구의 지속기간 동안 기준선 수준 이상으로 회복하였다.
실시예 11: CD8+ T 세포에 대한 인간 항-CD3 이중특이적 항체의 유동 세포측정법
본 실시예는 T 세포 동역학 및 활성화에 대한 1가 항-CD3 항체의 효능을 입증한다.
시노몰구스 원숭이 연구를 수행하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 말초 혈액에서 T 세포를 측정함으로써 효능을 결정하였다. 시노몰구스 원숭이 (n=2)에게 항-CD20/h2B4 또는 NNC (비-특이적 항체)/ h2B4를 0.2 ug/kg으로 매주 i.v. 투여하였다. CD20 표적화된 이중특이적 항체와 달리, NNC/ h2B4는 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 혈액에서 CD8+ T 세포 동역학에 대한 효과가 거의 없거나 전혀 없다. Ki67을 T 세포 활성화에 대한 마커로서 사용하였다.
생성된 T 세포 카운트를 도 8a 및 8b에서 사전연구 CD8+ T 세포 카운트의 백분율로서 그래프화하였다. CD20/ h2B4 이중특이적 항체가 투여된 시노몰구스 원숭이에서, Ki67+ T 세포가 증가하고 투여후 제3일 내지 제7일에 피크였으며, 이는 T 세포 활성화를 나타낸다. 그러나, NNC/ h2B4가 투여된 시노몰구스 원숭이에서, Ki67+ T 세포의 증가는 없었다.
실시예 12: B 세포에 대한 인간 항-CD3 이중특이적 항체의 유동 세포측정법
본 실시예는 B 세포 고갈에 대한 항-CD3 아암 친화도의 효과를 입증한다.
시노몰구스 원숭이 연구를 수행하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 말초 혈액에서 T 세포를 측정함으로써 효능을 결정하였다. 이중특이적 항체는 상이한 친화도를 갖는 4개의 항-CD3 항체 아암과 쌍형성된 항-CD20 아암으로 제조하였다. 0.2 ug/kg의 단일 i.v. 용량 후에, 유동 세포측정법에 의해 말초 혈액에서 B 세포를 측정함으로써 효능을 결정하였다.
도 9a - 9d에서, 생성된 B 세포 카운트를 사전연구 B 세포 카운트의 백분율로서 그래프화하였다. B 세포 고갈의 효능은 항-CD3 아암 친화도와 상관관계가 있다.
실시예 13: BCMA 양성 세포의 T-세포 매개된 사멸에 대한 이중특이적 항체의 시험관내 연구
본 실시예는 BCMA 양성 세포에서 항-BCMA/CD3 hIgG2ΔA 이중특이체의 시험관내 세포독성을 예시한다.
인간 항-BCMA (P5A2, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, P5C1, C01_Rd4_6nM_C12, COMBO_Rd4_0.6nM_C22, Combo_Rd4_0.6nM_C29, L3PY/H3TAQ 및 A02_Rd4_6nM_C01) 및 인간 항-CD3 (H2B4) 항체를 실시예 8에 기재된 바와 같이 이중특이적 교환을 위해 EEEE로 조작된 인간 IgG2dA로서 발현하였다.
PBMC로부터의 CD3+ T 세포를 범 T 세포 단리 키트, 인간 (밀테니(Miltenyi), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 음성 선택하였다. 표적 발현 (KMS12PE, L363 및 Molp8) 세포 및 CD3+ T-세포를 각각 20000개 및 100000개 세포/웰로 투명한 U-바닥 플레이트 상에 시딩하였다. 세포를 10-배 연속 희석된 이중특이적 항체로 삼중으로 처리하였다. 처리 20시간 후에 시토톡스 96(CytoTox 96)® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 세포 사멸을 결정하였다. 세포 세포독성을 비처리 이펙터 플러스 표적 대조군 웰의 백분율로서 결정하였다. EC50을 프리즘 소프트웨어에 의해 계산하였다. 표 10은 모든 인간 항-BCMA_H2B4 이중특이적 항체가 BCMA 발현 세포에서 세포 사멸 활성을 발휘한다는 것을 제시한다.
표 10
Figure 112020046425759-pat00112
UND는 결정되지 않은 것이고; N/A는 EC50이 결정될 수 없었다는 것이다.
실시예 14: 마우스 하이브리도마 클로닝된 항-CD3 항체의 시험관내 특징화
본 실시예는 항체 스크리닝을 위한 인간/시노몰구스 PBMC 세포에서의 마우스 하이브리도마로부터 클로닝된 항-CD3의 시험관내 T 세포 활성화/증식을 예시한다.
인간 항-CD3 항체를 면역화된 마우스로부터 클로닝하고, 마우스 IgG1로서 발현하고, 단백질 A 친화도 비드에 의해 정제하였다. 인간/시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포 (hu/cyPBMC)를 국내 혈액 은행으로부터 입수한 혈액 필터로부터 피콜 (밀도: 1.083g/mL, 지이) 밀도 구배 원심분리에 의해 제조하였다. 적혈구를 실온에서 3분 동안 LCK 완충제 (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 mM EDTA; 깁코) 중에서 인큐베이션함으로써 제거하였다. 세포를 600g로 5분 동안 원심분리하였다. 용해된 적혈구를 함유하는 상청액을 폐기하고, PBMC를 50 ml 1xPBS/1% BSA/1mM EDTA 중에서 2회 세척하였다. 펠릿화된 세포를 무혈청 배지인 배양 배지 X-VIVO-15 (론자(Lonza))에서 ml당 107개 세포로 조정하고, PBMC를 둥근 바닥 96웰 조직 배양 플레이트에 웰당 106개 (100ul)로서 시딩하였다. 선택된 Ab를 인간 PBMC와 혼합하기 위해 mL당 1000ng에서 1ng으로 10x 연속 희석하고, 시노몰구스 PBMC와 혼합하기 위해 mL당 5000ng에서 200ng으로 5x 연속 희석하였다. 3H-티미딘 혼입에 의한 PBMC T 세포 증식의 분석을 위해, 2일 배양을 삼중으로 수행하였다. 배양 최종 16시간 동안 3H-티미딘 (0.5 mCi/웰)을 첨가하고, 혼입을 측정하였다. 세포를 수거하고, 용해시키고, DNA를 유리-섬유 필터 상에 포획하였다. 방사능 (cpm)을 섬광 베타-카운터 상에서 카운팅함으로써 증식에 대한 측정으로서 사용하였다.
도 10a 및 10b는 선택된 항-CD3 1A4, 1C10, 2B4, 및 7A3 항체가 인간 및 시노몰구스 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)에 대한 티미딘 혼입 판독치를 가졌다는 것을 제시한다. 표 11은 비아코어 측정에 의한 그의 KD를 제시한다. 시험관내 특징화는 항-CD3 1C10 및 2B4 항체가 양성 대조군 SP34 항-CD3 항체 (비디 바이오사이언시스)와 유사하다는 것을 제시한다.
표 11 80nM - 0.64nM로 피팅된 데이터에 대한 항-xCD3e ab / bsc_hCD3ed 동역학적 결과
Figure 112020046425759-pat00113
주:
데이터는 단지 만족스러운 동역학적 피트에 대해서만 보고되어 있다. (+) = 양성 대조군
* 동역학적 결정은 항체가 이종이기 때문에 대략적인 추정치이다. 단지 정상 상태 친화도만이 측정되어 있다.
실시예 15: T 세포 매개된 사멸에 대한 이중특이적 항체의 시험관내 연구
본 실시예는 건강한 공여자 단리된 범 T 세포와 혼합된 SW480에서의 항-EpCam/CD3 이중특이체의 시험관내 세포독성을 예시한다.
A: 항-CD 항체 h2B4-1d, TK, hnpsTK, 및 yaesTK
인간 항-CD3 (h2B4-1d (또는 h2B4), h2B4-TK (또는 h2B4-VH-wt VL_TK), h2B4-hnpsTK (또는 h2B4-VH-hnps VL_TK), 및 h2B4-yaesTK (또는 h2B4-VH-yaes VL_TK)) 항체 및 인간 항-EpCam 항체를 실시예 8에 기재된 바와 같이 이중특이적 교환을 위해 RRRR 또는 EEEE로 조작된 인간 IgG2dA로서 발현하였다.
SW480을 세포 사멸 검정을 위한 표적 세포주로서 선택하고, 이펙터 세포 및 인간 T 세포를 인간 말초 혈액 단핵 세포 (huPBMC)로부터 정제하였다. 표적 및 이펙터 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 세포 배양 배지에 시딩하였다. 표적 세포의 수를 2x104개 세포/웰로 일정하게 유지하였다. mL당 3ug에서 3pg으로의 이중특이적 항체의 10-배 연속 희석물을 세포에 삼중으로 첨가하였다. 총 반응 부피는 200uL였다. 반응물을 48 및 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성의 분석을 위해, 세포 용해시에 방출된 안정한 시토졸 효소인 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 시토톡스 96® 비-방사성 세포독성 검정 키트 (프로메가, G1780)에 의해 정량적으로 측정하였다. 플레이트를 Vmax 동역학적 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 490 nM에서 판독하였다. 광학 밀도 값을 배지 배경 및 표적 및 이펙터 세포의 자발적 용해에 대해 보정하였다. 특이적 세포독성을 하기 식에 따라 계산하였다:
[% 특이적 용해 = (샘플의 490nM 판독치 - E+T 혼합 대조군의 490nM 판독치)/(총 T 용해의 490nM 판독치 - 배지 대조군의 490nM 판독치)x100%]
도 11a 및 11b는 모든 인간 항-EpCam_h2B4 이중특이적 항체가 시험관내 세팅에서 세포 사멸 활성을 갖고 항체 매개된 T 세포 활성화가 T 세포 활성화 마커에 의해 모니터링되었다는 것을 제시한다. 표 12A는 그의 EC50을 제시한다. 표 12B는 이중특이적 항체 포맷에 대한 비아코어 KD를 제시한다.
표 12A
Figure 112020046425759-pat00114
표 12B 37℃에서의 항-CD3 hIgG2dA 이중특이체 동역학에 대한 요약 표
Figure 112020046425759-pat00115
B: 항-CD 항체 m25A8, h25A8-B12, 및 h25A8-B13
인간 항-CD3 h2B4(h2B4_1d) 및 h25A8 (m25A8, h25A8-B12, 및 h25A8-B13) 및 인간 항-EpCam 항체를 실시예 8에 기재된 바와 같이 이중특이적 교환을 위해 RRRR 또는 EEEE로 조작된 인간 IgG2dA로서 발현하였다.
도 11c 및 11d는 모든 인간 항-EpCam_항-CD3 이중특이적 항체가 시험관내 세팅에서 세포 사멸 활성을 갖고 항체 매개된 T 세포 활성화가 T 세포 활성화 마커에 의해 모니터링되었다는 것을 제시한다. 표 12C는 시험관내 세포 사멸의 EC50을 제시한다. 표 12D는 37℃에서 이중특이적 항체 포맷에 대한 비아코어 동역학을 제시한다. 표 12E는 SEC-MALS (크기 배제 크로마토그래피와 다중-각도 광 산란) 및 DSC (시차 주사 열량측정법)를 사용하는 시험관내 특징화를 제시한다.
표 12C: 시험관내 세포 사멸의 EC50
Figure 112020046425759-pat00116
표 12D: 37℃에서의 항-CD3 hIgG2dA 이중특이체 동역학에 대한 요약 표
Figure 112020046425759-pat00117
표 12E: 시험관내 특징화
Figure 112020046425759-pat00118
실시예 16: 원발성 골수종 환자 샘플의 T 세포 매개된 사멸에 대한 이중특이적 항체의 시험관내 연구.
본 실시예는 원발성 골수종 세포에서 항-BCMA/CD3 이중특이체의 시험관내 세포독성을 예시한다.
인간 항-BCMA (P5A2, A02_Rd4_0.6nM_C01, A02_Rd4_6nM_C16, Combo_Rd4_0.6nM_C29, 및 P6E01 L3PY/H3TAQ) 및 인간 항-CD3 (h2B4) 항체를 실시예 8에 기재된 바와 같이 이중특이적 교환을 위해 EEEE 또는 RRRR로 조작된 인간 IgG2dA로서 발현하였다.
골수종 환자로부터의 총 골수 단핵 세포를 투명한 U-바닥 플레이트에 3000-5000개 골수종 세포/웰이 되는 총 골수 단핵 세포 수로 시딩하였다. 세포를 10-배 연속 희석된 이중특이적 항체로 처리하였다. 처리 5일 후에, 총 생존 세포를 CD138 및 CD38에 대한 항체 (바이오레전드, 캘리포니아주)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 PBS + 0.5% FBS 중에서 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, PBS 중 고정성 생존율 염료 이플루오르 780 (이바이오사이언스, 인크.(eBioscience, Inc.), 캘리포니아주)을 4℃에서 30분 동안 세포에 첨가하였다. BD 유동 세포측정기 상에서의 세포 획득 전에, 세포를 세척하고, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비드 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오레곤주)를 첨가하였다. 카운팅 비드를 사용하여 처리 대 비처리 웰 내 살아있는 세포 카운트로서 퍼센트 살아있는 세포를 결정하였다. EC50을 프리즘 소프트웨어에 의해 계산하였다.
표 13A는 모든 인간 항-BCMA_h2B4 이중특이적 항체가 골수종 환자 샘플에 대한 세포 사멸 활성을 갖고 환자 T 세포가 기능적 이펙터 세포라는 것을 제시한다. 표 13B는 상이한 이펙터 대 표적 (E:T) 비를 갖는 다발성 골수종 환자 샘플에 대한 1종의 항-BCMA 이중특이체의 사멸을 제시한다.
표 13A
Figure 112020046425759-pat00119
표 13B
Figure 112020046425759-pat00120
실시예 17: 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체가 투여된 시노몰구스 원숭이로부터의 항체 분비 세포의 ELISPOT
본 실시예는 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체에 의한 시노몰구스 원숭이에서의 IgG 분비 세포의 고갈을 예시한다.
시노몰구스 원숭이 (n=2)에게 100 ug/kg 및 300 ug/kg의 제1일 및 제8일 2회 용량의 이중특이적 항-BCMA_CD3 항체 (h2B4-VH-hnps VL_TK), A02_Rd4_0.6nM_C01/H2B4 및 Combo_Rd4_0.6nM_C29/H2B를 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여하였다. 동물을 1일 2회 및 각각의 혈액 수집 시점에 관찰하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제-6일, 제4일 및 제10일에 샘플링하였다. 동물을 부검하였을 때 제10일에 골수 샘플을 채취하였다.
소듐 헤파린 및 밀도 구배를 함유하는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)® CPT™ 세포 제조 튜브 내로 혈액을 수집한 다음, 원심분리 후 구배 계면에서 PBMC를 수집하였다.
골수의 샘플 (대퇴골로부터의 것)을 대략 5 mL의 100% 태아 소 혈청 (FBS)으로 플러싱함으로써 수집한 다음, 플러싱된 골수를 50 ml의 완충제 중에 현탁시킴으로써 단세포 현탁액을 제조하였다.
세포를 셀로미터 비전을 사용하여 카운팅하고, 완전 RPMI 1640 배양 배지로 PBMC에 대해 mL당 5 x 106개 세포 및 골수 세포에 대해 mL당 2 x 106개 세포의 농도로 조정하였다. 총 IgG-분비 세포를 맙테크(Mabtech)로부터의 ELISpotBASIC 키트 (#3850-2HW-플러스)를 사용하여 열거하였다. 간략하게, PBMC 또는 골수 세포를 삼중 웰에 명시된 농도 (5 x 105개/웰의 PBMC, 및 2 x 105개/웰의 골수 세포)로 첨가한 다음, 세포를 플레이트에서 연속 희석하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하고, 비오티닐화 검출 항체를 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션하고, 스트렙타비딘-HRP를 1시간 동안 첨가하였다. IgG 스팟을 TMB 기질 용액을 사용하여 시각화하고, 이뮤노스팟 영상화 분석기 시스템 (CTL) 및 이뮤노스팟 5.1 소프트웨어를 사용하여 카운팅하였다. 데이터를 삼중 샘플로부터의 IgG-분비 세포의 평균 (+/- SD) 수로서 표현하였다.
PBMC 및 골수에서의 생성된 IgG-분비 세포 카운트가 각각 표 14A 및 14B에 열거되어 있다. IgG-분비 세포의 고갈이 투여전과 비교하여 PBMC에서의 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체, 및 비히클 및 음성 대조군과 비교하여 골수에서의 것 둘 다에 대해 관찰되었다. 용량 의존성 효과가 골수에서 관찰되었다.
표 14A
Figure 112020046425759-pat00121
표 14B
Figure 112020046425759-pat00122
실시예 18: 항-BCMA/CD3 이중특이체는 MM1.S 종양 모델에서 종양 퇴행 및 억제를 유도한다
본 실시예는 동소 MM1.S 골수종 모델에서 종양 퇴행 및 억제를 예시한다.
BCMA 이중특이체의 생체내 효능 연구를 루시페라제 및 GFP를 발현하는 MM1.S 동소 모델로 수행하였다. 종양 세포 주사 1일 전에, 마우스에게 RS 2000 생물학적 연구 조사기 (알에이디 소스 테크놀로지스(RAD Source Technolgies), 조지아주)를 사용하여 100cGy를 조사하였다. 5백만개의 MM1.S LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 Nod/Scid/IL2Rg-/- (NSG) 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하였다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 15E6에 도달하였을 때, 동물에게 PBMC로부터의 2천만개의 확장된 T 세포를 볼루스 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 간략하게, 올셀즈(AllCells) (캘리포니아주 알라메다)로부터 구입한 범-T 세포를 인간 T 세포 활성화/확장 키트 (밀테니, 캘리포니아주 샌디에고)로 활성화시켰다. 3일 후에, 15U/mL의 IL2 (이바이오사이언스, 캘리포니아주 샌디에고)를 제11일까지 2일마다 첨가하였다. 세포를 수거하고, 활성화/확장 비드를 자기 제거하고, 세포를 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. T 세포 주사 1일 후에, 마우스를 상기 기재된 바와 같이 영상화하고, 동물을 7마리 마우스의 군으로 무작위화하였다; 0.03 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 A02_Rd4_0.6nM_C01 및 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 Combo_Rd4_0.6nM_C29. 인간 항-BCMA/CD3 (h2B4-VH-wt VL_TK) 이중특이적 및 음성 (NNC) 대조군 이중특이적 항체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. MM1.S 동소 모델에 대한 종점인 동물이 뒷다리 마비를 나타냈을 때 이들을 종결시켰다. 도 12는 인간 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 단일 용량이 용량-의존성 방식으로 종양 퇴행을 발생시켰다는 것을 제시한다.
실시예 19: 항-BCMA/CD3 이중특이체의 2회 용량은 공격성 Molp8 종양 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
본 실시예는 동소 Molp8 골수종 모델에서 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 2회 용량에 의한 종양 퇴행을 예시한다.
BCMA 이중특이체의 생체내 효능 연구를 루시페라제 및 GFP를 발현하는 Molp8 동소 모델로 수행하였다. 2백만개의 Molp8 LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 NSG 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하였다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 총 플럭스가 모든 동물에 대해 평균 25E6에 도달하였을 때, 7마리 마우스의 3개 군으로 무작위화하였다; 1) Combo_Rd4_0.6nM_C29, 0.3 mg/kg, 2) Combo_Rd4_0.6nM_C29, 0.3 mg/kg, 2회 용량 및 3) NNC_2B4, 0.3 mg/kg, 2회 용량. 동물에게 실시예 18에 기재된 바와 같이 2천만개의 확장된 T 세포를 볼루스 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. T 세포 주사 2일 후에, 마우스에게 이중특이적 항체를 투여하였다. Molp8 동소 모델에 대한 종점인 동물이 15% 초과의 체중 감소를 나타냈을 때 이들을 희생시켰다. 도 13은 인간 항-BCMA/CD3 (h2B4-VH-wt VL_TK) 이중특이적 항체의 2회 용량이 증가된 종양 퇴행을 발생시켰다는 것을 제시한다.
실시예 20: 동소 Molp8 종양 모델에서 다발성 골수종에 대한 표준 관리와 조합된 항-BCMA/CD3 이중특이체
본 실시예는 보르테조밉 또는 레날리도미드와 조합되었을 때 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체에 대한 반대 효과가 부재한다는 것 및 보르테조밉 및 레날리도미드 조합과 비교하여 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체에 의한 보다 우수한 효력을 입증한다.
BCMA 이중특이체의 생체내 효능 연구를 루시페라제 및 GFP를 발현하는 Molp8 동소 모델로 수행하였다. 2백만개의 Molp8 LucGFP 세포를 6-8주령 암컷 NSG 동물 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. D-루시페린 (레지스 테크놀로지스, 일리노이주 모턴 그로브) (15mg/mL로 동물당 200uL)의 복강내 주사에 이어서 이소플루란을 사용한 마취 및 후속하는 전신 생물발광 영상화 (BLI)로 종양 부담의 모니터링이 가능하였다. 종양 세포에 의해 발현된 루시페라제와 루시페린 사이의 상호작용에 의해 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT (퍼킨 엘머, 매사추세츠주)를 사용하는 영상화에 의해 포획하고, 리빙 이미지 4.4 (캘리퍼 라이프 사이언시스, 캘리포니아주 알라메다)를 사용하여 총 플럭스 (광자/초)로서 정량화하였다. 동물에게 실시예 18에 기재된 바와 같이 2천만개의 확장된 T 세포를 제7일에 볼루스 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. T 세포 주사 2일 후에, 마우스를 영상화하고, 평균 17E6 총 플럭스/군을 갖는 7마리 마우스의 5개 군으로 무작위화하였다: 1) Combo_Rd4_0.6nM_C29, 0.3 mg/kg, 2) Combo_Rd4_0.6nM_C29, 0.3 mg/kg 및 1mg/kg 보르테조밉, 3) Combo_Rd4_0.6nM_C29, 0.3 mg/kg 및 50 mg/kg 레날리도미드, 4) 1 mg/kg 보르테조밉 및 50 mg/kg 레날리도미드 및 5) 비히클. 항-BCMA/CD3 (PBS 중)을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 주사하고, 보르테조밉 (PBS 중)을 복강내 주사를 통해 투여하고, 레날리도미드 (30% PEG400/5% 프로필렌 글리콜/0.5% 트윈80)를 경구 위관영양을 통해 투여하였다. 비히클은 30% PEG400/5% 프로필렌 글리콜/0.5% 트윈80으로 이루어져 있었으며, 경구 위관영양을 통해 투여하였다. Molp8 동소 모델에 대한 종점인 동물이 15% 초과의 체중 감소를 나타낼 때 이들을 희생시켰다. 도 14는 항-BCMA/CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) 이중특이적 항체를 보르테조밉 또는 레날리도미드와 조합하는 것이 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 효능에 대해 부정적 영향을 미치지 않았다는 것을 제시한다. 이 모델에서, 단독 또는 레날리도미드 또는 보르테조밉과 조합된 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체는 레날리도미드 및 보르테조밉 조합보다 더 효과적이다.
실시예 21: OPM2 세포주에 대한 레날리도미드, 카르필조밉 또는 독소루비신과 조합된 항-BCMA/CD3 이중특이체의 시험관내 연구
본 실시예는 이중특이적 항체 단독과 비교하여 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체 활성을 위해 카르필조밉, 독소루비신 및 레날리도미드와 조합되었을 때 T 세포 기능에 대한 유해 효과가 부재한다는 것을 예시한다.
PBMC로부터의 CD3+ T 세포를 범 T 세포 단리 키트, 인간 (밀테니, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 음성 선택하였다. OPM2 세포 및 CD3+ T-세포를 각각 20000개 및 100000개 세포/웰로 투명한 U-바닥 플레이트에 시딩하였다. OPM2 및 CD3+ T 세포를 먼저 37℃에서 2시간 동안 표준 관리 하에 인큐베이션하였다. 1.56 nM 카르필조밉 및 6.25 nM 독소루비신을 0.02% DMSO 함유 PBS 중에 희석하였다. 레날리도미드를 195nM에서 0.1% DMSO 함유 PBS 중에 희석하였다. 세포를 10-배 연속 희석된 이중특이적 항체로 처리하였다. 처리 3일 후에, 총 생존 세포를 CD138, CD4, 및 CD8에 대한 항체 (바이오레전드)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 PBS + 0.5% FBS 중에서 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, PBS 중 고정성 생존율 염료 이플루오르 780 (이바이오사이언스, 인크., 캘리포니아주)을 4℃에서 30분 동안 세포에 첨가하였다. BD 유동 세포측정기 상에서의 세포 획득 전에, 세포를 세척하고, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비드 (몰레큘라 프로브스, 오레곤주)를 첨가하였다. 카운팅 비드를 사용하여 처리 대 비처리 웰 내 살아있는 세포 카운트로서 퍼센트 살아있는 세포를 결정하였다. 도 15a, 15b, 및 15c는 각각 카르필조밉, 레날리도미드, 및 독소루비신이 OPM2 세포에 대한 Combo_Rd4_0.6nM_C29-CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) 이중특이적 항체의 기능에 대해 부정적 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
실시예 22: KMS12BM 세포주에 대한 레날리도미드 및 카르필조밉과 조합된 항-BCMA/CD3 이중특이체의 시험관내 연구
본 실시예는 각각의 분자 단독과 비교하여 카르필조밉 및 레날리도미드과 조합되었을 때 항-BCMA/CD3 이중특이체 기능에 대한 상승작용적 효과를 예시한다.
PBMC로부터의 CD3+ T 세포를 범 T 세포 단리 키트, 인간 (밀테니, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 음성 선택하였다. KMS12BM 세포 및 CD3+ T-세포를 각각 20000개 및 100000개 세포/웰로 투명한 U-바닥 플레이트에 시딩하였다. 세포를 카르필조밉 및 소정 범위의 농도의 레날리도미드와 조합된 0.017 nM 항-BCMA/CD3 이중특이체로 처리하였다. 1.25 nM 카르필조밉을 0.02% DMSO 함유 PBS 중에 희석하였다. 레날리도미드를 0.1% DMSO 함유 PBS 중에 4uM에서 시작하여 4-배 희석되게 희석하였다. 처리 3일 후에, 총 생존 세포를 CD138, CD4, 및 CD8에 대한 항체 (바이오레전드, 캘리포니아주)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 세포를 PBS + 0.5% FBS 중에서 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, PBS 중 고정성 생존율 염료 이플루오르 780 (이바이오사이언스, 인크., 캘리포니아주)을 4℃에서 30분 동안 세포에 첨가하였다. BD 유동 세포측정기 상에서의 세포 획득 전에, 세포를 세척하고, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비드 (몰레큘라 프로브스, 오레곤주)를 첨가하였다. 카운팅 비드를 사용하여 처리 대 비처리 웰 내 살아있는 세포 카운트로서 퍼센트 살아있는 세포를 결정하였다. 도 16은 시험된 농도에서, 카르필조밉, 레날리도미드, 및 항-BCMA/CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) 이중특이적 항체가 단일 작용제 세포독성 기능을 거의 갖고 있지 않았다는 것을 제시한다. 모든 3종의 작용제가 조합되었을 때, 상승작용적 효과가 KMS12BM 세포에서 용량-의존성 레날리도미드 농도에서 관찰되었다.
개시된 교시가 다양한 적용, 방법, 키트, 및 조성물과 관련하여 기재되었지만, 본원의 교시 및 하기 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 상기 실시예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공되고, 본원에 제시된 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 교시가 이들 예시적 실시양태의 면에서 기재되었지만, 이들 예시적 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 통상의 기술자는 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 교시의 범주 내에 있다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌 및 그에 인용된 참고문헌은 이들이 이미 포함되어 있지는 않은 정도로, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
상기 기재 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 고려된 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기를 본문에서 아무리 상세하게 나타내 보일수 있을 지라도, 본 발명이 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명이 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 인지될 것이다.
ATCC ATCCPTA-122093 20150415 ATCC ATCCPTA-122094 20150415 ATCC ATCCPTA-122512 20150911 ATCC ATCCPTA-122513 20150911
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. Kuo, Tracy C Chaparro Riggers, Javier Chen, Wei Chen, Amy S Pascua, Edward D Van Blarcom, Thomas J Boustany, Leila M Ho, Wei-Hsien Yeung, Yik A Strop, Pavel Rajpal, Arvind <120> THERAPEUTIC ANTIBODIES AND THEIR USES <130> PC72209-02 <150> US 62/146,843 <151> 2015-04-13 <150> US 62/146,504 <151> 2015-04-13 <150> US 62/301,582 <151> 2016-02-29 <160> 502 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro 85 90 95 Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 119 <212> 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Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 267 Arg Ala Ser Cys Asp Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 268 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 268 Gln Gln Tyr Met Arg Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 269 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 269 Arg Ala Ser Glu Ala Val Pro Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 270 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 270 Cys Ser Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 271 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 271 Arg Ala Ser Val Arg Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 272 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 272 Gln Gln Tyr Met Lys Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 273 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 273 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ala Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 274 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MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is T, N, or S <400> 301 Ser Tyr Xaa Met Xaa 1 5 <210> 302 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is G or S <400> 302 Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr 1 5 <210> 303 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is T, N, or S <400> 303 Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr Xaa Met Xaa 1 5 10 <210> 304 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 304 Ala Ile Ser Gly Trp Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 305 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is I, V, T, H, L, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is S, D, G, T, I, L, F, M, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is G, Y, L, H, D, A, S, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S, Q, T, A, F, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is N, S, P, Y, W, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is F, Y, P, W, H, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is V, R, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is G or T <400> 305 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 Gly <210> 306 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is S, V, I, D, G, T, L, F, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is G, Y, L, H, D, A, S, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is S, G, F, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is N, S, P, Y, or W <400> 306 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 307 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is A or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is G, Q, L, P, or E <400> 307 Val Ser Pro Ile Xaa Xaa Xaa Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 308 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is D, S, T, or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is I, S, L, P, or D <400> 308 Tyr Trp Pro Met Xaa Xaa 1 5 <210> 309 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is R, G, W, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is A, P, G, L, C, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is S, G, or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Q, C, E, V, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S, P, G, A, R, or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is V, G, I, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is S, E, D, P, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is S, P, F, A, M, E, V, N, D, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is I, T, V, E, F, S, A, M, Q, Y, H, or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is L, W, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is A, S, or G <400> 309 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 310 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is S or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is T or P <400> 310 Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa 1 5 <210> 311 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Q or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is G, N, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S, W, or Y <400> 311 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro Ser Phe Thr 1 5 10 <210> 312 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is G, Q, E, L, F, A, S, M, K, R, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S, R, T, G, V, F, Y, D, A, H, V, E, K, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is W, F, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is L or I <400> 312 Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 313 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is T, N, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is I, V, T, H, L, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is S, D, G, T, I, L, F, M, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is G, Y, L, H, D, A, S, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is S, Q, T, A, F, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is N, S, P, Y, W, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa is S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa is F, Y, P, W, H, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa is V, R, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa is A or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa is G, Q, L, P, or E <400> 313 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr 20 25 30 Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ser Pro Ile Xaa Xaa Xaa Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 314 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is T, N, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is I, V, T, H, L, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is S, D, G, T, I, L, F, M, or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is G, Y, L, H, D, A, S, or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is S, Q, T, A, F, or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is N, S, P, Y, W, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa is S, T, I, L, T, A, R, V, K, G, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa is F, Y, P, W, H, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa is V, R, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa is G or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa is D, S, T, or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is I, S, L, P, or D <400> 314 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr 20 25 30 Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Xaa Xaa 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Trp Pro Met Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 315 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is R, G, W, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is A, P, G, L, C, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is S, G, or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Q, C, E, V, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is S, P, G, A, R, or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is V, G, I, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is S, E, D, P, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is S, P, F, A, M, E, V, N, D, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, R, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is L, W, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is A, S, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is S or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is T or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa is Q or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa is H or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa is G, N, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa is S, W, or Y <400> 315 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro 85 90 95 Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 316 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is R, G, W, A, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is A, P, G, L, C, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is S, G, or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Q, C, E, V, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is S, L, P, G, A, R, or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is V, G, or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is S, E, D, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is S, P, F, A, M, E, V, N, D, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is I, T, V, E, S, A, M, Q, Y, H, or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Y or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is L, W, or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is A, S, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is S or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is T or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa is G, Q, E, L, F, A, S, M, R, K, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa is S, R, T, G, R, V, D, A, H, E, K, C, F, or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa is W, S, or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa is L or I <400> 316 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Xaa Ala Ser Xaa Arg Ala Xaa Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Pro 85 90 95 Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 317 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 317 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Leu 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 318 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 318 Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 319 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 319 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 320 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 320 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 321 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 321 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 322 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 322 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 323 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 323 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 324 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 324 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 325 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 325 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 326 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 326 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 327 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 327 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 328 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 328 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser 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Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 330 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 330 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp Tyr Ala Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 331 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 331 Asp Tyr Tyr Met Thr 1 5 <210> 332 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 332 Gly Phe Thr Phe Ser Asp 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Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Arg Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 497 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 497 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 498 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 498 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 499 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 499 Gln His Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 500 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 500 Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 501 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 501 Gly Ala Ser Tyr Arg Ala Thr 1 5 <210> 502 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 502 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 135 140 Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 165 170 175 Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 180 185 190 Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195

Claims (12)

  1. (a) 서열식별번호: 332에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 417에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열식별번호: 335에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및 서열식별번호: 343에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 341에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 342에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역; 또는
    (b) 서열식별번호: 332에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 417에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열식별번호: 335에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및 서열식별번호: 340에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 341에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 342에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역;
    을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체.
    (a) 서열식별번호: 324에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 323에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (b) 서열식별번호: 320에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 319에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (c) 서열식별번호: 322에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 321에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (d) 서열식별번호: 326에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 325에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (e) 서열식별번호: 328에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 327에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
    (f) 서열식별번호: 330에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 329에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL
  3. (i) 서열식별번호: 331, 332, 또는 333에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열식별번호: 336 또는 417에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 335에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및 (i) 서열식별번호: 343에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열식별번호: 341에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 342에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  4. 서열식별번호: 324에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역, 및 서열식별번호: 323에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포.
  9. 제8항의 숙주 세포를 항체가 생산되도록 하는 조건 하에 배양하는 것, 및 항체를 숙주 세포 또는 배양물로부터 단리하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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