TW202029980A - Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露大體係關於特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、EpCAM可活化抗體、及其免疫偶聯物，以及製備及使用該等抗體、抗體片段、可活化抗體及免疫偶聯物以用於診斷及治療疾病諸如癌症之方法。

Description

ＥｐＣＡＭ抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
本揭露大體係關於特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、EpCAM可活化抗體及其免疫偶聯物，以及製備及使用該等抗體、抗體片段、可活化抗體、及免疫偶聯物用於診斷及治療疾病諸如癌症之方法。
上皮細胞黏附分子(EpCAM)為I型跨膜醣蛋白，其包含胞外域、跨膜域及單胞內域。人類中之EpCAM表現為上皮特異性的。大部分上皮細胞表現EpCAM，除了鱗狀上皮及一些特定的上皮細胞類型，諸如上皮角質細胞、肝細胞、胃壁細胞及肌上皮細胞(Balzar等人, J. Mol.Med.77:699-712 (1999)；Momburg等人, Cancer Res 47:2883-2891 (1987))。
EpCAM在不同來源之人類癌上豐富且均勻地表現(Went等人, Br. J. Cancer 94:128-35 (2006)；Herlyn等人, Proc Natl.Acad.Sci.USA 76:1438-1442 (1979)；Went等人, Hum.Pathol.35:122-128 (2004))。EpCAM在絕大多數上皮癌上過表現，該等上皮癌包括例如卵巢癌、結腸癌、胃癌、前列腺癌及肺癌。另外，EpCAM已顯示在大多數原發性、轉移性及播散性NSCLC (非小細胞肺癌細胞)上(Passlick, Int. J. Cancer 87:548-552 (2000))、在胃及胃食道接合部腺癌上(Martin,J. Clin.Pathol.52:701-704 (1999))以及在源自結直腸癌、胰腺癌及乳癌之細胞株中(Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3542-3546 (1990), Packeisen, Hybridoma18:37-40 (1999))表現。在另一研究中，已發現對繼發性腫瘤之108個樣品的免疫組織化學分析僅4%缺乏EpCAM表現。EpCAM亦在自結腸癌、乳癌、胰腺癌及前列腺癌中分離之癌症形成細胞或癌症幹細胞中過表現(O'Brien等人, Nature 445:106-110 (2007)；Marhaba等人, Curr.Mol.Med.8:784-804 (2008))。
正常細胞在上皮膜之基底側上表現EpCAM，而癌細胞在頂面上大量表現EpCAM。基於抗體之治療劑已經設計以利用EpCAM表現之此特徵，因為正常細胞EpCAM不太明顯且較少暴露，這意味著健康細胞可能不易於藉由治療性抗-EpCAM抗體來結合。
許多EpCAM抗體已用於臨床中，但出於各種原因而失敗。所測試之EpCAM抗體採用許多形式，包括裸抗體、免疫毒素及雙特異性或三特異性抗體(Baeuerle, Br. J. Cancer, 96:417-423 (2007))。例如，裸抗-EpCAM抗體阿德木單抗(adecatumumab) (MT201)已在結直腸癌、前列腺癌及乳癌之臨床治療研究中測試。當前基於抗-EpCAM抗體之方法面臨的安全問題包括全身不耐受及急性胰臟炎。因此，儘管已進行若干嘗試以開發治療性EpCAM抗體，但仍顯著需要開發克服先前所開發抗體之缺點及限制的新穎治療性EpCAM抗體。
本揭露提供特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、以及EpCAM可活化抗體、及包含該等抗體、抗體片段及可活化抗體之免疫偶聯物。亦提供包含編碼EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及可活化抗體之核酸序列的多核苷酸，以及包含該等多核苷酸之載體、及包含該等多核苷酸及載體之細胞。本揭露亦提供包含該等EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及可活化抗體之組成物，諸如醫藥組成物。進一步提供製備及使用該等EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、可活化抗體及組成物之方法。此等方法包括使用該等抗體、抗體片段、可活化抗體、免疫偶聯物及其他組成物抑制腫瘤生長，以及製備及使用該等抗體、抗體片段、可活化抗體、免疫偶聯物及組合物來診斷及治療疾病諸如癌症之方法。
在一些實施例中，本揭露提供： [1] 一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) 重鏈CDR1 (VH-CDR1)，其包含序列X1 YX3 X4 H，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)； (b) 重鏈CDR2 (VH-CDR2)，其包含序列WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)； (c) 重鏈CDR3 (VH-CDR3)，其包含序列X1 GX3 X4 FAY，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)； (d) 輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其包含序列RSSX4 SLLHSX10 GX12 TY LX16 ，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)； (e) 輕鏈CDR2 (VL-CDR2)，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) 輕鏈CDR3 (VL-CDR3)，其包含序列X1 QX3 LELPX8 T，其中X1 係選自A、L、及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)； [2] 如[1]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) 重鏈CDR1 (VH-CDR1)，其包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)； (b) 重鏈CDR2 (VH-CDR2)，其包含序列WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)； (c) 重鏈CDR3 (VH-CDR3)，其包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)； (d) 輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其包含序列RSSX4 SLLHSX10 GX12 TYLX16 ，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)； (e) 輕鏈CDR2 (VL-CDR2)，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) 輕鏈CDR3 (VL-CDR3)，其包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)； [3] 如[1]或[2]之EpCAM抗體或EpCAM-結合片段，其中該抗體或抗體片段包含具有選自下組之序列之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (a) 分別為SEQ ID NO: 13-15、42、40及41； (b) 分別為SEQ ID NO: 13-15及39-41； (c) 分別為SEQ ID NO: 13、26、15及39-41；及 (d) 分別為SEQ ID NO: 13、24、15、42、40及41； [4] 如[1]-[3]中任一項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段以3.0 nM或3.0 nM以下之KD結合至人類EpCAM及獼猴EpCAM； [5] 如[4]之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之人類EpCAM的胞外域內之表位； [6] 如[5]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)； [7] 如[4]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSKSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:39)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)； [8] 如[3]之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之VH或VL： (a) 具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (b) 具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:87之VL； (c) 具有序列SEQ ID NO:55之VH及具有序列SEQ ID NO:87之VL； (d) 具有序列SEQ ID NO:56之VH及具有序列SEQ ID NO:88之VL； (e) 具有序列SEQ ID NO:55之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL；及 (f) 具有序列SEQ ID NO:56之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； [9] 如[8]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:54之VH及SEQ ID NO:89之VL； [10] 如[8]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:54之VH及SEQ ID NO:87之VL； [11] 如[8]之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之重鏈及輕鏈： (a) 具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (b) 具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:138之LC； (c) 具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:139之LC； (d) 具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:139之LC； (e) 具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC；及 (f) 具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； [12] 如[11]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:103之HC及SEQ ID NO:140之LC； [13] 如[11]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:103之HC及SEQ ID NO:138之LC； [14] 如[1]或[2]之EpCAM抗體或EpCAM-結合片段，其中該抗體或抗體片段包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (a) 分別為SEQ ID NO: 22、14、15、42、40及41； (b) 分別為SEQ ID NO: 13、14、33、42、40及41； (c) 分別為SEQ ID NO: 23、14、15、42、40及41；及 (d) 分別為SEQ ID NO: 25、14、15、42、40及41； [15] 如[14]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYHIH (SEQ ID NO:22)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)； [16] 如[14]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGYWFAY (SEQ ID NO:33)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)； [17] 如[14]之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之VH或VL： (a) 具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (b) 具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (c) 具有序列SEQ ID NO:76之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL；及 (d) 具有序列SEQ ID NO:84之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； [18] 如[17]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:75之VH及SEQ ID NO:89之VL； [19] 如[17]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:77之VH及SEQ ID NO:89之VL； [20] 如[17]之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之重鏈及輕鏈： (a) 具有序列SEQ ID NO:125之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (b) 具有序列SEQ ID NO:127之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (c) 具有序列SEQ ID NO:126之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC；及 (d) 具有序列SEQ ID NO:134之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； [21] 如[20]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:125之HC及SEQ ID NO:140之LC； [22] 如[20]之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:127之HC及SEQ ID NO:140之LC； [23] 如[1]-[22]中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段為鼠類抗體、非人哺乳動物抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體； [24] 如[1]-[23]中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為全長抗體。 [25] 如[24]之全長抗體，其中該抗體為人類IgG1。 [26] 如[1]-[23]中任一項之抗體或抗體片段，其中抗體片段為Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv 、V-NAR域、IgNar、胞內抗體、IgGACH2 、微型抗體、F(ab’)3 、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc； [27] 一種包含如[1]-[26]中任一項之抗體或抗體片段的可活化抗體，其中該可活化抗體進一步包含 (a) 與該抗體或抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽；及 (b) 與該抗體或抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合， 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)； [28] 一種EpCAM可活化抗體，其包含： (a) EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自下組之成員之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (i) 分別為SEQ ID NO: 13-15、42、40及41； (ii) 分別為SEQ ID NO: 13-15及39-41； (iii) 分別為SEQ ID NO: 13、26、15及39-41；以及 (iv) 分別為SEQ ID NO: 13、24、15、42、40及41； (b) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合；及 (c) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽； 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)； [29] 如[28]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3； [30] 如[29]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； [31] 如[30]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之LC； [32] 如[29]-[31]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分； [33] 如[32]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:155之遮蔽部分； [34] 如[29]-[33]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分； [35] 一種EpCAM可活化抗體，其包含： (a) EpCAM抗體或EpCAM-結合片段，其包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (i) 分別為SEQ ID NO: 22、14、15、42、40及41； (ii) 分別為SEQ ID NO: 13、14、33、42、40及41； (iii) 分別為SEQ ID NO: 23、14、15、42、40及41；以及 (iv) 分別為SEQ ID NO: 25、14、15、42、40及41； (b) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合；及 (c) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽； 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)； [36] 如[35]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:22、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3； [37] 如[36]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； [38] 如[37]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:125之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之輕鏈； [39] 如[36]-[38]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-157及162-167之胺基酸序列的遮蔽部分； [40] 如[39]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:162-167之胺基酸序列的遮蔽部分； [41] 如[36]-[40]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分； [42] 如[35]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13、14、33、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3； [43] 如[42]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； [44] 如[43]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:127之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之輕鏈； [45] 如[42]-[44]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-161之胺基酸序列的遮蔽部分； [46] 如[45]之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:158-161之胺基酸序列的遮蔽部分； [47] 如[42]-[46]中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分； [48] 一種細胞，其產生如[1]-[26]中任一項之抗體或EpCAM-結合抗體片段或如[27]-[47]中任一項之可活化抗體； [49] 一種產生EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體之方法，其包含： (a) 培養如[48]之細胞；及 (b) 自該細胞或細胞培養物分離該EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體； [50] 如[49]之方法，其中該細胞為原核細胞； [51] 如[50]之方法，其中該細胞為CHO細胞； [52] 一種診斷試劑，其包含如[1]-[26]中任一項之抗體或抗體片段或如[27]-[47]中任一項之EpCAM可活化抗體； [53] 如[52]之診斷試劑，其中該抗體、抗體片段或可活化抗體經標記； [54] 如[53]之診斷試劑，其中該標記係選自：放射性標記、螢光團、發色團、顯像劑及金屬離子； [55] 一種多核苷酸或多核苷酸集合，其編碼如[1]-[26]中任一項之抗體或抗體片段或如[27]-[47]中任一項之可活化抗體； [56] 一種載體或載體集合，其包含如[55]之多核苷酸； [57] 一種宿主細胞，其包含如[55]之多核苷酸或多核苷酸集合或如[56]之載體； [58] 一種由下式表示之免疫偶聯物：
Figure 02_image001
其中： EpBA為根據[1]-[47]中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image003
其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image005
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽； W’為-NRe’ ， Re’ 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基； L’由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)- (B1’)；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs1 - (B2’)； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各自獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可電離基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
Figure 02_image007
其中q為1至5之整數； [59] 如[58]之免疫偶聯物，其中Ra 及Rb 二者均為H；且R5 為H或Me； [60] 如[58]或[59]之免疫偶聯物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽； [61] 如[58]-[60]中任一項之免疫偶聯物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly- Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:215)、ß-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:216)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:217)、Val-Arg、Arg- Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D- Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。更特定言之，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、或D-Ala-D-Ala； [62] 如[61]之免疫偶聯物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、或D-Ala-D-Ala； [63] 如[58]-[62]中任一項之免疫偶聯物，其中Q為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽； [64] 如[58]之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
其中 WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線
Figure 02_image019
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； [65] 如[58]-[64]中任一項之免疫偶聯物，其中N與C之間的雙線
Figure 02_image021
表示雙鍵，X不存在且Y為-H； [66] 如[58]-[64]中任一項之免疫偶聯物，其中N與C之間的雙線
Figure 02_image021
表示單鍵，X為H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽； [67] 如[66]之免疫偶聯物，其中Y為-SO3H、-SO3Na或-SO3K； [68] 如[66]之免疫偶聯物，其中Y為-SO3Na； [69] 一種由下式表示之免疫偶聯物：
Figure 02_image023
其中： EpBA為根據[1]-[47]中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL2 ； WL 為1至20之整數； CyL2 由下式表示：
Figure 02_image025
m’為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
Figure 02_image027
Figure 02_image029
其中q為1至5之整數； [70] 如[69]之免疫偶聯物，其中m’為1，且R1 及R2 二者均為H； [71] 如[69]之免疫偶聯物，其中m’為2，且R1 及R2 二者均為Me； [72] 如[69]之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
其中WL 為1至10之整數； [73] 如[69]之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image035
。 [74] 一種由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之免疫偶聯物：
Figure 02_image037
其中： WL 為1至10之整數； EpBA為EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3； [75] 如[74]之免疫偶聯物，其中該經分離之抗體或EpCAM-結合抗體片段包含分別具有序列SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:89之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； [76] 如[74]之免疫偶聯物，其中該經分離之抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:103及SEQ ID NO:140之重鏈及輕鏈； [77] 如[74]-[76]中任一項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分； [78] 如[77]之免疫偶聯物，其中該遮蔽部分具有胺基酸序列SEQ ID NO:155； [79] 如[77]或[78]之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其進一步包含SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169之可裂解部分； [80] 一種免疫偶聯物，其包含經由γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(GMBS)或N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS或sGMBS)連接子與由以下結構式表示之美登素化合物DM21L(亦稱為LDL-DM)偶合之EpBA
Figure 02_image039
其中EpBA為根據[1]-[47]中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體； [81] 如[80]之免疫偶聯物，其中該GMBS及磺基-GMBS (或sGMBS)連接子由下式表示：
Figure 02_image041
[82] 如[80]或[81]之免疫偶聯物，其係由下式表示：
Figure 02_image043
其中： EpBA經由Lys胺基連接至美登素化合物，其中q為1或10之整數； [83] 如[80]-[82]中任一項之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別包含序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3； [84] 如[83]之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別具有序列SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:89之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； [85] 如[84]之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別具有序列SEQ ID NO:103及SEQ ID NO:140之重鏈及輕鏈； [86] 如[83]-[85]中任一項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分； [87] 如[86]之免疫偶聯物，其中該遮蔽部分具有胺基酸序列SEQ ID NO:155； [88] 如[86]或[87]之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其進一步包含SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169之可裂解部分； [89] 如[58]-[88]中任一項之免疫偶聯物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽； [90] 一種醫藥組成物，其包含如[1]-[47]中任一項之抗體、抗原結合片段或可活化抗體及醫藥學上可接受之載劑； [91] 一種醫藥組成物，其包含如[58]-[88]中任一項之免疫偶聯物及醫藥學上可接受之載劑； [92] 一種殺滅癌細胞之方法，其包含使該癌細胞與有效量的如[1]-[47]中任一項之抗體、抗原結合片段或可活化抗體、如[58]-[88]中任一項之免疫偶聯物、或如[90]或[91]之醫藥組成物接觸； [93] 如[92]之方法，其中該癌細胞為上皮癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結直腸癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞或癌症幹細胞； [94] 如[92]之方法，其中該癌細胞為卵巢癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、胰腺癌細胞、或結直腸癌細胞； [95] 一種治療表現EpCAM之癌症之方法，該方法包含向有需要之受試者投與有效量的如[1]-[47]中任一項之抗體或抗原結合片段、如[58]-[88]中任一項之免疫偶聯物、或如[90]或[91]之醫藥組成物； [96] 根據[95]之治療方法，其中該癌症為上皮癌。 [97] 根據[95]之治療方法，其中該癌症為乳癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、小腸癌、或其轉移； [98] 根據[95]之治療方法，其中該癌症為卵巢癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌、或其轉移； [99] 如[97]之治療方法，其中該癌症為肺癌； [100] 如[99]之治療方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌； [101] 如[100]之治療方法，其中該非小細胞肺癌為非鱗狀非小細胞肺癌； [102] 如[95]之治療方法，其中該癌症為卵巢癌； [103] 如[95]之治療方法，其中該癌症為三陰性乳癌； [104] 如[95]之治療方法，其中該癌症為結直腸癌； [105] 如[95]之治療方法，其中該癌症為食道癌； [106] 如[95]之治療方法，其中該癌症為胃癌； [107] 如[95]之治療方法，其中該癌症為子宮癌； [108] 如[95]之治療方法，其中該癌症為胰腺癌； [109] 一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或其免疫偶聯物，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈及(ii)包含與以PTA-125342形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈； [110] 一種EpCAM可活化抗體、EpCAM-結合可活化抗體片段、或其免疫偶聯物，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈及(ii)包含與以PTA-125344形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈；及/或 [111] 一種EpCAM可活化抗體、EpCAM-結合可活化抗體片段、或其免疫偶聯物，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈及(ii)包含與以PTA-125345形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈。
本揭露提供特異性結合人類EpCAM之抗體及抗原結合抗體片段，包括可活化抗體(EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段之可活化形式)；以及包含該等抗體、抗體片段及可活化抗體之免疫偶聯物。已知EpCAM與上皮中之細胞-細胞黏附相關且參與細胞信號傳導、分化、增殖及遷移。EpCAM之過表現牽涉到疾病及病症諸如癌症之發病機制。例如，EpCAM在多種癌症類型中高度表現，該等癌症例如乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、頭頸癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌及腎癌、以及上皮來源之大多數癌症(及轉移)。EpCAM亦在腫瘤形成/癌症幹細胞中高度表現。所提供之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體及免疫偶聯物具有包括治療此等疾病及癌症之用途。定義
為了促進理解，下文定義了許多術語及短語。
如本文所用，除非另外指明，否則術語「上皮細胞黏附分子」或「EpCAM」係指任何天然人類EpCAM。該術語亦包括EpCAM之天然存在之變異體，例如剪接變異體、對偶基因變異體及同功型。EpCAM多肽可自多種來源分離，諸如自人類或獼猴組織或其他生物樣品分離，或藉由已知重組或合成方法製備。EpCAM亦稱為CD326、17-1A抗原、HEA125、MK-1、EGP-2、EGP314、EGP40、GA733-2、KSA、TACSTD1、TROP1、KS1/4、M4S1、DIAR5、MIC18、HNPCC8及ESA。EpCAM序列之實例包括但不限於NCBI參考號NP_002345.2 (胺基酸殘基24-314對應於成熟EpCAM，胺基酸24-265對應於成熟EpCAM之胞外區(SEQ ID NO:1))。成熟EpCAM之胞外區可進一步分成三個域：D1 (SEQ ID NO:1之胺基酸1-36 (SEQ ID NO:2))、D2 (SEQ ID NO:1之胺基酸43-112 (SEQ ID NO:3))及D3 (SEQ ID NO:1之胺基酸113-243 (SEQ ID NO:4))。
如本文所用，術語「抗體」及「抗原結合抗體片段」及其類似術語包括含有包含免疫球蛋白分子之至少一部分之分子的任何蛋白質或肽，諸如但不限於重鏈或輕鏈或其抗原結合部分之至少一個互補決定區(CDR)。此類抗體視情況進一步影響至少一種EpCAM活性，諸如但不限於此類抗體活體外、原位、活體內及/或離體調節、減少、增加、拮抗、促效、部分促效、部分拮抗、緩和、減輕、阻斷、抑制、消除及/或干擾至少一種EpCAM活性或結合。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段影響至少一種選自以下之經EpCAM-介導之活性或功能：配位體結合、受體信號傳導、膜締合、細胞遷移、細胞增殖、受體結合活性、RNA、DNA或蛋白質產生及/或合成。
抗體為由兩條相同輕鏈(LC)及兩條相同重鏈(HC)構成之異源四聚醣蛋白。通常，各輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鍵之數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈之間變化。各重鏈及輕鏈亦具有間隔的鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有可變區(VH)，接著許多恆定域。各輕鏈具有在一端處之可變區(VL)及在其另一端處之恆定域，該輕鏈之恆定域與該重鏈之第一恆定域比對且該輕鏈可變區與該重鏈之可變區比對。任何脊椎動物物種之抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種明顯不同類型(亦即κ及λ)之一者。免疫球蛋白可根據重鏈恆定域胺基酸序列歸為五種主要類別，亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgA及IgG進一步細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
術語「抗體」亦包括片段、指定部分及其變異體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或指定片段或其部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及抗原(例如EpCAM)-結合抗體片段。功能片段包括結合至單獨的或與其他抗原組合之哺乳動物抗原諸如EpCAM的抗原結合片段。例如，本揭露包括能夠結合至抗原或其部分之抗體片段，包括但不限於Fab (例如藉由木瓜酶消化)、Fab' (例如藉由胃蛋白酶消化及部分還原)及F(ab')2 (例如藉由胃蛋白酶消化)、facb (例如藉由血纖維蛋白溶酶消化)、pFc' (例如藉由胃蛋白酶或血纖維蛋白溶酶消化)、Fd (例如藉由胃蛋白酶消化、部分還原及再凝集)、Fv或scFv (例如藉由分子生物學技術)片段(參見例如Colligan, Immunology)。
此類片段可藉由酶促裂解、合成或重組技術產生，如此項技術中已知及/或如本文所揭露。抗體亦可使用其中一或多個終止密碼子已引入天然終止位點上游的抗體基因以多種截短形式產生。例如，編碼F(ab')2重鏈部分之組合基因可經設計以包括編碼重鏈之CH1域及/或鉸鏈區之DNA序列。抗體之各個部分可藉由習知技術化學連接在一起，或可使用遺傳工程化技術製備成連續蛋白。
術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分，通常為完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈(scFv)及Fv片段、雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單一Fab臂「單臂」抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體等等。
抗體片段包括含有包含以下各物之分子的任何蛋白質或肽：免疫球蛋白分子之至少一部分，諸如但不限於重鏈或輕鏈或其配位體結合部分之至少一個互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、框架區、或其任何部分，或者抗原或抗原受體或結合蛋白之至少一部分，其可併入本文所提供之EpCAM抗體中。
術語「可變」係指如下事實：抗體之可變區之某些部分的序列在抗體之間廣泛不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，變異性未均勻分佈遍及抗體之可變區。變異性集中於輕鏈及重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)或高變區的三個區段中。可變區之更高度保守部分稱為框架(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變區各自包含主要採用β-折疊構型之四個FR區，藉由三個CDR連接，由此形成環連接，且在一些情況下形成β-折疊結構之一部分。在各鏈中之CDR藉由FR區緊密保持在一起，且與來自另一條鏈之CDR一起，促使形成抗體之抗原結合位點。恆定域不直接牽涉於抗體與抗原之結合，但表現出各種效應子功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。存在至少兩種用於判定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列變異性之方法(亦即，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.))；及(2)基於抗原-抗體複合物之晶體學研究之方法(Al-lazikani等人, J. Molec.Biol.273:927-948 (1997))。此外，在此項技術中有時使用這兩種方法之組合來判定CDR。
當提及可變區中之殘基(輕鏈之大致殘基1-107及重鏈之大致殘基1-113)時通常使用Kabat編號體系(例如Kabat等人, Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))。
根據Kabat進行之胺基酸位置編號係指Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中用於抗體編譯之重鏈可變區或輕鏈可變區之編號體系。使用此編號體系，實際線性胺基酸序列可含有與可變區之FR或CDR之縮短或向其中之插入相對應的較少或額外胺基酸。例如，重鏈可變區可包括H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列中具有同源性之區與「標準」Kabat編號序列比對來判定給定抗體中殘基之Kabat編號。Chothia則係指結構環之位置(Chothia等人, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端視環之長度在H32與H34之間變化(此係由於Kabat編號方案將插入放置於H35A及H35B處；若35A或35B皆不存在，則環結束於32處；若僅35A存在，則環結束於33處；若35A及35B皆存在，則環結束於34處)。AbM超變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。
術語「EpCAM抗體」、「EpCAM抗體」、「特異性結合至EpCAM之抗體」、「EpCAM-結合抗體片段」、「特異性結合EpCAM之抗體片段」係指能夠以足夠親和力結合EpCAM以使得抗體適用作靶向EpCAM之診斷劑及/或治療劑的抗體。EpCAM抗體與不相關、非-EpCAM蛋白之結合程度小於該抗體與EpCAM之結合的約10%，如例如藉由放射免疫測定(RIA)所量測。
Figure 02_image045
術語「表位」係指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定子。表位通常由分子之化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。當抗原為多肽時，表位可由藉由蛋白質三級折疊鄰接之連續胺基酸及非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之表位通常在蛋白質變性時保留，而藉由三級折疊形成之表位通常在蛋白質變性時喪失。表位通常包括呈獨特空間構形之至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。
「阻斷」抗體為抑制或減少其所結合之抗原諸如EpCAM之生物活性的抗體。較佳之阻斷抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。理想地，生物活性減小了10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。在一實施例中，阻斷抗體使EpCAM相關酪胺酸激酶活性減小10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
「經分離之」抗體為自其天然環境分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組分為將干擾抗體之診斷或治療用途的材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳態樣中，抗體將(1)經純化至大於95重量%抗體，如藉由例如Lowry方法所判定，且最佳大於99重量%，(2)藉由使用旋杯定序儀純化至足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或者(3)藉由在還原性或非還原性條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色進行SDS-PAGE (十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)純化至均勻。經分離之抗體包括重組細胞內之原位EpCAM抗體，因為抗體之天然環境的至少一種組分將不存在。然而通常，經分離之抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
「人類抗體」係指人類產生之抗體或使用此項技術中已知之任何技術製成的具有與人類產生之抗體相對應之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、可活化抗體、抗原(例如人類或獼猴EpCAM)-結合抗體片段及/或包含至少一種人類重鏈及/或輕鏈多肽之抗體，諸如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
如本文所用，術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之序列來源於兩種或更多種物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區對應於來源於一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所要特異性、親和力及能力的抗體之可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體中之序列同源，以便避免於該物種中引發免疫反應。
如本文所用，術語「人源化抗體」係指非人類(例如鼠類)抗體之形式，其為含有微小非人類(例如鼠類)序列之特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或抗原結合抗體片段。通常，人源化抗體為人類免疫球蛋白，其中來自互補決定區(CDR)之殘基經來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR的具有所要特異性、親和力及能力之殘基置換(Jones等人, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239:1534-1536 (1988))。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基經來自非人類物種之抗體中具有所要特異性、親和力及能力之對應殘基置換。人源化抗體可進一步藉由取代Fv框架區及/或經置換之非人類殘基內之額外殘基來修飾以改進並優化抗體特異性、親和力及/或能力。一般而言，抗體將包含至少一個且通常兩個或三個可變區中之實質上全部，該等可變區含有全部或實質上全部與非人類免疫球蛋白相對應之CDR區，而全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白共有序列之彼等者。抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或恆定域(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部分。用於生成人源化抗體之方法之實例描述於美國專利第5,225,539號中。
抗體「效應子功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而改變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)。
「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應子功能之白血球。在某些態樣中，該等細胞表現至少一種FcyRIII且執行ADCC或ADCP效應子功能。介導ADCC或ADCP之人類白血球之實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性球。效應細胞可自天然來源例如血液中分離。
如本文所用，術語「Fc區」包括包含抗體之恆定區且排除免疫球蛋白域之第一恆定區的多肽。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域、以及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域、以及此等域N端之柔性鉸鏈。對於IgA及IgM而言，Fc可包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3 (Cγ2及Cγ3)及介於Cγ1 (Cγ1)與Cγ2 (Cγ2)之間的鉸鏈。儘管Fc區之邊界可改變，但人類IgG重鏈Fc區通常經限定為包含其羧基端之殘基C226或P230，其中編號係根據Kabat等人, (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)中之EU索引。「如Kabat中列出之EU索引」係指如Kabat等人，同上中所述之人類IgG1 EU抗體之殘基編號。Fc可係指分離的此區域、或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白背景下之此區域。Fc變異體蛋白可為抗體、Fc融合物、或包含Fc區之任何蛋白或蛋白域。包含變異Fc區之蛋白為特別較佳的，其為Fc之非天然存在之變異體。在許多Fc位置處觀測到多形性，該等位置包括但不限於Kabat 270、272、312、315、356及358，且因此可在呈現序列與現有技術序列之間存在輕微差異，且熟悉此項技藝者基於本發明教授內容將會理解。
如本文所用，術語「偶聯物」、「免疫偶聯物」、「ADC」、或「AADC」係指連接至細胞結合劑(亦即EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體)且由以下通式定義之化合物或其衍生物：C-L-A，其中C=化合物，L=連接子，且A= EpCAM-結合劑(EpBA) (例如EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，如本文所揭露)。在一些實施例中，亦可以相同方式使用以下通式：D-L-A，其中D=藥物，L=連接子且A=細胞結合劑(例如EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體)。
「連接子」為能夠將化合物(通常藥物，諸如美登素或吲哚啉并并苯二氮平化合物)以穩定共價方式連接至細胞結合劑諸如抗EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段之任何化學部分。在化合物或抗體保持活性之條件下，連接子易受或實質上抵抗酸誘導之裂解、光誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解。適合的連接子為此項技術中熟知的且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接子亦包括肽連接子及帶電連接子及其親水形式，如本文所揭露及此項技術已知的。
除非另外指示，否則如本文所用之「異常細胞增殖」係指獨立於正常調控機制(例如喪失接觸抑制)之細胞生長。這包括例如以下之異常生長：(1)藉由表現突變的酪胺酸激酶或過表現受體酪胺酸激酶而增殖之腫瘤細胞(腫瘤)；(2)出現異常酪胺酸激酶活化之其他增殖性疾病的良性及惡性細胞；(3)藉由受體酪胺酸激酶而增殖之任何腫瘤；(4)藉由異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化而增殖之任何腫瘤；(5)出現異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化之其他增殖性疾病的良性及惡性細胞；以及(6)其他增殖性疾病之良性及惡性細胞。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中特徵通常為不受調控之細胞生長的生理狀況。「腫瘤」包含一或多個癌細胞。癌症之實例包括但不限於癌、真性瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴樣惡性腫瘤。如本文所定義，術語「癌症」或「癌性」包括「癌前」病狀，若未經治療，則該病狀可演變為癌性病狀。在具體實施例中，癌症為上皮癌。上皮癌之實例包括乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、頭頸癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌及腎癌。可用所提供之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體、或免疫偶聯物診斷或治療之額外癌症包括食道癌、氣管癌、腦癌、癌、膽管細胞癌、子宮內膜癌、宮頸癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、睾丸癌、直腸癌、皮膚癌(黑素瘤)、小腸癌、膽囊癌、膽管癌、唾液腺癌。在一些實施例中，癌症為卵巢癌、子宮癌、胃癌、前列腺癌或結直腸癌。
術語「癌細胞」、「腫瘤細胞」及語法等同詞係指源自腫瘤或癌前病變之總細胞群，包括包含腫瘤細胞群塊之非致瘤細胞及致瘤幹細胞(癌症幹細胞)。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防一或多種細胞功能及/或造成細胞死亡之物質。
如本文所用，「治療」係指試圖改變正治療之個體或細胞之天然病程之臨床干預，且可執行以進行預防或在臨床病理過程期間執行。所要治療效果包括預防疾病之發生或復發、減輕症狀、削弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、減小疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本文所提供之方法及組成物適用於試圖延緩疾病或病症之發展。
術語諸如「治療(treating/treatment/to treat)」或「緩解(alleviating/to alleviate)」係指：1)治癒、減慢、減輕所診斷病理病狀或病症之症狀及/或停止其進展之治療性措施；以及2)預防及/或減慢所靶向病理病狀或病症之發展的預防性措施。因此，需要治療之彼等者包括已患有病症之彼等者；易於患上病症之彼等者；及病症有待預防之彼等者。在某些實施例中，若患者顯示如下一或多者，則根據本文所提供之方法成功「治療」受試者之癌症：癌細胞數目減少或癌細胞完全不存在；腫瘤尺寸減小；抑制或不存在癌細胞浸潤至周邊器官中，包括例如癌症擴散至軟組織及骨；抑制或不存在腫瘤轉移；抑制或不存在腫瘤生長；減輕與特定癌症相關之一或多種症狀；發病率及死亡率降低；生活品質提高；腫瘤之致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力減小；腫瘤中癌症幹細胞之數目或頻率減小；致瘤細胞分化成非致瘤狀態；或效應之一些組合。
如本文所揭露之抗體之「有效量」為足以執行特別陳述目的之量。「治療有效量」係指以所需劑量且持續所需時間有效實現所要治療結果之量。治療劑(例如偶聯物或免疫偶聯物)之「治療有效量」可根據各種因素而變化，該等因素諸如疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及抗體在個體中引發所要反應之能力。治療有效量亦為治療有益作用超過治療劑之任何毒性或有害作用之量。
「治療劑」包括生物劑，諸如抗體、肽、蛋白質、酶、化學治療劑、或偶聯物或免疫偶聯物。
術語「受試者」、「個體」、「動物」、「患者」及「哺乳動物」係指需要診斷、預後或治療之任何受試者，特別是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括但不限於人類、非人類靈長類、家養動物、農場動物、齧齒動物及其類似物，其為特定治療之接受者。
如本文可互換使用，術語「多核苷酸」或「核酸」係指具有任何長度之核苷酸的聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後，對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可由非核苷酸組分間隔。多核苷酸可在聚合之後進一步經修飾，諸如藉由與標記組分偶聯。其他類型之修飾包括例如「帽」，用類似物取代一或多個天然存在之核苷酸，核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、亞磷醯胺、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之彼等者，含有側基部分之彼等者，諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等)，具有嵌入劑之彼等者(例如吖啶、補骨脂素等)，含有螯合劑之彼等者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)，含有烷化劑之彼等者，具有經修飾之鍵之彼等者(例如α變旋異構核酸等)，以及未經修飾形式之多核苷酸。另外，通常存在於糖中之任何羥基均可例如經膦酸酯基團、磷酸酯基團置換，藉由標準保護基保護，或經活化以製備額外核苷酸之額外鍵，或可偶聯至固體支持物。5'端及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機加帽基團部分取代。其他羥基亦可經衍生化為標準保護基。多核苷酸亦可含有此項技術中通常已知之核糖或脫氧核糖之類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構體糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵可由替代性連接基團置換。該等替代性連接基團包括但不限於如下實施例，其中磷酸酯經P(O)S (「硫代酯」)、P(S)S (「二硫代酯」)、"(O)NR2 (「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲乙縮醛(formacetal)」)置換，其中各R或R』獨立地為H或經取代或未經取代之視情況含有醚(--O--)鍵之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烴基(araldyl)。並非多核苷酸中之所有鍵均需要一致。先前描述適用於本文中所提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
術語「載體」意指能夠遞送且視情況在宿主細胞中表現一或多個感興趣之基因或序列的構築體。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏接質體或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑相關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞諸如生產細胞。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指代具有任何長度之胺基酸的聚合物。該聚合物可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可由非胺基酸間隔。該等術語亦涵蓋已天然地或藉由幹預修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分偶聯。在該定義內亦包括，例如，含有胺基酸之一或多種類似物(包括，例如，非天然胺基酸，等等)以及本領域中已知之其他修飾的多肽。
如此項技術中已知，術語「一致」或「一致性」百分比為兩個多核苷酸或兩個多肽之間的關係量度，如藉由比較其序列所判定。相對於一序列之一致性或相似性在本文中定義為在比對該等序列及引入間隔(若需要的話)以實現最大序列一致性百分比之後在候選序列中與EpCAM抗體殘基一致(亦即相同殘基)或相似(亦即基於共同側鏈特性之相同組的胺基酸殘基，參見下文)之胺基酸殘基百分比。在可變區之外無抗體序列之N-端、C-端或內部延伸、缺失或插入應理解為影響序列一致性或相似性。一般而言，待比較之兩個序列經比對以得到該等序列之間的最大相關性。檢查兩個序列之比對且將給出所判定之兩個序列之間的確切胺基酸或核苷酸對應性之位置數目除以總比對長度且乘以100，以得到一致性數值%。此一致性數值%可在待比較之整個序列長度(這尤其適用於具有相同或極相似長度之序列且高度同源)上或在較短限定長度(這更適用於具有不同長度之序列或具有較低同源性水準)上判定。同樣，可基於一致及相似殘基二者之存在以類似方式判定相似性百分比。
一致性百分比可使用序列比較軟體或算法或藉由目視檢查量測。此項技術中已知之各種算法及軟體可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對。序列比對算法之一個此類非限制性實例為Karlin等人, Proc.Natl.Acad.Sci.87:2264-2268 (1990)所述之算法，如Karlin等人, Proc.Natl.Acad.Sci.90:5873-5877 (1993)中所修訂，且併入NBLAST及XBLAST程式(Altschul等人, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1991))中。在某些實施例中，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人, Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1997)所述。BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul等人, Meth.Enzym.266:460-480 (1996))、ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或Megalign (DNASTAR®)為可用於比對序列之額外可公開獲得之軟體程式。在某些實施例中，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比係使用GCG軟體中之GAP程式判定(例如使用NWSgapdna.CMP矩陣及間隙權重40、50、60、70、或90及長度權重1、2、3、4、5、或6)。在某些替代性實施例中，GCG軟體包中之GAP程式併入有Needleman及Wunsch(J. Mol.Biol.(48):444-453 (1970))之算法，該程式可用於判定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比(例如使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及間隙權重16、14、12、10、8、6、或4及長度權重1、2、3、4、5)。或者，在某些實施例中，核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比係使用Myers及Miller (CABIOS 4:11-17 (1989))之算法判定。例如，一致性百分比可使用ALIGN程式(2.0版)且使用具有殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4之PAM120判定。藉由特定比對軟體獲得之最大比對的適當參數可由熟悉此項技藝者判定。在某些實施例中，使用比對軟體之默認參數。在某些實施例中，第一胺基酸序列與第二序列胺基酸之一致性百分比「X」經計算為100 x (Y/Z)，其中Y為在第一序列與第二序列之比對(如藉由目視檢查或特定序列比對程式進行比對)中經評定為一致配對之胺基酸殘基數目且Z為第二序列中之總殘基數目。若第一序列之長度長於第二序列，則第一序列與第二序列之一致性百分比將大於第二序列與第一序列之一致性百分比。
作為非限制性實例，在某些實施例中，任何特定多核苷酸是否與參考序列具有某一序列一致性百分比(例如具有至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性及在一些實施例中至少95%、96%、97%、98%、或99%一致性)可使用Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)判定。Bestfit使用Smith及Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)中之局部同源性算法，以找出兩個序列之間的最佳同源性區段。當使用Bestfit或任何其他序列比對程式來判定特定序列例如是否與如本文所提供之參考序列具有95%一致性時，設置參數，以便計算參考核苷酸序列全長上之一致性百分比且允許參考序列中總核苷酸數目高達5%之同源性的間隙。
「保守胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有相似側鏈之另一胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基家族，包括例如鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如，以酪胺酸取代苯丙胺酸為保守取代。在一些實施例中，本文所提供之多肽及抗體序列中之保守取代並未消除含有胺基酸序列之多肽或抗體與該多肽或抗體所結合之抗原的結合。鑑別不消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守取代之方法為此項技術中熟知的(參見，例如Brummell等人, Biochem.32:1180-1187 (1993)；Kobayashi等人, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；及Burks等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417 (1997))。
如本文所用，「烷基」係指具有1至20個碳原子之飽和直鏈或支鏈單價烴基。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2)、2 丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2 戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3 二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。較佳，烷基具有1至10個碳原子。更佳，烷基具有1至4個碳原子。
基團中之碳原子數目在本文中可由前綴「Cx-xx」指定，其中x及xx為整數。例如，「C1-4烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。
術語「化合物」或「細胞毒性化合物」或「細胞毒性劑」可互換使用。其旨在包括結構或式或其任何衍生物已在本文中揭露之化合物或者以引用方式併入之結構或式或其任何衍生物。該術語亦包括本文所揭露之所有式之化合物的立體異構物、幾何異構物、互變異構物、溶劑合物、代謝物及鹽(例如醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括前述任一者之任何溶劑合物、水合物及同質異晶物。在某些實施例中，本文所提供之「立體異構物」、「幾何異構物」、「互變異構物」、「溶劑合物」、「代謝物」、「鹽」、「偶聯物」、「偶聯物鹽」、「溶劑合物」、「水合物」或「同質異晶物」之特定陳述在其他所揭露之實施例中不應解釋為該等形式之預期省略，其中術語「化合物」在未陳述該等其他形式之情況下使用。
術語「亞胺反應性試劑」係指能夠與亞胺基團反應之試劑。亞胺反應性試劑之實例包括但不限於亞硫酸鹽(H2SO3、H2SO2或HSO3-、SO32-或HSO2-與陽離子形成之鹽)、偏亞硫酸氫鹽(H2S2O5或S2O52-與陽離子形成之鹽)、一硫代磷酸鹽、二硫代磷酸鹽、三硫代磷酸鹽及四硫代磷酸鹽(PO3SH3、PO2S2H3、POS3H3、PS4H3或PO3S3-、PO2S23-、POS33-或PS43-與陽離子形成之鹽)、硫代磷酸酯((RiO)2PS(ORi)、RiSH、RiSOH、RiSO2H、RiSO3H)、各種胺(羥基胺(例如NH2OH)、肼(例如NH2NH2)、NH2O-Ri、Ri’NH-Ri、NH2-Ri)、NH2-CO-NH2、NH2-C(=S)-NH2、硫代硫酸鹽(H2S2O3或S2O32-與陽離子形成之鹽)、二硫亞磺酸鹽(H2S2O4或S2O42-與陽離子形成之鹽)、二硫代磷酸鹽(P(=S)(ORk)(SH)(OH)或其與陽離子形成之鹽)、羥胺酸(RkC(=O)NHOH或其與陽離子形成之鹽)、醯肼(RkCONHNH2)、甲醛次硫酸鹽(HOCH2SO2H或HOCH2SO2-與陽離子形成之鹽，諸如HOCH2SO2-Na+)、糖化核苷酸(諸如GDP-甘露糖)、氟達拉濱或其混合物，其中Ri及Ri’各自獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈或支鏈烷基且經至少一個選自N(Rj)2、-CO2H、SO3H及PO3H之取代基取代；Ri及Ri’可進一步視情況經本文所揭露之烷基的取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或支鏈烷基；且Rk為具有1至10個碳原子之直鏈、支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜環基或雜芳基(較佳，Rk為具有1至4個碳原子之直鏈或支鏈烷基；更佳，Rk為甲基、乙基或丙基)。較佳地，陽離子為一價陽離子，諸如Na+或K+。較佳地，亞胺反應性試劑選自亞硫酸鹽、羥基胺、脲及肼。更佳地，亞胺反應性試劑為NaHSO3或KHSO3。
術語「陽離子」係指具有正電荷之離子。陽離子可為單價(例如 Na+、K+、NH4+等)、二價(例如Ca2+、Mg2+等)或多價(例如Al3+等)。較佳地，陽離子為單價。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受之鹽」係指本文所提供之化合物之醫藥學上可接受之有機鹽或無機鹽。示範性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、柳酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、帕莫酸鹽(pamoate) (亦即，1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘酸鹽))、鹼金屬(例如，鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如，鎂)鹽及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一分子，諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子、或其他相對離子。該相對離子可為使母體化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽之結構中可具有一個以上帶電原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的情形可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
若本文所提供之化合物為鹼，則可藉由此項技術中可用之任何適合方法製備所要醫藥學上可接受之鹽，該方法例如用無機酸處理游離鹼，該無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸及其類似物，或者用有機酸處理游離鹼，該有機酸諸如乙酸、順丁烯二酸、琥珀酸、扁桃酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、柳酸、吡喃糖苷酸(諸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥基酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳香酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺酸或乙磺酸)或其類似物。
若本文所提供之化合物為酸，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由任何適合方法製備，該方法例如用無機鹼或有機鹼處理游離酸，該鹼諸如胺(一級胺、二級胺或三級胺)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或其類似物。適合鹽之說明性實例包括但不限於衍生自胺基酸(諸如甘胺酸及精胺酸)、氨、一級胺、二級胺及三級胺、及環狀胺(諸如哌啶、嗎啉及哌嗪)之有機鹽，以及衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。
如本文所用，術語「溶劑合物」意指一種化合物，其進一步包括化學計量或非化學計量之量的藉由非共價分子間力結合之溶劑，諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺、二氯甲烷、2-丙醇或其類似物。化合物之溶劑合物或水合物易於藉由將至少一莫耳當量之羥基溶劑(諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)添加至化合物中以造成亞胺部分之溶劑化或水合來製備。
「代謝物」或「分解代謝物」為所指定之化合物、其衍生物、或其偶聯物、或其鹽通過在體內代謝或分解代謝產生之產物。化合物、其衍生物、或其偶聯物之代謝物可使用此項技術中已知之常規技術鑑別且使用諸如本文揭露之彼等測試判定其活性。此類產物可由所投與化合物之氧化、羥基化、還原、水解、醯胺化、脫醯胺化、酯化、脫酯化、酶促裂解及其類似作用而產生。因此，本揭露包括本文所揭露之經EpCAM組成物之化合物、其衍生物、或其偶聯物之代謝物，包括藉由一個過程產生之化合物、其衍生物、或其偶聯物，該過程包含使所揭露之EpCAM化合物、其衍生物、或其偶聯物與哺乳動物接觸持續足以產生其代謝產物之時間。
片語「醫藥學上可接受之」表示物質或組成物必須為化學上及/或毒物學上與構成調配物之其他成分及/或與用其治療之哺乳動物相容的。
術語「保護基」或「保護部分」係指通常用於在與化合物、其衍生物、或其偶聯物上之其他官能基反應時阻斷或防護特定官能性之取代基。例如，「胺保護基」或「胺基保護部分」為連接至胺基以阻斷或保護化合物中之胺基官能性的取代基。此類基團為此項技術中熟知的(參見例如P. Wuts及T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis,第7章, J. Wiley & Sons, NJ)且例示為胺基甲酸酯(諸如胺基甲酸甲酯及胺基甲酸乙酯、FMOC、經取代之胺基甲酸乙酯、藉由1,6-β-消除(亦稱為「自我犧牲型」)裂解之胺基甲酸酯)、脲、醯胺、肽、烷基及芳基衍生物。適合之胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)。關於保護基及其用途之一般描述，參見P. G.M.Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一實施例中，胺基酸由NH2-C(Raa’Raa)- C(=O)OH表示，其中Raa及Raa’各自獨立地為H、具有1至10個碳原子之視情況經取代之直鏈、支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜芳基或雜環基，或者Raa及N-端氮原子可一起形成雜環(例如在脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基」係指當一個氫原子自胺基酸之胺及/或羧基端移除時得到之對應殘基，諸如-NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-。
術語「肽」係指由肽(醯胺)鍵連接之胺基酸單體的短鏈。在一些實施例中，肽含有2至20個胺基酸殘基。在其他實施例中，肽含有2至10個胺基酸殘基。在又其他實施例中，肽含有2至5個胺基酸殘基。如本文所用，當肽為細胞毒性劑或本文所揭露由特定胺基酸序列表示之連接子之一部分時，該肽可在兩個方向上連接至細胞毒性劑或連接子之其餘部分。例如，二肽X1-X2包括X1-X2及X2-X1。類似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3及X3-X2-X1，且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4及X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3及X4表示胺基酸殘基。
術語「反應性酯基」係指可易於與胺基反應以形成醯胺鍵之酯基。示範性反應性酯基包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺酯、N-羥基磺基-琥珀醯亞胺酯、對硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯及其衍生物，其中該等衍生物促成醯胺鍵形成。在某些實施例中，反應性酯基為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N羥基磺基-琥珀醯亞胺酯。
術語「胺反應基」係指可與胺基反應以形成共價鍵之基團。示範性胺反應基包括但不限於反應性酯基、醯基鹵化物、磺醯鹵化物、亞胺酸酯、或反應性硫酯基。在某些實施例中，胺反應基為反應性酯基。在一實施例中，胺反應基為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N羥基磺基-琥珀醯亞胺酯。
術語「硫醇反應基」係指可與硫醇(-SH)基團反應以形成共價鍵之基團。示範性硫醇反應基包括但不限於順丁烯二醯亞胺、鹵基乙醯基、鹵基乙醯胺(aloacetamide)、乙烯碸、乙烯基磺醯胺或乙烯基吡啶。在一實施例中，硫醇反應基為順丁烯二醯亞胺。
如本揭露及申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一個/種(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。
術語「及/或」在本文中使用時應理解為二或更多個指定特性或組分各自與另一者或不與另一者之特定揭露。因此，如在本文於片語諸如「A及/或B」中所用之術語「及/或」時旨在包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)以及「B」(單獨)。同樣，如片語諸如「A、B及/或C」中所用之短語「及/或」旨在包括以下態樣之各者：A、B及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
每當本文中以詞語「包含」揭露任何實施例時，亦提供以「由...組成」及/或「實質上由...組成」描述之其他類似實施例。EpCAM 抗體及 EpCAM- 結合抗體片段
提供特異性結合人類EpCAM之蛋白質。在一些實施例中，該等蛋白質在本文中稱為「EpCAM-結合劑」或「EpBA」
在額外實施例中，EpCAM-結合劑為EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，EpBA為全長EpCAM抗體(亦即特異性結合EpCAM之全長抗體)。在一些實施例中，EpCAM抗體為單株抗體。在一些實施例中，EpCAM抗體為重組抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、或其EpCAM-結合抗體片段。在一些實施例中，EpCAM抗體特異性結合人類EpCAM。在其他實施例中，EpCAM抗體特異性結合人類EpCAM及獼猴EpCAM。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段為小鼠、其他齧齒動物、嵌合、人源化或完全人類單株抗體。
在一些實施例中，EpCAM抗體為EpCAM-結合抗體片段。在額外實施例中，EpCAM-結合抗體片段為：Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、雙鏈抗體、或單鏈抗體分子。在額外態樣中，EpCAM抗體為EpCAM-結合抗體片段，為Fd、單鏈Fv (scFv)、二硫鍵連接之Fv、V-NAR域、IgNar、胞內抗體、IgGΔCH2、微型抗體、F(ab')3 、scAb、dAb、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單域重鏈抗體、單域輕鏈抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 、scFv-Fc或雙-scFv。
本文所提供之EpCAM抗體及EpCAM-結合抗體片段視情況以廣泛範圍之親和力(KD)結合EpCAM (例如人類EpCAM及/或鼠類EpCAM)。在一較佳實施例中，抗體以高親和力結合人類EpCAM。例如，人類或人類工程化或人源化或表面重構化mAb可以等於或小於約10-7 M之KD結合人類抗原，諸如但不限於0.1-9.9 (或其間之任何範圍或值) x 10-7 、10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、或10-12 、或其間之任何範圍或值，如藉由流動式細胞測量術基礎測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、表面電漿子共振(SPR)或KinExA®方法使用標準操作程序所判定。在一些實施例中，EpCAM抗體以約10-9 M或更小，更確切而言約10-9 至10-10 M之Kd結合。
抗體或抗體片段對EpCAM之親和力或親合力可以實驗方式使用此項技術中已知之任何適合方法，例如流動式細胞測量術、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、或放射性免疫測定(RIA)、或動力學(例如 BIACORE™分析)，使用標準操作程序來判定。可常規採用直接結合測定以及競爭性結合測定形式。(參見例如Berzofsky等人, "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E.編, Raven Press: New York, N.Y.(1984)；Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y.(1992)；以及本文所揭露之方法。若在不同條件(例如鹽濃度、pH、溫度)下量測，則特定抗體-EpCAM相互作用之經量測之親和力可改變。因此，較佳使用抗體及EpCAM之標準化溶液及標準化緩衝液(如此項技術中已知的且諸如本文中所揭露之緩衝液)進行親和力及其他EpCAM-結合參數(例如KD或Kd、K結合、K解離)之量測。
在一實施例中，使用流動式細胞測量術對在表面上表現EpCAM抗原之細胞進行結合測定。例如，將此類EpCAM-陽性細胞與不同濃度之EpCAM抗體在100 μL FACS緩衝液(補充有2%正常山羊血清之RPMI-1640培養基)中以1 x105 個細胞/樣品溫育。接著，使細胞成團，洗滌，且與100 μL經FITC-偶聯之山羊抗小鼠IgG-抗體(諸如可獲得自Jackson ImmunoResearch)於FACS緩衝液中一起溫育1 h。使細胞再次成團，用FACS緩衝液洗滌，且將其重懸浮於200 μL含有1%甲醛之PBS中。例如，使用FACSCalibur™流動式細胞測量儀使用HTS多孔取樣器採集樣品且使用CellQuest® Pro (全部均來自BD Biosciences, San Diego, US)分析。對於各樣品，輸出FL1 (MFI)之平均螢光強度且以半對數圖針對抗體濃度作圖以生成結合曲線。將S形劑量反應曲線對結合曲線擬合且使用諸如具有默認參數之GraphPad Prism v4 (GraphPad軟體, San Diego, CA)的程式計算EC50 值。EC50 值可用作各抗體之表觀解離常數「Kd」或「KD」之量度。
在某些實施例中，EpCAM抗體經修飾以改變其對EpCAM及/或EpCAM抗原片段之結合親和力。結合特性可藉由多種活體外測定方法且採用此項技術中已知之標準操作程序來判定，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA))、或動力學(例如BIACORE™分析)。
在一實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以如下解離常數或KD或Kd (k解離/k結合)特異性結合人類或獼猴EpCAM及/或EpCAM抗原片段：小於10-5 M、或小於10-6 M、或小於10-7 M、或小於10-8 M、或小於10-9 M、或小於10-10 M、或小於10-11 M、或小於10-12 M、或小於10-13 M。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以如下KD特異性結合人類或獼猴EpCAM及/或EpCAM抗原片段：1.0 x 10-9 M或更小、2.0 x 10-9 M或更小、3.0 x 10-9 M或更小、4.0 x 10-9 M或更小、5.0 x 10-9 M或更小、6.0 x 10-9 M或更小、7.0 x 10-9 M或更小、8.0 x 10-9 M或更小、或9.0 x 10-9 M或更小。在某些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以3.0 x 10-9 M或更小之KD結合至人類及獼猴EpCAM及/或EpCAM抗原片段。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以約0.4 x 10-9 M之KD結合至人類EpCAM。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以約0.8 x 10-9 M之KD結合至人類EpCAM。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以約0.8 x 10-9 M之KD結合至獼猴EpCAM。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以約2.2 x 10-9 M之KD結合至獼猴EpCAM。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段以約2.8 x 10-9 M之KD結合至獼猴EpCAM。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段特異性結合至人類EpCAM之胞外區(SEQ ID NO:1)內之表位。人類EpCAM之胞外區可進一步分成三個不同域：D1 (SEQ ID NO:2)、D2 (SEQ ID NO:3)及D3 (SEQ ID NO:4)。在某些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段特異性結合至人類EpCAM之第一胞外域(D1)內之表位。
在一實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有：包含X1 YX3 X4 H之VH-CDR1，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)；包含WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G之VH-CDR2，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)；及包含X1 GX3 X4 FAY之VH-CDR3，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)。
在額外實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含有：包含RSSX4 SLLHSX10 GX12 TYLX16 之輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之輕鏈VL-CDR2；及包含X1 QX3 LELPX8 T之VL-CDR3，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含有：包含序列SEQ ID NO:13之重鏈CDR1 (VH-CDR1)；包含序列SEQ ID NO:14之重鏈CDR2 (VH-CDR2)；包含序列SEQ ID NO:15之重鏈CDR3 (VH-CDR3)；包含序列SEQ ID NO:42之輕鏈CDR1 (VL-CDR1)；包含序列SEQ ID NO:40之輕鏈CDR2 (VL-CDR2)；及包含序列SEQ ID NO:41之輕鏈CDR3 (VL-CDR3)。
在一些實施例中，VH-CDR1包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，VH-CDR3包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)。在一些實施例中，VL-CDR3包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含：包含序列SEQ ID NO:13之重鏈CDR1 (VH-CDR1)；包含序列SEQ ID NO:14之重鏈CDR2 (VH-CDR2)；包含序列SEQ ID NO:15之重鏈CDR3 (VH-CDR3)；包含序列SEQ ID NO:42之輕鏈CDR1 (VL-CDR1)；包含序列SEQ ID NO:40之輕鏈CDR2 (VL-CDR2)；及包含序列SEQ ID NO:41之輕鏈CDR3 (VL-CDR3)。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含一組互補決定區(CDR)：重鏈可變區(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、輕鏈可變區(VL) CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3，其中重鏈CDR揭露於表2中。
Figure 02_image047
Figure 02_image049
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含表2中第一列之重鏈CDR。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含選自SEQ ID NO: 13及16-25之VH-CDR1；選自SEQ ID NO:14及26-29之VH-CDR2；及選自SEQ ID NO:15及30-38之VH-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:13之VH-CDR1；SEQ ID NO:14之VH-CDR2；及SEQ ID NO:15之VH-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:13之VH-CDR1；SEQ ID NO:26之VH-CDR2；及SEQ ID NO:15之VH-CDR3。
在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，其包含有：包含NYYIH (SEQ ID NO:13)之VH-CDR1或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；包含WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)之VH-CDR2或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；及包含DGPWFAY (SEQ ID NO:15)之重鏈CDR3或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體。
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:22之VH-CDR1；SEQ ID NO:14之VH-CDR2；及SEQ ID NO:15之VH-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:13之VH-CDR1；SEQ ID NO:14之VH-CDR2；及SEQ ID NO:33之VH-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:23之VH-CDR1；SEQ ID NO:14之VH-CDR2；及SEQ ID NO:15之VH-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:25之VH-CDR1；SEQ ID NO:14之VH-CDR2；及SEQ ID NO:15之VH-CDR3。
在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，其包含有：包含NYHIH (SEQ ID NO:22)之VH-CDR1或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；包含WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)之VH-CDR2或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；及包含DGPWFAY (SEQ ID NO:15)之重鏈CDR3或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體。在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，其包含有：包含NYYIH (SEQ ID NO:13)之VH-CDR1或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；包含WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)之VH-CDR2或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；及包含DGYWFAY (SEQ ID NO:33)之重鏈CDR3或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含一組互補決定區(CDR)：重鏈可變區(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、輕鏈可變區(VL) CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3，其中輕鏈CDR揭露於表3中。
Figure 02_image051
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含表3中第一列之輕鏈CDR。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含選自SEQ ID NO:39及42-45之VL-CDR1；SEQ ID NO:40之VL-CDR2；以及選自SEQ ID NO:41及46-51之VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:42之VL-CDR1；SEQ ID NO:40之VL-CDR2；及SEQ ID NO:41之VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含SEQ ID NO:39之VL-CDR1；SEQ ID NO:40之VL-CDR2；及SEQ ID NO:41之VL-CDR3。
在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，其包含有：包含RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)之VL-CDR1或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之VL-CDR2或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；及包含AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)之VL-CDR3或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體。在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體，其包含有：包含RSSKSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:39)之VL-CDR1或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之VL-CDR2或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體；及包含AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)之VL-CDR3或其包含1、2、3、或4個保守胺基酸取代之變異體。
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含選自SEQ ID NO:13及16-25之VH-CDR1；選自SEQ ID NO:14及26-29之VH-CDR2；選自SEQ ID NO:15及30-38之VH-CDR3；選自SEQ ID NO:39及42-45之VL-CDR1；SEQ ID NO:40之VL-CDR2；以及選自SEQ ID NO:41及46-51之VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15及39-41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13、26、15及39-41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13、26、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:22、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13、14、33、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:23、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:25、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含表4揭露之重鏈可變區(VH)序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與表4揭露之VH序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列。
Figure 02_image053
Figure 02_image055
Figure 02_image057
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有總計一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、少於十五、或零個選自SEQ ID NO:53-84之參考VH序列之胺基酸取代、缺失及/或插入的VH序列。在一些實施例中，插入、取代、缺失及/或插入處於參考序列之框架區中。在一些實施例中，取代為保守的。在其他實施例中，取代為非保守的。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:53-84之序列的VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:53-56之序列的VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:54之VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與選自SEQ ID NO:53-56之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與序列SEQ ID NO:54具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%一致性之VH序列。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:75-77及84之序列的VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:75之VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:77之VH。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與選自SEQ ID NO:75-77及84之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與序列SEQ ID NO:75具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%一致性之VH序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與序列SEQ ID NO:77具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%一致性之VH序列。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含表5揭露之輕鏈可變區(VL)序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與表5揭露之VL序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列。
Figure 02_image059
Figure 02_image061
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有總計一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、少於十五、或零個選自SEQ ID NO:86-99之參考VH序列之胺基酸取代、缺失及/或插入的VL序列。在一些實施例中，插入、取代、缺失及/或插入處於參考序列之框架區中。在一些實施例中，取代為保守的。在其他實施例中，取代為非保守的。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:86-99之序列的VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:86-89之序列的VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:87之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與選自SEQ ID NO:86-89之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與序列SEQ ID NO:89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%一致性之VL序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含與序列SEQ ID NO:87具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%一致性之VL序列。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含選自SEQ ID NO:53-84之序列的VH及包含選自SEQ ID NO:86-89之序列的VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:54之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:54之VH及包含序列SEQ ID NO:87之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:55之VH及包含序列SEQ ID NO:87之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:56之VH及包含序列SEQ ID NO:88之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:55之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:56之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:75之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:77之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:76之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含有包含序列SEQ ID NO:84之VH及包含序列SEQ ID NO:89之VL。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段與包含表4及5分別揭露之VH及VL序列之抗體競爭結合至人類EpCAM。
在一實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其與包含選自以下之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之抗體競爭結合至人類EpCAM： (a) SEQ ID NO:54之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO:89之輕鏈可變區(VL)； (b) SEQ ID NO:54之VH及SEQ ID NO:87之VL； (c) SEQ ID NO:75之VH及SEQ ID NO:89之VL；以及 (d) SEQ ID NO:77之VH及SEQ ID NO:89之VL。
若EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段結合至人類EpCAM之程度使其在一定程度上阻斷參考分子與人類EpCAM之結合，則其據稱與參考分子競爭結合至EpCAM。蛋白競爭結合至EpCAM且因此干擾、阻斷或「交叉阻斷」另一種蛋白與EpCAM之結合的能力可藉由此項技術中已知之任何標準競爭結合測定來判定，該等測定包括例如競爭ELISA測定、表面電漿子共振(SPR；BIACORE®, Biosensor, Piscataway, N.J.)或根據Scatchard等人 (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))所述之方法。抗體可據稱將參考EpCAM抗體與人類EpCAM之結合競爭性抑制了例如至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、或至少50%。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段進一步包括重鏈恆定區或其片段。在一些態樣中，抗體或抗體片段包含選自由以下組成之群的重鏈免疫球蛋白恆定區：(a)人類IgA恆定區或其片段；(b)人類IgD恆定區或其片段；(c)人類IgE恆定域或其片段；(d)人類IgG1恆定區或其片段；(e)人類IgG2恆定區或其片段；(f)人類IgG3恆定區或其片段；(g)人類IgG4恆定區或其片段；及(h)人類IgM恆定區或其片段。在某些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含重鏈恆定區或其片段，例如人類IgG恆定區或其片段。在其他實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有或已經突變以具有改變的效應子功能及/或半衰期之重鏈免疫球蛋白恆定域。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含表6中揭露之重鏈序列。
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在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自SEQ ID NO:102-134之重鏈(HC)序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自SEQ ID NO:102-106之重鏈(HC)序列。在一特定實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含SEQ ID NO:103之HC序列。在替代性實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自SEQ ID NO:125-127及134之HC序列。在一特定實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含SEQ ID NO:125之HC序列。在一特定實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含SEQ ID NO:127之HC序列。
在額外態樣中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含輕鏈免疫球蛋白恆定區。在另一態樣中，抗體包含人類Igκ恆定區或人類Igλ恆定區。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含表7中揭露之輕鏈序列。
Figure 02_image079
Figure 02_image081
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自SEQ ID NO:137-150之輕鏈(LC)序列。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自SEQ ID NO:137-140之輕鏈(LC)序列。在一特定實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含SEQ ID NO:140之LC序列。在另一實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含SEQ ID NO:138之LC序列。
在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有選自SEQ ID NO:102-134之序列的HC及具有選自SEQ ID NO:137-150之序列的LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:138之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:138之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:139之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:125之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:127之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:126之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在額外實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含具有序列SEQ ID NO:134之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
在一些實施例中，EpCAM抗體包含改變的(例如突變或工程化) Fc區。例如，在一些態樣中，Fc區已經改變以減小或增強抗體之效應子功能，改變抗體之血清半衰期或其他功能特性。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗但不涉及殺滅攜帶靶抗原之細胞的抗體之情況下，希望減小或消除效應子功能。當針對不需要之細胞諸如腫瘤及外來細胞時，通常希望增強效應子功能，其中FcγR以低水準表現，例如具有低水準FcγRIIB之腫瘤特異性B細胞(例如非霍奇金氏淋巴瘤、CLL及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma))。本發明之具有此等賦予或改變的效應子功能活性之免疫偶聯物適用於治療及/或預防需要增強效應子功能活性之功效的疾病、病症或感染。在一些態樣中，Fc區為選自IgM、IgA、IgG、IgE或其他同型之同型。
儘管EpCAM抗體及EpCAM-結合抗體片段之Fc區可具有結合至一或多個Fc受體(例如FcγR)之能力，在某些實施例中，抗體或抗體片段包含具有改變的與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)之結合(相對於由野生型Fc區顯示之結合)的變異Fc區，例如將具有增強的與活化性受體之結合且/或將具有實質上減小或不具有與抑制性受體結合之能力。因此，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段之Fc區可包括完全Fc區之一些或全部CH2域及/或一些或全部CH3域，或可包含變異CH2及/或變異CH3序列(其可包括例如相對於完全Fc區之CH2或CH3域之一或多個插入及/或一或多個缺失)。此類Fc區可包含非-Fc多肽部分，或可包含非天然之完全Fc區之部分，或可包含CH2及/或CH3域之非天然存在之取向(諸如兩個CH2域或兩個CH3域，或在N-端至C-端方向中，CH3域連接至CH2域等)。
鑑別為改變的效應子功能之Fc區修飾為此項技術中已知的，包括增加與活化性受體(例如FcγRIIA (CD16A)之結合且減少與抑制性受體(例如FcγRIIB (CD32B)之結合的修飾(參見例如Stavenhagen等人, Cancer Res. 57(18):8882-8890 (2007))。表 8 列出增加與活化性受體之結合且/或減少與抑制性受體之結合的示範性修飾之示範性單取代、二取代、三取代、四取代及五取代(編號為如Kabat中之EU索引的編號，且取代係相對於胺基酸序列SEQ ID NO:304 )。
Figure 02_image083
與CD32B之結合減少且與CD16A之結合增加的人類IgG1 Fc區之示範性變異體含有F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L取代，其中編號為如Kabat中之EU索引的編號。該等胺基酸取代可以任何組合形式存在於人類IgG1 Fc區中。在一實施例中，變異的人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P及Y300L取代。在另一實施例中，變異的人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L取代。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含含有減弱效應子功能之修飾的免疫球蛋白重鏈恆定區(參見例如Idusogie等人, J. Immunol.166:2571-2575 (2001)；Sazinsky等人, PNAS USA 105:20167-20172 (2008)；Davis等人, J. Rheumatol.34:2204-2210 (2007)；Bolt等人, Eur.J. Immunol.23:403-411 (1993)；Alegre等人, Transplantation 57:1537-1543 (1994)；Xu等人, Cell Immunol.200:16-26 (2000)；Cole等人, Transplantation 68:563-571 (1999)；Hutchins 等人, PNAS USA 92:11980-11984 (1995)；Reddy等人, J. Immunol.164:1925-1933 (2000)；WO97/11971及WO07/106585；美國申請公開案2007/0148167A1；McEarchern 等人, Blood 109:1185-1192 (2007)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691 (2009)；及Kumagai等人, J. Clin.Pharmacol.47:1489-1497 (2007)，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文)。
在一些實施例中，對於EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段之Fc區而言，較佳呈現出與選自由以下組成之群的效應子受體之結合減少(或實質上無結合)：FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)(異型R131及H131)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a) (異型V158及F158)以及FcγRIIIB (CD16b)(異型FcγIIIb-NA1及FcγIIIb-NA2)；相對於由野生型IgG Fc區(SEQ ID NO:304)呈現之結合。在一些實施例中，與包含對應免疫球蛋白之野生型Fc區之對應抗體或抗體結合片段的結合親和力相比，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段Fc區變異體效應子受體結合親和力已減小至1/10或更小、1/50或更小、或1/100或更小。
在一特定實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含呈現出效應子功能減弱(例如ADCC減小)之IgG Fc區且包含選自由以下組成之群的一或多個胺基酸位置處之修飾：233、234、235、236、237、238、239、265、266、267、269、270、271、295、296、297、298、300、324、325、327、328、329、331及332，其中胺基酸位置編號係根據如Kabat中所列出之EU索引。在一實施例中，EpCAM抗體之CH2-CH3域包括任何1、2、3、或4個如下取代：L234A、L235A、D265A、N297Q、N297A及N297G，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。在另一實施例中，CH2-CH3域含有N297Q取代、N297A取代、或L234A及L235A取代，因為此等突變消除FcR結合。或者，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含天然存在之Fc區的CH2-CH3域，其固有地呈現出與FcγRIIIA (CD16a)之結合減少(或實質上無結合)及/或效應子功能減弱(相對於由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:304)呈現出之結合及效應子功能。在一特定實施例中，EpCAM抗體之Fc恆定區包含IgG2 Fc區(SEQ ID NO:305)或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:306)。由於在需要效應子功能之情況下N297A、N297G、N297Q、L234A、L235A及D265A取代消除了效應子功能，所以較佳將不採用該等取代。
含Fc區之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段之CH2及CH3域的效應子功能減弱或消除之較佳IgG1序列包含取代L234A/L235A (加下劃線示出) (SEQ ID NO:307)：
Figure 02_image085
含Fc區之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段之CH2及CH3域的效應子功能減弱或消除之較佳IgG1序列包含取代N297A (加下劃線示出) (SEQ ID NO:308)：
Figure 02_image087
含Fc區之EpCAM抗體或EpCAM結合抗體片段之CH2及CH3域的效應子功能減弱或消除之較佳IgG1序列包含取代N297Q (加下劃線示出) (SEQ ID NO:309)：
Figure 02_image089
Figure 02_image091
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含一或多個對應於以下之修飾：IgG1-C220S、C226S、C229S、P238S；IgG1-C226S、C229S；IgG1-C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；IgG1-L234A、L235A；IgG1-L234F、L235E、P331S；IgG1- L234F、L235E、P331S；IgG1-H268Q、A330S、P331S；IgG1-G236R、L328R；IgG1-L235G、G236R、IgG1-N297A；IgG1-N325A、L328R；IgG1-N325L、L328R；IgG1-K326W、E333S；IgG2-V234A、G237A；IgG2-E333S；IgG2 H268Q、V309L、A330S、A331S；IgG4-S228P、L236E；IgG4-F234A、L235A；IgG4-F234A、G237A、E318A；IgG4-L235A、G237A、E318A；IgG4-L236E；IgG2-EU序列118-260；及IgG4-EU序列261-447；其中位置編號係根據如Kabat中之EU索引。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含CDC活性減小之重鏈免疫球蛋白恆定域。在具體態樣中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含含有減小CDC活性之突變的IgG1重鏈恆定區(參見例如WO 1997/11971及WO 2007/106585；美國申請公佈案2007/0148167A1；McEarchern等人,Blood 109:1185-1192 (2007)；Hayden-Ledbetter等人, Clin.Cancer 15:2739-2746 (2009)；Lazar等人, PNAS USA 103:4005-4010 (2006)；Bruckheimer等人, Neoplasia 11:509-517 (2009)；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691 (2009)；及Sazinsky等人, PNAS USA105:20167-20172 (2008)；該等文獻各自以引用方式整體併入本文)。減小CDC之重鏈恆定域序列修飾之實例包括一或多個對應於以下之修飾：IgG1-C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；IgG1-C226S、P230S；IgG1-L234F、L235E、P331S；IgG1-S239D、A330L、I332E；IgG2 EU序列118-260；IgG4-EU序列261-447；及IgG2-H268Q、V309L、A330S、A331S，根據EU索引
在一些實施例中，所提供之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含含有一或多個半衰期延長的胺基酸修飾(例如取代)之重鏈免疫球蛋白恆定域。能夠增加含Fc區之分子之半衰期的許多突變為此項技術中已知的且作為本文所提供之EpCAM抗體及EpCAM-結合抗體片段之組分包括在內。參見例如美國專利第6,277,375號；第7,083,784號；第7,217,797號，及第8,088,376號；美國公開案第2002/0147311號；及第2007/0148164號；以及PCT公開案第WO 1998/23289號；第WO 2009/058492號；及第WO 2010/033279號，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文。
包含Fc區之蛋白質的血清半衰期可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來提高。如本文所用，術語「半衰期」意指分子藥物動力學特性，該特性為在投與該分子後的分子平均存活時間之量度。半衰期可表示為自受試者(例如人類患者或其他哺乳動物)身體或其特定腔室清除百分之五十(50%)已知量之分子所需的時間，例如，如在血清中量測的，亦即循環半衰期，或在其他組織中。一般而言，半衰期增加導致所投與分子在循環中之平均滯留時間(MRT)增加。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自由以下組成之群的一或多個位置處之半衰期延長之胺基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435及436，其中胺基酸位置編號係根據EU索引。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段含有位置251-257、285-290、308-314、385-389及428-436處之胺基酸殘基之一或多個胺基酸取代，其中胺基酸位置編號係根據EU索引。在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段含有以下之一或多者：以Tyr、Phe、Trp、或Thr對Kabat位置252處之胺基酸取代；以Thr對Kabat位置254處之胺基酸取代；以Ser、Arg、Gln、Glu、Asp、或Thr對Kabat位置256處之胺基酸取代；以Leu對Kabat位置257處之胺基酸取代；以Pro對Kabat位置309處之胺基酸取代；以Ser對Kabat位置311處之胺基酸取代；以Thr、Leu、Phe、或Ser對Kabat位置428處之胺基酸取代；以Arg、Ser、Iso、Pro、或Gln對Kabat位置433處之胺基酸取代；或以Trp、Met、Ser、His、Phe、或Tyr對Kabat位置434處之胺基酸取代。更具體而言，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段域可含有相對於野生型人類IgG恆定域之胺基酸取代，包括以Tyr對Kabat位置252處之胺基酸取代、以Thr對Kabat位置254處之胺基酸取代及以Glu對Kabat位置256處之胺基酸取代。
在一些實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含至少一個選自以下之取代：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、N434S、N434H、N434Y、H435K及Y436I，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。在其他實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段包含選自以下之取代：(a) M252Y、S254T及T256E；(b) M252Y及S254T；(c) M252Y及T256E；(d) T250Q及M428L；(e) T307Q及N434A；(f) A378V及N434A；(g) N434A及Y436I；(h) V308P及N434A；以及(i) K288D及H435K。
在一較佳實施例中，EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段含有包含任1、2、或3個以下取代之變異IgG Fc區：M252Y、S254T及T256E。本揭露進一步提供具有變異Fc區之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，該等變異Fc區包含：(a)一或多個改變效應子功能及/或FcγR之突變；及(b)一或多個延長血清半衰期之突變。EpCAM 可活化抗體
在額外實施例中，本揭露提供EpCAM可活化抗體(例如，可活化EpCAM抗體及可活化EpCAM-結合抗體片段)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其特異性結合與遮蔽部分(MM)偶合之EpCAM (例如人類EpCAM)，使得MM之偶合降低EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段結合EpCAM之能力。在一些實施例中，MM經由某一序列偶合，該序列包括蛋白酶之受質，例如在患病組織中有活性之蛋白酶及/或與EpCAM共同定位於受試者之治療位點處之蛋白酶。EpCAM可活化抗體較佳在循環中為穩定的，在預期治療及/或診斷位點活化，但在正常例如健康組織或未靶向治療及/或診斷之其他組織中不活化，且在活化時呈現出與EpCAM之結合至少相當於對應未經修飾之抗體。亦提供包含EpCAM可活化抗體之免疫偶聯物，以及編碼EpCAM可活化抗體之核酸或核酸集合，以及包含該等核酸之載體及宿主細胞。亦提供包含可活化抗體、免疫偶聯物、核酸、載體及宿主細胞之醫藥組成物。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體或抗體片段進一步包含： (a) 與該抗體或抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽；及 (b) 與該抗體或抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合， 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)。
一種EpCAM可活化抗體，其包含： (a) EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自下組之成員之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (i) 分別為SEQ ID NO: 13-15、42、40及41； (ii) 分別為SEQ ID NO: 13-15及39-41； (iii) 分別為SEQ ID NO: 13、26、15及39-41；以及 (iv) 分別為SEQ ID NO: 13、24、15、42、40及41； (b) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合；及 (c) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽； 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)。
呈活化狀態之EpCAM可活化抗體結合人類EpCAM且包括(i) EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段(Ab)，其特異性結合至人類EpCAM (例如，如本文所揭露)；(ii)遮蔽部分(MM)，當EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制EpCAM可活化抗體與EpCAM之結合；及(c)可裂解部分(CM)，其偶合至EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該CM為充當蛋白酶受質之多肽。在一些實施例中，該EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：MM-CM-Ab或Ab-CM-MM。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含介於MM與CM之間的連接肽。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含介於CM與Ab之間的連接肽。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時以如下解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM：小於或等於1 nM、小於或等於5 nM、小於或等於10 nM、小於或等於15 nM、小於或等於20 nM、小於或等於25 nM、小於或等於50 nM、小於或等於100 nM、小於或等於150 nM、小於或等於250 nM、小於或等於500 nM、小於或等於750 nM、小於或等於1000 nM及122./或小於或等於2000 nM。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時以如下解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM (例如，人類EpCAM或獼猴EpCAM)：大於或等於1 nM、大於或等於5 nM、大於或等於10 nM、大於或等於15 nM、大於或等於20 nM、大於或等於25 nM、大於或等於50 nM、大於或等於100 nM、大於或等於150 nM、大於或等於250 nM、大於或等於500 nM、大於或等於750 nM、大於或等於1000 nM及122./或大於或等於2000 nM。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時以在如下範圍內之解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM (例如，人類EpCAM或獼猴EpCAM)：1 nM至2000 nM、1 nM至1000 nM、1 nM至750 nM、1 nM至500 nM、1 nM至250 nM、1 nM至150 nM、1 nM至100 nM、1 nM至50 nM、1 nM至25 nM、1 nM至15 nM、1 nM至10 nM、1 nM至5 nM、5 nM至2000 nM、5 nM至1000 nM、5 nM至750 nM、5 nM至500 nM、5 nM至250 nM、5 nM至150 nM、5 nM至100 nM、5 nM至50 nM、5 nM至25 nM、5 nM至15 nM、5 nM至10 nM、10 nM至2000 nM、10 nM至1000 nM、10 nM至750 nM、10 nM至500 nM、10 nM至250 nM、10 nM至150 nM、10 nM至100 nM、10 nM至50 nM、10 nM至25 nM、10 nM至15 nM、15 nM至2000 nM、15 nM至1000 nM、15 nM至750 nM、15 nM至500 nM、15 nM至250 nM、15 nM至150 nM、15 nM至100 nM、15 nM至50 nM、15 nM至25 nM、25 nM至2000 nM、25 nM至1000 nM、25 nM至750 nM、25 nM至500 nM、25 nM至250 nM、25 nM至150 nM、25 nM至100 nM、25 nM至50 nM、50 nM至2000 nM、50 nM至1000 nM、50 nM至750 nM、50 nM至500 nM、50 nM至250 nM、50 nM至150 nM、50 nM至100 nM、100 nM至2000 nM、100 nM至1000 nM、100 nM至750 nM、100 nM至500 nM、100 nM至250 nM、100 nM至150 nM、150 nM至2000 nM、150 nM至1000 nM、150 nM至750 nM、150 nM至500 nM、150 nM至250 nM、250 nM至2000 nM、250 nM至1000 nM、250 nM至750 nM、250 nM至500 nM、500 nM至2000 nM、500 nM至1000 nM、500 nM至750 nM、500 nM至500 nM、500 nM至250 nM、500 nM至150 nM、500 nM至100 nM、500 nM至50 nM、750 nM至2000 nM、750 nM至1000 nM、或1000 nM至2000 nM。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體在呈活化狀態時以如下解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM (例如，人類EpCAM或獼猴EpCAM)：小於或等於0.01 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.5 nM、1 nM、5 nM、或10 nM。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體在呈活化狀態時以如下解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM：大於或等於0.01 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.5 nM、1 nM、5 nM、或10 nM。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體在呈活化狀態時以在如下範圍內之解離常數特異性結合至哺乳動物EpCAM (例如，人類EpCAM或獼猴EpCAM)：0.01 nM至100 nM、0.01 nM至10 nM、0.01 nM至5 nM、0.01 nM至1 nM、0.01至0.5 nM、0.01 nm至0.1 nM、0.01 nm至0.05 nM、0.05 nM至100 nM、0.05 nM至10 nM、0.05 nM至5 nM、0.05 nM至1 nM、0.05至0.5 nM、0.05 nm至0.1 nM、0.1 nM至100 nM、0.1 nM至10 nM、0.1 nM至5 nM、0.1 nM至1 nM、0.1至0.5 nM、0.5 nM至100 nM、0.5 nM至10 nM、0.5 nM至5 nM、0.5 nM至1 nM、1 nM至100 nM、1 nM至10 nM、1 nM至5 nM、5 nM至100 nM、5 nM至10 nM、或10 nM至100 Nm。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體以小於1 nM之解離常數特異性結合至人類EpCAM。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體以小於1 nM之解離常數特異性結合至獼猴EpCAM。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體以小於1 nM之解離常數特異性結合至人類EpCAM及獼猴EpCAM。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之血清半衰期長於對應抗體之血清半衰期；例如， EpCAM可活化抗體之pK長於對應抗體之pK。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之血清半衰期類似於對應抗體之血清半衰期。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有表2之一列中列出之序列的VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有表3之一列中列出之序列的VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含選自SEQ ID NO:13及16-25之VH-CDR1；選自SEQ ID NO:14及26-29之VH-CDR2；選自SEQ ID NO:15及30-38之VH-CDR3；選自SEQ ID NO:39及42-45之VL-CDR1；SEQ ID NO:40之VL-CDR2；以及選自SEQ ID NO:41及46-51之VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3：(i)分別為SEQ ID NO:13-15、42、40及41；(ii)分別為SEQ ID NO: 13-15及39-41；(iii)分別為SEQ ID NO: 13、26、15及39-41；以及(iv)分別為SEQ ID NO: 13、26、15、42、40及41。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3：(i)分別為SEQ ID NO: 22、14、15、42、40及41；(ii)分別為SEQ ID NO: 13、14、33、42、40及41；(iii)分別為SEQ ID NO: 23、14、15、42、40及41；以及(iv)分別為SEQ ID NO: 25、14、15、42、40及41。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO: 22、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO: 13、14、33、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含表4所揭露之VH。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含表5所揭露之VL。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含與選自SEQ ID NO: 54、75及77之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含與包含SEQ ID NO:89之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含表6所揭露之HC。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含表7所揭露之LC。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:125之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:127之HC及具有序列SEQ ID NO:140之輕鏈。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其特異性結合至人類EpCAM之胞外區(SEQ ID NO:1)內之表位。在某些實施例中，EpCAM可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其特異性結合至人類EpCAM之第一胞外域(D1)(SEQ ID NO:2)內之表位。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含有包含X1 YX3 X4 H之VH-CDR1，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)；包含WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G之VH-CDR2，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)；及包含X1 GX3 X4 FAY之VH-CDR3，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含有包含RSSX4 SLLHSX10 G X12 TYLX16 之VH-CDR1，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之輕鏈VL-CDR2；及包含X1 QX3 LELPX8 T之VL-CDR3，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含有：包含序列SEQ ID NO:13之VH-CDR1；包含序列SEQ ID NO:14之VH-CDR2；包含序列SEQ ID NO:15之VH-CDR3；包含序列SEQ ID NO:42之VL-CDR1；包含序列SEQ ID NO:40之VL-CDR2；及包含序列SEQ ID NO:41之VL-CDR3。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之VH-CDR1包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之VH-CDR3包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之VL-CDR3包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含有：包含序列SEQ ID NO:13之VH-CDR1；包含序列SEQ ID NO:14之VH-CDR2；包含序列SEQ ID NO:15之VH-CDR3；包含序列SEQ ID NO:42之VL-CDR1；包含序列SEQ ID NO:40之VL-CDR2；及包含序列SEQ ID NO:41之VL-CDR3。
所揭露之EpCAM可活化抗體之適合組分亦包括EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其與包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL的EpCAM抗體交叉競爭結合至人類EpCAM及/或獼猴EpCAM。額外適合的EpCAM可活化抗體與包含具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL的EpCAM抗體交叉競爭結合至人類EpCAM及/或獼猴EpCAM。額外適合的EpCAM可活化抗體與包含具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL的EpCAM抗體交叉競爭結合至人類EpCAM及/或獼猴EpCAM。
本文所提供之EpCAM可活化抗體包括遮蔽部分(MM)。在一些實施例中，遮蔽部分(或「遮蔽劑」)為如下胺基酸序列，其偶合至或以其他方式連接至EpCAM抗體且定位於EpCAM可活化抗體構築體內，以使得遮蔽部分減小EpCAM抗體特異性結合EpCAM之能力。適合的遮蔽部分使用多種已知技術中之任一者鑑別。例如，肽遮蔽部分使用WO 2009/025846所述之方法鑑別，該專利之內容以引用方式整體併入本文中。
在一些實施例中，可活化抗體之MM與Ab結合所具有之解離常數大於Ab對EpCAM之解離常數。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之解離常數不大於Ab對EpCAM之解離常數。
在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之解離常數小於Ab對EpCAM之解離常數。
在一些實施例中，MM對Ab之解離常數(Kd)不大於Ab對靶標之解離常數之2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大、或介於1-5、5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000- 10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之間或更大。
在一些實施例中，當EpCAM可活化抗體呈裂解狀態時，MM不會干擾與EpCAM之結合或與Ab競爭結合至EpCAM。在一些實施例中，MM為長度約2至40個胺基酸之多肽。在一些實施例中，MM為長度多達約40個胺基酸之多肽。
在一些實施例中，MM多肽序列不同於EpCAM之序列。在一些實施例中，MM多肽序列與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於50%一致性。在一些實施例中，MM多肽序列不同於EpCAM之序列且與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於40%、30%、25%、20%、15%、或10%一致性。
在一些實施例中，MM與Ab之偶合減小Ab結合EpCAM之能力，使得Ab當偶合至MM時對EpCAM之解離常數(IQ)為大於Ab在不偶合至MM時對EpCAM之IQ的至少2、5、10、20、40、100、1,000、10,000。
在一些實施例中，在EpCAM存在下，當在活體外使用靶標置換測定，諸如WO 2010/081173中所述之測定來分析時，在CM未裂解時，與CM裂解時相比，MM使Ab結合EpCAM之能力減小了至少90%，所述專利以引用方式整體併入本文。
與未以MM修飾之Ab與人類EpCAM之特異性結合或親本Ab與人類EpCAM之特異性結合相比，當Ab以MM修飾且在人類EpCAM存在下時，Ab與人類EpCAM之特異性結合得以減少或抑制。
以MM修飾之Ab對人類EpCAM之IQ大於未以MM修飾之Ab或親本Ab對人類EpCAM之IQ之至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大、或介於5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之間。相反，以MM修飾之Ab對人類EpCAM之結合親和力低於未以MM修飾之Ab或親本Ab對人類EpCAM之結合親和力之至少2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大、或介於5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之間。
在一些實施例中，MM對Ab之解離常數(Kd)大約等於Ab對人類EpCAM之Kd。在一些實施例中，MM對Ab之解離常數(Kd)不大於Ab對人類EpCAM之解離常數。在一些實施例中，MM對Ab之解離常數(Kd)小於Ab對人類EpCAM之解離常數。在一些實施例中，MM對Ab之解離常數(Kd)大於Ab對人類EpCAM之解離常數。
在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd不大於Ab與人類EpCAM結合之Kd。
在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd不小於Ab與人類EpCAM結合之Kd。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd大約等於Ab與人類EpCAM結合之Kd。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd小於Ab與人類EpCAM結合之Kd。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd不大於Ab與人類EpCAM結合之Kd。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd大於Ab與人類EpCAM結合之Kd不超過2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、或1,000倍。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之Kd大於Ab與人類EpCAM結合之Kd介於1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000、或100-1,000倍之間。
在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力小於Ab與人類EpCAM結合之親和力。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力不大於Ab與人類EpCAM結合之親和力。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力大約等於Ab與人類EpCAM結合之親和力。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力不小於Ab與人類EpCAM結合之親和力。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力大於Ab與人類EpCAM結合之親和力。
在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力為小於Ab與人類EpCAM結合之親和力的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、或1,000倍。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力小於Ab與人類EpCAM結合之親和力介於1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000、或100-1,000倍之間。在一些實施例中，MM與Ab結合所具有之親和力小於Ab與人類EpCAM結合之親和力的2至20倍。在一些實施例中，未共價連接至Ab且在與EpCAM可活化抗體等莫耳濃度下之MM不抑制Ab與人類EpCAM之結合。
與未以MM修飾之Ab與人類EpCAM之特異性結合或親本Ab與人類EpCAM之特異性結合相比，當Ab以MM修飾且在人類EpCAM存在下時，Ab與人類EpCAM之特異性結合得以減小或抑制。當藉由活體內或活體外測定量測時，當與未以MM修飾之Ab與人類EpCAM之結合或親本Ab與人類EpCAM之結合相比時，Ab當以MM修飾時結合人類EpCAM之能力可減小了至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時、或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180日、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
MM抑制Ab與人類EpCAM之結合。MM結合Ab之抗原結合域且抑制Ab與人類EpCAM之結合。MM可在空間上抑制Ab與人類EpCAM之結合。MM可別構地抑制Ab與其靶標之結合。在此等實施例中，當在活體內或活體外測定中量測時，與未以MM修飾之Ab、親本Ab、或未偶合至MM之Ab與人類EpCAM之結合相比，當Ab以MM修飾或偶合至MM時且在靶標存在下，Ab與人類EpCAM無結合或實質上無結合，或者不大於0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、或50% Ab與人類EpCAM之結合，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時、或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180日、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
當Ab偶合至MM或藉由MM修飾時，MM『遮蔽』或減小或以其他方式抑制Ab與人類EpCAM之特異性結合。當Ab偶合至MM或藉由MM修飾時，此類偶合或修飾可實現減小或抑制Ab特異性結合其靶標之能力的結構改變。
偶合至MM或以MM修飾之Ab可由下式表示(以自胺基(N)端區至羧基(C)端區之順序： (MM)-(Ab) (Ab)-(MM) (MM)-L-(Ab) (Ab)-L-(MM) 其中MM為遮蔽部分，Ab為EpCAM抗體、EpCAM-結合抗原片段，且L為連接子。在許多實施例中，可能希望將一或多個連接子( 例如柔性連接子)插入至組成物中以便提供柔韌性。
在某些實施例中，MM不為Ab之天然結合配偶體。在一些實施例中，MM不含有或實質上不含有與Ab之任何天然結合配偶體之同源性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%相似性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%一致性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於25%一致性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於50%一致性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於20%一致性。在一些實施例中，MM與Ab之任何天然結合配偶體具有不大於10%一致性。
在一些實施例中，MM包含表9所揭露之序列。在一些實施例中，MM包含選自SEQ ID NO:151-157之序列。在一些實施例中，MM包含選自SEQ ID NO:158-161之序列。在一些實施例中，MM包含選自SEQ ID NO:162-167之序列。在一些實施例中，MM包含序列SEQ ID NO:155。
Figure 02_image093
本文所提供之EpCAM可活化抗體包括可裂解部分。在一些實施例中，可裂解部分(或「受質」)包括胺基酸序列，其為蛋白酶、通常胞外蛋白酶之受質。適合的受質使用多種已知技術中之任一者鑑別。例如，肽受質使用美國專利第7,666,817號及第8,563,269號；及WO 2014/026136所述之方法鑑別，該等專利各自之內容以引用方式整體併入本文中。(亦參見Boulware等人, BiotechnolBioeng.106(3):339-346 (2010))。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包括藉由MM修飾之Ab且亦包括一或多個可裂解部分(CM)。此類EpCAM可活化抗體呈現出與人類EpCAM之可活化/可轉化結合。EpCAM可活化抗體通常包括藉由遮蔽部分(MM)及可修飾或可裂解部分(CM)修飾或偶合至MM及CM之抗體或抗原結合抗體片段(Ab)。在一些實施例中，CM含有充當至少一種蛋白酶之受質的胺基酸序列。
EpCAM可活化抗體之元件經排列以使得MM及CM定位成在裂解(或相對活性)狀態下且在人類EpCAM存在下，EpCAM可活化抗體結合人類EpCAM，但當EpCAM可活化抗體在人類EpCAM存在下呈未裂解(或相對無活性)狀態時，EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之特異性結合減小或受抑制。EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之特異性結合由於對EpCAM可活化抗體藉由MM而特異性結合人類EpCAM之能力的抑制或遮蔽來減小。
以MM及CM修飾之EpCAM可活化抗體對人類EpCAM之IQ為大於未以MM及CM修飾之EpCAM可活化抗體或親本Ab對人類EpCAM之Kj之至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100.000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大、或介於5-10、10-100、10- 1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100- 100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之間。相反，以MM及CM修飾之Ab對人類EpCAM之結合親和力為低於未以MM及CM修飾之EpCAM可活化抗體或親本Ab對人類EpCAM之結合親和力之至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大、或介於5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之間。
與未以MM及CM修飾之EpCAM可活化抗體或親本Ab與人類EpCAM之特異性結合相比，當EpCAM可活化抗體以MM及CM修飾且在人類EpCAM存在下但修飾劑(例如至少一種蛋白酶)不存在下時，EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之特異性結合得以減小或抑制。當在活體內或活體外測定中量測時，當與親本Ab或未以MM及CM修飾之EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之結合相比時，EpCAM可活化抗體當以MM及CM修飾時結合人類EpCAM之能力可減小了至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，達至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小時、或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180日、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間。
如本文所用，術語裂解狀態係指在藉由至少一種蛋白酶修飾CM之後EpCAM可活化抗體之狀況。如本文所用，術語未裂解或完整狀態係指在不存在蛋白酶裂解CM之情況下EpCAM可活化抗體之狀況。如上文所討論，術語「可活化抗體」在本文中用於指代呈未裂解(天然或完整)狀態以及呈其裂解狀態之EpCAM可活化抗體。熟悉此項技藝者將顯而易知，在一些實施例中，裂解的EpCAM可活化抗體可能由於蛋白酶裂解CM而缺乏MM，造成至少MM之釋放(例如，其中MM未藉由共價鍵(例如半胱胺酸殘基之間的二硫鍵)連接至EpCAM可活化抗體。
可活化或可轉化意指當EpCAM可活化抗體呈抑制、遮蔽、完整或未裂解狀態(亦即第一構象)時，EpCAM可活化抗體呈現出第一水準的與靶標之結合，且當呈未抑制、未遮蔽及/或裂解狀態(亦即第二構象)時呈現出第二水準的與人類EpCAM之結合，其中靶標結合之第二水準大於第一結合水準。一般而言，人類EpCAM與EpCAM可活化抗體之接近在能夠裂解CM之裂解劑( 亦即蛋白酶)存在下大於此類裂解劑不存在之情況。因此，當EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時，Ab受抑制以免於結合人類EpCAM且可受遮蔽以免於人類EpCAM-結合(亦即第一構象使得Ab不能結合人類EpCAM)，且呈裂解狀態時，Ab未受抑制或未受遮蔽以實現靶標結合。
選擇EpCAM可活化抗體之CM及Ab，以使得Ab代表給定靶標之結合部分且CM代表蛋白酶之受質。在一些實施例中，蛋白酶與人類EpCAM共同定位於受試者之治療位點或診斷位點。如本文所用，共同定位係指處於相同位點或在附近相對接近處。在一些實施例中，蛋白酶裂解CM，產生結合至位於裂解位點附近之靶標的活化抗體。本文所揭露之EpCAM可活化抗體具有特定用途，例如能夠裂解CM中之位點的蛋白酶(亦即蛋白酶)在治療位點或診斷位點之含靶標組織中以相對高於非治療位點之組織(例如在健康組織)中之水準存在。在一些實施例中，本揭露之CM亦藉由一或多種其他蛋白酶裂解。在一些實施例中，其為與人類EpCAM共同定位且負責在活體內裂解CM之一或多種其他蛋白酶。
在一些實施例中，若EpCAM可活化抗體未受遮蔽或另外未受抑制以免於結合至人類EpCAM，則EpCAM可活化抗體提供減小的毒性及/或不良副作用，此等副作用否則可由EpCAM可活化抗體在非治療位點處之結合產生。
一般而言，EpCAM可活化抗體可藉由以下方式來設計：選擇感興趣之Ab且構築EpCAM可活化抗體之其餘部分，使得當構象上受限時MM提供EpCAM可活化抗體之遮蔽或使EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之結合減少。可考慮到結構設計標準以提供此功能特性。
提供EpCAM可活化抗體，其在受抑制構象對比未受抑制構象時呈現出靶標結合之所要動態範圍的可轉化表現型。動態範圍通常係指(a)在第一組條件下參數之最大偵測水準與(b)在第二組條件下該參數之最小偵測值之比率。例如，在EpCAM可活化抗體之情形下，動態範圍係指(a)在能夠裂解EpCAM可活化抗體之CM的至少一種蛋白酶存在下靶蛋白與EpCAM可活化抗體結合之最大偵測水準與(b)在該蛋白酶不存在下靶蛋白與EpCAM可活化抗體結合之最小偵測水準之比率。EpCAM可活化抗體之動態範圍可經計算為一種EpCAM可活化抗體的裂解劑(例如酶)處理之解離常數與多種EpCAM可活化抗體的裂解劑處理之解離常數的比率。EpCAM可活化抗體之動態範圍越大，EpCAM可活化抗體之可轉化表現型越好。
具有相對較高動態範圍值(例如大於1)之EpCAM可活化抗體呈現出更希望有的轉化表現型，使得EpCAM可活化抗體之靶蛋白結合發生之程度(例如主要發生)在能夠裂解EpCAM可活化抗體之CM的裂解劑(例如酶)存在下大於裂解劑不存在下之程度。
EpCAM可活化抗體可以多種結構構象提供。下文提供了EpCAM可活化抗體之示範性式。特別預期的是，在EpCAM可活化抗體內Ab、MM及CM之N-端至C-端之順序可逆轉。亦特別預期CM與MM之胺基酸序列可重疊，例如使得CM包含在MM內。
例如，EpCAM可活化抗體可由下式表示(以自胺基(N)端區至羧基(C)端區之順序： (MM)-(CM)-(Ab) (Ab)-(CM)-(MM) 其中MM為遮蔽部分，CM為可裂解部分，且Ab為EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段。應注意，儘管MM及CM經指示為以上式中之不同組分，但在本文所揭露之所有示範性實施例(包括式)中，預期MM與CM之胺基酸序列可重疊，例如使得CM完全或部分包含在MM內。另外，上式提供額外胺基酸序列，其可定位於EpCAM可活化抗體元件之N端或C端。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含可由蛋白酶裂解之CM。在一些實施例中，裂解CM之蛋白酶為在患病組織中有活性的，例如上調或另外失調，且當EpCAM可活化抗體暴露於蛋白酶時，蛋白酶裂解EpCAM可活化抗體中之CM。
在一些實施例中，蛋白酶與EpCAM共同定位於組織中，且當EpCAM可活化抗體暴露於蛋白酶時，蛋白酶裂解EpCAM可活化抗體中之CM。
在一些實施例中，CM定位於EpCAM可活化抗體中，使得當EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時，EpCAM可活化抗體與EpCAM之結合發生減少，其解離常數為大於未經修飾之Ab與EpCAM之結合的解離常數之至少2、5、10、20、40、50、100、或200倍，而呈裂解狀態時(亦即當EpCAM可活化抗體呈裂解狀態時)，Ab結合EpCAM。
在一些實施例中，CM為長度多達15個胺基酸之多肽。
在一些實施例中，CM為包括作為至少一種基質金屬蛋白酶(MMP)之受質的第一可裂解部分(CM1)及作為至少一種絲胺酸蛋白酶(SP)之受質的第二可裂解部分(CM2)的多肽。在一些實施例中，CM1-CM2受質之CM1受質序列及CM2受質序列各自獨立地為長度多達15個胺基酸之多肽。
在一些實施例中，CM為在癌症中經上調或咸信經上調或另外失調之至少一種蛋白酶之受質。在一些實施例中，CM為在炎症中經上調或咸信經上調之至少一種蛋白酶之受質。在一些實施例中，CM為在自體免疫中經上調或咸信經上調或另外失調之至少一種蛋白酶之受質。
在一些實施例中，CM為選自以下之至少一種蛋白酶之受質：基質金屬蛋白酶(MMP)、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、豆莢蛋白及絲胺酸蛋白酶，諸如蛋白裂解酶(MT-SP1)，及尿激酶(uPA)。不希望受到理論約束，咸信該等蛋白酶在癌症、炎症及/或自體免疫之至少一者中上調或另外失調。
示範性受質包括但不限於可由以下酶或蛋白酶之一或多者裂解之受質：ADAMS/ADAMTS (例如ADAM8、ADAM9、ADAM 10、ADAM 12、ADAM 15、ADAM 17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5)；天冬胺酸蛋白酶(例如BACE、腎素)；天冬胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶D及組織蛋白酶E)；半胱天冬酶(例如半胱天冬酶1-10及半胱天冬酶14)；半胱胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2及組織蛋白酶X/Z/P)；半胱胺酸蛋白酶(例如克魯茲蛋白酶(Cruzipain)、豆莢蛋白及Otubain-2)；KLK (例如KLK4-8、KLK10、KLK 11、KLK 13及KLK14)；金屬蛋白酶(例如穿膜肽酶(Meprin)、腦啡肽酶(Neprilysin)、PSMA及BMP1)；MMP (例如MMP1-3、MMP 7-17、MMP 19、MMP 20、MMP 23、MMP 24、MMP 26及MMP 27)；絲胺酸蛋白酶(例如活化蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶C、凝乳酶及凝血因子蛋白酶諸如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa及FXIIa)、彈性蛋白酶(例如人類嗜中性球彈性蛋白酶)；顆粒酶B；胍基苯甲酸酯酶(Guanidinobenzoatase)；HtrA1；乳鐵蛋白；小皮傘菌素(Marapsin)；NS3/4A；PACE4；胞漿素；PSA、tPA；凝血酶；中性蛋白酶；uPA；II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如DESC1、DPP-4、FAP、Hepsin、蛋白裂解酶-2、MT-SP1/蛋白裂解酶及TMPRSS2-4)。
在一些實施例中，CM經選擇用於與特定蛋白酶，例如已知與EpCAM可活化抗體之靶標共同定位之蛋白酶一起使用。
在一些實施例中，CM為至少一種MMP之受質。MMP之實例包括MMP1-3、MMP 7-17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26及MMP27。在一些實施例中，CM為選自以下之蛋白酶之受質：MMP 9、MMP 14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP 17、MMP11及MMP19。在一些實施例中，CM為MMP9之受質。在一些實施例中，CM為MMP14之受質。
可常規併入所提供之可活化抗體中的適合CM為此項技術中已知的。參見例如WO 2016/179285，例如第40-47頁，其內容以引用方式整體併入本文。
在一些實施例中，CM為嗜中性球彈性蛋白酶之受質。在一些實施例中，CM為絲胺酸蛋白酶之受質。在一些實施例中，CM為豆莢蛋白之受質。在一些實施例中，CM為蛋白裂解酶之受質。在一些實施例中，CM為半胱胺酸蛋白酶之受質。在一些實施例中，CM為半胱胺酸蛋白酶諸如組織蛋白酶之受質。在其他實施例中，CM為uPA之受質。
在具體實施例中，CM為uPA之受質。在一些實施例中，CM包含表10所揭露之序列。
Figure 02_image095
在一些實施例中，CM包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO:168)。
在一些實施例中，CM包含序列ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO:169)。
在一些實施例中，CM為至少兩種蛋白酶之受質。在一些實施例中，各蛋白酶係選自：ADAMS/ADAMTS(例如ADAM8、ADAM9、ADAM 10、ADAM 12、ADAM 15、ADAM 17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5)；天冬胺酸蛋白酶(例如BACE、腎素)；天冬胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶D及組織蛋白酶E)；半胱天冬酶(例如半胱天冬酶1-10及半胱天冬酶14)；半胱胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2及組織蛋白酶X/Z/P)；半胱胺酸蛋白酶(例如克魯茲蛋白酶、豆莢蛋白及Otubain-2)；KLK (例如KLK4-8、KLK10、KLK 11、KLK 13及KLK14)；金屬蛋白酶(例如穿膜肽酶、腦啡肽酶、PSMA及BMP1)；MMP (例如MMP1-3、MMP 7-17、MMP 19,、MMP 20、MMP 23、MMP 24、MMP 26及MMP 27)；絲胺酸蛋白酶(例如活化蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶C、凝乳酶及凝血因子蛋白酶諸如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa及FXIIa)、彈性蛋白酶(例如人類嗜中性球彈性蛋白酶)；顆粒酶B；胍基苯甲酸酯酶；HtrA1；乳鐵蛋白；小皮傘菌素；NS3/4A；PACE4；胞漿素；PSA、tPA；凝血酶；中性蛋白酶；uPA；II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如DESC1、DPP-4、FAP、Hepsin、蛋白裂解酶-2、MT-SP1/蛋白裂解酶及TMPRSS2-4。在一些實施例中，CM為至少兩種蛋白酶之受質，其中該等蛋白酶之一係選自：MMP、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、豆莢蛋白及蛋白裂解酶，且另一種蛋白酶係選自以上列出之彼等。在一些實施例中，CM為選自下組之至少兩種蛋白酶之受質：MMP、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、豆莢蛋白及蛋白裂解酶。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包括至少第一CM及第二CM。在一些實施例中，第一CM及第二CM各自為長度不超過15個胺基酸之多肽。在一些實施例中，該EpCAM可活化抗體中之第一CM及第二CM呈未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：MM-CM1-CM2-Ab或Ab-CM2- CM1-MM。在一些實施例中，第一CM及第二CM中之至少一者為用作選自以下之蛋白酶之受質的多肽：MMP、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、豆莢蛋白及蛋白裂解酶。在一些實施例中，第一CM在靶組織中由選自MMP、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、豆莢蛋白及蛋白裂解酶之第一裂解劑裂解，且第二CM在靶組織中由第二裂解劑裂解。在一些實施例中，其他蛋白酶係選自前述段落中呈現之列表。在一些實施例中，第一裂解劑及第二裂解劑為選自MMP、凝血酶、嗜中性球彈性蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、uPA、豆莢蛋白及蛋白裂解酶之相同蛋白酶，且第一CM及第二CM為該酶之不同受質。在一些實施例中，第一裂解劑及第二裂解劑為選自前述段落中之列表的相同蛋白酶。在一些實施例中，第一裂解劑及第二裂解劑為不同蛋白酶。在一些實施例中，第一裂解劑及第二裂解劑共同定位於靶組織中。在一些實施例中，第一CM及第二CM在靶組織中藉由之至少一種裂解劑裂解。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體亦包括信號肽。在一些實施例中，信號肽經由間隔物偶聯至EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，間隔物在信號肽不存在下偶聯至EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，間隔物直接連接至EpCAM可活化抗體之MM。在一些實施例中，間隔物直接連接至EpCAM可活化抗體之MM，其結構排列自N端至C端為間隔物-MM-CM-Ab。
適合的間隔物及間隔物技術為此項技術中已知的且可常規用於在一些實施例中將間隔物併入所提供之可活化抗體中。參見例如WO 2016/179285(例如在第52-53頁)，其內容以引用方式整體併入本文。
在許多實施例中，可能希望將一或多個連接子(例如柔性連接子)插入至EpCAM可活化抗體構築體中，以便在MM-CM接合部、CM-Ab接合部、或這二者中之一或多者處提供柔韌性。例如，Ab、MM及/或CM可不含足夠數量之殘基(例如Gly、Ser、Asp、Asn，尤其是Gly及Ser，特別是Gly)，以提供所要柔韌性。同樣地，此類EpCAM可活化抗體構築體之可轉化表現型可得益於一或多個胺基酸之引入以提供柔性連接子。另外，如下文所述，在EpCAM可活化抗體作為構象受限之構築體提供時，柔性連接子可經可操作地插入以便於形成且維持未裂解EpCAM可活化抗體之環狀結構。
例如，在某些實施例中，EpCAM可活化抗體包含下式之一(其中下式表示N-端至C-端方向或C-端至N-端方向之胺基酸序列)： (MM)-L1-(CM)-(Ab) (MM)-(CM)-L2-(Ab) (MM)-L1-(CM)-L2-(Ab) 其中MM、CM及Ab如上文所定義；其中L1及L2各自獨立且視情況存在或不存在，為包括至少1個柔性胺基酸(例如Gly)之相同或不同柔性連接子。另外，上式提供額外胺基酸序列，其可定位於EpCAM可活化抗體元件之N端或C端。實例包括但不限於靶向部分(例如，存在於靶組織中之細胞之受體的配位體)及血清半衰期延長部分(例如，結合血清蛋白之多肽，該等血清蛋白諸如免疫球蛋白(例如IgG)或血清白蛋白(例如人類血清白蛋白(HSA))。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體暴露於蛋白酶且由該蛋白酶裂解，使得在活化或裂解狀態下，活化抗體包括輕鏈序列，該輕鏈序列在蛋白酶裂解CM後包括LP2及/或CM序列之至少一部分。
CM具體地由至少一種蛋白酶以約0.001-1500 x 104 M-1 S-1 或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500 x 104 M-1 S-1 之速率裂解。在一些實施例中，CM具體地以約100,000 M-1 S-1 之速率裂解。在一些實施例中，CM具體地以約1 x 102 至約1 x 106 M-1 S-1 (亦即約1 x 102 至約1 x 106 M-1 S-1 )之速率裂解。
對於酶進行之特異性裂解，使酶與CM接觸。當包含與MM及CM偶合之Ab的EpCAM可活化抗體(例如EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段)係在EpCAM及足夠的酶活性存在下時，可裂解CM。足夠的酶活性可係指酶與CM接觸並實現裂解之能力。可容易設想到，酶可在CM附近，但由於其他細胞因素或酶之蛋白質修飾而不能裂解。
適用於本文所揭露之EpCAM可活化抗體組成物中之連接子通常為提供經修飾之Ab (例如EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段)或EpCAM可活化抗體之柔韌性，以便於抑制EpCAM可活化抗體與人類EpCAM之結合的連接子。此類連接子通常稱為柔性連接子。適合的連接子可容易選擇且可具有任何適合的不同長度，諸如1個胺基酸(例如Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且其長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸。
本文所提供之可活化抗體、抗體及抗體片段之示範性柔性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n。適合的連接子及連接子技術為此項技術中已知的且可常規用於在一些實施例中將間隔物併入所提供之可活化抗體中。參見例如WO 2016/179285 (例如在第26、113-116頁)，其內容以引用方式整體併入本文。熟悉此項技藝者將認識到，EpCAM可活化抗體之設計可包括全部或部分柔性之連接子，使得該等連接子可包括一個柔性連接子以及賦予結構較小柔性之一或多個部分以提供所要EpCAM可活化抗體結構。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含第一連接肽(LP1)及第二連接肽(LP2)，且其中EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：MM-LP1-CM-LP2-Ab或Ab-LP2-CM-LP1-MM。在一些實施例中，兩個連接肽不需要彼此相同。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含第一連接肽(LP1)及第二連接肽(LP2)，且其中EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：MM-LP1-CM-LP2-Ab或Ab-LP2-CM-LP1-MM。在一些實施例中，兩個連接肽不需要彼此相同。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體之LP1或LP2之至少一者包含柔性連接子。適合的連接子及連接子技術為此項技術中已知的且可常規用於在一些實施例中將間隔物併入所提供之可活化抗體中。參見例如WO 2016/179285(例如在第26、113-116頁)，其內容以引用方式整體併入本文。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有表11所揭露之序列之輕鏈。在一些實施例中，可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:174之輕鏈。在一些實施例中，可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:179之輕鏈。
Figure 02_image097
Figure 02_image099
Figure 02_image101
Figure 02_image103
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO: 170-180之序列之輕鏈及具有選自SEQ ID NO: 103、125及127之序列之重鏈。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO: 170-180之序列之輕鏈及具有序列SEQ ID NO: 103之重鏈。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:174之輕鏈及具有序列SEQ ID NO:103之重鏈。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有序列SEQ ID NO:179之輕鏈及具有序列SEQ ID NO:103之重鏈。
在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO: 181-188之序列之輕鏈及具有序列SEQ ID NO:127之重鏈。在一些實施例中，EpCAM可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO: 189-200之序列之輕鏈及具有序列SEQ ID NO:125之重鏈。
在某些實施例中，huEpCAM23抗體由質體編碼，該等質體於2018年10月4日根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款儲藏於位於10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110之美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)且具有ATCC儲藏號PTA-125343及PTA-125344或PTA-125345。本文提供EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體、免疫偶聯物之實例。多核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法
本揭露進一步提供包含編碼本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體之核苷酸序列的多核苷酸。
可使用此項技術中已知之方法獲得多核苷酸且測定多核苷酸之核苷酸序列。例如，若已知抗體之核苷酸序列，則可由經化學合成之寡核苷酸組裝編碼該抗體之多核苷酸(例如，如Kutmeier等人, BioTechniques 17:242 (1994)中所述)，簡言之，其涉及合成含有編碼該抗體之序列部分的重疊寡核苷酸、退火且連接彼等寡核苷酸，接著藉由PCR擴增所連接之寡核苷酸。
在一些實施例中，本揭露之多核苷酸包含表12中列出之序列。
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:201及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:202。在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:203及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:204。在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:205及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:204。在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:206及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:204。在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:207及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:204。
在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:203及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:208。在一些實施例中，本揭露之EpBA包含重鏈核酸序列SEQ ID NO:203及輕鏈核酸序列SEQ ID NO:209。
在一些實施例中，本揭露之EpBA包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於美國菌種保存中心(ATCC®)之質體編碼的重鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈可變區及(ii)包含與以PTA-125342形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。本揭露亦包括製備及使用包含EpBA之EpCAM抗體及EpCAM-結合抗體片段之方法。
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM抗體，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈及(ii)包含與以PTA-125342形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈。本揭露亦包括製備及使用EpCAM抗體之方法。
在一些實施例中，本揭露提供一種EpCAM可活化抗體或EpCAM-結合可活化抗體片段，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈可變區及(ii)包含與以PTA-125344形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。本揭露亦包括製備及使用EpCAM可活化抗體或EpCAM-結合可活化抗體片段之方法。
在其他實施例中，本揭露提供一種EpCAM可活化抗體或EpCAM-結合可活化抗體片段，其包含有(i)包含與以PTA-125343形式儲藏於ATCC®之質體編碼的重鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的重鏈可變區及(ii)包含與以PTA-125345形式儲藏於ATCC®之質體編碼的輕鏈可變區之胺基酸序列相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。本揭露亦包括製備及使用EpCAM可活化抗體或EpCAM-結合可活化抗體片段之方法。
用於構築含有抗體編碼序列及適當轉錄及翻譯控制信號之重組載體的方法為此項技術中熟知的。一旦已重組表現抗體，則其可藉由此項技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之任何方法純化，該等方法例如藉由層析法(例如離子交換層析法、親和力層析法(特別是藉由蛋白A之後對特定抗原之親和力層析法及定量管柱層析法)、離心、差式溶解、或藉由任何其他用於純化蛋白質之標準技術。就此而言，本揭露已提及美國專利第7,538,195號，其內容以引用方式整體併入本文。
本揭露亦提供藉由在引起抗體及/或EpCAM可活化抗體表現之條件下培養細胞產生本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體的方法，其中該細胞包含編碼該抗體、抗體片段或可活化抗體之核酸分子。
本揭露亦提供一種藉由如下步驟製造在活化狀態下結合EpCAM之EpCAM可活化抗體的方法：(a)在引起EpCAM可活化抗體表現之條件下培養包含編碼EpCAM可活化抗體之核酸構築體的細胞，其中該EpCAM可活化抗體包含遮蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及Ab (例如，以及EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段)，(i)其中CM為用作蛋白酶之受質的多肽；且(ii)其中CM定位於EpCAM可活化抗體內，使得當EpCAM可活化抗體呈未裂解狀態時，MM干擾Ab與EpCAM之特異性結合，且呈裂解狀態時，MM不會干擾或競爭Ab與EpCAM之特異性結合；及(b)回收該EpCAM可活化抗體。適合的Ab、MM及/或CM包括本文所揭露之Ab、MM及/或CM中之任一者。免疫偶聯物
在一實施例中，本揭露提供免疫偶聯物，其包含與細胞毒性劑偶聯或共價連接之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體(例如，如本文所揭露)。細胞毒性劑包括對細胞有害之任何試劑，諸如綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、肉毒桿菌毒素A至F、蓖麻毒素相思豆毒素、皂草素及此等試劑之細胞毒素片段。細胞毒性劑亦包括具有預防性或治療性治療病症之治療效果的任何試劑。此類治療劑可為化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，且包括具有所要生物活性且/或改變給定生物反應之治療劑。治療劑之實例包括但不限於烷化劑、血管生成抑制劑、抗有絲分裂劑、激素治療劑及適用於治療細胞增殖病症之抗體。在某些實施例中，治療劑為美登素化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所述之彼等，該等專利各自之內容以引用方式整體併入本文。在某些實施例中，治療劑為苯二氮平化合物，諸如吡咯并苯二氮平(PBD) (諸如WO 2010/043880、WO 2011/130616、WO 2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708所述之彼等)以及吲哚啉并并苯二氮平(IGN)化合物(諸如WO 2010/091150及WO 2012/128868及US 20170014522中所述之彼等，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文。
如本文所用，「吡咯并苯二氮平」(PBD)化合物為具有吡咯并苯二氮平核心結構之化合物。吡咯幷苯二氮平可經取代或未經取代。「吡咯幷苯二氮平」化合物亦可包括具有藉由連接子連接之兩個吡咯幷苯二氮平核心之化合物。可減少作爲吲哚啉幷苯二氮平核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，吡咯幷苯二氮平化合物包含由
Figure 02_image111
表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，吡咯幷苯二氮平化合物包含由4e3
Figure 02_image113
表示之核心結構，其可視情況經取代。
如本文所用，「吲哚啉并并苯二氮平」(IGN)化合物為具有吲哚啉并并苯二氮平核心結構之化合物。吲哚啉幷苯二氮平可經取代或未經取代。「吲哚啉并并苯二氮平」(IGN)化合物亦可包括具有藉由連接子連接之兩個吲哚啉并并苯二氮平核心的化合物。可減少作爲吲哚啉幷苯二氮平核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，吲哚啉并并苯二氮平化合物包含由
Figure 02_image115
表示之核心結構，其可視情況經取代。
在一些實施例中，吲哚啉并并苯二氮平化合物包含由
Figure 02_image117
表示之核心結構，其可進一步經取代。
細胞毒性劑可直接或使用此項技術中已知之技術經由連接子間接偶合或偶聯至EpCAM-結合劑(例如，本文所揭露之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)，以產生「免疫偶聯物」、「偶聯物」、「ADC」或「AADC」。連接子分子
此項技術中已知之任何適合的連接子可用於製備所揭露之免疫偶聯物。在某些實施例中，連接子為雙官能連接子。如本文所用，術語「雙官能連接子」係指具有兩個反應基團之修飾劑；一個反應基團能夠與細胞結合劑反應，而另一個反應基團與細胞毒性化合物反應以將兩個部分連接在一起。此類雙官能交聯劑為此項技術中熟知的(參見例如Isalm及Dent於Bioconjugation 第5章, 第218-363頁, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999中)。例如，能夠經由硫醚鍵連接之雙官能交聯劑包括N -琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(SMCC)以引入順丁烯二醯亞胺基，或者包括N -琥珀醯亞胺基-4-(碘乙醯基)-胺基苯甲酸酯(SICBA)以引入碘乙醯基。將順丁烯二醯亞胺基或鹵基乙醯基引入細胞結合劑上之其他雙官能交聯劑為此項技術中熟知的(參見例如US 2008/0050310及US 20050169933，獲自Pierce Biotechnology Inc. P.O.Box 117, Rockland, IL 61105, USA)，且包括但不限於雙-順丁烯二醯亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2 、BM(PEO)3 、N-(β-順丁烯二醯亞胺基-丙氧基)琥珀醯亞胺酯(BMPS)、γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)、6-順丁烯二醯亞胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(EMCS)、5-順丁烯二醯亞胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-胺基己酸酯)(其為SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC))、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸醯肼或HCl鹽(MPBH)、N-琥珀醯亞胺基 3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)、N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)、κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺酯(KMUA)、N-琥珀醯亞胺基4-(p-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、琥珀醯亞胺基-6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯(SMPH)、琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基磺醯基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙-順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙-順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、磺基琥珀醯亞胺基 4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-SICBA)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-KMUS)及磺基琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
異雙官能交聯劑為具有兩個不同反應基團之雙官能交聯劑。含有胺反應性N -羥基琥珀醯亞胺基(NHS基團)及羰基反應性肼基之異雙官能交聯劑亦可用於將本文所揭露之細胞毒性化合物與細胞結合劑(例如EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)連接。此類市售之異雙官能交聯劑之實例包括琥珀醯亞胺基6-肼基菸醯胺丙酮腙(SANH)、琥珀醯亞胺基4-肼基對苯二甲酸酯鹽酸鹽(SHTH)及琥珀醯亞胺基肼菸酸酯鹽酸鹽(SHNH)。攜帶酸不穩定鍵之偶聯物亦可使用本揭露之攜帶肼之苯二氮平來製備。可用的雙官能交聯劑之實例包括琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯甲酸酯(SFB)及琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯氧基乙酸酯(SFPA)。
使細胞結合劑能夠經由二硫鍵與細胞毒性化合物連接之雙官能交聯劑為此項技術中已知的且包括N -琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)，以引入二硫代吡啶基。可用於引入二硫鍵基團之其他雙官能交聯劑為此項技術中已知的且揭露於美國專利6,913,748、6,716,821以及US 20090274713及20100129314中，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文。或者，亦可使用交聯劑諸如2-亞胺基硫雜環戊烷、高半胱胺酸硫內酯、或S-乙醯基琥珀酸酐引入硫醇基。
在某些實施例中，雙官能連接子由下文所述之式(a1L) - (a10L)中之任一者表示。細胞毒性劑 A. 美登素
在某些實施例中，細胞毒性劑為美登素化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所述之彼等，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文。在某些實施例中，美登素化合物由下式表示：
Figure 02_image119
其中該等變量如上文在以上第一實施例之第13至第15特定實施例之任一者及其中所述之任何更特定實施例中所述。
在一更具體實施例中，美登素化合物為DM4：
Figure 02_image121
。
在另一實施例中，美登素化合物為DM1：
Figure 02_image123
。B. 苯二氮平
在某些實施例中，細胞毒性劑為苯二氮平化合物，諸如吡咯并苯二氮平(PBD) (諸如WO 2010/043880、WO 2011/130616、WO 2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708中所述之彼等)及吲哚啉并并苯二氮平(IGN)化合物(諸如WO 2010/091150及WO 2012/128868及US20170014522中所述之彼等。此等專利、專利公開案及申請案各自之完整教授內容以引用方式整體併入本文。
如本文所用，「苯二氮平」化合物為具有苯二氮平核心結構之化合物。苯二氮平核心可經取代或未經取代及/或與一或多個環結構稠合。其亦包括具有兩個由連接子連接之苯二氮平核心之化合物。可減少作為苯二氮平核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
如本文所用，「吡咯并苯二氮平」(PBD)化合物為具有吡咯并苯二氮平核心結構之化合物。吡咯幷苯二氮平可經取代或未經取代。其亦包括具有兩個由連接子連接之吡咯幷苯二氮平核心之化合物。可減少作爲吲哚啉幷苯二氮平核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，細胞毒性劑為由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之吲哚啉并并苯二氮平化合物：
Figure 02_image125
Figure 02_image127
其中： Lc’ 由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)E (B1)；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs (B2) C(=O)E為反應性酯基團，諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯、硝基苯基(例如，2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯或五氟苯基酯，較佳為N-羥基琥珀醯亞胺酯； Zs 由下式或其藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image129
其中： q為1至5之整數；且 U為-H或SO3 H；且 其餘變量如上文所述之第一實施例之第1至第12及第17特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在某些實施例中，細胞毒性劑為由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之吲哚啉并并苯二氮平化合物：
Figure 02_image131
Figure 02_image133
其中： 式(C1a’)、(C1a’1)、(C1b’)及(C1b’1)之-Lcc 由下式表示：
Figure 02_image135
其中該等變量如在第二實施例之第1至第9及第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述；且 式(C2a定實、(C2a定實施、(C2b定)及(C2b定)施之Lcc ’由下式表示：
Figure 02_image137
其中該等變量如上文在第二實施例之第10至第16及第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在某些實施例中，細胞毒性劑為以下中之任一者的吲哚啉并并苯二氮平化合物或其醫藥學上可接受之鹽：
Figure 02_image139
Figure 02_image141
Figure 02_image143
Figure 02_image145
上文所示之化合物D1、sD1、D2、sD2、DGN462、sDGN462、D3及sD3可根據此項技術中已知之程序製備，例如，如美國專利第9,381,256號、第8,765,740號、第8,426,402號及第9,353,127以及US 2016/0082114中所述，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文中。
在某些實施例中，上文所示之化合物(例如sD1、sD2、sD4、sDGN462、sD3、sD4、sD5、sD5N、sD6或sD7)之醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。在具體實施例中，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
在一特定實施例中，細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image147
；或
Figure 02_image149
。 在一特定實施例中，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在另一特定實施例中，細胞毒性劑由下式表示：
Figure 02_image151
。示範性免疫偶聯物
在第一實施例中，免疫偶聯物包含經由位於EpBA上之一或多個離胺酸之ε-胺基共價連接至本文所揭露之細胞毒性劑的EpCAM-結合劑(EpBA，例如本文所揭露之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)。
在第一實施例之第1特定實施例中，免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image153
其中： EpBA (例如，本文揭露之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)經由離胺酸殘基共價連接至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 為由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之細胞毒性化合物：
Figure 02_image155
其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽； W’為-NRe ’， Re ’為-(CH2-CH2-O)n-Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基； L'由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)- (B1’)；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs1 - (B2’)； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各自獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
Figure 02_image159
其中q為1至5之整數。
在第2特定實施例中，對於式(L1)之偶聯物，CyL1 由式(L1a)或(L1a1)表示；且其餘變量如上文在第1特定實施例中所述。
在第3特定實施例中，對於式(L1)之偶聯物，CyL1 由式(L1b)或(L1b1)表示；且其餘變量如上文在第1特定實施例中所述。更特定言之，Rx3 為(C2 -C4 )烷基。
在第4特定實施例中，對於式(L1)之偶聯物，CyL1 由式(L1a)表示；Ra 及Rb 皆為H；R5 為H或Me，且其餘變量如上文在第1特定實施例中所述。
在第5特定實施例中，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量如上文在第1、第2或第4特定實施例中所述。在一更特定實施例中，P係選自：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala- Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:215)、p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:216)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:217)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D- Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。更特定言之，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、或D-Ala-D-Ala。
在第6特定實施例中，Q為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變量如上文在第1、第2、第4或第5特定實施例或其中所述之任何其他實施例中所述。
在第7特定實施例中，第一實施例之免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image161
Figure 02_image163
Figure 02_image165
Figure 02_image167
Figure 02_image169
Figure 02_image171
Figure 02_image173
Figure 02_image175
Figure 02_image177
Figure 02_image179
其中WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵，X為-H且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含有：包含X1 YX3 X4 H之VH-CDR1，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)；包含WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G之VH-CDR2，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)；及包含X1 GX3 X4 FAY之VH-CDR3，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)。在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含有：包含RSSX4 SLLHSX10 G X12 TYLX16 之VL-CDR1，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之輕鏈VL-CDR2；及包含X1 QX3 LELPX8 T之VL-CDR3，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。
在一些實施例中，EpBA之VH-CDR1包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，EpBA之VH-CDR3包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)。在一些實施例中，EpBA之VL-CDR3包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含有包含SEQ ID NO:155之MM的EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA進一步包含有包含SEQ ID NO:168之CM的EpCAM可活化抗體。在替代性實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含有包含SEQ ID NO:169之CM的EpCAM可活化抗體。在一實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:174之輕鏈。在一實施例中，第1至第7特定實施例之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:179之輕鏈。
在第8特定實施例中，第一實施例之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image183
其中： EpBA為經由Lys殘基共價連接至CyL2 的本文所揭露之EpCAM-結合劑(例如，EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)； WL 為1至20之整數；且 CyL2 由下式表示：
Figure 02_image185
。
在第9特定實施例中，第一實施例之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image187
其中： EpBA為經由Lys殘基共價連接至CyL2 的本文所揭露之EpCAM-結合劑(例如，EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)； WL 為1至20之整數； CyL2 由下式表示：
Figure 02_image189
m’為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
Figure 02_image191
其中q為1至5之整數。
在第10特定實施例中，對於式(L2)之免疫偶聯物，m’為1，且R1 及R2 皆為H；且其餘變量如上文在第13特定實施例中所述。
在第11特定實施例中，對於式(L2)之免疫偶聯物，m’為2，且R1 及R2 皆為Me；且其餘變量如上文在第13特定實施例中所述。
在第12特定實施例中，第一實施例之免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示。
Figure 02_image193
其中WL 為1至10之整數。
在第12特定實施例中，對於第一實施例之免疫偶聯物，Y為-SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K；且其餘變量如上文在第1至第16特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。在一實施例中，Y為-SO3Na。
在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含有：包含X1 YX3 X4 H之VH-CDR1，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)；包含WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G之VH-CDR2，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)；及包含X1 GX3 X4 FAY之VH-CDR3，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含有：包含RSSX4 SLLHSX10 GX12 TYLX16 之輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之輕鏈VL-CDR2；及包含X1 QX3 LELPX8 T之VL-CDR3，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。
在一些實施例中，EpBA之VH-CDR1包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，EpBA之VH-CDR3包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)。在一些實施例中，EpBA之VL-CDR3包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含有包含SEQ ID NO:155之MM的EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA進一步包含有包含SEQ ID NO:168之CM的EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含有包含SEQ ID NO:169之CM的EpCAM可活化抗體。在一實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:174之輕鏈。在一實施例中，第8至第12特定實施例之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:179之輕鏈。
在某些實施例中，對於包含第一實施例、或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12特定實施例之免疫偶聯物的組成物(例如醫藥組成物)，組成物中每個抗體分子之細胞毒性劑之平均數目(亦即，wL之平均值)亦稱為藥物-抗體比率(DAR)，其範圍為1.0至8.0。在一些實施例中，DAR範圍為1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5、或1.8至2.2。在一些實施例中，DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0、或小於2.5。
在第二實施例中，免疫偶聯物包含經由位於EpBA上之一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基(-SH)共價連接至本文所揭露之細胞毒性劑的EpBA。
在第1特定實施例中，第二實施例之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image195
其中： EpBA為經由半胱胺酸殘基共價連接至CyC1 的本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體； WC 為1或2； CyC1 由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image197
其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數； W'為-NRe' ， Re’ 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基；且 LC 由以下表示：
Figure 02_image200
其中s1為共價連接至EpBA之位點，且s2為共價連接至CyC1 上之-C(=O)-基團的位點；其中 R19 及R20 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； m"為1與10之間的整數；且 Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基。
在第2特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，CyC1由式(C1a)或(C1a1)表示；且其餘變量如上文在第二實施例之第1特定實施例中所述。
在第3特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，CyC1由式(C1b)或(C1b1)表示；且其餘變量如上文在第二實施例之第1特定實施例中所述。
在第4特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，CyC1由式(C1a)或(C1a1)表示；Ra及Rb皆為H；且R5為H或Me；且其餘變量如上文在第二實施例之第1或第2特定實施例中所述。
在第5特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量如上文在第1、第2或第4特定實施例中所述。在一更特定實施例中，P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -tosyl-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly- Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:215)、ß-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:216)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:217)、Val-Arg、Arg- Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D- Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更特定實施例中，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、或D-Ala-D-Ala。
在第6特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變量如上文在第二實施例之第1、第2、第4或第5特定實施例或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在第7特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，R19及R20皆為H；且m”為1至6之整數；且其餘變量如上文在第二實施例之第1、第2、第3、第4、第5或第6特定實施例或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在第8特定實施例中，對於式(C1)之免疫偶聯物，-L-LC-由下式表示：
Figure 02_image202
且其餘變量如上文在第二實施例之第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7特定實施例或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在第9特定實施例中，第二實施例之免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image204
Figure 02_image206
其中N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，N與C之間的雙線
Figure 02_image157
表示單鍵，X為-H且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第3實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image210
其中：
Figure 02_image212
為經由Lys胺基連接至L2 之EpBA；
Figure 02_image214
為經由Cys硫醇基連接至L2 基團之EpBA； R3 及R4 各自獨立地為H或Me； m1、m3、n1、r1、s1及t1各自獨立地為1至6之整數； m2、n2、r2、s2及t2各自獨立地為1至7之整數； t3為1至12之整數； D1 由下式表示：
Figure 02_image216
；及 q為1至20之整數。在一更特定實施例中，D1 由下式表示：
Figure 02_image218
。
在第3實施例之第1特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image220
其中： m1及m3各自獨立地為2至4之整數； m2為2至5之整數； r1為2至6之整數； r2為2至5之整數；且 其餘變量如第3實施例中所述。
在第2特定實施例中，對於第3實施例及第1特定實施例中所述之免疫偶聯物，A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro、或D-Ala-tBu-Gly。在一更特定實施例中，對於第3實施例及第1特定實施例中所述之免疫偶聯物，A為L-Ala-D-Ala-L-Ala。
在第3特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image222
Figure 02_image224
Figure 02_image226
Figure 02_image228
Figure 02_image230
Figure 02_image232
Figure 02_image234
Figure 02_image236
Figure 02_image238
其中： A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly，且 D1 由下式表示：
Figure 02_image240
； 且其餘變量如第3實施例及其第1及第2特定實施例中所述。在一更特定實施例中，A為L-Ala-D-Ala-L-Ala。在一更特定實施例中，D1 由下式表示：
Figure 02_image242
。
在第4特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image244
Figure 02_image246
其中D1 由下式表示：
Figure 02_image248
。
在第5特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image250
其中： CBA為EpBA； q為1或2； D1 由下式表示：
Figure 02_image252
。
在第6特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image254
其中： CBA為EpBA； q為1或10之整數； D1 由下式表示：
Figure 02_image256
。
在另一特定實施例中，本揭露提供一種EpBA免疫偶聯物，其包含經由γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)或N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS或sGMBS)連接子與由下式表示之美登素化合物DM21L (亦稱為LDL-DM)偶合之EpBA (例如EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)：
Figure 02_image258
。 GMBS及磺基-GMBS (或sGMBS)連接子為此項技術中已知的且可由以下結構式表示：
Figure 02_image260
。
在一實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image262
， 其中： EpBA為經由Lys胺基連接至美登素化合物之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其中q為1或10之整數。
在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含有：包含X1 YX3 X4 H之VH-CDR1，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)；包含WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G之VH-CDR2，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)；及包含X1 GX3 X4 FAY之VH-CDR3，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)。在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含有：包含RSSX4 SLLHSX10 GX12 TYLX16 之輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)；包含QTSNLAS (SEQ ID NO:40)之輕鏈VL-CDR2；及包含X1 QX3 LELPX8 T之VL-CDR3，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。
在一些實施例中，EpBA之VH-CDR1包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，EpBA之VH-CDR3包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)。在一些實施例中，EpBA之VL-CDR3包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含有包含SEQ ID NO:155之MM的EpCAM可活化抗體。在一些實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA進一步包含有包含SEQ ID NO:168之CM的EpCAM可活化抗體。在替代性實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含有包含SEQ ID NO:169之CM的EpCAM可活化抗體。在一實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:174之輕鏈。在一實施例中，EpBA-DM21L偶聯物之EpBA包含EpCAM可活化抗體，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:179之輕鏈。
在某些實施例中，對於包含EpBA-LDL-DM免疫偶聯物之組成物(例如醫藥組成物)，每個抗體分子之細胞毒性劑之平均數目(亦即，q之平均值)亦稱為藥物-抗體比率(DAR)，DAR範圍為3.0至4.0、3.2至3.8、或3.4至3.7。在一些實施例中，DAR為3.2、3.3、3.4、3.5、3.5、3.7或3.8。製備免疫偶聯物之方法
包含經由位於如以上第一實施例或其中所述之任何特定實施例所述之EpBA上的一或多個離胺酸殘基之ε-胺基共價連接至細胞毒性劑之EpCAM-結合劑的免疫偶聯物(EpBA，例如EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)可藉由此項技術中已知之任何方法製備，參見例如WO 2012/128868及WO 2012/112687，該等文獻各自之內容以引用方式整體併入本文。
在某些實施例中，第一實施例之免疫偶聯物藉由第一方法製備，該第一方法包含使EpBA (例如，本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)與具有胺反應基之細胞毒性劑反應之步驟。
在一實施例中，對於上文所述之第一方法，在亞胺反應性試劑諸如NaHSO3 存在下進行該反應。
在一實施例中，對於上文所述之第一方法，具有胺反應基之細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image264
其中該等變量之定義如上文對於式(L1a’)、(L1a’1)、(L1b’)及(L1b’1)所述。
在某些實施例中，第一實施例之免疫偶聯物藉由第二方法製備，該第二方法包含如下步驟： (a) 使細胞毒性劑與具有胺反應基及硫醇反應基之連接子化合物反應以形成具有與其結合之胺反應基的細胞毒性劑-連接子化合物；及 (b) 使EpBA與細胞毒性劑-連接子化合物反應。
在一實施例中，在亞胺反應性試劑(例如NaHSO3 )存在下進行步驟(a)之反應。在一實施例中，在未經純化下使細胞毒性劑-連接子化合物與EpBA反應。或者，首先純化細胞毒性劑-連接子化合物，之後與EpBA反應。
在某些實施例中，第一實施例之免疫偶聯物藉由第三方法製備，該第三方法包含如下步驟： (a) 使EpBA與具有胺反應基及硫醇反應基之連接子化合物反應以形成具有與其結合之硫醇反應基的經修飾之EpBA；及 (b) 使經修飾之EpBA與細胞毒性劑反應。
在一實施例中，在亞胺反應性試劑(例如NaHSO3 )存在下進行步驟(b)之反應。
在某些實施例中，第一實施例之免疫偶聯物藉由第四方法製備，該第四方法包含使EpBA、細胞毒性化合物及具有胺反應基及硫醇反應基之連接子化合物反應之步驟。在一實施例中，在亞胺反應性試劑(例如NaHSO3 )存在下進行反應。
在某些實施例中，對於上文所述之第二、第三或第四方法，具有胺反應基及硫醇反應基之連接子化合物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image266
其中X為鹵素；JD -SH、-SSRd 或-SC(=O)Rg ；Rd 為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；Rg 為烷基；且其餘變量如上文對於式(a1) - (a10)所述；且細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image268
其中該等變量如上文對於式(L1a’)、(L1a’1)、(L1b’)、(L1b’1)、(L2a’)、(L2a’1)、(L2b’)及(L2b’1)所述。
在某些實施例中，對於上文所述之第二、第三或第四方法，具有胺反應基及硫醇反應基之連接子化合物由式(a1L) - (a10L)中之任一者表示且細胞毒性劑由下式表示：
Figure 02_image270
其中該等變量如上文在以上所述之第一實施例之第13至第15特定實施例之任一者及其中所述之任何更特定實施例中所述。
在一特定實施例中，對於上文所述之第二、第三或第四方法，連接子為磺基-SPDB，細胞毒性劑為DM4，且免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image272
其中WL 為1至10之整數。
經由位於如以上第二實施例中所述之EpCAM-結合劑上的一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基(-SH)共價連接至細胞毒性劑之EpCAM-結合劑的免疫偶聯物(例如，第1至第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例之免疫偶聯物)可藉由使具有一或多個自由半胱胺酸之EpBA與本文所揭露之具有硫醇反應基之細胞毒性劑反應來製備。
在一實施例中，具有硫醇反應基之細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image274
其中-LC c 由下式表示：
Figure 02_image276
其中該等變量如以上在第二實施例之第1至第9及第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在另一實施例中，具有硫醇反應基之細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image278
Figure 02_image280
其中Lcc’一由下式表示：
Figure 02_image282
其中該等變量如以上在第二實施例之第10至第16及第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在又一實施例中，具有硫醇反應基之細胞毒性劑由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image284
其中LCc鹽如上文所述且其餘變量如以上在第二實施例之第17至第23特定實施例之任一者或其中所述之任何更特定實施例中所述。
在某些實施例中，在EpBA與細胞毒性劑之反應中使用有機溶劑以溶解細胞毒性劑。示範性有機溶劑包括但不限於二甲基乙醯胺(DMA)、丙二醇等。在一實施例中，在DMA及丙二醇存在下進行EpBA與細胞毒性劑之反應。
在一特定實施例中，由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之細胞毒性劑：
Figure 02_image286
與EpBA (例如，本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)反應以形成由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之免疫偶聯物：
Figure 02_image288
其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且WC為1或2。在一更特定實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。甚至更特定言之，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在某些實施例中，當Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽時，免疫偶聯物藉由如下步驟製備：(a) 使上文所述具有硫醇反應基且含有亞胺之細胞毒性劑(亦即，式(C1a’)、(C1a’1)、(C1b’)、(C1b’1)、(C2a’’)、(C2a’’1)、(C2b’’)或(C2b’’1)，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H)中的亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在pH 1.9至5.0之水溶液中反應以形成包含由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之經修飾之亞胺部分的經修飾之細胞毒性劑：
Figure 02_image290
及(b) 使經修飾之細胞毒性劑與本文所揭露之EpCAM-結合劑(例如，本文所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)反應以形成免疫偶聯物。
在第1態樣中，對於上文所述之方法，在pH 1.9至5.0下進行步驟(a)之反應。更具體而言，pH值為2.5至4.9、1.9至4.8、2.0至4.8、2.5至4.5、2.9至4.5、2.9至4.0、2.9至3.7、3.1至3.5、或3.2至3.4。在另一特定實施例中，步驟(a)之反應在pH 1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0下進行。在又一特定實施例中，步驟(a)之反應在pH 3.3下進行。如本文所用，具體pH值意指具體值± 0.05。
在一些實施例中，在緩衝溶液存在下進行步驟(a)之反應。在所提供之方法中可使用此項技術中已知之任何適合的緩衝溶液。適合的緩衝溶液包括例如但不限於檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、含甘胺酸之緩衝液(例如，甘胺酸-HCl緩衝液)、苯二甲酸鹽緩衝液(例如，包含苯二甲酸氫鈉或苯二甲酸氫鉀之緩衝溶液)及其組合。在一些實施例中，緩衝溶液為琥珀酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及Na2HPO4之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在其他實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及K2HPO4之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，上文所述之緩衝溶液之濃度可在10至250 mM、10至200 mM、10至150 mM、10至100 mM、25至100 mM、25至75 mM、10至50 mM、或20至50 mM之範圍內。
在第2態樣中，在緩衝溶液(例如，第1態樣中所述之緩衝液)不存在下進行步驟(a)之反應。在一些實施例中，本發明方法包含如下步驟：(a)使上文所述具有硫醇反應基且含有亞胺之細胞毒性劑(亦即，式(C1a’)、(C1a’1)、(C1b’)、(C1b’1)、(C2a’’)、(C2a’’1)、(C2b’’)或(C2b’’1)，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H)中的亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在水溶液中反應以形成包含由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之經修飾之亞胺部分的經修飾之細胞毒性劑：
Figure 02_image292
其中該水溶液不包含緩衝液；及(b)使經修飾之細胞毒性劑與本文揭露之EpCAM-結合劑(例如，本文揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體)反應以形成免疫偶聯物。在一些實施例中，步驟(a)之反應於有機溶劑與水之混合物中進行。更具體而言，步驟(a)之反應於二甲基乙醯胺(DMA)與水之混合物中進行。在一些實施例中，DMA與水之混合物包含按體積計小於60%之DMA。甚至更具體而言，DMA與水之體積比為1:1。
在第3態樣中，對於上文或在第一或第二態樣中所述之方法，在步驟(a)之反應中每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至5.0當量亞硫酸氫鹽或0.25或2.5當量偏亞硫酸氫鹽。在一些實施例中，每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至4.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至3.0、0.5至2.5、0.8至2.0、0.9至1.8、1.0至1.7、1.1至1.6、或1.2至1.5當量亞硫酸氫鹽，或0.25至2.25、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至1.5、0.25至1.25、0.4至1.0、0.45至0.9、0.5至0.85、0.55至0.8、或0.6至0.75當量偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5或5.0當量亞硫酸氫鹽，或0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65 0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、2.0、2.25或2.5當量偏亞硫酸氫鹽。在又其他實施例中，每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用1.4當量亞硫酸氫鹽或0.7當量偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用1.2當量亞硫酸氫鹽或0.6當量偏亞硫酸氫鹽。如本文所用，具體當量意指具體值± 0.05。
在第4態樣中，對於上文所述之方法，在pH 2.9至3.7下進行步驟(a)之反應，且使1.0至1.8當量亞硫酸氫鹽或0.5至0.9當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在一些實施例中，步驟(a)之反應在pH 3.1至3.5下進行，且使1.1至1.6當量亞硫酸氫鹽或0.55至0.8當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，在pH 3.2至3.4下進行步驟(a)之反應，且使1.3至1.5當量亞硫酸氫鹽或0.65至0.75當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，步驟(a)之反應在pH 3.3下進行，且使1.4當量亞硫酸氫鹽或0.7當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在又其他實施例中，在pH 3.3下進行步驟(a)之反應，且使1.4當量亞硫酸氫鈉與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。
在第5態樣中，對於上文或在第1、第2、第3或第4態樣中所述之方法，在有機溶劑與水之混合物中進行步驟(a)之反應。可使用任何適合的有機溶劑。示範性有機試劑包括但不限於醇類(例如甲醇、乙醇、丙醇等)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。在一些實施例中，有機溶劑與水混溶。在其他實施例中，有機溶劑不可與水混溶，亦即，步驟(a)之反應在雙相溶液中進行。在一些實施例中，有機溶劑為二甲基乙醯胺(DMA)。有機溶劑(例如DMA)可按水與有機溶劑之總體積計以1%-99%、1-95%、10-80%、20-70%、30-70%、1-60%、5-60%、10-60%、20-60%、30-60%、40-60%、45-55%、10-50%、或20-40%之量存在。在一些實施例中，步驟(a)之反應於DMA與水之混合物中進行，其中DMA與水之體積比為1:1。
在第6態樣中，對於上文或在第1、第2、第3、第4或第5態樣中所述之方法，可在任何適合溫度下進行步驟(a)之反應。在一些實施例中，在0℃至50℃、10℃至50℃、10℃至40℃、或10℃至30℃之溫度下進行反應。在其他實施例中，在15℃至30℃、20℃至30℃、15℃至25℃、16℃至24℃、17℃至23℃、18℃至22℃、或19℃至21℃之溫度下進行反應。在又其他實施例中，可在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下進行反應。在一些實施例中，可在0℃至15℃、0℃至10℃、1℃至10℃、5℃至15℃、或5℃至10℃下進行反應。
在第7態樣中，對於上文或在第1、第2、第3、第4、第5或第6態樣中所述之方法，進行步驟(a)之反應達1分鐘至48小時、5分鐘至36小時、10分鐘至24小時、30分鐘至24小時、30分鐘至20小時、1小時至20小時、1小時至15小時、1小時至10小時、2小時至10小時、3小時至9小時、3小時至8小時、4小時至6小時、或1小時至4小時。在一些實施例中，使反應進行4至6小時。在其他實施例中，使反應進行10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時等。在其他實施例中，使反應進行4小時。在又其他實施例中，使反應進行2小時。
在第8態樣中，對於本文或在第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7態樣中所揭露之方法，在pH 4至9下進行步驟(b)之反應。在一些實施例中，步驟(b)之反應在pH 4.5至8.5、5至8.5、5至8、5至7.5、5至7、5至6.5、或5.5至6.5下進行。在其他實施例中，在pH 5.0、5.1、5.2、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下進行步驟(b)之反應。
在一些實施例中，對於上文或在第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8態樣中所述之方法，在包含水與有機溶劑之混合物的水溶液中進行步驟(b)之反應。可使用上文所述之任何合適的有機溶劑。更具體而言，有機溶劑為DMA。在一些實施例中，水溶液包含按體積計小於50%、小於40%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於3%、小於2%、或小於1%之有機溶劑(例如DMA)。
在一些實施例中，對於本文或在第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8態樣中所揭露之方法，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鉀。在一特定實施例中，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉。
在一些實施例中，對於本文或在第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8態樣中所揭露之方法，經修飾之細胞毒性劑在與步驟(b)中之細胞結合劑反應之前未經純化。或者，經修飾之細胞毒性劑在步驟(b)中與細胞結合劑反應之前經純化。本文揭露之任何適合方法均可用於純化經修飾之細胞毒性劑。
在一些實施例中，對於上文所述之方法，步驟(a)之反應未引起順丁烯二醯亞胺基團之實質磺化。在一些實施例中，少於50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之順丁烯二醯亞胺基團為磺化的。順丁烯二醯亞胺磺化百分比等於順丁烯二醯亞胺磺化之細胞毒性劑(僅對順丁烯二醯亞胺具有磺化之細胞毒性劑)及二磺化之細胞毒性劑(對順丁烯二醯亞胺及亞胺部分具有磺化之細胞毒性劑)之總量除以含亞胺之細胞毒性劑在其與亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽反應前之起始量。
在一些實施例中，藉由上文所述之任何方法製備之免疫偶聯物經歷純化步驟。就此而言，免疫偶聯物可使用切向流過濾(TFF)、非吸附性層析、吸附性層析、吸附性過濾、選擇性沉澱、或任何其他適合的純化方法、以及其組合由混合物之其他組分純化。
在一些實施例中，免疫偶聯物使用單個純化步驟(例如TFF)純化。較佳，偶聯物係使用單個純化步驟(例如，TFF)純化並交換至適當調配物中。在其他實施例中，免疫偶聯物係使用兩個連續純化步驟純化。例如，免疫偶聯物可首先藉由選擇性沉澱、吸附性過濾、吸附性層析或非吸附性層析來純化，接著以TFF純化。熟悉此項技藝者將瞭解，免疫偶聯物之純化能夠分離包含與細胞毒性劑化學偶合之細胞結合劑的穩定偶聯物。
任何合適之TFF系統均可用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore, Billerica, Mass.)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG, Edgewood, N.Y.)、及Centrasette型系統(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。
任何合適之吸附性層析樹脂均可用於純化。較佳吸附性層析樹脂包括氫氧磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定金屬親和層析(IMAC)、染料配位體層析、親和層析、逆相層析及其組合。合適之氫氧磷灰石樹脂之實例包括陶瓷氫氧磷灰石(CHT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)、HA Ultrogel氫氧磷灰石(Pall Corp., East Hills, N.Y.)及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。合適之HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖、及辛基瓊脂糖樹脂(全部均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)、以及Macro-prep甲基及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、及Q-瓊脂糖樹脂(全部均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)、及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之混合模式離子交換器之實例包括Bakerbond CBAx樹脂(JT Baker, Phillipsburg N.J.)。合適之IMAC樹脂之實例包括Chelating瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之染料配位體樹脂之實例包括藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之親和樹脂之實例包括蛋白A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和樹脂，例如Lentil凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑攜帶適當的凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑有特異性之抗體。此類抗體可固定至例如瓊脂糖4快速流動樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)。合適之逆相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac, Hesperia, Calif.)。
任何合適之非吸附性層析樹脂均可用於純化。適合之非吸附性層析樹脂之實例包括但不限於SEPHADEX™ G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL™樹脂( 例如 S-200及S-300)、SUPERDEX™樹脂(例如SUPERDEX™ 75及SUPERDEX™200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)以及熟悉此項技藝者已知之其他樹脂。
包含與本文第3實施例中所述之美登素化合物共價連接之EpBA的免疫偶聯物可根據此項技術中已知之任何適合方法製備。
在某些實施例中，免疫偶聯物可藉由第一方法製備，該第一方法包含使EpBA與式(II)之美登素化合物反應之步驟： L2 '—A—NH—CR1 R2 -S-L1 —D (II)。
在某些實施例中，免疫偶聯物可藉由第二方法製備，該第二方法包含如下步驟： (a) 使式(III)或(IV)之美登素化合物與本文所述之連接子化合物反應以形成具有與其結合之胺反應基或硫醇反應基且可共價連接至EpBA之細胞毒性劑-美登素化合物，其中式(III)及(IV)由以下表示：
Figure 02_image294
(b) 使EpBA與美登素-連接子化合物反應以形成免疫偶聯物。
在某些實施例中，免疫偶聯物可藉由第三方法製備，該第三方法包含如下步驟： (a) 使EpBA與本文所述之連接子化合物反應以形成具有與其結合之胺反應基或硫醇反應基且可共價連接至式(III)或(IV)之美登素化合物的經修飾之抗-EpBA( 例如 式(II)之化合物)；及 (b) 使經修飾之EpBA與式(III)或(IV)之美登素化合物反應以形成免疫偶聯物。
在某些實施例中，免疫偶聯物可藉由第三方法製備，該第三方法包含使EpBA、連接子化合物及式(III)或(IV)之美登素化合物反應以形成免疫偶聯物。在一實施例中，首先混合EpBA與式(III)或(IV)之美登素化合物，接著添加連接子化合物。
在某些實施例中，對於上文所述之第二、第三或第四方法，連接子化合物由式(a1L) - (a10L)中之任一者表示：
Figure 02_image296
Figure 02_image298
其中X為鹵素；JD -SH或-SSRd ；Rd 為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；Rg 為烷基；且U為-H或SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在一實施例中，連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在一特定實施例中，本發明之免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image300
； 且免疫偶聯物可藉由上文所述之第二、第三或第四方法製備，其中該連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且該美登素化合物由式(D-1)表示：
Figure 02_image302
其中D1 由下式表示：
Figure 02_image304
。
在一更特定實施例中，式(I-1)之免疫偶聯物藉由使式(D-1)之美登素化合物與連接子化合物GMBS或磺基-GMBS反應以形成美登素-連接子化合物，接著使EpBA與美登素-連接子化合物反應來製備。在一甚至更特定實施例中，美登素連接子化合物在與EpBA反應前未經純化。
在另一特定實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image306
；且免疫偶聯物可藉由上文所述之第二、第三或第四方法製備，其中該連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且該美登素化合物由上文所述之式(D-2)表示。在一更特定實施例中，式(I-2)之免疫偶聯物藉由使式(D-2)之美登素化合物與連接子化合物GMBS或磺基-GMBS反應以形成美登素-連接子化合物，接著使EpBA與美登素-連接子化合物反應來製備。在一甚至更特定實施例中，美登素連接子化合物在與EpBA反應前未經純化。
在另一特定實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image308
；且該免疫偶聯物根據上文所述之第一方法藉由使EpBA與式(D-3)之美登素化合物反應來製備：
Figure 02_image310
。
在另一特定實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image312
；且該免疫偶聯物根據上文所述之第一方法藉由使EpBA與式(D-4)之美登素化合物反應來製備：
Figure 02_image314
。
在另一特定實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image316
；且該免疫偶聯物根據上文所述之第一方法藉由使EpBA與式(D-5)之美登素化合物反應來製備：
Figure 02_image318
。
在另一特定實施例中，免疫偶聯物由下式表示：
Figure 02_image320
；且該免疫偶聯物根據上文所述之第一方法藉由使EpBA與式(D-6)之美登素化合物反應來製備：
Figure 02_image322
。
在一些實施例中，藉由上文所述之任何方法製備之免疫偶聯物經歷純化步驟。就此而言，免疫偶聯物可使用切向流過濾(TFF)、非吸附性層析、吸附性層析、吸附性過濾、選擇性沉澱、或任何其他適合之純化方法、以及其組合由混合物之其他組分純化。
在一些實施例中，免疫偶聯物使用單個純化步驟(例如TFF)純化。較佳，偶聯物係使用單個純化步驟(例如，TFF)純化並交換至適當調配物中。在本發明之其他實施例中，免疫偶聯物係使用兩個連續純化步驟純化。例如，免疫偶聯物可首先藉由選擇性沉澱、吸附性過濾、吸附性層析或非吸附性層析來純化，接著以TFF純化。熟悉此項技藝者將瞭解，免疫偶聯物之純化能夠分離包含與細胞毒性劑化學偶合之細胞結合劑的穩定偶聯物。
任何合適之TFF系統均可用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore, Billerica, Mass.)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG, Edgewood, N.Y.)及Centrasette型系統(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。
任何合適之吸附性層析樹脂均可用於純化。較佳吸附性層析樹脂包括氫氧磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定金屬親和層析(IMAC)、染料配位體層析、親和層析、逆相層析及其組合。合適之氫氧磷灰石樹脂之實例包括陶瓷氫氧磷灰石(CHT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)、HA Ultrogel氫氧磷灰石(Pall Corp., East Hills, N.Y.)、及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。合適之HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖、及辛基-瓊脂糖樹脂(所有均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)、以及Macro-prep甲基及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、及Q-瓊脂糖樹脂(全部均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)、及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之混合模式離子交換器之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker, Phillipsburg N.J.)。合適之IMAC樹脂之實例包括Chelating瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之染料配位體樹脂之實例包括藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適之親核樹脂之實例包括蛋白A瓊脂糖樹脂(例如，MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和樹脂，例如Lentil凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑攜帶適當的凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑有特異性之抗體。此類抗體可固定至例如瓊脂糖4快速流動樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)。合適之逆相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac, Hesperia, Calif.)。
任何合適之非吸附性層析樹脂均可用於純化。合適之非吸附性層析樹脂之實例包括但不限於SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如，S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如，SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如，P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)、及一般熟習此項技術者已知之其他樹脂。診斷及研究應用
除了本文所討論之抗體之治療用途以外，本文所提供之抗體片段及可活化抗體亦可用於許多已知的診斷及研究應用中。所提供之EpCAM抗體及/或EpCAM-結合抗體片段可用於例如純化、偵測及靶向EpCAM，包括活體外 及活體內 診斷方法。例如，抗體及/或片段可用於在免疫測定中定性及定量量測由生物樣品中之細胞表現之EpCAM水準( 例如 人類EpCAM或獼猴EpCAM)。參見例如 Harlow等人 , Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)，該文獻之完整內容以引用方式併入本文。
所提供之EpCAM抗體及/或EpCAM-結合抗體片段可用於例如競爭結合測定、直接及間接夾心測定、以及免疫沉澱測定(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 第147-158頁(CRC Press, Inc., 1987))。
可偵測標記之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及/或EpCAM可活化抗體可藉由連接至酶免疫測定(EIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)中所用之酶來達成。所連接之酶與經暴露之受質反應以產生可例如藉由分光光度法、螢光光度法或藉由目視方式偵測之化學部分。可用於可偵測標記例如所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體之酶包括但不限於蘋果酸去氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母乙醇去氫酶、α-甘油磷酸去氫酶、丙醣磷酸異構酶、山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶、天門冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核醣核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶、葡萄糖澱粉酶及乙醯基膽鹼脂酶。
藉由放射性標記EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體，可能經由使用放射性免疫測定(RIA)偵測EpCAM (參見例如Work等人, Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y.(1978))。放射性同位素可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器或藉由自動放射攝影術之方式偵測。特別適用於本揭露之目的之同位素為：3 H、125 I、131 I、35 S、14 C，且較佳為125 I。
亦可能以螢光化合物標記EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體。當經螢光標記之抗體、抗體片段或可活化抗體暴露於適當波長之光時，則可由於螢光而偵測其存在。最常用之螢光標記化合物為螢光素異硫氰酸鹽、玫瑰紅、藻紅素、藻藍素、異藻藍蛋白、鄰苯二甲醛及螢光胺。
EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體亦可使用螢光發射金屬諸如125Eu或其他鑭系元素來可偵測地標記。此等金屬可使用金屬螯合基團諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺-四乙酸(EDTA)連接至EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體。
在額外實施例中，EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體藉由與化學發光化合物偶合來可偵測地標記。經化學發光標記之抗體或抗體片段之存在接著藉由偵測在化學反應過程期間出現的發光之存在來判定。特別有用之化學發光標記化合物之實例為流明諾、異流明諾、芳族(theromatic)吖啶酯、咪唑、吖啶鹽及草酸酯。同樣，生物發光化合物可用於標記EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體或其衍生物。生物發光為催化性蛋白提高化學發光反應之效率的生物系統中可見的一種類型之化學發光。生物發光蛋白之存在藉由偵測發光之存在來判定。用於標記目的之重要生物發光化合物為螢光素、螢光素酶及水母素。
EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段及EpCAM可活化抗體適用於活體內成像，其中向受試者投與以可偵測部分諸如不透射線劑或放射性同位素標記之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體，較佳投與至血流中，且分析宿主中經標記抗體或抗體片段之存在及定位。此成像技術適用於對惡性腫瘤進行分期及治療。EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體可以在宿主中藉由核磁共振、放射線或此項技術中已知之其他偵測手段可偵測之任何部分標記。
根據所揭露之方法使用之標記可為能夠直接或間接產生可偵測信號之任何可偵測部分。例如，標記可為生物素標記、酶標記( 例如 螢光素酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及山葵過氧化酶)、放射性標記( 例如 3 H、14 C、32 P、35 S及125 I)、螢光團諸如螢光或化學發光化合物( 例如 螢光素異硫氰酸鹽、玫瑰紅)、顯像劑( 例如 Tc-m99 及銦(111 In))以及金屬離子( 例如 鎵及銪)。
可採用此項技術中已知用於將EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段或EpCAM可活化抗體偶聯至標記之任何方法，包括由以下文獻所述之彼等示範性方法：Hunter等人 , Nature 144:945 (1962)；David等人 , Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain等人 , J. Immunol.Meth. 40:219 (1981)；Nygren,Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)。治療應用
亦包括用於抑制表現EpCAM( 例如 人類EpCAM或獼猴EpCAM)之細胞之生長的方法。如本文所提供，所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體及/或其偶聯物具有結合存在於細胞( 例如 人類細胞或獼猴細胞)表面上之EpCAM且介導細胞殺滅之能力。在具體實施例中，免疫偶聯物包含細胞毒性有效負荷，例如 吲哚啉并并苯二氮平DNA-烷化劑，經內化且經由 細胞毒性有效負荷(例如 苯二氮平，例如 吲哚啉并并苯二氮平DNA-烷化劑)之活性來介導細胞殺滅。此類細胞殺滅活性可藉由免疫偶聯物誘導的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)來增強。
如本文所用，術語「抑制(inhibit/ inhibiting)」包括對細胞生長(包括細胞死亡)之任何抑制效應。抑制效應包括暫時性效應、持續性效應及永久性效應。
本文所提供之治療應用包括治療患有疾病之受試者之方法。以所提供之方法治療之疾病為特徵在於表現( 例如 EpCAM過表現)之彼等疾病。此類疾病包括例如乳癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、結直腸癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、或小腸癌、胰腺癌、或其他上皮癌、或與其相關之轉移。熟悉此項技藝者將理解，本揭露之方法亦可用於治療待描述但由EpCAM之表現表徵之其他疾病。
在其他具體實施例中，所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體及/或其偶聯物適用於治療表現EpCAM之癌症。在一些實施例中，癌症為上皮癌或鱗狀癌。在一些實施例中，癌症為乳癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、結直腸癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、胰腺癌或小腸癌。
本文所提供之治療應用亦可在活體外 及離體 實踐。
本揭露亦提供所揭露之EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、EpCAM可活化抗體及/或其偶聯物之治療應用，其中向受試者投與以醫藥學上可接受之劑型的該等抗體、抗體片段、可活化抗體或偶聯物。其可以推注形式或在一定時間段內藉由連續輸注靜脈內投與，藉由肌內、皮下、非經腸、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑來投與。其亦可藉由瘤內、瘤周、病灶內或病灶周途徑投與，以發揮局部以及全身性治療作用。
亦提供使用結合EpCAM之EpCAM可活化抗體，特別是結合且中和或以其他方式抑制EpCAM之至少一種生物活性及/或EpCAM-介導之信號傳導的EpCAM可活化抗體來在受試者中治療、預防與EpCAM異常表現及/或活性相關之症狀、及/或延緩該症狀之發作或進展、或減輕該症狀之方法。
在一些實施例中，本揭露提供使用結合EpCAM之EpCAM可活化抗體，特別是結合、靶向、中和、殺滅或以其他方式抑制表現或異常表現EpCAM之細胞之至少一種生物活性的EpCAM可活化抗體來在受試者中治療、預防與表現EpCAM或異常表現EpCAM之細胞之存在、生長、增殖、轉移及/或活性相關之症狀、及/或延緩該症狀之發作或進展、或減輕該症狀之方法。本揭露亦提供使用結合EpCAM之EpCAM可活化抗體，特別是結合、靶向、中和、殺滅或以其他方式抑制表現EpCAM之細胞之至少一種生物活性的EpCAM可活化抗體來在受試者中治療、預防與表現EpCAM之細胞之存在、生長、增殖、轉移及/或活性相關之症狀、及/或延緩該症狀之發作或進展、或減輕該症狀之方法。
本揭露亦提供使用結合EpCAM之EpCAM可活化抗體，特別是結合、靶向、中和、殺滅或以其他方式抑制異常表現EpCAM之細胞之至少一種生物活性的EpCAM可活化抗體來在受試者中治療、預防與異常表現EpCAM之細胞之存在、生長、增殖、轉移及/或活性相關之症狀、及/或延緩該症狀之發作或進展、或減輕該症狀之方法。
本揭露提供在受試者中預防EpCAM介導之疾病、延緩該疾病之進展、治療該疾病、減輕該疾病之症狀或以其他方式改善該疾病之方法，該等方法藉由向有需要之受試者投與治療有效量之本文所揭露之EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體來進行。
本揭露亦提供在受試者中預防癌症( 例如 上皮癌及其轉移)、延緩該癌症之進展、治療該癌症、減輕該癌症之症狀或以其他方式改善該癌症之方法，該等方法藉由向有需要之受試者投與治療有效量之本文所揭露之EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體來進行。已知EpCAM在多種癌症中表現，包括大多數上皮來源之癌症(及轉移)。
在一些實施例中，癌症為上皮癌或鱗狀癌。
在一些實施例中，癌症為乳癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、結直腸癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、胰腺癌或小腸癌。
在一些實施例中，癌症為乳癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、結腸癌、直腸癌、小腸癌、卵巢癌、胃癌或食道癌。
在一些實施例中，癌症為卵巢癌、子宮癌、胃癌、前列腺癌或結直腸癌。
在一些實施例中，癌症為卵巢癌。
在一些實施例中，癌症為子宮癌。
在一些實施例中，癌症為胃癌。
在一些實施例中，癌症為胰腺癌。
在一些實施例中，癌症為結直腸癌。
在一些實施例中，癌症為乳癌。在某些實施例中，癌症為三陰性乳癌。
在一些實施例中，癌症為肺癌。在一些實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。在一些實施例中，非小細胞肺癌為非鱗狀非小細胞肺癌。
此等方法及用途之任何實施例中所用之EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體可在疾病之任何階段投與。例如，此類EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體可投與至罹患任何階段(自早期至轉移)之癌症的患者。術語受試者與患者在本文中可互換使用。
在一些實施例中，受試者為哺乳動物，諸如人類、非人靈長類、伴侶動物( 例如 貓、狗、馬)、農場動物、役用動物或動物園動物。在一些實施例中，受試者為人類。在一些實施例中，受試者為伴侶動物。在一些實施例中，受試者為在獸醫看護下之動物。
將EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體、及其治療性調配物投與至罹患或易患與異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症(諸如癌症)之受試者。罹患或易患與異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症的受試者係使用此項技術中已知之多種方法中之任一者來鑑別。例如，罹患癌症或其他腫瘤性病狀之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。例如，罹患炎症及/或炎性病症之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及/或體液分析，例如 血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。
若達成多種實驗室或臨床目標中之任一者，則認為向罹患與異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症( 例如 癌症，諸如癌)之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。例如，若與同異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症相關的症狀中之一或多者得以減輕、減少、抑制或不會進展至另一(例如惡化)狀態，則認為向罹患該疾病或病症之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。若與異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症進入緩解期或未進展成另一(亦即 惡化)狀態，則認為向罹患該疾病或病症之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之抗-EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。
在一些實施例中，將EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體、及其治療性調配物投與至罹患或易患疾病或病症之受試者，諸如罹患癌症或其他腫瘤性病狀之受試者，其中受試者之患病細胞表現EpCAM。在一些實施例中，患病細胞與異常EpCAM表現及/或活性相關。在一些實施例中，患病細胞與正常EpCAM表現及/或活性相關。罹患或易患疾病或病症之受試者(其中受試者之患病細胞表現EpCAM)使用此項技術中已知之多種方法中之任一者來鑑別。例如，罹患癌症或其他腫瘤性病狀之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。例如，罹患炎症及/或炎性病症之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及/或體液分析，例如 血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。
在一些實施例中，將EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體、及其治療性調配物投與至罹患或易患與表現EpCAM之細胞或此類細胞之存在、生長、增殖、轉移及/或活性相關之疾病或病症之受試者，諸如罹患癌症或其他腫瘤性病狀之受試者。在一些實施例中，細胞與異常EpCAM表現及/或活性相關。在一些實施例中，細胞與正常EpCAM表現及/或活性相關。罹患或易患與表現EpCAM之細胞相關之疾病或病症的受試者係使用此項技術中已知之多種方法中之任一者鑑別。例如，罹患癌症或其他腫瘤性病狀之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。例如，罹患炎症及/或炎性病症之受試者係使用評價健康狀況之多種臨床及/或實驗室測試中之任一者，諸如身體檢查及/或體液分析，例如 血液、尿液及/或糞便分析來鑑別。
若達成多種實驗室或臨床目標中之任一者，則認為向罹患與表現EpCAM之細胞相關之疾病或病症( 例如 癌症，諸如癌)之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。例如，若與同表現EpCAM之細胞相關之疾病或病症相關之症狀中之一或多者得以減輕、減少、抑制或不會進展至另一(亦即 惡化)狀態，則認為向罹患該疾病或病症之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。若與表現EpCAM之細胞相關之疾病或病症進入緩解期或未進展成另一(亦即 惡化)狀態，則認為向罹患該疾病或病症之患者投與EpCAM抗體、經偶聯之EpCAM抗體、EpCAM可活化抗體及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體為成功的。
本揭露提供特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、EpCAM可活化抗體、以及經偶聯之EpCAM抗體、抗體片段或可活化抗體，其適用於治療、預防與異常EpCAM表現及/或活性相關之疾病或病症、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀的方法中。例如，將EpCAM可活化抗體用於治療、預防癌症或其他腫瘤性病狀、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀之方法中。
本揭露提供特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、EpCAM可活化抗體、及經偶聯之EpCAM抗體、抗體片段或可活化抗體，其適用於治療、預防與表現EpCAM之細胞相關之疾病或病症、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀的方法中。在一些實施例中，細胞與異常EpCAM表現及/或活性相關。在一些實施例中，細胞與正常EpCAM表現及/或活性相關。例如，EpCAM可活化抗體可用於治療、預防癌症或其他腫瘤性病狀、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀之方法中。
本揭露提供特異性結合人類EpCAM之抗體及抗體片段、EpCAM可活化抗體、經偶聯之EpCAM抗體及抗體片段、及/或經偶聯之EpCAM可活化抗體，其適用於治療、預防患病細胞表現EpCAM之疾病或病症、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀的方法中。在一些實施例中，患病細胞與異常EpCAM表現及/或活性相關。在一些實施例中，患病細胞與正常EpCAM表現及/或活性相關。例如，將EpCAM可活化抗體用於治療、預防癌症或其他腫瘤性病狀、延緩其進展、減輕及/或緩解其症狀之方法中。醫藥組成物
所提供之組成物包括適用於製造醫藥組成物之原料藥物組成物( 例如 不純或非無菌組成物)及可用於製備單位劑型之醫藥組成物( 亦即 適用於投與至受試者或患者之組成物)。此類組成物包含預防或治療有效量之所提供之免疫偶聯物及醫藥學上可接受之載劑。
較佳，所提供之組成物包含預防或治療有效量之所揭露之免疫偶聯物及醫藥學上可接受之載劑。
在一特定實施例中，術語「醫藥學上可接受之」意指由聯邦管理機構或州政府批準或美國藥典或其他公認的用於動物且更具體地用於人類之藥典中列出的。術語「載劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑( 例如 弗氏佐劑(完全及不完全)、賦形劑或媒劑。一般而言，本文所提供之組成物之成分以單位劑型單獨或混合在一起供應，例如在指示活性劑之量的氣密密封容器諸如安瓿或小袋中作為乾燥凍乾粉末或無水濃縮物供應。在該組成物欲藉由輸注投與之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸注瓶分配。在該組成物藉由注射投與之情況下，可提供一安瓿之無菌注射用水或生理食鹽水，使得該等成分可在投與之前混合。
本揭露亦提供一種醫藥包或套組，其包含單獨或與此類醫藥學上可接受之載劑一起填充有本文所提供之免疫偶聯物的一或多個容器。本揭露亦提供一種醫藥包或套組，其包含填充有本文所提供之醫藥組成物之一或多種成分的一或多個容器。視情況，此類容器可附有管理藥物或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的須知，該須知反映了該機構對製造、使用或銷售以供人類投藥之批準。
本揭露提供可用於以上方法中之套組。套組可包含本文所揭露之免疫偶聯物中之任一者。投與方法
可提供所揭露之組成物，其係用於藉由向受試者投與治療有效量之本文所提供之免疫偶聯物來治療、預防及減輕與疾病、病症相關之一或多種症狀。在一較佳態樣中，此類組成物實質上經純化(亦即實質上不含限制其作用或產生不想要之副作用的物質)。在一特定實施例中，受試者為動物，較佳為哺乳動物，諸如非靈長類(例如牛、馬、貓、犬、齧齒動物等)或靈長類(例如猴，諸如獼猴、人類等)。在一較佳實施例中，受試者為人類。
投與本文所提供之免疫偶聯物之方法包括但不限於非經腸投與( 例如 皮內、肌內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外、及黏膜(例如 鼻內及經口途徑)。在一特定實施例中，本文所提供之免疫偶聯物經肌內、靜脈內或皮下投與。組成物可藉由任何適宜途徑，例如藉由輸注或推注注射投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身或局部的。
本揭露亦提供，所揭露之免疫偶聯物之製劑經包裝於指示分子之量的氣密密封容器諸如安瓿或小袋中。在一實施例中，此類分子在氣密密封容器中作為乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物供應，且可例如 以水或鹽水重構至適當濃度以投與至受試者。較佳，免疫偶聯物在氣密密封容器中作為乾燥無菌凍乾粉末供應。
本文所提供之免疫偶聯物之凍乾製劑在其初始容器中應儲存在2℃與8℃之間，且分子應在重構後12小時內，較佳6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，此類分子在指示分子、融合蛋白或經偶聯之分子之量及濃度的氣密密封容器中以液體形式供應。較佳，此類免疫偶聯物當以液體形式提供時在氣密密封容器中供應。
如本文所用，醫藥組成物之「治療有效量」為足以實現有益或所要結果之量，該等結果包括但不限於臨床結果，諸如減少癌症症狀( 例如 癌細胞之增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等 ) ， 從而提高罹患該疾病之彼等之生命品質、減少治療該疾病所需之其他藥物之劑量、增強另一種藥物之作用(諸如經由 靶向及/或內化)、延緩疾病之進展、及/或延長個體之存活。
治療有效量可在一或多次投與中投與。出於本揭露之目的，藥物、化合物或醫藥組成物之治療有效量為足以直接或間接減少病毒存在之增殖(或效應)且減輕病毒疾病及/或延緩病毒疾病之發展的量。實例 實例 1 ：針對人類及獼猴 EpCAM (CD326) 抗原之小鼠單株抗體的生成
為了生成針對人類及獼猴(cyno) EpCAM之單株抗體，使用三種不同免疫方案。在第一種免疫方案中，用表現cyno-EpCAM之300-19細胞株(其為BALB/c源性pre-B細胞)皮下注射野生型BALB/c雌性小鼠三次，且接著用表現人類-EpCAM之300-19細胞株注射兩次。在第二種免疫方案中，用NSCLC細胞株H1568皮下注射野生型BALB/c雌性小鼠四次，且接著用獼猴原代腎上皮細胞注射四次。在第三種免疫方案中，用表現人類-EpCAM之300-19細胞皮下注射FcγR2b ko/ko BALB/c雌性小鼠(型號579, Taconic)三次，且接著用表現cyno-EpCAM之300-19細胞注射兩次。在所有三種方案中，於PBS中製備細胞且將其以5 X 106 個細胞/小鼠/注射之劑量注射至小鼠中，每次注射之間間隔兩週。為了加強免疫反應，在第一次免疫後一週注射抗GITR Ab (純系DTA-1)。在為了融合瘤形成而處死之前三天，經免疫之小鼠接受另一劑量之表現人類-EpCAM之300-19細胞的腹膜內注射。根據標準動物方案收集小鼠脾臟且在兩個無菌、磨砂顯微載波片之間研磨以獲得RPMI-1640培養基中之單細胞懸浮液。在用ACK裂解緩衝液裂解紅血球後，將脾細胞與鼠類骨髓瘤P363Ag8.653細胞(P3細胞)以1個P3細胞:3個脾細胞之比率混合。洗滌脾細胞與P3細胞之混合物且在室溫下用融合培養基(0.3 M甘露醇/D-山梨醇、0.1 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2及1 mg/mL BSA)中之鏈蛋白酶處理3 min。藉由添加胎牛血清(FBS)停止反應，接著洗滌細胞，使其重懸浮於2 mL冷融合培養基中且使用BTX ECM 2001電融合機進行融合。將融合細胞輕輕加入含有次黃嘌呤-胺蝶呤-胸苷(HAT)之RPMI-1640選擇培養基中，在37℃下溫育20 min，且隨後以200 μL/孔接種至十個平底96-孔板中。接著將該等板在37℃下於5% CO2溫育器中溫育，直至融合瘤純系準備用於抗體篩選。亦可使用其他免疫及融合瘤產生技術，包括J. Langone及H. Vunakis (編, Methods in Enzymology, 第121卷, Immunochemical Techniques, Part I, Academic Press, Florida)；以及E. Harlow及D. Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY)所述之彼等。融合瘤 篩選及次選殖
使用流動式細胞測量術結合測定，用表現人類EpCAM之300-19細胞及野生型300-19細胞進行融合瘤篩選。簡言之，首先用CELLTRACE™遠紅DDAO-SE標記野生型300-19細胞，將其與未經處理之細胞以1:1比率混合且與融合瘤上清液一起在冰上溫育2小時。接著洗滌細胞，與經PE-標記之抗小鼠IgG一起溫育，洗滌，用福馬林固定，且使用FACS陣列分析。擴增對人類-EpCAM抗原有特異性反應性之融合瘤，且藉由流動式細胞測量術結合測定，使用如下三種獨立細胞株重篩選上清液：表現人類-EpCAM之300-19細胞、表現獼猴-EpCAM之300-19細胞及野生型300-19細胞。藉由有限稀釋進一步次選殖與人類及獼猴EpCAM抗原有陽性結合但在野生型300-19細胞上有陰性結合之融合瘤。自顯示與人類及獼猴EpCAM抗原之特異性結合的各融合瘤中選擇一個次純系以用於後續分析。
在此研究過程中進行總計20次融合。生成對人類及獼猴EpCAM抗原有特異性之63種融合瘤，且次選殖29種融合瘤。培養穩定次純系且使用商用小鼠IgG同型化試劑來鑑別單株抗體之同型。鼠類抗體純化
使用基本上由兩個層析步驟亦即蛋白A親和力及陶瓷羥磷灰石(CHT)組成之方案純化來自融合瘤次純系的經過濾之上清液。簡言之，藉由添加1:10體積之1 M Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)來中和經過濾之上清液。將經中和之上清液裝載在已用1 PBS (pH 7.3±0.1)預先平衡之蛋白A管柱(HiTrap Protein A HP，1 mL)上。用1X PBS (pH 7.3±0.1)洗滌管柱以減少非特異性宿主細胞蛋白。接著用含有50 mM氯化鈉之25 mM乙酸(pH 3.2)溶析結合抗體且立即用1M Tris-鹼中和至pH 7.0±0.2。將經中和之池於CHT結合緩衝液(15 mM磷酸鈉，pH 7.0±0.1)中1:10稀釋且裝載至用CHT結合緩衝液預先平衡之II型CHT管柱(40 μm粒度)上。接著用線性梯度(10管柱體積中之15 mM至160 mM磷酸鈉)溶析結合蛋白，且將感興趣之級分(高百分比單體，藉由尺寸排除層析獲得，SEC)彙集，用1X PBS (pH 7.3±0.1)透析，且過濾滅菌。藉由量測在280 nm下之吸光度及1.44 mL mg-1 cm-1 之消光係數來判定最終抗體濃度。
在裝備有在線UV、傳導率及pH探針之AKTA純化系統上進行全部純化實驗。使用Agilent HPVL 1100系統，藉由在TSKgel G3000SWXL管柱(7.8 x 300 mm)上注射40 μg樣品來進行SEC分析，該管柱亦具有在線保護管柱(6.0 x 40 mm)以延長管柱壽命。流動相含有50 mm磷酸鈉緩衝液及400 mm過氯酸鈉，流率為1.0 mL/min，且溶析等度。實例 2 ： 鼠類 EpCAM 抗體之結合親和力
藉由流動式細胞測量術結合測定，使用經純化之抗體mEpCAM23 (使用實例1中所述之第三免疫方案獲得)測定結合親和力且使用HSC2細胞(圖 1A )或使用獼猴原代腎上皮細胞(圖 1B )進行。在結合測定中，將每種樣品2x104 個細胞與不同濃度之mEpCAM23在200 μL FACS緩衝液(補充有2%正常山羊血清之RPMI 1640培養基)中於冰上溫育2小時。接著使細胞成團，洗滌兩次，且與100 μL同ALexa Fluor Plus 488偶聯之山羊抗小鼠IgG-抗體一起溫育30 min。使細胞再成團，用FACS緩衝液洗滌，且重懸浮於200 μL含有1%甲醛之PBS中。使用具有HTS多孔取樣器之FACSCalibur™流動式細胞測量儀採集樣品且使用CellQuest™ Pro分析。對於各樣品，計算FL1之幾何平均螢光強度且以半對數圖針對抗體濃度作圖。藉由非線性迴歸生成劑量-反應曲線，且使用GraphPad Prism v4計算各曲線之EC50 值，各曲線對應於各抗體之表觀解離常數(Kd )。
如圖 1A 及1B 所示，mEpCAM23抗體之表觀Kd 範圍為自3.8 x 10-10 至7.9 x 10-10 。鑑別mEpCAM23之序列，且選擇mEpCAM23純系進行嵌合化、人源化及進一步評價。實例 3 ： 對 EpCAM 抗體之 VL 及 VH 之選殖及定序 對VL 及VH 區之選殖
使用Quick-RNA®微型製備套組，根據製造商方案由EpCAM融合瘤之5 x 106 個細胞製備總細胞RNA。隨後使用SuperScript III® cDNA合成套組，根據製造商說明書由總RNA合成cDNA。
用於擴增源自融合瘤細胞之抗體可變區cDNA的PCR程序係基於如下文獻中所述之方法：Wang等人 (J. Immunol.Methods 233:167-177 (2000))及Co等人 (J. Immunol. 148:1149-54 (1992))。簡言之，分別藉由在5’-端上之簡並引子及在3’ -端上之鼠類κ或IgG1 恆定區特異性引子擴增VL 及VH 序列。將經純化之擴增子發送至Genewiz以用於Sanger定序。
由於用於選殖VL 及VH cDNA序列之簡並引子可改變5’-端，因此需要額外定序工作來驗證完全cDNA序列。將初步序列輸入NCBI IgBlast站點之搜索查詢中以鑑別抗體序列所來源之鼠類生殖系序列。接著設計PCR引子以退火至鼠類抗體之經生殖系連接之前導序列，使得新PCR反應將產生未被PCR引子改變之完全可變區cDNA序列。 用於序列確認之質量測定
將針對各EpCAM抗體獲得之可變區cDNA序列與生殖系恆定區序列組合以獲得全長抗體cDNA序列。為了確認該等定序結果，將全長重鏈及輕鏈cDNA序列之分子量與藉由LC/MS分析經純化之鼠類EpCAM抗體所獲得之分子量相比較。 嵌合抗體表現及純化
對鼠類EpCAM抗體之可變區胺基酸序列進行密碼子優化，合成且藉由GenScript (New Jersey)與人類IgG1恆定區同框選殖以構築嵌合版本之EpCAM抗體。簡言之，將輕鏈可變區選殖至內部pAbKZeo質體之EcoRI及BsiWI位點中且將重鏈可變區選殖至內部pAbG1Neo質體之HindIII及Apa1位點中。此等表現構築體在懸浮液適應之HEK-293T細胞中使用PEI作為轉染試劑在搖瓶中瞬時產生。如先前所述進行PEI瞬時轉染( 參見 Durocher等人 , Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002))，例外之處在於HEK-293T細胞在Freestyle 293 (Invitrogen)中生長且在添加PEI-DNA複合物後使培養體積未稀釋。將轉染物溫育一週，收穫，且接著使用蛋白A與CHT層析之組合，使用如實例1所述之程序純化經過濾之上清液。實例 4 ： 抗體人源化
使用基本上如Jones等人 , Nature 321: 604-608 (1986)；Verhoeyen等人 , Science 239:1534-1536 (1988)；美國專利第5,225,539號及第5,585,089號中所述之互補決定區(CDR)接枝程序進行抗體人源化。CDR接枝一般由以下組成：用人類抗體Fv框架區置換小鼠抗體之Fv框架區(FR)，同時保留對親本抗體之特異性抗原-結合特性而言關鍵的小鼠CDR殘基。根據Kabat CDR定義，鼠類EpCAM-23抗體之示範性CDR示於下表13中。
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CDR-接枝過程藉由選擇適當人類受體框架，通常為源自與親本鼠類抗體享有最高序列同源性之人類抗體基因之彼等框架開始。此等受體框架通常使用International ImMunoGeneTics information system® (IMGT (http://imgt.cines.fr/))之交互工具DomainGapAlign來鑑別，如Ehrenmann等人, Nucleic Acids Res. 38: D301-307 (2010)中所述。在選擇與鼠類序列享有最高序列一致性之VL 及VH 人類生殖系序列之後，藉由將鼠類CDR接枝到人類生殖系序列中生成人源化版本之抗體。由於鼠類CDR與人類框架之間的不相容性，通常在CDR接枝後觀測到減小或消除之抗原結合親和力，Foote及Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992)；然而，直接在CDR下面之殘基(稱為遊標帶殘基)之平台可有助於保留引導抗體特異性及親和力的CDR環之構象。因此，通常需要將此等游標帶殘基反突變成鼠類殘基以修復結合親和力。
圖 2A 及 2B 展示初始muEpCAM-23輕鏈及重鏈序列之可變區與其最親近之人類生殖系配對之間的序列比對。基於比對結果，作為EpCAM-23抗體之VL 及VH 域之受體框架選出之人類生殖系序列分別為IGKV2D- 29*02 (圖 2A )及IGHV1-3*01 (圖 2B )。
藉由將VL之Kabat位置24-34 (CDR-L1)、50-56 (CDR-L2)及89-97 (CDR-L2)、以及VH之Kabat位置31-35 (CDR-H1)、50-65 (CDR-H2)及95-102 (CDR-H3)接枝至對應人類生殖系IGKV2D-29*01及IGHV1-3*01框架中來創建muEpCAM-23之初始CDR接枝物。初始經CDR接枝之版本含有VL 中之12個框架殘基取代及VH 中之27個框架殘基變化。另外，亦製備含有游標帶殘基之一或多個反突變之變異體，且隨後評價EpCAM-結合。所測試之游標帶殘基反突變包括VL 中之3個殘基(FW-L1中之位置4，及FW-L2中之位置36、64)及VH 中之6個殘基(FW-H2中之位置47、48，FW-H3中之位置67、69、71及73)。此外，為了使偶聯落於CDR中之離胺酸殘基之潛在影響最小化，用一些版本之CDR區中之精胺酸置換離胺酸殘基。另外，在一些接枝版本中，某些CDRH2殘基經改變成IGHV1-3*01生殖系殘基以提高人性化程度。表14及表15分別列出各種人源化VL與VH版本之間的所有殘基變化。合成人源化DNA構築體，表現，且基本上使用實例2所述之程序純化重組抗體以用於進行後續人類EpCAM及獼猴EpCAM-結合分析。
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嵌合/人源化EpCAM抗體之結合親和力
進行流動式細胞測量術結合測定且如實例2所述，使用第二經Alexa Fluor Plus 488偶聯之山羊抗人類抗體(Invitrogen)來分析。
分析嵌合抗體chEpCAM23與HSC2細胞(圖 3A )及獼猴原代腎上皮細胞(圖 3B )之結合親和力。
若干人源化版本之EpCAM23保留與人類HSC2細胞之結合(圖 3C )。然而，僅版本Gv2.2 (VL Gv2及VH Gv2)及版本Gv4.2 (VL Gv4及VH Gv2)亦保留與獼猴原代腎上皮細胞之結合(圖 3D )。另外，製備且評價具有半胱胺酸特異性偶聯位點之另一版本的Gv4.2，亦即huEpCAM23Gv4.2-C442。如圖 3E 及3F 所示，此抗體以類似於huEpCAM23Gv4.2之Kd結合至HSC2及獼猴原代腎上皮細胞。圖 4A 及4B 展示初始鼠類EpCAM-23抗體接枝版本Gv 2.2與接枝版本Gv 4.2之可變區的序列比對。有效負載通常使用離胺酸或半胱胺酸殘基偶聯至抗體，且接枝版本Gv4.2與版本Gv2.2之不同之處僅為單個胺基酸(位置23中離胺酸變成精胺酸)。因此，為了便於偶聯，選擇Gv4.2用於進一步評價。實例 5 ： huEpCAM-23Gv4.2 抗體之親和力調節
為了持久的腫瘤保留，單株抗體必須以高親和力結合至抗原。然而，已假設，若抗體與腫瘤抗原之間的相互作用太高，則單株抗體之有效腫瘤浸潤可受損，使得活體內 功效降低。最佳親和力可能為許多變量之函數，該等變量諸如抗原表現及異質性；腫瘤尺寸；受體內化及再循環之速率；血管分佈；旁觀者殺滅活性；及藥物與抗體比率(DAR) (Vasalou等人 , PLoS ONE 10(3):e0118977 (2015) doi:10.1371/journal.pone. 0118977)。因此，為了更好地理解所有此等變量之相互影響，創建人源化抗體Gv4.2之親和力變異體。藉由誘變小鼠/人類天然庫中罕見(＜5%頻率)的經溶劑暴露之CDR殘基或VH/VL框架殘基來創建變異體。藉由使用商用軟體MOE (Chemical computing group)之抗體建模特性創建Gv4.2抗體之同源性模型來鑑別經溶劑暴露之位置。表16列出所探索之所有位置，且表17展示各種變異體與人類HSC2細胞及獼猴原代腎上皮細胞之結合KD。表現所有變異體，將其純化，且基本上使用實例2及4中所述之程序對FACS結合進行表徵。
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實例 6 ： 人源化抗 -EpCAM23Gv4.2 抗體之親和力變異體之結合親和力
在酶聯免疫吸附測定(ELISA)中使用經mFc-標記之huEpCAM或cynoEpCAM蛋白測試一組初始人源化抗-EpCAM23Gv4.2親和力變異體。簡言之，將各經mFc-標記之EpCAM蛋白於50 mM碳酸氫鈉緩衝液pH 9.6中稀釋至0.5 ug/mL，且將100 μL添加至各孔中。在4℃下溫育16 h後，用具有0.1% Tween-20 (TBST)之經Tris-緩衝之鹽水洗滌該等板，接著用200 μL阻斷緩衝液(具有1% BSA之TBS)進行阻斷。接下來，將於阻斷緩衝液中連續稀釋之親和力變異體100 μL第一抗體一式兩份添加至ELISA孔中且在室溫下溫育1 h。接著將該等板用TBST洗滌3次，之後將100 μL抗人類IgG (H+L)-HRP添加至各孔中。將該等板再在室溫下溫育1 h，接著用TBST洗滌三次。最後，將100 μL TMB一種組分HRP微孔受質添加至各孔中且溫育5 min。藉由添加100 μL終止溶液終止反應，且在多孔板讀取器中讀取450 nm下之吸光度。以半對數圖針對抗體濃度繪製OD450之圖。藉由非線性迴歸生成劑量-反應曲線，且使用GraphPad Prism v6計算各曲線之EC50值。
來自ELISA測定之結果展示於圖 5A 及 5B (對於包含輕鏈中之突變的變異體而言)及圖 5C 及 5D (對於包含重鏈中之突變的變異體而言)中。圖 5A-5D 中所示之七種變異體表現出不同結合曲線，由輕鏈變異體Gv4c.2及重鏈變異體Gv4.2c所展現之結合尤其不同。變異體Gv4c.2展示與三種輕鏈突變變異體中之cynoEpCAM- mFc蛋白之最弱結合，其具有比其親本抗體弱3倍之親和力(圖 5B )。然而，變異體Gv4c.2展示與親本抗體類似之對huEpCAM-mFc之KD (圖 5A )。在四種重鏈突變變異體中，變異體Gv4.2c展示顯著減小的與cynoEpCAM-mFc之結合(圖 5D )，但展示與親本抗體相比類似的與huEpCAM-mFc之結合(圖 5C )。使用此等重鏈與輕鏈變異體之不同組合，製備雙重突變變異體以及上文提及之單一突變變異體。
將額外的人源化抗-EpCAM23Gv4.2親和力變異體與HSC2細胞及獼猴原代腎上皮細胞之結合親和力與親本抗體之結合親和力相比較。進行流動式細胞測量術結合測定且如實例2及4所述進行分析，且評價總計60種變異體。圖 5E-5H 展示雙重突變變異體之結合曲線，且圖 5I-5K 展示在huEpCAM23Gv4.2重鏈中含有單一突變之某些親和力變異體之結合曲線。如圖 5E-5K 所示，生成具有多種結合曲線之變異體。具體而言，雙重突變變異體Gv4a.2a、Gv4b.2a及Gv4c.2a呈現極高螢光強度且未能浸透兩種細胞類型：HSC2 (圖 5E )及獼猴原代腎上皮細胞(圖 5F )。另外，變異體Gv4a.2b及Gv4b.2b在獼猴原代腎上皮細胞上呈現出之親和力與親本抗體相比減小約4倍(圖 5H )，但展示在HSC2細胞上之類似結合(圖 5G )。相對於親本抗體，雙重突變變異體Gv4b.2d、Gv4c.2b及Gv4c.2d在獼猴原代腎上皮細胞上具有極差結合，但在HSC2細胞上具有類似結合。如圖 5I-5K 所示，單一突變親和力變異體之表觀解離常數(Kd )之範圍為自0.8 nM至約6 nM，其表現出與親本抗體huEpCAM23Gv4.2 (Kd 0.4 nM)在HSC2細胞上之表觀解離常數相比增加2至15倍。亦以獼猴原代腎上皮細胞測試此等單一突變變異體，其資料展示於圖 5L-5N 中。
具體而言，huEpCAM23Gv4.2Q在HSC2細胞及獼猴原代腎細胞上皆展示高螢光強度，而huEpCAM23Gv4.2R僅在HSC2細胞上展示高螢光強度(圖 5I 及5L )。huEpCAM23Gv4.2H及huEpCAM23Gv4.2L展示類似Kd 值，但與獼猴原代腎上皮細胞上之極差結合相關。圖 5I 及5L 中所示之其他純系在兩種細胞類型上浸透且與不同Kd 值相關。
圖 5J 及5M 展示在CDR1之相同位置中含有特定胺基酸取代之親和力變異體之結合特徵( 亦即 以另一胺基酸取代位置33處之初始Y殘基)。圖 5J 及5M 中所示之全部變異體在HSC2細胞上與親本抗體相比具有減小的Kd 值，且在獼猴原代腎上皮細胞上表現出極差結合(除了huEpCAM23Gv4.2-1361-I之外)。圖 5K 及5N 展示在CDR3之相同位置中含有特定胺基酸取代之親和力變異體之結合特徵( 亦即 以另一胺基酸取代位置97處之初始P殘基)。huEpCAM23Gv4.2-1565-Y變異體以與親本抗體相比減小之Kd 值浸透HSC2細胞及獼猴原代上皮細胞，而其餘變異體僅浸透HSC2細胞而不浸透獼猴原代腎上皮細胞。
總之，此等資料展示生成具有不同幾何平均螢光結合強度及Kd 範圍之親和力變異體。基於此等結果，選擇兩種親和力變異體huEpCAM23Gv4.2-1361-H及huEpCAM23Gv4.2-1565-Y以用於進一步評價。具體而言，由於其相對於親本抗體在HSC2上之稍微較低之結合親和力(亦即在HSC2細胞上與親本抗體相比減小約3倍之Kd )及其不同突變位點，選擇此等變異體。實例 7 ：遮蔽劑發現
設計本文所提供之研究以鑑別並表徵用於可活化抗-EpCAM抗體(「可活化抗體」)中使用之遮蔽部分(MM或「遮蔽劑」)。
使用與人類及獼猴EpCAM交叉反應之人源化抗人類EpCAM單株抗體(EpCAM23Gv4.2)，以便使用與2010年7月15日公佈之PCT國際公佈案第WO 2010/081173號所述類似之方法篩選隨機X15 肽文庫，其中X為任何胺基酸。篩選係由一輪MACS及三輪FACS分選組成。使用具有抗-EpCAM抗體之蛋白-A Dynabeads (Invitrogen)進行初始MACS分選。對於MACS，將抗-EpCAM抗體與DyLight-488 (ThermoFisher)偶聯，確認EpCAM結合活性，且將抗-EpCAM-488用作所有FACS輪次之螢光探針。藉由來自各FACS輪次之序列分析鑑別各別肽純系。
生成並使用人源化抗人類EpCAM單株抗體(EpCAM23(1361-H)及EpCAM23(1565-Y))之兩種重鏈變異體，以便使用與2010年7月15日公佈之PCT國際公佈案第WO 2010/081173號所述類似之方法篩選隨機X15 肽文庫，其中X為任何胺基酸。使用EpCAM23(1565-Y)重鏈變異體鑑別遮蔽劑EP101至EP 104。使用EpCAM23(1361-H)重鏈變異體鑑別遮蔽劑EP105至EP 110。亦生成Ep107遮蔽部分中離胺酸殘基之突變
所選抗-EpCAM遮蔽部分之序列在表18中列出。
Figure 02_image338
使用此等遮蔽肽生成本揭露之抗-EpCAM可活化抗體。此等抗-EpCAM可活化抗體中某些之胺基酸序列展示於下表19中。在一些實施例中，本揭露之此等抗-EpCAM可活化抗體包括ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:242)、AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:243)、ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO:244)、ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO:245)、ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO:246)、ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO:247)、ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO:248)、ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO:169)、AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO:249)、AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO:250)、AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO:251)、AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO:252)、AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO:253)、或AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO:168)。在一些實施例中，本揭露之某些抗-EpCAM可活化抗體包括預期不裂解之不可裂解部分「NSUB」。
雖然下文所示之本揭露之可活化抗體之某些輕鏈序列包括N-端間隔物序列QGQSGQG (SEQ ID NO:254)，但熟悉此項技藝者將瞭解，本揭露之可活化抗-EpCAM抗體可包括任何適合的間隔物序列，例如選自由以下組成之群的間隔物序列：QGQSGQ (SEQ ID NO:255)、QGQSG (SEQ ID NO:256)、QGQS (SEQ ID NO:257)、QGQ、QG、GQSGQG (SEQ ID NO:258)、QSGQG (SEQ ID NO:259)、SGQG (SEQ ID NO:260)、GQG、G、或Q。在一些實施例中，本揭露之可活化抗-EpCAM抗體之輕鏈可不具有連接至N端之間隔物序列。
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Figure 02_image342
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Figure 02_image346
具有以下重鏈及輕鏈之示範性抗-EpCAM可活化抗體示於下表20中。
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Figure 02_image350
使用固相結合測定證明本揭露之抗人類EpCAM抗體之結合。簡言之，將重組人類EpCAM-mFC蛋白(Immunogen)塗覆於ELISA板上(50 μL之1 μg/mL)，且接著與連續稀釋之抗-EpCAM抗體(以62.5 nM開始)或可活化抗-EpCAM抗體(以1 μM開始)一起溫育，其中可活化抗體呈其未裂解形式進行測定。使用以Ultra TMB-ELISA試劑(Thermo Fisher Scientific)偶聯至山葵過氧化酶(Sigma)之抗人類IgG (抗-Fab)偵測結合抗體之量且在450 nM下量測OD。量測各抗體及可活化抗體之KD ，且計算各可活化抗體相對於未遮蔽抗體之ELISA遮蔽效率(ME)，其示範性結果示於表21及22中。總之，此等資料顯示本揭露之抗人類EpCAM可活化抗體與本揭露之親本抗-EpCAM抗體相比表現出與重組EpCAM蛋白之結合親和力的偏移。
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Figure 02_image354
如表21及22所示，此等示範性結果表明抗人類EpCAM可活化抗體相對於未遮蔽之抗-EpCAM抗體顯示出一定範圍之遮蔽效率。實例 8 ：抗 -EpCAM23Gv4.2 可活化抗體、抗體 - 藥物偶聯物、及可活化抗體 - 藥物偶聯物之結合親和力
藉由流動式細胞測量術評價包含huEpCAM23Gv4.2及7種不同遮蔽劑之一種的可活化抗體及可活化抗體-藥物偶聯物(「AADC」)之結合親和力。具體而言，使用抗體huEpCAM23Gv4.2、酶敏感性受質3014、以及選自Ep1-2、Ep-2、Ep03、Ep04、Ep05、Ep07及Ep11之遮蔽劑來生成可活化抗體及可活化抗體藥物偶聯物。亦生成包含藉由不可裂解之肽部分(「NSUB」或「非受質」)連接至抗體之遮蔽劑的可活化抗體以用作陰性對照。NSUB並非蛋白酶之受質，且遮蔽劑不能自包含NSUB之可活化抗體中移除。因此，預期包含NSUB之可活化抗體甚至在用uPA處理後仍保持無活性。 活體外EpCAM可活化抗體/AADC活化
為了活體外活化有受質之EpCAM可活化抗體，於PBS中以1 mg/ml製備所要量之可活化抗體，且將uPA添加至溶液中至最終濃度1 μM (基於蛋白質濃度)。接著將溶液在37℃下於濕潤的5% CO2溫育器中溫育隔夜。 EpCAM可活化抗體結合親和力
將EpCAM可活化抗體與HSC2細胞之結合親和力與親本抗體huEpCAM23Gv4.2之結合親和力相比較，且在活化形式與非活化形式之可活化抗體之間作比較。如上文所述活化可活化抗體。進行流動式細胞測量術結合測定且如實例2所述使用第二經Alexa Flour plus 488偶聯之山羊抗人類抗體來分析。如圖 6A 所示，可活化抗體在未經活化之情況下與細胞具有極差結合，其表觀Kd ＞ 1X10-7 M，而經活化之可活化抗體保留與親本抗體類似之水準之結合親和力。使用獼猴原代腎細胞對5種可活化抗體進行進一步測試，且觀測到類似結果(參見圖 6B )。在HSC2及獼猴原代腎上皮細胞中，經活化對比未經活化之可活化抗體的表觀Kd值相差超過10倍。 與抗-huEpCAM23Gv4.2抗體及抗-huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014可活化抗體偶聯之sSPDB-DM4及DGN549的結合親和力
使用HSC2細胞測定huEpCAM23Gv4.2之sSPDB-DM4及DGN549 ADC偶聯物以及加有3014/NSUB及各種遮蔽劑受質之huEpCAM23Gv4.2之經活化AADC的結合親和力。如上文所述活化可活化抗體。進行流動式細胞測量術結合測定且如實例2所述使用第二經Alexa Flour plus 488偶聯之山羊抗人類抗體來分析。具體而言，將加有3014受質之經活化DGN549 AADC的結合親和力與DGN549 ADC之結合親和力相比較，且將加有3014受質之經活化sSPDB-DM4 AADC與sSPDB-DM4 ADC及其NSUB形式對應體相比較。sSPDB-DM4偶聯物之結合曲線提供於圖 7A 中，且DGN549偶聯物之結合曲線提供於圖 7B 中。如圖 7A 及7B 所示，經活化AADC具有與對應ADC類似之與HSC2細胞之結合。相比之下，NSUB AADC表現出與細胞之較差結合。此等資料表明可活化抗體結合細胞之能力可藉由用uPA處理來恢復，該uPA經由3014受質而非經由NSUB受質自可活化抗體移除遮蔽劑。實例 9 ： 與 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014 及 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014 偶聯之 sSPDB-DM4 、 DM21 及 DGN549 之結合親和力
使用另一受質2014製備包含具有Ep05遮蔽劑之huEpCAM23Gv4.2的額外可活化抗體。藉由使sSPDB-DM4、DM21L及DGN549偶聯至huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014且藉由使sSPDB-DM4及DM21L偶聯至huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014生成AADC以用於進一步評價。在經活化及未經活化形式下測定偶聯物與HSC2細胞之結合親和力，且將AADC之親和力與對應可活化抗體及野生型抗體相比較。進行流動式細胞測量術結合測定且如實例2所述使用第二經PE偶聯之山羊抗人類抗體分析。如實例8所述活化可活化抗體及AADC。huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-sSPDB-DM4、huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB-DM4及huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DGN549之結合親和力分別示於圖 8A 、 8B 及 8C 中。huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L及huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L之結合親和力示於圖 8D 中。經活化之可活化抗體及AADC具有與野生型抗體類似的與HSC2細胞之結合親和力，而未經活化形式不能良好結合至細胞。此等結果與實例4-6及8中所述之結果一致。實例 10 ： 表位定位
人類CD326抗原EpCAM (上皮細胞黏附分子)由314個胺基酸構成，含有265個胺基酸之胞外域、23個胺基酸之跨膜域及26個胺基酸之胞質尾區。胞外域可進一步分成三個域(D1、D2及D3)。胞外域含有兩個富含半胱胺酸之上皮生長因子樣(EGF-樣)重複序列，其包括包含來自成熟蛋白之位置24處(亦即信號肽裂解前)之麩醯胺酸至位置59處之半胱胺酸之區域的第一域(參見SEQ ID NO:2)以及包含自位置66處之半胱胺酸至位置135處之半胱胺酸之區域的第二域(參見SEQ ID NO:3)。接著，與前兩個域串聯，亦存在無半胱胺酸之第三域(D3)，其包括胺基酸殘基136-243 (參見SEQ ID NO:4)。
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藉由利用人類與小鼠EpCAM之胞外域的組合使嵌合蛋白工程化來定位人源化EpCAM抗體Gv4.2之表位。因為人類與小鼠EpCAM共享超過82%胺基酸序列一致性及85%相似性(參見圖 9 )，所以嵌合蛋白之拓樸結構應保持完整。 EpCAM嵌合變異體選殖及表現
對人類EpCAM (殘基1-265)之胞外區進行密碼子優化，合成且在Genscript處利用HindIII及BamHI限制性位點同框選殖至含有小鼠IgG2a Fc區之載體(pGSmuFc2ANL)中。類似地，藉由以對應小鼠殘基置換與人類EpCAM域D1 (24-59)、域D2 (66-135)、域D3 (136-265)或其組合相對應之殘基來合成含有人類/小鼠EpCAM胞外域之各種嵌合變異體的其他表現載體。圖 10A 及 10B 展示各種嵌合變異體之胞外區之比對。此等表現構築體在懸浮液適應之HEK-293T細胞中使用PEI作為轉染試劑於搖瓶中瞬時產生。將轉染物溫育一週，收穫，且使用蛋白A與CHT層析之組合，基本上使用如實例1所述之程序純化經過濾之上清液。 抗體與各種EpCAM構築體之結合
在酶聯免疫吸附測定(ELISA)形式中測試人源化EpCAM抗體huEpCAM23Gv4.2與上文所述之EpCAM蛋白之結合。簡言之，基本上如實例1所述使用蛋白A與CHT層析之組合純化各經mFc-標記之EpCAM蛋白。將各經mFc-標記之EpCAM蛋白以50 mM碳酸氫鈉緩衝液pH 9.6稀釋至0.5 ug/mL，且將100 μL添加至各孔中。在4℃下溫育16 h後，用具有0.1% Tween-20 (TBST)之經Tris-緩衝之鹽水洗滌該等板，接著用200 μL阻斷緩衝液(具有1% BSA之TBS)阻斷。接下來，將以阻斷緩衝液連續稀釋之100 μL第一抗體huEpCAM23Gv4.2一式兩份添加至ELISA孔中且在室溫下溫育1 h。接著將該等板用TBST洗滌3次，之後將100 μL抗人類IgG (H+L)-HRP添加至各孔中。將該等板再次在室溫下溫育1 h，接著用TBST洗滌三次。最後，將100 μL TMB一種組分HRP微孔受質添加到各孔中且溫育5 min。藉由添加100 μL終止溶液終止反應，且在多孔板讀取器中讀取450 nm下之吸光度。以半對數圖針對抗體濃度繪製OD450之圖。藉由非線性迴歸生成劑量-反應曲線，且使用GraphPad Prism v6計算各曲線之EC50 值。
與野生型EpCAM相比，評價huEpCAM23Gv4.2抗體與嵌合EpCAM蛋白之結合。圖 11 表明huEpCAM23Gv4.2抗體以與野生型EpCAM類似之親和力結合至EpCAM-D2 (66-135)及EpCAM-D3 (136-265)。相反，huEpCAM23Gv4.2抗體不結合至EpCAM-D1及D1/D2構築體，且對於嵌合蛋白EpCAM-D1(24-59)構築體，結合幾乎消除。此等結果指示huEpCAM23Gv4.2抗體之表位主要位於EpCAM之D1 (24-59)域內。實例 11 ： EpCAM 抗體藥物偶聯物及可活化抗體藥物偶聯物之製備 huEpCAM23Gv4.2-磺基-SPDB-DM4偶聯物之製備
根據比爾定律(Beer’s law)，分別用280、343及412 nm之UV/Vis吸光度值及消光係數計算huEpCAM23Gv4.2、磺基-SPDB及DM4之莫耳濃度。藉由使連接子與50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5中之50 mM DTT反應且量測在343 nm下之巰基吡啶釋放來測定連接子濃度。藉由使DM4與50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5中之10 mM DTNB [5,5-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)]反應且量測在412 nm下之吸光度來測定藥物濃度。
在抗體偶聯前，藉由使5.0 mM磺基-SPDB與6.3 mM DM4於30%含水[50 mM EPPS pH 8.0 (4-(2-羥乙基)-哌嗪丙磺酸)]及70%有機[(N-N-二甲基乙醯胺，DMA，SAFC)]中在20℃下反應90 min來製備磺基-SPDB-DM4原位混合物。在偶聯反應期間，使8-10 mg/mL抗體溶液與相對於抗體5至6倍莫耳過量之磺基-SPDB-DM4在25℃下於具有8% DMA (v/v)之50 mM EPPS pH 8.0中反應15-20小時。使用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖及0.01% Tween-20 pH 5.0調配物緩衝液中，且經由具有0.22 μm PVDF膜之注射過濾器過濾。
如下文所述測定與抗體(DAR)偶聯之DM4之莫耳比及未經偶聯之美登素物質之百分比。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.7 mol DM4/mol抗體，藉由SEC測得95%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。
藉由量測在252及280 nm下之UV/Vis吸光度且使用說明各組分之貢獻的二項方程計算[Ab]及[DM4]來判定DAR。存在於最終huEpCAM23Gv4.2-磺基-SPDB-DM4偶聯物中的未結合美登素之量係由經由HISEP管柱(25 cm x 4.6 mm，5 μm)分析之樣品中觀測到之所得峰面積來計算。存在於偶聯物樣品中之游離美登素百分比(% FM)係使用以下方程式計算：游離美登素% = (由DM4引起之逆相PA 252) / (由DM4引起之逆相PA 252 +由DM4引起之流過PA 252) x 100%。 huEpCAM23Gv4.2 Ep05-3014-磺基-SPDB-DM4 AADC偶聯物之製備
在抗體偶聯前，藉由使5.0 mM磺基-SPDB與6.3 mM DM4在20℃下於30%含水[50 mM EPPS pH 8.0 (4-(2-羥乙基)-哌嗪丙磺酸)]及70%有機[(N-N-二甲基乙醯胺，DMA，SAFC)]中反應90 min來製備磺基-SPDB-DM4原位混合物。在偶聯反應期間，使8-10 mg/mL抗體溶液與相對於抗體5至6倍莫耳過量之磺基-SPDB-DM4在25℃下於具有8% DMA (v/v)之50 mM EPPS pH 8.0中反應4-5小時。使用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0調配物緩衝液中，且經由具有0.22 μm PVDF膜之注射過濾器過濾。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.6 mol DM4/mol可活化抗體，藉由SEC測得98%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。 huEpCAM23Gv4.2 Ep05-2014-磺基-SPDB-DM4 AADC偶聯物之製備
在抗體偶聯前，藉由使5.0 mM磺基-SPDB與6.3 mM DM4在20℃下於30%含水[50 mM EPPS pH 8.0 (4-(2-羥乙基)-哌嗪丙磺酸)]及70%有機[(N-N-二甲基乙醯胺，DMA，SAFC)]中反應90 min來製備磺基-SPDB-DM4原位混合物。在偶聯反應期間，使8-10 mg/mL抗體溶液與相對於抗體5至6倍莫耳過量之磺基-SPDB-DM4在25℃下於具有8% DMA (v/v)之50 mM EPPS pH 8.0中反應4-5小時。使用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0調配物緩衝液中，且經由具有0.22 μm PVDF膜之注射過濾器過濾。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.6 mol DM4/mol可活化抗體，藉由SEC測得98%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。 huEpCAM23Gv4.2 Ep05-NSUB-磺基-SPDB-DM4 AADC偶聯物之製備
在抗體偶聯前，藉由使5.0 mM磺基-SPDB與6.3 mM DM4在20℃下於30%含水[50 mM EPPS pH 8.0 (4-(2-羥乙基)-哌嗪丙磺酸)]及70%有機[(N-N-二甲基乙醯胺，DMA，SAFC)]中反應90 min來製備磺基-SPDB-DM4原位混合物。在偶聯反應期間，使8-10 mg/mL抗體溶液與相對於抗體5至6倍莫耳過量之磺基-SPDB-DM4在25℃下於具有8% DMA (v/v)之50 mM EPPS pH 8.0中反應4-5小時。使用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0調配物緩衝液中，且經由具有0.22 μm PVDF膜之注射過濾器過濾。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.8 mol DM4/mol可活化抗體，藉由SEC測得99%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1% 游離藥物。 huEpCAM23Gv4.2-GMBS-DM21L偶聯物之製備
根據比爾定律，分別用280、343及412 nm之UV/Vis吸光度值及消光係數計算huEpCAM23Gv4.2、磺基-GMBS及DM21之莫耳濃度。藉由使連接子與50 mM DTT於50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5中反應且量測在343 nm下之巰基吡啶釋放來測定連接子濃度。藉由使DM21與10 mM DTNB [5,5-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)]於50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5中反應且量測在412 nm下之吸光度來測定藥物濃度。
偶聯前，分別藉由使3 mM磺基-GMBS與3.9 mM DM21於60/40 (v/v) DMA及琥珀酸鹽緩衝液pH 5.0中反應來製備磺基-GMBS-DM21原位混合物。用相對於5 mg/mL抗體6-7個連接子過量之磺基-GMBS-DM21於具有15% DMA (v/v)之60 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS) pH 8.5中進行偶聯。在25℃下溫育4-5小時後，用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0中，且經由0.22 µm PVDF膜過濾器過濾。
如下文所述測定與抗體(DAR)偶聯之DM21之莫耳比及未經偶聯之美登素物質之百分比。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.7 mol DM21/mol抗體，藉由SEC測得95%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。
藉由量測在252及280 nm下之UV/Vis吸光度且使用說明各組分之貢獻的二項方程計算[Ab]及[DM21]來測定與抗體偶聯之DM21 (DAR)之莫耳比。存在於最終huEpCAM23Gv4.2-GMBS-DM21偶聯物中的未結合美登素之量係由經由HISEP管柱(25 cm x 4.6 mm，5 μm)分析之樣品中觀測到之所得峰面積來計算。存在於偶聯物樣品中之游離美登素百分比(% FM)係使用以下方程式計算：游離美登素%= (由DM21引起之逆相PA 252) / (由DM21引起之逆相PA 252 +由DM21引起之流過PA 252) x 100%。 huEpCAM23Gv4.2 Ep05-3014-GMBS-DM21L偶聯物之製備
偶聯前，分別藉由使3 mM磺基-GMBS與3.9 mM DM21於60/40 (v/v) DMA及琥珀酸鹽緩衝液pH 5.0中反應來製備磺基-GMBS-DM21原位混合物。用相對於5 mg/mL可活化抗體6-7個連接子過量之磺基-GMBS-DM21於具有15% DMA (v/v)之60 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS) pH 8.5中進行偶聯。在25℃下溫育4-5小時後，用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0中，且經由0.22 µm PVDF膜過濾器過濾。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.6 mol DM21/mol可活化抗體，藉由SEC測得99%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。 huEpCAM23Gv4.2 Ep05-2014-GMBS-DM21L偶聯物之製備
偶聯前，分別藉由使3 mM磺基-GMBS與3.9 mM DM21於60/40 (v/v) DMA及琥珀酸鹽緩衝液pH 5.0中反應來製備磺基-GMBS-DM21原位混合物。用相對於5 mg/mL可活化抗體6-7個連接子過量之磺基-GMBS-DM21於具有15% DMA (v/v)之60 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS) pH 8.5中進行偶聯。在25℃下溫育4-5小時後，用NAP脫鹽管柱將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20 pH 5.0，且經由0.22 µm PVDF膜過濾器過濾。藉由UV-Vis測得經純化之偶聯物具有3.6 mol DM21/mol可活化抗體，藉由SEC測得99%單體，且藉由HPLC Hisep管柱分析測得低於1%游離藥物。 huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物(經離胺酸連接)之製備
根據比爾定律，分別用280及330 nm之UV/Vis吸光度值及其消光係數計算huEpCAM23Gv4.2及SO3 -DGN549-NHS之莫耳濃度。於DMA中製備DGN549-NHS藥物儲備液且於乙醇中稀釋以用於量測330 nm吸光度。在室溫下藉由在90% DMA及10% 50 mM琥珀酸鹽pH 5.0中相對於DGN549-NHS添加5-10莫耳過量之NaHSO3 持續3-4小時來進行DGN549-NHS磺化反應。
藉由使相對於2 mg/mL抗體4-5莫耳過量之磺化DGN549-NHS試劑(D2)於50 mM EPPS pH 8.0、15% DMA (v/v)中反應來製備huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物。在25℃下進行反應3-5小時。經由以含有10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉之緩衝液pH 5.0平衡之Sephadex G-25管柱純化反應混合物且經0.22 um PVDF過濾器過濾。如下所述測定每個抗體之DGN549的莫耳比(DAR)及總游離DGN549物質之百分比。獲得每個抗體具有2.7個DGN549分子之huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物，其中存在＜1%未經偶聯之DGN549。
對於DGN偶聯物，藉由量測280及330 nm之UV/Vis吸光度且根據比爾定律計算[Ab]及[DGN549]來測定DAR。為了測定未經偶聯之DGN549之量，使偶聯物穿過雙管柱系統(TOSOH SEC QC-PAK GFC 300及Agilent Zorbax C18管柱)，以計算游離DGN549之總AUC。據報告游離DGN549為未經偶聯之DGN549相對於總DGN549之比率。 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DGN549偶聯物(經離胺酸連接)之製備
藉由使相對於2 mg/mL可活化抗體4-5莫耳過量之磺化DGN549-NHS試劑(D2)於50 mM EPPS pH 8.0、15% DMA (v/v)中反應來製備huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物。在25℃下進行反應3-5小時。經由以含有10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉之緩衝液pH 5.0平衡之Sephadex G-25管柱純化反應混合物且經0.22 um PVDF過濾器過濾。獲得每個可活化抗體具有2.6個DGN549分子之偶聯物，其中存在＜1%未經偶聯之DGN549。 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DGN549偶聯物(經離胺酸連接)之製備
藉由使相對於2 mg/mL可活化抗體4-5莫耳過量之磺化DGN549-NHS試劑(D2)於50 mM EPPS pH 8.0、15% DMA (v/v)中反應來製備huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物。在25℃下進行反應3-5小時。經由以含有10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉之緩衝液pH 5.0平衡之Sephadex G-25管柱純化反應混合物且經0.22 um PVDF過濾器過濾。獲得每個可活化抗體具有2.8個DGN549分子之偶聯物，其中存在＜1%未經偶聯之DGN549。 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-NSUB-DGN549偶聯物(經離胺酸連接)之製備
藉由使相對於2 mg/mL可活化抗體4-5莫耳過量之磺化DGN549-NHS試劑(D2)於50 mM EPPS pH 8.0、15% DMA (v/v)中反應來製備huEpCAM23Gv4.2-DGN549偶聯物。在25℃下進行反應3-5小時。經由以含有10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、及0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉之緩衝液pH 5.0平衡之Sephadex G-25管柱純化反應混合物且經0.22 um PVDF過濾器過濾。獲得每個可活化抗體具有2.9個DGN549分子之偶聯物，其中存在＜1%未經偶聯之DGN549。 huEpCAM23Gv4.2-C442-DGN549偶聯物之製備
使用標準程序製備具有在還原狀態下的兩個未配對半胱胺酸殘基之huEpCAM23Gv4.2-C442抗體。用含有5 mM EDTA pH 6.0及10莫耳當量之Mal-DGN549 (或D5，作為DMA中之8.2 mM儲備溶液)且具有2% v/v DMA及38% v/v丙二醇之PBS中最終抗體濃度為1 mg/mL之此中間物進行偶聯反應。在水浴中在25℃下進行偶聯反應15-20小時。經由Sephadex G-25管柱將該偶聯物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、及50 µM亞硫酸氫鈉pH 5.0緩衝液中，且經由0.22 µm PVDF注射過濾器過濾。獲得每個抗體具有2.0個DGN549分子之偶聯物，其中存在＜1%未經偶聯之DGN549。實例 12. EpCAM 抗體及 EpCAM 可活化抗體偶聯物之活體外 細胞毒性
使用活體外細胞毒性測定量測EpCAM靶向抗體-藥物偶聯物(ADC)及可活化抗體-藥物偶聯物(AADC)殺滅腫瘤細胞之能力。為評價特異性殺滅，在使用及不使用阻斷抗體之情況下，量測抗-EpCAM ADC之功效。簡言之，將靶細胞以2000個細胞/孔鋪於100 μL由ATCC推薦之完全細胞培養基中。將50 ul/孔僅培養基(非阻斷條件)或500 nM裸EpCAM抗體(用於阻斷)添加至該溶液中。將偶聯物於完全細胞培養基中連續稀釋且每孔添加50 μL各稀釋液。偶聯物之最終濃度範圍通常為1.5 x 10-13 M至5 x 10-8 M。接著將細胞在37℃下於濕潤的5% CO2溫育箱中溫育5至6日，且藉由比色WST-8測定判定其餘細胞之活力。在活細胞中由去氫酶還原WST-8成可溶於組織培養基中之橙色甲臢產物，且所產生之甲臢之量與活細胞之數目成正比。將WST-8添加至10%之最終體積中且將板在37℃下於濕潤的5% CO2溫育箱中再溫育2至4小時。藉由以多孔板讀取器量測450 nm之吸光度(A450)來分析板，且自全部值減去僅具有培養基及WST-8之孔的背景A450吸光度。藉由將各經處理樣品值除以具有未經處理細胞之孔的平均值來計算活力百分比。活力百分比= 100* (A450經處理樣品– A450背景)/ (A450未經處理樣品– A450背景)。對於各處理，在半對數圖中將活力值百分比針對抗體濃度作圖，藉由非線性迴歸生成劑量-反應曲線，且用GraphPad Prism 6計算各曲線之EC50 值。 EpCAM ADC在NSCLC、CRC及HNC中之活體外 細胞毒性活性
在表現EpCAM之NSCLC細胞株H1568、H292、及H2110、CRC細胞株LoVo、及HNC細胞株Detroit562中在有及無EpCAM抗體阻斷之情況下評估huEpCAM23Gv4.2-sSBDP-DM4偶聯物之活體外細胞毒性。來自細胞毒性測定之結果示於圖 12A-12E 中。具體而言，huEpCAM23Gv4.2-sSBDP-DM4在所測試之所有五種細胞株中均具有特異性細胞殺滅。無阻斷之huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4偶聯物之EC50值在H1568細胞中為0.06 nM，在H292細胞中為0.07 nM，在H2110細胞中為0.09 nM，在Lovo細胞中為0.02 nM，且在Detroit562細胞中為0.03 nM。相比之下，相同偶聯物之EpCAM抗體阻斷引起細胞殺滅，其EC50值在H1568細胞中為3.9 nM，在H292細胞中為2.2 nM，在H2110細胞中為2.8 nM，在Lovo細胞中為20 nM，且在Detroit562細胞中為1.4 nM。
另外，將DGN549分別偶聯至huEpCAM23Gv4.2之Lys及位點特異性C442位點。評價該等偶聯物且使用H2110細胞將其與非靶向同型對照IgG1偶聯物chKTI-DGN549比較。如圖 12F 中所示，兩種偶聯物huEpCAM23Gv4.2-lys-DGN549及–C442-DGN549具有類似EC50且比chKTI-DGN549＞100倍更有效。
在額外實驗中，將DM21偶聯至huEpCAM23Gv4.2。在四種NSCLC細胞株及一種頭頸細胞株中在有及無huEpCAM23Gv4.2阻斷之情況下分析huEpCAM23Gv4.2-DM21L偶聯物之效力。圖 12G-12K 中所示之結果指示huEpCAM23Gv4.2-DM21L偶聯物對所測試之所有五種細胞株有效且細胞毒性可藉由添加親本抗體而阻斷。 EpCAM AADC在NSCLC及卵巢癌細胞株中之活體外 細胞毒性活性
為了擴大在用huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4、DM21及DGN549偶聯物觀測之活體外 細胞毒性活性，用相同有效負載製備EpCAM AADC。具體而言，將sSPDB-DM4及DM21L偶聯至可活化抗體huEpCAM-Ep05-3014及huEpCAM-Ep05-2014，且將DGN549偶聯至huEpCAM23Gv4.2-3014。在NSCLC細胞株Calu3、EBC-1及H2110中分析DM4、DM21及DGN549偶聯物之活性。另外，在Detroit562細胞中測試DM21L AADC，且在OV90細胞中分別測試DM4及DGN549 AADC。評價經活化及未經活化形式之AADC的效力且將其與其對應體EpCAM-靶向之ADC或非靶向同型對照IgG1偶聯物chKTI ADC相比較。如實例8所述，進行活體外 AADC活化。來自典型細胞毒性測定之結果示於圖 13-15 中。具體而言，DM4偶聯物之活體外 活性示於圖 13A-13D 中，且DM21L偶聯物之活體外 活性示於圖 14A-14D 中，且DGN549偶聯物之活體外 活性示於圖 15A-15D 中。如所預期，經活化之AADC具有與EpCAM-特異性ADC類似的活性，且未經活化之AADC對該等細胞之效力低得多。EC50值之範圍對於sSPDB-DM4 ADC而言為0.06至0.46 nM，且對於經活化之sSPDB-DM4 AADC而言為0.08 nM至1.4 nM (參見表23)。經活化之DM21 AADC之EC50範圍為0.3至2 nM (參見表24)。另外，huEpCAM-DGN549 ADC及經活化之huEpCAM-Ep05-3014-DGN549 AADC非常有效，其中EC50值之範圍對於ADC為0.006至0.02 nM，且對於AADC為0.017至0.06 nM (參見表25)。此等結果顯示，對於ADC及AADC兩種偶聯物觀測到良好的特異性窗口，表明細胞毒性為抗-EpCAM抗體結合至靶細胞之結果。
Figure 02_image358
Figure 02_image360
Figure 02_image362
亦評價包含額外遮蔽劑之huEpCAM23Gv4.2-DGN549 AADC的活體外效力並將其與個別遮蔽劑效率相比較。如表26所示，huEpCAM23Gv4.2 AADC之活體外活性之窗口與遮蔽劑效率充分相關。
Figure 02_image364
實例 13 ： EpCAM ADC 和 AADC 在攜帶 NCI-H2110 人類 NSCLC 異種移植物之 CB17 SCID 小鼠中之活性
在一系列活體內研究中評價不同劑量之EpCAMG23v4.2-DGN549及huEpCAMG23v4.2-s-SPDB-DM4抗體-藥物偶聯物(ADC)以及其包含具有3014或2014受質之經遮蔽抗體的衍生之可活化抗體-藥物偶聯物(AADC)的抗腫瘤活性。在人類NSCLC皮下異種移植物模型的攜帶NCI-H2110腫瘤之6-8週齡雌性CB17 SCID小鼠(CB17/lcr-PrdxSCID)中進行研究。動物獲自Charles River Laboratories且在分配至研究中之前的5日觀測期期間未展示疾病或疾患症候。
NCI-H2110細胞係自一致性＞ 98%細胞活力之組織培養物收穫，藉由錐藍排除法判定。使用27號針，藉由右腹皮下注射，用0.1 mL無血清培養基與Matrigel (SFM:Mat)之1:1溶液中的107 個NCI-H2110細胞接種各小鼠。將小鼠隨機分到治療組中，隨後基於其腫瘤體積(TV)投與物品(測試劑及媒劑對照)。次日，基於個體體重(BW)向該等動物投與物品。用裝備27號針之1.0 mL注射器，作為單次靜脈內推注投與物品。
在StudyDirector軟體中每週兩次記錄腫瘤體積(TV)及體重(BW)量測值。對於圓柱形體積，根據下式，自卡尺量測值評估腫瘤體積(mm3 )：TV (mm3 ) = (L x W x H)/2，其中L、W及H為各別正交腫瘤長度、寬度及高度量測值(以mm計)。使用小鼠體重(g)追蹤經治療之小鼠的體重變化(BWC)，其表示為給定量測時間下之體重(BWt)與治療前的初始體重(BWi)相比之百分比，計算如下：% BWC = [(BWt / BWi) – 1] x 100。
用於評價治療功效之主要終點為腫瘤生長抑制及腫瘤消退。腫瘤生長抑制(TGI)為經治療組(T)之中值TV在對照安慰劑組(C)之中值TV達到接近1000 mm3 之尺寸時的比率，且使用下式表示為在隨機分組之時的初始TV之百分比：TGI = T/C x 100。根據NCI標準，TGI ≤ 42%為抗腫瘤活性之最低水準(將活性標記為A)，TGI ＜ 10%係視為抗腫瘤活性之高水準(將高度活性標記為HA)，而具有TGI ＞ 42%之治療則被視為無活性(IA)。當小鼠之TV與治療時的TV相比減小了50%或更大時，將小鼠定義為具有部分消退(PR)；當偵測不到可觸及之腫瘤時，定義為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時(EoS)無腫瘤，則定義為無腫瘤存活者(TFS)。
定義化合物功效之次要終點為腫瘤生長延緩，如藉由LCK (log細胞殺滅)活性及壽命增加(ILS)所量度。根據下式計算LCK活性：LCK = (T-C)/(Td x 3.32)，其中T為一組之中值存活(天數)，排除TFS，C為對照組之中值存活(天數)，且Td為腫瘤倍增時間(天數)，如經過時間對於對照(媒劑)組之中值TV所判定。根據NCI標準，LCK ＞2.8定義化合物為高度活性的(++++)，[0.7；2.8]中之LCK為活性的(定義為3級)，而LCK＜ 0.7定義為無活性的(-)。根據下式，壽命增加(ILS)表示為經治療組(T) (包括所有動物)之中值存活與對照組(C)相比之百分比
ILS = (T-C)/C x 100。根據NCI標準，ILS ≥ 25%定義為最低活性水準，而ILS ≥ 50%表示高活性水準。
若腫瘤超過1000 mm3；若動物損失多於其初始體重之20% (% BWC ＜ -20%)，這為大致的毒性指數；若腫瘤變壞死；或若小鼠在研究期間之任何時間點變得垂死，則對小鼠施以安樂死。 huEpCAMG23v4.2-DGN549之活體內 功效
接種小鼠且在接種後(dpi) 6日隨機分到6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於118與122.1 mm3 之間。該研究在接種後116日結束(EOS = 116 dpi)。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組及分別以0.5、1.5及3 µg/kg投與之三個huEpCAMG23v4.2-DGN549 ADC組，其中全部劑量均基於藥物濃度。
在此研究中，當對照安慰劑組之中值TV達到1070.4 mm3 時，在27 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 16 中。所有治療均在所示劑量下均良好耐受，且未觀測到體重損失。ADC huEpCAM23Gv4.2-DGN549在3 µg/kg下為高活性的(HA)，具有1.8%之TGI值、6/6 PR、3/6 CR及1/6 TSF。另外，此組亦顯示LCK = 1.77，將該治療定量為活性的(++)，且179% ILS (高活性的)，表明良好的腫瘤生長延緩。3 µg/kg方案中之腫瘤消退在ADC投與後的早期時間點開始且導致早至治療後7日的多次部分消退。具體而言，1.5 µg/kg劑量為活性的，具有31.6%之TGI值、1/6 PR及ILS 46% (活性的)。相比之下，huEpCAM23Gv4.2-DGN549之0.5 µg/kg劑量為無活性的。因此，此等資料顯示使用huEpCAM23Gv4.2-DGN549之治療在此腫瘤模型中誘導高腫瘤消退發生率且在低至1.5 µg/kg之劑量下導致有力的抗腫瘤活性。 攜帶具有3014可裂解部分之Ep02、Ep01-02、Ep11、及Ep04遮蔽部分的經遮蔽之EpCAM-DGN549的功效
接種小鼠且在接種後(dpi) 6日隨機分到6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於105.8與115.4 mm3 之間。該研究在接種後120日結束(EOS = 120 dpi)。
該等治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組及基於藥物濃度以3及5 µg/kg投與之四個經遮蔽之huEpCAMG23v4.2-DGN549 AADC組(亦即，攜帶連接至3014受質之遮蔽劑Ep02、Ep01-02、Ep11及Ep04之AADC)。用5 µg/kg huEpCAM23Gv4.2-DGN549 ADC治療之陽性對照組亦包括於此研究中。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1072.4 mm3 時，在25 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 17A 中。所有治療在所示劑量下均良好耐受，且在此研究中未觀測到體重損失。
ADC huEpCAM23Gv4.2-DGN549在5 µg/kg下為高活性的(HA)，具有0.3%之TGI值、6/6 PR、6/6 CR、研究結束時6/6無腫瘤之動物、及120 dpi，這導致380% ILS。
Ep01-02-3014-DGN549在5 µg/kg下顯示最小活性，具有34.5% TGI及48% ILS。Ep11-3014-DGN549在5 µg/kg劑量下有活性，具有10.1% TGI、1/6 PR、0.89 LCK (+)及78% ILS，但在更低劑量下無活性。Ep02-3014-DGN549 AADC在3 µg/kg下有活性(38.6% TGI、1/6 PR)且在5 ug/kg下為高活性的(9.9% TGI、2/6 PR、66% ILS)。Ep04-3014-DGN549 AADC在3 µg/kg下有活性(19.7% TGI、60% ILS)且在5 µg/kg下為高活性的(4.2% TGI)，從而誘導多次消退(6/6 PR、1/6 CR)且顯著增加該組之壽命(LCK = 1.48、144% ILS)。因此，此等資料顯示在此腫瘤模型中用Ep04-DGN549 AADC之治療在5 µg/kg劑量下為高度有效的，而用Ep02-及Ep01-02-及Ep11-3014-DGN549 AADC之治療顯示較小之抗腫瘤活性。 攜帶具有3014可裂解部分之Ep03、Ep05、Ep07及Ep04遮蔽劑之經遮蔽之EpCAM-DGN549的功效
接種小鼠且在接種後(dpi) 6日隨機分到6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於98.5與104.8 mm3 之間。該研究在接種後118日結束(EOS = 118 dpi)。
該等治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組及基於藥物濃度以3及5 µg/kg投與的四個經遮蔽之huEpCAMG23v4.2-DGN549 AADC組(亦即，攜帶連接至3014受質之遮蔽劑Ep03、Ep05、Ep07及Ep04之AADC)。亦包括投與攜帶不可裂解Ep04遮蔽劑之AADC Ep04-NSUB-DGN549之陰性對照組，以及用5 µg/kg huEpCAM23Gv4.2-DGN549 ADC治療之陽性對照組。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1293.4 mm3 時，在25 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 17B 中。所有治療在所示劑量下均良好耐受，且在此研究中未觀測到體重損失。
用作陽性對照之huEpCAM23Gv4.2-DGN549 ADC在5 µg/kg下為高活性的(HA)，此係基於腫瘤生長抑制(TGI = 0.0%)、多次消退(6/6 PR、6/6 CR及研究結束時6/6無腫瘤之動物、118 dpi)、以及總體腫瘤生長延緩(372% ILS)，與先前結果一致。
正如預期，不可裂解之Ep04-NSUB-DGN549為無活性的(TGI = 43.6%、LCK = 0.5)，且不誘導消退，其中腫瘤生長之輕微抑制可能歸因於有效負載，而非特異性經抗原引導之抗腫瘤反應。與先前結果一致，以5 µg/kg投與之Ep04-3014-DGN549 AADC顯示活性，如藉由腫瘤生長抑制(TGI = 3.2%)及腫瘤生長延緩(LCK = 2.37、+++、及210% ILS)所定義，且誘導多次消退(5/6 PR、3/6 CR及2/6 TFS)。
Ep03-及Ep07-3014-DGN549 AADC在3 µg/kg下有活性，其腫瘤生長抑制率分別為21.7%及35.9%，且具有LCK值0.79 (+)及44% ILS，但在此劑量下不誘導消退。在5 µg/kg下，Ep03-及Ep07-3014-DGN549 AADC皆為高活性的(TGI分別為7.6%及6.4%，LCK = 1.69 (++)，94% ILS)且誘導幾次消退(分別為2/6及3/6 PR)。
Ep05-3014-DGN549 AADC在3 µg/kg下有活性(17.5% TGI、1/6 PR、LCK = 1.4 (++)及78% ILS)，且在5 ug/kg下為高活性的，類似於Ep04-3014-DGN549 AADC。確切而言，以5 ug/kg投與之Ep05-3014-DGN549 AADC顯示腫瘤生長抑制至3.7%、LCK = 2.4 (+++)、134% ILS、及多次消退(6/6 PR、2/6 CR)。因此，該等資料顯示在此模型中用Ep04-及Ep05-3014-EpCAM AADC之治療在5 µg/kg下產生高活性。Ep04-及Ep05-3014-DGN549在此劑量下皆誘導多次腫瘤消退事件，且在較低劑量3 µg/kg下保持活性。 Ep05-2014-DM4及Ep05-2014-DGN549之功效
接種小鼠且在接種後7日(dpi)將其隨機分到6只小鼠之組。各組之平均腫瘤體積(TV)介於96.7與102.3 mm3 之間。該研究在接種後58日結束(EOS = 58 dpi)。
在此研究之第1部分中，治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組及基於藥物濃度以5 µg/kg投與之兩個經遮蔽之huEpCAMG23v4.2-DGN549 AADC組(亦即，具有攜帶3014受質之可裂解遮蔽劑之AADC及呈不可裂解之NSUB (無受質)形式的AADC)。在此研究之第2部分中，治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、以15、30及45 µg/kg(基於藥物濃度)投與之huEpCAMG23v4.2 -s-SPDB-DM4 ADC組、兩個Ep01-02-2014-s-SPDB AADC組(以45及30 µg/kg投與)、及不可裂解之變異體Ep01-02-NSUB-s-SPDB-DM4組。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1156.9 mm3 時，在23 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 17C 及17D 中。所有治療在指示劑量下均良好耐受，且在此研究中未觀測到體重損失。A. 攜帶 Ep05 及 Ep07 遮蔽劑之經遮蔽之 EpCAM-3014-DGN549 AADC 的功效。
此研究之部分A之結果示於圖 17C 中。以5 µg/kg投與之Ep05-3014-DGN549及Ep07-3014-DGN549 AADC基於腫瘤生長抑制(2.9%及3.9%)為高活性的(HA)，其具有多次部分消退(分別為6/6及5/6)，但在研究結束時(58 dpi)無CR且無TFS。用Ep05-3014-DGN549 AADC治療之組的中值存活＞ 58 d，且用Ep07-3014-DGN549 AADC治療之組的中值存活為56 d，其分別產生LCK值2.56及2.41 (+++活性)，且對應ILS分別為＞ 152%及143%。正如預期，不可裂解之Ep05-NSUB-DGN549及Ep07-NSUB-DGN549 AADC無活性(TGI ＞ 70%、LCK = 0.29、且ILS = 17%)。B. huEpCAMG23v4.2-s-SPDB-DM4 及 Ep01-02-2014-s-SPDB-DM4 之功效。
此研究之部分B之結果示於圖 17D 中。用基於藥物以45、30及15 µg/kg投與之huEpCAMG23Gv4.2-s-SPDB-DM4 ADC (親本EpCAM-DM4)測試美登素有效負載之功效。親本EpCAM-DM4 ADC在低至30 µg/kg之劑量下為高活性(TGI ＜ 1%、ILS ＞ 152%)，且誘導多次消退(分別對於45及30 µg/kg劑量而言，為6/6 PR、6/6及5/6 CR及TFS)。在15 µg/kg劑量下，親本EpCAM-DM4 ADC保持有活性(TGI = 20.3%、LCK = 1.02)，且雖然多次PR (6/6)未全部進展至CR及TFS (1/6)，但該組之壽命與對照(媒劑)組相比增加了70%。亦使用Ep01-02遮蔽劑及2014受質Ep01-02-2014-DM4以AADC形式測試美登素有效負載之功效。45 µg/kg劑量顯示根據腫瘤生長抑制(35.6%)之最小活性，但未誘導任何消退且僅稍微增加該組之壽命。總之，此等資料顯示EpCAM-DGN549 AADC之抗腫瘤活性為腫瘤特異性的(因為含有具有不可裂解遮蔽劑之Ab的AADC為無活性的)，且可裂解之DM4有效負載呈ADC形式時極有效，其中使用Ep01-02遮蔽劑及2014受質以AADC形式之DM4有效負載之活性有限。 Ep05-2014-DM4及Ep05-2014-DGN549之功效
接種小鼠且在接種後8日(dpi)將其隨機分到6只小鼠之組。各組之平均腫瘤體積(TV)介於90.8與99.1 mm3 之間。該研究在接種後62日結束(EOS = 62 dpi)。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組及具有3014受質之兩個Ep05 AADC (基於Ab (約25 µg/kg，基於藥物)以1.5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM4 AADC及基於藥物以5 µg/kg投與之Ep05-3014-DGN549 AADC)。類似地以對應不可裂解之NSUB AADC作為陰性對照向兩個組給藥。向三個額外組投與1.5、2.5及5 mg/kg (基於Ab)之Ep05-2014-DM4 AADC，且向兩個額外組投與3及5 µg/kg (基於藥物)之Ep05-2014-DGN549 AADC。隨機分組後5日(13dpi)向所有動物給藥。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1241.8 mm3 時，在30 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 17E 及17F 中。所有治療在所指示劑量下均良好耐受，且在此研究中未觀測到體重損失。
正如預期，不依賴於所用之有效負載，所有Ep05-NSUB AADC均無活性。Ep05-2014-DM4 AADC在5 mg/kg下為高活性的(TGI = 0%)，其在6/6小鼠中誘導CR，在EoS時全部定義為TFS。以2.5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM4 AADC基於TGI (7.2%)亦為高活性的，但僅誘導3個PR及1個CR、1個TSF。以1.5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM4 AADC無活性，與相同劑量之Ep05-3014-DM4 AADC一樣(圖 17E )。Ep05-3014-DGN549 AADC在5 µg/kg下為高活性的(HA) (TGI = 5.5%)，但僅誘導2個PR。有2014-受質之AADC Ep05-2014-DGN549在所用兩個劑量下皆無活性，且不會誘導腫瘤生長之消退(圖 17F )。因此，此等資料顯示Ep05 AADC之抗腫瘤活性為腫瘤特異性的，因為含有具有不可裂解遮蔽劑之Ab的AADC不依賴於有效負載而無活性。另外，5 µg/kg Ep05-DGN549 AADC當與3014受質一起使用時有高活性，但使用2014受質時則喪失活性。相比之下，攜帶可裂解之s-SPDB-DM4有效負載之Ep05-2014-DM4 AADC為高活性的且以劑量依賴性方式誘導多次腫瘤消退。實例 14 ：在攜帶 Calu-3 NSCLC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05- 3014-DM4 及 2014-DM4 之功效
用0.2 mL SFM:Matrigel中之5x106 個Calu-3細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後10日(dpi)將小鼠隨機分到6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於97.6與106.4 mm3 之間。該研究在接種後119日結束(EOS = 119 dpi)。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、作為陽性對照之親本huEpCAMG23v4.2-s-SPDB-DM4 ADC組、作為陰性對照之不可裂解之Ep05-NSUB-DM4 AADC組、Ep05-3014-DM4 AADC組、及Ep05-2014-DM4 AADC組，其中所有AADC化合物均以5及2.5 mg/kg測試(基於可活化抗體濃度)。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1138 mm3 時，在73 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 18 中。所有治療在所指定劑量下均良好耐受，且在此研究中未觀測到體重損失。
正如預期，Ep05-NSUB-DM4 AADC無活性，而親本EpCAM-DM4 ADC在5 mg/kg劑量下有活性，其在5 mg/kg下TGI = 15.6%，且在2.5 mg/kg下為21%。此外，EpCAM-DM4 ADC延緩腫瘤生長，但不會誘導任何消退。類似地，使用E05-3014-DM4及Ep05-2014-DM4 AADC未觀測到消退。Ep05-3014-DM4 AADC在5及2.5 mg/kg下有活性(TGI值分別為15.6%及21%)，而Ep05-2014-DM4 AADC則無活性(TGI ＞ 40%)。因此，此等資料顯示在Calu-3腫瘤模型中用EpCAM-DM4 ADC或Ep05-DM4 AADC之治療引起一定程度之腫瘤生長延緩，但呈現出最少量之總體抗腫瘤活性。實例 15 ：在攜帶 NCI-H292 NSCLC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05- 3014-DM4 及 2014-DM4 之功效
用0.1 mL SFM中之2.5x106 個NCI-H292細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後13日(dpi)將小鼠隨機分到6只小鼠之組。各組之平均腫瘤體積(TV)介於88.7與94.1 mm3 之間。在64 dpi時終止研究。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、作為陽性對照之親本huEpCAMG23v4.2-s-SPDB-DM4 ADC組、作為陰性對照以2.5 mg/kg投與之不可裂解之Ep05-NSUB-DM4 AADC組、及Ep05-3014-DM4 AADC與Ep05-2014-DM4 AADC兩個組(二者皆基於可活化抗體濃度以5及2.5 mg/kg投與)。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到939.8 mm3 時，在28 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 19 中。所有治療在指定劑量下均良好耐受，且雖然若干動物由於體重損失而不得不處死，但此係由於異種移植物模型之特徵，而非由於治療。
正如預期，Ep05-NSUB-DM4 AADC無活性，而親本EpCAM-DM4 ADC在2.5 mg/kg下有活性，其TGI為22.7%。EpCAM-DM4 ADC延緩腫瘤生長(ILS= 100% (28.5日))，但不會誘導任何消退。在此模型中未觀測到消退，除了在以2.5 mg/kg給藥之E05-3014-DM4組中之短暫、未持續PR之外。然而，Ep05-3014-DM4及Ep05-2014-DM4 AADC二者在低至2.5 mg/kg劑量下為高活性的(TGI分別為10%及11.45%)且增加對應組之壽命多於兩倍(100%)。因此，此等資料顯示NCI-H292腫瘤對EpCAM-DM4 ADC以及衍生的Ep05-DM4 AADC敏感。雖然未觀測到顯著腫瘤消退之誘導，但在治療組中存在顯著腫瘤生長延緩及壽命增加。此外，對有3014-受質之AADC及有2014-受質之AADC的反應係類似的。實例 16 ：在攜帶 Detroit 562 HNSCC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05-3014-DM4 、 Ep05-2014-DM4 、 Ep05-3014-DM21 及 Ep05-2014-DM21 之功效
用0.2 mL SFM:Matrigel之1:1溶液中的107 個Detroit 562細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後4日(dpi)將小鼠隨機分到8只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於99.2與106 mm3 之間。在90 dpi時終止研究。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM4 AADC組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM4 AADC組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM21L AADC組、以5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM21L AADC組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、及以5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM21L AADC組。所有AADC均基於可活化抗體濃度來投與。另外，陽性對照ADC組係基於抗體濃度以2.5 mg/kg投與huEpCAM23Gv4.2-DM21L。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1004.2 mm3 時，在28 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 20 中。所有治療在指定劑量下均良好耐受。
此研究中所用之所有AADC (Ep05-3014-DM4、Ep05-2014-DM4、Ep05-3014-DM21L、及Ep05-2014-DM21L)以及huEpCAM23Gv4.2-DM21L ADC在所有測試劑量下均為高活性的(對於所有治療組TGI為0%，除了2.5 mg/kg Ep05-3014-DM21L之外，其TGI為0.7%)，且對應組之壽命增加多於三倍(200%)。所有組均誘導100%部分消退，除了2.5 mg/kg Ep05-2014-DM21L組之外，其誘導87.5%部分消退。此等部分消退大多數進展至完全消退(亦即，＞75% PR進展至CR)，這保持至研究結束，產生多個無腫瘤存活者。關於與各組相關之TGI、PR、CR及TFS之額外細節提供於圖 20 中。
因此，此等資料顯示Detroit 562腫瘤對Ep05-DM4 AADC高度敏感，從而在治療組中引起顯著腫瘤消退、腫瘤生長延緩及壽命增加。實例 17 ：在攜帶 NCI-H441 NSCLC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05-3014-DM21 及 Ep05-2014-DM21 之功效
用0.2 mL SFM中之107 個NCI-H441細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後8日(dpi)將小鼠隨機分成到8只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於95.1與101.4 mm3 之間。在92 dpi時終止研究。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、以2.5 mg/kg(基於抗體濃度)投與之親本huEpCAM23Gv4.2-DM21L ADC組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM21L AADC組、以5 mg/kg投與之Ep05-3014-DM21L AADC組、以2.5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、及以5 mg/kg投與之Ep05-2014-DM21L AADC組。所有AADC均基於可活化抗體濃度來投與。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1109.7 mm3 時，在37 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 21 中。所有治療在指定劑量下均良好耐受。
所有治療均為有活性至高活性的，使組壽命增加了＞ 149%且在各組中誘導100% PR。達成多個CR且一致地保持至研究結束，產生多個TFS。huEpCAM23Gv4.2-DM21 ADC在2.5 mg/kg下為高活性的，其具有7.7%之TGI、8/8 PR及7/8 CR。類似地，Ep05-2014-DM21 AADC在2.5及5 mg/kg劑量下為高活性的，其具有分別為6.2%及4.2%之TGI及分別為6/8及5/8之CR。Ep05-3014-DM21 AADC在5 mg/kg劑量下有活性，其具有10.1%之TGI及5/8 CR。在2.5 mg/kg劑量下，Ep05-3014-DM21 AADC為高活性的，其具有6.3%之TGI及6/8 CR。
因此，此等資料顯示NCI-H441腫瘤對Ep05-DM21L AADC敏感，從而在治療組中引起顯著腫瘤消退、腫瘤生長延緩及壽命增加。實例 18 ：在攜帶 OV-90 EOC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05-2014-DM21 之功效
用0.1 mL SFM:Matrigel中之107 個OV-90細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後7日(dpi)將小鼠隨機分到各6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於92.2與98.5 mm3 之間。在71 dpi時終止研究。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、以1.25 mg/kg(基於抗體濃度)投與之親本huEpCAM23Gv4.2-DM21 ADC組、以1.25 mg/kg(基於可活化抗體濃度)投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、以2.5 mg/kg(基於可活化抗體濃度)投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、以1.25 mg/kg(基於抗體濃度)投與之chKTI-DM21L非靶向陰性對照ADC組、及以2.5 mg/kg(基於抗體濃度)投與之chKTI-DM21L非靶向陰性對照ADC組。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到1436.7 mm3 時，在34 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 22 中。所有治療在指定劑量下均良好耐受。
此研究中所用的所有EpCAM靶向治療(1.25 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-DM21 ADC組以及2.5及1.25 mg/kg之Ep05-2014-DM21L AADC組)為高活性的，其TGI ＜ 5%，與未治療動物相比組壽命增加＞ 109%，且各組中100% PR。該等組中之所有PR均進展至完全消退(CR)且保持至研究結束，從而引起TFS。非靶向chKTI-DM21 ADC在2.5及1.25 mg/kg下對OV-90腫瘤無活性，其TGI ＞ 74.5%且無腫瘤消退。
因此，此等資料顯示OV-90腫瘤對Ep05-2014-DM21L AADC敏感，從而在治療組中引起顯著腫瘤消退及壽命增加。實例 19 ：在攜帶 Calu-3 NSCLC 異種移植物之 C.B-17 SCID 小鼠中 Ep05-2014-DM21 之功效
用0.2 mL SFM:Matrigel中之5x106 個Calu-3細胞/小鼠在右腹區域中皮下接種6-8週齡雌性小鼠。在接種後6日(dpi)將小鼠隨機分到各6只小鼠之組中。各組之平均腫瘤體積(TV)介於110.3與116.5 mm3 之間。
治療組包括投與媒劑(200 µl/ms)之安慰劑對照組、以2.5 mg/kg(基於抗體濃度)投與之親本huEpCAM23Gv4.2-DM21L ADC組、以2.5 mg/kg(基於可活化抗體濃度)投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、以5 mg/kg(基於可活化抗體濃度)投與之Ep05-2014-DM21L AADC組、以2.5 mg/kg(基於抗體濃度)投與之chKTI-DM21L非靶向陰性對照ADC組、及以5 mg/kg(基於抗體濃度)投與之chKTI-DM21L非靶向陰性對照ADC組。
在此研究中，當對照安慰劑(媒劑)組之中值TV達到963.8 mm3 時，在62 dpi時測定TGI。
該研究之結果示於圖 23 中。所有治療在指定劑量下均良好耐受。
2.5 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-DM21 ADC為高活性的，其具有7.8%之TGI、6/6 PR、5/6 CR、及在最後測量時(75 dpi)時1/6無腫瘤小鼠。Ep05-2014-DM21L AADC在5 mg/kg下為高活性的，其具有4.4% TGI、5/6 PR進展成CR、及在最後測量時(75 dpi)時2/6無腫瘤小鼠。Ep05-2014-DM21L AADC在2.5 mg/kg劑量下有活性，其具有30.4% TGI及3/6 PR。非靶向chKTI-DM21L ADC對照組在5及2.5 mg/kg下對Calu-3腫瘤無活性，其在5 mg/kg劑量下TGI ＞ 90%且無腫瘤消退。
因此，此等資料顯示Calu-3腫瘤對Ep05-2014-DM21L AADC敏感，從而引起顯著腫瘤消退及腫瘤生長延緩。實例 20 ：在食蟹獼猴中分析 EpCAM- 靶向 AADC 藥物動力學及耐受性 DM4 偶聯物之藥物動力學及耐受性
為了進一步評估與EpCAM-靶向ADC及AADC的耐受性及藥物動力學，根據表27所示之研究設計，向雄性食蟹獼猴投與huEpCAM23 Gv4.2-s-SPDB-DM4、huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-s-SPDB-DM4、或huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-s-SPDB-DM4。
Figure 02_image366
在單次IV輸注ADC或AADC後，觀測食蟹獼猴達28日且收集樣品以用於藥物動力學分析。具體而言，監測猴之體重變化、臨床觀測、及臨床病理學評價(例如，脂酶及澱粉酶)。
如圖 24 所示，EpCAM-靶向AADC在食蟹獼猴中在8 mg/kg下良好耐受。具體而言，在接受8 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-s-SPDB-DM4或huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-s-SPDB-DM4之猴中的臨床觀測限於注射部位之皮膚變紅，且糞便排出被視為正常的。對接受12 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-s-SPDB-DM4之猴獲得類似結果。相比之下，接受8 mg/kg ADC之猴被視為垂死的且臨床觀測由異常步態、活動減少、食欲降低、觸摸冷、輕度皮膚發現(變紅或皸裂)、液狀糞及疑似脫水組成。
接受EpCAM-靶向DM4 AADC之食蟹獼猴相對於接受EpCAM-靶向DM4 ADC之猴亦顯示經改良之血清化學。具體而言，僅在ADC組中觀測到白蛋白、TP、A/G比率(圖 25A )、尿素氮(圖 25B )及肌酸酐(圖 25C )之變化，且脂酶(圖 25D )及澱粉酶(圖 25E )血清濃度之增加類似地僅與ADC組相關。
如圖 26 及表28所示，AADC之投與亦與經改良之偶聯物暴露相關。總之，此等資料提示DM4 AADC之有效遮蔽減少了EpCAM之正常組織表現對藥物動力學及毒性概況之影響。
Figure 02_image368
DM21 偶聯物之藥物動力學及耐受性
在單獨研究中，根據表29所示之研究設計，向雄性食蟹獼猴投與huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L或huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L。
Figure 02_image370
在單次IV輸注ADC或AADC後，觀測食蟹獼猴達28日且收集樣品以用於藥物動力學分析。具體而言，監測猴之體重變化、臨床觀測、及臨床病理學評價(例如 ，脂酶及澱粉酶)。
如圖 27 所示，huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L在食蟹獼猴中在12 mg/kg下良好耐受。具體而言，臨床觀測限於皮膚變紅/變暗、液狀糞、及凹眼(脫水)。相比之下，接受12 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L之猴表現出與先前研究中接受huEpCAM23Gv4.2-s-SPDB-DM4之彼等類似的臨床觀測。
接受12 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L之食蟹獼猴亦顯示與先前研究中接受12 mg/kg huEpCAMGv4.2-Ep05-2014-s-SPDB-DM4之猴類似的血清化學。具體而言，對於該兩個組，A/G比率(圖 28A )、尿素氮(圖 28B )、及肌酸酐(圖 28C )、脂酶(圖 28D )、及澱粉酶(圖 28E )血清濃度之變化為類似的，而huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L組之血清化學參數趨向於先前研究中對DM4 ADC組所獲得之彼等。
如圖 29 及表30所示，huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L之投與亦與相比於所有其他測試偶聯物(包括DM4及DM21L偶聯物二者)而言改良的偶聯物暴露相關。總之，此等資料提示DM21 AADC之有效遮蔽減少了EpCAM之正常組織表現對藥物動力學及毒性概況之影響。
Figure 02_image372
實例 21 ： EpCAM 表現之分析 EpCAM腫瘤表現
為了評價跨越不同適應症之EpCAM表現，首先用ImmunoGen開發以用於初步研究用途的EpCAM免疫組織化學(IHC)測定評價代表10種不同腫瘤類型之組織微陣列(TMA)。
分析的所有腫瘤均為FFPE (福馬林固定及石臘包埋)樣品。具體而言，分析代表10種不同適應症之兩個多癌TMA以及代表三陰性乳癌(TNBC)、卵巢癌及膀胱癌之適應症特異性TMA。亦分析結直腸癌(CRC) TMA，並且分析肺癌及卵巢癌之整個腫瘤組織FFPE塊。
使用Ventana Discovery Ultra自動染色儀對EpCAM進行免疫組織化學染色。EpCAM之第一抗體為可商購獲得之兔單株抗體。評價所有樣品且由經評分算法培訓的經職業驗證之病理學家進行評分。需要存在至少100個活腫瘤細胞用於評分。在自0至3之半定量整數標度上對染色強度進行評分，其中0表示無染色，1表示弱染色，2表示中度染色，且3表示強染色。記錄在各強度水準下陽性染色細胞之百分比。評分係基於EpCAM僅至細胞膜之定位。藉由H-評分分析染色結果，該H-評分將染色強度之組分與陽性細胞之百分比組合。其具有0與300之間的值且經定義為： 1 * (在1+強度下染色之細胞的百分比) +2 * (在2+強度下染色之細胞的百分比) +3 * (在3+強度下染色之細胞的百分比) = H評分
下表31匯總了來自多癌TMA之所有10種適應症的基於膜染色之EpCAM的流行率。
Figure 02_image374
根據來自多癌TMA之結果，對於經擴展之流行率分析選擇五種適應症特異性TMA：具有42條病例(40條有價值)之結直腸癌(CRC) TMA、具有37個核心之卵巢癌TMA、具有81個核心之三陰性乳癌(TNBC)、具有60個癌核心之膀胱癌TMA及具有80個腺癌核心及80個鱗狀細胞癌核心(各自有79條有價值)之非小細胞肺癌(NSCLC) TMA。圖 30 描述了在各腫瘤適應症內具有H評分之分解的EpCAM表現。
另外，藉由IHC分析NSCLC-腺癌(n = 86)、NSCLC-鱗狀細胞癌(n =19)及卵巢癌(n = 29)之完整腫瘤組織切片的EpCAM表現。對所有該等樣品之膜染色進行評分且結果匯總於表32中。
Figure 02_image376
此等初步研究之結果顯示EpCAM在廣泛範圍之實體癌中表現且支持抗-EpCAM9藥物偶聯物在許多不同表現EpCAM之實體腫瘤中之用途。 正常人類組織中之EpCAM表現
藉由IHC以上文所述類似之方式使用相同的抗-EpCAM兔單株抗體及Ventana Discovery Ultra自動染色儀評價EpCAM之正常人類組織表現。
使用代表來自3個單獨個體之35種不同器官/解剖部位的多組織微陣列TMA，所有分析組織均為FFPE (福馬林固定及石蠟包埋)樣品。評價所有樣品且由經評分算法培訓的經職業驗證之病理學家進行評分。需要存在至少100個活腫瘤細胞用於評分。與腫瘤樣品一樣，在自0至3之半定量整數標度上對染色強度進行評分，其中0表示無染色，1表示弱染色，2表示中度染色，且3表示強染色。然而，與腫瘤不同，由於通常可見於不同組織中之不同結構而未計算H-評分，該等不同結構使得H-評分不能準確反映染色。記錄下病理學家在各器官內觀測到之任何染色模式的描述，其結果匯總於表33中。
在許多正常人類組織(尤其是小腸、結腸及直腸)中觀察到明顯的強染色。因此，替代性靶向方法(諸如基於可活化抗體之技術)代表用於克服潛在毒性風險之有吸引力的選項。
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應理解，[實施方式]部分但不是[發明內容]及[摘要]部分意欲用於解釋申請專利範圍。[發明內容]及[摘要]部分可闡述如發明人所預期之本揭露之一或多個但不是所有示範性實施例，且因此，不意欲以任何方式限制本揭露及隨附申請專利範圍。
已藉助於說明特定功能之實行方案及其關係的示範性標題及其他功能性建構基元在上文描述本揭露。為便於描述，本文中將該等功能性建構基元之邊界已任意地定義。可界定替代性邊界，只要指定功能及其關係得到適當執行即可。
具體實施例之前文描述將充分地揭露所涵蓋組成物及方法之一般性質 ，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本揭露之一般範疇的情況下，可輕易地針對各種應用對此等具體實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭露實施例之等效物的含義及範圍內。本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。
本揭露之廣度及範疇不應受任何上述示範性實施例限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效物定義。
[圖 1A 及 1B ]展示鼠類EpCAM抗體mEpCAM23與HSC2細胞(圖 1A )及獼猴腎上皮細胞( 圖 1B) 之結合曲線。
[圖 2A 及2B ]展示原始muEpCAM-23輕鏈及重鏈序列之可變區與其最近的人類生殖系配對之間的序列比對。基於比對結果，作為EpCAM-23抗體之VL及VH域之受體框架選擇之人類生殖系序列分別為IGKV2D- 29*02 (圖 2A )及IGHV1-3*01 (圖 2B )。
[圖 3A-3F ]展示mEpCAM23之各種人源化抗體之結合曲線。具體而言，圖 3A 展示mEpCAM23與HSC2細胞之結合，圖 3B 展示mEpCAM23與獼猴原代腎上皮細胞之結合，圖 3C 展示各種人源化EpCAM23抗體與HSC2細胞之結合，且圖 3D 展示各種人源化EpCAM23抗體與獼猴原代腎上皮細胞之結合。圖 3E 展示經位點特異性修飾之抗體huEpCAM23Gv4.2-C442與HSC2細胞之結合且圖 3F 展示相同抗體與獼猴原代腎上皮細胞之結合。
[圖 4A 及4B ]展示原始鼠類EpCAM-23抗體移植版本Gv2.2及移植版本Gv4.2之可變區的序列比對。具體而言，圖 4A 展示抗體輕鏈之可變區的比對，且圖 4B 展示抗體重鏈之可變區的比對。
[圖 5A-5N ]展示huEpCAM23Gv4.2之各種親和力變異體對HSC2細胞及獼猴原代腎上皮細胞之結合曲線。具體而言，圖 5A 展示Gv4a.2、Gv4b.2及Gv4c.2與huEpCAM-mFc之結合；圖 5B 展示Gv4a.2、Gv4b.2及Gv4c.2與cynoEpCAM-mFc之結合；圖 5C 展示Gv4.2a、Gv4.2b、Gv4.2c及Gv4.2d與huEpCAM-mFc之結合；圖 5D 展示Gv4.2a、Gv4.2b、Gv4.2c及Gv4.2d與cynoEpCAM-mFc之結合；圖 5E 展示Gv4a.2a、Gv4b.2a及Gv4c.2a與HSC2細胞之結合；圖 5F 展示Gv4a.2a、Gv4b.2a及Gv4c.2a與獼猴原代腎上皮細胞之結合；圖 5G 展示Gv4a.2b、Gv4a.2d、Gv4b.2b、Gv4b.2d、Gv4c.2b及Gv4c.2d與HSC2細胞之結合；且圖 5H 展示Gv4a.2b、Gv4a.2d、Gv4b.2b、Gv4b.2d、Gv4c.2b及Gv4c.2d與獼猴原代腎上皮細胞之結合。圖 5I 展示Gv4.2H、Gv4.2K、Gv4.2L、Gv4.2O、Gv4.2P、Gv4.2Q、Gv4.2R及Gv4.2S在HSC2細胞上之結合；圖 5J 展示1361-D、1361-H、1361-I及1361-L在HSC2細胞上之結合；且圖 5K 展示1565-A、1565-F、1565-G、1565-S、1565-T、1565-V及1565-Y在HSC2細胞上之結合。圖 5L 展示Gv4.2H、Gv4.2K、Gv4.2L、Gv4.2O、Gv4.2P、Gv4.2Q、Gv4.2R及Gv4.2S在獼猴原代腎上皮細胞上之結合；圖 5M 展示1361-D、1361-H、1361-I及1361-L在獼猴原代腎上皮細胞上之結合；且圖 5N 展示1565-A、1565-F、1565-G、1565-S、1565-T、1565-V及1565-Y在獼猴原代腎上皮細胞上之結合。
[圖 6A 及6B ]展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2可活化抗體與HSC2細胞及獼猴原代腎上皮細胞上之各種遮蔽劑的結合曲線。具體而言，圖 6A 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23與HSC2細胞上之受質3014及與遮蔽劑Ep01-2、Ep02、Ep03、Ep04、Ep05、Ep07及Ep11之結合，且圖 6B 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23與獼猴原代腎上皮細胞上之受質3014及與遮蔽劑Ep02、Ep03、Ep04、Ep05及Ep07之結合。
[圖 7A 及7B ]展示huEpCAM23之各種經uPA-處理之可活化抗體-藥物偶聯物在HSC2細胞上之結合曲線。具體而言，圖 7A 展示經uPA-處理之huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4與HSC2細胞上之受質3014及與遮蔽劑Ep01-2、Ep02、Ep03、Ep04、Ep05、Ep07及Ep11之結合，且圖 7B 展示經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-lys-DGN549與HSC2細胞上之受質3014及與遮蔽劑Ep01-2、Ep02、Ep03、Ep04、Ep05、Ep07及Ep11之結合。
[圖 8A-8D ]展示各種可活化抗體-藥物偶聯物與HSC2細胞上之受質2014或3014之結合曲線。具體而言，圖 8A 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-sSPDB-DM4在HSC2細胞上之結合，圖 8B 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB-DM4在HSC2細胞上之結合，圖 8C 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05- 3014-lys-DGN549在HSC2細胞上之結合，且圖 8D 展示完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-GMBS-DM21L以及完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-GMBS-DM21L在HSC2細胞上之結合。
[圖 9 ]展示在裂解信號肽後人類EpCAM (SEQ ID NO:1)及小鼠EpCAM (SEQ ID NO:210)之胞外域的比對。
[圖 10A 及10B ]展示人類EpCAM (SEQ ID NO:1)、小鼠EpCAM (SEQ ID NO:210)及各種嵌合EpCAM變異體(SEQ ID NOs:211-214)之胞外區之比對。圖 10A 展示胺基酸殘基1-160之間的比對，且圖 10B 展示胺基酸殘基161-243之間的比對。
[圖 11 ]展示huEpCAM23Gv4.2與人類EpCAM及小鼠EpCAM之胞外域的結合曲線。
[圖 12A-12K ]展示在各種細胞株中huEpCAM23Gv4.2之抗體-藥物偶聯物(ADC)的劑量反應曲線。具體而言，圖 12A-12E 展示在H1568細胞(圖 12A )、H292細胞(圖 12B )、H2110細胞(圖 12C )、LoVo細胞(圖 12D )及Detroit562細胞(圖 12E )中huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4之劑量反應曲線。圖 12F 展示在H2110細胞中huEpCAM23Gv4.2-lys-DGN549及huEpCAM23Gv4.2-C442-DGN549之劑量反應曲線。圖 12G-12K 展示在Calu3細胞(圖 12G )、Detroit562細胞(圖 12H )、EBC-1細胞(圖 12I )、H2110細胞(圖 12J )及H441細胞(圖 12K )中huEpCAM23Gv4.2-GMBS-DM21L之劑量反應曲線。
[圖 13A-13D ]展示在各種細胞株中huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4之完整及經uPA-活化之可活化抗體-藥物偶聯物(AADC)的劑量反應曲線。具體而言，展示在Calu3細胞(圖 13A )、OV90細胞(圖 13B )、EBC-1細胞(圖 13C )及H2110細胞(圖 13D )中完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05- 2014-sSPDB-DM4以及完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB- DM4的劑量反應曲線。
[圖 14A-14D ]展示在各種細胞株中huEpCAM23Gv4.2-GMBS-DM21L之完整及經uPA-活化之AADC的劑量反應曲線。具體而言，展示在Calu3細胞(圖 14A )、Detroit562細胞(圖 14B )、EBC-1細胞(圖 14C )及H2110細胞(圖 14D )中完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-GMBS-DM21L以及完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-GMBS-DM21L的劑量反應曲線。
[圖 15A-15D ]展示在各種細胞株中huEpCAM23-lys-DGN549之完整及經uPA-活化之AADC的劑量反應曲線。具體而言，展示在H2110細胞(圖 15A )、EBC-1細胞(圖 15B )、Calu3細胞(圖 15C )及OV90細胞(圖 15D )中完整及經uPA-活化之huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-lys-DGN549之劑量反應曲線。
[圖 16 ]展示在H2110非小細胞肺癌異種移植物模型中huEpCAM23Gv4.2-lys-DGN549之抗腫瘤活性。
[圖 17A-17F ]展示在H2110非小細胞肺癌異種移植物模型中huEpCAM23Gv4.2之各種AADC之抗腫瘤活性。具體而言，圖 17A 展示具有遮蔽劑Ep02、Ep01、Ep11及Ep04之huEpCAM23-lys-DGN549的抗腫瘤活性，圖 17B 展示具有遮蔽劑Ep03、Ep05、Ep07及Ep04之huEpCAM23-lys-DGN549的抗腫瘤活性，且圖 17C 展示huEpCAM23-Ep05-3014-lys- DGN549及huEpCAM23-Ep07-3014-lys-DGN549與不可裂解之偶聯物相比之抗腫瘤活性。圖 17D 展示huEpCAM23Gv4.2-Ep01-02-2014-sSPDB-DM4與不可裂解之偶聯物及ADC huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4相比之抗腫瘤活性，圖 17E 展示huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-sSPDB-DM4及huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB-DM4與不可裂解之偶聯物相比之抗腫瘤活性，且圖 17F 展示huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-lys-DGN549及 huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-lys-DGN549與不可裂解之偶聯物相比之抗腫瘤活性。
[圖 18 ]展示在Calu3非小細胞肺癌異種移植物模型中huEpCAM23Gv4.2- sSPDB-DM4之各種AADC之抗腫瘤活性。
[圖 19 ]展示在H292非小細胞肺癌異種移植物模型中huEpCAM23Gv4.2- sSPDB-DM4之各種AADC之抗腫瘤活性。
[圖 20 ]展示在攜帶Detroit 562 HNSCC異種移植物之C.B-17 SCID小鼠中Ep05-3014-DM4、Ep05-2014-DM4、Ep05- 3014-DM21及Ep05-2014-DM21之抗腫瘤活性。
[圖 21 ]展示在攜帶NCI-H441 NSCLC異種移植物之C.B-17 SCID小鼠中Ep05-3014-DM21及Ep05-2014-DM21之抗腫瘤活性。
[圖 22 ]展示在攜帶OV-90 EOC異種移植物之C.B-17 SCID小鼠中Ep05-2014-DM21之抗腫瘤活性。
[圖 23 ]展示在攜帶Calu-3 NSCLC異種移植物之C.B-17 SCID小鼠中Ep05-2014-DM21之抗腫瘤活性。
[圖 24 ]展示EpCAM-靶向ADC (huEpCAM23Gv4.2- sSPDB-DM4 (抗-EpCAM-DM4))及EpCAM-靶向AADC (huEpCAM23Gv4.2- Ep05-2014-sSPDB-DM4 (M05-2014-DM4))及huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB- DM4 (M05-3014-DM4))於食蟹獼猴中之耐受性。
[圖 25A-25E ]展示投與EpCAM-靶向ADC (huEpCAM23Gv4.2-sSPDB-DM4)或EpCAM-靶向AADC (huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-sSPDB-DM4)之食蟹獼猴的血清化學。具體而言，圖 25A 展示A/G比率，圖 25B 展示尿素氮濃度，圖 25C 展示肌酸酐濃度，圖 25D 展示脂酶濃度，且圖 25E 展示澱粉酶濃度。
[圖 26 ]展示接受8 mg/kg EpCAM-靶向ADC (huEpCAM23Gv4.2- sSPDB-DM4 (抗-EpCAM-DM4))或8 mg/kg EpCAM-靶向AADC (huEpCAM23Gv4.2- Ep05-2014-sSPDB-DM4 (M05-2014-DM4))或huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-sSPDB-DM4 (M05-3014- DM4 AADC))之食蟹獼猴的藥物動力學曲線。
[圖 27 ]展示huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L (Ep05-2014-DM21L)及huEpCAM23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L (Ep05-3014-DM21L)於食蟹獼猴中之耐受性。
[圖 28A-28E ]展示投與12 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L (Ep05-2014-DM21L)及huEpCAM 23Gv4.2-Ep05-3014-DM21L (Ep05-3014-DM21L)之食蟹獼猴的血清化學。具體而言，圖 28A 展示A/G比率，圖 28B 展示尿素氮濃度，圖 28C 展示肌酸酐濃度，圖 28D 展示脂酶濃度，且圖 28E 展示澱粉酶濃度。
[圖 29 ]展示接受12 mg/kg huEpCAM23Gv4.2-Ep05-2014-DM21L (Ep05-2014-DM21)之食蟹獼猴的藥物動力學曲線。
[圖 30 ]展示適應症特異性組織微陣列中EpCAM表現之擴展分析。
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Claims (108)

  1. 一種EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) 重鏈CDR1 (VH-CDR1)，其包含序列X1 YX3 X4 H，其中X1 係選自N及S，X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W，且X4 係選自I及M (SEQ ID NO:5)； (b) 重鏈CDR2 (VH-CDR2)，其包含序列WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)； (c) 重鏈CDR3 (VH-CDR3)，其包含序列X1 GX3 X4 FAY，其中X1 係選自D及E，X3 係選自P、A、S、Y、F、G、T及V，且X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:8)； (d) 輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其包含序列RSSX4 SLLHSX10 GX12 TY LX16 ，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)； (e) 輕鏈CDR2 (VL-CDR2)，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) 輕鏈CDR3 (VL-CDR3)，其包含序列X1 QX3 LELPX8 T，其中X1 係選自A、L及Q，X3 係選自S、G、Y及N，且X8 係選自N及W (SEQ ID NO:11)。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) 重鏈CDR1 (VH-CDR1)，其包含序列NYX3 IH，其中X3 係選自Y、N、F、S、H、D、L、I及W (SEQ ID NO:6)； (b) 重鏈CDR2 (VH-CDR2)，其包含序列WX2 X3 PGX6 VYIQYX12 X13 KFX17 G，其中X2 係選自I及F，X3 係選自Y及N，X6 係選自N及D，X12 係選自N及S，X13 係選自E及Q，且X17 係選自K及Q (SEQ ID NO:7)； (c) 重鏈CDR3 (VH-CDR3)，其包含序列DGPX4 FAY，其中X4 係選自Y及W (SEQ ID NO:9)； (d) 輕鏈CDR1 (VL-CDR1)，其包含序列RSSX4 SLLHSX10 GX12 TYLX16 ，其中X4 係選自R及K，X10 係選自N及D，X12 係選自F及I，且X16 係選自Y及S (SEQ ID NO:10)； (e) 輕鏈CDR2 (VL-CDR2)，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) 輕鏈CDR3 (VL-CDR3)，其包含序列AQX3 LELPNT，其中X3 係選自S、G、Y及N (SEQ ID NO:12)。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有選自下組之序列之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (a) 分別為SEQ ID NO: 13-15、42、40及41； (b) 分別為SEQ ID NO: 13-15及39-41； (c) 分別為SEQ ID NO: 13、26、15及39-41；以及 (d) 分別為SEQ ID NO: 13、24、15、42、40及41。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段以3.0 nM或更小之KD 結合至人類EpCAM及獼猴EpCAM。
  5. 如申請專利範圍第4項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO:2的人類EpCAM之胞外域內之表位。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)。
  7. 如申請專利範圍第4項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSKSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:39)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)。
  8. 如申請專利範圍第3項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之VH及VL： (a) 具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (b) 具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:87之VL； (c) 具有序列SEQ ID NO:55之VH及具有序列SEQ ID NO:87之VL； (d) 具有序列SEQ ID NO:56之VH及具有序列SEQ ID NO:88之VL； (e) 具有序列SEQ ID NO:55之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL；以及 (f) 具有序列SEQ ID NO:56之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:54之VH及SEQ ID NO:89之VL。
  10. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:54之VH及SEQ ID NO:87之VL。
  11. 如申請專利範圍第8項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之重鏈及輕鏈 (a) 具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (b) 具有序列SEQ ID NO:103之HC及具有序列SEQ ID NO:138之LC； (c) 具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:139之LC； (d) 具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:139之LC； (e) 具有序列SEQ ID NO:105之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC；以及 (f) 具有序列SEQ ID NO:106之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
  12. 如申請專利範圍第11項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:103之HC及SEQ ID NO:140之LC。
  13. 如申請專利範圍第11項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:103之HC及SEQ ID NO:138之LC。
  14. 如申請專利範圍第1項或第2項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (a) 分別為SEQ ID NO:22、14、15、42、40及41； (b) 分別為SEQ ID NO:13、14、33、42、40及41； (c) 分別為SEQ ID NO:23、14、15、42、40及41；以及 (d) 分別為SEQ ID NO:25、14、15、42、40及41。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYHIH (SEQ ID NO:22)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGPWFAY (SEQ ID NO:15)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)。
  16. 如申請專利範圍第14項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含： (a) VH-CDR1，其包含序列NYYIH (SEQ ID NO:13)； (b) VH-CDR2，其包含序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:14)； (c) VH-CDR3，其包含序列DGYWFAY (SEQ ID NO:33)； (d) VL-CDR1，其包含序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:42)； (e) VL-CDR2，其包含序列QTSNLAS (SEQ ID NO:40)；及 (f) VL-CDR3，其包含序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:41)。
  17. 如申請專利範圍第14項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之VH及VL： (a) 具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (b) 具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL； (c) 具有序列SEQ ID NO:76之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL；以及 (d) 具有序列SEQ ID NO:84之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
  18. 如申請專利範圍第17項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:75之VH及SEQ ID NO:89之VL。
  19. 如申請專利範圍第17項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:77之VH及SEQ ID NO:89之VL。
  20. 如申請專利範圍第17項之EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含選自以下之重鏈及輕鏈 (a) 具有序列SEQ ID NO:125之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (b) 具有序列SEQ ID NO:127之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC； (c) 具有序列SEQ ID NO:126之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC；以及 (d) 具有序列SEQ ID NO:134之HC及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
  21. 如申請專利範圍第20項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:125之HC及SEQ ID NO:140之LC。
  22. 如申請專利範圍第20項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:127之HC及SEQ ID NO:140之LC。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段為鼠類抗體、非人哺乳動物抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
  24. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為全長抗體。
  25. 如申請專利範圍第24項之全長抗體，其中該抗體為人類IgG1。
  26. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之抗體或抗體片段，其中抗體片段為Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fd 、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv 、V-NAR域、IgNar、胞內抗體、IgGΔCH2 、微型抗體、F(ab')3 、四鏈抗體、三鏈抗體、雙鏈抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
  27. 一種包含如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之抗體或抗體片段的可活化抗體，其中該可活化抗體進一步包含 (a) 與該抗體或抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質多肽；及 (b) 與該抗體或抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合， 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)。
  28. 一種EpCAM可活化抗體，其包含： (a) EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自下組之成員之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (i) 分別為SEQ ID NO: 13-15、42、40及41； (ii) 分別為SEQ ID NO:13-15及39-41； (iii) 分別為SEQ ID NO:13、26、15及39-41；以及 (iv) 分別為SEQ ID NO:13、24、15、42、40及41； (b) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合；及 (c) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽； 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)。
  29. 如申請專利範圍第28項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
  30. 如申請專利範圍第29項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:54之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
  31. 如申請專利範圍第30項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:103之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之LC。
  32. 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分。
  33. 如申請專利範圍第32項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:155之遮蔽部分。
  34. 如申請專利範圍第29項至第33項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分。
  35. 一種EpCAM可活化抗體，其包含： (a) EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有選自由以下組成之群之序列的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3： (i) 分別為SEQ ID NO: 22、14、15、42、40及41； (ii) 分別為SEQ ID NO: 13、14、33、42、40及41； (iii) 分別為SEQ ID NO: 23、14、15、42、40及41；以及 (iv) 分別為SEQ ID NO: 25、14、15、42、40及41。 (b) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之遮蔽部分，其中當該可活化抗體呈未裂解狀態時，該遮蔽部分抑制該抗體或抗體片段與EpCAM之結合；及 (c) 與該EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段偶合之可裂解部分，其中該可裂解部分為充當蛋白酶之受質的多肽； 其中該可活化抗體呈該未裂解狀態時具有如下自N端至C端之結構排列：(遮蔽部分)-(可裂解部分)-(抗體或抗體片段)或(抗體或抗體片段)-(可裂解部分)-(遮蔽部分)。
  36. 如申請專利範圍第35項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:22、14、15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
  37. 如申請專利範圍第36項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:75之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
  38. 如申請專利範圍第37項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:125之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之輕鏈。
  39. 如申請專利範圍第36項至第38項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-157及162-167之胺基酸序列的遮蔽部分。
  40. 如申請專利範圍第39項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:162-167之胺基酸序列的遮蔽部分。
  41. 如申請專利範圍第36項至第40項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分。
  42. 如申請專利範圍第35項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13、14、33、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
  43. 如申請專利範圍第42項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:77之VH及具有序列SEQ ID NO:89之VL。
  44. 如申請專利範圍第43項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段，其包含具有序列SEQ ID NO:127之重鏈及具有序列SEQ ID NO:140之輕鏈。
  45. 如申請專利範圍第42項至第44項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:151-161之胺基酸序列的遮蔽部分。
  46. 如申請專利範圍第45項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含具有選自SEQ ID NO:158-161之胺基酸序列的遮蔽部分。
  47. 如申請專利範圍第42項至第46項中任一項之EpCAM可活化抗體，其中該可活化抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO:168或169之可裂解部分。
  48. 一種細胞，其產生如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之抗體或EpCAM-結合抗體片段或如申請專利範圍第27項至第47項中任一項之可活化抗體。
  49. 一種產生EpCAM抗體或EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體之方法，其包含： (a) 培養如申請專利範圍第48項之細胞；及 (b) 自該細胞或細胞培養物分離該EpCAM抗體、EpCAM-結合抗體片段、或EpCAM可活化抗體。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該細胞為真核細胞。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該細胞為CHO細胞。
  52. 一種診斷試劑，其包含如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之抗體或抗體片段或如申請專利範圍第27項至第47項中任一項之EpCAM可活化抗體。
  53. 如申請專利範圍第52項之診斷試劑，其中該抗體、抗體片段或可活化抗體經標記。
  54. 如申請專利範圍第53項之診斷試劑，其中該標記係選自：放射性標記、螢光團、發色團、顯像劑及金屬離子。
  55. 一種多核苷酸或多核苷酸集合，其編碼如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之抗體或抗體片段或如申請專利範圍第27項至第47項中任一項之可活化抗體。
  56. 一種載體或載體集合，其包含如申請專利範圍第55項之多核苷酸。
  57. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第55項之多核苷酸或多核苷酸集合或如申請專利範圍第56項之載體。
  58. 一種由下式表示之免疫偶聯物：
    Figure 03_image001
    其中： EpBA為根據申請專利範圍第1項至第47項中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image003
    ，或
    Figure 03_image005
    其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image007
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽； W’為NRe’ ， Re’ 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； R k 為-H或-Me； R x3 為(C 1 -C 6 )烷基； L'由下式表示： -NR 5 -P-C(=O)-(CR a R b ) m -C(=O)- (B1’)；或 -NR 5 -P-C(=O)-(CR a R b ) m -S-Z s1 - (B2’)； R 5 為-H或(C 1 -C 3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各自獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
    Figure 03_image009
    其中q為1至5之整數。
  59. 如申請專利範圍第58項之免疫偶聯物，其中Ra 及Rb 皆為H；且R5 為H或Me。
  60. 如申請專利範圍第58項或第59項之免疫偶聯物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  61. 如申請專利範圍第58項至第60項中任一項之免疫偶聯物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:215)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:216) 、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:217)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  62. 如申請專利範圍第61項之免疫偶聯物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  63. 如申請專利範圍第58項至第62項中任一項之免疫偶聯物，其中Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  64. 如申請專利範圍第58項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image011
    Figure 03_image013
    Figure 03_image015
    Figure 03_image017
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    其中 WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線
    Figure 03_image023
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  65. 如申請專利範圍第58項至第64項中任一項之免疫偶聯物，其中N與C之間的雙線
    Figure 03_image025
    表示雙鍵，X不存在且Y為-H。
  66. 如申請專利範圍第58項至第64項中任一項之免疫偶聯物，其中N與C之間的雙線
    Figure 03_image023
    表示單鍵，X為-H且Y為 -SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  67. 如申請專利範圍第66項之免疫偶聯物，其中Y為 -SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K。
  68. 如申請專利範圍第66項之免疫偶聯物，其中Y為-SO 3 Na。
  69. 一種由下式表示之免疫偶聯物： 其中：
    Figure 03_image027
    EpBA為根據申請專利範圍第1項至第47項中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL2 ；WL 為1至20之整數； CyL2 由下式表示：
    Figure 03_image029
    m’為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：
    Figure 03_image031
    其中q為1至5之整數。
  70. 如申請專利範圍第69項之免疫偶聯物，其中m’為1，且R1 及R2 皆為H。
  71. 如申請專利範圍第69項之免疫偶聯物，其中m’為2，且R1 及R2 皆為Me。
  72. 如申請專利範圍第69項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image033
    Figure 03_image035
    其中WL 為1至10之整數。
  73. 如申請專利範圍第69項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image037
    。
  74. 一種由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示之免疫偶聯物：
    Figure 03_image039
    其中： W L 為1至10之整數； EpBA為EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體，其包含分別具有序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
  75. 如申請專利範圍第74項之免疫偶聯物，其中該經分離之抗體或EpCAM-結合抗體片段包含分別具有序列SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:89之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。
  76. 如申請專利範圍第74項之免疫偶聯物，其中該經分離之抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:103及SEQ ID NO:140之重鏈及輕鏈。
  77. 如申請專利範圍第74項至第76項中任一項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分。
  78. 如申請專利範圍第77項之免疫偶聯物，其中該遮蔽部分具有胺基酸序列SEQ ID NO:155。
  79. 如申請專利範圍第77項或第78項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其進一步包含SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169之可裂解部分。
  80. 一種免疫偶聯物，其包含經由γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)或N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS或sGMBS)連接子與由以下結構式表示之美登素化合物DM21L(亦稱為LDL-DM)偶合之EpBA：
    Figure 03_image041
    ， 其中EpBA為根據申請專利範圍第1項至第47項中任一項之EpCAM抗體、EpCAM抗體片段或EpCAM可活化抗體。
  81. 如申請專利範圍第80項之免疫偶聯物，其中該GMBS及磺基-GMBS (或sGMBS)連接子由下式表示：
    Figure 03_image043
    。
  82. 如申請專利範圍第80項或第81項之免疫偶聯物，其由下式表示：
    Figure 03_image045
    ， 其中： EpBA經由Lys胺基連接至該美登素化合物，其中q為1或10之整數。
  83. 如申請專利範圍第80項至第82項中任一項之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別包含序列SEQ ID NO:13-15、42、40及41之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3。
  84. 如申請專利範圍第83項之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別具有序列SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:89之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。
  85. 如申請專利範圍第84項之免疫偶聯物，其中該EpBA包含分別具有序列SEQ ID NO:103及SEQ ID NO:140之重鏈及輕鏈。
  86. 如申請專利範圍第83項至第85項中任一項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其包含具有選自SEQ ID NO:151-157之胺基酸序列的遮蔽部分。
  87. 如申請專利範圍第86項之免疫偶聯物，其中該遮蔽部分具有胺基酸序列SEQ ID NO:155。
  88. 如申請專利範圍第86項或第87項之免疫偶聯物，其中該免疫偶聯物包含可活化抗體，其進一步包含SEQ ID NO:168或SEQ ID NO:169之可裂解部分。
  89. 如申請專利範圍第58項至第88項中任一項之免疫偶聯物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
  90. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之抗體、抗原結合片段或可活化抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  91. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第58項至第88項中任一項之免疫偶聯物及醫藥學上可接受之載劑。
  92. 一種殺滅癌細胞之方法，其包含使該癌細胞與有效量的如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之抗體、抗原結合片段或可活化抗體、如申請專利範圍第58項至第88項中任一項之免疫偶聯物、或如申請專利範圍第90項或第91項之醫藥組成物接觸。
  93. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該癌細胞為上皮癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結直腸癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞或癌症幹細胞。
  94. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該癌細胞為卵巢癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、胰腺癌細胞或結直腸癌細胞。
  95. 一種治療表現EpCAM之癌症的方法，該方法包含向有需要之受試者投與治療有效量的如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之抗體或抗原結合片段、如申請專利範圍第58項至第88項中任一項之免疫偶聯物、或如申請專利範圍第90項或第91項之醫藥組成物。
  96. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為上皮癌。
  97. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為乳癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、小腸癌或其轉移。
  98. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為卵巢癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌或其轉移。
  99. 如申請專利範圍第97項之治療方法，其中該癌症為肺癌。
  100. 如申請專利範圍第99項之治療方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌。
  101. 如申請專利範圍第100項之治療方法，其中該非小細胞肺癌為非鱗狀非小細胞肺癌。
  102. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為卵巢癌。
  103. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為三陰性乳癌。
  104. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為結直腸癌。
  105. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為食道癌。
  106. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為胃癌。
  107. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為子宮癌。
  108. 如申請專利範圍第95項之治療方法，其中該癌症為胰腺癌。
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