ES2912266T3 - Inmunoconjugados dirigidos a ADAM9 y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que se une específicamente a ADAM9 humano y ADAM9 cyno: (I) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo está conjugado con un agente farmacológico; y (II) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable de cadena pesada (VH), donde dicho dominio variable de cadena pesada comprende un dominio CDRH1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3, y dicho dominio variable de cadena ligera comprende un dominio CDRL1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3, donde: (A) dicho dominio CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:34; y (B) dicho dominio CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:36; y (C) dicho dominio CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:46; y donde: (A) dicho dominio CDRL1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; y (B) dicho dominio CDRL2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y (C) dicho dominio CDRL3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:65.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoconjugados dirigidos a ADAM9 y procedimientos de uso de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse específicamente a la "proteína 9 que contiene el dominio de desintegrina y metaloproteinasa" ("ADAM9") conjugado con al menos un agente farmacológico. La invención se refiere particularmente a tales inmunoconjugados que reaccionan de forma cruzada con el ADAM9 humano y el ADAM9 de un primate no humano (tal como un mono cynomolgus). La invención se refiere además a todos los inmunoconjugados que comprenden un dominio variable de cadena ligera (VL) y/o un dominio variable de cadena pesada (VH) que ha sido humanizado y opcionalmente desinmunizado para exhibir una inmunogenicidad reducida tras la administración de tales inmunoconjugados a un sujeto receptor. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen cualquiera de tales inmunoconjugados, y a inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 (tal como cáncer).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
ADAM es una familia de proteínas involucradas en diversos procedimientos fisiológicos y patológicos (Amendola, R.S. y col. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2" ("El dominio de la desintegrina de ADAM9 activa los neutrófilos humanos a través de un circuito autocrino que involucra integrinas y CXCR2"), J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Edwards, D.R. y col. (2008) "The ADAM Metalloproteases" ("Las metaloproteasas ADAM"), Molec. Aspects Med. 29:258-289). Se han identificado al menos 40 genes miembros de la familia, y se cree que al menos 21 de dichos miembros son funcionales en seres humanos (Li, J. y col. (2016) "Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion" ("La sobreexpresión de ADAM9 promueve la invasión de células de cáncer de colon"), J. invest. Surg 26(3):127-133; Duffy, M.J. y col. (2011) "The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?" ("La familia de proteasas ADAM: ¿nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas para el cáncer?"), Clin. Proteomics 8:9:1-13; véase también la publicación de patente de los EE.UU. n.° 2013/0045244).
Los miembros de la familia ADAM tienen una estructura bien conservada con 8 dominios, entre los que se encuentran un dominio de metaloproteasa y un dominio de unión a integrina (desintegrina) (Duffy, M.J. y col. (2009) "The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology" ("El papel de las ADAM en la fisiopatología de la enfermedad"), Clin. Chim. Acta 403:31-36). El dominio de la metaloproteasa ADAM actúa como una sheddasa y se ha informado que modula una serie de procedimientos biológicos al escindir las proteínas transmembrana, que a continuación pueden actuar como ligandos solubles y regular la señalización celular (Amendola, R.S. y col. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2" ("El dominio de la desintegrina de ADAM9 activa los neutrófilos humanos a través de un circuito autocrino que involucra integrinas y CXCR2"), J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Ito, N. y col. (2004) "ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase" ("Las ADAM, una desintegrina y metaloproteinasas, median en el desprendimiento de oxitocinasa"), Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008-1013).
ADAM9 es un miembro de la familia de moléculas ADAM. Se sintetiza como una forma inactiva que se escinde proteolíticamente para generar una enzima activa. El procesamiento en el sitio aguas arriba es particularmente importante para la activación de la proenzima. ADAM9 se expresa en fibroblastos (Zigrino, P. y col. (2011) "The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts" ("Los dominios tipo desintegrina y ricos en cisteína de ADAM-9 median en las interacciones entre las células de melanoma y los fibroblastos"), J. Biol. Chem. 286:6801-6807), células musculares lisas vasculares activadas (Sun, C. y col. (2010) "ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling" ("ADAM15 regula la permeabilidad endotelial y la migración de neutrófilos a través de la señalización Src/ERK1/2"), Cardiovasc. Res. 87:348-355), monocitos (Namba, K. y col. (2001) "Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes" ("Implicación de ADAM9 en la formación de células gigantes multinucleadas de monocitos sanguíneos"), Cell. Inmunol. 213:104-113), macrófagos activados (Oksala, N. y col. (2009) "ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries - Tampere Vascular Study" ("ADAM-9, ADAM-15 y ADAM-17 están regulados al alza en macrófagos en placas ateroscleróticas humanas avanzadas en aorta y arterias carótidas y femorales: estudio vascular de Tampere"), Ann. Med. 41:279-290).
La actividad de la metaloproteasa de ADAM9 participa en la degradación de los componentes de la matriz, para permitir así la migración de las células tumorales (Amendola, R.S. y col. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2" ("El dominio de la desintegrina de ADAM9 activa los neutrófilos humanos a través de un circuito autocrino que involucra integrinas y CXCR2"), J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962). Su dominio de desintegrina, que es altamente homólogo a muchas desintegrinas de veneno de serpiente, permite la interacción entre ADAM9 y las integrinas, y permite que ADAM9 module, positiva o negativamente, los eventos de adhesión celular (Zigrino, P. y col. (2011) "The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts" ("Los dominios tipo desintegrina y ricos en cisteína de ADAM-9 median en las interacciones entre las células de melanoma y los fibroblastos"), J. Biol. Chem. 286:6801-6807; Karadag, A. y col. (2006) "ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin" ("ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), un miembro de la familia de desintegrinas y metaloproteinasas A, regula la producción de interleucina-6 inducida por células de mieloma en osteoblastos mediante interacción directa con la integrina Alpha(v)Beta5"), Blood 107:3271-3278; Cominetti, M.R. y col. (2009) "Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions» ("Inhibición de la adhesión de plaquetas y células tumorales por el dominio de desintegrina de ADAM9 humano al colágeno I en condiciones de flujo dinámico"), Biochimie, 91:1045-1052). Se ha demostrado que el dominio de desintegrina de ADAM9 interactúa con las integrinas a6p1, a6p4, avp5 y a9p1.
Se ha descubierto que la expresión de ADAM9 es relevante para la enfermedad, especialmente el cáncer. Se ha descubierto que ADAM9 escinde y libera varias moléculas con funciones importantes en la tumorigénesis y la angiogénesis, tales como TEK, KDR, EPHB4, CD40, VCAM1 y CDH5. ADAM9 es expresado por muchos tipos de células tumorales, incluyendo células tumorales de cánceres de mama, cánceres de colon, cánceres gástricos, gliomas, cánceres de hígado, cánceres de pulmón de células no pequeñas, melanomas, mielomas, cánceres de páncreas y cánceres de próstata (Yoshimasu, T y col. (2004) "Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis" ("La sobreexpresión de ADAM9 en cáncer de pulmón de células no pequeñas se correlaciona con metástasis cerebral"), Cancer Res. 64:4190-4196; Peduto, L. y col. (2005) "Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer" ("Función crítica para ADAM9 en cáncer de próstata de ratón"), Cancer Res. 65:9312-9319; Zigrino, P. y col. (2005) "ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines" ("Expresión y regulación de ADAM-9 en líneas celulares de melanoma y melanoma de piel humana"), int. J. Cancer 116:853-859; Fritzsche, F.R. y col. (2008) "ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression" ("ADAM9 está altamente expresado en el cáncer de células renales y está asociado con la progresión del tumor"), BMC Cancer 8:179:1-9; Fry, J.L. y col. (2010) "Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration" ("Las isoformas secretadas y unidas a la membrana de la proteasa ADAM9 tienen efectos opuestos sobre la migración de células de cáncer de mama"), Cancer Res. 70, 8187-8198; Chang, L. y col. (2016) "Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer" ("Rnai combinado dirigido a Stat3 humano y ADAM9 como terapia génica para el cáncer de pulmón de células no pequeñas"), Oncology Letters 11:1242-1250; Fan, X. y col. (2016) "ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas" ("La expresión de ADAM9 está asociada con el grado del tumor del glioma y el tipo histológico, y actúa como un factor pronóstico en los gliomas de bajo grado"), Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11).
De manera significativa, se ha descubierto que el aumento de la expresión de ADAM9 se correlaciona positivamente con la malignidad del tumor y el potencial metastásico (Amendola, R.S. y col. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Involvings And CXCR2" ("El dominio de la desintegrina de ADAM9 activa los neutrófilos humanos a través de un circuito autocrino que involucra integrinas y CXCR2"), J. Leukocyte Biol 97(5):951-962; Fan, X. y col. (2016) "ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas" ("La expresión de ADAM9 está asociada con el grado del tumor del glioma y el tipo histológico, y actúa como un factor pronóstico en los gliomas de bajo grado"), Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11; Li, J. y col. (2016) "Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion" ("La sobreexpresión de ADAM9 promueve la invasión de células de cáncer de colon"), J. Invest. Surg.
26(3):127-133). Además, ADAM9 y su isoforma soluble secretada parecen ser cruciales para que las células cancerosas se diseminen (Amendola, R.S. y col. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving And CXCR2" ("El dominio de la desintegrina de ADAM9 activa los neutrófilos humanos a través de un circuito autocrino que involucra integrinas y CXCR2"), J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Fry, J.L. y col. (2010) "Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration" ("Las isoformas secretadas y unidas a la membrana de la proteasa ADAM9 tienen efectos opuestos sobre la migración de células de cáncer de mama"), Cancer Res. 70, 8187-8198; Mazzocca, A. (2005) "A Secreted Form OfADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions" ("Una forma secretada de ADAM9 promueve la invasión del carcinoma a través de las interacciones tumor-estroma"), Cancer Res. 65:4728-4738; véase también las patentes de los EE.UU. n.° 9 150 656; 7 585 634; 7829 277; 8 101 361; y 8445 198 y la publicación de patente de los EE.UU. n.° 2009/0023149).
Por lo tanto, varios estudios han identificado a ADAM9 como una diana potencial para la terapia contra el cáncer (Peduto, L. (2009) "ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer" ("ADAM9 como posible molécula diana en el cáncer"), Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287; Duffy, M.J. y col. (2009) "Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression" ("Papel de ADAM en la formación y progresión del cáncer") Clin. Cancer Res. 15:1140-1144; Duffy, M.J. y col. (2011) "The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?" ("La familia de proteasas ADAM: ¿nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas para el cáncer?"), Clin. Proteomics 8:9:1-13; Josson, S. y col. (2011) "Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy" ("La inhibición de la expresión de ADAM9 induce alteraciones fenotípicas epiteliales y sensibiliza las células de cáncer de próstata humano a la radiación y la quimioterapia"), Prostate 71(3):232-240; véase también las publicaciones de patente de los EE.UU. n.° 2016/0138113, 2016/0068909, 2016/0024582, 2015/0368352, 2015/0337356, 2015/0337048, 2015/0010575, 2014/0342946, 2012/0077694, 2011/0151536, 2011/0129450, 2010/0291063, 2010/0233079, 2010/0112713, 2009/0203051, 2004 /0092466, 2003/0091568y 2002/0068062y , y las publicaciones del PCT n.°WO 2016/077505 ,WO 2014/205293 , WO 2014/186364, WO 2014/124326, WO 2014/108480,WO 2013/119960, WO 2013/098797 , WO2013/049704 y WO 2011/100362). El documento US2009/0285840A1 describe composiciones y procedimientos que inhiben la expresión de los productos del gen Adam9, tal como el ARNm de ADAM9 y/o polipéptidos ADAM9, como estrategia terapéutica para el tratamiento de la neovascularización patológica y afecciones asociadas con la angiogénesis. El documento DE10337368A1 describe el diagnóstico de cáncer de páncreas mediante la detección de la expresión de la proteína ADAM9 usando anticuerpos específicos y también el uso terapéutico de estos anticuerpos y de ácidos nucleicos específicos de ADAM9. Además, también se ha descubierto que la expresión de ADAM9 es relevante para la enfermedad pulmonar y la inflamación (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de los EE.Uu . n.° 2016/0068909; 2012/0149595; 2009/0233300; 2006/0270618; y 2009/0142301). Los anticuerpos que se unen a ADAM9 están disponibles en el mercado de Abcam, Thermofisher, Sigma-Aldrich y otras compañías.
Sin embargo, a pesar de todos los avances anteriores, sigue existiendo la necesidad de inmunoconjugados dirigidos a ADAM9 de alta afinidad que exhiban una unión mínima a tejidos normales y que sean capaces de unirse a ADAM9 humano y no humano con una afinidad alta similar. La presente invención aborda esta necesidad y la necesidad de tratamientos mejorados para el cáncer.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Según un aspecto de la invención, se proporcionan inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse específicamente a la "proteína 9 que contiene el dominio de desintegrina y metaloproteinasa" ("ADAM9") conjugado con al menos un agente farmacológico como se define en la reivindicación 1. Los inmunoconjugados tienen reactividad cruzada con el ADAM9 humano y el ADAM9 de un primate no humano (un mono cynomolgus). Los inmunoconjugados comprenden un dominio variable de cadena ligera (VL) y/o un dominio variable de cadena pesada (VH) que han sido humanizados (y opcionalmente desinmunizados) para exhibir una inmunogenicidad reducida tras la administración de tales inmunoconjugados a un sujeto receptor. Según aspectos adicionales de la invención, se proporcionan una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 15, y un inmunoconjugado o composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 (tal como cáncer) como se define en las reivindicaciones 16 y 17.
En detalle, la presente invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que se une específicamente a ADAM9 humano y ADAM9 cyno:
(I) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo está conjugado con un agente farmacológico; y
(II) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable de cadena pesada (VH), donde dicho dominio variable de cadena pesada comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3, y dicho dominio variable de cadena ligera comprende un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3, donde:
(A) dicho dominio CDRh1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:34; y
(B) dicho dominio CDRh2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:36; y
(C) dicho dominio CDRh3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:46; y
donde:
(A) dicho dominio CDRl1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; y
(B) dicho dominio CDRl2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y
(C) dicho dominio CDRl3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:65.
En determinadas realizaciones, el dominio variable de cadena pesada (VH) de la variante optimizada de MAB-A se selecciona de entre el grupo que consiste en:
(5) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20);
(6) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21);
(7) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22);
(8) hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23);
(9) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24);
(10) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25);
(11) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26);
(12) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27);
(13) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28) y
(14) hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29).
En determinadas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera (VL) de la variante optimizada de MAB-A se selecciona de entre el grupo que consiste en:
(1) hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54);
(2) hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55);
(3) hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56);
(4) hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57).
En determinadas realizaciones, el dominio CDRh1 comprende la secuencia de aminoácidos SYWMH (SEQ ID NO:8)), el dominio CDRh2 comprende la secuencia de aminoácidos EIIPI FGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35)) y el dominio CDRh3 comprende la secuencia de aminoácidos GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45)
En determinadas realizaciones, el dominio CDRl1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62)), el dominio CDRl2 comprende la secuencia de aminoácidos AASDLES (SEQ ID NO:13)) y el dominio CDRl3 comprende la secuencia de aminoácidos QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14).
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado comprende:
(A) el dominio variable de cadena pesada (VH) de hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28); o
(b ) el dominio variable de cadena ligera (VL) de hMAB-A (2I.2) (SeQ ID NO:55); o
(C) el dominio variable de cadena pesada (VH) de hMAB-A (2I.2) (SEQ IDNO:28) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de hMAB-A (2I.2) (SEQ IDNO:55)
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado comprende una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc variante que comprende: (a) una o más modificaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de la región Fc variante por un FcyR; y/o (b) una o más modificaciones de aminoácidos que introducen un residuo de cisteína. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de la región Fc variante por un FcyR comprenden: (A) L234A; (B) L235A; o (C) L234A y L235A; donde dicha numeración es la del índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos que introducen un residuo de cisteína comprende S442C, donde dicha numeración es la del índice EU como en Kabat.
El inmunoconjugado de la presente invención comprende un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que se une específicamente a ADAM9 humano y ADAM9 cyno, donde el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo se conjuga con el agente farmacológico.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo está optimizado para tener al menos una mejora de 100 veces en la afinidad de unión a ADAM9 cyno y conserva una alta afinidad de unión a ADAM9 humano en comparación con el anticuerpo parental quimérico o murino.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3, y un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3 que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) las SEQ ID NO:8, 35 y 37 y las SEQ ID NO:62, 13, 14, respectivamente;
(b) las SEQ ID NO: 8, 35 y 38 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(c) las SEQ ID NO: 8, 35 y 39 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(d) las SEQ ID NO: 8, 35 y 40 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(e) las SEQ ID NO: 8, 35 y 41 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(f) las SEQ ID NO: 8, 35 y 42 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(g) las SEQ ID NO: 8, 35 y 43 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(h) las SEQ ID NO: 8, 35 y 44 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(i) las SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14 respectivamente; y
(j) las SEQ ID NO: 8, 35 y 46 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen secuencias que son al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % idénticas a las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(b) la SEQ ID NO:21 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(c) la SEQ ID NO:22 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(d) la SEQ ID NO:23 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(e) la SEQ ID NO:24 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(f) la SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(g) la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(h) la SEQ ID NO:27 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(i) la SEQ ID NO:28 y la SEQ ID NO:55, respectivamente; y
(j) la SEQ ID NO:29 y la SEQ ID NO:55, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) la SEQ ID NO:20 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(b) la SEQ ID NO:21 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(c) la SEQ ID NO:22 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(d) la SEQ ID NO:23 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(e) la SEQ ID NO:24 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(f) la SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(g) la SEQ ID NO:26 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(h) la SEQ ID NO:27 y la SEQ ID NO:55, respectivamente;
(i) la SEQ ID NO:28 y la SEQ ID NO:55, respectivamente; y
(j) la SEQ ID NO:29 y la SEQ ID NO:55, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado es un anticuerpo de longitud completa que comprende una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc es una región Fc variante que comprende: (a) una o más modificaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de la región Fc variante por un FcyR seleccionado de entre el grupo que consiste en: L234A, L235Ay L234Ay L235A; y/o (b) una modificación de aminoácido que introduce un residuo de cisteína en S442, donde dicha numeración es la del índice EU como en Kabat.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:68, respectivamente; y
(b) la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO:68, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) la SEQ ID NO:141 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(b) la SEQ ID NO:142 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(c) la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(d) la SEQ ID NO:151 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(e) la SEQ ID NO:152 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(f) la SEQ ID NO:153 y la SEQ ID NO:68, respectivamente; y
(g) la SEQ ID NO:154 y la SEQ ID NO:68, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000006_0001
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención que está unido covalentemente a CyL1 a través de un residuo de lisina;
WL es un número entero entre 1 y 20; y
CyL1 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000007_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble ~ entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(C1-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(C1-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
- Ra-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)-(B1'); o
- NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1-(B2');
R5 es -H o un alquilo(Ci-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son cada uno independientemente -H, alquilo(C1-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
m es un número entero entre 1 y 6; y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000008_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000008_0002
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención que está unido covalentemente a CyL2 a través de un residuo de lisina;
Wl es un número entero entre 1 y 20; y
CyL2 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000008_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H;
Rx1 y Rx2 son independientemente alquilo(C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000009_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000009_0002
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención que está unido covalentemente a CyL3 a través de un residuo de lisina;
Wl es un número entero entre 1 y 20;
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000009_0003
m' es 1 o 2;
R1 y R2, son cada uno independientemente H o un alquilo(C1-C3); y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000010_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención comprende un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo unido al maitansinoide DM4 a través de N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB), donde un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3 y un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3 que tienen las secuencias de SEQ iD NO:8, 35 y 45 y SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ iD NO: 151 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, X en la SEQ ID NO:52 o la SEQ ID NO:151 es lisina. En algunas realizaciones, Xen la SEQ ID NO:52 o la SEQ ID NO:151 está ausente.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000010_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
WL es un número entero entre 1 y 10;
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio CDRH1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3 y un dominio CDRL1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO:8, 35 y 45 y SEQ ID NO:62, 13, 14, respectivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, Xen la SEQ ID NO:52 o la SEQ ID NO:151 es lisina. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, X en la SEQ ID NO:52 o la SEQ ID NO:151 está ausente. En algunas realizaciones, el valor de DAR para una composición (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprende el inmunoconjugado está en el intervalo de 1,0 a 5,0, de 1,0 a 4,0, de 1,0 a 3,4, de 1,0 a 3,0, de 1,5 a 2,5, de 2,0 a 2,5 o de 1,8 a 2.2. En algunas realizaciones, el DAR es inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,5, inferior a 3,0 o inferior a 2,5.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA 4 — Cyc1)
' / WC
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención unido covalentemente a CyC1 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000011_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son independientemente -H, alquilo(Ci-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(C1-C6); y,
LC se representa mediante
Figure imgf000012_0001
, s i es el sitio unido covalentemente a CBA y s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -C(=O)- en CyC1; donde: R19 y R20, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
m" es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo(C1-C3).
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000012_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma,
donde la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio CDRH1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3 y un dominio CDRL1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, X en la s Eq ID NO:142 es lisina. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO:152 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, X en la SEQ ID NO:142 o la SEQ ID NO:152 es lisina. En algunas realizaciones, X en la SEQ ID NO:142 o la SEQ ID NO:152 está ausente.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA-f— Cyc2)
' 'W C
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención unido covalentemente a CyC2 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000013_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(C1-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
Rx1 es un alquilo(C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W' es -NRe’;
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo(C1-C6);
LC' se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000014_0001
donde:
s i es el sitio unido covalentemente al CBAy s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -S- en CyC2;
Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, Rio, R11, Ri2, R13, Ri9, R20, R2i y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(Ci-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
C BA-í— Cyc3)
' / wc
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en esta invención unido covalentemente a CyC3 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC3 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000014_0002
donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2, son cada uno independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
LC' se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000015_0001
donde:
s i es el sitio unido covalentemente al CBAy s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -S- en CyC3;
Z es C(=O)-NR9- o -NRa-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, Rio, R11, Ri 2, Ri 3, Ri9, R2o, R2i y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(Ci-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000015_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
DM es un resto farmacológico representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000015_0003
Wc es 1 o 2 ;
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3 y un dominio CDRl1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, Xen la SEQ ID NO:142 o la SEQ ID NO: 152 es lisina. En algunas realizaciones, Xen la SEQ ID NO:142 o la SEQ ID NO: 152 está ausente. En algunas realizaciones, Wc es 2.
En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000016_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
DM es un resto farmacológico representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000016_0002
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio CDRH1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3 y un dominio CDRL1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO:68, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO:68, respectivamente; y
Wc es 1 o 2. En algunas realizaciones, Wc es 2.
Otro aspecto de la presente invención se establece en la reivindicación 15 y proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del inmunoconjugado como se describe en esta invención y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención se establece en la reivindicación 16 y proporciona el inmunoconjugado o la composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva del inmunoconjugado o de la composición farmacéutica.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer mieloide, melanoma y cáncer linfoide. En determinadas realizaciones, el cáncer de pulmón de células no pequeñas es carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma o carcinoma indiferenciado de células grandes. En determinadas realizaciones, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, linfoma colorrectal primario, leiomiosarcoma o carcinoma de células escamosas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En los siguientes ejemplos, los inmunoconjugados que comprenden chMAB-A o hMAB-A(2.2) se muestran únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención reivindicada.
Las FIG. 1A-1C presentan los resultados de estudios de inmunohistoquímica (IHC) y muestran la capacidad de MAB-A para marcar específicamente una diversidad de tipos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (FIG. 1A), células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer gástrico (FIG. 1B) y células de cáncer de colon (FIG. 1C), mientras que el control de isotipo no marcó específicamente ninguno de estos tipos de células cancerosas (FIG. 1A-1C).
La FIG. 2 presenta los resultados de estudios de tinción celular y muestran que MAB-A se une a ADAM9 humano y, en menor medida, a ADAM9 de mono cynomolgus, expresado transitoriamente en la superficie de células 293-FT y CHO-K (paneles superior e inferior respectivamente).
Las FIG. 3A-3B representan las secuencias de aminoácidos del dominio murino anti-ADAM9-VH alineado con varias variantes humanizadas/optimizadas de MAB-A (FIG. 3A, SEQ ID NO:7, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 y 28) y el dominio murino anti-ADAM9-VL alineado con varias variantes humanizadas/optimizadas de MAB-A (FIG. 3B, SEQ ID NO:11, 51, 52, 53 y 54). Las posiciones sustituidas dentro de las CDR durante la optimización inicial se subrayan de la siguiente manera: los sitios potenciales de desamidación e isomeración se indican con subrayado simple, los residuos de lisina se indican con doble subrayado, los residuos lábiles adicionales se indican con un doble subrayado discontinuo.Las FIG. 4A-4B presentan las curvas de unión ELISA de los diez clones de hMAB-A optimizados seleccionados que comprenden variantes de CDRh3, el hMAB-A parental (2.2) y un anticuerpo de control de isotipo. La FIG. 4A presenta las curvas de unión para cynoADAM9 y la FIG. 4B presenta las curvas de unión para huADAM9.
Las FIG. 5A-5B presentan las curvas de unión ELISA de las variantes Fc. La FIG. 5A presenta las curvas de unión para cynoADAM9 y la FIG. 5B presenta las curvas de unión para huADAM9.
Las FIG. 6A-6B muestran la tinción de membrana ADAM9 IHC en una micromatriz de tejido de 20 carcinomas y la tinción citoplásmica y de membrana ADAM IHC en ocho indicaciones seleccionadas, respectivamente.
Las FIG. 7A-7B muestran la internalización de pulsos y la internalización continua de diversos conjugados de anticuerpos anti-ADAM9.
Las FIG. 8A-8D muestran las curvas de unión de FACS de los anticuerpos chMAB-A, hMAB-A(2.2), hMAB-A(2C.2) y hMAB-A(2I.2) y sus inmunoconjugados correspondientes.
Las FIG. 9A-9H muestran la citotoxicidad in vitro de diversos inmunoconjugados anti-ADAM9 (hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, hMAB-A(2.2)-DGN549 y hMAB- A(2I.2)-S442C-DGN549) en un amplio panel de líneas de células tumorales positivas para ADAM9. Los conjugados basados en IgG1 no dirigidos se incluyen como controles negativos.
La FIG.10 muestra la actividad antitumoral de hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, por anticuerpo) y chMAB-A-DGN549 (10 pg/kg, por carga útil) en el modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas humano Calu-3.
La FIG. 11 muestra la actividad antitumoral de hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 3 pg/kg y 10 pg/kg, por carga útil) en el modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas humano Calu-3.
La FIG. 12 muestra la actividad antitumoral de hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, por anticuerpo) en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de células escamosas de pulmón de células no pequeñas H1703.
La FIG. 13 muestra la actividad antitumoral de chMAB-A-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg) en el modelo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello Detroit562 (volumen tumoral de 95,76 a 450,83 mm3).
La FIG. 14 muestra la actividad antitumoral de chMAB-A-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg y 5 mg/kg) en el modelo de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello Detroi562 (volumen tumoral de 277,51 a 503,49 mm3).
La FIG. 15 muestra la actividad antitumoral de huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en el modelo de xenoinjerto de carcinoma gástrico SNU-5.
La FIG. 16 muestra la actividad antitumoral de huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en el modelo de xenoinjerto de carcinoma gástrico SNU-5.
La FIG. 17 muestra la actividad antitumoral de huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en el modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal SW48.
La FIG. 18 muestra la actividad antitumoral de huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en el modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal SW48.
La FIG. 19A muestra la unión de huFcRn 250 nM y 1000 nM a anticuerpos anti-ADAM9 capturados con y sin la mutación YTE a pH 6,0.
La FIG. 19B muestra la unión de anticuerpos anti-ADAM9 25 nM y 100 nM con y sin la mutación YTE a FcRn inmovilizado a pH 6,0.
La FIG. 20 muestra los datos FC del conjugado anticuerpo-fármaco para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 y hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 en monos cynomolgus a 4mg/kg y a 12 mg/kg (dosis de anticuerpo).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse específicamente a la "proteína 9 que contiene el dominio de desintegrina y metaloproteinasa" ("ADAM9") conjugado con al menos un agente farmacológico como se define en la reivindicación 1. Los inmunoconjugados tienen reactividad cruzada con el ADAM9 humano y el ADAM9 de un primate no humano (un mono cynomolgus). Los inmunoconjugados comprenden un dominio variable de cadena ligera (VL) y/o un dominio variable de cadena pesada (VH) que han sido humanizados (y opcionalmente desinmunizados) para exhibir una inmunogenicidad reducida tras la administración de tales inmunoconjugados a un sujeto receptor. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas como se define en la reivindicación 15 que contienen cualquiera de tales inmunoconjugados, y a inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 (tal como cáncer) como se define en las reivindicaciones 16 y 17.
I. Anticuerpos y sus dominios de unión
Los inmunoconjugados de la presente invención comprenden un anticuerpo que se une a ADAM9 o a un fragmento de unión a ADAM9 del mismo. Los "anticuerpos" son moléculas de inmunoglobulina capaces de unirse de forma específica a una diana, tal como un carbohidrato, un polinucleótido, un lípido, un polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en el dominio variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en esta invención, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales, anticuerpos camélidos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, el término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al epítopo. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. Las últimas décadas han visto un resurgimiento del interés en el potencial terapéutico de los anticuerpos, y los anticuerpos se han convertido en una de las principales clases de fármacos derivados de la biotecnología (Chan, C.E. y col. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases" ("El uso de anticuerpos en el tratamiento de enfermedades infecciosas"), Singapore Med. J. 50(7):663-666). Además de su uso en diagnósticos, se ha demostrado que los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos. Más de 200 fármacos basados en anticuerpos han sido aprobados para su uso o están en desarrollo.
Los anticuerpos son capaces de "unirse inmunoespecíficamente" a un polipéptido o proteína o a una molécula no proteica debido a la presencia en dicha molécula de un dominio o resto o conformación particular (un "epítopo"). Una molécula que contiene un epítopo puede tener actividad inmunogénica, de modo que provoque una respuesta de producción de anticuerpos en un animal; tales moléculas se denominan "antígenos". Como se usa en esta invención, se dice que un anticuerpo se une " inmunoespecíficamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con ese epítopo en relación con epítopos alternativos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo viral es un anticuerpo que se une a ese epítopo viral con mayor afinidad, avidez, mayor facilidad y/o mayor duración de lo que se une inmunoespecíficamente a otros epítopos virales o a epítopos no virales. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une inmunoespecíficamente a una primera diana puede o no unirse específica o preferiblemente a una segunda diana. Como tal, la "unión inmunoespecífica" a un epítopo particular no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la unión exclusiva a ese epítopo. En general, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión "inmunoespecífica". Se dice que dos moléculas son capaces de unirse entre sí de una manera "fisioespecífica", si dicha unión exhibe la especificidad con la que los receptores se unen a sus respectivos ligandos.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogéneos donde el anticuerpo monoclonal se compone de aminoácidos (naturales o no naturales) que están involucrados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único epítopo (o sitio antigénico). El término "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2 Fv), monocatenarios (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un antígeno. No se pretende que el término se limite con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se produce (por ejemplo, por hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo". Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica. Un procedimiento que puede emplearse es el procedimiento de Kohler, G. y col. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity" ("Cultivos continuos de células fusionadas que secretan anticuerpos de especificidad predefinida"), Nature 256:495-497, o una modificación del mismo. Típicamente, los anticuerpos monoclonales se desarrollan en ratones, ratas o conejos. Los anticuerpos se producen inmunizando a un animal con una cantidad inmunogénica de células, extractos de células o preparaciones de proteínas que contienen el epítopo deseado. El inmunógeno puede ser, pero no se limita a, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o tejidos. Las células utilizadas para la inmunización pueden cultivarse durante un período de tiempo (por ejemplo, al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células pueden usarse como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, tal como Ribi (véase, por ejemplo, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production" ("Revisión de adyuvantes seleccionados utilizados en la producción de anticuerpos"), ILAR J. 37(3):119-125). En general, las células deben mantenerse intactas y preferiblemente viables cuando se usan como inmunógenos. Las células intactas pueden permitir que el animal inmunizado detecte mejor los antígenos que las células rotas. El uso de adyuvantes desnaturalizantes o duros, por ejemplo, el adyuvante de Freund, puede romper las células y, por lo tanto, se desaconseja. El inmunógeno se puede administrar varias veces a intervalos periódicos, como cada dos semanas o cada semana, o se puede administrar de forma que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo, en un tejido recombinante). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales existentes y cualquier otro anticuerpo equivalente que sea inmunoespecífico para un epítopo patógeno deseado se pueden secuenciar y producir de forma recombinante por cualquier medio conocido en la técnica. En una realización, dicho anticuerpo se secuencia y la secuencia de polinucleótidos a continuación se clona en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés se puede mantener en un vector en una célula huésped y la célula huésped a continuación se puede expandir y congelar para uso futuro. La secuencia de polinucleótidos de tales anticuerpos puede usarse para la manipulación genética para generar un anticuerpo quimérico optimizado por afinidad, un anticuerpo humanizado y/o un anticuerpo caninizado, para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo, así como los inmunoconjugados de la invención. El principio general en la humanización de un anticuerpo implica retener la secuencia básica de la porción de unión al antígeno del anticuerpo, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanos.
Los anticuerpos naturales (tales como los anticuerpos IgG naturales) están compuestos por dos "cadenas ligeras" en complejo con dos "cadenas pesadas". Cada cadena ligera contiene un dominio variable ("VL") y un dominio constante ("CL"). Cada cadena pesada contiene un dominio variable ("VH"), tres dominios constantes ("CH1", "CH2" y "CH3") y una región "bisagra" ("H") ubicada entre los dominios CH1 y CH2. Por el contrario, los scFv son moléculas de cadena sencilla creadas al unir dominios variables de cadena ligera y pesada a través de un péptido de enlace corto.
La unidad estructural básica de las inmunoglobulinas naturales (por ejemplo, IgG) es, por lo tanto, un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, normalmente expresado como una glicoproteína de aproximadamente 150.000 Da. La porción amino-terminal ("N-terminal") de cada cadena incluye un dominio variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal ("C-terminal") de cada cadena define una región constante, con cadenas ligeras que tienen un solo dominio constante y cadenas pesadas que generalmente tienen tres dominios constantes y una región bisagra. Así, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-VL-CL-c y la estructura de las cadenas pesadas de IgG es n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (donde n y c representan, respectivamente, el extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido).
A. Características de los dom inios variables de anticuerpos
Los dominios variables de una molécula de IgG consisten en 1, 2 y más comúnmente 3 regiones determinantes de complementariedad ("CDR", es decir, CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente), que contienen los residuos en contacto con el epítopo y segmentos que no son CDR, denominados regiones marco ("FR"), que en general mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de las regiones CDR para permitir tal contacto (aunque determinados residuos marco también pueden contactar con el epítopo). Por lo tanto, los dominios VL y VH tienen típicamente la estructura: n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c (donde "n" indica el extremo N terminal y "c" indica el extremo C terminal). Los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, segunda, tercera y cuarta FR de la cadena ligera de un anticuerpo se denominan en esta invención respectivamente como: dominio FRl1, dom inio FRl2, dom inio FRl3 y dom inio FRl4. De manera similar, los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, segunda, tercera y cuarta FR de la cadena pesada de un anticuerpo se denominan en esta invención respectivamente como: dom inio FRh1, dom inio FRh2, dominio FRh3 y dom inio FRh4. Los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, segunda y tercera CDR de la cadena ligera de un anticuerpo se denominan en esta invención respectivamente como: dom inio CDRl1, dom inio CDRl2 y dom inio CDRl3. De manera similar, los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, segunda y tercera CDR de la cadena pesada de un anticuerpo se denominan en esta invención respectivamente como: dom inio CDRh1, dom inio CDRh2 y dom inio CDRh3. Por lo tanto, los términos dominio CDRl1, dominio CDRl2, dominio CDRl3, dominio CDRh1, dominio CDRh2 y dominio CDRh3 se refieren a polipéptidos que cuando se incorporan a un anticuerpo hacen que el anticuerpo sea capaz de unirse a un epítopo específico.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la numeración de los residuos en los dominios variables de las cadenas pesada y ligera maduras de inmunoglobulinas se designa por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia de consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de residuo a cada aminoácido, y las CDR se identifican según lo definido por Kabat (se entenderá que CDRh1 según lo definido por Chothia, C. & Lesk, A.M. ((1987) "Canonical structures forthe hypervariable regions of immunoglobulins," ("Estructuras canónicas para las regiones hipervariables de inmunoglobulinas"), J. Mol. Biol. 196:901-917) comienza cinco residuos antes). El esquema de numeración de Kabat es extensible a los anticuerpos no incluidos en su compendio al alinear el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat por referencia a los aminoácidos conservados. Este procedimiento para asignar números de residuos se ha convertido en estándar en el campo e identifica fácilmente aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, incluidas variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de la cadena ligera de un anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de la cadena ligera de un anticuerpo de ratón.
La capacidad de un anticuerpo para unirse a un epítopo de un antígeno depende de la presencia y la secuencia de aminoácidos de los dominios v L y VH del anticuerpo. La interacción de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH forma uno de los dos sitios de unión al epítopo de un anticuerpo natural, tal como una IgG. Los anticuerpos naturales son capaces de unirse a una sola especie de epítopo (es decir, son monoespecíficos), aunque pueden unirse a múltiples copias de esa especie de epítopo (es decir, exhibiendo bivalencia o multivalencia).
En consecuencia, como se usa en esta invención, la expresión "fragmento de unión al epítopo" significa un fragmento de un anticuerpo capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo, y la expresión "sitio de unión al epítopo" se refiere a una porción de una molécula que comprende un fragmento de unión al epítopo. Un fragmento de unión al epítopo puede contener cualquiera de los 1, 2, 3, 4 o 5 dominios CDR de un anticuerpo, o puede contener los 6 dominios CDR de un anticuerpo y, aunque es capaz de unirse inmunoespecíficamente a dicho epítopo, puede exhibir una inmunoespecificidad, afinidad o selectividad hacia dicho epítopo que difiere de la de dicho anticuerpo. Preferiblemente, sin embargo, un fragmento de unión al epítopo contendrá los 6 dominios CDR de tal anticuerpo. Un fragmento de unión al epítopo de un anticuerpo puede ser una sola cadena polipeptídica (por ejemplo, un scFv) o puede comprender dos o más cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales con un extremo amino terminal y un extremo carboxi terminal (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab2, etc.). A menos que se indique específicamente, el orden de los dominios de las moléculas de proteína descritas en esta invención está en la dirección "N-terminal a C-terminal".
La invención también abarca inmunoconjugados que comprenden fragmentos de dominio variable de cadena sencilla ("scFv") que comprenden un dominio anti-ADAM9-VL y/o VH de la invención. Los fragmentos de dominio variable de cadena única comprenden dominios VL y VH que se unen entre sí mediante un péptido "enlazador" corto. Dichos enlazadores pueden modificarse para proporcionar funciones adicionales, como permitir la unión de un fármaco o permitir la unión a un soporte sólido. Las variantes monocatenarias se pueden producir de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede usar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, se puede introducir un polinucleótido que contiene un plásmido adecuado que codifica el scFv en una célula huésped adecuada, ya sea eucariota, tales como células de levadura, planta, insecto o mamífero, o procariota, tales como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden fabricarse mediante manipulaciones habituales tales como la ligadura de polinucleótidos. El scFv resultante se puede aislar utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.
El término anticuerpo "humanizado" se refiere a una molécula quimérica que tiene un sitio de unión al epítopo de una inmunoglobulina de una especie no humana y una estructura de inmunoglobulina remanente que se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados generalmente se preparan usando técnicas recombinantes. Los inmunoconjugados de la presente invención pueden comprender variantes humanizadas, quiméricas o caninizadas de un anticuerpo que se designa en esta invención como "MAB-A". Las secuencias de polinucleótidos que codifican los dominios variables de MAB-A pueden usarse para la manipulación genética para generar derivados de MAB-A que posean características mejoradas o alteradas (por ejemplo, afinidad, reactividad cruzada, especificidad, etc.). El principio general en la humanización de un anticuerpo implica retener la secuencia básica de la porción de unión al epítopo del anticuerpo, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanos. Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida; (2) diseñar el anticuerpo humanizado o el anticuerpo caninizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización o canonización; (3) emplear las metodologías/técnicas reales de humanización o caninización; y (4) transfectar y expresar el anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.° 4816 567; 5 807 715; 5866 692; y 6331 415. El término anticuerpo "optim izado" se refiere a un anticuerpo que tiene al menos un aminoácido que es diferente del anticuerpo parental en al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) en la región variable de la cadena ligera o pesada, lo que le confiere una mayor afinidad de unión, (por ejemplo, una afinidad de unión 2 veces o más veces mayor), a ADAM9 humano y/o ADAM9 de mono cynomolgus en comparación con el anticuerpo parental. Se entenderá a partir de las enseñanzas proporcionadas en esta invención que los anticuerpos de la invención están humanizados y, opcionalmente, optimizados.
El sitio de unión al epítopo puede comprender un dominio variable completo fusionado con uno o más dominios constantes o solo las CDR de dicho dominio variable injertadas en regiones marco apropiadas. Los sitios de unión al epítopo pueden ser de tipo natural o pueden estar modificados por una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Tal acción elimina parcial o completamente la capacidad de la región constante para servir como inmunógeno en los receptores (por ejemplo, individuos humanos); sin embargo, permanece la posibilidad de una respuesta inmunitaria al dominio variable extraño (LoBuglio, A.F. y col. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response" ("Anticuerpo monoclonal quimérico humano/de ratón en el hombre: cinética y respuesta inmunitaria"), Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 86:4220-4224). Otra estrategia se centra no solo en proporcionar regiones constantes derivadas de seres humanos, sino también en modificar los dominios variables para remodelarlos lo más cerca posible de una forma que se encuentra en las inmunoglobulinas humanas. Se sabe que los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos contienen tres CDR que varían en respuesta a los antígenos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por las cuatro regiones marco, que están relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan una estructura para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un antígeno particular, los dominios variables pueden "reformarse" o "humanizarse" injertando CDR derivadas de anticuerpos no humanos en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. Se ha informado de la aplicación de esta estrategia en diversos anticuerpos en Sato, K. y col. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. y col. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy" ("Remodelación de anticuerpos humanos para terapia"), Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. y col. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" ("Remodelación de anticuerpos humanos: injerto de una actividad antilisozima"), Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.A. y col. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation" ("Humanización de un anticuerpo monoclonal de ratón mediante injerto de CDR: la importancia de los residuos del marco en la conformación del bucle"), Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. y col. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity" ("Construcción de anticuerpos humanos remodelados con actividad neutralizadora del VIH"), Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S.D. y col. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," ("Remodelación de un anticuerpo CD4 terapéutico"), Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU) 88:4181-4185; Tempest, P.R. y col. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," ("Remodelación de un anticuerpo monoclonal humano para inhibir la infección por el virus sincitial respiratorio humano in vivo"), Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S. y col. (1991) "HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy" ("Anticuerpos humanizados para terapia antiviral"), Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU) 88:2869-2873; Carter, P. y col. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy" ("Humanización de un anticuerpo anti-p185her2 para la terapia del cáncer humano"), Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU) 89:4285-4289; y Co, M.S. y col. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," ("Anticuerpos quiméricos y humanizados con especificidad para el antígeno CD33"), J. Immunol. 148:1149-1154. Según la invención reivindicada, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro o cinco) que difieren en secuencia con respecto a las CDR del anticuerpo original.
Se han descrito varias moléculas de anticuerpos humanizados que comprenden un sitio de unión al epítopo derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen un dominio variable de roedor o de roedor modificado y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) asociadas fusionadas con dominios constantes humanos (véanse, por ejemplo, Winter y col. (1991) "Man-made Antibodies" ("Anticuerpos producidos por el hombre"), Nature 349:293-299; Lobuglio y col. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response" ("Anticuerpo monoclonal quimérico humano/de ratón en el hombre: cinética y respuesta inmunitaria"), Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 86:4220-4224; Shaw y col. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen" ("Caracterización de un anticuerpo monoclonal quimérico humano/de ratón (17-1A) contra un antígeno asociado a un tumor de cáncer de colon"), J. Immunol. 138:4534-4538; y Brown y col. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody" ("Anticuerpo monoclonal quimérico humano/murino modificado por ingeniería genética específico de tumor"), Cancer Res. 47:3577-3583). Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región marco de soporte (FR) humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. y col. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy" ("Remodelación de anticuerpos humanos para terapia"), Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. y col. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" ("Remodelación de anticuerpos humanos: injerto de una actividad antilisozima"), Science 239:1534-1536; y Jones y col. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse" ("Reemplazo de las regiones determinantes de la complementariedad en un anticuerpo humano con las de un ratón"), Nature 321:522-525). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones marco de roedor recubiertas de forma recombinante (véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n.° 519 596). Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia las moléculas de anticuerpos antihumanos de roedores, lo que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Otros procedimientos de humanización de anticuerpos que también se pueden utilizar se describen en Daugherty y col. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins" ("La reacción en cadena de la polimerasa facilita la clonación, el injerto de CDR y la expresión rápida de un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra el componente CD18 de las integrinas leucocitarias"), Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 y en las patentes de los EE.UU. n.° 6 180377; 6 054 297; 5997 867; y 5866 692.
B. Características de los dominios constantes de anticuerpos
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la numeración de los residuos en la región constante de una cadena pesada de IgG es la del índice EU como en Kabat y col., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTERES, 5a ed. Public Health Service, NH1, MD (199l) ("Kab a t"). La expresión "el índice EU tal como se establece en Kabat" se refiere a la numeración de los dominios constantes del anticuerpo IgG1 EU humano proporcionado en Kabat. Este procedimiento para asignar números de residuos se ha convertido en estándar en el campo e identifica fácilmente aminoácidos en posiciones equivalentes en las regiones constantes de diferentes isotipos de anticuerpos.
1. Regiones constantes de la cadena ligera
Como se indicó anteriormente, cada cadena ligera de un anticuerpo contiene un dominio variable ("VL") y un dominio constante ("CL").
Un dominio CL preferido es un dominio CL kappa de IgG humano. La secuencia de aminoácidos de un dominio CL kappa humano ejemplar es (SEQ ID NO:69)
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC ■
Alternativamente, un dominio CL ejemplar es un dominio CL lambda de IgG humano. La secuencia de aminoácidos de un dominio CL lambda humano ejemplar es (SEQ ID NO:70):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
2. Regiones constantes de la cadena pesada
a. Regiones Fc de origen natural
Como se proporciona en esta invención, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender una región Fc. La región Fcde dichos inmunoconjugados de la invención puede ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Los inmunoconjugados de la invención pueden comprender además un dominio CH1 y/o una región bisagra. Cuando está presente, el dominio CH1 y/o la región bisagra puede ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), y es preferiblemente del mismo isotipo que la región Fc deseada.
La región Fc de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención puede ser una región Fc completa (por ejemplo, una región Fc de IgG completa) o sólo un fragmento de una región Fc. Opcionalmente, la región Fc de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención carece del residuo de aminoácido de lisina C-terminal.
Los dominios CH1 de las dos cadenas pesadas de un anticuerpo forman un complejo con la región constante "CL" de la cadena ligera del anticuerpo, y se unen a los dominios CH2 de las cadenas pesadas a través de un dominio bisagra intermedio.
Un dominio CH1 ejemplares un dominio CH1 de IgG1 humano. La secuencia de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG1 humano ejemplar es (SEQ ID NO:71):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
Un dominio CH1 ejemplares un dominio CH1 de IgG2 humano. La secuencia de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG2 humano ejemplar es (SEQ ID NO:72):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
Un dominio CH1 ejemplares un dominio CH1 de IgG4 humano. La secuencia de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG4 humano ejemplar es (SEQ ID NO:73):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
Una región bisagra ejemplar es una región bisagra de IgG1 humana. La secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG1 humana ejemplares (SEQ ID NO:74): EPKSCDKTHTCPPCP.
Otra región bisagra ejemplar es una región bisagra de IgG2 humana. La secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG2 humana ejemplares (SEQ ID NO:75): ERKCCVECPPCP.
Otra región bisagra ejemplar es una región bisagra de IgG4 humana. La secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG4 humana ejemplar es (SEQ ID NO:76): ESKYGPPCPSCP. Como se describió anteriormente, una región bisagra de IgG4 puede comprender una mutación estabilizadora, tal como la sustitución S228P. La secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG4 estabilizada ejemplares (SEQ ID NO:77): ESKYGPPCPPCP.
Los dominios CH2 y CH3 de las dos cadenas pesadas de un anticuerpo interactúan para formar una "región Fc", que es un dominio reconocido por los "receptores Fc" celulares, incluyendo, pero sin limitación, los receptores gamma Fc ("FcyR"). Como se usa en esta invención, el término "región Fc" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de IgG que comprende los dominios CH2 y CH3 de esa cadena. Se dice que una región Fc es de un isotipo, clase o subclase de IgG particular si su secuencia de aminoácidos es la más homóloga a ese isotipo, en relación con otros isotipos de IgG.
La secuencia de aminoácidos del dominio CH2-CH3 de una IgG1 humana ejemplar es (SEQ ID NO:1)
231 2 40 25 0 26 0 27 0 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
numerados por el índice EU como se establece en Kabat, donde X es una lisina (K) o está ausente.
La secuencia de aminoácidos del dominio CH2-CH3 de una IgG2 humana ejemplar es (SEQ ID NO:2):
231 2 40 25 0 26 0 27 0 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF R W SV LTW H QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
numerados por el índice EU como se establece en Kabat, donde X es una lisina (K) o está ausente.
La secuencia de aminoácidos del dominio CH2-CH3 de una IgG3 humana ejemplar es (SEQ ID NO:3):
231 240 250 26 0 27 0 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
numerados por el índice EU como se establece en Kabat, donde X es una lisina (K) o está ausente.
La secuencia de aminoácidos del dominio CH2-CH3 de una IgG4 humana ejemplar es (SEQ ID NO:4):
231 240 250 26 0 27 0 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
numerados por el índice EU como se establece en Kabat, donde X es una lisina (K) o está ausente.
Se han observado polimorfismos en varias posiciones diferentes dentro de las regiones constantes del anticuerpo (por ejemplo, posiciones Fc, incluyendo, pero sin limitación, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 numeradas por el índice EU tal como se establece en Kabat), y por lo tanto pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias de la técnica anterior. Las formas polimórficas de inmunoglobulinas humanas han sido bien caracterizadas. En la actualidad se conocen 18 alotipos Gm: G1m (1,2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, y col., "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis ofStructure, Function And Regulation" ("Las subclases de IgG humana: análisis molecular de estructura, función y regulación"). Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. y col., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Se contempla específicamente que los anticuerpos de la presente invención pueden incorporar cualquier alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina, y sin limitación al alotipo, isoalotipo o haplotipo de las secuencias proporcionadas en esta invención. Además, en algunos sistemas de expresión, el residuo de aminoácido C-terminal (en negrita arriba) del dominio CH3 puede eliminarse después de la traducción. En consecuencia, el residuo C-terminal del dominio CH3 es un residuo de aminoácido opcional en los inmunoconjugados de la invención. Específicamente abarcados por la presente invención se encuentran los inmunoconjugados que carecen del residuo C-terminal del dominio CH3. También se abarcan específicamente por la presente invención dichas construcciones que comprenden el residuo de lisina C-terminal del dominio CH3.
b. Receptores Fcy (FcyR)
En la función inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmunitario da como resultado una amplia gama de respuestas, que van desde funciones efectoras, tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de los mastocitos y la fagocitosis, hasta señales inmunomoduladoras, tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión de la región Fc de anticuerpos o inmunocomplejos a receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas y, en particular, a receptores (denominados singularmente como "receptor gamma Fc", "FcyR" y colectivamente como "FcyR") que se encuentran en las superficies de múltiples tipos de células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos B, células dendríticas foliculares, células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos).
La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos e inmunocomplejos resulta de la heterogeneidad estructural de los tres receptores Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (Cd 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y FcyRIII (CD16) son receptores activadores (es decir, potenciadores del sistema inmunitario); FcyRIIB (CD32B) es un receptor inhibidor (es decir, amortiguador del sistema inmunitario). Además, la interacción con el receptor Fc neonatal (FcRn) media el reciclaje de moléculas de IgG desde el endosoma hasta la superficie celular y su liberación a la sangre. La secuencia de aminoácidos de IgG1 de tipo natural ejemplar (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:2), IgG3 (SEQ ID NO:3) e IgG4 (SEQ ID NO:4) se han presentado anteriormente.
La capacidad de los diferentes FcyR para mediar funciones diametralmente opuestas refleja las diferencias estructurales entre los diferentes FcyR y, en particular, refleja si el FcyR unido posee un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor ("ITAM") o un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptor ("ITIM"). El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas en estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los FcyR que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA y activan el sistema inmunitario cuando se unen a regiones Fc (por ejemplo, regiones Fc agregadas presentes en un inmunocomplejo). FcyRIIB es el único FcyR natural conocido actualmente que contiene ITIM; actúa para amortiguar o inhibir el sistema inmunitario cuando se une a regiones Fc agregadas. Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. La agrupación de FcyRIIA a través de inmunocomplejos o el entrecruzamiento de anticuerpos específicos sirve para agregar ITAM con quinasas asociadas al receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de ITAM sirve como un sitio de acoplamiento para la quinasa Syk, cuya activación da como resultado la activación de sustratos aguas abajo (por ejemplo, PI3K). La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios. El gen FcyRIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es un 96 % idéntico a FcyRIIA y se une a complejos IgG de manera indistinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclase inhibitoria de FcyR. Recientemente se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se coliga junto con un FcyR activador, el ITIM en FcyRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la inositol polifosfato 5'-fosfatasa (SHIP), que hidroliza los mensajeros de fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de la tirosina quinasa mediada por FcyR que contiene ITAM, previniendo en consecuencia la entrada de Ca++ intracelular. Por lo tanto, el entrecruzamiento de FcyRIIB amortigua la respuesta de activación a la ligadura de FcyR e inhibe la capacidad de respuesta celular. Por lo tanto, se aborta la activación de las células B, la proliferación de las células B y la secreción de anticuerpos.
c. Regiones Fc variantes
La modificación de la región Fc puede conducir a un fenotipo alterado, por ejemplo, vida media en suero alterada, estabilidad alterada, susceptibilidad alterada a las enzimas celulares o función efectora alterada. Por lo tanto, puede ser deseable modificar una molécula que contiene la región Fc de la presente invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para mejorar la eficacia de dicha molécula en el tratamiento del cáncer. La reducción o eliminación de la función efectora es deseable en determinados casos, por ejemplo en el caso de anticuerpos cuyo mecanismo de acción implica el bloqueo o el antagonismo, pero no la destrucción de las células que portan un antígeno diana. Por lo general, es deseable una mayor función efectora cuando se dirige a células indeseables, tales como células tumorales y extrañas, donde los FcyR se expresan a niveles bajos, por ejemplo, células B específicas del tumor con niveles bajos de FcyRIIB (por ejemplo, linfoma no Hodgkin, CLLy linfoma de Burkitt). Los inmunoconjugados de la invención que poseen tal actividad de función efectora conferida o alterada son útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección en la que se desea una mayor eficacia de la actividad de la función efectora.
En consecuencia, en determinadas realizaciones, la región Fc de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención puede ser una región Fc variante diseñada por ingeniería. Aunque la región Fc de los inmunoconjugados de la presente invención puede poseer la capacidad de unirse a uno o más receptores Fc (por ejemplo, FcyR, más preferiblemente dicha región Fc variante tiene una unión alterada a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (Cd 32A), FcyRIIB (c D32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (en relación con la unión exhibida por una región Fc de tipo natural), por ejemplo, tendrá una unión mejorada a un receptor activador y/o tendrá una capacidad sustancialmente reducida o nula para unirse a receptor(es) inhibidor(es). Por lo tanto, la región Fc de los inmunoconjugados de la presente invención puede incluir parte o la totalidad del dominio CH2 y/o parte o la totalidad del dominio CH3 de una región Fc completa, o puede comprender una variante CH2 y/o una secuencia CH3 variante (que puede incluir, por ejemplo, una o más inserciones y/o una o más deleciones con respecto a los dominios CH2 o CH3 de una región Fc completa). Dichas regiones Fc pueden comprender porciones de polipéptidos que no son Fc, o pueden comprender porciones de regiones Fc no completas de forma natural, o pueden comprender orientaciones no naturales de dominios CH2 y/o CH3 (tales como, por ejemplo, dos dominios CH2 o dos dominios CH3, o en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio CH3 unido a un dominio CH2, etc.).
Las modificaciones de la región Fc identificadas como que alteran la función efectora se conocen en la técnica, incluyendo las modificaciones que aumentan la unión a los receptores activadores (por ejemplo, FcyRIIA (CD16A) y reducen la unión a los receptores inhibidores (por ejemplo, FcyRIIB (CD32B) (véase, por ejemplo, Stavenhagen, J.B. y col, (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors" ("La optimización Fc de anticuerpos terapéuticos mejora su capacidad para destruir células tumorales in vitro y controla la expansión tumoral in vivo a través de receptores Fcgamma activadores de baja afinidad"), Cancer Res. 57(18):8882-8890). La Tabla 1 enumera sustituciones ejemplares simples, dobles, triples, cuádruples y quíntuples (la numeración es la del índice EU como en Kabat, y las sustituciones son relativas a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1) de modificación ejemplar que aumenta la unión a receptores activadores y/o reduce la unión a los receptores inhibitorios.
Figure imgf000026_0001
Las variantes ejemplares de regiones Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o unión aumentada a CD16A contienen sustituciones F243L, R292P, Y300L, V305I o P396L, donde la numeración es la del índice EU como en Kabat. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en una región Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En una realización, la región Fc de IgG1 humana variante contiene una sustitución F243L, R292p e Y300L. En otra realización, la región Fc de IgG1 humana variante contiene una sustitución F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L.
En determinadas realizaciones, se prefiere que las regiones Fc de los inmunoconjugados de la presente invención exhiban una unión reducida (o sustancialmente nula) a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (c D32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (en relación con la unión exhibida por la región Fcde IgG1 de tipo natural (SEQ ID NO:1). En una realización específica, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden una región Fc de IgG que exhibe una función efectora ADCC reducida. En una realización preferida de la invención, los dominios CH2-CH3 de los inmunoconjugados incluyen cualquiera de las sustituciones 1,2, 3 o 4: L234A, L235A, D265A, N297Q y N297G, donde la numeración es la del índice EU como en Kabat. En otra realización, los dominios CH2-CH3 contienen una sustitución N297Q, una sustitución N297G, sustituciones L234A y L235A o una sustitución D265A, ya que estas mutaciones anulan la unión a FcR. Alternativamente, se utiliza un dominio CH2-CH3 de una región Fc natural que exhibe inherentemente una unión reducida (o sustancialmente nula) a FcyRIIIA (CD16a) y/o una función efectora reducida (en relación con la función efectora y de unión exhibida por la región Fc de IgGl de tipo naatural (SEQ ID NO:1)). En una realización específica, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden una región Fc de IgG2 (SEQ ID NO:2) o una región Fc de IgG4 (SEQ ID NO:4). Cuando se utiliza una región Fc de IgG4, la presente invención también abarca la introducción de una mutación estabilizadora, tal como la sustitución de la región bisagra S228P descrita anteriormente (véase, por ejemplo, SEQ ID NO:77). Dado que las sustituciones N297G, N297Q, L234A, L235Ay D265A suprimen la función efectora, en circunstancias en las que se desea la función efectora, estas sustituciones preferiblemente no se emplearían.
Una secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención que tiene una función efectora reducida o abolida comprenderá las sustituciones L234A/L235A (que se muestran subrayadas) (SEQ ID NO:78):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
Una segunda secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende una sustitución S442C (que se muestra subrayada), que permite unir covalentemente dos dominios CH3 entre sí a través de un enlace disulfuro o conjugación de un agente farmacéutico. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO:79):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LCLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
Una tercera secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende las sustituciones L234A/L235A (que se muestran subrayadas) que reducen o anulan la función efectora y la sustitución S442C (que se muestra subrayada) que permite que dos dominios CH3 se unan covalentemente entre sí mediante un enlace disulfuro o la conjugación de un agente farmacéutico. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO:80):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LCLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
La vida media en suero de las proteínas que comprenden las regiones Fc puede incrementarse aumentando la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. El término "vida media", como se usa en esta invención, significa una propiedad farmacocinética de una molécula que es una medida del tiempo medio de supervivencia de las moléculas después de su administración. La vida media se puede expresar como el tiempo requerido para eliminar el cincuenta por ciento (50 %) de una cantidad conocida de la molécula del cuerpo de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano u otro mamífero) o un compartimento específico del mismo, por ejemplo, medida en suero, es decir, vida media circulante, o en otros tejidos. En general, un aumento en la vida media da como resultado un aumento en el tiempo medio de residencia (TMR) en circulación para la molécula administrada.
En algunas realizaciones, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden una región Fc variante que comprende al menos una modificación de aminoácido en relación con una región Fc de tipo natural, de manera que dicha molécula tiene una vida media aumentada (en relación con una molécula que comprende una región Fc de tipo natural). En algunas realizaciones, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden una región Fc de IgG variante, donde dicha región Fc variante comprende una sustitución de aminoácidos que prolonga la vida media en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 y 436, donde la numeración es la del índice EU como en Kabat. Se conocen en la técnica numerosas mutaciones capaces de aumentar la vida media de una molécula que contiene la región Fc e incluyen, por ejemplo, M252Y, S254T, T256E y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, véanse las mutaciones descritas en las patentes de los EE.UU. n.° 6277 375, 7083 784; 7217 797, 8088 376; las publicaciones de los EE.UU. n.° 2002/0147311; 2007/0148164; y las publicaciones del PCT n.° WO 98/23289; WO 2009/058492; y WO 2010/033279. Los inmunoconjugados con vida media mejorada también incluyen aquellos que poseen regiones Fc variantes que comprenden sustituciones en dos o más de los residuos de la región Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 y 436, donde la numeración es la del índice EU como en Kabat. En particular, dos o más sustituciones seleccionadas de entre: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K e Y436I, donde la numeración es la del índice EU como en Kabat.
En una realización específica, un inmunoconjugado de la presente invención posee una región Fcde IgG variante que comprende las sustituciones:
(A) M252Y, S254T y T256E;
(B) M252Y y S254T;
(C) M252Y y T256E;
(D) T250Q y M428L;
(E) T307Q y N434A;
(F) A378V y N434A;
(G) N434A y Y436I;
(H) V308P y N434A; o
(I) K288D y H435K.
En una realización preferida de la invención, el inmunoconjugado de la presente invención posee una región Fc de IgG variante que comprende cualquiera de las sustituciones 1, 2 o 3: M252Y, S254T y T256e . La invención abarca además inmunoconjugados que poseen regiones Fc variantes que comprenden:
(A) una o más mutaciones que alteran la función efectora y/o FcyR; y
(B) una o más mutaciones que prolongan la vida media en suero.
Una cuarta secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende las sustituciones M252Y, S254T y T256E (que se muestran subrayadas), para prolongar la vida media en suero. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO:147):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
Una quinta secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende las sustituciones M252Y, S254T y T256E (que se muestran subrayadas), para prolongar la vida media en suero, y la sustitución S442C (que se muestra subrayada), para permitir que dos dominios CH3 se unan covalentemente entre sí a través de un enlace disulfuro o para permitirla conjugación de un resto de fármaco. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO: 148):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LCLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
Una sexta secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende las sustituciones L234A/L235A (que se muestran subrayadas) que reducen o suprimen la función efectora y las sustituciones M252Y, S254T y T256E (que se muestran subrayadas), para prolongar la vida media en suero. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO: 149):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
Una séptima secuencia de IgG1 preferida para los dominios CH2 y CH3 de los inmunoconjugados que contienen la región Fc de la presente invención comprende las sustituciones L234A/L235A (que se muestran subrayadas), que reducen o suprimen la función efectora y las sustituciones M252Y, S254T y T256e (que se muestran subrayadas), para prolongar la vida media en suero y la sustitución S442C (que se muestra subrayada) para permitir que dos dominios CH3 se unan covalentemente entre sí a través de un enlace disulfuro o para permitir la conjugación de un resto de fármaco. La secuencia de aminoácidos de dicha molécula es (SEQ ID NO:150):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LCLSPGX
donde, X es una lisina (K) o está ausente.
II. Anticuerpos anti-ADAM9 ejemplares
Los anticuerpos particulares y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos capaces de unirse específicamente a ADAM9 son útiles en la generación de los inmunoconjugados de la invención.
Un polipéptido ADAM9 humano representativo (secuencia NCBI NP_003807, que incluye una secuencia señal de residuos de 28 aminoácidos, que se muestra subrayada), que se muestra solo con fines ilustrativos y no según la invención reivindicada, tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:5)
MGSGARFPSG TLRVRWLLLL GLVGPVLGAA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR
LTRERREAPR PYSKQVSYVI QAEGKEHIIH LERNKDLLPE DFWYTYNRE
GTLITDHPNI QNHCHYRGYV EGVHNSSIAL SDCFGLRGLL HLENASYGIE
PLQNSSHFEH IIYRMDDVYK EPLKCGVSNK DIERETARDE EEEPPSMTQL
LRRRRAVLPQ TRYVELFIW DKERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY
IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIVGGAGDV LGNFVQWRER FLITRRRHDS
AQLVLKKGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGQITVET FASIVAHELG
HNLGMNHDDG RDCSCGAKSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF ERLTLNRGGN
CLLNIPKPDE AYSAPSCGNK LVDAGEECDC GTPRECELDP CCEGSTCRLR
SFAECAYGDC CKDCRFLPGG TLCRGKTSEC DVPEYCNGSS QFCQPDVFIQ
NGYPCQNNKA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS RARAAPRDCF IEVNSRGDRF
GNCGFSGNEY KKCATGNALC GKLQCENVQE IPVFGIVPAI IQTPSRGTRC
WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TKCGAGKICR NFQCVDASVL NYDCDVQRRC
HGHGVCNSNK NCHCENGWAP PNCETKGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL
V FFFL IV PL I V C A IFIFIK R DQLWRSYFRK RRSQTYESDG RNQANPSRQP
GSVPRHVSPV TPPREVPIYA NRFAVPTYAA KQPQQFPSRP PPPQPRVSSQ
GNLIPARPAP APPLYSSLT
De los 819 residuos de aminoácidos de ADAM9 (SEQ ID NO:5), los residuos 1-28 son una secuencia señal, los residuos 29-697 son el dominio extracelular, los residuos 698-718 son el dominio transmembrana y los residuos 719­ 819 son el dominio intracelular. Tres dominios estructurales están ubicados dentro del dominio extracelular: un dominio de metaloproteasa de zinc de la familia reprolisina (M12B) (en aproximadamente los residuos 212-406); un dominio de desintegrina (en aproximadamente los residuos 423-497); y un dominio similar a EGF (en aproximadamente los residuos 644-697). Se han identificado varias modificaciones e isoformas postraduccionales y la proteína se escinde proteolíticamente en la red trans-Golgi antes de que llegue a la membrana plasmática para generar una proteína madura. La eliminación del prodominio se produce a través de la escisión en dos sitios diferentes. Procesado muy probablemente por una proproteína convertasa tal como la furina, en el límite entre el prodominio y el dominio catalítico (Arg-205/Ala-206). Un sitio adicional de proproteína convertasa de escisión aguas arriba (Arg-56/Glu-57) tiene un papel importante en la activación de ADAM9.
Un polipéptido ADAM9 de mono cynomolgus representativo (secuencia NCBI XM_005563126.2, que incluye una posible secuencia señal de 28 residuos de aminoácidos, que se muestra subrayada), que se muestra solo con fines ilustrativos y no según la invención reivindicada, tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6):
MGSGVGSPSG TLRVRWLLLL CLVGPVLGAA RPGFQQTSHL SSYEIITPWR
LTRERREAPR PYSRQVSYLI QAEGREHIIH LERNRDLLPE DFWYTYNRE
GTVITDHPNI QNHCHFRGYV EGVYNSSVAL SNCFGLRGLL HLENASYGIE
PLQNSSHFEH IIYRMDDVHR EPLRCGVSNR DIERETTRDE EEEPPSMTQL
LRRRRAVLPQ TRYVELFIW DRERYDMMGR NQTAVREEMI LLANYLDSMY
IMLNIRIVLV GLEIWTNGNL INIAGGAGDV LGNFVQWRER FLITRRRHDS
AQLVLRRGFG GTAGMAFVGT VCSRSHAGGI NVFGHITVET FASIVAHELG
HNLGMNHDDG RDCSCGARSC IMNSGASGSR NFSSCSAEDF ERLTLNRGGN
CLLNIPRPDE AYSAPSCGNR LVDAGEECDC GTPRECELDP CCEGSTCRLR
SFAECAYGDC CRDCRFLPGG TLCRGRTSEC DVPEYCNGSS QFCQPDVFIQ
NGYPCQNNRA YCYNGMCQYY DAQCQVIFGS RARAAPRDCF IEVNSRGDRF
GNCGFSGNEY RRCATGNALC GRLQCENVQE IPV FG IV PA I IQTPSRGTRC
WGVDFQLGSD VPDPGMVNEG TRCGADRICR NFQCVDASVL NYDCDIQRRC
HGHGVCNSNR NCHCENGWAP PNCETRGYGG SVDSGPTYNE MNTALRDGLL
V FFFL IV PL I V C A IF IF IR R DQLWRRYFRR RRSQTYESDG RNQANPSRQP
VSVPRHVSPV TPPREVPIYA NRFPVPTYAA RQPQQFPSRP PPPQPRVSSQ
GNLIPARPAP APPLYSSLT
El dominio de la metaloproteasa de zinc de la familia de la reprolisina (M12B) de la proteína se encuentra aproximadamente en los residuos 212-406); el dominio desintegrina de la proteína está aproximadamente en los residuos 423-497.
En determinadas realizaciones, los inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos anti-ADAM9 y los fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos de la invención se caracterizan por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve de los siguientes criterios:
(1) la capacidad de unirse de forma inmunoespecífica a ADAM9 humano como se expresa endógenamente en la superficie de una célula cancerosa;
(2) se une específicamente a ADAM9 de primate humano y no humano (por ejemplo, ADAM9 de mono cynomolgus) con una afinidad de unión similar;
(3) se une específicamente a ADAM9 humano con una constante de unión en equilibrio (Kd) de 4 nM o menos; (4) se une específicamente a ADAM9 de primate no humano con una constante de unión en equilibrio (Kd) de 4 nM o menos
(5) se une específicamente a ADAM9 humano con una tasa de asociación (ka) de 5 * 105 M'1min_1 o más;
(6) se une específicamente a ADAM9 de primate no humano con una tasa de asociación (ka) de 1 * 106 M'1min_1 o más;
(7) se une específicamente a ADAM9 humano con una tasa de disociación (kd) de 1 *10 '3 min-1 o menos;
(8) se une específicamente a ADAM9 de primate no humano con una tasa de disociación (kd) de 9 * 10-4 min-1 o menos.
(9) están optimizados para tener una mejora de al menos 100 veces (por ejemplo, una mejora de al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces, al menos 250 veces, al menos 300 veces, al menos 350 veces, al menos 400 veces, al menos 450 veces, al menos 500 veces, al menos 550 veces o al menos 600 veces) en la afinidad de unión (por ejemplo, medida mediante análisis BIACORE®) a ADAM9 cyno y conserva la unión de alta afinidad a ADAM9 humano (por ejemplo, análisis BIACORE®) en comparación con el anticuerpo parental quimérico o murino.
Como se describe en esta invención, las constantes de unión de un anticuerpo anti-ADAM9 o fragmento de unión a ADAM9 del mismo pueden determinarse usando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, mediante un análisis BIACORE®. Los datos de resonancia de plasmones superficiales pueden ajustarse a un modelo de unión de Langmuir 1:1 (simultáneo ka kd) y una constante de unión de equilibrio Kd calculada a partir de la relación de constantes de velocidad kd/ka. Dichas constantes de unión pueden determinarse para un anticuerpo anti-ADAM9 monovalente o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo (es decir, una molécula que comprende un único sitio de unión al epítopo de ADAM9), un anticuerpo anti-ADAM9 bivalente o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo (es decir, un molécula que comprende dos sitios de unión al epítopo de ADAM9), o anticuerpos anti-ADAM9 y fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos que tienen mayor valencia (por ejemplo, una molécula que comprende tres, cuatro o más sitios de unión al epítopo de ADAM9).
La presente invención abarca particularmente inmunoconjugados que poseen un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) anti-ADAM9 y un dominio variable de cadena pesada (VH) anti-ADAM9 que se unen inmunoespecíficamente a un epítopo de un polipéptido ADAM9 humano. A menos que se indique lo contrario, todos estos anticuerpos anti-ADAM9 y los fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos son capaces de unirse inmunoespecíficamente a ADAM9 humana. Como se usa en esta invención, dichos dominios variables de ADAM9 se denominan "anti-ADAM9-VL" y "anti-ADAM9-VH", respectivamente.
A. Anticuerpos murinos anti-ADAM9 humano
Se internaliza un anticuerpo murino anti-ADAM9 que bloquea la actividad de procesamiento de la proteína diana de ADAM9 y se identificó que tenía actividad antitumoral (véase, por ejemplo, la patente de los EE.u U. n.° 8361 475). Este anticuerpo, designado en las patentes de los EE.UU. n.° 7674619 y 8361 475 como un anticuerpo "anti-KID24" producido por el clon de hibridoma ATCC PTA-5174, se designa en esta invención como "MAB-A". MAB-A exhibe una fuerte unión preferencial a los tumores sobre los tejidos normales (véanse las FIG 7A-7C). MAB-A exhibió poca o ninguna tinción en un gran panel de tipos de células normales (Tabla 2).
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Como se muestra en la FIG. 2 , MAB-A se une a ADAM9 humano con alta afinidad, pero se une a ADAM9 de primate no humano (por ejemplo, mono cynomolgus) en menor medida.
Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL y VH de MAB-A se proporcionan a continuación con fines ilustrativos y no son según la invención reivindicada. Se humanizaron los dominios VH y VL de MAB-A y se optimizaron las CDR para mejorar la afinidad y/o para eliminar posibles pasivos de aminoácidos. La CDRh3 se optimizó aún más para mejorar la unión a ADAM9 de primate no humano mientras se mantenía su alta afinidad por ADAM9 humano.
Los inmunoconjugados preferidos de la presente invención que comprenden 1, 2 o las 3 CDRh de un dominio VH y 1 o 2 de las CDRl del dominio VL de una variante optimizada de MAB-A, y preferiblemente poseen además la regiones marco humanizadas ("FR") de los dominios VH y/o VL de MAB-A humanizado. Otros inmunoconjugados preferidos de la presente invención poseen el dominio VH completo de una variante humanizada/optimizada de MAB-A.
La invención se refiere particularmente a inmunoconjugados que comprenden:
(A)
(1) las tres CDRL del dominio VL de MAB-A; y
(2) las cuatro FR del dominio VL de una variante humanizada de MAB-A; o
(B) las tres CDRh del dominio VH de una variante optimizada de MAB-A; y las tres CDRl del dominio VL de MAB-A; o (C)
(1) las tres CDRh del dominio VH de una variante optimizada de MAB-A; y
(2) las cuatro FR del dominio VH de una variante humanizada de MAB-A; o
(D)
(1) el dominio VH de una variante humanizada/optimizada de MAB-A; y
(2) el dominio VL de una variante humanizada/optimizada de anticuerpo murino MAB-A, "MAB-A"
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo murino anti-ADAM9 MAB-A es SEQ ID NO:7, que se muestra solo con fines ilustrativos y no es según la invención reivindicada (los residuos de CDRH se muestran subrayados):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMHWVKQR PGQGLEWIGE
IIPINGHTNY NEKFKSKATL TLDKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTLT VSS
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRH1 de MAB-A es (SEQ ID NO:8): SYWMH.
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRH2 de MAB-A es (SEQ ID NO:9): EIIPINGHTNYNEKFKS.
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRH3 de MAB-A es (SEQ ID NO:10): GGYYYYGSRDYFDY.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo murino anti-ADAM9 MAB-A es SEQ ID NO:11, que se muestra solo con fines ilustrativos y no es según la invención reivindicada (los residuos de CDRL se muestran subrayados):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQIPGQPPKL
L IY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSHEDPF
TFGGGTKLEI K
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRL1 de MAB-A es (SEQ ID NO:12): KASQSVDYDGDSYMN.
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRL2 de MAB-A es (SEQ ID NO:13): AASDLES.
La secuencia de aminoácidos del dominio CDRL3 de MAB-A es (SEQ ID NO:14): QQSHEDPFT.
B. Dominios anti-ADAM9-VH y VL humanizados/optimizados ejemplares
1. Dominios VH variantes de MAB-A
Las secuencias de aminoácidos de determinados dominios anti-ADAM9-VH humanizados/optimizados preferidos de MAB-A son variantes del dominio ADAM9-VH de MAB-A (SEQ ID NO:7).
Las secuencias de aminoácidos de determinados dominios anti-ADAM9-VH humanizados/optimizados preferidos de MAB-A:
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
se presentan a continuación (los residuos de CDRH se muestran con subrayado simple; las diferencias relativas a hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:7) se muestran con doble subrayado).
Las secuencias de aminoácidos de dominios anti-ADAM9-VH humanizados/optimizados de MAB-A:
hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16)
hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17)
hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18)
hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19)
también se proporcionan a continuación, pero las secuencias anteriores no forman parte de la presente invención reivindicada.
hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IN G H T N Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NERFQGR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWIHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NERFQGR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYFNSGTL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYIGKGVL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRFGWL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYTGKGVL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYDSNAVL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYFHSGTL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYFNKAVL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGGSGVL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPROGFL DYWGQGTTVT VSS
hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIP IF G H T N Y NEKFKSR F T I SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYYNSGTL DYWGQGTTVT VSS
Las secuencias de aminoácidos adecuadas para las FR de un dominio anti-ADAM9-VH humanizado y/u optimizado de MAB-A son:
Dominio f Rh1 (SEQ id NO:30): EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS
Dominio FRh2 (SEQ ID NO:31): WVRQAPGKGLEWVG
Dominio FRh3 (SEQ ID NO:32): RFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCAR
Dominio FRh4 (SEQ ID NO:33): WGQGTTVTVSS
La secuencia de aminoácidos para el dominio CDRH1 de un dominio anti-ADAM9-VH es una de las siguientes:
SEQ ID NO:8: SYWMH
SEQ ID NO:34: SYWIH
La secuencia de aminoácidos para el dominio CDRH2 de un dominio anti-ADAM9-VH es una de las siguientes:
SEQ ID NO:9 :EIIPINGHTNYNEKFKS
SEQ ID NO:35: EIIPIFGHTNYNEKFKS
SEQ ID NO:36: EIIPIFGHTNYNERFQG
La secuencia de aminoácidos para el dominio CDRH3 de un dominio anti-ADAM9-VH es una de las siguientes:
SEQ ID NO:37: GGYYYYFNSGTLDY
SEQ ID NO:38: GGYYYYIGKGVLDY
SEQ ID NO:39: GGYYYYPRFGWLDY
SEQ ID NO:40: GGYYYYTGKGVLDY
SEQ ID NO:41: GGYYYYDSNAVLDY
SEQ ID NO:42: GGYYYYFHSGTLDY
SEQ ID NO:43: GGYYYYFNKAVLDY
SEQ ID NO:44: GGYYYYGGSGVLDY
SEQ ID NO:45: GGYYYYPRQGFLDY
SEQ ID NO:46: GGYYYYYNSGTLDY
Una primera cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A que queda fuera del alcance de la presente invención reivindicada contiene el dominio hMAB-A VH (2) (SEQ ID NO:l7), y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:50):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYGSRDYF DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una segunda cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A v H (2C) (SEQ ID NO:22), y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:51):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRFGWL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una tercera cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A que contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:52):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Como se indicó anteriormente, los dominios CH2-CH3 de la región Fc pueden diseñarse, por ejemplo, para reducir la función efectora y/o para introducir un sitio de conjugación y/o para prolongar la vida media en suero. En determinadas realizaciones, los dominios CH2-CH3 de las cadenas pesadas de IgG1 humanizadas/optimizadas ejemplares de la invención comprenden una o más sustituciones seleccionadas de entre: L234A, L235A, M252Y, S254T, T256E y S442C.
Así, una cuarta cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (21) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones L234Ay L235A en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEq ID NO:78) y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:141)
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una quinta cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A v H (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además la sustitución S442C en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEQ ID No :79) y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:142):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLCLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una sexta cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones L234A, L235A y S442C en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEQ ID NO:80) y tiene la secuencia de aminoácidos (s Eq ID n O:143):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLCLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una séptima cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones M252Y, S254T y T256E en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEQ ID NO:147) y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:151):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una octava cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones M252Y, S254T, T256E y S442C en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SeQ ID No :148) y tiene la secuencia de aminoácidos (s Eq ID n O:152):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLCLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una novena cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones L234A, L235A, M252Y, S254T y T256E en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEQ ID NO:149) y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:153):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
Una décima cadena pesada de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28), y comprende además las sustituciones L234A, L235A, M252Y, S254T, T256E y S442C en los dominios CH2-CH3 de la región Fc (SEQ ID NO:150) y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:154):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE
IIPIFG H TN Y NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG
YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLCLS
PGX
donde X es una lisina (K) o está ausente.
2. Dominios VL variantes de MAB-A
Las secuencias de aminoácidos de los dominios anti-ADAM9-VL humanizados/optimizados preferidos de MAB-A son variantes del dominio ADAM9-VL de MAB-A (SEQ ID NO:11).
Las secuencias de aminoácidos de un dominio anti-ADAM9-VL humanizado preferido de MAB-A: hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54), y de determinados dominios anti-ADAM9-VL humanizados/optimizados preferidos de MAB-A: hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55), hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56) y hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57), se presentan a continuación (los residuos de CDRl se muestran con subrayado simple; las diferencias relativas a hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54) se muestran con doble subrayado).
hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT IS C KASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
L IY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF
TFGQGTKLEI K
hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT IS C KASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL
L IY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF
TFGQGTKLEI K
hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCRASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL
L IY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF
TFGQGTKLEI K
hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCRASQSVD YSGDSYLNWY QQKPGQPPKL
L IY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCOOSYSTPF
TFGQGTKLEI K
En consecuencia, las secuencias de aminoácidos adecuadas para las FR de un dominio anti-ADAM9-VL humanizado y/u optimizado de MAB-A son:
Dominio FRl1 (SEQ ID NO:58): DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC
Dominio FRl2 (SEQ ID NO:59): WYQQKPGQPPKLLIY
Dominio FRl3 (SEQ ID NO:60): GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYC
Dominio FRl4 (SEQ ID NO:61): FGQGTKLEIK
La secuencia de aminoácidos para el dominio CDRL1 de un dominio anti-ADAM9-VL es una de las siguientes:
SEQ ID NO:12: KASQSVDYDGDSYMN
SEQ ID NO:62: KASQSVDYSGDSYMN
SEQ ID NO:63: RASQSVDYSGDSYMN
SEQ ID NO:64: RASQSVDYSGDSYLN
La secuencia de aminoácidos para el dominio CDRL3 de un dominio anti-ADAM9-VL es una de las siguientes:
SEQ ID NO:14: QQSHEDPFT
SEQ ID NO:65: QQSYSTPFT
Una cadena ligera de IgG1 humanizada/optimizada ejemplar de un derivado/variante de MAB-A contiene el dominio hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55), y tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:68):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL
LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF
TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
La invención contempla además tales inmunoconjugados que comprenden además cualquiera de las FRh1, FRh2, FRh3, o FRh4, FRl1, FRl2, FRl3 o FRl4 de MAB-A humanizadas proporcionadas anteriormente, y contempla particularmente tales inmunoconjugados que comprenden FRH1, FRH2, FRH3 y FRH4, y/o que comprenden FRL1, FRl2, FRl3, FRl4 y FRh1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo incluye un dominio CDRH1, un dominio CDRH2 y un dominio CDRH3, y un dominio CDRL1, un dominio CDRL2 y un dominio CDRL3 que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) las SEQ ID NO: 8, 35 y 37 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(b) las SEQ ID NO: 8, 35 y 38 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(c) las SEQ ID NO: 8, 35 y 39 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(d) las SEQ ID NO: 8, 35 y 40 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(e) las SEQ ID NO: 8, 35 y 41 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(f) las SEQ ID NO: 8, 35 y 42 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(g) las SEQ ID NO: 8, 35 y 43 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(h) las SEQ ID NO: 8, 35 y 44 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(i) las SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14 respectivamente; y
(j) las SEQ ID NO: 8, 35 y 46 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente.
En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo incluye un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3, y un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo incluye un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen secuencias que son al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o son el 100 % idénticas a las secuencias siguientes:
Figure imgf000041_0001
Por "sustancialmente idéntico" o "idéntico" se entiende un polipéptido que exhibe al menos un 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en esta invención). Preferiblemente, tal secuencia es al menos el 60 %, más preferiblemente al menos el 80 % o al menos el 85 %, y más preferiblemente al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o incluso el 100 % idéntica en el nivel de aminoácidos o ácido nucleico a la secuencia utilizada para la comparación.
La identidad de la secuencia se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia de Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software hace coincidir secuencias similares o idénticas asignando grados de homología a varias sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En una estrategia ejemplar para determinar el grado de identidad, se puede utilizar un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3 y e-1°° que indica una secuencia estrechamente relacionada.
En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo incluye un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen secuencias que son al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, o son el 100 % idénticas a las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado comprende una cadena pesada y una secuencia de cadena ligera como se indica a continuación:
(a) la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(b) la SEQ ID NO:52 y la SEQ ID NO:68, respectivamente
(c) la SEQ ID NO: 141 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(d) la SEQ ID NO:142 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(e) la SEQ ID NO: 143 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(f) la SEQ ID NO: 151 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(g) la SEQ ID NO: 152 y la SEQ ID NO:68, respectivamente;
(h) la SEQ ID NO:153 y la SEQ ID NO:68, respectivamente; e
(i) la SEQ ID NO: 154 y la SEQ ID NO:68, respectivamente.
En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:52 y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:68. En otras realizaciones particulares, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:142 y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:68. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado está diseñado para prolongar la vida media en suero y comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:151 y una cadena ligera que tiene la secuencia de s Eq ID NO:68. En otras realizaciones particulares, el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado/optimizado está diseñado para prolongar la vida media en suero y para la conjugación específica del sitio y comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 152 y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO:68.
La presente invención también contempla expresamente inmunoconjugados que se unen inmunoespecíficamente a un epítopo de un polipéptido ADAM9 humano, y que comprenden cualquiera de los dominios VL o VH anti-ADAM9 MAB-A humanizados/optimizados proporcionados anteriormente. La presente invención contempla particularmente dichos anticuerpos anti-ADAM9 y los fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos que comprenden cualquiera de las siguientes combinaciones de dominios VL o VH anti-ADAM9 humanizados/optimizados:
Figure imgf000042_0001
La presente invención abarca específicamente inmunoconjugados que comprenden un dominio anti-ADAM9-VL y/o VH humanizado/optimizado como se ha indicado anteriormente. En realizaciones particulares, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden (i) un dominio anti-ADAM9-VL y/o VH humanizado/optimizado según lo indicado anteriormente, y (ii) una región Fc.
Aunque las modificaciones particulares de los dominios VH y VL anti-ADAM9 se resumen anteriormente y se comparan en las FIG. 3A-3B, no es necesario modificar todos o la mayoría de estos residuos al diseñar un dominio anti-ADAM9-VH o VL humanizado y/u optimizado de la invención. La presente invención también abarca variaciones menores de estas secuencias VH y VL que incluyen, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos de los residuos de aminoácidos C-terminal y/o N-terminal que pueden introducirse para facilitar la subclonación.
MI. Conjugados de anticuerpo y fármaco
Definiciones
El término " inmunoconjugado", "conjugado" o "ADC", como se usa en esta invención, se refiere a un compuesto o un derivado del mismo (un agente farmacológico) que está unido o conjugado con un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo, como se describe en esta invención.
Un "enlazador" es cualquier resto químico capaz de unir un agente farmacológico descrito en esta invención (por ejemplo, compuestos de maitansinoide o (indolinobenzodiazepina)), a un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo de una forma covalente estable. Los enlazadores pueden ser susceptibles o ser sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasa, la escisión inducida por esterasa y la escisión de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo permanecen activos. Se conocen en la técnica enlazadores adecuados e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa y grupos lábiles a esterasa. Los enlazadores también incluyen enlazadores cargados y formas hidrofílicas de los mismos tal como se describe en esta invención y se conoce en la técnica.
"Alquilo " como se usa en esta invención se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturada de uno a veinte átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo, incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-1 -propilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1 -pentilo, 2-pentilo 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1 -butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo), 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, 1-heptilo, 1-octilo, y similares. Preferiblemente, el alquilo tiene uno a diez átomos de carbono. Más preferiblemente, el alquilo tiene de uno a cuatro átomos de carbono.
Se puede especificar el número de átomos de carbono en un grupo en esta invención mediante el prefijo "Cx-xx", donde x y xx son números enteros. Por ejemplo, "alquilo C1-4" es un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
El término "compuesto" o "compuesto c ito tóxico ," o "agente c ito tóxico " se utilizan de forma intercambiable. Estos pretenden incluir compuestos para los que se describe una estructura o fórmula o cualquier derivado de las mismas en la presente invención o una estructura o fórmula o cualquier derivado de las mismas que se incorpora por referencia. El término también incluye estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, solvatos, metabolitos y sales (por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables) de un compuesto de todas las fórmulas descritas en la presente invención. El término también incluye cualquier solvato, hidrato y polimorfo de cualquiera de los anteriores. No se debe interpretar la referencia específica a "estereoisómeros", "isómeros geométricos", "tautómeros", "solvatos", "metabolitos", "sal", "conjugados", "sal conjugada", "solvato", "hidrato" o "polimorfo" en determinados aspectos de la invención descritos en esta solicitud como una omisión voluntaria de dichas formas en otros aspectos de la invención en la que el término "compuesto" se utiliza sin referencia a dichas otras formas.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse a su imagen especular, mientras que el término "aquiral" hace referencia a moléculas que se superponen a su imagen especular.
El término "estereoisómero" se refiere a compuestos con constitución química idéntica y conectividad, pero diferentes orientaciones espaciales de sus átomos que no se pueden interconvertir mediante la rotación en torno a enlaces simples.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diasterómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Se pueden separar mezclas de diasterómeros mediante procedimientos analíticos de alta resolución tales como cristalización, electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones que se utilizan en esta invención siguen, generalmente, lo planteado por S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y por Eliel, E. y Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invención pueden contener centros quirales o asimétricos y, por lo tanto, existen en diferentes formas estereoisoméricas. Se pretende que formen parte de la presente invención todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, incluyendo diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de los mismos, tales como mezclas racémicas. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. Al describir un compuesto ópticamente activo, se utilizan los prefijos D y L o R y S para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Se utilizan los prefijos d y l o (+) y (-) para designar el signo de la rotación del plano de luz polarizada por el compuesto, y (-) o 1 indican que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo que son imágenes especulares uno del otro.
También se puede referir a un estereoisómero específico como un enantiómero, y, a menudo, se hace referencia a una mezcla de dichos isómeros como una mezcla enantiomérica. Se hace referencia a una mezcla 50:50 de enantiómeros como mezcla racémica o racemato, y esta puede surgir cuando una reacción o proceso químico no es estereoselectiva o estereoespecífica. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas sin actividad óptica.
Los términos "tautóm ero" o "forma tautomérica" se refieren a isómeros estructurales de energías diferentes que son interconvertibles a través de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros por transferencia de protones (también conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones a través de la migración de un protón, tal como isomerizaciones de ceto-enol e imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones mediante la reorganización de algunos de los electrones de enlace.
El término "reactivo que reacciona con imina" se refiere a un reactivo capaz de reaccionar con un grupo imina. Los ejemplos de reactivo que reacciona con imina incluyen sulfitos (H2SO3, H2SO2 o una sal de HSO3', SO32' o HSO2' formado con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52' formada con un catión), mono, di, tri, y tetratiofosfatos (PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de PO3S3', PO2S23', POS33' o PS43' formada con un catión), ésteres de tio fosfato ((RiO)2PS(ORi), RiSH, RSOH, RSO2H, RSO3H), varias aminas (hidroxil amina (por ejemplo, NH2OH), hidrazina (por ejemplo, NH2NH2), NH2O-Ri, Ri',NH-Ri, NH2-R'), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32' formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2'formada con un catión, tal como HOCH2SO2'Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, donde Ri y Ri' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de entre -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, y -PO3H; Ri y Ri' puede estar opcionalmente sustituido además con un sustituyente para un alquilo descrito en esta invención; Rj es alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferiblemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; más preferiblemente, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferiblemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+. Preferiblemente, el reactivo que reacciona con imina se selecciona de entre sulfitos, hidroxilamina, urea e hidrazina. Más preferiblemente, el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
El término "catión" se refiere a un ion con carga positiva. El catión puede ser monovalente (por ejemplo, Na+, K+, NH4+ etc.), bivalente (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, etc.) o multivalente (por ejemplo, A13+ etc.). Preferiblemente, el catión es monovalente
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en esta invención, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de la invención. Las sales ejemplares incluyen, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato "mesilato", etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, sales de pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio) y sales de amonio. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabilice la carga en el compuesto parental. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos donde los átomos con carga múltiple son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden presentar múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Si el compuesto es una base, se puede preparar la sal farmacéuticamente aceptable deseada mediante cualquier procedimiento adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, el tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, un ácido de piranosidilo, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfa hidroxiácido, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinnámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido etanosulfónico, o similares.
Si el compuesto es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, el tratamiento del ácido libre con una base orgánica o inorgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo, o similares. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
Como se usa en esta invención, el término "solvato" significa un compuesto que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente tal como agua, isopropanol, acetona, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y diclorometano de etanolamina, 2-propanol o similares, enlazados mediante fuerzas intermoleculares no covalentes. Los solvatos o hidratos de los compuestos se preparan fácilmente mediante la adición de al menos un equivalente molar de un disolvente hidroxílico tal como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol o agua al compuesto para dar como resultado la solvatación o hidratación del resto de imina.
Un "metabolito" o "catabolito" es un producto producido mediante catabolismo o metabolismo en el cuerpo de un compuesto específico, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, o una sal del mismo. Se puede identificar los metabolitos de un compuesto, un derivado del mismo o un conjugado del mismo mediante técnicas habituales conocidas en la técnica y determinar sus actividades mediante ensayos tales como los descritos en esta invención. Por ejemplo, tales productos pueden ser el resultado de la oxidación, hidroxilación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación, escisión enzimática y similares del compuesto administrado.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser química y/o toxicológicamente compatible con los otros ingredientes comprendidos en una formulación y/o el mamífero que se trata con los mismos.
El término "grupo protector" o "resto pro tector ' se refiere a un sustituyente que se emplea comúnmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular, al tiempo que se hacen reaccionar otros grupos funcionales del compuesto, un derivado del mismo o un conjugado del mismo. Por ejemplo, un "grupo protector de amina" o un "resto protector de amino" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Tales grupos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, P. W utsyT. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, capítulo 7, J. Wiley & Sons, NJ) y están ejemplificados por carbamatos tales como carbamato de metilo y etilo, FMOC, carbamatos de etilo sustituidos, carbamatos escindidos por eliminación de 1,6-p (también denominados "autoinmolativos"), ureas, amidas, péptidos, derivados de alquilo y arilo. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para encontrar una descripción general de grupos protectores y su uso, véase P. G.M. Wuts y T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 2007.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o aminoácido de origen no natural. En una realización, el aminoácido está representado por NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH, donde Raa y Raa' son cada uno independientemente H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo o heterociclilo o Raa y el átomo de nitrógeno N-terminal pueden formar conjuntamente un anillo heterocíclico (por ejemplo, como en prolina). El término "residuo de aminoácido" se refiere al residuo correspondiente cuando se elimina un átomo de hidrógeno del extremo amina y/o carboxi del aminoácido, tal como -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-.
El término "péptido" se refiere a cadenas cortas de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (amida). En una algunas realizaciones, los péptidos contienen de 2 a 20 residuos de aminoácidos. En otras realizaciones, los péptidos contienen de 2 a 10 residuos de aminoácidos. En otras realizaciones más, los péptidos contienen de 2 a 5 residuos de aminoácidos. Como se usa en esta invención, cuando un péptido es una porción de un agente citotóxico o un enlazador descrito en esta invención representado por una secuencia específica de aminoácidos, el péptido se puede conectar al resto del agente citotóxico o al enlazador en ambas direcciones. Por ejemplo, un dipéptido X1-X2 incluye X1-X2 y X2-X1. De manera similar, un tripéptido X1-X2-X3 incluye X1-X2-X3 y X3-X2-X1 y un tetrapéptido X1-X2-X3-X4 incluye X1-X2-X3-X4 y X4-X2-X3-X1. X1, X2, X3 y X4 representan un residuo de aminoácido.
El término "grupo éster reactivo" se refiere a un grupo de un grupo éster que puede reaccionar fácilmente con un grupo amina para formar un enlace amida. Los grupos éster reactivos ejemplares incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxisulfosuccinimida, ésteres de para-nitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo y sus derivados, donde dichos derivados facilitan la formación de enlaces amida. En determinadas realizaciones, el grupo éster reactivo es un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster N-hidroxisulfosuccinimida.
La expresión "grupo reactivo a amina" se refiere a un grupo que puede reaccionar con un grupo amina para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos a amina ejemplares incluyen grupos éster reactivos, haluros de acilo, haluros de sulfonilo, imidoéster o grupos tioéster reactivos. En determinadas realizaciones, el grupo reactivo a amina es un grupo éster reactivo. En una realización, el grupo reactivo a amina es un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster de N-hidroxisulfosuccinimida.
La expresión "grupo reactivo a tio l" se refiere a un grupo que puede reaccionar con un grupo tiol (-SH) para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos a tiol ejemplares incluyen maleimida, haloacetilo, aloacetamida, vinilsulfona, vinilsulfonamida o vinilpiridina. En una realización, el grupo reactivo a tiol es maleimida.
Como se usa en la presente descripción y las reivindicaciones, las formas singulares "un ," "una" y "el/la" incluyen las formas en plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.
Se entiende que siempre que se describan realizaciones en esta invención con la expresión "que comprende", también se proveen realizaciones análogas de cualquier otra manera descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
A. Inmunoconjugados ejemplares
La presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo (como se define en esta invención) conjugado con al menos un agente farmacológico. Los agentes farmacológicos incluyen, pero sin limitación, citotoxinas (porejemplo, un agente citostático o citocida), agentes terapéuticos e iones metálicos radiactivos, por ejemplo, emisores alfa. Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células tales como, por ejemplo, exotoxina de Pseudomonas, toxina diftérica, una toxina botulínica A a F, ricina, abrina, saporina y fragmentos citotóxicos de tales agentes. Los agentes terapéuticos incluyen cualquier agente que tenga un efecto terapéutico para tratar profiláctica o terapéuticamente un trastorno. Dichos agentes terapéuticos pueden ser agentes terapéuticos químicos, agentes terapéuticos de proteínas o polipéptidos, e incluyen agentes terapéuticos que poseen una actividad biológica deseada y/o modifican una determinada respuesta biológica. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen agentes alquilantes, inhibidores de la angiogénesis, agentes antimitóticos, agentes de terapia hormonal y anticuerpos útiles para el tratamiento de trastornos de proliferación celular. En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos son compuestos de maitansinoides, tales como los descritos en las patentes de los EE.UU. n.° 5208 020 y 7276 497. En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos son compuestos de benzodiazepina, tal como pirrolobenzodiazepina (PBD) (tales como los descritos en los documentos WO2010/043880, WO2011/130616, WO2009/016516, WO 2013/177481 y WO 2012/112708) y compuestos de indolinobenzodiazepina (IGN) (tales como los descritos en los documentos WO/2010/091150y WO 2012/128868 y la solicitud de los EE.UU. n.° 15/195 269, depositada el 28 de junio de 2016, titulada "CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES" ("CONJUGADOS DE ANTICUERPOS DISEÑADOS POR INGENIERÍA CON CISTEÍNA").
Como se usa en esta invención, un compuesto de "pirrolobenzodiazepina" (PBD) es un compuesto que tiene una estructura de núcleo de pirrolobenzodiazepina. La pirrolobenzodiazepina puede estar sustituida o no sustituida. También incluye un compuesto que tiene dos núcleos de pirrolobenzodiazepina unidos por un enlazador. La funcionalidad imina (-C=N-) como parte del núcleo de indolinobenzodiazepina se puede reducir.
En determinadas realizaciones, el compuesto de pirrolobenzodiazepina comprende una estructura central representada por
Figure imgf000046_0001
que puede estar opcionalmente sustituida.
En determinadas realizaciones, los compuestos de pirrolobenzodiazepina comprenden una estructura central representada por
Figure imgf000046_0002
que puede estar opcionalmente sustituida.
Como se usa en esta invención, un compuesto de "indolinobenzodiazepina" (IGN) es un compuesto que tiene una estructura de núcleo de indolinobenzodiazepina. La indolinobenzodiazepina puede estar sustituida o no sustituida. También incluye un compuesto que tiene dos núcleos de indolinobenzodiazepina unidos por un enlazador. La funcionalidad imina (-C=N-) como parte del núcleo de indolinobenzodiazepina se puede reducir.
En determinadas realizaciones, el compuesto de indolinobenzodiazepina comprende una estructura central representada por
Figure imgf000047_0001
que puede estar opcionalmente sustituida.
En algunas realizaciones, el compuesto de indolinobenzodiazepina comprende una estructura central representada por
Figure imgf000047_0002
que puede estar sustituida adicionalmente.
El agente farmacológico puede acoplarse o conjugarse directamente con el anticuerpo anti-ADAM9 o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo o indirectamente, a través de un enlazador utilizando técnicas conocidas en la técnica para producir un "inmunoconjugado", "conjugado" o "ADC".
En una primera realización, el inmunoconjugado de la presente invención comprende un anticuerpo antiADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención unido de forma covalente a un agente farmacológico descrito en esta invención mediante el grupo amino £ de uno o más residuos de lisina ubicados en el anticuerpo antiADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo.
En una 1a realización específica de la primera realización, el inmunoconjugado de la presente invención se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000047_0003
( L l) ,
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención anteriormente que está unido covalentemente a CyL1 a través de un residuo de lisina;
WL es un número entero entre 1 y 20; y
CyL1 es un compuesto citotóxico representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000048_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(Ci-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
- NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)-(B1'); o
- NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1-(B2');
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son cada uno independientemente -H, alquilo(C1-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
m es un número entero entre 1 y 6; y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000049_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5.
En una 2a realización específica, para los conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado mediante la fórmula (L1a) o (L1a1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a realización específica.
En una 3a realización específica, para los conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado mediante la fórmula (L1b) o (L1b1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a realización específica. Más específicamente, Rx3 es un alquilo(C2-C4).
En una 4a realización específica, para los conjugados de fórmula (L1), CyL1 está representado mediante la fórmula (L1a); Ra y Rb son ambos H; R5 es H o Me, y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a realización específica.
En una 5a realización específica, P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables se han descrito anteriormente en la 1a, 2a o 4a realización específica. En una realización más específica, P se selecciona de entre el grupo que consiste en Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met­ Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe y Gln-Ala. Más específicamente, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 6a realización específica, Q es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el resto de las variables son como se han descrito anteriormente en la 1a, 2a, 4a o 5a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 7a realización específica, el inmunoconjugado de la primera realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde Wl es un número entero entre 1 y 10; la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H; y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una 8a realización específica, el inmunoconjugado de la primera realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000057_0002
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención anteriormente que está unido covalentemente a CyL2 a través de un residuo de lisina;
WL es un número entero entre 1 y 20; y
CyL2 es un compuesto citotóxico representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000058_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
Rx1 y Rx2 son independientemente alquilo(C1-C6);
Re es-H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000058_0002
y
Figure imgf000059_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5.
En una 9a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L2), CyL2 está representado mediante la fórmula (L2a) o (L2a1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 8a realización específica. En una 10a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L2), CyL2 está representado mediante la fórmula (L2b) o (L2b1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 8a realización específica. En una 11a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L2), Re es H o Me; Rx1 y Rx2 son independientemente -(CH2)p-(CRfRg)-, donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o un alquilo (Ci-C4) y p es 0, 1,2 o 3; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 8a, 9a o 10a realización específica. Más específicamente, Rfy Rgson iguales o diferentes, y se seleccionan de entre -H y -Me.
En una 12a realización específica, el inmunoconjugado de la primera realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde WL es un número entero entre 1 a 10; la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H; y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace doble. En otra realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una 13a realización específica, los inmunoconjugados de la primera realización se representan mediante la siguiente fórmula:
CBA 4— CyL3
WL (L3),
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención anteriormente que está unido covalentemente a CyL3 a través de un residuo de Lys;
WL es un número entero entre 1 y 20;
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000061_0002
m' es 1 o 2;
Ri y R2, son cada uno independientemente H o un alquilo(Ci-C3); y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000062_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5
En una 14a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L3), m' es i , y Ri y R2 son ambos H; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 13a realización específica.
En una 15a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (L3), m' es 2, y R1 y R2 son ambos Me; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 13a realización específica.
En una 16a realización específica, los inmunoconjugados de la primera realización se representan mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde Wl es un número entero entre 1 y 10.
En una 17a realización específica, para los inmunoconjugados de la primera realización, Y es -SO3H, -SO3Na o -SO3K, y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de la 1a a 16a realización específica o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma. En una realización, Y es -SO3Na.
En determinadas realizaciones, para composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden inmunoconjugados de la primera realización, o la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a, 13a, 14a, 15a, 16a o 17a realización específica, el número promedio de agente citotóxico por molécula de anticuerpo (es decir, el valor promedio de wL), también conocido como la relación fármaco-anticuerpo (DAR) en la composición está en el intervalo de 1,0 a 8,0. En algunas realizaciones, DAR está en el intervalo de 1,0 a 5,0, de 1,0 a 4,0, de 1,0 a 3,4, de 1,0 a 3,0, de 1,5 a 2,5, de 2,0 a 2,5 o de 1,8 a 2,2. En algunas realizaciones, el DAR es inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,5, inferior a 3,0 o inferior a 2,5.
En una segunda realización, los inmunoconjugados de la presente invención comprenden un anticuerpo antiADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención unido de forma covalente a un agente citotóxico descrito en esta invención mediante el grupo tiol (-SH) de uno o más residuos de cisteína ubicados en el anticuerpo antiADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo.
En una 1a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA-f— Cyc1)
Wc ( C l ) .
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención unido covalentemente a CyC1 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000064_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(C1-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son independientemente -H, alquilo(C1-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(Ci-C6); y,
LC se representa mediante
Figure imgf000065_0001
donde s1 es el sitio unido covalentemente a CBA, y s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -C (=O)- en CyC1; donde:
R19 y R20, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
m" es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo(C1-C3).
En una 2a realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 está representado mediante la fórmula (C1a) o (C1a1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a realización específica de la segunda realización.
En una 3a realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 está representado mediante la fórmula (C1b) o (C1b1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a realización específica de la segunda realización.
En una 4a realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), CyC1 está representado mediante la fórmula (C1a) o (C1a1); Ra y Rb son ambos H; y R5 es H o Me; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a o 2a realización específica de la segunda realización.
En una 5a realización específica, para el inmunoconjugado de fórmula (C1), P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a, 2a o 4a realización específica. En una realización más específica, P se selecciona de entre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, phe-N9-tosil-Arg, phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe y Gln-Ala. En otra realización más específica, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 6a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), Q es-SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el resto de las variables son como se han descrito anteriormente en la 1a, 2a, 4a o 5a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 7a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), R19 y R20 son ambos H; y m" es un número entero entre 1 y 6; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a o 6a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 8a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C1), -L-Lc- está representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000065_0002
y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a o 7a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 9a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000066_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una 10a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA - f— CyC2)
7wc (C2),
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención anteriormente unido covalentemente a CyC2 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000067_0001
,
o
Figure imgf000068_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
Rx1 es un alquilo(C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe’;
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
R x2 es un alquilo(Ci-C6);
Le' se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000068_0002
donde:
s i es el sitio unido covalentemente al CBAy s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -S- en Cye2;
Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos.
En una realización más específica, q y r son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero entre 1 y 3. Aún más específicamente, R10, R11, R12 y R13 son todos H.
En otra realización más específica, m y n son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero entre 1 y 3. Aún más específicamente, Ri9, R20, R2i y R22 son todos H.
En una 11a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), CyC2 está representado mediante la fórmula (C2a) o (C2a1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 10a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 12a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), CyC2 está representado mediante la fórmula (C2b) o (C2b1); y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 10a realización específica de la segunda realización.
En una 13a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables son como se describen en la 10a, 11a o 12a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma. En una realización más específica, P' se selecciona de entre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe y Gln-Ala. En otra realización más específica, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 14a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C2), -Lc'- se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000069_0001
En una 15a realización específica, para los inmunoconjugados de (C2), Re es H o Me; Rx1 es -(CH2)p-(CRfRg)- y Rx2 es -(CH2)p-(CRfRg)-, donde Rf y Rg son cada uno independientemente -H o un alquilo (C1-C4); y p es 0, 1, 2 o 3; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 10a, 11a, 12a, 13a o 14a realización específica de la segunda realización. Más específicamente, Rfy Rgson iguales o diferentes, y se seleccionan de entre -H y -Me.
En una 16a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H y cuando sea un enlace simple, X sea -H e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace doble, X está ausente e Y es -H. En otra realización específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una 17a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
CBA-f— Cyc3)
Wc(C3),
donde:
CBA es un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención anteriormente unido covalentemente a CyC3 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC3 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000072_0001
donde:
m' es 1 o 2;
R1 y R2, son cada uno independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
LC' se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000072_0002
donde:
s1 es el sitio unido covalentemente al CBA y s2 es el sitio unido covalentemente al grupo -S- en CyC3;
Z es C(=O)-NRg- o -NRg-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
Rg, R10, R11, Ri2, Ri 3, Rig, R2o, R2i y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(Ci-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos.
En una realización más específica, q y r son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero entre 1 y 3. Aún más específicamente, R10, R11, R12 y R13 son todos H.
En otra realización más específica, m y n son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 6, más específicamente, un número entero entre 1 y 3. Aún más específicamente, R1g, R20, R21 y R22 son todos H.
En una 18a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), P' es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 17a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma. En una realización más específica, P' se selecciona de entre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe y Gln-Ala. En otra realización más específica, P' es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala o D-Ala-D-Ala.
En una 19a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), -Lc'- se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000073_0001
donde M es H+ o un catión; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 17a o 18a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 20a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), m' es 1 y Ri y R2 son ambos H; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 17a, 18a o 19a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 21a realización específica, para los inmunoconjugados de fórmula (C3), m' es 2 y R1 y R2 son ambos Me; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en la 17a, 18a o 19a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una 22a realización específica, el inmunoconjugado de la segunda realización se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000073_0002
o
Figure imgf000074_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde DM es un resto de fármaco representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000074_0002
En una 23a realización específica, para los inmunoconjugados de la segunda realización, Y es -SO3H, -SOsNa o -SO3K; y el resto de variables son como se describen en cualquiera de las realizaciones específicas 1a a 22a de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma. En una realización, Y es -SO3Na.
C. Moléculas enlazadoras ejemplares
Cualquier enlazador adecuado conocido en la técnica se puede usar para preparar los inmunoconjugados de la presente invención. En determinadas realizaciones, los enlazadores son enlazadores bifuncionales. Como se usa en esta invención, el término "enlazador bifuncional" se refiere a agentes modificadores que poseen dos grupos reactivos; uno de los cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión a células, mientras que el otro reacciona con el compuesto citotóxico para unir los dos restos entre sí. Dichos reticuladores bifuncionales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Isalm y Dent en Bioconjugation, capítulo 5, págs 218-363, Groves Dictionaries Inc. Nueva York, 1999). Por ejemplo, los agentes de reticulación bifuncionales que permiten la unión a través de un enlace de tioéter incluyen N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) para introducir grupos maleimido o con N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. Otros agentes reticuladores bifuncionales que introducen grupos maleimido o grupos haloacetilo en un agente de unión a células son bien conocidos en la técnica (véanse las solicitudes de patente de los EE.UU. n.° 2008/0050310, 20050169933, disponible en Pierce Technology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, EE.UU.) e incluyen bismaleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, éster de N-(P-maleimidopropiloxi)succinimida (BMPS), éster de N-succinimidilo de ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida de ácido £-maleimidocaproico (EMCS), NHS de ácido 5-maleimidovalérico, HBVS, N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un análogo de “cadena larga” de SMCC (LC-SMCC), éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (m Bs ), hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico o la sal de HCl (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), éster de N-succinimidilo de ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), 4-(p-maleimidofenil)-butirato de N-succinimidilo (SMPB), succinimidil-6-(P-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobismaleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBs), éster de N-(y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimda (sulfo-GMBS), éster de N-(£-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido (sulfo-EMCS), éster de N-(kmaleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida (sulfo-KMUS) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB).
Los agentes de reticulación heterobifuncionales son agentes de reticulación bifuncionales que tienen dos grupos reactivos diferentes. Los agentes de reticulación heterobifuncionales que contienen un grupo N-hidroxisuccinimida reactivo a amina (grupo NHS) y un grupo hidrazina reactivo a carbonilo también se pueden utilizar para unir los compuestos citotóxicos descritos en esta invención con un agente de unión celular (por ejemplo, un anticuerpo). Los ejemplos de dichos agentes de reticulación heterobifuncionales disponibles en el mercado incluyen hidrazona de acetona de 6-hidrazinonicotinamida de succinimidilo (SANH), clorhidrato de 4-hidrazidotereftalato de succinimidilo (SHTH) y clorhidrato de nicotinato de hidrazinio de succinimidilo (SHNH). Los conjugados que poseen un conector lábil en ácido también se pueden preparar utilizando un derivado de benzodiazepina que posee hidrazina de la presente invención. Los ejemplos de agentes de reticulación bifuncionales que se pueden utilizar incluyen benzoato de succinimidil-p-formilo (SFB) y succinimidil-p-formilfenoxiacetato (SFPA).
Los agentes de reticulación bifuncionales que permiten la unión del agente de unión a células con compuestos citotóxicos mediante enlaces disulfuro se conocen en la técnica e incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (Sp DB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo. En la técnica se conocen otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro y se describen en las patentes de los EE.UU. 6 913 748, 6 716 821 y en las publicaciones de patentes de los EE.UU. 20090274713 y 20100129314. Alternativamente, también se pueden utilizar agentes de reticulación tales como 2-iminotiolano, tiolactona de homocisteína o anhídrido S-acetilsuccínico que introducen grupos tiol.
En determinadas realizaciones, los enlazadores bifuncionales están representados por cualquiera de las fórmulas (a1L) -(a10L) descritas a continuación.
D. Agentes farmacológicos ejemplares
1. Maitansinoide
En determinadas realizaciones, el agente farmacológico es un compuesto de maitansinoide, tales como los descritos en las patentes de los EE.UU. n.° 5 208 020 y 7 276 497. En determinadas realizaciones, el compuesto de maitansinoide se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000075_0001
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de las realizaciones específicas 13a a 17a de la primera realización anterior y cualquiera de las realizaciones más específicas descrita en la misma.
En una realización más específica, el compuesto maitansinoide es DM4:
Figure imgf000075_0002
En otra realización, el compuesto maitansinoide es DM1:
Figure imgf000075_0003
2. Benzodiazepina
En determinadas realizaciones, el agente farmacológico es un compuesto de benzodiazepina, tal como pirrolobenzodiazepina (PBD) (tales como los descritos en los documentos WO2010/043880, WO2011/130616, WO2009/016516, WO 2013/177481 y WO 2012/112708) y compuestos de indolinobenzodiazepina (IGN) (tales como los descritos en los documentos wO/2010/091150y w O 2012/128868 y la solicitud de los EE.UU. n.° 15/195 269, depositada el 28 de junio de 2016, titulada "CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES" ("CONJUGADOS DE ANTICUERPOS DISEÑADOS POR INGENIERÍA CON CISTEÍNA"). Como se usa en esta invención, un compuesto de "benzodiazepina" es un compuesto que tiene una estructura de núcleo de benzodiazepina. El núcleo de benzodiazepina puede estar sustituido o no sustituido, y/o fusionado con una o más estructuras de anillo. También incluye un compuesto que tiene dos núcleos de benzodiazepina unidos por un enlazador. La funcionalidad imina (-C=N-) como parte del núcleo de benzodiazepina se puede reducir.
Como se usa en esta invención, un compuesto de "pirrolobenzodiazepina" (PBD) es un compuesto que tiene una estructura de núcleo de pirrolobenzodiazepina. La pirrolobenzodiazepina puede estar sustituida o no sustituida. También incluye un compuesto que tiene dos núcleos de pirrolobenzodiazepina unidos por un enlazador. La funcionalidad imina (-C=N-) como parte del núcleo de indolinobenzodiazepina se puede reducir.
En determinadas realizaciones, el agente farmacológico es un compuesto de indolinobenzodiazepina representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000077_0001
una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
Lc’ se representa mediante la siguiente fórmula:
- NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (B1); o
- NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B2)
C (=O) E es un grupo éster reactivo, tal como éster de N-hidroxisuccinimida, ésterde N-hidroxisulfosuccinimida, éster de nitrofenilo (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo), éster de dinitrofenilo (por ejemplo, 2,4-dinitrofenilo), éster de sulfotetrafluorofenilo (porejemplo, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo) o ésterde pentafluorofenilo, preferiblemente ésterde N-hidroxisuccinimida;
Zs se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000078_0001
donde:
q es un número entero entre 1 y 5; y
U e s - H o SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el resto de variables son como se describen en cualquiera de las realizaciones específicas 1a a 12a y 17a de la primera realización descrita anteriormente o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En determinadas realizaciones, el agente farmacológico es un compuesto de indolinobenzodiazepina representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000078_0002
Figure imgf000079_0001
una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
— LCc para las fórmulas (C1a'), (C1a'1), (C1b') y (C1b'1) se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000080_0001
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de las realizaciones específicas 1a a 9a y 23a de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma; y
LCc' para las fórmulas (C2a’'), (C2a'’1), (C2b'’) y (C2b'’1) se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000080_0002
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de la 10a a 16a y 23a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En determinadas realizaciones, el agente farmacológico es un compuesto de indolinobenzodiazepina de cualquiera de los siguientes o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos:
Figure imgf000080_0003
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0002
Los compuestos D1, sD1, D2, sD2, DGN462, sDGN462, D3 y sD3 que se muestran anteriormente se pueden preparar según los procedimientos descritos en las patentes de los EE.UU. n.° 9381 256, 8765 740, 8426 4O2 y 9353 127 y la publicación de solicitud de los EE.UU. US2016/0082114.
En determinadas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable de los compuestos mostrados anteriormente (por ejemplo, sD1, sD2, sD4, sDGN462, sD3, sD4, sD5, sD5', sD6 o sD7) es una sal de sodio o potasio. Más específicamente, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio.
En una realización específica, el agente farmacológico está representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000083_0001
o
Figure imgf000084_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización específica, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio.
En otra realización específica, el agente farmacológico se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000084_0002
IV. Procedimientos de producción
Los anticuerpos anti-ADAM9 y los fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos de la presente invención se producen lo más preferiblemente a través de la expresión recombinante de moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos, como es bien conocido en la técnica.
Los polipéptidos de la invención pueden prepararse convenientemente utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis", Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids" ("Procedimiento general para la síntesis rápida en fase sólida de grandes cantidades de péptidos: especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo al nivel de aminoácidos individuales"), Proc. Natl. Acad. Sci (EE.Uu) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century" ("Síntesis de fase sólida en el siglo XXI"), Mini Rev. Med. Chem 6(1):3-10).
Como alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante y expresarse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante aislando primero los anticuerpos fabricados a partir de animales huéspedes, obteniendo la secuencia del gen y usando la secuencia del gen para expresar el anticuerpo de forma recombinante en células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que puede emplearse es expresar la secuencia del anticuerpo en plantas {por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descrito procedimientos adecuados para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche (véase, por ejemplo, Peeters y col. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants" ("Producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en plantas"), Vaccine 19:2756; Lonberg, N. y col. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice" ("Anticuerpos humanos de ratones transgénicos"), Int. Rev. Inmunol 13:65-93; y Pollock y col. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies" ("Leche transgénica como procedimiento para la producción de anticuerpos recombinantes"), J. Immunol Methods 231:147-157). Los procedimientos adecuados para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, monocatenarios, etc., son conocidos en la técnica y se han descrito anteriormente. En otra alternativa, los anticuerpos se pueden preparar de forma recombinante mediante la tecnología de presentación de fagos (véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.° 5565332; 5580 717; 5733 743; 6265 150; y Winter, G. y col. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology" ("Fabricación de anticuerpos mediante tecnología de presentación de fagos"), Annu. Rev. Inmunol. 12.433-455).
Los vectores que contienen polinucleótidos de interés (por ejemplo, polinucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos anti-ADAM9 y los fragmentos de unión a ADAM9 de los mismos de la presente invención) pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de varios medios apropiados, que incluyen electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos a menudo dependerá de las características de la célula huésped.
Cualquier célula huésped capaz de sobreexpresar ADN heterólogos puede usarse con el fin de expresar un polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células COS, HeLa y CHO.
La invención incluye inmunoconjugados que comprenden una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo de esta invención. Los polipéptidos de esta invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos se pueden producir mediante degradación proteolítica u otra de los anticuerpos, mediante procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión) como se ha descrito anteriormente o mediante síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se preparan convenientemente mediante síntesis química. Los procedimientos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado.
La modificación de polipéptidos es una práctica habitual en la técnica y no es necesario describirla en detalle en esta invención. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional, o el uso de análogos químicos. Los residuos de aminoácidos que se pueden sustituir de forma conservadora entre sí incluyen: glicina/alanina; serina/treonina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos serían conservativas, es decir, el aminoácido sustituido tendría propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales sustituciones conservadoras son conocidas en la técnica, y anteriormente se han proporcionado ejemplos. Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde cambiar o modificar uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como el dominio variable. Los cambios en el dominio variable pueden alterar la afinidad de unión y/o especificidad. Otros procedimientos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden usar modificaciones, por ejemplo, para la unión de etiquetas para inmunoensayo, tal como la unión de restos radiactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos modificados se preparan utilizando procedimientos establecidos en la técnica y pueden seleccionarse utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica.
La invención abarca inmunoconjugados que comprenden proteínas de fusión que poseen uno o más de los anti-ADAM9-VLy/o VH de esta invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende una cadena ligera, una cadena pesada o tanto una cadena ligera como una pesada. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado públicamente. Para los fines de esta invención, una proteína de fusión de anticuerpos contiene uno o más dominios polipeptídicos que se unen específicamente a ADAM9 y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región.
V. Conjugación de fármacos
Los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo unido covalentemente a un agente farmacológico a través del grupo £-amino de uno o más residuos de lisina ubicados en el anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en la primera realización anterior o cualquiera de las realizaciones específicas descritas en la misma se puede preparar según cualquiera de los procedimientos conocido en la técnica, véase, por ejemplo, los documentos WO 2012/128868 y WO2012/112687. En determinadas realizaciones, es posible preparar los inmunoconjugados de la primera realización mediante un primer procedimiento que comprende las etapas de hacer reacciónar el CBA con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a amina.
En una realización, para el primer procedimiento descrito anteriormente, la reacción se lleva a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina, tal como NaHSO3.
En una realización, para el primer procedimiento descrito anteriormente, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a imina se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000086_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde las definiciones de las variables se han descrito anteriormente para las fórmulas (L1a'), (L1a'1), (L1b') y (L1b'1).
En determinadas realizaciones, es posible preparar los inmunoconjugados de la primera realización mediante un segundo procedimiento que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar el agente citotóxico con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo a amina y un grupo reactivo a tiol para formar un compuesto de agente citotóxico y enlazador con el grupo reactivo a amina enlazado al mismo; y
(b) hacer reaccionar el CBA con el compuesto de agente citotóxico y enlazador.
En una realización, para el segundo procedimiento descrito anteriormente, la reacción en la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina (por ejemplo, NaHSOs).
En una realización, para el segundo procedimiento descrito anteriormente, el compuesto de agente citotóxico y enlazador se hace reaccionar con el CBA sin purificación. De manera alternativa, en primer lugar, se purifica el compuesto de agente citotóxico y enlazador antes de hacer reacción con el CBA.
En determinadas realizaciones, es posible preparar los inmunoconjugados de la primera realización mediante un tercer procedimiento que comprende las etapas de:
(a) hacer reaccionar el CBA con un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo a amina y un grupo reactivo a tiol para formar un CBA modificado con un grupo reactivo a tiol enlazado al mismo; y
(b) hacer reaccionar el CBA modificado con el agente citotóxico.
En una realización, para el tercer procedimiento descrito anteriormente, la reacción en la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un reactivo que reacciona con imina (por ejemplo, NaHSO3).
En determinadas realizaciones, es posible preparar los inmunoconjugados de la primera realización mediante un cuarto procedimiento que comprende las etapas de hacer reacciónar el CBA, un compuesto citotóxico y un compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo a amina y un grupo reactivo a tiol.
En una realización, para el cuarto procedimiento, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente que reacciona con imina (por ejemplo, NaHSO3).
En determinadas realizaciones, para el segundo, tercer o cuarto procedimiento, descritos anteriormente, el compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo a amina y un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000087_0001
donde X es halógeno; JD -SH, -SSRd, o -SC(=O)Rg; Rdes fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; Rges un alquilo; y el resto de variables son como se han descrito anteriormente para la fórmula (a1) -(a10); y el agente citotóxico se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000088_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde las variables son como se han descrito anteriormente para las fórmulas (L1a'), (L1a'1), (L1b'), (L1b'1), (L2a'), (L2a'1), (L2b') y (L2b'1).
En determinadas realizaciones, para los procedimientos segundo, tercero o cuarto descritos anteriormente, el compuesto enlazador que tiene un grupo reactivo a amina y un grupo reactivo a tiol está representado por cualquiera de las fórmulas (a1L) -(a10L) y el agente citotóxico se representa mediante lo siguiente fórmula:
Figure imgf000088_0002
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de las realizaciones específicas 13a a 17a de la primera realización descrita anteriormente y cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una realización específica, para los procedimientos segundo, tercero o cuarto descritos anteriormente, el enlazador es sulfo-SPDB, el agente citotóxico es DM4 y el inmunoconjugado se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000089_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde WL es un número entero entre 1 y 10.
Los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo unido covalentemente a un agente citotóxico a través del grupo tiol (-SH) de uno o más residuos de cisteína ubicados en el anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo como se describe en la segunda realización anterior (por ejemplo, los inmunoconjugados de cualquiera de las realizaciones específicas 1a a 23a o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma) se pueden preparar haciendo reaccionar el CBA que tiene una o más cisteínas libres con un agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol descrito en esta invención. En una realización preferida de la invención, los inmunoconjugados de la presente invención poseen una región Fc de IgG variante que comprende un residuo de cisteína adicional, para permitir la conjugación de un agente farmacológico con dicha molécula (por ejemplo, SEQ ID NO: 79 y 80).
En una realización, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde -LCc se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000090_0001
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de las realizaciones específicas 1a a 9a y 23a de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En otra realización, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000090_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde LCc’ se representa mediante la siguiente fórmula: o
Figure imgf000091_0001
donde las variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de la 10a a 16a y 23a realización específica de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En otra realización más, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000091_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde Lcc ‘se ha descrito anteriormente y el resto de variables son como se han descrito anteriormente en cualquiera de las realizaciones específicas 17a a 23a de la segunda realización o cualquiera de las realizaciones más específicas descritas en la misma.
En una realización específica, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000091_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
En otra realización específica, el agente citotóxico que tiene un grupo reactivo a tiol se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000092_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
En determinadas realizaciones, se utilizan los disolventes orgánicos en la reacción del CBAy el agente citotóxico para solubilizar el agente citotóxico. Los disolventes orgánicos ejemplares incluyen dimetilacetamida (DMA), propilenglicol, etc. En una realización, la reacción del CBAy el agente citotóxico se lleva a cabo en presencia de DMA y propilenglicol. En una realización específica, el agente citotóxico representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000092_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, se hace reaccionar con un CBA (por ejemplo, un anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión aADAM9 del mismo) para formar el inmunoconjugado representado mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000092_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H, y cuando sea un enlace simple, X sea -H, e Y sea -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y WC es 1 o 2. En una realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e Y es -H. En otra realización más específica, la línea doble
entre N y C representa un enlace simple, X es -H e Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Aún más específicamente, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio.
En determinadas realizaciones, cuando Y es -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, los inmunoconjugados se pueden preparar (a) haciendo reaccionar el resto imina en el agente citotóxico que contiene imina que tiene un grupo reactivo a tiol descrito anteriormente (es decir, la fórmula (C1a'), (C1a'1), (C1b'), (C1b'1), (C2a"), (C2a"1), (C2b") o (C2b"1), donde la línea doble
entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e Y es -H) con un dióxido de azufre, sal de bisulfito o sal de metabisulfito en una solución acuosa a un pH de 1,9 a 5,0 para formar un agente citotóxico modificado que comprende un resto de imina modificado representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000093_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; y (b) hacer reaccionar el agente citotóxico modificado con el anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención para formar el inmunoconjugado.
En un 1° aspecto, para el procedimiento descrito anteriormente, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 1,9 a 5,0. Más específicamente, el pH es de 2,5 a 4,9, de 1,9 a 4,8, de 2,0 a 4,8, de 2,5 a 4,5, de 2,9 a 4,5, de 2,9 a 4,0, de 2,9 a 3,7, de 3,1 a 3,5 o de 3,2 a 3,4. En otra realización específica, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o 5,0. En otra realización específica más, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 3,3.
Como se usa en esta invención, un valor de pH específico significa el valor específico ± 0,05.
En algunas realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de una solución tampón. Cualquier solución tampón adecuada conocida en la técnica se puede utilizar en los procedimientos de la presente invención. Las soluciones tampón adecuadas incluyen, por ejemplo, un tampón de citrato, un tampón de acetato, un tampón de succinato, un tampón de fosfato, un tampón que contiene glicina (por ejemplo, tampón de glicina-HCl), un tampón de ftalato (por ejemplo, una solución tampón que comprende hidrogenoftalato de sodio o potasio), y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la solución tampón es un tampón de fosfato. En algunas realizaciones, la solución tampón es un tampón de fosfato. En algunas realizaciones, el tampón es un tampón de citrato-fosfato. En algunas realizaciones, el tampón es un tampón de citrato-fosfato que comprende ácido cítrico y Na2HPO4. En otras realizaciones, el tampón es un tampón de citrato-fosfato que comprende ácido cítrico y K2HPO4. En algunas realizaciones, la concentración de la solución tampón descrita anteriormente puede estar en el intervalo de 10 a 250 mM, de 10 a 200 mM, de 10 a 150 mM, de 10 a 100 mM, de 25 a 100 mM, de 25 a 75 mM, de 10 a 50 mM o de 20 a 50 mM.
En un 2° aspecto, la etapa de reacción (a) se lleva a cabo en ausencia de una solución tampón (por ejemplo, los tampones descritos en el 1° aspecto). En algunas realizaciones, el presente procedimiento comprende las etapas de: (a) hacer reaccionar el resto imina en el agente citotóxico que contiene imina que tiene un grupo reactivo a tiol descrito anteriormente (es decir, la fórmula (C1a'), (C1a'1), (C1b'), (C1b'1), (C2a"), (C2a"1), (C2b") o (C2b"1), donde la línea doble
entre N y C representa un doble enlace, X está ausente e Y es -H) con dióxido de azufre, una sal de bisulfito o una sal de metabisulfito en una solución acuosa para formar un agente citotóxico modificado que comprende un resto de imina modificado representado mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde la solución acuosa no comprende un tampón; y (b) hacer reaccionar el agente citotóxico modificado con el anticuerpo anti-ADAM9 o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo descrito en esta invención para formar el inmunoconjugado. En algunas realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en una mezcla de un disolvente orgánico y agua. Más específicamente, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en una mezcla de dimetilacetamida (DMA) y agua. En algunas realizaciones, la mezcla de DMA y agua comprende menos del 60 % de DMA en volumen. Aún más específicamente, la relación de volumen de DMA y agua es 1:1.
En un 3° aspecto, para los procedimientos descritos anteriormente o en el 1° o 2° aspecto, se utilizan de 0,5 a 5,0 equivalentes de la sal de bisulfito o de 0,25 o 2,5 equivalentes de la sal de metabisulfito por cada 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina en la reacción de la etapa (a). En algunas realizaciones, se usan de 0,5 a 4,5, de 0,5 a 4,0, de 0,5 a 3,5, de 0,5 a 4,0, de 0,5 a 3,5, de 0,5 a 3,0, de 0,5 a 2,5, de 0,8 a 2,0, de 0,9 a 1,8, de 1,0 a 1,7, de 1,1 a 1,6 o de 1,2 a 1,5 equivalentes de la sal de bisulfito o de 0,25 a 2,25, de 0,25 a 2,0, de 0,25 a 1,75, de 0,25 a 2,0, de 0,25 a 1,75, de 0,25 a 1,5, de 0,25 a 1,25, de 0,4 a 1,0, de 0,45 a 0,9, de 0,5 a 0,85, de 0,55 a 0,8 o de 0,6 a 0,75 equivalentes de la sal de metabisulfito por cada 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones, se usan 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,31,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2.7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 equivalentes de la sal de bisulfito o 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1.7, 1,75, 2,0, 2,25 o 2,5 equivalentes de la sal de metabisulfito para cada 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones más, se usan 1,4 equivalentes de la sal de bisulfito o 0,7 equivalentes de la sal de metabisulfito porcada 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones, se usan 1,2 equivalentes de la sal de bisulfito o 0,6 equivalentes de la sal de metabisulfito por cada 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina.
Como se usa en esta invención, un equivalente específico significa el valor específico ± 0,05.
En un 4° aspecto, para los procedimientos descritos anteriormente, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 2,9 a 3,7 y se hacen reaccionar de 1,0 a 1,8 equivalentes de la sal de bisulfito o de 0,5 a 0,9 equivalentes de la sal de metabisulfito con 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En algunas realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 3,1 a 3,5 y se hacen reaccionar de 1,1 a 1,6 equivalentes de la sal de bisulfito o de 0,55 a 0,8 equivalentes de la sal de metabisulfito con 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 3,2 a 3,4 y se hacen reaccionar de 1,3 a 1,5 equivalentes de la sal de bisulfito o de 0,65 a 0,75 equivalentes del metabisulfito con 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 3,3 y se hacen reaccionar 1,4 equivalentes de la sal de bisulfito o 0,7 equivalentes de la sal de metabisulfito con 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina. En otras realizaciones más, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo a un pH de 3,3 y se hacen reaccionar 1,4 equivalentes de bisulfito de sodio con 1 equivalente del agente citotóxico que contiene imina.
En un 5° aspecto, para los procedimientos descritos anteriormente o en el 1°, 2°, 3° o 4° aspecto, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en una mezcla de un disolvente orgánico y agua. Puede usarse cualquier disolvente orgánico adecuado. Los disolventes orgánicos ejemplares incluyen alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, etc.), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), acetonitrilo, acetona, cloruro de metileno, etc. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico es miscible con agua. En otras realizaciones, el disolvente orgánico no es miscible con agua, es decir, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en una solución bifásica. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico es dimetilacetamida (DMA). El disolvente orgánico (por ejemplo, DMA) puede estar presente en la cantidad del 1 %-99 %, 1-95 %, 10-80 %, 20-70 %, 30-70 %, 1-60 %, 5-60 %, 10-60%, 20-60 %, 30-60 %, 40-60 %, 45-55 %, 10-50 % o 20-40 %, en volumen del volumen total de agua y el disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo en una mezcla de DMA y agua, donde la relación de volumen de DMA y agua es 1:1.
En un 6° aspecto, para los procedimientos descritos anteriormente o en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° aspecto, la reacción de la etapa (a) puede llevarse a cabo a cualquier temperatura adecuada. En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo a una temperatura de 0 °C a 50 °C, de 10 °C a 50 °C, de 10 °C a 40 °C o de 10 °C a 30 °C. En otras realizaciones, la reacción se lleva a cabo a una temperatura de 15 °C a 30 °C, de 20 °C a 30 °C, de 15 °C a 25 °C, de 16 °C a 24 °C, de 17 °C a 23 °C, de 18 °C a 22 °C o de 19 °C a 21 °C. En otras realizaciones más, la reacción se puede llevar a cabo a 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C o 25 °C. En algunas realizaciones, la reacción se puede llevar a cabo de 0 °C a 15 °C, de 0 °C a 10 °C, de 1 °C a 10 °C, de 5 °C a 15 °C o de 5 °C a 10 °C.
En un 7° aspecto, para los procedimientos descritos anteriormente o en el 1°, 2°, 3°, 4°, 5° o 6° aspecto, la reacción de la etapa (a) se lleva a cabo durante de 1 minuto a 48 horas, de 5 minutos a 36 horas, de 10 minutos a 24 horas, de 30 minutos a 24 horas, de 30 minutos a 20 horas, de 1 hora a 20 horas, de 1 hora a 15 horas, de 1 hora a 10 horas, de 2 horas a 10 horas, de 3 horas a 9 horas, de 3 horas a 8 horas, de 4 horas a 6 horas o de 1 hora a 4 horas. En algunas realizaciones, se permite que la reacción prosiga durante de 4 a 6 horas. En otras realizaciones, se permite que la reacción prosiga durante 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, etc. En otras realizaciones, se permite que la reacción prosiga durante 4 horas. En otras realizaciones más, se permite que la reacción prosiga durante 2 horas.
En un 8° aspecto, para los procedimientos de la presente invención descritos en esta invención o en el 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6° o 7° aspecto, la reacción de la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de 4 a 9. En algunas realizaciones, la reacción de la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de 4,5 a 8,5, de 5 a 8,5, de 5 a 8, de 5 a 7,5, de 5 a 7, de 5 a 6,5, o de 5,5 a 6,5. En otras realizaciones, la reacción de la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0.
En algunas realizaciones, para los procedimientos descritos anteriormente o en el 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7° u 8° aspecto, la reacción de la etapa (b) se lleva a cabo en una solución acuosa que comprende una mezcla de agua y un disolvente orgánico. Puede usarse cualquier disolvente orgánico adecuado descrito anteriormente. Más específicamente, el disolvente orgánico es DMA. En algunas realizaciones, la solución acuosa comprende menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % del disolvente orgánico (por ejemplo, DMA) en volumen.
En algunas realizaciones, para los procedimientos descritos en esta invención o en el 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7° u 8° aspecto, la sal de bisulfito es bisulfito de sodio o potasio y la sal de metabisulfito es metabisulfito de sodio o potasio. En una realización específica, la sal de bisulfito es bisulfito de sodio y la sal de metabisulfito es metabisulfito de sodio.
En algunas realizaciones, para los procedimientos descritos en esta invención o en el 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7° u 8° aspecto, el agente citotóxico modificado no se purifica antes de que reaccione con el agente de unión celular en la etapa (b). Alternativamente, el agente citotóxico modificado se purifica antes de que reaccione con el agente de unión celular en la etapa (b). Cualquier procedimiento adecuado descrito en esta invención puede usarse para purificar el agente citotóxico modificado.
En algunas realizaciones, para los procedimientos descritos anteriormente, la reacción de la etapa (a) no da como resultado una sulfonación sustancial del grupo maleimida. En algunas realizaciones, menos del 50 %, del 40 %, del 30 %, del 20 %, del 10 %, del 9 %, del 8 %, del 7 %, del 6 %, del 5 %, del 4 %, del 3 %, del 2 % o del 1 % del grupo maleimida está sulfonado. El porcentaje de sulfonación de maleimida es igual a la cantidad total del agente citotóxico sulfonado con maleimida (el agente citotóxico que tiene sulfonación en la maleimida solamente) y el agente citotóxico disulfonado (el agente citotóxico que tiene sulfonación en los restos de maleimida e imina) dividido por la cantidad inicial del agente citotóxico que contiene imina antes de su reacción con la sal de bisulfito o la sal de metabisulfito.
En algunas realizaciones, los inmunoconjugados preparados mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se someten a una etapa de purificación. En este sentido, el inmunoconjugado se puede purificar a partir de los otros componentes de la mezcla usando filtración de flujo tangencial (TFF), cromatografía de no adsorción, cromatografía de adsorción, filtración de adsorción, precipitación selectiva o cualquier otro procedimiento de purificación adecuada, así como combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado se purifica mediante una única etapa de purificación (por ejemplo, TFF). Preferiblemente, el conjugado se purifica y se cambia a la formulación apropiada utilizando una única etapa de purificación (por ejemplo, TFF). En otras realizaciones de la invención, el inmunoconjugado se purifica utilizando dos etapas de purificación secuenciales. Por ejemplo, el inmunoconjugado puede purificarse primero mediante precipitación selectiva, filtración de adsorción, cromatografía de absorción o cromatografía de no absorción, seguido de purificación con TFF. Un experto en la materia apreciará que la purificación del inmunoconjugado permite el aislamiento de un conjugado estable que comprende el agente de unión celular unido químicamente al agente citotóxico.
Se puede utilizar cualquier sistema adecuado de TFF para la purificación, incluyendo un sistema tipo Pellicon (Milipore, Billerica, Mas.), un sistema de casete Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, N.Y.), y un sistema de tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, N.Y.).
Se puede utilizar cualquier resina de cromatografía de adsorción adecuada para la purificación. Las resinas de cromatografía de adsorción preferidas incluyen cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía hidrofóbica inducida por carga (HCIC), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio iónico de modo mixto, cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC), cromatografía con pigmentos como ligandos, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de resinas de hidroxiapatita adecuadas incluyen cerámicas de hidroxiapatita (CHT tipo I y tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.), hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, n Y) y cerámicas de fluorapatito (CFT tipo I y tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Un ejemplo de una resina de HCIC adecuada es la resina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, N.Y.). Los ejemplos de resinas de HIC adecuadas incluyen las resinas Butyl-Sepharose, Hexyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose y Octyl Sepharose (todas de GE Healthcare, Piscataway, N.J.), así como las resinas Macro-prep Methyl y Macro-Prep t-Butyl (Biorad Laboratories, Hércules, Calif.). Los ejemplos de resinas de intercambio iónico adecuadas incluyen SP-Sepharose, CM-Sepharose, y Q-Sepharose (todas de GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas S Unosphere (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de intercambiadores de iones de modo mixto adecuados incluyen resina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg N.J.). Los ejemplos de resinas de IMAC adecuadas incluyen resinas Sepharose de quelación (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas Profinity para IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas de pigmentos como ligandos adecuadas incluyen resina Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas de afinidad adecuadas incluyen resina Protein A Sepharose (por ejemplo, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el agente de unión celular es un anticuerpo, y resinas de afinidad a lectina, por ejemplo, resinas Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el el agente de unión celular presenta sitios de unión de lectina adecuados. Alternativamente, se puede usar un anticuerpo específico para el agente de unión celular. Dicho anticuerpo se puede inmovilizar, por ejemplo, en resina Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, N.J.). Los ejemplos de resinas de fase inversa adecuadas incluyen resinas C4, C8 y C18 (Grace Vydac, Hesperia, Calif.).
Se puede utilizar cualquier resina de cromatografía de adsorción adecuada para la purificación. Los ejemplos de resinas de cromatografía de no adsorción adecuadas incluyen SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, resinas SEPHACRYL™ (por ejemplo, S-200 y S-300), resinas SUPERDEX™ (por ejemplo, SUPERDEX™ 75 y SUPERDEX™ 200), resinas BIO-GEL® (por ejemplo, P-6, P-10, P-30, P-60, y P-100) y otras conocidas para los expertos en la materia.
VI. Usos de los inmunoconjugados de la presente invención
La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden inmunoconjugados de la presente invención.
Como se proporciona en esta invención, los inmunoconjugados de la presente invención, que comprenden los dominios anti-ADAM9-VL y/o VH humanizados/optimizados proporcionados en esta invención tienen la capacidad de unirse a ADAM9 presente en la superficie de una célula y mediar en la destrucción celular. En particular, los inmunoconjugados de la presente invención que comprenden un agente farmacológico, se internalizan y median en la destrucción celular a través de la actividad del agente farmacológico. Tal actividad de destrucción celular puede aumentarse mediante la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos inductores de inmunoconjugados (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Por lo tanto, los inmunoconjugados de la presente invención, que comprenden los dominios anti-ADAM9-VL y/o VH humanizados/optimizados proporcionados en esta invención tienen la capacidad de tratar cualquier enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9. Como se ha analizado anteriormente, ADAM9 es un antígeno oncoembrionario expresado en numerosas neoplasias malignas sanguíneas y sólidas que se asocia con tumores de alto grado que exhiben una morfología menos diferenciada y se correlaciona con malos resultados clínicos. Por lo tanto, sin limitación, los inmunoconjugados de la presente invención pueden emplearse en el tratamiento del cáncer, particularmente un cáncer caracterizado por la expresión de ADAM9.
En otras realizaciones particulares, los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer mieloide, melanoma y cáncer linfoide.
En realizaciones adicionales, los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas (células escamosas, adenocarcinoma o carcinoma indiferenciado de células grandes) y cáncer colorrectal (adenocarcinoma, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, linfoma colorrectal primario, leiomiosarcoma o carcinoma de células escamosas).
Además de su utilidad en la terapia, los inmunoconjugados de la presente invención pueden marcarse de forma detectable y usarse en el diagnóstico de cáncer o en la obtención de imágenes de tumores y células tumorales.
VII. Composiciones Farmacéuticas
Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para administrar a un sujeto o paciente) que se pueden utilizar en la preparación de formas de dosificación unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de los inmunoconjugados de la presente invención, o una combinación de dichos agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de inmunoconjugados de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención también abarca tales composiciones farmacéuticas que además incluyen un segundo anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico de tumor) que es específico para un antígeno de cáncer particular y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador ' hace referencia a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo o incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran por separado o se mezclan entre sí en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o una bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina estéril de grado farmacéutico. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de un inmunoconjugado de la presente invención, solo o con dicho portador farmacéuticamente aceptable. Además, también se pueden incluir en el paquete o kit farmacéutico uno o más agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad. La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Puede haber un aviso asociado a dicho recipiente o recipientes de la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por el organismo de la fabricación, el uso o la venta para administración en seres humanos.
La presente invención proporciona kits que se pueden utilizar en los procedimientos anteriores. Un kit puede comprender cualquiera de los inmunoconjugados de la presente invención. El kit puede comprender además uno o más agentes profilácticos y/o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes.
VIII. Procedimientos de administración
Las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar para su uso en el tratamiento, la profilaxis y la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un inmunoconjugado de la invención. En un aspecto preferido de la invención, dichas composiciones están sustancialmente purificadas (es decir, sustancialmente libres de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, preferiblemente un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor, etc.) o un primate (por ejemplo, un mono tal como un mono cynomolgus, un ser humano, etc). En una realización preferida de la invención, el sujeto es un ser humano.
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar las composiciones, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y col. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System" ("Transformación de genes in vitro mediada por receptores mediante un sistema portador de ADN soluble"), J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc.
Los procedimientos para administrar los inmunoconjugados para su uso según la invención incluyen administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y a través de la mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, los inmunoconjugados para uso según la presente invención se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. La composición se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La invención también prevé que las preparaciones de los inmunoconjugados de la presente invención se envasen en un recipiente cerrado herméticamente tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de la molécula. En una realización, dichas moléculas se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente cerrado herméticamente y se pueden reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) a la concentración adecuada para administración a un sujeto. Preferiblemente, los inmunoconjugados de la presente invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado.
Las preparaciones liofilizadas de los inmunoconjugados de la presente invención deben almacenarse a entre 2 °C y 8 °C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse dentro de las 12 horas, preferiblemente dentro de las 6 horas, dentro de las 5 horas, dentro de las 3 horas o dentro de la 1 hora después de ser reconstituidas. En una realización alternativa, dichas moléculas se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferiblemente, dichos inmunoconjugados, cuando se proporcionan en forma líquida, se suministran en un recipiente herméticamente cerrado.
Como se usa en esta invención, una "cantidad efectiva" de una composición farmacéutica es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos tales como la disminución de los síntomas resultantes de la enfermedad, la atenuación de un síntoma de infección (por ejemplo, carga viral, fiebre, dolor, sepsis, etc.) o un síntoma de cáncer (por ejemplo, la proliferación, de células cancerosas, presencia de tumor, metástasis tumorales, etc.), aumentando así la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, la disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, la mejora del efecto de otro medicamento, tal como a través de la focalización y/o internalización, el retraso de la progresión de la enfermedad y/o la prolongación de la supervivencia de los individuos.
Una cantidad efectiva se puede administrar en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad efectiva de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente: para destruir y/o reducir la proliferación de células cancerosas, y/o eliminar, reducir y/o retrasar el desarrollo de metástasis desde un sitio primario de cáncer. En algunas realizaciones, una cantidad efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede lograrse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, se puede considerar una "cantidad efectiva" en el contexto de la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos, y se puede considerar que un solo agente se administra en una cantidad efectiva si, junto con uno o más agentes distintos, se puede lograr o se logra un resultado deseable.
Para los inmunoconjugados para su uso según la invención, la dosis administrada a un paciente se determina preferiblemente basándose en el peso corporal (kg) del sujeto receptor.
La dosificación y la frecuencia de administración de un inmunoconjugado para su uso según la presente invención pueden reducirse o alterarse mejorando la captación y la penetración tisular de la molécula mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
La dosificación de un inmunoconjugado para su uso según la invención administrado a un paciente puede calcularse para su uso como terapia de agente único. Alternativamente, la molécula se puede usar en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosis administrada a un paciente es más baja que cuando dichas moléculas se usan como terapia de agente único.
Las composiciones farmacéuticas para su uso según la invención pueden administrarse localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante infusión local, mediante inyección o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas o fibras sialastic. Preferiblemente, al administrar un inmunoconjugado para su uso según la invención, se debe tener cuidado de utilizar materiales que la molécula no absorba.
Las composiciones para su uso según la invención se pueden administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véanse Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery" ("Nuevos procedimientos de administración de fármacos"), Science 249: 1527-1533); Treat y col., en LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327).
El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilacticamente efectiva de un inmunoconjugado de la presente invención puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. También se apreciará que la dosificación eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particular.
EJEMPLOS
Habiendo descrito ahora en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos ilustran diversos procedimientos para composiciones en los procedimientos de diagnóstico o tratamiento de la invención. Estos ejemplos pretenden ilustrar, pero de ningún modo limitar, el alcance de la invención.
Ejemplo 1
Especificidad de células tumorales del anticuerpo anti-ADAM9 MAB-A
Se identificó un anticuerpo murino anti-ADAM9 (denominado en esta invención como MAB-A) que: (1) bloquea la actividad de procesamiento de la proteína diana de ADAM9; (2) se internaliza; y (3) tiene actividad antitumoral (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 8361475). La especificidad de células tumorales de MAB-A fue investigada por IHC. El tejido tumoral se puso en contacto con MAB-A (0,4 pg/ml) o un control de isotipo (0,4 pg/ml) y se visualizó la extensión de la tinción. Se encontró que MAB-A marca fuertemente una diversidad de tipos de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma (FIG. 1A), células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer gástrico (FIG. 1B ), así como muestras de cáncer de colon (FIG. 1C). El tejido normal se puso en contacto con MAB-A (1,25 pg/ml) y se visualizó la extensión de la tinción. Como se resume en la Tabla 2 anterior, MAB-A exhibió poca o ninguna tinción de una amplia diversidad de tejidos normales. Se observará que la concentración de MAB-A utilizada en estos estudios fue casi 3 veces mayor que la utilizada para la tinción de células tumorales. Los resultados de estos estudios de IHC indican que MAB-A exhibe una fuerte unión preferencial a las células tumorales sobre las células normales.
Ejemplo 2
Reactividad cruzada de especies
Se examinó la unión de MAB-A a ADAM9 humana (huADAM9) y ADAM9 de mono cynomolgus (cynoADAM9). Brevemente, las células 293-FT y CHO-K que expresan transitoriamente huADAM9, cynoADAM9, un antígeno no relacionado o las células parentales no transfectadas se incubaron con MAB-A seguido de anticuerpo secundario anti­ PE murino de cabra y se analizaron mediante FACS. Como se muestra en la FIG. 2, MAB-A exhibe una fuerte unión a huADAM9 expresada transitoriamente en ambos tipos de células. MAB-A exhibe una unión deficiente a cynoADAM9. MAB-A no se unió a las células parentales o a las células que expresaban un antígeno irrelevante. Se observaron niveles bajos similares de unión a cynoADAM en los ensayos ELISA.
Ejemplo 3
Humanización y optim ización Inicial
La humanización de MAB-A produjo un dominio VH humanizado, denominado en esta invención como "hMAB-A VH(1)" y un dominio VL humanizado denominado en esta invención como "hMAB-A VL(1)". A continuación, los dominios variables humanizados se optimizaron para mejorar la actividad de unión y/o para eliminar residuos de aminoácidos potencialmente lábiles como se describe con más detalle a continuación. Esta primera ronda de optimización produjo tres dominios VH humanizados adicionales, denominados en esta invención como "hMAB-A VH(2)", "hMAB-A VH(3)" y "hMAB-A VH(4)", y tres dominios VL humanizados adicionales denominados en esta invención como "hMAB-A V l (2)", "hMAB-A VL(3)" y "hMAB-A VL(4)". Además, se generó una versión quimérica de MAB-A ("chMAB-A") que tiene los dominios VH y Vl murinos y regiones constantes humanas. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL murinos y humanizados/optimizados se han proporcionado anteriormente, se proporciona una alineación en las FIG. 3A y 3B . La secuencia de consenso de estos dominios VH y VL humanizados/optimizados se ha proporcionado anteriormente. Cuando se generaron múltiples dominios variables humanizados, los dominios variables humanizados de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-ADAM9 particular (por ejemplo, MAB-A) pueden usarse en cualquier combinación y las combinaciones particulares de cadenas humanizadas se denominan por referencia a los dominios VH/VL específicos, por ejemplo, un anticuerpo que comprende hMAB-A VH(1) y hMAB-A VL(2), se denomina específicamente "hMAB-A (1.2)".
En los siguientes ejemplos, cualquier inmunoconjugado que comprenda los siguientes dominios VH se muestra solo con fines ilustrativos y no forma parte de la presente invención reivindicada:
hMAB-A VH (1)
hMAB-A VH (2)
hMAB-A VH (3)
hMAB-A VH (4).
En los siguientes ejemplos, cualquier inmunoconjugado que comprenda la versión quimérica de MAB-A (chMAB-A) se muestra únicamente con fines ilustrativos y no forma parte de la presente invención reivindicada.
Se generó hMAB-A VH(1) con regiones marco derivadas de las líneas germinales humanas VH3-21 y VH3-64, y se generó hMAB-A VL(1) con regiones marco derivadas de las líneas germinales humanas B3 y L6. Las CDR murinas se conservaron en estos dominios variables humanizados.
Se identificó un sitio potencial de desamidación en la CDRh2 (mostrado con subrayado simple en la FIG. 3A) y un sitio potencial de isomerización del ácido aspártico en CDRl1 (mostrado con subrayado simple en la FIG. 3B). Se examinaron las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones para identificar sustituciones para eliminar estos sitios manteniendo la afinidad de unión. Se seleccionaron una sustitución de fenilalanina en la posición 54 (N54F) de CDRh2 (presente en hMAB-A VH(2)) y en serina en la posición 28 (D28S) de CDRl1 (presente en hMAB-A VL(2)), donde la numeración corresponde a Kabat. Las sustituciones identificadas pueden usarse por separado o en combinación. Sorprendentemente, se descubrió que los anticuerpos que comprenden la sustitución N54F exhibían un aumento de aproximadamente 2 veces en la afinidad por a Da m 9 humana (véase, por ejemplo, la Tabla 3 , a continuación) y una unión ligeramente mejorada a ADAM9 de cynomolgus.
Se generaron variantes optimizadas adicionales para minimizar el número de residuos de lisina presentes en las CDR. Dos residuos de lisina están presentes en CDRh2 (indicados con doble subrayado en la FIG. 3A), y una lisina está presente en CDRlI (indicado con doble subrayado en la FIG. 3B). Se examinaron las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones para identificar sustituciones que mantenían la afinidad de unión. Se seleccionaron sustituciones de arginina en la posición 62 (K62R), de glutamina en la posición 64 (K64Q) y serina en la posición 65 (S65G) para CDRh2 (presente en hMAB-A VH(3)), donde la numeración es según Kabat. Se seleccionó una sustitución de una arginina en la posición 24 (K24R) para CDRl1 (presente en hMAB-A VL(3)). Las sustituciones identificadas pueden usarse por separado o en combinación.
Se identificaron otros residuos potencialmente lábiles presentes en las CDR (indicados con un subrayado de puntos en las FIG. 3A-3B), un residuo de metionina dentro de CDRh1 en la posición 34 (M34), un residuo de metionina dentro de CDRl1 en la posición 33 (M33), y residuos de histidina, ácido glutámico y ácido aspártico en la posición 92 (H93), 93 (E93) y 94 (D94), dentro de CDRl3, donde la numeración es según Kabat. Se examinaron las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones para identificar sustituciones que mantenían la afinidad de unión. Se seleccionó la sustitución de isoleucina en la posición 34 (M34I) para CDRh1 y se seleccionaron sustituciones de leucina, tirosina, serina y treonina para las posiciones 33 (m 33L), 92 (H93Y), 93 (E93S) y 94 (D94T) de CDRl3, donde la numeración es según Kabat. Cada una de estas posiciones podría sustituirse fácilmente en combinación con todas las sustituciones detalladas anteriormente para producir hMAB-A VH(4) y hMAB-A VL(4), que cuando se emparejan generan un anticuerpo que conservaba una pequeña mejora en la afinidad en comparación con el anticuerpo murino parental, y que tiene un potencial muy reducido de desamidación u oxidación y no tiene residuos de lisina en las CDR.
La afinidad de unión relativa de los anticuerpos humanizados/optimizados hMAB-A (1.1), hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (3.3), hMAB-A (4.4) y el quimérico chMAB-A (que tiene dominios VH/VL murinos) a huADAM se investigó mediante el análisis BIACORE®, en el que se hizo pasar ADAM9 humano soluble marcado con His "(shADAM9-His" que contiene una porción extracelular de ADAM9 humano fusionado con una proteína que contiene histidina) sobre una superficie recubierta con anticuerpo inmovilizado. Brevemente, cada anticuerpo se capturó en una superficie anti-Fc humana de cabra Fab2 y a continuación se incubó en presencia de diferentes concentraciones (6,25-100 nM) de la proteína shADAM9-His. La cinética de la unión se determinó mediante el análisis de unión BIACORE® (modelo de unión de Langmuir 1:1 normalizado). Los ka, kdy Kd calculados a partir de estos estudios se presentan en la Tabla 3. La unión a cynoADAM9 se examinó mediante FACS como se ha descrito anteriormente y mediante ELISA.
Tabla 3.
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Los resultados de estos estudios demuestran que los anticuerpos humanizados/optimizados tienen la misma o mayor afinidad de unión por el ADAM9 humano que el anticuerpo murino parental. En particular, se observó que la introducción de la mutación N54F en los anticuerpos humanizados resultó en una mejor unión a huADAM9 (es decir, hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3) y hMAB-A (3.3)). Esta mutación también proporcionó una ligera mejora en la unión a cynoADAM9 según lo determinado por FACS y ELISA, sin embargo, estos anticuerpos continuaron exhibiendo una unión deficiente a cynoADAM9. Estos estudios también identificaron sustituciones adicionales que podrían introducirse para eliminar los residuos de lisina de las CDR sin reducir la afinidad. Se identificaron sustituciones adicionales para eliminar otros residuos potencialmente lábiles con un impacto mínimo en la afinidad.
Ejemplo 4
Optimización de la unión a ADAM9 de primates no humanos
Se usó mutagénesis aleatoria para introducir sustituciones dentro de los dominios CDRh2 de cadena pesada (posiciones Kabat 53-58) y CDRh3 (posiciones Kabat 95-100 y 100a-100f) de hMAB-A (2.2). Los mutantes se examinaron para identificar clones que tenían una unión mejorada a ADAM9 de primate no humano (por ejemplo, cynoADAM9) y que conservaban una unión de alta afinidad a huADAM9. Se seleccionaron 48 clones de dos cribados independientes de mutaciones dentro de CDRh3 (posiciones Kabat 100a-100f). La Tabla 4 proporciona un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los residuos 100a-f de CDRh3 de Kabat de los clones hMAB-A (2.2) seleccionados para mejorar la unión a cynoADAM9 a partir de dos cribados independientes. En la Tabla 5 se proporcionan alineaciones de clones adicionales. Como se indica en dichas tablas, surgieron clones similares en cada experimento, que incurrieron en patrones de sustitución discretos.
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Para todos los clones examinados, Gly y Ala son los residuos de aminoácidos preferidos en la posición 4 (P4) y Leu, Met y Phe son los residuos de aminoácidos preferidos en la posición 6 (P6). Los residuos de aminoácidos preferidos en otras posiciones (por ejemplo, posición 2 (P2), posición 3 (P3) y posición 5 (P5)) dependen del residuo de aminoácido encontrado en P1. Para los clones que tenían un resto Pro en la posición 1 (PI), se prefirieron Lys y Arg en P2, Phe y Met en P3, Gly en P4 y Trp o Phe en P5. Para los clones que tenían un Phe, Tyr o Trp en P1, se prefirieron Asn e His en P2, Ser e His en P3 y Leu en P6. Para los clones que tenían Ile, Leu o Val en P1, se prefirió Gly en P2, Lys en P3, Val en P5 e hidrófobo en P6. Además, como puede verse en la Tabla 4, para los clones que tienen un resto Thr en P1, se prefirió Gly en P2, se prefirieron Lys, Met y Asn en P3, se prefirió Gly en P4, se prefirieron Val o Thr en P5 y Leu y Met en P6. También se identificaron a frecuencias más bajas clones adicionales que tenían un residuo de Asp, Gly, Arg, His o Ser en P1 (véanse la Tabla 4 y la Tabla 5).
El dominio VH de los diez clones que se muestran en la Tabla5 se usó para generar variantes optimizadas adicionales de hMAB-A (2.2) denominadas hMAB-A (2A.2)-(2J.2). La unión de los clones seleccionados se examinó mediante ensayo ELISA. Brevemente, se usaron anticuerpos que se unen a péptidos que contienen histidina, y que habían sido recubiertos en placas de microtitulación, para capturar cynoADAM9 soluble marcado con péptido His ("cynoADAM9-His") (1 |jg/ml) o huADAM9 soluble marcado con péptido His (1 jg/ml), y se examinó la unión de diluciones en serie del hMAB-A parental (2.2) y las diez variantes c DRh3 hMAB-A (2A.2). Las curvas de unión de cynoADAM9 y huADAM9 se presentan en la FIG.4A y la FIG. 4B , respectivamente. Las variantes de hMAB-A (2A.2) que comprenden cada uno de los dominios VH seleccionados exhibieron una unión mejorada a cynoADAM9 con MAB-A VH(2B), MAB-A VH(2C), MAB-A VH(2D) y MAB-A VH(2I), que muestra la mayor mejora en la unión de cynoADAM9 mientras mantienen una unión similar a huADAM9 como el anticuerpo parental hMAB-A (2.2).
La afinidad de unión relativa de los anticuerpos humanizados/más optimizados MAB-A VH(2B.2), MAB-A VH(2C.2), MAB-A VH(2D.2) y MAB-A VH(2I.2), y el parental hMAB-A (2.2), a huADAM9-His y cynoADAM9-His se investigó usando el análisis BIACOREBIACORE® esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los ka, kd y Kd calculados a partir de estos estudios se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6
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Los estudios de unión demuestran que los cuatro mejores clones exhibieron una mejora de entre 150-550 veces en la afinidad de unión a cynoADAM9 mientras mantenían la misma alta afinidad de unión a huADAM9 que el anticuerpo parental. Se seleccionó hMAB-A (2C.2) y hMAB-A (21.2) para estudios adicionales.
Ejemplo 5
Estudio inm unohistoquím ico del anticuerpo hMAB-A (2I.2)
La especificidad celular de hMAB-A (21.2) fue investigada por IHC. Se pusieron en contacto células de control positivo y negativo, y tejidos humanos y de mono cynomolgus normales con hMAB-A (21.2) (2,5 |jg/ml) o un control de isotipo (2,5 jg/m l) y se visualizó la extensión de la tinción. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 7.
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También se realizaron estudios IHC para evaluar la unión de hMAB-A (21.2) humanizado/optimizado a una concentración de 12,5 |jg/ml (5x concentración óptima de tinción). En este estudio se emplearon células de control positivo y negativo, y tejidos humanos y de mono cynomolgus normales. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 8.
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Se realizó un estudio IHC comparativo para evaluar las diferencias en la unión de hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (2C.2) y hMAB-A (2I.2) a 2,5 |jg/ml o 5 |jg/ml. En este estudio se emplearon células de control positivo y negativo, y tejidos humanos y de mono cynomolgus normales. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 9.
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Se realizó un estudio IHC comparativo adicional para evaluar las diferencias en la unión de hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (2C.2) y hMAB-A (21.2) y MAB-A murino a 2,5 |jg/ml, 5 jg/m l o 12,5 jg/ml. En este estudio se emplearon células de control positivo y negativo, y tejidos humanos y de mono cynomolgus normales. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 10.
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Por lo tanto, los resultados demuestran que hMAB-A (2.2) exhibió un bajo nivel general de tinción de hepatocitos humanos y túbulos renales a una concentración óptima, con una intensidad de tinción/frecuencia de reactividad más baja en hepatocitos y túbulos renales observada en el control negativo. hMAB-A (2.2) exhibió una tinción de bajo nivel similar de hepatocitos cyno y túbulos renales a una concentración óptima, con una intensidad de tinción/frecuencia de reactividad más baja en los túbulos renales observados en el control negativo.
Los resultados también demuestran que hMAB-A (2C.2) exhibió un bajo nivel general de tinción de hepatocitos humanos y túbulos renales a una concentración óptima, con una intensidad de tinción/frecuencia de reactividad más baja en hepatocitos y túbulos renales observada en el control negativo. hMAB-A (2C.2) exhibió una tinción de bajo nivel similar en hepatocitos cyno y túbulos renales a una concentración óptima. No se observaron hallazgos mínimos adicionales en el epitelio cyno pulmonar, los islotes/epitelio del páncreas y el epitelio de la vejiga para hMAB-A (2C.2) en el tejido humano correspondiente; se observó menor intensidad de tinción/frecuencia de reactividad en el epitelio pulmonar, los túbulos renales, el epitelio vesical en el control negativo. Los resultados también demuestran que hMAB-A (21.2) no exhibió tinción de tejidos humanos o cyno a la concentración óptima, con rara /- tinción del epitelio de células de transición de la vejiga. hMAB-A (21.2) también exhibió un bajo nivel general y tinción de frecuencia de células alveolares de pulmón humano, epitelio ductal del páncreas, túbulo renal, epitelio de células de transición de la vejiga a una concentración óptima de 5x y tinción de bajo nivel general del epitelio cyno bronquial y el epitelio de células de transición de la vejiga a una concentración óptima de 5x. hMAB-A (21.2) exhibe un perfil de IHC global favorable en los tejidos normales humanos analizados y un perfil similar en los tejidos correspondientes del mono cynomolgus.
Ejemplo 6
hMAB-A (21.2) que comprende regiones Fc variantes
hMAB-A (21.2) comprende una cadena ligera (SEQ ID NO:68) que tiene una región constante de cadena ligera kappa y una cadena pesada (SEQ ID NO:52) que tiene regiones constantes de cadena pesada de IgG de tipo natural. Las variantes Fc se generaron introduciendo las siguientes sustituciones en la región Fc: L234A/L235A (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 78) denominada hMAB-A (2I.2)(AA); S442C (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 79) denominada hMAB-A (2I.2)(C); y L234A/L235A/S442C (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 80) denominada hMAB-A (2I.2)(AA/C). La unión de cada variante de Fc a huADAM9-His y cynoADAM9-His se examinó mediante ensayo ELISA. Brevemente, se usaron anticuerpos que se unen a péptidos que contienen histidina, y que habían sido recubiertos en placas de microtitulación, para capturar cynoADAM9 soluble marcado con péptido His o huADAM9 soluble marcado con péptido His (0,5 pg/ml), y se examinó la unión de diluciones en serie del hMAB-A parental (2.2) y las variantes Fc. Las curvas de unión de huADAM9 y cynoADAM9 se presentan en la FIG. 5A y la FIG. 5B , respectivamente, y muestran que cada una de las variantes de Fc conservó la afinidad de unión de hMAB-A (21.2) que tiene una región Fc de tipo natural.
Ejemplo 7
Análisis de expresiones diana
Para evaluar la expresión de ADAM9 en diferentes indicaciones, primero se evaluó una micromatriz de tejido (TMA) con 20 tipos de tumores diferentes utilizando un ensayo ADAM9 IHC desarrollado en ImmunoGen para uso preliminar en investigación.
Todas las muestras analizadas fueron muestras FFPE (fijadas en formalina e incluidas en parafina). La TMA de carcinoma 500 core 20 se adquirió de Folio Biosciences (n. ° de cat. ARY-HH0212). La TMA de Ns CLC con 80 núcleos para adenocarcinoma y 80 núcleos para carcinoma de células escamosas se adquirió de US Biomax (n. ° de cat. LC1921A). La TMA de cáncer colorrectal con 80 núcleos para adenocarcinoma se adquirió de Pantomics Inc. (n. ° de cat. COC1261). Las muestras de cáncer gástrico se adquirieron de Avaden Biosciences.
La tinción inmunohistoquímica para ADAM9 se llevó a cabo con el sistema de tinción automática Ventana Discovery Ultra. El anticuerpo primario para ADAM9 fue un anticuerpo monoclonal de conejo disponible en el mercado. Todas las muestras fueron evaluadas y puntuadas por un patólogo certificado por la junta capacitado en el algoritmo de puntuación. Se requirió la presencia de al menos 100 células tumorales viables para la puntuación. La intensidad de la tinción se puntuó en una escala entera semicuantitativa de 0 a 3, representando 0 ausencia de tinción, 1 tinción débil, 2 tinción moderada y 3 tinción fuerte. Se registró el porcentaje de células que se tiñeron positivamente en cada nivel de intensidad. La puntuación se basó en la localización de Adam9 solo en la membrana celular, así como en la evaluación de la localización tanto en el citoplasma como en la membrana. Los resultados de la tinción se analizaron mediante la puntuación H, que combina los componentes de la intensidad de la tinción con el porcentaje de células positivas. Tiene un valor entre 0 y 300 y se define como:
1 * (porcentaje de células con intensidad de tinción 1+)
2 * (porcentaje de células con intensidad de tinción 2+)
3 * (porcentaje de células con intensidad de tinción 3+)
= puntuación H
La TMA de carcinoma 500 core 20 con 5 controles de tejido normal para cada tipo de tumor se tiñó y calificó de dos maneras diferentes: (1) según la tinción de membrana sola o (2) según la tinción de membrana y citoplasmática. La Tabla 11 a continuación y la FIG. 6A resumen la prevalencia de ADAM9 basada en la tinción de membrana para las veinte indicaciones y la Tabla 12 y la FIG. 6B resumen los resultados de la tinción de membrana y citoplasmática para ocho indicaciones seleccionadas.
Sobre la base de los resultados de la TMA multicarcinoma, se eligieron tres indicaciones para un análisis de prevalencia ampliado: cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer colorrectal (CRC) y cáncer gástrico. Para NSCLC, se tiñó y evaluó una TMA con 80 núcleos para adenocarcinoma y 80 núcleos para carcinoma de células escamosas. Para CCR se analizó una TMA con 80 núcleos para adenocarcinoma, de los cuales 78 fueron evaluables. Para el cáncer gástrico, se analizaron 15 secciones de tejido completo de adenocarcinoma. Todas estas muestras se puntuaron para tinción de membrana y citoplasmática, y los resultados se resumen en la Tabla 13. Los resultados de estos estudios preliminares muestran que ADAM9 se expresa en una amplia gama de cánceres sólidos y respaldan el uso de conjugados anti-ADAM9-fármaco en muchos tumores sólidos diferentes que expresan ADAM9.
Tabla 11: Prevalencia de ADAM9 en 20 indicaciones diferentes se ún la tinción de membrana
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Tabla 12: Prevalencia de ADAM9 en 8 indicaciones seleccionadas según la tinción de membrana y citoplasmática
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Tabla 13: Prevalencia de ADAM9 en muestras adicionales para NSCLC, CRC y cáncer gástrico según la tinción de membrana y citoplasmática
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Ejemplo 8
Estudios de internalización de anticuerpos anti-ADAM9
Para evaluar la internalización de los anticuerpos anti-ADAM9 de la invención, se realizaron experimentos de internalización basados en citometría de flujo en los anticuerpos hMAB-A(2.2), hMAB-A(21.2) y hMAB-A(2I.2)-S442C conjugados con Alexa Fluor 488.
Los conjugados de anticuerpos anti-ADAM9 Alexa488 para hMAB-A(2.2), hMAB-A(21.2), hMAB-A(2I.2)-S442C se generaron utilizando el éster de tetrafluorofenilo Alexa Fluor 488 según las instrucciones del fabricante (Thermofisher). Los conjugados se eluyeron en PBS libre de azida de sodio, pH 7,2 para permitir los ensayos de internalización. La concentración y el grado de marcaje se calcularon a partir de medidas de absorción a 280 nm y 494 nm. Se realizaron ensayos de unión de FACS para garantizar que el etiquetado de Alexa488 no afectara negativamente la unión de la diana.
La internalización de los conjugados anti-ADAM9-Alexa488 se determinó después de la exposición continua y pulsada a los conjugados fluorescentes. Para experimentos continuos, las células NCI-HI703 se trataron con una concentración de saturación del anticuerpo marcado con Alexa488 indicado en hielo o a 37 °C durante todo el tiempo indicado. Mientras que para los experimentos de pulsos, los conjugados anti-ADAM9-Alexa488 se unieron previamente a las células en hielo y el exceso de conjugado se lavó antes de cambiar a 37 °C y monitorear la internalización. En los puntos de tiempo indicados después de la exposición continua o de pulso, las células se levantaron con verseno (Thermofisher) y se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, y los pocillos replicados se resuspendieron en PBS enfriado con hielo sin (muestras no extinguidas) o con anticuerpo anti-A488300 nM (muestras extinguidas). Todas las muestras se incubaron durante 30 min en hielo. A continuación se sedimentaron las células, se fijaron en paraformaldehído al 1 % y se analizaron por citometría de flujo. La fluorescencia de las células incubadas en hielo durante 30 minutos y a continuación incubadas con el anticuerpo anti-Alexa488 representa la fracción fluorescente inextinguible y se sustrajo de todas las demás muestras antes de calcular la internalización. El porcentaje de internalización se calculó como la fluorescencia de las muestras extinguidas corregida para la extinción incompleta de la superficie (fluorescencia intracelular) dividida por la de las células no extinguidas (fluorescencia total). Se representó gráficamente la internalización de los conjugados de anticuerpos anti-ADAM9 y los datos se ajustaron mediante una ecuación de decaimiento exponencial monofásico (GraphPad Prism, ver. 5.01).
La internalización de los anticuerpos anti-ADAM9 marcados con Alexa488 unidos a la superficie se evaluó después del tratamiento continuo y por pulsos en células NCI-HI703. Los tres conjugados anti-ADAM9-Alexa488 analizados mostraron una rápida internalización, con ~39 % de los conjugados internalizados en los primeros 15 minutos y un total de ~77 % internalizados después de 6 horas (FIG. 7A). Curiosamente, después de una exposición continua durante 24 horas, la señal fluorescente internalizada fue ~7 veces mayor que la señal fluorescente inicial total unida a la superficie celular después de 30 minutos (FIG. 7B). Por lo tanto, es probable que ADAM9 se reponga en la superficie celular a partir de un grupo intracelular durante las incubaciones a 37 °C, lo que permite múltiples rondas de internalización del conjugado de anticuerpos anti-ADAM9. La eficacia de los inmunoconjugados anti-ADAM9 se basa en la internalización, el tráfico intracelular y la degradación de los inmunoconjugados. La potencia de los inmunoconjugados anti-ADAM9 puede explicarse en parte por la alta internalización de los inmunoconjugados anti-ADAM9 que probablemente conduce a la generación de grandes cantidades de catabolitos citotóxicos.
Ejemplo 9
Estudios de procesamiento celular de anticuerpos anti-ADAM9
Para evaluar la unión a la diana en la célula, la captación y la degradación lisosomal de chMAB-A, se utilizó un procedimiento de procesamiento de anticuerpos marcados con 3H-propionamida descrito anteriormente ( Lai y col., Pharm Res. 2015 Nov; 32(11):3593-603). Usando este procedimiento, el anticuerpo chMAB-A dirigido a ADAM9 se marcó con trazas con propionato tritiado a través de residuos de lisina. Se ha demostrado previamente que tras la unión celular, la captación y el tráfico al lisosoma, el Ab marcado con [3H]propionato (3H-Ab) se degrada y la lisina-[3H]propionamida se libera en el medio de crecimiento celular. La adición de disolvente orgánico precipita el anticuerpo marcado intacto y deja la lisina-[3H]propinoamida en solución, lo que permite una medición conveniente y precisa de la extensión del procesamiento de anticuerpos.
chMAB-A se marcó con [3H]-propionato como se ha descrito anteriormente. La línea NSCLC, NCI-H1703, y la línea CRC, DLD-1, se trataron con anticuerpo 3H-chMAB-A 10 nM después de la determinación de la saturación del antígeno a través de la curva de unión. Algunas muestras de células se trataron con el anticuerpo de control de isotipo tritiado no dirigido, 3H-chKTI, mientras que otras no se trataron. Las células se colocaron en placas y se cultivaron durante la noche en placas de 6 pocillos y a continuación se sometieron a pulsos de reactivos como se ha descrito anteriormente. Brevemente, las células se incubaron con anticuerpo 3H-chMAB-A o 3H-chKTI durante 20 minutos antes de lavarlas 3 veces en medio fresco. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de una incubación de 20-24 horas, se recogieron las células y se precipitó la proteína con una mezcla 4:3 de volumen de acetona: medio/células. Las muestras se congelaron a -80 °C durante un mínimo de 1 hora antes de descongelarlas y separarlas por centrifugación. Los sedimentos se trataron para solubilizar la proteína antes del recuento durante 5 minutos en un contador de centelleo líquido Tri-Carb (LSC). Según el protocolo del fabricante, se añadió 1 ml de SOLVABLE (Perkin Elmer) a cada muestra de sedimento y se incubó en un baño de agua a 50 °C durante la noche. Las muestras se retiraron del baño de agua, se transfirieron a viales de centelleo de vidrio de 20 ml y se añadieron EDTA y H2O2 a las muestras, seguido de una incubación adicional de 1 hora a 50 °C. Las muestras se extinguieron con HCl, se añadieron 15 ml de fluido de centelleo líquido Optima Gold (Perkin Elmer) y las muestras se agitaron con vórtex a fondo. Las muestras se mantuvieron en la oscuridad durante un mínimo de 4 horas antes del recuento por LSC. Las muestras de extracto de acetona sin proteínas se secaron para volúmenes < 1 ml al vacío y se procesaron con Solvable como se ha descrito anteriormente antes de LSC. La cantidad de anticuerpo marcado unido, degradado e intacto se calculó a partir de los valores de CPM de la muestra resultante.
El nivel de procesamiento del anticuerpo 3H-chMAB-A se determinó después del tratamiento por pulsos y la incubación durante la noche a 37 °C. Las células NCI-HI703 mostraron un 93 % de 3H-chMAB-A procesado en 24 horas, y las células DLD-1 mostraron un 92 % de 3H-chMAB-A procesado en el mismo período de tiempo. La unión y el procesamiento de 3H-chKTI fueron insignificantes (CPM total >100 veces menor que para el anticuerpo dirigido). Los valores de procesamiento para estas líneas celulares son altos, especialmente en comparación con los valores de procesamiento de pulsos de 24 horas informados anteriormente para otros anticuerpos/dianas ADC que respaldan los anticuerpos anti-ADAM9 descritos en esta invención como conjugados de fármacos efectivos.
Ejemplo 10
Estudios de afinidad de unión de conjugados de anticuerpos anti-ADAM9 humanizados/optimizados y fármacos
Para evaluar la consecuencia de la conjugación en la unión al antígeno, se determinó la afinidad de unión relativa de cada inmunoconjugado anti-ADAM9 y su respectivo anticuerpo no conjugado a ADAM9 mediante análisis FACS en células 300-19 que expresan ectópicamente ADAM9 humano o ADAM9 de cynomolgus. Brevemente, las células 300­ 19 que expresan ADAM9 se incubaron con series de dilución de anticuerpos anti-ADAM9 o inmunoconjugados durante 30 min. a 4 °C en tampón FACS (PBS, BSA al 0,1 %, NaN3 al 0,01 %). A continuación, las muestras se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia durante 30 minutos a 4 °C. Se representó gráficamente la media normalizada de la intensidad de fluorescencia en cada concentración y se calculó la CE50 de unión usando un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). Los resultados de este estudio se resumen en la Tabla 14.
Todos los anticuerpos e inmunoconjugados anti-ADAM9 analizados se unieron con una afinidad similar a la de ADAM9 humano con una CE50 de aproximadamente 1,4 nM medida por citometría de flujo, lo que indica que la conjugación no alteró apreciablemente la afinidad de unión del anticuerpo (véase,
las FIG. 8A-8D). Si bien la humanización mejoró la unión a ADAM9 cynomolgus en relación con el anticuerpo quimérico (chMAB-A), se optimizaron aún más las variantes (hMAB-A(2C.2), hMAB-A(21.2) y hMAB-A(2I.2) s 442C) y sus inmunoconjugados exhibieron una unión notablemente mejorada a ADAM9 cynomolgus. La notable mejora en la unión a ADAM9 cynomolgus facilita los estudios de toxicología y seguridad para validar el uso de inmunoconjugados de ADAM9 como terapias farmacológicas.
Tabla 14
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0004
Ejemplo 11
Síntesis de N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)etil)-11 -(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepmo[1,2-a]mdol-9-M)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepmo[1,2-a]mdol-9-N)oxi)metN)feml-13,13-dimetN-2,5,8-trioxa-14,15-ditia-11-azanonadecan-19-amida, Compuesto D6
Figure imgf000112_0001
Etapa 1: A una solución del tiol IDGN462 libre (40 mg, 0,042 mmol) y NHS 4-(2-piridilditio)butanato (35 mg, 80 % de pureza, 0,085 mmol) en diclorometano anhidro (0,5 ml) se añadió diisopropiletilamina anhidra (0,015 ml, 0,085 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se inactivó con cloruro de amonio saturado y se diluyó con diclorometano. La mezcla obtenida se separó en un embudo de separación. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC semipreparativa de fase inversa (columna C18, CH3CN/H2O). Se combinaron las fracciones que contenían el producto puro, se congelaron y se liofilizaron para producir el éster de NHS deseado, compuesto 6a (29,7 mg, 60 % de rendimiento). LCMS = 9,1 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1157,3 (M 1)+.
Figure imgf000112_0002
Etapa 2: A una solución del éster de NHS, compuesto 6a (12,3 mg, 0,011 mmol) y clorhidrato de N-(2-aminoetil)maleimida (2,0 mg, 0,011 mmol) en diclorometano anhidro (0,3 ml) se añadió DIPEA (0,0022 ml, 0,013 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, a continuación se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante Hp Lc semipreparativa de fase inversa (columna C18, CH3CN/H2O). Se combinaron las fracciones que contenían el producto puro, se congelaron y se liofilizaron para producir la maleimida deseada, compuesto Da (10 mg, 80 % de rendimiento). LCMS = 8,3 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1181,8 (M 1)+.
Ejemplo 12
Síntesis de N1 -(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)etil)-N6-((S)-1 -(((S)-1 -((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-1 -oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)adipamida, compuesto D5
Figure imgf000112_0003
Se disolvieron éster de NHS, compuesto 5a (8,2 mg, 7,6 pmol) y clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (2,2 mg, 0,011 mmol) en diclorometano anhidro (305 pl) a temperatura ambiente. Se añadió DIPEA (2,66 pl, 0,015 mmol) y se agitó la reacción durante 3,5 horas. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, 35 % a 55 %). Las fracciones de producto deseado se congelaron y se liofilizaron para producir maleimida, compuesto D5 como un polvo blanco sólido (5,3 mg, 58 % de rendimiento). LCMS = 5,11 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 1100,6 (M 1)+.
Ejemplo 13
Síntesis de ácido 1-((2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-N)etN)amino)-4-((5-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)-1-oxobutano-2-sulfónico, compuesto D4
Figure imgf000113_0001
A una suspensión del tiol libre, D1 (88 mg, 0,105 mmol) y ácido 1-((2,5-dioxopirrolidin-1-il oxi)-1-oxo-4-(piridin-2-ildisulfanil)butano-2-sulfónico (sulfo-SPDB) (64,0 mg, 0,158 mmol) en diclorometano anhidro (2,10 ml) se añadió DIPEA (55,0 pl, 0,315 mmol) bajo nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante l6 horas y a continuación se añadieron clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (55,6 mg, 0,315 mmol), diclorometano anhidro (1,0 ml) y DIPEA (0,055 ml, 0,315 mmol). La mezcla se agitó durante 5 horas adicionales a temperatura ambiente, tras lo cual la reacción se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante RP-HPLC (C18, CH3CN/H2O). Se congelaron y se liofilizaron las fracciones que contienen el producto deseado para producir maleimida, D4 (20 mg, 16 % de rendimiento) como un sólido blanco. LCMS = 4,92 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 1158,6 (M 1)+.
Ejemplo 14
Síntesis de N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)etil)-11 -(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-M)oxi)metM)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-N)oxi)metN)fenN)-2,5,8-tríoxa-11-azapentadecan-15-amida, compuesto D7
Figure imgf000113_0002
A una solución de éster de NHS, 7a (5 mg, 4,82 pmol) y clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (1,7 mg, 9,64 pmol) en diclorometano anhidro (200 pl) se añadió DIPEA (1,512 pl, 8,68 pmol) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y a continuación, se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante RP-HPLC (C18, CH3CN/H2O). Se congelaron y se liofilizaron las fracciones que contienen el producto deseado para producir maleimida, compuesto D7 (3,5 mg, 68 % de rendimiento). LCMS = 4,61 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1062,8 (M 1)+.
Ejemplo 15
Preparación de conjugado específico de sitio de cisteína del anticuerpo anti-ADAM9 hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549
hMAB-A(2I.2)-S442C es un anticuerpo humanizado/optimizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 (que comprende una secuencia VL de SEQ ID NO:55), y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:142 (que comprende una secuencia VH de SEQ ID NO:28), que incluye un Cys diseñado por ingeniería correspondiente al del 6° al último residuo de SEQ ID NO:142, cuando X es una lisina, o correspondiente al del 5° al último residuo de SEQ ID NO:142, cuando X está ausente.
Los dos residuos de cisteína desapareados en el anticuerpo hMAB-A(2I.2)-S442C se redujeron usando procedimientos estándar. A una solución de este intermedio en solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido N,N,W,N'-etilendiaminotetracético (EDTA) 5 mM pH 6,0, se añadió N,N-dimetilacetamida (DMA), propilenglicol y 10 equivalentes molares de DGN549-C (compuesto D5) como una solución madre en DMA para producir una mezcla de reacción con una composición final de disolvente del 2 % v/v DMA y 38 % v/v propilenglicol en PBS EDTA 5 mM pH 6,0 y la reacción se permitió proseguir durante la noche a 25 °C.
El conjugado se purificó en succinato 20 mM, sacarosa al 8,5 %, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 pM, pH 4,2 usando un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) equipado con columnas de desalinización Sephadex G-25 Fine con la velocidad de flujo establecida en 5 ml/min. A continuación, el conjugado se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 |jm. Se descubrió que el conjugado tenía un promedio de 1,9 mol DGN549/mol anticuerpo por UV-vis, 97,6 % de monómero por SEC y 0,8 % de DGN549 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
Ejemplo 16
Preparación de conjugados IGN unidos a lisina de anticuerpos anti-ADAM9
a. Preparación de hMAB-A(2I.2)-DGN549
hMAB-A(2I.2) es un anticuerpo humanizado/optimizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:52. A una solución que contiene el anticuerpo hMAB-A(2I.2) tamponado a pH 8,5 con ácido 2-[4-(hidroxietil)piperzin-1-il]etanosulfónico (HEPES) 15 mM, se añadió N,N-dimetilacetamida (DMA) junto con 4,8 equivalentes de DGN549-L (compuesto D2) como solución madre en DMA de manera que la composición final del disolvente fue del 10 % (v/v) DMA y 90 % (v/v) tampón acuoso. La reacción se permitió proseguir durante 4 h a 25 °C.
El conjugado se purificó en succinato 20 mM, sacarosa al 8,5%, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 jM , pH 5,2, sobre columnas de desalinización Sephadex G25, se dializó frente a este tampón utilizando una membrana con un límite de peso molecular de 10 kDa y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 jm .
El conjugado tenía un promedio de 2,8 mol DGN549/mol anticuerpo por UV-vis, 98,6 % de monómero por SEC, y < 0,5 % de DGN549 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
b. Preparación de hMAB-A(2.2)-DGN549
hMAB-A(2.2) es un anticuerpo humanizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:50. El anticuerpo hMAB-A(2.2) se conjugó con DGN549 utilizando las mismas condiciones que las descritas para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que se añadieron a la reacción 4,4 equivalentes de DGN549-L (compuesto D2). Se purificó hMAB-A(2.2)-DGN549 de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549.
hMAB-A(2.2)-DGN549 purificado tenía un promedio de 2,7 mol DGN549/mol anticuerpo por UV-vis, 95,6 % de monómero por SEC y 0,6 % de DGN549 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
c. Preparación de hMAB-A(2C.2)-DGN549
hMAB-A(2C.2) es un anticuerpo humanizado/optimizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:51.
El anticuerpo hMAB-A(2C.2) se conjugó con DGN549 utilizando las mismas condiciones que las descritas para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que se añadieron a la reacción 4,9 equivalentes de DGN549-L (compuesto D2). Se purificó hMAB-A(2C.2)-DGN549 de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549.
hMAB-A(2C.2)-DGN549 purificado tenía un promedio de 2,8 mol DGN549/mol anticuerpo por UV-vis, 98,6 % de monómero por SEC y 0,6 % de DGN549 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
d. Preparación de chMAB-A-DGN549, chMAB-A-sSPDB-IGN137, chMAB-A-IGN23 y chMAB-A-sSPDB-DGN462
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con DGN549 utilizando las mismas condiciones que las descritas para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que se añadieron a la reacción 3,4 equivalentes de DGN549-L (compuesto D2). chMAB-A-DGN549 se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que el conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5 %, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 jM , pH 6,2. chMAB-A-DGN549 purificado tenía un promedio de 2,7 mol DGN549/mol anticuerpo por UV-vis, 94,4% de monómero por SEC, y < 0,4 % de DGN549 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con IGN137 (compuesto D1) a través del enlazador sulfo-SPDB como se ha descrito anteriormente en la patente de los EE.UU. n.° 9381 256. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que el conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5 %, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 jM , pH 6,2. El conjugado tenía un promedio de 2,9 mol IGN137/mol anticuerpo por UV-vis, 88,4 % de monómero por SEC y < 0,4 % de IGN137 no conjugado por tándem SEC/RP-UPLC. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con IGN23 (compuesto D3) como se ha descrito anteriormente en la patente de los EE.UU. n.° 8426 402. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que el conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5 %, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 j M, pH 6,2 y no se realizó diálisis. El conjugado tenía un promedio de 3,2 mol IGN23/mol anticuerpo por UV-vis, 97,9 % de monómero por SEC y 1,2 % de IGN23 no conjugado por análisis de HPLC de fase inversa. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con DGN462 a través de sulfo-SPDB como se ha descrito anteriormente en lapatente de los EE.UU. n.° 8765740. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-DGN549, excepto que el conjugado se purificó en histidina 20 mM, cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5 %, Tween-20 al 0,01 %, bisulfito de sodio 50 j M, pH 6,2 y no se realizó diálisis. El conjugado tenía un promedio de 2,8 mol DGN462/mol anticuerpo por UV-vis, 95,6% de monómero por SEC y 0,5% de DGN462 no conjugado por análisis de HPLC de fase inversa. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
Ejemplo 17
Preparación de conjugados DM unidos a lisina de anticuerpos anti-ADAM9
a. Preparación de hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2I.2) es un anticuerpo humanizado/optimizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:52.
Para preparar el conjugado hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, se realizaron adiciones de sulfo-SPDB (sSPDB) y DM4 por etapas. En primer lugar, se mezcló una solución que contenía el anticuerpo hMAB-A(2I.2) tamponado a pH 8,1 con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinapropanosulfónico (EPPS) 50 mM, cloruro de sodio 50 mM con DMA y 11,5 equivalentes de sSPDB de una solución madre de DMA de manera que la composición final del disolvente fue del 10 % (v/v) DMA y 90 % (v/v) tampón acuoso. Después de permitir que continuara la primera etapa de reacción durante 4 h. a 25 °C, se añadieron 17,3 equivalentes de DM4 de una solución madre de DMA, d Ma y tampón EPPS 500 mM/cloruro de sodio 500 mM pH 8,1 a la mezcla de reacción de manera que se mantuvo la composición de disolvente final del 10 % (v/v) DMA y 90 % (v/v) de tampón acuoso de la primera etapa de reacción. Se permitió que la segunda etapa de reacción prosiguiera durante la noche a 25 °C.
El conjugado se purificó en succinato 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 0,5 %, Tween-20 al 0,01 %, pH 5,5, sobre columnas de desalinización Sephadex G25, se dializó frente a este tampón utilizando una membrana con un límite de peso molecular de 10 kDa y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 jm .
El conjugado tenía un promedio de 3,5 mol DM4/mol anticuerpo por UV-vis, 99,2 % de monómero por SEC, y < 1,7 % de DM4 no conjugado por HPLC de modo mixto. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
b. Preparación de hMAB-A(2C.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2C.2) es un anticuerpo humanizado/optimizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:51.
El anticuerpo hMAB-A(2C.2) se conjugó con DM4 a través del enlazador sSPDB usando el mismo procedimiento que el descrito para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4.
El conjugado tenía un promedio de 3,2 mol DM4/mol anticuerpo por UV-vis, 98,9 % de monómero por SEC, y 2,6 % de DM4 no conjugado por HPLC de modo mixto. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
c. Preparación de hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2.2) es un anticuerpo humanizado con una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:50.
El anticuerpo hMAB-A(2.2) se conjugó con DM4 a través del enlazador sSPDB usando el mismo procedimiento que el descrito para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. El conjugado se purificó en succinato 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 0,5 %, Tween-20 al 0,01 %, pH 5,5 utilizando un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) equipado con columnas de desalinización Sephadex G-25 Fine y a continuación se filtró a través de un filtro de 0,22 filtro de jeringa jm
El conjugado tenía un promedio de 3,2 mol DM4/mol anticuerpo por UV-vis, 97,4 % de monómero por SEC, y < 1,1 % de DM4 no conjugado por HPLC de modo mixto. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
d. Preparación de chMAB-A-sSPDB-DM4 y chMAB-A-SMCC-DM1
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con DM4 a través del enlazador sulfo-SPDB usando el mismo procedimiento que el descrito para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, excepto que se usaron 6,4 equivalentes de sSPDB y 9,6 equivalentes de DM4 en las respectivas etapas de reacción. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, excepto que no se realizó diálisis. El conjugado tenía un promedio de 3,4 mol DM4/mol anticuerpo por UV-vis, 97,0 % de monómero por SEC, y 4,7 % de DM4 no conjugado por HPLC de modo mixto. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
El anticuerpo chMAB-A se conjugó con DM1 a través del enlazador SMCC usando procedimientos descritos anteriormente en la patente de los EE.UU. n.° 8624003. El conjugado se purificó de la misma manera que se describe para hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, excepto que no se realizó diálisis. El conjugado tenía un promedio de 3,9 mol DM1/mol anticuerpo por UV-vis, 99,7 % de monómero por SEC, y 4,9 % de DM1 no conjugado por HPLC de modo mixto. No se muestra la LC-MS del conjugado deglicosilado.
Ejemplo 18
C ito to x ic id a d in vitro de conjugados anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco
La citotoxicidad in vitro de diversos inmunoconjugados de anticuerpos anti-ADAM9 frente a un panel de líneas celulares que expresan ADAM9 se comparó con conjugados de IgG1 no dirigidos. En concreto, se sembraron de 500 a 2000 células/pocillo en placas de 96 pocillos 24 horas antes del tratamiento. Los conjugados se diluyeron en el medio de cultivo usando series de diluciones con un factor de dilución de 3 y se añadieron 100 pl por pocillo. En cada placa de ensayo se incluyeron pocillos de control que contenían células pero carecían de conjugado, así como también pocillos que contenían únicamente medio. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada punto de datos. Las placas se incubaron a 37 °C en un incubador humidificado al 5 % de CO2 durante 4 a 5 días. A continuación, se determinó la cantidad relativa de células viables en cada pocillo utilizando el kit de conteo de células 8 basado en WST-8 (Dojindo Molecular Technologies). Se calculó la fracción superviviente de células en cada pocillo, en primer lugar, mediante la corrección de la absorbancia de fondo del medio y a continuación, mediante la división de cada valor entre el promedio de los valores en los pocillos de control (células no tratadas). El porcentaje de células supervivientes se representó gráficamente frente a la concentración de conjugado y la CE50 de actividad se calculó utilizando un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).
Estos resultados muestran que los inmunoconjugados anti-ADAM9 pueden destruir un amplio panel de líneas de células tumorales positivas para ADAM9, incluyendo líneas de células tumorales de pulmón, páncreas, riñón, próstata y colon (véanse las FIG. 9A-9H). En cada caso probado, se observa una buena ventana de especificidad, lo que sugiere que la citotoxicidad es el resultado de la unión específica del anticuerpo anti-ADAM9 a las células diana. En particular, los conjugados anti-ADAM9-DGN549 (hMAB-A(2.2)-DGN549 y hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549) fueron extremadamente potentes con valores CI50 que oscilaron entre 1 y 115 pM y fueron ~3 logs más activos que un conjugado IgG1 no dirigido (véase la Tabla 15).
Tabla 15
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Ejemplo 19
Actividad antitumoral de conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco en ratones SCID con xenoinjertos de adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas humanas Calu3
Se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables de hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 y una dosis única de conjugados chMAB-A-DGN549 en ratones hembra SCID portadores de células Calu3, un modelo de xenoinjerto subcutáneo de adenocarcinoma de pulmón humano.
Se recogieron células Calu3 para la inoculación, con una viabilidad del 99 % determinada por exclusión con azul de tripano. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células Calu3 en 0,2 ml de matrigel al 50 %/medio libre de suero al 50 % mediante inyección subcutánea en la zona del costado derecho. Se obtuvieron ochenta y cuatro ratones SCID hembra (de 6 semanas) de Charles River Laboratories. Tras la recepción, se observaron los animales durante 9 días antes del inicio del estudio. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar o antes del tratamiento.
Ochenta y cuatro ratones se distribuyeron aleatoriamente en 8 grupos (8 ratones por grupo) por volumen tumoral. Los volúmenes tumorales oscilaron entre 74,09 y 150,21 (106,41 ± 18,69, media ± DE) mm3 Los ratones se midieron y se aleatorizaron en función del volumen del tumor el día 6 después de la implantación. Los ratones recibieron la dosis el día 7 después de la implantación. El peso corporal de los ratones osciló entre 16,05 y 21,72 (18,64 ± 1,03, media ± DE) gramos. Los ratones de cada grupo se identificaron mediante el procedimiento del punzón. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se realizó por vía intravenosa con una jeringa de 1,0 ml equipada con una aguja de calibre 27 de A pulgada. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdx1, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg (por anticuerpo), qdx1, hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg (por anticuerpo), qdx1, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg (por anticuerpo), qdx1 y chMAB-A-DGN549 en 10|jg/kg (por carga útil; 0,6 mg/kg por anticuerpo), qdx1.
Se midió el tamaño de los tumores dos veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x A. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (RP) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (RC) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable y un superviviente sin tumor (TFS) es el número de ratones sin tumor al final del estudio. Se determinó el volumen tumoral y el peso corporal con el software StudyLog. El log-10 de muerte celular (LCK) se calculó con la fórmula LCK = (T-C) / Td x 3,32, donde (T - C), o retraso en el crecimiento del tumor (TGD), es la mediana de tiempo (en días) para que los tumores del grupo de tratamiento y del grupo de control alcancen un tamaño predeterminado de 815 mm3 (supervivientes sin tumor excluidos) 1, Td es el tiempo de duplicación del tumor en ratones (estimado a partir del ajuste de la curva exponencial no lineal de la mediana diaria del crecimiento del tumor de control) y x es el número de duplicaciones de células por log de crecimiento celular. %T/C (inhibición del crecimiento tumoral) es la relación de la mediana del volumen tumoral (VT) del grupo de tratamiento en un momento predeterminado (es decir, el momento en que la mediana de VT para los tumores de control alcanza el volumen tumoral máximo, es decir, VT a ~1000mm3, o cuando los tumores se volvieron necróticos, por lo que este es el momento en que todos los ratones del grupo de control abandonaron el estudio) hasta la mediana de VT de los controles en el punto final para los controles.
El peso corporal de todos los ratones se midió dos veces por semana como índice aproximado de la toxicidad del fármaco. Los pesos corporales (PC) de los ratones se expresaron como cambio porcentual en el peso corporal con respecto al peso corporal previo al tratamiento de la siguiente manera: % cambio de PC = [(PC post/PC pre) - 1] x 100, donde PC post es el peso después del tratamiento y PC pre es el peso corporal inicial antes del tratamiento. El porcentaje de pérdida de peso corporal (PPC) se expresó como el cambio medio en el peso corporal después del tratamiento. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor era mayor de 1000 mm3 o necrótico, o si el peso corporal descendía un 20 % más en cualquier punto del estudio.
Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 10. El conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 fue activo en todas las dosis probadas. El conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 tuvo un valor de inhibición del crecimiento tumoral (T/C) del 39 %, un valor T-C de 17 y un valor LCK de 0,5 en dosis de 1,25 mg/kg (con 3 regresiones parciales de 8 ratones y regresiones completas); un valor T/C del 25 %, un valor T-C de 22 y un valor LCK de 0,7 en 2,5 mg/kg (con 3 regresiones parciales de 8 ratones y sin regresiones completas), y un valor T/C del 14 %, un valor T-C de 36 y un valor LCK de 1,1 en dosis de 5 mg/kg (con 4 regresiones parciales de 8 ratones y 1 regresión completa de 8 ratones). chMAB-A-DGN549 fue muy activo en 10 pg/kg (por carga útil; 0,6 mg/kg por anticuerpo) con 8 regresiones completas de 8 ratones. No se observó una pérdida de peso corporal significativa con los conjugados hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 o chMAB-DGN549 o chKTI-sSPDB-DM4 en las dosis indicadas y, por lo tanto, los tres conjugados fueron bien tolerados en ratones a las dosis indicadas en este estudio. Los resultados muestran que el conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 es activo a dosis variables en este modelo. Los resultados también muestran que chMAB-A-DGN549 es muy activo en dosis de 10 pg/kg (por carga útil; 0,6 mg/kg por anticuerpo).
También se evaluó la actividad antitumoral de diversas dosis de hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 como una única dosis iv en ratones SCID hembra con xenoinjertos tumorales Calu-3, un modelo de NSCLC. Seis días después de la inoculación, se distribuyeron aleatoriamente los ratones en 8 grupos (n = 8 por grupo) por volumen de tumor. Los grupos de tratamiento incluyeron un grupo de control dosificado con vehículo (PBS), conjugado hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 dosificado en 0,5 (por carga útil; 0,04 mg/kg por anticuerpo), 1 (por carga útil; 0,08 mg/kg por anticuerpo), 3 (por carga útil; 0,25 mg/kg por anticuerpo) y 10 pg/kg (por carga útil; 0,8 mg/kg por anticuerpo) como una única dosis iv, así como un control no dirigido del conjugado huKTI-S442C-DGN549 en 1 (por carga útil; 0,08 mg/kg por anticuerpo), 3 (por carga útil; 0,25 mg/kg por anticuerpo) y 10 pg/kg (por carga útil; 0,8 mg/kg por anticuerpo) dosificado como una única dosis iv.
Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales se midieron como se ha descrito anteriormente y los resultados se muestran en la FIG. 11. Brevemente, hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 fue muy activo incluso con la dosis más baja de 0,5 pg/kg (por carga útil; 0,04 mg/kg por anticuerpo) y se observó una potente actividad en dosis de 1 (por carga útil; 0,08 mg/kg por anticuerpo), 3 (por carga útil; 0,25 mg/kg por anticuerpo), 10 pg/kg (por carga útil; 0,8 mg/kg por anticuerpo). El control no dirigido, huKTI-S442C-DGN549 estuvo inactivo en este modelo en las tres dosis probadas, es decir, 1 (por carga útil; 0,08 mg/kg por anticuerpo), 3 (por carga útil; 0,25 mg/kg por anticuerpo) y 10 ug/kg (por carga útil; 0,8 mg/kg por anticuerpo). hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 0,5 pg/kg (por carga útil; 0,04 mg/kg por anticuerpo) tenía un t /c del 7 %, con 7/8 RP, y 0/8 Rc al final del estudio. hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 1 pg/kg (por carga útil; 0,08 mg/kg por anticuerpo) tenía un T/C del 2 %, con 8/8 RP, y 2/8 r C al final del estudio. hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 3 pg/kg (por carga útil; 0,25 mg/kg por anticuerpo) tenía un T/C del 0 %, con 8/8 RP, y 8/8 RC al final del estudio y hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 10 pg/kg (por carga útil; 0,8 mg/kg por anticuerpo) tenía un T/C del 0 %, con 8/8 RP, y 8/8 RC al final del estudio.
Ambos hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (en 0,5, 1, 3, 10 pg/kg, por carga útil), y huKTI-S442C-DGN549 (en 1, 3,10 pg/kg, por carga útil) fueron bien tolerados en ratones a todas las dosis indicadas en este estudio. No se observó una pérdida significativa de peso corporal con ninguno de los dos conjugados en las dosis indicadas. Los resultados de este estudio sugieren que el conjugado hMAB-A(21.2)-S442C-DGN549 demostró una actividad antitumoral convincente y es altamente eficaz en el modelo de xenoinjerto de tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas Calu-3.
Ejemplo 20
Actividad antitumoral de conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco en ratones SCID con xenoinjertos de carcinoma de células escamosas de pulmón de células no pequeñas H1703
Se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables del conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en ratones hembra SCID portadores de células H1703, un modelo de xenoinjerto de carcinoma de células escamosas de NSCLC.
Se recogieron células H1703 para la inoculación, con una viabilidad del 100 % determinada por exclusión con azul de tripano. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células H1703 en 0,2 ml de matrigel al 50 %/medio libre de suero al 50 % mediante inyección subcutánea en la zona del costado derecho. Se obtuvieron setenta y dos ratones sin pelaje hembra (de 6 semanas) de Charles River Laboratories el 24/3/16. Tras la recepción, se observaron los animales durante 8 días antes del inicio del estudio. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar o antes del tratamiento. Cuarenta y ocho ratones se distribuyeron aleatoriamente en 8 grupos (6 ratones por grupo) por volumen tumoral. Los volúmenes tumorales oscilaron entre 76,18 y 159,00 (115,19 ± 22,08, media ± DE) mm3. Los ratones se midieron y se aleatorizaron en función del volumen del tumor el día 19 después de la implantación. Los ratones recibieron la dosis el día 20 después de la implantación (21/4/16). El peso corporal de los ratones osciló entre 20,20 y 29,15 (23,88 ± 1,95, media ± DE) gramos. Los ratones de cada grupo se identificaron mediante el procedimiento del punzón. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se realizó por vía intravenosa con una jeringa de 1,0 ml equipada con una aguja de calibre 27 de A pulgada. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (PBS) en 150 pl/ratón, qdxl, chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdxl, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg, qdxl, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg, qdx1 y hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdx1.
Las medidas del tamaño del tumor y del peso corporal se determinaron como se describe en el Ejemplo 19. Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 12. hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 fue muy activo a una dosis baja de 2,5 mg/kg con un T/C del 6 %, T-C de 28 y LCK de 1,4 (con 3 regresiones parciales de 6 ratones y sin regresiones completas). y muy activo en dosis de 5 mg/kg con un T/C del 1 %, T-C de 63 y LCK de 3,2 (con 6 regresiones parciales de 6 ratones, 3 regresiones completas de 6 ratones y 1 superviviente sin tumor). El conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 estaba inactivo en dosis de 1,25 mg/kg, y tuvo una inhibición del crecimiento tumoral (T/C) del 79 %, T-C de 4 y LCK de 0,2 (con 1 regresión parcial de 6 ratones y sin regresiones completas). No se observó una pérdida de peso corporal significativa con los conjugados hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 o chKTI-sSPDB-DM4 en las dosis indicadas y, por lo tanto, los dos conjugados fueron bien tolerados en ratones a las dosis indicadas en este estudio. Los resultados muestran que el conjugado hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 es muy activo a dosis de tan solo 2,5 mg/kg en este modelo.
Ejemplo 21
Actividad antitumoral de conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco en ratones SCID con xenoinjertos de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello Detroit562
Se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables de conjugados chMAB-A-sSPDB-DM4 en ratones inmunodeficientes CD-1 hembra portadores de células Detroit562, un modelo de xenoinjerto de carcinoma faríngeo.
Se obtuvieron ratones (de 6 semanas) de Charles River Laboratories (1/7/14). Tras la recepción, se observaron los animales durante 15 días antes del inicio del estudio. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar o antes del inicio del estudio. Se recogieron células Detroit562 para la inoculación, con una viabilidad de más del 90 % determinada por exclusión con azul de tripano. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células Detroit562 en 0,2 ml de matrigel al 50 %/medio libre de suero al 50 % mediante inyección subcutánea en la zona del costado derecho.
Cuarenta y dos ratones se distribuyeron aleatoriamente en 6 grupos (7 ratones por grupo) por volumen tumoral. El volumen del tumor osciló entre 95,76 y 450,83 mm3. Los ratones se midieron y se aleatorizaron en función del volumen del tumor el día 26 después de la implantación. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se realizó el día siguiente a la aleatorización (día de estudio 0) mediante inyección intraperitoneal utilizando una jeringa de 1,0 ml equipada con una aguja de calibre 27 de A pulgada. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdx1, chKTI-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg, qdx1.
Las medidas del tamaño del tumor y del peso corporal se determinaron como se describe en el Ejemplo 19. Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 13. Brevemente, chMAB-A-sSPDB-DM4 fue activo en los 3 niveles de dosis probados (5, 2,5 y 1,25 mg/kg) en el transcurso del estudio. chMAB-A-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg tenía un T/C del 32 %, y 6/7 RP y 1/7 RC al final del estudio. chMAB-A-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg tenía un T/C del 27 %, y 6/7 RP y 2/7 RC al final del estudio. chMAB-A-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg tenía un T/C del 37 %, y 5/7 RP y 0/7 RC al final del estudio. chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg tenía un T/C del 89 %, y 3/7 RP y 0/7 RC al final del estudio. chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg tenía un T/C del 80 %, y 3/7 RP y 1/7 RC al final del estudio.
chMAB-A-sSPDB-DM4 fue bien tolerado en ratones en todas las dosis examinadas en este estudio. No se observó una pérdida significativa de peso corporal en las dosis indicadas. Los resultados de este estudio sugieren que el conjugado chMAB-A-sSPDB-DM4 demuestra actividad antitumoral y es eficaz en el modelo de xenoinjerto de tumor de carcinoma faríngeo Detroit562.
En un segundo estudio, se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables de conjugados chMAB-A-sSPDB-DM4 en ratones inmunodeficientes CD-1 hembra portadores de xenoinjertos tumorales Detroit562 de mayor volumen.
Se obtuvieron ratones (de 5 semanas) de Charles River Laboratories (17/9/14). Tras la recepción, se observaron los animales durante 7 días antes del inicio del estudio. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar o antes del inicio del estudio. Se recogieron células Detroit562 para la inoculación, con una viabilidad de más del 90 % determinada por exclusión con azul de tripano. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células Detroit562 en 0,2 ml de matrigel al 50 %/medio libre de suero al 50 % mediante inyección subcutánea en la zona del costado derecho.
Ochenta ratones se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos (6 ratones por grupo) por volumen tumoral. El volumen del tumor osciló entre 277,51 y 503,49 mm3. Los ratones se midieron y se aleatorizaron en función del volumen del tumor el día 35 después de la implantación. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se llevó a cabo a los dos días siguientes a la aleatorización (día de estudio 1) mediante inyección intraperitoneal utilizando una jeringa de 1,0 ml equipada con una aguja de calibre 27 de A pulgada. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (Pb S), chMAB-A-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, qdx1 y chMAB-A-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg, qdx1.
Las medidas del tamaño del tumor y del peso corporal se determinaron como se describe en el Ejemplo 19. Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 14. Brevemente, chMAB-A-sSPDB-DM4 fue activo en los 2 niveles de dosis probados (5 y 1,25 mg/kg) en el transcurso del estudio. chMAB-A-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg tenía un T/C deL 3 %, y 6/6 RP y 1/7 Rc al final del estudio. chMAB-A-sSPDB-DM4 en 1,25 mg/kg tenía un T/C del 14 %, y 6/6 RP y 0/7 RC al final del estudio.
chMAB-A-sSPDB-DM4 fue bien tolerado en ratones en ambas dosis examinadas en este estudio. No se observó una pérdida significativa de peso corporal en las dosis indicadas. Los resultados de este estudio sugieren que el conjugado chMAB-A-sSPDB-DM4 demuestra actividad antitumoral y es eficaz en el modelo de xenoinjerto de tumor de carcinoma faríngeo Detroit562 de mayor volumen.
Ejemplo 22
Actividad antitumoral de conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco en ratones sin pelaje con xenoinjertos de carcinoma gástrico SNU-5
Se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables de huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 y una dosis única de conjugados huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en ratones sin pelaje hembra portadores de células Snu-5, un modelo de xenoinjerto de carcinoma gástrico humano.
Se recogieron células Snu-5 para la inoculación, con una viabilidad del 100 % determinada por exclusión con azul de tripano. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células Snu-5 en 0,1 ml de matrigel al 50 %/medio libre de suero al 50 % mediante inyección subcutánea en la zona del costado derecho. Se obtuvieron cincuenta y seis ratones sin pelaje hembra (de 6 semanas) de Charles River Laboratories el 25/1/17. Tras la recepción, se observaron los animales durante 8 días antes del inicio del estudio. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar o antes del tratamiento.
Cincuenta y seis ratones se distribuyeron aleatoriamente en 7 grupos (8 ratones por grupo) por volumen tumoral. Los volúmenes tumorales oscilaron entre 76,29 y 129,12 (130,58 ± 13,28, media ± DE) mm3. Los ratones se midieron y se aleatorizaron en función del volumen del tumor el día 13 después de la implantación. Los ratones recibieron la dosis el día 14 después de la implantación (17/02/2017). El peso corporal de los ratones osciló entre 19,50 y 26,35 (22,69 ± 1,40, media ± DE) gramos. Los ratones de cada grupo se identificaron mediante el procedimiento del punzón. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se realizó por vía intravenosa con unajeringa de 1,0 ml equipada con una aguja de calibre 27 de A pulgada. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 2,5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, huKTI-S442C-DGN549 en 10 pg/kg, huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 3 pg/kg y huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 10 pg/kg.
Se midió el tamaño de los tumores dos veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x A. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (RP) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (RC) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable y un superviviente sin tumor (TFS) es el número de ratones sin tumor al final del estudio. Se determinó el volumen tumoral y el peso corporal con el software StudyLog. El log-10 de muerte celular (LCK) se calculó con la fórmula LCK = (T-C) / Td x 3,32, donde (T - C), o retraso en el crecimiento del tumor (TGD), es la mediana de tiempo (en días) para que los tumores del grupo de tratamiento y del grupo de control alcancen un tamaño predeterminado de 798 mm3 (supervivientes sin tumor excluidos) 1, Td es el tiempo de duplicación del tumor en ratones (estimado a partir del ajuste de la curva exponencial no lineal de la mediana diaria del crecimiento del tumor de control) y x es el número de duplicaciones de células por log de crecimiento celular. %T/C (inhibición del crecimiento tumoral) es la relación de la mediana del volumen tumoral (VT) del grupo de tratamiento en un momento predeterminado (es decir, el momento en que la mediana de VT para los tumores de control alcanza el volumen tumoral máximo, es decir, TV a ~1000mm3, o cuando los tumores se volvieron necróticos, por lo que este es el momento en que todos los ratones del grupo de control abandonaron el estudio) hasta la mediana de VT de los controles en el punto final para los controles.
El peso corporal de todos los ratones se midió dos veces por semana como índice aproximado de la toxicidad del fármaco. Los pesos corporales (PC) de los ratones se expresaron como cambio porcentual en el peso corporal con respecto al peso corporal previo al tratamiento de la siguiente manera: % cambio de PC = [(PC post / PC pre) -1 ] x 100, donde PC post es el peso después del tratamiento y PC pre es el peso corporal inicial antes del tratamiento. El porcentaje de pérdida de peso corporal (PPC) se expresó como el cambio medio en el peso corporal después del tratamiento. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor era mayor de 1000 mm3 o necrótico, o si el peso corporal descendía un 20 % más en cualquier punto del estudio.
Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 15 y la FIG. 16. El conjugado huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 fue muy activo en ambas dosis probadas. El conjugado huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 tuvo un valor de inhibición del crecimiento tumoral (T/C) del 5 %, en dosis de 2,5mg/kg (con 8 regresiones parciales de 8 ratones y 2 regresiones completas); un valor T/C del 1%, 5mg/kg (con 8 regresiones parciales de 8 ratones y 6 regresiones completas). huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 fue muy activo en ambas dosis probadas. El conjugado huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 tenía un valor (T/C) del 7 %, en dosis de 3 pg/kg (con 8 regresiones parciales de 8 ratones y 4 regresiones completas); un valor T/C del 4 %, 5 mg/kg (con 8 regresiones parciales de 8 ratones y 5 regresiones completas). No se observó una pérdida de peso corporal significativa con los conjugados huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 o huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 o chKTI-sSPDB-DM4 o huKTI-S442C-DGN549 en las dosis indicadas y, por lo tanto, los cuatro conjugados fueron bien tolerados en ratones a las dosis indicadas en este estudio.
Ejemplo 23
Actividad antitumoral de conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y fármaco en ratones con xenoinjertos de línea celular de cáncer colorrectal SW48
Se evaluó la actividad antitumoral de dosis variables de conjugados hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 y huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN649 en ratones sin pelaje hembra portadores de células SW48, un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer colorrectal.
Se recogieron células SW48 para la inoculación. Los ratones fueron inoculados con células SW48 por inyección subcutánea en la zona del costado derecho. Los animales no mostraron signos de enfermedad al llegar de los laboratorios o antes del tratamiento.
Cuarenta y dos ratones se distribuyeron aleatoriamente en 7 grupos (6 ratones por grupo) por volumen tumoral. Los volúmenes tumorales oscilaron entre 89 y 169 mm3. Los ratones se midieron, se aleatorizaron y se dosificaron en función del volumen del tumor el día 17 después de la implantación. Los ratones de cada grupo se identificaron mediante marcas en las orejas. La administración de los agentes de prueba y el vehículo se llevó a cabo por vía intravenosa. Los grupos incluyeron: un grupo de control dosificado con vehículo (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 en 10 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 en 10 mg/kg, huKTI-S442C-DGN549 en 5 pg/kg, huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 2,5 pg/kg y huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 en 5 pg/kg.
Las medidas del tamaño del tumor y del peso corporal se determinaron como se describe en el Ejemplo 22. Los resultados del estudio se muestran en la FIG. 17 y la FIG. 18. El conjugado huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 fue activo en ambas dosis probadas. El conjugado huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 tuvo un valor de inhibición del crecimiento tumoral (T/C) del 13 %, en dosis de 5 mg/kg (sin regresiones parciales o completas); un valor T/C del 5 %, 10 mg/kg (con 6 regresiones parciales de 6 ratones). huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 fue activo en dosis de 5 pg/kg e inactivo en dosis probadas de 2,5 pg/kg. El conjugado huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 tenía un valor (T/C) del 92 %, en dosis de 2,5 pg/kg; un valor T/C del 41 %, 5 pg/kg (con 2 regresiones parciales de 6 ratones). No se observó una pérdida de peso corporal significativa con los conjugados hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 o huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 o chKTI-sSpDB-DM4 o huKTI-S442C-DGN549 en las dosis indicadas y, por lo tanto, los cuatro conjugados fueron bien tolerados en ratones a las dosis indicadas en este estudio (necesita confirmación de MGNX).
Ejemplo 24
Ampliación de la exposición de los conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y maitansinoide mediante la mejora de la unión de FcRn
Para maximizar el potencial de los conjugados de anticuerpo anti-ADAM9 y maitansinoide para impulsar la eficacia, se introdujeron las sustituciones M252Y, S254T y T256E ("la mutación YTE") en la región Fc de los anticuerpos anti-ADAM9, hMAB-A(2I.2) y hMAB-A(2I.2)-S442C, para extender la exposición de los conjugados de anticuerpo y fármaco al mejorar la unión de FcRn. FcRn juega un papel importante en el mantenimiento de los niveles séricos de IgG. Las IgG que tienen endocitosis no específica se unen a FcRn en el endosoma debido a una interacción dependiente del pH. A continuación, la IgG unida a FcRn se clasifica en endosomas de reciclaje y se transporta de regreso a la superficie celular donde se libera la IgG debido al pH neutro. Mejorar la unión de FcRn puede mejorar la clasificación y mejorar la farmacocinética.
El conjugado hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 se preparó como se detalla en el Ejemplo 17a. El conjugado hMAB-A(2I.2)-S442C-YTE-sSPDB-DM4 se preparó como se ha descrito anteriormente en la publicación del PCT n.° WO2017/004025. Como se ve en las Figuras 19A y 19B, la mutación YTE aumentó la afinidad de unión y la avidez del anticuerpo hMAB-A(2I.2) por FcRn humano y cyno. Además, el conjugado hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 mostró una actividad in vitro e in vivo similar en NCI-H1703, SNU5 y Calu3 que el conjugado huMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 parental.
Se realizaron estudios de FC y tolerabilidad en cynomolgus para caracterizar la tolerabilidad y el perfil farmacocinético del conjugado hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 en comparación con el conjugado parental hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. Ambos conjugados se administraron como infusiones IV de 10 minutos a monos cynomolgus macho a una dosis de 4 y 12 mg/kg (dosis de anticuerpo) para evaluar tanto el perfil FC como la tolerabilidad aguda. Además, los anticuerpos desnudos, hMAB-A(2I.2) y hMAB-A(2I.2)-YTE, se administraron a monos cynomolgus macho a una dosis de 4 mg/kg para abordar los posibles efectos de la conjugación en los parámetros FC. Se recogió sangre en el transcurso de 28 días para permitir la medición de las concentraciones de ADC, anticuerpo total y carga útil libre. La

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o un fragmento de unión a ADAM9 del mismo que se une específicamente a ADAM9 humano y ADAM9 cyno:
(I) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo está conjugado con un agente farmacológico; y
(II) donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable de cadena pesada (VH), donde dicho dominio variable de cadena pesada comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3, y dicho dominio variable de cadena ligera comprende un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3, donde:
(A) dicho dominio CDRh1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:34; y
(b ) dicho dominio CDRh2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:36; y
(C) dicho dominio CDRh3 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:46; y
donde:
(A) dicho dominio CDRl1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64; y
(B) dicho dominio CDRl2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y
(C) dicho dominio CDRl3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:65.
2. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o el fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio CDRh1, un dominio CDRh2 y un dominio CDRh3 y un dominio CDRl1, un dominio CDRl2 y un dominio CDRl3 que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
(a) las SEQ ID NO: 8, 35 y 45 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(b) las SEQ ID NO: 8, 35 y 38 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(c) las SEQ ID NO: 8, 35 y 39 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(d) las SEQ ID NO: 8, 35 y 40 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(e) las SEQ ID NO: 8, 35 y 41 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(f) las SEQ ID NO: 8, 35 y 42 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(g) las SEQ ID NO: 8, 35 y 43 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(h) las SEQ ID NO: 8, 35 y 44 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente;
(i) las SEQ ID NO: 8, 35 y 37 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14 respectivamente; y
(j) las SEQ ID NO: 8, 35 y 46 y las SEQ ID NO: 62, 13, 14, respectivamente.
3. El inmunoconjugado de la reivindicación 1 o 2, donde:
(A) dicho dominio VH comprende las SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 o la SEQ ID NO:29; y
(B) dicho dominio VL comprende las SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 o SEQ ID NO:57.
4. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, donde dicho dominio CDRh1 comprende la secuencia de aminoácidos SYWMH (s Eq ID NO:8), dicho dominio CDRh2 comprende la secuencia de aminoácidos EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35), dicho dominio CDRh3 comprende la secuencia de aminoácidos GGYYYYPRQGFLDY (Se Q ID NO:45), dicho dominio CDRl1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62), dicho dominio CDRl2 comprende la secuencia de aminoácidos AASDLES (SEQ ID NO:13) y dicho dominio CDRl3 comprende la secuencia de aminoácidos QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14).
5. El inmunoconjugado de la reivindicación 4, donde dicho inmunoconjugado comprende:
(A) el dominio variable de cadena pesada (VH) de hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28); y/o
(b ) el dominio variable de cadena ligera (VL) de hMAB-A (2I.2) (SeQ ID NO:55); y/o
(C) el dominio variable de cadena pesada (VH) de hMAB-A (2I.2) (SEQ ID n O:28) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:55).
6. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho inmunoconjugado comprende una región Fc, opcionalmente donde dicha región Fc es una región Fc variante que comprende:
(a) una o más modificaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de la región Fc variante por un FcyR; y/o (b) una o más modificaciones de aminoácidos que introducen un residuo de cisteína; y/o
(c) una o más modificaciones de aminoácidos que prolongan la vida media en suero.
7. El inmunoconjugado de la reivindicación 6, donde
(I) dichas una o más modificaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de la región Fc variante por un FcyR comprenden:
(A) L234A;
(B ) L235A; o
(C) L234A y L235A; y
(II) dichas una o más modificaciones de aminoácidos que introducen un residuo de cisteína comprenden S442C; y (III) dichas una o más modificaciones de aminoácidos que prolongan la vida media en suero comprenden:
(A) M252Y;
(B) M252Y y S254T;
(C) M252Y y T256E;
(D) M252Y, S254T y T256E; o
(E) K288D y H435K; y
donde dicha numeración es la del índice EU como en Kabat.
8. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000211_0002
y
9. El inmunoconjugado de la reivindicación 8, donde X en las SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153 o SEQ ID NO:154 está ausente.
10. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho el anticuerpo anti-ADAM9 humanizado comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO:152 y SEQ ID NO:68, respectivamente.
11. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tienen las secuencias de SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:55, respectivamente.
12. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde dicho agente farmacológico es un compuesto de maitansinoide, un compuesto de pirrolobenzodiazepina o un compuesto de indolinobenzodiazepina.
13. El inmunoconjugado de la reivindicación 12, donde dicho agente farmacológico es un compuesto maitansinoide.
14. El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el inmunoconjugado está representado por una fórmula seleccionada de entre el grupo que consiste en:
(I)
Figure imgf000211_0001
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyL1 a través de un residuo de lisina;
Wl es un número entero entre 1 y 20; y
CyL1 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000212_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, Xesté ausente e Y sea -H o un alquilo(C1-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(Ci-C6);
L' se representa mediante la siguiente fórmula:
NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)-(B1'); o
NRa-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1-(B2');
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son cada uno independientemente -H, alquilo(C1-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
m es un número entero entre 1 y 6; y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000213_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5, y opcionalmente donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio;
Figure imgf000213_0002
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyL2 a través de un residuo de lisina;
WL es un número entero entre 1 y 20; y
CyL2 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000213_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina e Y sea -OH o -SO3H;
Rx1 y Rx2 son independientemente alquilo(C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000214_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5, y opcionalmente donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio;
Figure imgf000214_0002
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyL3 a través de un residuo de lisina;
WL es un número entero entre 1 y 20;
CyL3 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000214_0003
m' es 1 o 2;
Ri y R2, son cada uno independientemente H o un alquilo(Ci-C3); y
Zs1 se selecciona de entre cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000215_0001
donde q es un número entero entre 1 y 5, y opcionalmente donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio;
(IV)
CBA-(— Cyc1)
' , wc
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyC1 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC1 se representa mediante la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma donde:
la línea doble -- entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(C1-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
R5 es -H o un alquilo(C1-C3);
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos;
Ra y Rb, en cada aparición, son independientemente -H, alquilo(C1-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q;
W' es -NRe’,
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx3 es un alquilo(C1-C6); y,
Le se representa mediante
Figure imgf000216_0001
s i es el sitio unido covalentemente a CBA, y s2 es el sitio unido covalentemente al grupo C (=O) en CyC1; donde: R19 y R20, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
m" es un número entero entre 1 y 10; y
Rh es -H o un alquilo(C1-C3), y opcionalmente donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o potasio;
Figure imgf000216_0002
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyC2 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC2 se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000216_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
la línea doble
entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H o un alquilo(Ci-C4); y, cuando sea un enlace simple, X sea -H o un resto protector amina, Y sea -OH o -SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
Rx1 es un alquilo(C1-C6);
Re es -H o un alquilo(C1-C6);
W es -NRe’;
Re’ es -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n es un número entero entre 2 y 6;
Rk es -H o -Me;
Rx2 es un alquilo(C1-C6);
LC' se representa mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000217_0001
Figure imgf000217_0002
en donde:
s1 es el sitio enlazado covalentemente a CBAy s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC2;
Z es C(=O)-NR9-, o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(C1-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o un alquilo(C1-C3); y
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos y, opcionalmente, donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o de potasio;
y
(VI)
CBA-í— Cyc3 ]
' 7wc
donde:
CBA es dicho anticuerpo anti-ADAM9 humanizado o fragmento de unión a ADAM9 del mismo que está unido covalentemente a CyC3 a través de un residuo de cisteína;
WC es 1 o 2;
CyC3 se representa mediante la siguiente fórmula:
donde:
m' es 1 o 2;
Ri y R2, son cada uno independientemente -H o un alquilo(Ci-C3);
Figure imgf000218_0001
s i es el sitio enlazado covalentemente a CBAy s2 es el sitio enlazado covalentemente al grupo -S- en CyC3;
Z es C(=O)-NR9- o -NR9-C(=O)-;
Q es -H, un sustituyente cargado o un grupo ionizable;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 y R22,, en cada aparición, son independientemente -H o un alquilo(Ci-C3);
q y r, en cada aparición, son independientemente un número entero entre 0 y 10;
m y n son cada uno independientemente un número entero entre 0 y 10;
Rh es -H o alquilo(C1-C3);
P' es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene de 2 a 20 residuos de aminoácidos y, opcionalmente, donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de sodio o de potasio.
15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16. Un inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 o la composición farmacéutica de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de A dA m 9.
17. El inmunoconjugado o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 16, donde dicha enfermedad o afección asociada con, o caracterizada por, la expresión de ADAM9 es cáncer, opcionalmente donde dicho cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer mieloide, melanoma y cáncer linfoide.
ES17835533T 2016-12-23 2017-12-21 Inmunoconjugados dirigidos a ADAM9 y procedimientos de uso de los mismos Active ES2912266T3 (es)

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