TW201822821A - 靶向adam9之免疫共軛物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含能夠特異性結合至「含解整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」(「ADAM9」)、共軛至至少一種藥理學藥劑之抗體或其片段的免疫共軛物。本發明特別關於與人類ADAM9及非人類靈長類(例如，食蟹獼猴)之ADAM9具有交叉反應性的此類免疫共軛物。本發明另外關於包含輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域之所有此類免疫共軛物，該輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域已經人源化及/或去免疫化以便在向接受受試者投與此類免疫共軛物時展現降低的免疫原性。本發明亦關於含有此類免疫共軛物中任一者之醫藥組成物，以及涉及此類免疫共軛物中任一者在治療癌症及其他疾病及病狀中之用途的方法。

Description

靶向ADAM9之免疫共軛物及其使用方法
本發明係關於包含能夠特異性結合至「含解整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」(「ADAM9 」)、共軛至至少一種藥理學藥劑之抗體或其片段的免疫共軛物。本發明特別關於與人類ADAM9及非人類靈長類(例如 ，食蟹獼猴)之ADAM9具有交叉反應性的此類免疫共軛物。本發明另外關於包含輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域之所有此類免疫共軛物，該輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域已經人源化及/或去免疫化以便在向接受受試者投與此類免疫共軛物時展現降低的免疫原性。本發明亦關於含有此類免疫共軛物中任一者之醫藥組成物，以及涉及此類免疫共軛物中任一者在治療癌症及其他疾病及病狀中之用途的方法。
ADAM為涉及各種生理及病理過程之蛋白質家族(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Edwars, D.R.等人 (2008) 「The ADAM Metalloproteases ,」 Molec. Aspects Med. 29:258-289)。已鑒別出該家族之至少40個基因成員，且認為此類成員中之至少21個在人類中具有功能性(Li, J.等人 (2016) 「Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion ,」 J. Invest. Surg. 26(3):127-133；Duffy, M.J.等人 (2011) 「The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?,」 Clin. Proteomics 8:9:1-13；亦參見美國專利公開案第2013/0045244號)。
ADAM家族成員有具有8個域之相當保守的結構，在該8個域中有金屬蛋白酶域及整合素結合(解整合素)域(Duffy, M.J.等人 (2009) 「The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology ,」 Clin. Chim. Acta 403:31-36)。ADAM金屬蛋白酶域充當脫落酶(sheddase)且已報道藉由裂解跨膜蛋白來調節一系列生物學過程，該等跨膜蛋白接著可充當可溶性配體並調控細胞傳訊(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Ito, N.等人 (2004) 「ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase ,」 Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008-1013)。
ADAM9為ADAM分子家族之成員。其經合成為非活性形式，該非活性形式經蛋白水解裂解，產生活性酶。在上游位點處之加工對酶原之活化特別重要。ADAM9在以下項中表現：纖維母細胞(Zigrino, P.等人 (2011) 「The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts ,」 J. Biol. Chem. 286:6801-6807)、經活化之血管平滑肌細胞(Sun, C.等人 (2010) 「ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling ,」 Cardiovasc. Res. 87:348-355)、單核球(Namba, K.等人 (2001) 「Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes ,」 Cell. Immunol. 213:104-113)、經活化之巨噬細胞(Oksala, N.等人 (2009) 「ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries -Tampere Vascular Study ,」 Ann. Med. 41:279-290)。
ADAM9之金屬蛋白酶活性參與基質組分之降解，從而使腫瘤細胞遷移(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962)。ADAM9之與許多蛇毒解整合素高度同源的解整合素域允許ADAM9與整合素之間的相互作用，且使ADAM9能夠積極或消極地調節細胞黏著事件(Zigrino, P.等人 (2011) 「The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts ,」 J. Biol. Chem. 286:6801-6807；Karadag, A.等人 (2006) 「ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin ,」 Blood 107:3271-3278；Cominetti, M.R.等人 (2009) 「Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions ,」 Biochimie, 91:1045-1052)。已顯示ADAM9解整合素域與α6β1、α6β4、αvβ5及α9β1整合素相互作用。
已發現ADAM9之表現與疾病(尤其是癌症)相關。已發現ADAM9裂解並釋放眾多在腫瘤形成及血管生成方面具有重要作用的分子，諸如TEK、KDR、EPHB4、CD40、VCAM1及CDH5。ADAM9由許多類型的腫瘤細胞表現，該等腫瘤細胞包括乳癌、結腸癌、胃癌、神經膠質瘤、肝癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌及前列腺癌之腫瘤細胞(Yoshimasu, T.等人 (2004) 「Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis ,」 Cancer Res. 64:4190-4196；Peduto, L.等人 (2005) 「Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer ,」 Cancer Res. 65:9312-9319；Zigrino, P.等人 (2005) 「ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines ,」 Int. J. Cancer 116:853-859；Fritzsche, F.R.等人 (2008) 「ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression ,」 BMC Cancer 8:179:1-9；Fry, J.L.等人 (2010) 「Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration ,」 Cancer Res. 70, 8187-8198；Chang, L.等人 (2016) 「Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non ‑ Small Cell Lung Cancer ,」 Oncology Letters 11:1242-1250；Fan, X.等人 (2016) 「ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas ,」 Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11)。
顯著地，已經發現ADAM9表現增加與腫瘤惡性及轉移潛能正相關(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fan, X.等人 (2016) 「ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas ,」 Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11；Li, J.等人 (2016) 「Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion ,」 J. Invest. Surg. 26(3):127-133)。另外，ADAM9及其分泌之可溶性同功型似乎對於癌細胞散佈為至關重要的(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 ,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fry, J.L.等人 (2010) 「Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration ,」 Cancer Res. 70, 8187-8198；Mazzocca, A. (2005) 「A Secreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions ,」 Cancer Res. 65:4728-4738；亦參見美國專利第9,150,656號；第7,585,634號；第7,829,277號；第8,101,361號；及第8,445,198號以及美國專利公開案第2009/0023149號)。
因此，眾多研究已經將ADAM9鑒別為抗癌療法之潛在標靶(Peduto, L. (2009) 「ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer ,」 Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287；Duffy, M.J.等人 (2009) 「Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression ,」 Clin. Cancer Res. 15:1140-1144；Duffy, M.J.等人 (2011) 「The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?,」 Clin. Proteomics 8:9:1-13；Josson, S.等人 (2011) 「Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy ,」 Prostate 71(3):232-240；亦參見美國專利公開案第2016/0138113號、第2016/0068909號、第2016/0024582號、第2015/0368352號、第2015/0337356號、第2015/0337048號、第2015/0010575號、第2014/0342946號、第2012/0077694號、第2011/0151536號、第2011/0129450號、第2010/0291063號、第2010/0233079號、第2010/0112713號、第2009/0285840號、第2009/0203051號、第2004/0092466號、第2003/0091568號及第2002/0068062號以及PCT公開案第WO 2016/077505號、第WO 2014/205293號、第WO 2014/186364號、第WO 2014/124326號、第WO 2014/108480號、第WO 2013/119960號、第WO 2013/098797號、第WO 2013/049704號及第WO 2011/100362號)。另外，亦已發現ADAM9之表現與肺部疾病及炎症相關(參見，例如 ，美國專利公開案第2016/0068909號；第2012/0149595號；第2009/0233300號；第2006/0270618號；及第2009/0142301號)。結合至ADAM9之抗體可自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich及其他公司商購獲得。
然而，儘管存在所有先前進展，但仍需要高親和力靶向ADAM9之免疫共軛物，該等免疫共軛物展現與正常組織之最小結合且能夠以類似的高親和力結合至人類及非人類ADAM9。本發明解決此需要及對改善的癌症治療的需要。
本發明係關於包含能夠特異性結合至「含解整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」(「ADAM9 」)、共軛至至少一種藥理學藥劑之抗體或其片段的免疫共軛物。本發明特別關於與人類ADAM9及非人類靈長類(例如 ，食蟹獼猴)之ADAM9具有交叉反應性的此類免疫共軛物。本發明另外關於包含輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域之所有此類免疫共軛物，該輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域已經人源化及/或去免疫化以便在向接受受試者投與此類免疫共軛物時展現降低的免疫原性。本發明亦關於含有此類免疫共軛物中任一者之醫藥組成物，以及涉及此類免疫共軛物中任一者在治療癌症及其他疾病及病狀中之用途的方法。
詳言之，本發明提供一種包含抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之免疫共軛物： (I) 其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段共軛至藥理學藥劑；且 (II) 其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域，其中該重鏈可變域包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域，且該輕鏈可變域包含CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域，其中： (A) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列；或 (B) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列；或 (C) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列。
在某些實施例中，該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含： (A) (1) MAB-A之該重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (B) (1) MAB-A之該輕鏈可變(VL)域之該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (C) (1) MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之該VH域之該FR1、FR2、FR3及FR4；或 (D) (1) MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之該VL域之該FR1、FR2、FR3及FR4；或 (E) (1) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之該重鏈可變(VH)域；及 (2) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之該VL輕鏈可變(VL)域。
在某些實施例中，MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域分別具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO:47 (SYWX1 H) 其中：X1 為M或I； (2)SEQ ID NO:48 (EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 ) 其中：X2 、X3 、X4 及X5 經獨立地選擇，且 其中：X2 為N或F；X3 為K或R；X4 為K或Q；且X5 為S或G；及 (3)SEQ ID NO:49 (GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY) 其中：X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，且X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得： (A) 當X6 為P時：X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； (B) 當X6 為F、Y或W時：X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； (C) 當X6 為I、L或V時：X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； (D) 當X6 為T時：X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； (E) 當X6 為G時：X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L；且 (F) 當X6 為D時：X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
在某些實施例中，MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域包含胺基酸序列SEQ ID NO:15 ： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFSSYWX1 H WVRQA PGKGLEWVGE IIPIX2 GHTNY NEX3 FX4 X5 RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY WGQGTTVT VSS 其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 及X6 經獨立地選擇， 其中：X1 為M或I；X2 為N或F；X3 為K或R；X4 為K或Q；X5 為S或G，且X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得： 當X6 為P時；X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； 當X6 為F、Y或W時；X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； 當X6 為I、L或V時；X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； 當X6 為T時；X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； 當X6 為G時；X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L； 當X6 為D時；X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
在某些實施例中，MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域係選自由以下所組成之群組： (1) hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )； (2) hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )； (3) hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )； (4) hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )； (5) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )； (6) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )； (7) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )； (8) hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )； (9) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )； (10) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )； (11) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )； (12) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )； (13) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 )；及 (14) hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 )。
在某些實施例中，MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域分別具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO:66 (X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N) 其中：X12 、X13 、X14 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；且X14 為M或L； (2)SEQ ID NO:13 (AASDLES)；及 (3)SEQ ID NO:67 (QQSX15 X16 X17 PFT) 其中：X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且其中：X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
在某些實施例中，輕鏈可變(VL)域包含胺基酸序列SEQ ID NO:53 ： DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCX12 ASQSVD YX13 GDSYX14 N WY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSX15 X16 X17 PF T FGQGTKLEI K 其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；X14 為M或L；X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
在某些實施例中，MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域係選自由以下所組成之群組： (1) hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )； (2) hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )； (3) hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )； (4) hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )； (5) hMAB-A VL(2A) (SEQ ID NO:20 )。
在某些實施例中，該CDRH 1域包含胺基酸序列SYWMH (SEQ ID NO:8 )，該CDRH 2域包含胺基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35 )，且該CDRH 3域包含胺基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45 )。
在某些實施例中，該CDRL 1域包含胺基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62 )，該CDRL 2域包含胺基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:13 )，且該CDRL 3域包含胺基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14 )。
在某些實施例中，免疫共軛物包含： (A) hMAB-A(2I.2) 之重鏈可變(VH)域(SEQ ID NO:28 )；或 (B) hMAB-A(2I.2) 之輕鏈可變(VL)域(SEQ ID NO:55 )；或 (C) hMAB-A(2I.2) 之重鏈可變(VH)域(SEQ ID NO:28 )及hMAB-A(2I.2) 之輕鏈可變(VL)域(SEQ ID NO:55 )。
在某些實施例中，免疫共軛物包含Fc區。在一些實施例中，Fc區為包含以下之變異體Fc區：(a)減少該變異體Fc區對FcγR之親和力的一或多個胺基酸修飾；及/或(b)引入半胱胺酸殘基的一或多個胺基酸修飾。在某些實施例中，減少變異體Fc區對FcγR之親和力的一或多個胺基酸修飾包含：(A) L234A；(B) L235A；或(C) L234A及L235A；其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號。在一些實施例中，引入半胱胺酸殘基的該一或多個胺基酸修飾包含S442C，其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物包含特異性結合至人類ADAM9及cynoADAM9之人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段共軛至該藥理學藥劑。
在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下所組成之群組之序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域： (a) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (c) 分別SEQ ID NO: 8、36及10以及SEQ ID NO: 63、13、14；及 (d) 分別SEQ ID NO: 34、36及10以及SEQ ID NO:64、13、65。
在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與選自由以下所組成之群組之序列至少90%、至少95%或至少99%一致的序列： (a) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及 (d)分別SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有選自由以下所組成之群組之序列： (a) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及 (d) 分別SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段經最佳化以相較於嵌合或鼠親代抗體與cynoADAM9之結合親和力有至少100倍增強並保留與人類ADAM9的高親和力結合。
在某些實施例中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下所組成之群組之序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域： (a) 分別SEQ ID NO: 8、35及37以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別SEQ ID NO: 8、35及38以及SEQ ID NO: 62、13、14； (c) 分別SEQ ID NO: 8、35及39以及SEQ ID NO: 62、13、14； (d) 分別SEQ ID NO: 8、35及40以及SEQ ID NO: 62、13、14； (e) 分別SEQ ID NO: 8、35及41以及SEQ ID NO: 62、13、14； (f) 分別SEQ ID NO: 8、35及42以及SEQ ID NO: 62、13、14； (g) 分別SEQ ID NO: 8、35及43以及SEQ ID NO: 62、13、14； (h) 分別SEQ ID NO: 8、35及44以及SEQ ID NO: 62、13、14； (i) 分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14；及 (j) 分別SEQ ID NO: 8、35及46以及SEQ ID NO: 62、13、14。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與選自由以下所組成之群組之序列至少90%、至少95%或至少99%一致的序列： (a) 分別SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有選自由以下所組成之群組之序列： (a) 分別SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體為包含Fc區之全長抗體。在一些實施例中，Fc區為包含以下之變異體Fc區：(a)減少該變異體Fc區對FcγR之親和的之一或多個胺基酸修飾，其選自由以下所組成之群組：L234A、L235A、及L234A及L235A；及/或(b)在S442處引入半胱胺酸殘基的胺酸修飾，其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號。
在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下所組成之群組之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:68； (b) 分別SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:68；及 (c) 分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68。
在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下所組成之群組之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:68； (b) 分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68； (c) 分別SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:68； (d) 分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68； (e) 分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68； (f) 分別SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:68；及 (g) 分別SEQ ID NO:154及SEQ ID NO:68。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本文所述之本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 由下式表示：或或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基； L'由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)- (B1')；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs1 - (B2')； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20之間個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本文所述之本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL2 ； WL 為1至20之整數；且 CyL2 由下式表示：；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H； Rx1 及Rx2 獨立地為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL3 ； WL 為1至20之整數； CyL3 由下式表示：， m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物包含經由N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)鍵聯至美登木素生物鹼DM4的人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其中人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X為離胺酸。在一些實施例中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X不存在。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： WL 為1至10之整數；
CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，在一些實施例中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X為離胺酸。在一些實施例中，在一些實施例中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X不存在。在一些實施例中，包含免疫共軛物之組成物(例如 ，醫藥組成物)之DAR值處於以下範圍內：1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5或1.8至2.2。在一些實施例中，DAR小於4.0，小於3.8，小於3.6，小於3.5，小於3.0或小於2.5。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本文所述之本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC1 ； WC 為1或2； CyC1 由下式表示：；或， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基；且， LC 由表示，s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC1 上之-C(=O)-基團之位點；其中： R19 及R20 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； m"為1與10之間的整數；且 Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；
CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，SEQ ID NO:142中之X為離胺酸。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。在一些實施例中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。
在某些實施例中，免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本文所述之本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC2 ； WC 為1或2； CyC2 由下式表示：或， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； Rx1 為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ； Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx2 為(C1 -C6 )烷基； LC '由下式表示：；； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC2 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為-H、帶電取代基或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為本文所述之本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC3 ； WC 為1或2； CyC3 由下式表示：其中： m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； LC '由下式表示：；； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC3 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為H、帶電取代基、或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： DM為由下式表示之藥物部分：； WC 為1或2；
CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。在一些實施例中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。在一些實施例中，WC 為2。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： DM為由下式表示之藥物部分：； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈；且 WC 為1或2。在一些實施例中，WC 為2。
本發明之另一態樣提供一種醫藥組成物，其包含有效量本文所述之本發明之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療受試者之與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀的方法，其包含向該受試者投與有效量本文所述之本發明之免疫共軛物或醫藥組成物。在本發明中亦提供本文所述之本發明之免疫共軛物或醫藥組成物在治療受試者之與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀中之用途。本發明亦提供本文所述之本發明之免疫共軛物或醫藥組成物用於製造用於治療受試者之與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀的藥物之用途。
在某些實施例中，與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀為癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下所組成之群組：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、胰腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。在某些實施例中，非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌。在某些實施例中，結腸直腸癌為腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸基質瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張美國專利申請序列第62/438,488號(2016年12月23日申請；待審)；及美國專利申請序列第62/480,201號(2017年3月31日申請；待審)之優先權，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。 對序列表之引用
本申請案包括根據37C.F.R. 1.821及以下 之一或多個序列表，該等序列表揭示於計算機可讀媒體中(文件名稱：NAME_Sequence_Listing_ST25.txt，創建於2017年12月## 日，且大小為## 個位元組)，該文件以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於包含能夠特異性結合至「含解整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」(「ADAM9 」)、共軛至至少一種藥理學藥劑之抗體或其片段的免疫共軛物。本發明特別關於與人類ADAM9及非人類靈長類(例如 ，食蟹獼猴)之ADAM9具有交叉反應性的此類免疫共軛物。本發明另外關於包含輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域之所有此類免疫共軛物，該輕鏈可變(VL)域及/或重鏈可變(VH)域已經人源化及/或去免疫化以便在向接受受試者投與此類免疫共軛物時展現降低的免疫原性。本發明亦關於含有此類免疫共軛物中任一者之醫藥組成物，以及涉及此類免疫共軛物中任一者在治療癌症及其他疾病及病狀中之用途的方法。 I. 抗體及其結合域
本發明之免疫共軛物包含結合至ADAM9或其ADAM9結合片段之抗體。「抗體 」為能夠透過位於免疫球蛋白分子之可變域 中的至少一個抗原識別位點來特異性結合至標靶(諸如，碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等 )的免疫球蛋白分子。如本文所使用，術語「抗體 (antibody) 」及「抗體 (antibodies) 」係指單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多株抗體、駱駝源化抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、內抗體及以上任一者之抗原決定基結合片段。特別地，術語「抗體」包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段，亦即 含有抗原決定基結合位點之分子。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如 ，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如 ，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 )或子類。近幾十年來已看到對抗體之治療潛能之關注的復興，且抗體已經成為生物技術衍生藥物之主要類別之一(Chan, C.E.等人 (2009) 「The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,」 Singapore Med. J. 50(7):663-666)。除了在診斷中之用途以外，已經顯示抗體可用作治療劑。超過200種基於抗體之藥物已經核准使用或處於開發中。
抗體能夠「免疫特異性結合 」至多肽或蛋白質或非蛋白質分子，這歸因於在此類分子上存在特定域或部分或構象(「抗原決定基 」)。含抗原決定基之分子可具有免疫原性活性，使得其引起動物之抗體產生反應；此類分子被稱為「抗原 」。如本文所用，若抗體相對於替代性抗原決定基更頻繁、更迅速、以更長的持續時間及/或以更大的親和力與抗原決定基反應或締合，則稱抗體「免疫特異性 」結合另一分子之區(亦即 ，該抗原決定基)。例如，免疫特異性結合至病毒抗原決定基之抗體為與該抗體免疫特異性結合至其他病毒抗原決定基或非病毒抗原決定基相比，以更大親和力、親合力、更容易及/或以更長的持續時間結合該病毒抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦應理解，例如，免疫特異性結合至第一標靶之抗體(或部分或抗原決定基)可或可不特異性或優先地結合至第二標靶。因而，與特定抗原決定基之「免疫特異性結合」未必需要(儘管其可包括)與該抗原決定基之唯一結合。通常並非必要地，對結合之提及意指「免疫特異性」結合。若結合展現受體結合其各個配體的特異性，則稱兩個分子能夠以「生理特異性 」方式彼此結合。
術語「單株抗體 」係指同源抗體群體，其中單株抗體包含涉及抗原之選擇性結合的胺基酸(天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸)。單株抗體針對單一抗原決定基(或抗原位點)具有高特異性。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白、人源化單株抗體、嵌合單株抗體及免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態，該免疫球蛋白分子包含具有所要特異性及結合至抗原之能力的抗原識別位點。該術語並非意欲就抗體之來源或製成(例如 ，藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、基因轉殖動物等 )該抗體之方式進行限制。該術語包括完整免疫球蛋白以及以上在「抗體」之定義下所述的片段等 。製造單株抗體之方法為此項技術中已知的。一種可採用的方法為Kohler, G.等人 (1975) 「Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,」 Nature 256:495-497之方法或其修改。通常，在小鼠、大鼠或兔中開發單株抗體。抗體藉由用免疫原性量的細胞、細胞提取物或含有所要抗原決定基之蛋白質製劑使動物免疫來產生。免疫原可為但不限於初代細胞、經培養細胞株、癌性細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫之細胞可在將其用作免疫原之前培養一段時間(例如 ，至少24小時)。細胞可自身用作免疫原或與非變性佐劑(諸如Ribi)組合使用(參見，例如 ，Jennings, V.M. (1995) 「Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,」 ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，細胞在用作免疫原時應保持完整且較佳保持活力。完整細胞與經免疫動物之破裂細胞相比可使抗原更好地被偵測到。使用變性或苛刻的佐劑(例如 ，弗氏佐劑)可使細胞破裂，且因此不受提倡。免疫原可以週期性間隔(諸如每兩週或每週)投與多次，或可以維持動物(例如 ，組織重組體)之活力的方式投與。或者，現有單株抗體及對所要病原性抗原決定基具有免疫特異性的任何其他等效抗體可藉由此項技術中已知的任何手段對來定序及重組產生。在一個實施例中，對這類抗體進行定序，且接著將多核苷酸序列選殖至載體中以供表現或繁殖。編碼所關注抗體之序列可維持在宿主細胞中之載體中，且接著可將該宿主細胞擴增並冷凍以供未來使用。此類抗體之多核苷酸序列可用於遺傳操作以產生親和力經最佳化的嵌合抗體、人源化抗體及/或犬源化抗體，以改善抗體之親和力或其他特徵，以及產生本發明之免疫共軛物。將抗體人源化之一般原則涉及保留該抗體之抗原結合部分的基本序列，同時用人類抗體序列交換抗體之非人類其餘部分。
天然抗體(諸如天然IgG抗體)由兩條與「重鏈 」複合之「輕鏈 」組成。各輕鏈含有可變域(「VL 」)及恆定域(「CL 」)。各重鏈含有可變域(「VH 」)、三個恆定域(「CH1 」、「CH2 」及「CH3 」)及位於CH1 與CH2 域之間的「鉸鏈 」區(「H 」)。相比之下，scFv為藉由經由短鍵聯肽將輕鏈可變域及重鏈可變域鍵聯在一起所製成之單鏈分子。
天然存在之免疫球蛋白(例如 IgG)之基本結構單元因此為具有兩條輕鏈及兩條重鏈之四聚體，其通常表現為約150,000 Da之醣蛋白。各鏈之胺基端(「N 端 」)部分包括具有約100至110或更多個胺基酸之主要負責抗原識別的可變域。各鏈之羧基端(「C 端 」)部分限定恆定區，其中輕鏈具有單個恆定域，且重鏈通常具有三個恆定域及鉸鏈區。因此，IgG分子輕鏈之結構為n-VL-CL-c，且IgG重鏈之結構為n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n及c分別表示多肽之N端及C端)。 A. 抗體可變域之特徵
IgG分子之可變域由1、2且最常見3個互補決定區(「CDR 」，亦即 分別為CDR1 、CDR2 及CDR3 )及非CDR區段(稱為架構區 (「FR 」)組成，該等互補決定區含有與抗原決定基接觸之殘基，該等架構區一般維持結構並決定CDR區之位置以容許此類接觸(儘管某些架構殘基亦可與抗原決定基接觸)。因此，VL及VH域通常具有以下結構：n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c (其中「n」表示N端，且「c」表示C端)。作為(或可用作)抗體輕鏈之第一、第二、第三及第四FR的多肽在本文中分別定名為：FRL 1 域 、FRL 2 域 、FRL 3 域 及FRL 4 域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈之第一、第二、第三及第四FR的多肽在本文中分別定名為：FRH 1 域、FRH 2 域、FRH 3 域及FRH 4 域 。作為(或可用作)抗體輕鏈之第一、第二及第三CDR的多肽在本文中分別定名為：CDRL 1 域 、CDRL 2 域 及CDRL 3 域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈之第一、第二及第三CDR的多肽在本文中分別定名為：CDRH 1 域 、CDRH 2 域 及CDRH 3 域 。因此，術語CDRL 1域、CDRL 2域、CDRL 3域、CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域係關於在併入抗體中時使抗體能夠結合至特異性抗原決定基之多肽。
在本說明書通篇，免疫球蛋白之成熟重鏈及輕鏈之可變域中殘基之編號由鏈中胺基酸之位置來定名。Kabat描述抗體之眾多胺基酸序列，鑒別各亞組之胺基酸共同序列，且將殘基號分配至各胺基酸，且CDR係如由Kabat所定義來鑒別(應當理解，如由Chothia, C.及Lesk, A. M. ((1987) 「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins ,」 J. Mol. Biol. 196:901-917)所定義之CDRH 1較早開始為五個殘基)。可藉由參考保守胺基酸將所論述之抗體與Kabat中之共同序列之一進行比對來將Kabat之編號方案擴展至未包括在其概要中的抗體。此用於分配殘基號之方法已成為本領域中之標準，且容易鑒別不同抗體(包括嵌合或人源化變異體)中等效位置處的胺基酸。例如，人類抗體輕鏈之位置50處的胺基酸佔據與小鼠抗體輕鏈之位置50處的胺基酸等效的位置。
抗體結合抗原之抗原決定基的能力取決於抗體之VL及VH域之存在及胺基酸序列。抗體之輕鏈及重鏈之相互作用且特別是抗體之VL域及VH域之相互作用形成天然抗體(諸如IgG)之兩個抗原決定基結合位點之一。天然抗體能夠結合至僅一種抗原決定基種類(亦即 ，該等天然抗體為單特異性的)，但是該等天然抗體可結合該抗原決定基種類之多個拷貝(亦即 ，展現二價或多價)。
因此，如本文所使用，術語「抗原決定基結合片段 」意指能夠免疫特異性結合至抗原決定基的抗體片段，且術語「抗原決定基結合位點 」係指分子之包含抗原決定基結合片段的部分。抗原決定基結合片段可含有抗體之CDR域中之任何1、2、3、4或5者，或可含有抗體之CDR域中之全部6者，且雖然能夠免疫特異性結合至此類抗原決定基，但是可對此類抗原決定基展現與此類抗體之免疫特異性、親和性或選擇性不同的免疫特異性、親和性或選擇性。然而，較佳的是，抗原決定基結合片段將含有此類抗體之CDR域中之全部6者。抗體之抗原決定基結合片段可為單個多肽鏈(例如 ，scFv)，或可包含二或更多個多肽鏈，該等多肽鏈各自具有胺基端及羧基端(例如 ，Fab片段、Fab2 片段等 )。除非具體指出，否則本文所述之蛋白質分子之域之順序係以「N 端至 C 端 」方向。
本發明亦涵蓋包含單鏈可變域片段(「scFv 」)之免疫共軛物，該等單鏈可變域片段包含本發明之抗ADAM9-VL及/或VH域。單鏈可變域片段包含使用短「連接子」肽鍵聯在一起之VL及VH域。此類連接子可經修飾以提供額外的功能，諸如容許藥物連接或容許至固體支持物之連接。單鏈變異體可重組或合成產生。對於scFv之合成產生，可使用自動化合成儀。對於scFv之重組產生，可將含有編碼scFv之多核苷酸的合適質粒引入合適宿主細胞(真核細胞(諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核細胞(諸如大腸桿菌))中。編碼所關注scFv之多核苷酸可藉由常規操作(諸如，多核苷酸之連接)製成。所得scFv可使用此項技術中已知的標準蛋白質純化技術來分離。
本發明亦特別涵蓋：包含本發明抗ADAM9抗體之人源化/經最佳化變異體之CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3域，以及含有此類CDRL 中之任何1、2或3者的VL域及含有此類CDRH 中之任何1、2或3者的VH域的免疫共軛物；以及包含上述者之多特異性結合分子。術語「人源化 」抗體係指具有來自非人類物種的免疫球蛋白之抗原決定基結合位點及基於人類免疫球蛋白之結構及/或序列的其餘免疫球蛋白結構的嵌合分子。一般使用重組技術製備人源化抗體。本發明之免疫共軛物可包含在本文中定名為「MAB-A 」的抗體之人源化、嵌合或犬源化變異體。編碼MAB-A之可變域的多核苷酸序列可用於遺傳操作，以產生具有改善或改變的特徵(例如 ，親和力、交叉反應性、特異性等 )之MAB-A衍生物。將抗體人源化之一般原則涉及保留該抗體之抗原決定基結合部分的基本序列，同時用人類抗體序列交換抗體之非人類其餘部分。使單株抗體人源化有四個一般步驟。此等步驟為：(1)判定起始抗體輕鏈可變域及重鏈可變域之核苷酸及經預測之胺基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，亦即 在人源化或犬源化過程期間決定使用哪個抗體架構區；(3)採用現行的人源化或犬源化方法/技術；及(4)轉染且表現人源化抗體。參見，例如美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；及第6,331,415號。術語「經最佳化 」抗體係指在輕鏈可變區或重鏈可變區中之至少一個互補決定區(CDR)中具有至少一個與親代抗體不同的胺基酸的抗體，此舉賦予比親代抗體高的與人類ADAM9及/或食蟹獼猴ADAM9之結合親和力，例如，高2倍或更多倍的結合親和力。從本文所提供之教示應理解，本發明之抗體可為人源化抗體、經最佳化抗體或人源化抗體及經最佳化抗體兩者。
抗原決定基結合位點可包含融合至一或多個恆定域之完整可變域，或僅包含接枝至適當架構區之此類可變域之CDR。抗原決定基結合位點可為野生型或可藉由一或多個胺基酸取代、插入或缺失來修飾。此類作用部分或完全消除恆定區充當接受者(例如 ，人類個體)之免疫原的能力，然而對外來可變域之免疫反應的可能性保持不變(LoBuglio, A.F.等人 (1989) 「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一方法不僅關注提供來源於人類的恆定區，而且關注修飾可變域以便將該等可變域盡可能緊密地改造成見於人類免疫球蛋白中之形式。已知抗體之重鏈及輕鏈兩者之可變域含有三個CDR，其回應於所論述之抗原而變化且決定結合能力，其側接有四個架構區，該等架構區在給定物種中相對保守且推定地提供用於CDR之骨架。當相對於特定抗原來製備非人類抗體時，可變域可藉由將來源於非人類抗體之CDR接枝於欲修飾之人類抗體中存在的FR上來「改造」或「人源化」。此方法於各種抗體之應用已由以下文獻報導：Sato, K.等人 (1993) Cancer Res 53:851-856；Riechmann, L.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies for Therapy ,」 Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,」 Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等人 (1991) 「Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,」 Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等人 (1991) 「Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,」 Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等人 (1991) 「Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等人 (1991) 「Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,」 Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等人 (1991) 「Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等人 (1992) 「Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；及Co, M.S.等人 (1992) 「Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,」 J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施例中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，人源化鼠抗體，其含有鼠抗體中存在之所有六個CDR)。在其他實施例中，人源化抗體具有相對於原始抗體之CDR在序列方面不同的一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個)。
已經描述眾多包含來源於非人類免疫球蛋白之抗原決定基結合位點的人源化抗體分子，具有齧齒動物或經修飾齧齒動物可變域及其融合至人類恆定域之相關互補決定區(CDR)的嵌合抗體(參見，例如Winter等人 (1991) 「Man-made Antibodies ,」 Nature 349:293-299；Lobuglio等人 (1989) 「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224；Shaw等人 (1987) 「Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,」 J. Immunol. 138:4534-4538；及Brown等人 (1987) 「Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,」 Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述在與適當人類抗體恆定區融合之前接枝至人類支持架構區(FR)中之齧齒動物CDR(參見，例如Riechmann, L.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies for Therapy ,」 Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,」 Science 239:1534-1536；及Jones等人 (1986) 「Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,」 Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述由重組鑲飾(veneered)齧齒動物架構區支持之齧齒動物CDR(參見，例如歐洲專利公開案第519,596號)。此等「人源化」分子經設計成使對齧齒動物抗人類抗體分子之非所要免疫學反應最小化，這限制彼等部分在人類接受者中之治療應用的持續時間及有效性。亦可利用之使抗體人源化之其他方法由Daugherty等人 (1991) 「Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,」 Nucl. Acids Res. 19:2471-2476揭示，且在美國專利第6,180,377號；第6,054,297號；第5,997,867號；及第5,866,692號中揭示。 B. 抗體恆定域之特徵
在本說明書通篇，IgG重鏈之恆定區中殘基之編號為如Kabat等人 , SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 第5版 Public Health Service, NH1, MD (1991) (「Kabat 」)中的EU索引之編號，該文獻明確以引用方式併入本文中。術語「如 Kabat 中所闡明之 EU 索引 」係指Kabat中提供之人類IgG1 EU抗體之恆定域之編號。此用於分配殘基編號之方法已成為本領域中之標準，且容易鑒別不同抗體同型之恆定區中之等效位置處的胺基酸。 1. 輕鏈之恆定區
如上文所指示，抗體之各輕鏈含有可變域(「VL 」)及恆定域(「CL 」)。
較佳CL域為人類IgG CLκ域。示範性人類CLκ域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:69 )： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
或者，示範性CL域為人類IgG CLλ域。示範性人類CLλ域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:70 )： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS 2. 重鏈之恆定區 a. 天然存在之Fc區
如本文所提供，本發明之免疫共軛物可包含Fc區。本發明之此類免疫共軛物之Fc區可為任何同型(例如 ，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本發明之免疫共軛物可進一步包含CH1域及/或鉸鏈區。當存在時，CH1域及/或鉸鏈區可為任何同型(例如 ，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，且較佳為與所要Fc區相同的同型。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之Fc區可為完整Fc區(例如 ，完整IgG Fc區)或僅為Fc區之片段。視情況，本發明之含Fc區之免疫共軛物之Fc區缺乏C端離胺酸胺基酸殘基。
抗體之兩條重鏈之CH1域與抗體輕鏈之「CL」恆定區複合，且經由介入鉸鏈域連接至重鏈CH2域。
示範性CH1域為人類IgG1 CH1域。示範性人類IgG1 CH1域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:71 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示範性CH1域為人類IgG2 CH1域。示範性人類IgG2 CH1域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:72 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示範性CH1域為人類IgG4 CH1域。示範性人類IgG4 CH1域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:73 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
一個示範性鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。示範性人類IgG1鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:74 )：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示範性鉸鏈區為人類IgG2鉸鏈區。示範性人類IgG2鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:75 )：ERKCCVECPPCP。
另一示範性鉸鏈區為人類IgG4鉸鏈區。示範性人類IgG4鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:76 )：ESKYGPPCPSCP。如上文所述，IgG4鉸鏈區可包含穩定化突變，諸如S228P取代。示範性穩定化IgG4鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:77 )：ESKYGPPCPPCP。
抗體之兩條重鏈之CH2及CH3域相互作用以形成「Fc 區 」，其為由細胞「Fc 受體 」(包括但不限於Fcγ受體(「FcγR 」))識別之域。如本文所使用，術語「Fc區」用於定義IgG重鏈之包含該鏈之CH2及CH3域的C端區。若Fc區之胺基酸序列相對於其他IgG同型與一IgG同型之同源性最高，則稱該Fc區為特定IgG同型、類別或子類。
示範性人類IgG1之CH2-CH3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:1 )： 如藉由如Kabat所闡明之EU索引所編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
示範性人類IgG2之CH2-CH3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:2 )：如藉由如Kabat所闡明之EU索引所編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
示範性人類IgG3之CH2-CH3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:3 )：如藉由如Kabat所闡明之EU索引所編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
示範性人類IgG4之CH2-CH3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:4 )： 如藉由如Kabat所闡明之EU索引所編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
已經在抗體恆定區(例如 ，Fc位置，包括但不限於如藉由如Kabat所闡明之EU索引所編號的位置270、272、312、315、356及358)內的眾多不同位置處觀察到多形性，且因此所呈現之序列與現有技術之序列之間可存在輕微差異。人類免疫球蛋白之多形性形式已經良好表徵。目前，已知18個Gm同種異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc,等人 , 「The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function And Regulation. 」 Pergamon, Oxford,第43-78頁(1990)；Lefranc, G.等人 , 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮，本發明之抗體可併入任何免疫球蛋白基因之任何同種異型、同族同種異型(isoallotype)或單倍型，且不限於本文所提供之序列之同種異型、同族同種異型或單倍型。此外，在一些表現系統中，CH3域之C端胺基酸殘基(上文加粗)可經轉譯後移除。因此，CH3域之C端殘基為本發明之免疫共軛物中之可選胺基酸殘基。本發明具體涵蓋缺乏CH3域之C端殘基的免疫共軛物。本發明亦具體涵蓋包含CH3域之C端離胺酸殘基之此類構築體。 b. Fcγ受體(FcγR)
在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統細胞之相互作用導致一系列廣泛的反應，其範圍為從效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞去顆粒及吞噬作用)至諸如調控淋巴球增殖及抗體分泌之免疫調節訊息。所有此等相互作用皆透過抗體或免疫複合物之Fc區與造血細胞上之特化細胞表面受體且特別是與見於多種類型的免疫系統細胞(例如 ，B淋巴球、濾泡樹狀細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞)之表面上的受體(單一地稱為「Fcγ 受體 」 「FcγR 」，且共同稱為「FcγR 」)之結合來起始。
由抗體及免疫複合物觸發的細胞反應之多樣性係由以下三種Fc受體之結構異質性引起：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16)。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)及FcγRIII (CD16)為活化的(亦即 ，免疫系統增強)受體；FcγRIIB (CD32B)為抑制性(亦即 ，免疫系統阻抑)受體。另外，與新生兒Fc受體(FcRn)之相互作用介導IgG分子自胞內體循環至細胞表面且釋放至血液中。上文呈現示範性野生型IgG1 (SEQ ID NO:1 )、IgG2 (SEQ ID NO:2 )、IgG3 (SEQ ID NO:3 )及IgG4 (SEQ ID NO:4 )之胺基酸序列。
不同FcγR介導完全相反功能之能力反映不同的FcγR之間的結構差異，且特別反映結合的FcγR是具有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(「ITA M 」)還是具有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(「ITI M 」)。此等結構募集不同的細胞質酶決定FcγR介導之細胞反應之結果。含ITAM之FcγR包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，且當結合至Fc區(例如 ，存在於免疫複合物中之聚集的Fc區)時活化免疫系統。FcγRIIB為當前唯一已知的天然含ITIM之FcγR；其在結合至聚集的Fc區時發揮作用以阻抑或抑制免疫系統。人類嗜中性球表現FcγRIIA基因。經由免疫複合物或特異性抗體交聯進行的FcγRIIA聚集用於使ITAM與促進ITAM磷酸化之受體相關激酶聚集。ITAM磷酸化用作Syk激酶之停泊位點(docking site)，該Syk激酶之活化導致下游受質(例如 ，PI3 K)之活化。細胞活化導致促炎性介質之釋放。FcγRIIB基因在B淋巴球上表現；其細胞外域與FcγRIIA 96%一致，且以不可區分之方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB之細胞質域中之存在限定FcγR之此抑制性子類。最近確立了此抑制之分子基礎。當連同活化FcγR一起共連接時，FcγRIIB中之ITIM變為磷酸化的，且吸引肌醇多磷酸5'-磷酸酶(SHIP)之SH2域，該肌醇多磷酸5'-磷酸酶水解由於含ITAM之FcγR介導之酪胺酸激酶活化而釋放的磷酸肌醇傳訊者，因此防止細胞內Ca++ 流入。因此，FcγRIIB之交聯阻抑對FcγR連接之活化反應且抑制細胞反應性。B細胞活化、B細胞增殖及抗體分泌因此被中止。 c. 變異體Fc區
Fc區之修飾可導致表型改變，例如血清半衰期改變、穩定性改變、對細胞酶之易感性改變或效應功能改變。因此，可能需要關於效應功能修飾本發明之含Fc區之分子，例如以增強此類分子在治療癌症方面之有效性。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗作用但不殺傷帶有靶抗原之細胞的抗體之情況下，需要減少或消除效應功能。當針對以低水準表現FcγR的非所要細胞(諸如腫瘤及外來細胞，例如具有低水準FcγRIIB之腫瘤特異性B細胞(例如 ，非何傑金氏淋巴瘤、CLL及柏基特氏淋巴瘤))時，效應功能增加一般為所要的。具有此類經賦予或改變之效應功能活性之本發明之免疫共軛物可用於治療及/或預防需要增強的效應功能活性之功效的疾病、病症或感染。
因此，在某些實施例中，本發明之含Fc區之免疫共軛物之Fc區可為經工程改造之變異體Fc區。儘管本發明之免疫共軛物之Fc區可具有結合至一或多種Fc受體(例如 ，FcγR)之能力，但是更佳的是，此類變異體Fc區與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)之結合(相對於由野生型Fc區展現之結合)改變，例如 ，與活化受體之結合將增強及/或結合至抑制性受體之能力實質上降低或無能力。因此，本發明之免疫共軛物之Fc區可包括完整Fc區之一些或全部CH2域及/或一些或全部CH3域，或可包含變異體CH2及/或變異體CH3序列(其可相對於完整Fc區之CH2或CH3域包括例如一或多個插入及/或一或多個缺失)。此類Fc區可包含非Fc多肽部分，或可包含非天然完整Fc區之部分，或可包含CH2及/或CH3域之非天然存在之取向(諸如，例如兩個CH2域或兩個CH3域，或在N端至C端方向上，CH3域鍵聯至CH2域等 )。
鑒別為改變效應功能之Fc區修飾為此項技術中已知的，包括增加與活化受體(例如 ，FcγRIIA (CD16A)之結合且降低與抑制性受體(例如 ，FcγRIIB (CD32B)之結合的修飾(參見，例如 ，Stavenhagen, J.B.等人 (2007) 「Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,」 Cancer Res. 57(18):8882-8890)。表 1 列出增加與活化受體之結合及/或降低與抑制性受體之結合的示範性修飾之示範性單一、雙重、三重、四重及五重取代(編號為如Kabat中之EU索引之編號，且取代係相對於胺基酸序列SEQ ID NO:1 )。
與CD32B之結合降低及/或與CD16A之結合增加的人類IgG1 Fc區之示範性變異體含有F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L取代，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。此等胺基酸取代可以任何組合存在於人類IgG1 Fc區中。在一個實施例中，變異體人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P及Y300L取代。在另一實施例中，變異體人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L取代。
在某些實施例中，本發明之免疫共軛物之Fc區較佳展現與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)之結合減少(或實質上無結合)(相對由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )所展現之結合)。在具體實施例中，本發明之免疫共軛物包含展現ADCC效應功能降低之IgG Fc區。在較佳實施例中，免疫共軛物之CH2-CH3域包括以下取代中之任何1、2、3或4者：L234A、L235A、D265A、N297Q及N297G，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。在另一實施例中，CH2-CH3域含有N297Q取代、N297G取代、L234A及L235A取代或D265A取代，因為此等突變消除FcR結合。或者，利用固有地展現與FcγRIIIA (CD16a)之結合減少(或實質上無結合)及/或效應功能降低(相對於野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )所展現之結合及效應功能))的天然存在之Fc區之CH2-CH3域。在具體實施例中，本發明之免疫共軛物包含IgG2 Fc區(SEQ ID NO:2 )或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:4 )。當利用IgG4 Fc區時，本發明亦涵蓋引入穩定化突變，諸如上文所述之鉸鏈區S228P取代(參見，例如 ，SEQ ID NO:77 )。由於N297G、N297Q、L234A、L235A及D265A取代消除效應功能，所以在需要效應功能之情況下，較佳不採用此等取代。
效應功能降低或消除的本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之較佳IgG1序列將包含取代L234A/L235A (加下劃線示出)(SEQ ID NO:78 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第二較佳IgG1序列包含S442C取代(加下劃線示出)，S442C取代容許兩個CH3域經由二硫鍵彼此共價鍵結或醫藥藥劑之共軛。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:79 )： 其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第三較佳IgG1序列包含L234A/L235A取代(加下劃線示出)及S442C取代(加下劃線示出)，L234A/L235A取代降低或消除效應功能，S442C取代容許兩個CH3域經由二硫鍵彼此共價鍵結或醫藥藥劑之共軛。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:80 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
包含Fc區之蛋白質之血清半衰期可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來增加。如本文所使用之術語「半衰期」意指分子之藥物動力學性質，其為分子在其投與之後的平均存活時間之量度。半衰期可表示為自受試者(例如 ，人類患者或其他哺乳動物)體內或其具體區室中消除百分之五十(50%)已知量的分子所需之時間，例如，如在血清中(亦即 循環半衰期)或在其他組織中所量測。一般而言，半衰期之增加導致經投與分子在循環中之平均停留時間(MRT)之增加。
在一些實施例中，本發明之免疫共軛物包含變異體Fc區，該變異體Fc區相對於野生型Fc區包含至少一個胺基酸修飾，使得該分子之半衰期增加(相對於包含野生型型Fc區之分子)。在一些實施例中，本發明之免疫共軛物包含變異體IgG Fc區，其中該變異體Fc區包含在選自由以下所組成之群組之一或多個位置處的半衰期延長胺基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435及436，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。能夠增加含Fc區之分子之半衰期的眾多突變為此項技術中已知的，且包括例如M252Y、S254T、T256E及其組合。例如，參見以下文獻中所述之突變：美國專利第6,277,375號、第7,083,784號；第7,217,797號、第8,088,376號；美國公開案第2002/0147311號；第2007/0148164號；及PCT公開案第WO 98/23289號；第WO 2009/058492號；及第WO 2010/033279號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。半衰期增強的免疫共軛物亦包括具有包含在Fc區殘基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435及436中之二或更多者處的取代的變異體Fc區的免疫共軛物，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。特別地，二或更多個取代係選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K及Y436I，其中編號為如Kabat中之EU索引之編號。
在具體實施例中，本發明之免疫共軛物具有包含以下取代之變異體IgG Fc區： (A) M252Y、S254T及T256E； (B) M252Y及S254T； (C) M252Y及T256E； (D) T250Q及M428L； (E) T307Q及N434A； (F) A378V及N434A； (G) N434A及Y436I； (H) V308P及N434A；或 (I) K288D及H435K。
在較佳實施例中，本發明之免疫共軛物具有包含以下取代中之任何1、2或3者之變異體IgG Fc區：M252Y、S254T及T256E。本發明進一步涵蓋具有包含以下之變異體Fc區的免疫共軛物： (A) 改變效應功能及/或FcγR之一或多個突變；及 (B) 延長血清半衰期之一或多個突變。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第四較佳IgG1序列包含M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以便延長血清半衰期。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:147 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第五較佳IgG1序列包含M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)以便延長血清半衰期，且包含S442C取代(加下劃線示出)，以便容許兩個CH3域經由二硫鍵彼此共價鍵結或容許藥物部分之共軛。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 148 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第六較佳IgG1序列包含降低或消除效應功能之L234A/L235A取代(加下劃線示出)，以及M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以便延長血清半衰期。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 149 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區之免疫共軛物之CH2及CH3域之第七較佳IgG1序列包含降低或消除效應功能之L234A/L235A取代(加下劃線示出)，以及M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)以便延長血清半衰期，以及S442C取代(加下劃線示出)，以便容許兩個CH3域經由二硫鍵彼此共價鍵結或容許藥物部分之共軛。此類分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:150 )：其中，X 為離胺酸(K)或不存在。II. 示範性抗 ADAM9 抗體
本發明提供能夠特異性結合至ADAM9、可用於產生本發明之免疫共軛物之特定抗體及其抗原結合片段。
代表性人類ADAM9多肽(NCBI序列NP_003807，包括加下劃線示出之28個胺基酸殘基訊息序列)具有胺基酸序列(SEQ ID NO:5 )：在ADAM9之819個胺基酸殘基(SEQ ID NO:5 )中，殘基1-28為訊息序列，殘基29-697為細胞外域，殘基698-718為跨膜域，且殘基719-819為細胞內域。三個結構域位於以下細胞外域內：蛇毒金屬蛋白酶(Reprolysin) (M12B)家族鋅金屬蛋白酶域(在約殘基212-406處)；解整合素域(在約殘基423-497處)；及類EGF域(在約殘基644-697處)。已鑒別出眾多轉譯後修飾及同功型，且蛋白質在其到達細胞膜以產生成熟蛋白質之前在高基氏體成熟面網(trans-Golgi network)中經蛋白水解裂解。前域(pro-domain)之移除經由在兩個不同位點處之裂解發生。最可能由前蛋白轉化酶(諸如弗林蛋白酶)在前域與催化域之間的邊界(Arg-205/Ala-206)處進行加工。另外的上游裂解前蛋白轉化酶位點(Arg-56/Glu-57)在ADAM9之活化中具有重要作用。
代表性食蟹獼猴ADAM9多肽(NCBI序列XM_005563126.2，包括加下劃線示出之可能的28個胺基酸殘基訊息序列)具有胺基酸序列(SEQ ID NO:6 )：蛋白質之蛇毒金屬蛋白酶(M12B)家族鋅金屬蛋白酶域在約殘基212-406處；蛋白質之解整合素域在約殘基423-497處。
在某些實施例中，本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段之特徵在於以下準則中之任何一、二、三、四、五、六、七、八或九者： (1) 免疫特異性結合如癌細胞表面上所內源性表現之人類ADAM9之能力； (2) 以類似結合親和力特異性結合人類及非人類靈長類ADAM9(例如 ，食蟹獼猴之ADAM9)； (3) 以4 nM或更小的平衡結合常數(KD )特異性結合人類ADAM9； (4) 以4 nM或更小的平衡結合常數(KD )特異性結合非人類靈長類ADAM9； (5) 以5 x 105 M-1 min-1 或更大的締合速率(ka)特異性結合人類ADAM9； (6) 以1 x 106 M-1 min-1 或更大的締合速率(ka)特異性結合非人類靈長類ADAM9； (7) 以1 x 10-3 min-1 或更小的解離速率(kd)特異性結合人類ADAM9； (8) 以9 x 10-4 min-1 或更小的解離速率(kd)特異性結合非人類靈長類ADAM9。 (9) 經最佳化以相較於嵌合或鼠親代抗體與cynoADAM9之結合親和力(例如，如藉由BIACORE®分析所量測)有至少100倍增強(例如，至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少450倍、至少500倍、至少550倍或至少600倍增強)，並保留與人類ADAM9的高親和力結合(例如，BIACORE®分析)。
如本文所述，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之結合常數可使用表面電漿共振例如 經由BIACORE®分析來判定。可將表面電漿共振資料擬合至1:1朗繆耳(Langmuir)結合模型(同時ka kd)，且自速率常數之比kd/ka計算平衡結合常數KD 。可判定單價抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(亦即 ，包含單個ADAM9抗原決定基結合位點之分子)、二價抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(亦即 ，包含兩個ADAM9抗原決定基結合位點之分子)或具有更高價之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段(例如 ，包含三、四或更多個ADAM9抗原決定基結合位點之分子)之此類結合常數。
本發明特別涵蓋具有抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之免疫共軛物，該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含免疫特異性結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基的抗ADAM9輕鏈可變(VL)域及抗ADAM9重鏈可變(VL)域。除非另外說明，否則所有此類抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段皆能夠免疫特異性結合至人類ADAM9。如本文所使用，此類ADAM9可變域分別稱為「抗 ADAM9-VL 」及「抗 ADAM9-VH 」。A. 鼠抗人類 ADAM9 抗體
已鑒別出阻斷ADAM9之靶蛋白加工活性、經內化且具有抗腫瘤活性的鼠抗ADAM9抗體(參見，例如 ，美國專利第8,361,475號)。此抗體在美國專利第7,674,619號及第8,361,475號中定名為由融合瘤殖株ATCC PTA-5174產生之「抗KID24」抗體，在本文中定名為「MAB-A 」。MAB-A展現出優於正常組織的與腫瘤之強優先結合(參見圖 7A-7C )。MAB-A跨大量正常細胞類型展現極少或無染色(表 2 )。
如圖 2 中所示，MAB-A以高親和力結合人類ADAM9，但在較低程度上結合非人類靈長類(例如 ，食蟹獼猴) ADAM9。
下文提供MAB-A之VL及VH域之胺基酸序列。將MAB-A之VH及VL域人源化，並將CDR經最佳化以改善親和力及/或去除潛在的胺基酸不利條件。將CDRH 3經進一步最佳化以增強與非人類靈長類ADAM9之結合，同時維持其對人類ADAM9之高親和力。
本發明之較佳免疫共軛物包含MAB-A之經最佳化變異體之VH域之1、2或全部3個CDRH 及/或VL域之1、2或全部3個CDRL ，且較佳進一步具有人源化MAB-A之VH及/或VL域之人源化架構區(「FR 」)。本發明之其他較佳免疫共軛物具有MAB-A之人源化/經最佳化變異體之整個VH及/或VL域。
本發明特別關於包含以下之免疫共軛物： (A) (1) MAB-A之VH域之三個CDRH ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH域之四個FR；或 (B) (1) MAB-A之VL域之三個CDRL ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL域之四個FR；或 (C) MAB-A之經最佳化變異體之VH域之三個CDRH ；及MAB-A之VL域之三個CDRL ；或 (D) MAB-A之VH域之三個CDRH ；及經最佳化變異體MAB-A之VL域之三個CDRL ；或 (E) MAB-A之經最佳化變異體之VH域之三個CDRH ；及經最佳化MAB-A之VL域之三個CDRL ；或 (F) (1) MAB-A之經最佳化變異體之VH域之三個CDRH ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH域之四個FR；或 (G) (1) MAB-A之經最佳化變異體之VL域之三個CDRL ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL域之四個FR；或 (H) (1) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之VH域；及 (2) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之VL域。鼠抗體「MAB-A」
鼠抗ADAM9抗體MAB-A之VH域之胺基酸序列為SEQ ID NO:7 (CDRH 殘基經加下劃線示出)：
MAB-A之CDRH 1域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:8) ：SYWMH。
MAB-A之CDRH 2域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:9) ：EIIPINGHTNYNEKFKS。
MAB-A之CDRH 3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:10) ：GGYYYYGSRDYFDY。
鼠抗ADAM9抗體MAB-A之VL域之胺基酸序列為SEQ ID NO:11 (CDRL 殘基經加下劃線示出)：
MAB-A之CDRL 1域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:12) ：KASQSVDYDGDSYMN。
MAB-A之CDRL 2域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:13) ：AASDLES。
MAB-A之CDRL 3域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:14) ：QQSHEDPFT。B. 示範性人源化 / 經最佳化抗 ADAM9-VH 及 VL 域 1. MAB-A 之變異體 VH 域
MAB-A之某些較佳人源化/經最佳化抗ADAM9-VH域之胺基酸序列為MAB-A之ADAM9-VH域(SEQ ID NO:7 )之變異體，且由SEQ ID NO:15 表示(CDRH 殘基經加下劃線示出)：其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 及X6 經獨立地選擇， 其中：X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得：
MAB-A之較佳人源化抗ADAM9 VH域之胺基酸序列：hMAB-AVH(1) (SEQ ID NO:16 )及MAB-A之某些較佳人源化/經最佳化抗ADAM9-VH域之胺基酸序列：呈現於下文(CDRH 殘基以單下劃線示出；相對於hMAB-AVH(1) (SEQ ID NO:7 )之差異以雙下劃線示出)。
MAB-A之人源化及/或經最佳化抗ADAM9-VH域之FR的合適胺基酸序列為： FRH 1域(SEQ ID NO:30) ： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS FRH 2域(SEQ ID NO:31 )： WVRQAPGKGLEWVG FRH 3域(SEQ ID NO:32 )：RFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCAR FRH 4域(SEQ ID NO:33 )： WGQGTTVTVSS
抗ADAM9-VH域之CDRH 1域的合適替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:8 ： SYWMHSEQ ID NO:34 ： SYWIH
抗ADAM9-VH域之CDRH 2域的合適替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:9 ： EIIPINGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:35 ： EIIPIFGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:36 ： EIIPIFGHTNYNERFQG
抗ADAM9-VH域之CDRH 3域的合適替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:10 ： GGYYYYGSRDYFDYSEQ ID NO:37 ： GGYYYYFNSGTLDYSEQ ID NO:38 ： GGYYYYIGKGVLDYSEQ ID NO:39 ： GGYYYYPRFGWLDYSEQ ID NO:40 ： GGYYYYTGKGVLDYSEQ ID NO:41 ： GGYYYYDSNAVLDYSEQ ID NO:42 ： GGYYYYFHSGTLDYSEQ ID NO:43 ： GGYYYYFNKAVLDYSEQ ID NO:44 ： GGYYYYGGSGVLDYSEQ ID NO:45 ： GGYYYYPRQGFLDYSEQ ID NO:46 ： GGYYYYYNSGTLDY
因此，本發明涵蓋具有包含以下之VH域之ADAM9結合分子： (1) CDRH 1域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:47 ： SYWX1 H 其中：X1 為M或I； (2) CDRH 2域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:48 ： EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 其中：X2 、X3 、X4 及X5 經獨立地選擇，且 其中：X2 為N或F；X3 為K或R；X4 為K或Q；且X5 為S或G。 且 (3) CDRH 3域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:49 ： GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY 其中：X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，且X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得：
MAB-A之衍生物/變異體之第一示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2) 域(SEQ ID NO:17 )，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:50 )：其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第二示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2C) 域(SEQ ID NO:22 )，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:51 )：其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第三示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:52 )：其中X為離胺酸(K)或不存在。
如上文所提供，Fc區之CH2-CH3域可經工程改造例如以降低效應功能及/或引入共軛位點及/或延長血清半衰期。在某些實施例中，本發明之示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈之CH2-CH3域包含選自以下之一或多個取代：L234A、L235A、M252Y、S254T、T256E及S442C。
因此，MAB-A之衍生物/變異體之第四示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:78) 中之取代L234A及L235A，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:141 )其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第五示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:79) 中之S442C取代，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:142 )：其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第六示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:80 )中之取代L234A、L235A及S442C，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:143 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第七示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:147 )中之取代M252Y、S254T及T256E，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:151 )：其中X 為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第八示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:148 )中之取代M252Y、S254T、T256E及S442C，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:152 )：其中X 為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第九示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:149 )中之取代L234A、L235A、M252Y、S254T及T256E，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:153 )：其中X 為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第十示範性人源化/經最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3域(SEQ ID NO:150 )中之取代L234A、L235A、M252Y、S254T、T256E及S442C，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:154 )：其中X 為離胺酸(K)或不存在。2. MAB-A之變異體 VL 域
MAB-A之較佳人源化/經最佳化抗ADAM9-VL域之胺基酸序列為MAB-A之ADAM9-VL域(SEQ ID NO:11 )之變異體，且由SEQ ID NO:53 表示(CDRL 殘基係加下劃線示出)：其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；X14 為M或L；X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
MAB-A之較佳人源化抗ADAM9-VL域之胺基酸序列(hMAB-AVL(1)(SEQ ID NO:54 ))及MAB-A之某些較佳人源化/經最佳化抗ADAM9-VL域之胺基酸序列(hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )、hMAB-AVL(3) (SEQ ID NO:56 )及hMAB-AVL(4) (SEQ ID NO:57 ))呈現於下文(CDRL 殘基以單下劃線示出；相對於hMAB-AVL(1) (SEQ ID NO:54 )之差異以雙下劃線示出)。
因此，MAB-A之人源化及/或經最佳化抗ADAM9-VL域之FR的合適胺基酸序列為： FRL 1域(SEQ ID NO:58 )： DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC FRL 2域(SEQ ID NO:59 )： WYQQKPGQPPKLLIY FRL 3域(SEQ ID NO:60 )： GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYC FRL 4域(SEQ ID NO:61 )： FGQGTKLEIK
抗ADAM9-VL域之CDRL 1域的合適替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:12 ： KASQSVDYDGDSYMNSEQ ID NO:62 ： KASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:63 ： RASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:64 ： RASQSVDYSGDSYLN
抗ADAM9-VL域之CDRL 3域的合適替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:14 ： QQSHEDPFTSEQ ID NO:65 ： QQSYSTPFT
因此，本發明涵蓋包含以下之抗ADAM9抗體VL域： (1) CDRL 1域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:66 ： X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N 其中：X12 、X13 、X14 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；且X14 為M或L； (2) CDRL 2域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:13 ： AASDLES 且 (3) CDRL 3域，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO:67 ： QQSX15 X16 X17 PFT 其中：X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
MAB-A之衍生物/變異體之示範性人源化/經最佳化IgG1輕鏈含有hMAB-AVL (2)域(SEQ ID NO:55 )，且具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:68 )：
本發明另外明確地考慮免疫特異性結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基且包含上文提供之MAB-A CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2或CDRL 3中之任一者的免疫共軛物，且特別考慮包含以下之此類免疫共軛物：上文提供之MAB-A CDRH 1之一、上文提供之MAB-A CDRH 2之一、上文提供之MAB-A CDRH 3之一、上文提供之MAB-A CDRL 1之一、上文提供之MAB-A CDRL 2之一及上文提供之MAB-A CDRL 3之一。本發明進一步考慮進一步包含上文提供之人源化MAB-A FRH 1、FRH 2、FRH 3、或FRH 4、FRL 1、FRL 2、FRL 3或RL 4中任一者的此類免疫共軛物，且特別考慮包含FRH 1、FRH 2、FRH 3及FRH 4及/或包含FRL 1、FRL 2、FRL 3、FRL 4及FRH 1之此類免疫共軛物。
在一些實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括具有選自由以下所組成之群組之序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域： (a) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (c) 分別SEQ ID NO: 8、36及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (d) 分別SEQ ID NO: 34、36及10以及SEQ ID NO:64、13、65 (e) 分別SEQ ID NO: 8、35及37以及SEQ ID NO: 62、13、14； (f) 分別SEQ ID NO: 8、35及38以及SEQ ID NO: 62、13、14； (g) 分別SEQ ID NO: 8、35及39以及SEQ ID NO: 62、13、14； (h) 分別SEQ ID NO: 8、35及40以及SEQ ID NO: 62、13、14； (i) 分別SEQ ID NO: 8、35及41以及SEQ ID NO: 62、13、14； (j) 分別SEQ ID NO: 8、35及42以及SEQ ID NO: 62、13、14； (k) 分別SEQ ID NO: 8、35及43以及SEQ ID NO: 62、13、14； (l) 分別SEQ ID NO: 8、35及44以及SEQ ID NO: 62、13、14； (m) 分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14；及 (n) 分別SEQ ID NO: 8、35及46以及SEQ ID NO: 62、13、14。
在特定實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
在一些實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與如下序列至少90%、至少95%、至少99%或100%一致的序列： (a) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56； (d) 分別SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57； (e) 分別SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (f) 分別SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (g) 分別SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (h) 分別SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (i) 分別SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (j) 分別SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (k) 分別SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (l) 分別SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (m) 分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (n) 分別SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55
「實質上一致的」或「一致的」意指展現與參考胺基酸序列(例如，本文所述之任何一種胺基酸序列)至少50%一致性的多肽。較佳地，這種序列在胺基酸水準或核酸上與用於比較之序列至少60%、更佳至少80%或至少85%、及更佳至少90%、至少95%至少99%或甚至100%一致。
通常使用序列分析軟體(例如，序列分析軟體包Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)量測序列一致性。此類軟體藉由為各種取代、缺失及/或其他修飾分配同源性程度來對一致或類似的序列進行匹配。保守取代通常包括以下群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。在判定一致性程度之示範性方法中，可使用BLAST程式，e-3 與e-100 之間的機率記分指示緊密相關之序列。
在特定實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列至少90%、至少95%、至少99%或100%一致的序列。
在某些實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體包含如下之重鏈及輕鏈序列： (a) 分別SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:68； (b) 分別SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:68； (c) 分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68； (d) 分別SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:68； (e) 分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68； (f) 分別SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:68； (g) 分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68； (h) 分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68； (i) 分別SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:68；及 (j) 分別SEQ ID NO:154及SEQ ID NO:68。
在特定實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體包含具有SEQ ID NO:52之序列的重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列的輕鏈。在其他特定實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體包含具有SEQ ID NO:142之序列的重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列的輕鏈。在其他實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體經工程改造以實現血清半衰期延長，且包含具有SEQ ID NO:151之序列的重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列的輕鏈。在其他特定實施例中，人源化/經最佳化抗ADAM9抗體經工程改造以實現血清半衰期延長及位點特異性共軛，且包含具有SEQ ID NO:152之序列的重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列的輕鏈。
本發明亦明確考慮免疫特異性結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基且包含上文提供之人源化/經最佳化抗ADAM9 MAB-A VL或VH域中之任一者的免疫共軛物。本發明特別考慮包含人源化/經最佳化抗ADAM9 VL或VH域之以下組合中任一者的此類抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段：
本發明具體涵蓋包含如上文所提供之人源化/經最佳化抗ADAM9-VL及/或VH域的免疫共軛物。在特定實施例中，本發明之免疫共軛物包含(i)如上文所提供之人源化/經最佳化抗ADAM9-VL及/或VH域，及(ii)Fc區。
儘管抗ADAM9 VH及VL域之特定修飾在上文概述且在圖 3A-3B 中進行比較，但是在工程改造本發明之人源化及/或經最佳化抗ADAM9-VH或VL域時，不必對此等殘基中之全部或大部分進行修飾。本發明亦涵蓋此等VH及VL序列之較小變化，包括例如可引入以促進次選殖之C端及/或N端胺基酸殘基之胺基酸取代。III. 抗體藥物共軛物 定義
如本文所使用之術語「免疫共軛物 」、「共軛物 」或「ADC 」係指鍵聯至或共軛至細胞結合劑(例如 ，本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段)之化合物或其衍生物(例如，藥理學藥劑)。
「連接子 」為能夠以穩定、共價方式將化合物(通常為藥物，諸如本文所述之細胞毒性劑或藥理學藥劑(例如 ，美登木素生物鹼或(吲哚啉并苯二氮平)化合物))鍵聯至細胞結合劑(諸如抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段)之任何化學部分。在化合物或抗體保持活性之條件下，連接子易受或實質上抵抗酸誘導之裂解、光誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解。合適連接子為此項技術中熟知的，且包括例如二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接子亦包括如本文所述且此項技術中已知的帶電連接子及其親水性形式。
如本文所使用之「烷基 」係指具有一至二十個碳原子之飽和直鏈或分支鏈單價烴基。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2 CH(CH3 )2 )、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。較佳地，烷基具有一至十個碳原子。更佳地，烷基具有一至四個碳原子。
基團中之碳原子數可在本文中藉由字首「Cx-xx 」指定，其中x及xx為整數。例如，「C1-4 烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。
術語「化合物 」或「細胞毒性化合物 」或「細胞毒性劑 」可互換使用。其擬包括結構或結構式或其任何衍生物已經揭示於本發明或者結構或結構式或其任何衍生物以引用方式併入的化合物。該術語亦包括本發明中揭示之所有式之化合物的立體異構物、幾何異構物、互變異構物、溶劑化物、代謝物及鹽(例如 醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括前述任一者之任何溶劑化物、水合物及多形體。在本申請案中所述本發明某些態樣中有關「立體異構物」、「幾何異構物」、「互變異構物」、「溶劑化物」、「代謝物」、「鹽」、「共軛物」、「共軛物鹽」、「溶劑化物」、「水合物」或「多形體」之具體陳述不應解釋為擬在未陳述此等其他形式之情況下使用術語「化合物」之本發明其他態樣中省略此等形式。
術語「對掌性 」係指分子具有與鏡像搭配物不可重疊之性質，而術語「非對掌性」係指分子可重疊於其鏡像搭配物上。
術語「立體異構物 」係指具有相同化學構成及連接性但原子之空間定向不同，無法藉由圍繞單鍵之旋轉而相互轉化的化合物。
「非鏡像異構物 」係指具有二或更多個對掌性中心且分子不互為鏡像之立體異構物。非鏡像異構物具有不同物理性質，例如 熔點、沸點、光譜性質及反應性。非鏡像異構物之混合物可在諸如結晶、電泳及層析之高解析度分析程序下分離。
「鏡像異構物 」係指化合物之兩個互為不可重疊鏡像之立體異構物。
本文中使用之立體化學定義及規則一般遵循S. P. Parker編輯, McGraw-Hill,Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及Eliel, E.及Wilen, S.,Stereochemistry of Organic Compounds , John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994。本發明化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。預期本發明化合物之所有立體異構形式，包括但不限於非鏡像異構物、鏡像異構物及構型異構物，以及其混合物(諸如外消旋混合物)，皆形成本發明之一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即 其具有使平面偏振光之平面旋轉之能力。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示分子圍繞其對掌性中心之絕對組態。字首d及I或(+)及(-)用於表示化合物旋轉平面偏振光之符號，其中(-)或1意指該化合物為左旋的。字首為(+)或d之化合物為右旋的。對於既定化學結構，此等立體異構物為相同的，例外之處為其互為鏡像。特定立體異構物亦可稱為鏡像異構物，且此等異構物之混合物常稱為鏡像異構混合物。鏡像異構物之50:50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或製程中不存在立體選擇或立體特異性時存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指兩種鏡像異構物質之缺乏光學活性之等莫耳混合物。
術語「互變異構物 」或「互變異構形式 」係指具有不同能量之結構異構物，其可經由低能障壁相互轉化。舉例而言，質子互變異構物(亦稱為質子轉移互變異構物)包括經由質子遷移發生之相互轉化，諸如酮基-烯醇及亞胺-烯胺異構化。價態互變異構物包括藉由一些鍵結電子之重排發生之相互轉化。
術語「亞胺反應性試劑」係指能夠與亞胺基團反應之試劑。亞胺反應性試劑之實例包括但不限於亞硫酸根(H2 SO3 、H2 SO2 或HSO3 - 、SO3 2- 或HSO2 - 與陽離子形成之鹽)、偏亞硫酸氫根(H2 S2 O5 或S2 O5 2- 與陽離子形成之鹽)、單、二、三及四-硫代磷酸根(PO3 SH3 、PO2 S2 H3 、POS3 H3 、PS4 H3 或PO3 S3- 、PO2 S2 3- 、POS3 3- 或PS4 3- 與陽離子形成之鹽)、硫代磷酸酯((Ri O)2 PS(ORi )、Ri SH、Ri SOH、Ri SO2 H、Ri SO3 H)、各種胺(羥基胺(例如 NH2 OH)、肼(例如 NH2 NH2 )、NH2 O-Ri 、Ri 'NH-Ri 、NH2 -Ri )、NH2 -CO-NH2 、NH2 -C(=S)-NH2 、硫代硫酸根(H2 S2 O3 或S2 O3 2- 與陽離子形成之鹽)、連二亞硫酸根(H2 S2 O4 或S2 O4 2- 與陽離子形成的鹽)、二硫代磷酸根(P(=S)(ORk )(SH)(OH)或其與陽離子形成之鹽)、羥肟酸(Rk C(=O)NHOH或與陽離子形成之鹽)、醯肼(Rk CONHNH2 )、甲醛次硫酸根(HOCH2 SO2 H或HOCH2 SO2 - 與陽離子形成之鹽，諸如HOCH2 SO2 - Na+ )、糖化核苷酸(諸如GDP-甘露糖)、氟達拉濱(fludarabine)或其混合物，其中Ri 及Ri' 各獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈或分支烷基且經至少一個選自-N(Rj )2 、-CO2 H、-SO3 H及-PO3 H之取代基取代；Ri 及Ri' 可進一步視情況經本文所述之烷基之取代基取代；Rj 為具有1至6個碳原子之直鏈或分支烷基；且Rk 為具有1至10個碳原子之直鏈、分支或環狀烷基、烯基或炔基，芳基、雜環基或雜芳基(較佳地，Rk 為具有1至4個碳原子之直鏈或分支烷基；更佳地，Rk 為甲基、乙基或丙基)。較佳地，陽離子為一價陽離子，諸如Na+ 或K+ 。較佳地，亞胺反應性試劑選自亞硫酸鹽、羥基胺、脲及肼。更佳地，亞胺反應性試劑為NaHSO3 或KHSO3 。
術語「陽離子」係指帶正電之離子。陽離子可為一價(例如，Na+、K+、NH4+等)、二價(例如，Ca2+、Mg2+等)或多價(例如，Al3+等)。較佳地，陽離子為一價。
如本文所使用之短語「醫藥學上可接受之鹽 」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。示範性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽(saccharate)、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、帕莫酸鹽(pamoate)(亦即 1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘酸鹽))、鹼金屬(例如 鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如 鎂)鹽及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一分子，諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。該相對離子可為使母化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽之結構中可具有一個以上帶電原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的情形可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
若本發明化合物為鹼，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中可用之任何適合方法製備，例如用諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸及其類似酸之無機酸或用諸如乙酸、順丁烯二酸、琥珀酸、扁桃酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、哌喃糖苷酸(pyranosidyl acid)(諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥基酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳族酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺酸或乙烷磺酸)或其類似酸之有機酸處理遊離鹼。
若本發明之化合物為酸，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由任何合適之方法製備，例如用諸如胺(一級、二級或三級胺)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或其類似鹼之無機或有機鹼處理遊離酸。合適的鹽之說明性實例包括但不限於衍生自胺基酸(諸如甘胺酸及精胺酸)、氨、一級胺、二級胺及三級胺、及環狀胺(諸如哌啶、嗎啉及哌嗪)之有機鹽，以及衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。
如本文所使用，術語「溶劑化物 」意謂進一步包括藉由非共價分子間力結合之化學計量或非化學計量之量的溶劑(諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸以及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇或其類似溶劑)的化合物。化合物之溶劑化物或水合物易於藉由將至少1莫耳當量羥基溶劑(諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)添加至化合物以引起亞胺部分之溶劑化或水合作用來製備。
「代謝物 」或「分解代謝物 」為透過指定化合物、其衍生物、或其共軛物或其鹽在體內代謝或分解代謝產生之產物。化合物、其衍生物或其共軛物之代謝物可使用此項技術中已知之常規技術鑒別，且其活性可使用諸如本文所述者之測試來判定。此類產物可例如由投與之化合物之氧化、羥基化、還原、水解、胺化、脫醯胺、酯化、脫酯、酶促裂解及其類似反應產生。因此，本發明包括藉由包含使本發明化合物、其衍生物或其共軛物與哺乳動物接觸一段足以產生其代謝產物之時間之方法而製備的本發明化合物、其衍生物或其共軛物之代謝物(包括化合物、其衍生物或其共軛物)。
短語「醫藥學上可接受之 」表示物質或組成物必須與構成調配物之其他成分及/或用其治療之哺乳動物在化學上及/或毒理學上相容。
術語「保護基 」或「保護部分 」係指常用於在化合物、其衍生物或其共軛物上之其他官能基反應時阻斷或保護特定官能基的取代基。舉例而言，「胺保護基」或「胺基保護部分」為連接至胺基以阻斷或保護化合物中之胺基官能基的取代基。此類基團為此項技術中熟知的(參見，例如P. Wuts及T. Greene, 2007,Protective Groups in Organic Synthesis , 第7章, J. Wiley & Sons, NJ)且例證為胺基甲酸酯，諸如胺基甲酸甲酯及胺基甲酸乙酯、FMOC、經取代胺基甲酸乙基酯、藉由1,6-β-消除反應(亦稱「自消耗(self immolative)」)裂解之胺基甲酸酯；脲；醯胺；肽；烷基及芳基衍生物。合適之胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)。對於保護基及其用途之一般描述，參見 P. G.M. Wuts及T. W. Greene,Protective Groups in Organic Synthesis , John Wiley & Sons, New York, 2007。
術語「胺基酸 」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸由NH2 -C(Raa' Raa )-C(=O)OH表示，其中Raa 及Raa' 各自獨立地為H，具有1至10個碳原子之視情況經取代直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，芳基、雜芳基或雜環基，或Raa 及N端氮原子可一起形成雜環(例如 ，如脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基 」係指當一個氫原子自胺基酸之胺及/或羧基端移除時得到之相應殘基，諸如-NH-C(Raa' Raa )-C(=O)O-。
術語「肽 」係指藉由肽(醯胺)鍵鍵聯之胺基酸單體之短鏈。在一些實施例中，肽含有2至20個胺基酸殘基。在其他實施例中，肽含有2至10個胺基酸殘基。在又其他實施例中，肽含有2至5個胺基酸殘基。如本文所使用，當肽為本文所述之由具體胺基酸序列表示之細胞毒性劑或連接子之一部分時，肽可在兩個方向上連接至細胞毒性劑或連接子之其餘部分。例如，二肽X1-X2包括X1-X2及X2-X1。類似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3及X3-X2-X1，且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4及X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3及X4表示胺基酸殘基。
術語「反應性酯基 」係指可易於與胺基反應以形成醯胺鍵之基團(酯基)。示範性反應性酯基包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺酯、N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯、對硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯及其衍生物，其中該等衍生物促進醯胺鍵形成。在某些實施例中，反應性酯基為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯。
術語「胺反應性基團 」係指可與胺基反應以形成共價鍵之基團。示範性胺反應性基團包括但不限於反應性酯基、醯基鹵化物、磺醯基鹵化物、亞胺酯或反應性硫酯基。在某些實施例中，胺反應性基團為反應性酯基。在一個實施例中，胺反應性基團為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯。
術語「硫醇反應性基團 」係指可與硫醇(-SH)基團反應以形成共價鍵之基團。示範性硫醇反應性基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯基、鹵乙醯胺(aloacetamide)、乙烯基碸、乙烯基磺醯胺或乙烯基吡啶(vinyal pyridine)。在一個實施例中，硫醇反應性基團為順丁烯二醯亞胺。
如本揭露及申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確說明，否則單數形式「一個 / 種 (a/an) 」及「該 」包括複數形式。
應理解，當在本文中用語言「包含 」描述實施例時，亦提供以「由 … 組成 」及/或「基本上由 … 組成 」之術語描述的其他類似實施例。A. 示範性免疫共軛物
在第二態樣中，本發明係關於包含共軛至至少一種藥理學藥劑之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段的免疫共軛物。藥理學藥劑包括但不限於細胞毒素(例如 ，細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑及放射性金屬離子例如 α-發射體。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害任何藥劑，諸如，例如綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、白喉毒素(Diptheria toxin)、A型至F型肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)、蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、皂草素(saporin)及此類藥劑之細胞毒性片段。治療劑包括具有預防性或治療性地治療病症的治療效應的任何藥劑。此類治療劑可為化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，且包括具有所要生物活性及/或修飾既定生物反應的治療劑。治療劑之實例包括烷化劑、血管生成抑制劑、抗有絲分裂劑、激素療法劑及可用於治療細胞增殖性病症的抗體。在某些實施例中，治療劑為美登木素生物鹼化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所述之化合物，該等專利以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，治療劑為苯二氮平化合物，諸如吡咯并苯二氮平(PBD) (諸如WO2010/043880、WO2011/130616、WO2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708中所述者)及吲哚啉并苯二氮平(IGN)化合物(諸如WO/2010/091150及WO 2012/128868以及2016年6月28日申請之名稱為「CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES」的美國申請案第15/195,269號中所述者)。所有此等專利、專利公開案及申請案之全部教示以全文引用之方式併入本文中。
如本文所使用，「吡咯并苯二氮平 」(PBD)化合物為具有吡咯并苯二氮平核心結構之化合物。吡咯并苯二氮平可為經取代或未取代。其亦包括具有由連接子鍵聯之兩個吡咯并苯二氮平核心的化合物。可減少作為吲哚啉并苯二氮平核心之一部分的亞胺官能性(-C=N-)。
在某些實施例中，吡咯并苯二氮平化合物包含由表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，吡咯并苯二氮平化合物包含由表示之核心結構，其可視情況經取代。
如本文所使用，「吲哚并苯二氮平 」(IGN)化合物為具有吲哚啉并苯二氮平核心結構之化合物。吲哚啉并苯二氮平可為經取代或未取代。其亦包括具有兩個由連接子鍵聯之吲哚啉并苯二氮平核心的化合物。可減少作為吲哚啉并苯二氮平核心之一部分的亞胺官能性(-C=N-)。
在某些實施例中，吲哚啉并苯二氮平化合物包含由表示之核心結構，其可視情況經取代。
在一些實施例中，吲哚啉并苯二氮平化合物包含由表示之核心結構，其可進一步經取代。
藥理學藥劑可使用此項技術中已知的技術直接或透過連接子間接偶合或共軛至抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，以產生「免疫共軛物」、「共軛物」或「ADC」。
在第一實施例中，本發明之免疫共軛物包含本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過位於該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基共價鍵聯至本文所述之藥理學藥劑。
在第一實施例之第一具體實施例中，本發明之免疫共軛物由下式表示：(L1)， 其中： CBA為本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 為由下式表示之細胞毒性化合物：(L1a)、(L1a1)，(L1b)或(L1b1)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基； L'由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)- (B1')；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs1 - (B2')； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20之間個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在第二具體實施例中，對於式(L1)之共軛物，CyL1 由式(L1a)或(L1a1)表示；且其餘變量如上文在第一具體實施例中所述。
在第三具體實施例中，對於式(L1)之共軛物，CyL1 由式(L1b)或(L1b1)表示；且其餘變量如上文在第一具體實施例中所述。更具體地，Rx3 為(C2 -C4 )烷基。
在第四具體實施例中，對於式(L1)之共軛物，CyL1 由式(L1a)表示；Ra 及Rb 兩者為H；R5 為H或Me，且其餘變量如上文在第一具體實施例中所述。
在第五具體實施例中，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量描述於上文第一具體實施例、第二具體實施例或第四具體實施例中。在更具體實施例中，P係選自由以下所組成之群組：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。更具體地，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第六具體實施例中，Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變量如上文在第一具體實施例、第二具體實施例、第四具體實施例或第五具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第七具體實施例中，第一實施例之免疫共軛物由下式表示：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在更具體實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。在另一更具體實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第八具體實施例中，第一實施例之免疫共軛物由下式表示：(L2)， 其中： CBA為本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL2 ； WL 為1至20之整數；且 CyL2 為由下式表示之細胞毒性化合物：(L2a)；(L2a1)；(L2b)；或(L2b1) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； Rx1 及Rx2 獨立地為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在第九具體實施例中，對於式(L2)之免疫共軛物，CyL2 由式(L2a)或(L2a1)表示；且其餘變量如上文在第八具體實施例中所述。
在第十具體實施例中，對於式(L2)之免疫共軛物，CyL2 由式(L2b)或(L2b1)表示；且其餘變量如上文在第八具體實施例中所述。
在第十一具體實施例中，對於式(L2)之免疫共軛物，Re 為H或Me；Rx1 及Rx2 獨立地為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，其中Rf 及Rg 各自獨立地為-H或(C1 -C4 )烷基；且p為0、1、2或3；且其餘變量如上文在第八具體實施例、第九具體實施例或第十具體實施例中所述。更具體地，Rf 及Rg 相同或不同，且選自-H及-Me。
在第十二具體實施例中，第一實施例之免疫共軛物由下式表示：；；； ；；；；；；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在更具體實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵。在另一更具體實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十三具體實施例中，第一實施例之免疫共軛物由下式表示：(L3)， 其中： CBA為本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過Lys殘基共價鍵聯至CyL3 ； WL 為1至20之整數； CyL3 由下式表示：， m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)及(b10)， 其中q為1至5之整數。
在第十四具體實施例中，對於式(L3)之免疫共軛物，m'為1，且R1 及R2 兩者為H；且其餘變量如上文在第十三具體實施例中所述。
在第十五具體實施例中，對於式(L3)之免疫共軛物，m'為2，且R1 及R2 兩者為Me；且其餘變量如上文在第十三具體實施例中所述。
在第十六具體實施例中，第一實施例之免疫共軛物由下式表示：；；或，， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數。
在第十七具體實施例中，對於第一實施例之免疫共軛物，Y為-SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K；且其餘變量如上文在第一具體實施例至第十六具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。在一個實施例中，Y為-SO3 Na。
在某些實施例中，對於包含第一實施例或第一具體實施例、第二具體實施例、第三具體實施例、第四具體實施例、第五具體實施例、第六具體實施例、第七具體實施例、第八具體實施例、第九具體實施例、第十具體實施例、第十一具體實施例、第十二具體實施例、第十三具體實施例、第十四具體實施例、第十五具體實施例、第十六具體實施例或第十七具體實施例之免疫共軛物之組成物(例如 ，醫藥組成物)，組成物中每個抗體分子之細胞毒性劑之平均數(亦即 ，平均值wL )(亦稱為藥物-抗體比(DAR))處於1.0至8.0之範圍內。在一些實施例中，DAR處於以下範圍內：1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5或1.8至2.2。在一些實施例中，DAR小於4.0，小於3.8，小於3.6，小於3.5，小於3.0或小於2.5。
在第二實施例中，本發明之免疫共軛物包含本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過位於該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基(-SH)共價鍵聯至本文所述之細胞毒性劑。
在第一具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：(C1)， 其中： CBA為本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC1 ； WC 為1或2； CyC1 由下式表示：(C1a)；(C1a1)；(C1b)，或(C1b1) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基；且， LC 由以下表示：， 其中s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC1 上之-C(=O)-基團之位點；其中： R19 及R20 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； m"為1與10之間的整數；且 Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基。
在第二具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，CyC1 由式(C1a)或(C1a1)表示；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例中所述。
在第三具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，CyC1 由式(C1b)或(C1b1)表示；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例中所述。
在第四具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，CyC1 由式(C1a)或(C1a1)表示；Ra 及Rb 兩者為H；且R5 為H或Me；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例或第二具體實施例中所述。
在第五具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例、第二具體實施例或第四具體實施例中所述。在更具體實施例中，P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更具體實施例中，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第六具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例、第二具體實施例、第四具體實施例或第五具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第七具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，R19 及R20 兩者為H；且m"為1至6之整數；且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例、第二具體實施例、第三具體實施例、第四具體實施例、第五具體實施例或第六具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第八具體實施例中，對於式(C1)之免疫共軛物，-L-LC -由下式表示：， 且其餘變量如上文在第二實施例之第一具體實施例、第二具體實施例、第三具體實施例、第四具體實施例、第五具體實施例、第六具體實施例或第七具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第九具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：；；；或， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在更具體實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。在另一更具體實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：(C2)， 其中： CBA為本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC2 ； WC 為1或2； CyC2 由下式表示：(C2a)，(C2a1)，(C2b)，或(C2b1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； Rx1 為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ； Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx2 為(C1 -C6 )烷基； LC '由下式表示：；或； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC2 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為-H、帶電取代基或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在更具體實施例中，q及r各自獨立地為1至6之間之整數，更具體地為1至3之間之整數。甚至更具體地，R10 、R11 、R12 及R13 皆為H。
在另一更具體實施例中，m及n各自獨立地為1與6之間之整數，更具體地為1至3之間之整數。甚至更具體地，R19 、R20 、R21 及R22 皆為H。
在第十一具體實施例中，對於式(C2)之免疫共軛物，CyC2 由式(C2a)或(C2a1)表示；且其餘變量如以上在第二實施例之第十具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第十二具體實施例中，對於式(C2)之免疫共軛物，CyC2 由式(C2b)或(C2b1)表示；且其餘變量如以上在第二實施例之第十具體實施例中所述。
在第13具體實施例中，對於式(C2)之免疫共軛物，P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量如在第二實施例之第十具體實施例、第十一具體實施例或第十二具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。在更具體實施例中，P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更具體實施例中，P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第十四具體實施例中，對於式(C2)之免疫共軛物，-LC '-由下式表示：；；或。
在第十五具體實施例中，對於(C2)之免疫共軛物，Re 為H或Me；Rx1 為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，且Rx2 為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，其中Rf 及Rg 各自獨立地為-H或(C1 -C4 )烷基；且p為0、1、2或3；且其餘變量如上文在第二實施例之第十具體實施例、第十一具體實施例、第十二具體實施例、第十三具體實施例或第十四具體實施例中所述。更具體地，Rf 及Rg 相同或不同，且選自-H及-Me。
在第十六具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：；；；；；；；； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。在更具體實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。在另一具體實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十七具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：(C3)， 其中： CBA為本文上文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC3 ； WC 為1或2； CyC3 由下式表示：(C3a) 其中： m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； LC '由下式表示：；； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC3 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為H、帶電取代基、或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在更具體實施例中，q及r各自獨立地為1至6之間之整數，更具體地為1至3之整數。甚至更具體地，R10 、R11 、R12 及R13 皆為H。
在另一更具體實施例中，m及n各自獨立地為1與6之間之整數，更具體地為1至3之整數。甚至更具體地，R19 、R20 、R21 及R22 皆為H。
在第十八具體實施例中，對於式(C3)之免疫共軛物，P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變量如上文在第二實施例之第十七具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。在更具體實施例中，P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更具體實施例中，P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第十九具體實施例中，對於式(C3)之免疫共軛物，-LC '-由下式表示：；；或， 其中M為H+ 或陽離子；且其餘變量如上文在第二實施例之第十七具體實施例或第十八具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第二十具體實施例中，對於式(C3)之免疫共軛物，m'為1，且R1 及R2 兩者為H；且其餘變量如上文在第二實施例之第十七具體實施例、第十八具體實施例或第十九具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第二十一具體實施例中，對於式(C3)之免疫共軛物，m'為2，且R1 及R2 兩者為Me；且其餘變量如上文在第二實施例之第十七具體實施例、第十八具體實施例或第十九具體實施例或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在第二十二具體實施例中，第二實施例之免疫共軛物由下式表示：；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中DM為由下式表示之藥物部分：。
在第二十三具體實施例中，對於第二實施例之免疫共軛物，Y為-SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K；且其餘變量如在第二實施例之第一具體實施例至第二十二具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。在一個實施例中，Y為-SO3 Na。C. 示範性連接子分子
此項技術中已知的任何合適連接子可用於製備本發明之免疫共軛物。在某些實施例中，連接子為雙官能連接子。如本文所使用，術語「雙官能連接子 」係指具有兩個反應性基團之改質劑，該兩個反應性基團之一者能夠與細胞結合劑反應，而另一者與細胞毒性化合物反應，以將兩個部分鍵聯在一起。此類雙官能交聯劑為此項技術中熟知的(參見，例如Isalm及Dent 於Bioconjugation 第5章, 第218-363頁, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999中)。舉例而言，經由硫醚鍵實現鍵聯之雙官能交聯劑包括用以引入順丁烯二醯亞胺基之N -琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(SMCC)或用以引入碘代乙醯基之N -琥珀醯亞胺基-4-(碘代乙醯基)-胺基苯甲酸酯(SIAB)。將順丁烯二醯亞胺基或鹵代乙醯基引入細胞結合劑上之其他雙官能交聯劑為此項技術中熟知的(參見，美國專利公開案第2008/0050310號、第20050169933號，可從Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA獲得)且包括但不限於雙-順丁烯二醯亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2 、BM(PEO)3 、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙氧基)琥珀醯亞胺酯(BMPS)、γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)、ε-順丁烯二醯亞胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(EMCS)、5-順丁烯二醯亞胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯)(其為SMCC(LC-SMCC)之「長鏈」類似物)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁醯肼或鹽酸鹽(MPBH)、N-琥珀醯亞胺基3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)、N-琥珀醯亞胺基碘代乙酸酯(SIA)、κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺酯(KMUA)、N-琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、琥珀醯亞胺基-6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯(SMPH)、琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基磺醯基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙-順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙-順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、磺基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷醯基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-KMUS)、及磺基琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
異雙官能交聯劑為具有兩個不同反應性基團之雙官能交聯劑。亦可使用含有胺反應性N -羥基琥珀醯亞胺基(NHS基團)及羰基反應性肼基之異雙官能交聯劑將本文所述細胞毒性化合物與細胞結合劑(例如 抗體)連接。此類商購獲得之異雙官能交聯劑之實例包括琥珀醯亞胺基6-肼基菸醯胺丙酮腙(SANH)、琥珀醯亞胺基4-肼基對苯二甲酸酯鹽酸鹽(SHTH)及琥珀醯亞胺基肼菸酸酯鹽酸鹽(SHNH)。帶有酸不穩定鍵聯之共軛物亦可使用帶有肼之本發明苯二氮平衍生物製備。可用的雙官能交聯劑之實例包括琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯甲酸酯(SFB)及琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯氧基乙酸酯(SFPA)。
經由二硫鍵實現細胞結合劑與細胞毒性化合物之鍵聯之雙官能交聯劑為此項技術中已知的，且包括用以引入二硫吡啶基之N -琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。可用以引入二硫基團之其他雙官能交聯劑為此項技術中已知的，且揭示於美國專利6,913,748、6,716,821及美國專利公開案20090274713及20100129314中，所有該等專利皆以引用方式併入本文中。或者，亦可使用交聯劑，諸如2-亞胺基硫雜環戊烷、高半胱胺酸硫內酯或S-乙醯基琥珀酸酐引入硫醇基。 在某些實施例中，雙官能連接子由下文所述之式(a1L)-(a10L)中之任一者表示。D. 示範性藥理學藥劑 1. 美登木素生物鹼
在某些實施例中，藥理學藥劑為美登木素生物鹼化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所述之化合物，該等專利以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，美登木素生物鹼化合物由下式表示：其中變量如上文在上文第一實施例之第十三具體實施例至第十七具體實施例中之任一者及其中所述之任何更具體實施例中所述。
在更具體實施例中，美登木素生物鹼化合物為DM4：。
在另一實施例中，美登木素生物鹼化合物為DM1：。2. 苯二氮平
在某些實施例中，藥理學藥劑為苯二氮平化合物，諸如吡咯并苯二氮平(PBD) (諸如WO2010/043880、WO2011/130616、WO2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708中所述者)及吲哚啉并苯二氮平(IGN)化合物(諸如WO/2010/091150及WO 2012/128868以及2016年6月28日申請之名稱為「CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES」的美國申請案第15/195,269號中所述者)。所有此等專利、專利公開案及申請案之全部教示以全文引用之方式併入本文中。
如本文所使用，「苯二氮平」化合物為具有苯二氮平核心結構之化合物。苯二氮平核心可為經取代或未取代，及/或與一或多個環結構稠合。其亦包括具有由連接子鍵聯之兩個苯二氮平核心的化合物。可減少作為苯二氮平核心之一部分的亞胺官能性(-C=N-)。
如本文所使用，「吡咯并苯二氮平」(PBD)化合物為具有吡咯并苯二氮平核心結構之化合物。吡咯并苯二氮平可為經取代或未取代。其亦包括具有由連接子鍵聯之兩個吡咯并苯二氮平核心的化合物。可減少作為吲哚啉并苯二氮平核心之一部分的亞胺官能性(-C=N-)。
在某些實施例中，藥理學藥劑為由下式表示之吲哚啉并苯二氮平化合物：(L1a')、(L1a'1)、(L1b')、(L1b'1)、(L2a')；(L2a'1)；(L2b')；或(L2b'1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： Lc '由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)E (B1)；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs (B2) C(=O)E為反應性酯基，諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯、硝基苯基(例如 ，2-硝基苯基或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如 ，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如 ，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯或五氟苯基酯，較佳為N-羥基琥珀醯亞胺酯； Zs 由下式表示：(a1)；(a2)；(a3)；(a4)；(a5)，(a6)，(a7)；(a8)；(a9)；及(a10)， 其中： q為1至5之整數；且 U為-H或SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且 其餘變量如在上文所述之第一實施例之第一具體實施例至第十二具體實施例及第十七具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在某些實施例中，藥理學藥劑為由下式表示之吲哚啉并苯二氮平化合物：(C1a')；(C1a'1)(C1b')，(C1b'1)，(C2a")，(C2a"1)，(C2b")或(C2b"1) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 式(C1a')、(C1a'1)、(C1b')及(C1b'1)之-LC c 由下式表示：其中變量如上文在第二實施例之第一具體實施例至第九具體實施例及第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述；且 式(C2a")、(C2a"1)、(C2b")及(C2b"1)之Lcc '由下式表示：；或； 其中變量如上文在第二實施例之第十具體實施例至第十六具體實施例及第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在某些實施例中，藥理學藥劑為以下任一者之吲哚啉并苯二氮平化合物或其醫藥學上可接受之鹽：
以上所示之化合物D1、sD1、D2、sD2、DGN462、sDGN462、D3及sD3可根據美國專利第9,381,256號、第8,765,740號、第8,426,402號及第9,353,127號以及美國申請公開案US2016/0082114中所述之程序來製備，所有該等文獻皆以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，以上所示之化合物(例如 ，sD1、sD2、sD4、sDGN462、sD3、sD4、sD5、sD5'、sD6或sD7)之醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。更具體地，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
在具體實施例中，藥理學藥劑由下式表示：；或或其醫藥學上可接受之鹽。在具體實施例中，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在另一具體實施例中，藥理學藥劑由下式表示：。IV. 生產方法
如此項技術中所熟知，本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段最佳透過編碼此類多肽之核酸分子之重組表現來生產。
本發明之多肽可使用固相肽合成來方便地製備(Merrifield, B. (1986) 「Solid Phase Synthesis ,」 Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) 「General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,」 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) 「Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,」 Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
在替代方案中，抗體可使用此項技術中已知的任何方法來重組製備及表現。抗體可藉由首先分離由宿主動物製成之抗體、獲得基因序列並使用該基因序列在宿主細胞(例如 ，CHO細胞)中重組表現抗體來重組地製成。可採用之另一方法為在植物(例如 ，煙草)或轉基因奶中表現抗體序列。已經揭示用於在植物或奶中重組地表現抗體之合適方法(參見，例如Peeters等人 (2001) 「Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,」 Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等人 (1995) 「Human Antibodies From Transgenic Mice ,」 Int. Rev. Immunol 13:65-93；及Pollock等人 (1999) 「Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,」 J. Immunol Methods 231:147-157)。用於製造抗體衍生物(例如 ，人源化、單鏈等 )之合適方法為此項技術中已知的，且已在上文描述。在另一替代方案中，抗體可藉由噬菌體顯示技術來重組地製成(參見，例如美國專利第5,565,332號；第5,580,717號；第5,733,743號；第6,265,150號；及Winter, G.等人 (1994) 「Making Antibodies By Phage Display Technology ,」 Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
含有所關注多核苷酸(例如 ，編碼本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段之多肽鏈的多核苷酸)之載體可藉由眾多適當手段中之任一者來引入宿主細胞中，該等手段包括電穿孔，採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微粒子炸射法(microprojectile bombardment)；脂轉染；及感染(例如 ，在載體為感染劑(諸如牛痘病毒)之情況下)。引入載體或多核苷酸之選擇將常常取決於宿主細胞之特徵。
能夠過表現異源DNA之任何宿主細胞可出於表現所關注多肽或蛋白質之目的來使用。合適哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括但不限於COS、HeLa及CHO細胞。
本發明包括包含本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之胺基酸序列的免疫共軛物。本發明之多肽可藉由此項技術中已知的程序來製造。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解，藉由如上文所述之重組方法(亦即 ，單一或融合多肽)或藉由化學合成來產生。抗體之多肽，尤其是至多約50個胺基酸之較短多肽藉由化學合成來方便地製造。化學合成之方法為此項技術中已知的，且可商購獲得。
本發明包括包含抗ADAM9抗體及其片段之變異體的免疫共軛物，包括不顯著影響此類分子之性質的功能上等效之多肽以及具有增強的或減少的活性之變異體。多肽之修飾為此項技術中之常規實踐，且不需要在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、不顯著有害地改變功能活性的胺基酸之一或多個缺失或添加或使用化學類似物的多肽。可彼此保守地取代之胺基酸殘基包括但不限於：甘胺酸/丙胺酸；絲胺酸/蘇胺酸；纈胺酸/異白胺酸/白胺酸；天冬醯胺/麩醯胺酸；天冬胺酸/麩胺酸；離胺酸/精胺酸；及苯丙胺酸/酪胺酸。此等多肽亦包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其他轉譯後修飾之多肽，諸如，例如以不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。較佳地，胺基酸取代將為保守的，亦即 經取代之胺基酸將具有與原始胺基酸之化學性質類似的化學性質。此類保守取代為此項技術中已知的，且實例已在上文經提供。胺基酸修飾之範圍可為從改變或修飾一或多個胺基酸至區(諸如可變域)之完全重新設計。可變域之變化可改變結合親和力及/或特異性。其他修飾方法包括使用此項技術中已知的偶合技術，包括但不限於酶促手段、氧化取代及螯合。修飾可用於例如用於免疫檢定之標記之連接，諸如用於放射免疫檢定之放射性部分之連接。經修飾多肽係使用此項技術中經建立之程序來製造，且可使用此項技術中已知的標準檢定來篩選。
本發明涵蓋包含具有本發明之一或多種抗ADAM9-VL及/或VH之融合蛋白的免疫共軛物。在一個實施例中，提供融合多肽，其包含輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈兩者。在另一實施例中，融合多肽含有異源免疫球蛋白恆定區。在另一實施例中，融合多肽含有由公開保藏之融合瘤產生的抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域。出於本發明之目的，抗體融合蛋白含有一或多個特異性結合至ADAM9之多肽域、及天然分子中不與之連接之另一胺基酸序列，例如來自另一區之異源序列或同源序列。V. 藥物共軛
如上文第一實施例或其中所述之任何具體實施例中所述之包含透過位於抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基共價鍵聯至藥理學藥劑的抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段的免疫共軛物可根據此項技術中已知的任何方法來製備，參見，例如WO 2012/128868及WO2012/112687，該等文獻以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，第一實施例之免疫共軛物可藉由第一方法製備，該第一方法包含使CBA與具有胺反應性基團之細胞毒性劑反應之步驟。
在一個實施例中，對於上文所述之第一方法，反應在亞胺反應性試劑(諸如NaHSO3 )之存在下進行。
在一個實施例中，對於上文所述之第一方法，具有亞胺反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：(L1a')、(L1a'1)、(L1b')或(L1b'1)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中對於變量之定義在上文針對式(L1a')、(L1a'1)、(L1b')及(L1b'1)經描述。
在某些實施例中，第一實施例之免疫共軛物可藉由第二方法製備，該第二方法包含以下步驟： (a)使細胞毒性劑與具有胺反應性基團及硫醇基反應性基團之連接子化合物反應，以形成其上結合胺反應性基團的細胞毒性劑-連接子化合物；及 (b)使CBA與細胞毒性劑-連接子化合物反應。
在一個實施例中，對於上文所述之第二方法，步驟(a)中之反應在亞胺反應性試劑(例如 NaHSO3 )之存在下進行。
在一個實施例中，對於上文所述之第二方法，細胞毒性劑-連接子化合物無需純化即與CBA反應。或者，細胞毒性劑-連接子化合物在與CBA反應之前首先經純化。
在某些實施例中，第一實施例之免疫共軛物可藉由第三方法製備，該第三方法包含以下步驟： (a)使CBA與具有胺反應性基團及硫醇基反應性基團之連接子化合物反應，以形成其上結合硫醇基反應性基團的經修飾CBA；及 (b)使經修飾CBA與細胞毒性劑反應。
在一個實施例中，對於上文所述之第三方法，步驟(b)中之反應在亞胺反應性試劑(例如 NaHSO3 )之存在下進行。
在某些實施例中，第一實施例之免疫共軛物可藉由第四方法製備，該第四方法包含使CBA、細胞毒性化合物以及具有胺反應性基團及硫醇基反應性基團之連接子化合物反應之步驟。
在一個實施例中，對於第四方法，反應在亞胺反應性藥劑(例如 NaHSO3 )之存在下進行。
在某些實施例中，對於上文所述之第二方法、第三方法或第四方法，具有胺反應性基團及硫醇基反應性基團之連接子化合物由下式表示：(a1L)；(a2L)；(a3L)；(a4L)；(a5L)，(a6L)，(a7L)；(a8L)；(a9L)；及(a10L)， 其中X為鹵素；JD 為-SH、-SSRd 或-SC(=O)Rg ；Rd 為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；Rg 為烷基；且其餘變量為如上文針對式(a1)-(a10)所述；且細胞毒性劑由下式表示：(L2a')；(L2a'1)；(L2b')；或(L2b'1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中變量如上文針對式(L1a')、(L1a'1)、(L1b')、(L1b'1)、(L2a')、(L2a'1)、(L2b')及(L2b'1)所述。
在某些實施例中，對於上文所述之第二方法、第三方法或第四方法，具有胺反應性基團及硫醇基反應性基團之連接子化合物由式(a1L)-(a10L)中之任一者表示，且細胞毒性劑由下式表示：其中變量如上文在上文所述之第一實施例之第十三具體實施例至第十七具體實施例中之任一者及其中所述之任何更具體實施例中所述。
在具體實施例中，對於上文所述之第二方法、第三方法或第四方法，連接子為磺基-SPDB，細胞毒性劑為DM4，且免疫共軛物由下式表示：， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數。
如上文第二實施例中所述之包含透過位於抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基(-SH)共價鍵聯至細胞毒性劑之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段的免疫共軛物(例如 ，第一具體實施例至第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例之免疫共軛物)可藉由使具有一或多個游離半胱胺酸之CBA與本文所述之具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑反應來製備。
在較佳實施例中，本發明之免疫共軛物具有包含另外半胱胺酸殘基之變異體IgG Fc區，以便容許藥理學藥劑共軛至此類分子(例如 ，SEQ ID NO: 79 及80 )。
在一個實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：(C1a')；(C1a'1)(C1b')；或(C1b'1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中-LC c 由下式表示：其中變量如上文在第二實施例之第一具體實施例至第九具體實施例及第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在另一實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：(C2a")，(C2a"1)，(C2b")，(C2b"1) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Lcc '由下式表示：；或； 其中變量如上文在第二實施例之第十具體實施例至第十六具體實施例及第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在又一實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：(C3a')， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中LC c '在上文經描述，且其餘變量如上文在第二實施例之第十七具體實施例至第二十三具體實施例中之任一者或其中所述之任何更具體實施例中所述。
在具體實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一具體實施例中，具有硫醇基反應性基團之細胞毒性劑由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，在CBA及細胞毒性劑之反應中使用有機溶劑來溶解細胞毒性劑。示範性有機溶劑包括但不限於二甲基乙醯胺(DMA)、丙二醇等 。在一個實施例中，CBA及細胞毒性劑之反應在DMA及丙二醇之存在下進行。
在具體實施例中，由下式表示之細胞毒性劑：或其醫藥學上可接受之鹽與CBA(例如 ，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段)反應以形成由下式表示之免疫共軛物：， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽；且WC 為1或2。在更具體實施例中，N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。在另一更具體實施例中，N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。甚至更具體地，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在某些實施例中，當Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽時，免疫共軛物可藉由以下來製備：(a)使上文所述之具有硫醇反應性基團的含亞胺之細胞毒性劑(亦即 式(C1a')、(C1a'1)、(C1b')、(C1b'1)、(C2a")、(C2a"1)、(C2b")或(C2b"1)，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H)之亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在1.9至5.0之pH的水溶液中反應，以形成經修飾細胞毒性劑，其包含由下式表示之經修飾亞胺部分：或其醫藥學上可接受之鹽；及(b)使經修飾細胞毒性劑與本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段反應以形成免疫共軛物。
在第一態樣中，對於上文所述之方法，步驟(a)之反應在1.9至5.0之pH下進行。更具體地，pH為2.5至4.9、1.9至4.8、2.0至4.8、2.5至4.5、2.9至4.5、2.9至4.0、2.9至3.7、3.1至3.5或3.2至3.4。在另一具體實施例中，步驟(a)之反應在1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH下進行。在又一具體實施例中，步驟(a)之反應在3.3之pH下進行。
如本文所使用，具體pH值意指具體值± 0.05。
在一些實施例中，步驟(a)之反應在緩衝溶液之存在下進行。此項技術中已知的任何合適緩衝溶液可用於本發明之方法中。合適緩衝溶液包括例如但不限於檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、含甘胺酸之緩衝液(例如甘胺酸-HCl緩衝液)、鄰苯二甲酸鹽緩衝液(例如，包含鄰苯二甲酸氫鈉或鄰苯二甲酸氫鉀之緩衝溶液)及其組合。在一些實施例中，緩衝溶液為琥珀酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及Na2 HPO4 之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在其他實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及K2 HPO4 之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，上文所述之緩衝溶液之濃度可處於以下範圍內：10至250 mM、10至200 mM、10至150 mM、10至100 mM、25至100 mM、25至75 mM、10至50 mM或20至50 mM。
在第二態樣中，反應步驟(a)在不存在緩衝溶液(例如，第一態樣中所述之緩衝液)之情況下進行。在一些實施例中，本發明方法包含以下步驟：(a)使上文所述之具有硫醇反應性基團的含亞胺之細胞毒性劑(亦即 式(C1a')、(C1a'1)、(C1b')、(C1b'1)、(C2a")、(C2a"1)、(C2b")或(C2b"1)，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H)之亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在水溶液中反應，以形成經修飾細胞毒性劑，其包含由下式表示之經修飾亞胺部分：或其醫藥學上可接受之鹽，其中水溶液不包含緩衝液；及(b)使經修飾細胞毒性劑與本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段反應以形成免疫共軛物。在一些實施例中，步驟(a)之反應在有機溶劑及水之混合物中進行。更具體地，步驟(a)之反應在二甲基乙醯胺(DMA)及水之混合物中進行。在一些實施例中，DMA及水之混合物包含按體積計小於60%的DMA。甚至更具體地，DMA及水之體積比為1:1。
在第三態樣中，對於上文所述或第一態樣或第二態樣中之方法，在步驟(a)之反應中，對於每1當量的含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至5.0當量的亞硫酸氫鹽或0.25或2.5當量的偏亞硫酸氫鹽。在一些實施例中，對於每1當量的含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至4.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至3.0、0.5至2.5、0.8至2.0、0.9至1.8、1.0至1.7、1.1至1.6或1.2至1.5當量的亞硫酸氫鹽或0.25至2.25、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至1.5、0.25至1.25、0.4至1.0、0.45至0.9、0.5至0.85、0.55至0.8或0.6至0.75當量的偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，對於每1當量的含亞胺之細胞毒性劑使用0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5或5.0當量的亞硫酸氫鹽或0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65 0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、2.0、2.25或2.5當量的偏亞硫酸氫鹽。在又其他實施例中，對於每1當量的含亞胺細胞毒性劑使用1.4當量的亞硫酸氫鹽或0.7當量的偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，對於每1當量的含亞胺之細胞毒性劑，使用1.2當量的亞硫酸氫鹽或0.6當量的偏亞硫酸氫鹽。
如本文所使用，具體當量意指具體值± 0.05。
在第四態樣中，對於上文所述之方法，步驟(a)之反應在2.9至3.7之pH下進行，且使1.0至1.8當量的亞硫酸氫鹽或0.5至0.9當量的偏亞硫酸氫鹽與1當量的含亞胺之細胞毒性劑反應。在一些實施例中，步驟(a)之反應在3.1至3.5之pH下進行，且使1.1至1.6當量的亞硫酸氫鹽或0.55至0.8當量的偏亞硫酸氫鹽與1當量的含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，步驟(a)之反應在3.2至3.4之pH下進行，且使1.3至1.5當量的亞硫酸氫鹽或0.65至0.75當量的偏亞硫酸氫鹽與1當量的含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，步驟(a)之反應在3.3之pH下進行，且使1.4當量的亞硫酸氫鹽或0.7當量的偏亞硫酸氫鹽與1當量的含亞胺之細胞毒性劑反應。在又其他實施例中，步驟(a)之反應在3.3之pH下進行，且使1.4當量的亞硫酸氫鈉與1當量的含亞胺之細胞毒性劑反應。
在第五態樣中，對於上文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣或第四態樣中之方法，步驟(a)之反應在有機溶劑及水之混合物中進行。可使用任何合適的有機溶劑。示範性有機溶劑包括但不限於醇(例如甲醇、乙醇、丙醇等)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮、二氯甲烷等等。在一些實施例中，有機溶劑可與水混溶。在其他實施例中，有機溶劑不可與水混溶，亦即步驟(a)之反應在雙相溶液中進行。在一些實施例中，有機溶劑為二甲基乙醯胺(DMA)。按水及有機溶劑之總體積之體積計，有機溶劑(例如，DMA)可以1%-99%、1-95%、10-80%、20-70%、30-70%、1-60%、5-60%、10-60%、20-60%、30-60%、40-60%、45-55%、10-50%或20-40%之量存在。在一些實施例中，步驟(a)之反應在DMA及水之混合物中進行，其中DMA及水之體積比為1:1。
在第六態樣中，對於上文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣或第五態樣中之方法，步驟(a)之反應可在任何合適的溫度下進行。在一些實施例中，反應係在以下溫度下進行：0℃至50℃、10℃至50℃、10℃至40℃或10℃至30℃。在其他實施例中，反應係在以下溫度下進行：15℃至30℃、20℃至30℃、15℃至25℃、16℃至24℃、17℃至23℃、18℃至22℃或19℃至21℃。在又其他實施例中，反應係在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下進行。在一些實施例中，反應可在0℃至15℃、0℃至10℃、1℃至10℃、5℃至15℃或5℃至10℃下進行。
在第七態樣中，對於上文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣、第五態樣或第六態樣中之方法，步驟(a)之反應進行1分鐘至48小時、5分鐘至36小時、10分鐘至24小時、30分鐘至24小時、30分鐘至20小時、1小時至20小時、1小時至15小時、1小時至10小時、2小時至10小時、3小時至9小時、3小時至8小時、4小時至6小時或1小時至4小時。在一些實施例中，使反應進行4至6小時。在其他實施例中，使反應進行10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時等。在其他實施例中，使反應進行4小時。在又其他實施例中，使反應進行2小時。
在第八態樣中，對於本文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣、第五態樣、第六態樣或第七態樣中之本發明方法，步驟(b)之反應在4至9之pH下進行。在一些實施例中，步驟(b)之反應在以下pH下進行：4.5至8.5、5至8.5、5至8、5至7.5、5至7、5至6.5或5.5至6.5。在其他實施例中，步驟(b)之反應在pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下進行。
在一些實施例中，對於上文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣、第五態樣、第六態樣、第七態樣或第八態樣中之方法，步驟(b)之反應在包含水及有機溶劑之混合物的水溶液中進行。可使用上文所述之任何合適的有機溶劑。更具體地，有機溶劑為DMA。在一些實施例中，水溶液包含按體積計小於50%、小於40%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於3%、小於2%或小於1%的有機溶劑(例如DMA)。
在一些實施例中，對於本文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣、第五態樣、第六態樣、第七態樣或第八態樣中之方法，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鉀。在具體實施例中，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉，且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉。
在一些實施例中，對於本文所述或第一態樣、第二態樣、第三態樣、第四態樣、第五態樣、第六態樣、第七態樣或第八態樣中之方法，經修飾細胞毒性劑在步驟(b)中與細胞結合劑反應之前未經純化。或者，經修飾細胞毒性劑在步驟(b)中與細胞結合劑反應之前經純化。本文所述之任何合適的方法可用於純化經修飾細胞毒性劑。
在一些實施例中，對於上文所述之方法，步驟(a)之反應不導致順丁烯二醯亞胺基團之實質磺化。在一些實施例中，小於50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的順丁烯二醯亞胺基團為磺化的。順丁烯二醯亞胺磺化之百分比係等於順丁烯二醯亞胺磺化之細胞毒性劑(僅在順丁烯二醯亞胺上具有磺化之細胞毒性劑)及二磺化之細胞毒性劑(在順丁烯二醯亞胺及亞胺部分兩者上具有磺化之細胞毒性劑)之總量除以含亞胺之細胞毒性劑在與亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽反應之前的起始量。
在一些實施例中，使藉由上文所述之任何方法製備的免疫共軛物經歷純化步驟。就此而言，可使用切向流過濾(TFF)、非吸附層析、吸附層析、吸附過濾、選擇性沉澱或任何其他合適的純化方法以及其組合來自混合物之其他組分中純化免疫共軛物。
在一些實施例中，使用單一純化步驟(例如，TFF)來純化免疫共軛物。較佳地，使用單一純化步驟(例如，TFF)將共軛物純化且交換至適當調配物中。在本發明之其他實施例中，使用兩個連續的純化步驟純化免疫共軛物。例如，免疫共軛物可首先藉由選擇性沉澱、吸附過濾、吸附層析或非吸附層析來純化，隨後用TFF進行純化。一般熟習此項技術者將理解，免疫共軛物之純化實現包含化學偶合至細胞毒性劑之細胞結合劑的穩定共軛物之分離。
任何合適的TFF系統皆可用於純化，該系統包括Pellicon型系統(Millipore, Billerica, Mass.)、Sartocon盒式系統(Sartorius AG, Edgewood, N.Y.)及Centrasette型系統(Pall Corp., East Hills, N.Y.)
任何合適的吸附層析樹脂皆可用於純化。較佳吸附層析樹脂包括氫氧磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定化金屬親和層析(IMAC)、染料配體層析、親和層析、逆相層析及其組合。合適的氫氧磷灰石樹脂之實例包括陶瓷氫氧磷灰石(I型及II型CHT，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)、HA Ultrogel氫氧磷灰石(Pall Corp., East Hills, N.Y.)及陶瓷氟磷灰石(I型及II型CFT，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適的HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。合適的HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖及辛基瓊脂糖樹脂(全部來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)以及Macro-prep甲基樹脂及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適的離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(全部來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適的混合模式離子交換劑之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker, Phillipsburg N.J.)合適的IMAC樹脂之實例包括螯合瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適的染料配體樹脂之實例包括藍瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適的親和樹脂之實例包括：蛋白A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect，GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和樹脂，例如扁豆凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑帶有適當凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑有特異性的抗體。這種抗體可經固定至例如瓊脂糖4快速流樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)上。合適的逆相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac, Hesperia, Calif.)。
任何合適的非吸附層析樹脂皆可用於純化。合適的非吸附層析樹脂之實例包括但不限於SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如，S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如，SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如，P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)及一般熟習此項技術者已知之其他樹脂。 VI. 本發明之免疫共軛物之用途
本發明涵蓋包含本發明之免疫共軛物之組成物，包括醫藥組成物。
如本文所提供，包含本文提供之人源化/經最佳化抗ADAM9-VL及/或VH域的本發明之免疫共軛物具有結合細胞表面上存在之ADAM9且介導細胞殺傷之能力。特別地，包含藥理學藥劑之本發明免疫共軛物經內化，且經由藥理學藥劑之活性介導細胞殺傷。此類細胞殺傷活性可藉由免疫共軛物誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)來擴大。
因此，包含本文提供之人源化/經最佳化抗ADAM9-VL及/或VH域的本發明之免疫共軛物具有治療與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之任何疾病或病狀的能力。如上文所討論，ADAM9為眾多血液及實體惡性腫瘤中表現之腫瘤-胚胎抗原，其與展現低分化形態學之高級腫瘤相關，且與不良臨床結果相關聯。因此，在無限制的情況下，本發明之免疫共軛物可用於治療癌症，特別是特徵在於ADAM9表現之癌症。
在其他特定實施例中，本發明之免疫共軛物可用於治療肺癌(例如，非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。
在進一步實施例中，本發明之免疫共軛物可用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞、腺癌或大細胞未分化癌)及結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸道基質瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌)。
除了其用於治療以外，本發明之免疫共軛物可經可偵測地標記，且用於癌症之診斷或腫瘤及腫瘤細胞之成像。 VII. 醫藥組成物
本發明之組成物包括可用於製造醫藥組成物(例如 ，不純或非無菌組成物)的原料藥(bulk drug)組成物及可用於製備單位劑型的醫藥組成物(亦即 合適於向受試者或患者投與之組成物)。此類組成物包含預防或治療有效量的本發明之免疫共軛物、或此類藥劑及醫藥學上可接受之載劑之組合。較佳地，本發明之組成物包含預防或治療有效量的本發明之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦涵蓋此類醫藥組成物，其另外包括對特定癌症抗原有特異性的第二治療性抗體(例如 ，腫瘤特異性單株抗體)及醫藥學上可接受之載劑。
在具體實施例中，術語「醫藥學上可接受之 」意謂由聯邦政府或州政府之管理機構核准或列於美國藥典或其他通常認可之藥典中以在動物中，且更特定言之在人類中使用。術語「載劑 」係指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑(例如 弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑或媒劑。一般而言，本發明組成物之成分分別或以混合在一起之單位劑型(例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式)在指示活性劑之量的密封容器(諸如安瓿或藥囊)中供應。在欲藉由輸注投與組成物之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶分配。在藉由注射投與組成物之情況下，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿以使得可於投與之前混合該等成分。
本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有本發明之免疫共軛物(單獨或與此類醫藥學上可接受之載劑一起)之容器。另外，可用於治療疾病之一或多種其他預防劑或治療劑亦可容納於醫藥包裝或套組中。本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有本發明之醫藥組成物之一或多種成分之容器。視情況，此類容器可附有管理藥物或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的須知，該須知反映了該機構對製造、使用或銷售以供人類投與之批准。
本發明提供可用於上文方法中之套組。套組可包含本發明之任何免疫共軛物。套組可在一或多個容器中進一步包含一或多種可用於治療癌症之其他預防劑及/或治療劑。 VIII. 投與方法
可提供本發明之組成物以供藉由向受試者投與有效量的本發明之免疫共軛物來治療、預防及改善與疾病、病症相關之一或多種症狀。在較佳態樣中，此類組成物為實質上純的(亦即 ，實質上不含限制其作用或產生非所要副作用之物質)。在具體實施例中，受試者為動物，較佳為哺乳動物，諸如非靈長類(例如 ，牛、馬、貓、犬、齧齒動物等 )或靈長類(例如 ，猴諸如食蟹獼猴、人類等 )。在較佳實施例中，受試者為人類。
各種遞送系統為已知的，且可用於投與本發明之組成物，例如 ，囊封於脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現抗體或融合蛋白之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見，例如 Wu等人 (1987)「 Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, 」 J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、作為逆轉錄病毒或其他載劑之一部的核酸之構築等 。
投與本發明之免疫共軛物之方法包括但不限於腸胃外投與(例如 ，皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及黏膜(例如 ，鼻內及經口途徑)。在具體實施例中，本發明之免疫共軛物以肌肉內、靜脈內或皮下方式投與。組成物可藉由任何方便途徑例如藉由輸注或推注注射來投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部。
本發明亦提供，將本發明之免疫共軛物製劑包裝在指示分子之量的密封容器(諸如安瓿或藥囊)中。在一個實施例中，此類分子以乾燥經滅菌凍乾粉末或無水濃縮物形式在密封容器中供應，且可例如 用水或鹽水復原至適當濃度以向受試者投與。較佳地，本發明之免疫共軛物以乾燥無菌凍乾粉末形式在密封容器中供應。
本發明之免疫共軛物之凍乾製劑應在2℃與8℃之間在其原始容器中儲存，且分子應在復原後12小時內、較佳6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在替代性實施例中，此類分子以液體形式在指示分子、融合蛋白或共軛分子之量及濃度的密封容器中供應。較佳地，此類免疫共軛物當以液體形式提供時在密封容器中供應。
如本文所使用，醫藥組成物之「有效量 」為足以產生有益或所要結果之量，該等包括但不限於臨床結果，諸如減少由疾病引起之症狀、減輕感染之症狀(例如 ，病毒負荷、發熱、疼痛、敗血症等)或癌症之症狀(例如，癌細胞增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等 )，從而增加罹患該疾病之患者之生活品質、減少治療疾病所需之其他藥物之劑量、諸如經由靶向及/或內化來增強另一藥物之作用、延遲疾病之進展及/或延長個體之存活。
有效量可以一或多次投與形式投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組成物之有效量為足以殺傷癌細胞及/或減少癌細胞增殖、及/或消除、減少及/或延遲癌症原發部位之轉移發展的量。在一些實施例中，藥物、化合物或醫藥組成物之有效量可能結合另一種藥物、化合物或醫藥組成物來達成或可能不達成。因此，「有效量」可在投與一或多種化療劑之情形下考慮，且若結合一或多種其他藥劑，可達成或達成所要結果，則單一藥劑可被認為以有效量給予。
對於本發明所涵蓋之免疫共軛物，向患者投與之劑量較佳基於接受受試者之體重(kg)來判定。
本發明免疫共軛物之投與之劑量及頻率可藉由修飾(諸如，例如脂化)而增強分子之攝取及組織滲透來降低或改變。
可計算向患者投與之本發明免疫共軛物之劑量，以用作單一藥劑療法。或者，分子可與其他治療組成物組合使用，且向患者投與之劑量低於該等分子用作單一藥劑療法時的劑量。
本發明之醫藥組成物可以局部方式向需要治療之區域投與；這可藉由例如但不限於局部輸注、藉由注射或藉助於植入物來達成，該植入物為多孔、非多孔或凝膠狀材料，包括膜(諸如sialastic膜)或纖維。較佳地，當投與本發明之免疫共軛物時，必須注意使用該分子不吸收之材料。
本發明之組成物可在囊泡，特別是在脂質體中遞送(參見 ，Langer (1990)「 New Methods Of Drug Delivery, 」 Science 249:1527-1533)；Treat等人 , 於LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein及Fidler (編), Liss, New York,第353-365頁(1989)中；Lopez-Berestein, ibid.,第317-327頁)。
以治療或預防有效量的本發明之免疫共軛物治療受試者可包括單次治療，或較佳可包括一系列治療。亦應當理解，用於治療之分子之有效劑量可在特定治療時程中增加或減少。 實例
現在已經大致描述本發明，透過參考以下實例將更容易理解本發明。以下實例說明本發明之診斷或治療方法中組成物之各種方法。該等實例意欲說明，但絕不限制本發明之範疇。 實例1抗 ADAM9 抗體 MAB-A 之腫瘤細胞特異性
已鑒別出鼠ADAM9抗體(在本文中定名為MAB-A)，其：(1)阻斷ADAM9之靶蛋白加工活性；(2)經內化；及(3)具有抗腫瘤活性(參見，例如 美國專利第8361475號)。藉由IHC研究MAB-A之腫瘤細胞特異性。使腫瘤組織與MAB-A (0.4 μg/mL)或同型對照(0.4 μg/mL)接觸，且目視檢查染色程度。發現MAB-A強標記多種大細胞癌、鱗狀細胞癌及腺癌非小細胞肺癌細胞型(圖 1A )、乳癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞(圖 1B )以及結腸癌樣品(圖 1C )。使正常組織與MAB-A (1.25 μg/mL)接觸，且目視檢查染色程度。如上文表 2 中所概述，MAB-A展現多種多樣的正常組織之極少或無染色。應該指出，此等研究中使用之MAB-A之濃度為用於染色腫瘤細胞的濃度的幾乎3倍。此等IHC研究之結果指示，MAB-A展現出優於正常細胞的與腫瘤細胞之強的優先結合。 實例2 物種交叉反應性
檢查MAB-A與人類ADAM9 (huADAM9)及食蟹獼猴ADAM9 (cynoADAM9)之結合。簡而言之，將暫時表現huADAM9、cynoADAM9、無關抗原之293-FT及CHO-K細胞或未經轉染之親代細胞與MAB-A一起培育，隨後與山羊抗鼠-PE二級抗體一起培育，且藉由FACS來分析。如圖 2 中所示，MAB-A展現出與兩種細胞型上暫時表現之huADAM9之強結合。MAB-A展現出與cynoADAM9之不良結合。MAB-A不結合至親代細胞或表現無關抗原之細胞。在ELISA檢定中看到與cynoADAM之類似的低水準結合。 實例3 人源化及初始最佳化
MAB-A之人源化產生人源化VH域(本文中定名為「hMAB-A VH(1) 」)及人源化VL域(本文中定名為「hMAB-A VL(1)」)。接著對人源化可變域進行最佳化以增強結合活性及/或去除潛在的不穩定胺基酸殘基，如下文所更詳細地描述。此第一輪最佳化產生三個另外的人源化VH域(本文中定名為「hMAB-A VH(2) 」、「hMAB-A VH(3) 」及「hMAB-A VH(4) 」)及三個另外的人源化VL域(本文中定名為「hMAB-A VL(2) 」、「hMAB-A VL(3) 」及「hMAB-A VL(4) 」)。另外，產生具有鼠VH及VL域以及人類恆定區的MAB-A之嵌合形式(「chMAB-A 」)。上文提供鼠及人源化/經最佳化VH及VL域之胺基酸序列，在圖 3A 及圖 3B 中提供比對。上文提供此等人源化/經最佳化VH及VL域之共同序列。在產生多個人源化可變域之情況下，可以任何組合使用特定抗ADAM9抗體(例如 ，MAB-A)之人源化重鏈可變域及輕鏈可變域，且藉由引用具體VH/VL域之方式來提及人源化鏈之特定組合，例如，將包含hMAB-A VH(1)及hMAB-A VL(2)之抗體具體稱為「 hMAB-A (1.2)」。
產生具有來源於人類生殖系VH3-21及VH3-64之架構區之hMAB-A VH(1)，且產生具有來源於人類生殖系B3及L6之架構區之hMAB-A VL(1)。在此等人源化可變域中保留鼠CDR。
在CDRH 2中鑒別出潛在的脫醯胺位點(在圖 3A 中以單下劃線示出)，且在CDRL 1中鑒別出潛在的天冬胺酸異構化位點(在圖 3B 中以單下劃線示出)。檢查此等位置處的胺基酸取代以鑒別去除此等位點同時維持結合親和力之取代。選擇CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(2)中)之位置54處之苯丙胺酸取代(N54F)及CDRL 1 (存在於hMAB-A VL(2)中)之位置28處之絲胺酸取代(D28S)，其中編號係根據Kabat。可單獨或組合使用所鑒別之取代。驚人地發現，包含N54F取代之抗體展現出對人類ADAM9之親和力之2倍增加(參見，例如 下文表 3 )及輕微改善的與食蟹獼猴ADAM9之結合。
另外，產生經最佳化變異體以使CDR中存在之離胺酸殘基之數目最小化。兩個離胺酸殘基存在於CDRH 2中(在圖 3A 中用雙下劃線指示)，且一個離胺酸存在於CDRL 1中(在圖 3B 中用雙下劃線指示)。檢查此等位置處的胺基酸取代以鑒別維持結合親和力之取代。選擇CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(3)中)之位置62處之精胺酸取代(K62R)、位置64處之麩醯胺酸取代(K64Q)及位置65處之絲胺酸取代(S65G)，其中編號係根據Kabat。選擇CDRL 1 (存在於hMAB-A VL(3)中)之位置24處之精胺酸取代(K24R)。可單獨或組合使用所鑒別之取代。
鑒別CDR中存在之其他潛在不穩定殘基(在圖 3A-3B 中用虛線下劃線指示)，CDRH 1內位置34處之一個甲硫胺酸殘基(M34)、CDRL 1內位置33處之一個甲硫胺酸殘基(M33)以及CDRL 3內位置92處之組胺酸殘基(H93)、位置93處之麩胺酸殘基(E93)及位置94處之天冬胺酸殘基(D94)，其中編號係根據Kabat。檢查此等位置處的胺基酸取代以鑒別維持結合親和力之取代。選擇CDRH 1之位置34處之異白胺酸取代(M34I)，且選擇CDRL 3之位置33處之白胺酸取代(M33L)、位置92處之酪胺酸取代(H93Y)、位置93處之絲胺酸取代(E93S)及位置94處之蘇胺酸取代(D94T)，其中編號係根據Kabat。此等位置中之各者可容易地與上文詳述之所有取代組合經取代，以產生hMAB-A VH(4)及hMAB-A VL(4)，其在配對在一起時產生相較於親代鼠抗體保留小的親和力改善之抗體，且該抗體之脫醯胺或氧化之可能性大大減小且CDR中無離胺酸殘基。
使用BIACORE®分析研究人源化/經最佳化抗體hMAB-A (1.1)、hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (3.3)、hMAB-A (4.4)及嵌合c hMAB-A (具有鼠VH/VL域)與huADAM之相對結合親和力，其中將經His標記之可溶性人類ADAM9 (「shADAM9-His 」，含有融合至含組胺酸之蛋白的人類ADAM9之細胞外部分)在塗佈有固定化抗體之表面上通過。簡而言之，將各抗體捕捉在Fab2山羊抗人類Fc表面上，且接著在不同濃度(6.25-100 nM)之shADAM9-His蛋白存在下進行培育。經由BIACORE®分析結合(經正規化之1:1朗格繆爾結合模型)判定結合之動力學。此等研究之經計算之ka 、kd 及KD 呈現於表 3 中。藉由如上文所述之FACS且藉由ELISA來檢查與cynoADAM9之結合。表 3.
此等研究之結果說明，人源化/經最佳化抗體具有與親代鼠抗體相比相同或較高的與人類ADAM9之結合親和力。特別地，觀察到在人源化抗體中引入N54F突變得到與huADAM9 (亦即，hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)及hMAB-A (3.3))之結合改善。如藉由FACS及ELISA所判定，此突變亦提供與cynoADAM9之結合之輕微改善，然而，此等抗體繼續展現與cynoADAM9之不良結合。此等研究亦鑒別可經引入以自CDR中去除離胺酸殘基而不減少親和力的另外取代。鑒別另外的取代以去除對親和力具有最小影響的其他潛在不穩定殘基。 實例4 與非人類靈長類ADAM9之結合之最佳化
使用隨機突變誘發來在hMAB-A (2.2)之重鏈CDRH 2 (Kabat位置53-58)及CDRH 3 (Kabat位置95-100及100a-100f)域內引入取代。對突變體進行篩選以鑒別具有增強的與非人類靈長類ADAM9(例如 ，cynoADAM9)之結合且保留與huADAM9之高親和力結合的殖株。自CDRH 3 (Kabat位置100a-100f)內突變之兩次獨立的篩選選擇48種殖株。表 4 提供自兩次獨立篩選針對增強的與cynoADAM9之結合所選擇的hMAB-A(2.2) 殖株之CDRH 3 Kabat殘基100a-f之胺基酸序列之比對。另外的殖株比對提供於表 5 中。如此類表中所指示，各實驗中出現類似的殖株，該等殖株處於離散的取代模式中。
對於所有經檢查之殖株，Gly及Ala為位置4 (P4)處之較佳胺基酸殘基，且Leu、Met及Phe為位置6 (P6)處之較佳胺基酸殘基。其他位置(例如 ，位置2 (P2)、位置3 (P3)及位置5 (P5))處之較佳胺基酸殘基取決於P1處發現之胺基酸殘基。對於在位置1 (P1)處具有Pro殘基之殖株，P2處Lys及Arg為較佳的，P3處Phe及Met為較佳的，P4處Gly為較佳的，且P5處Trp或Phe為較佳的。對於在P1處具有Phe、Tyr或Trp之殖株，P2處Asn及His為較佳的，P3處Ser及His為較佳的，且P6處Leu為較佳的。對於在P1處具有Ile、Leu或Val之殖株，P2處Gly為較佳的，P3處Lys為較佳的，P5處Val為較佳的，且P6處疏水性為較佳的。另外，如可在表 4 中看到，對於在P1處具有Thr殘基之殖株，P2處Gly為較佳的，P3處Lys、Met及Asn為較佳的，P4處Gly為較佳的，P5處Val或Thr為較佳的，且P6處Leu及Met為較佳的。亦鑒別出以較低頻率的在P1處具有Asp、Gly、Arg、His或Ser殘基之另外殖株(參見表 4 及表 5 )。
使用表 5 中所示之十個殖株之VH域產生hMAB-A (2.2)之經進一步最佳化之變異體，定名為hMAB-A (2A.2)-(2J.2)。藉由ELISA檢定檢查所選殖株之結合。簡而言之，使用結合至含組胺酸之肽且已塗佈至微量滴定板上之抗體捕捉經His肽標記之可溶性cynoADAM9 (「cynoADAM9-His 」) (1 μg/mL)或經His肽標記之可溶性huADAM9 (1 μg/mL)，且檢查親代hMAB-A (2.2)及十個CDRH 3 hMAB-A (2A.2)變異體之連續稀釋液之結合。結合曲線cynoADAM9及huADAM9分別呈現於圖 4A 及圖 4B 中。在MAB-A VH(2B)、MAB-A VH(2C)、MAB-A VH(2D)及MAB-A VH(2I)之情況下，包含各所選VH域之hMAB-A (2A.2)變異體展現改善的與cynoADAM9之結合，顯示cynoADAM9結合之最大增強，同時維持與親代hMAB-A (2.2)抗體類似的與huADAM9之結合。
基本上如上文所述使用BIACORE®分析研究人源化/經進一步最佳化抗體MAB-A VH(2B.2)、MAB-A VH(2C.2)、MAB-A VH(2D.2)及MAB-A VH(2I.2)以及親代hMAB-A (2.2)與huADAM9-His及cynoADAM9-His之相對結合親和力。此等研究之經計算之ka 、kd 及KD 呈現於表 6 中。
結合研究說明，四個最高殖株展現與cynoADAM9之結合親和力之150-550倍之間的增強，同時維持與親代抗體一樣高的與huADAM9之親和力結合。選擇hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)以進行進一步研究。實例 5 抗體 hMAB-A (2I.2) 之免疫組織化學研究
藉由IHC研究hMAB-A (2I.2)之細胞特異性。使陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹獼猴組織與hMAB-A (2I.2) (2.5 μg/mL)或同型對照(2.5 μg/mL)接觸，且目視檢查染色程度。研究之結果概述於表 7 中。
亦進行IHC研究以評定在12.5 μg/mL之濃度(5x最佳染色濃度)下人源化/經最佳化hMAB-A (2I.2)之結合。此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹獼猴組織。研究之結果概述於表 8 中。
進行比較性IHC研究以評定在2.5 μg/mL或5 μg/mL下hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)之結合差異。此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹獼猴組織。研究之結果概述於表 9 中。
進行進一步比較性IHC研究以評定在2.5 μg/mL、5 μg/mL或12.5 μg/mL下hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)以及鼠MAB-A之結合差異。此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹獼猴組織。研究之結果概述於表 10 中。
結果因此說明，hMAB-A (2.2)展現出在最佳濃度下人類肝細胞及腎小管之總體低水準染色，在陰性對照中觀察到肝細胞及腎小管中較低染色強度/反應性頻率。hMAB-A (2.2)展現出在最佳濃度下類似的食蟹獼猴肝細胞及腎小管之低水準染色，在陰性對照中觀察到腎小管中較低染色強度/反應性頻率。
結果亦說明，hMAB-A (2C.2)展現出在最佳濃度下人類肝細胞及腎小管之總體低水準染色，在陰性對照中觀察到肝細胞及腎小管中較低染色強度/反應性頻率。hMAB-A (2C.2)展現出在最佳濃度下類似的在食蟹獼猴肝細胞及腎小管中之低水準染色。相應人類組織中未觀察到hMAB-A (2C.2)在食蟹獼猴肺上皮、胰島/上皮及膀胱上皮中之另外最小實驗值；陰性對照中在肺上皮、腎小管、膀胱上皮中觀察到較低染色強度/反應性頻率。結果亦說明，hMAB-A (2I.2)展現在最佳濃度下無人類或食蟹獼猴組織之染色，+/-膀胱移形細胞上皮染色罕見。hMAB-A (2I.2)亦展現出在5x最佳濃度下人類肺泡細胞、胰腺導管上皮、腎小管、膀胱移形細胞上皮之總體低水準及頻率染色，以及在5x最佳濃度下食蟹獼猴支氣管上皮及膀胱移形細胞上皮之總體低水準染色。hMAB-A(2I.2)展現出所測試之人類正常組織之總體有利的IHC概況及相應食蟹獼猴組織之類似概況。實例 6 包含變異體 Fc 區之 hMAB-A (2I.2)
hMAB-A (2I.2)包含具有κ輕鏈恆定區之輕鏈(SEQ ID NO:68 )及具有野生型IgG重鏈恆定區之重鏈(SEQ ID NO:52 )。藉由將以下取代引入至Fc區中來產生Fc變異體：L234A/L235A (參見，例如 SEQ ID NO: 78 )，其定名為hMAB-A (2I.2)(AA)；S442C (參見，例如 SEQ ID NO: 79 )，其定名為hMAB-A (2I.2)(C)；及L234A/L235A/S442C (參見，例如 SEQ ID NO: 80 )，其定名為hMAB-A (2I.2)(AA/C)。藉由ELISA檢定檢查各Fc變異體與huADAM9-His及cynoADAM9-His之結合。簡而言之，使用結合至含組胺酸之肽且已塗佈至微量滴定板上之抗體捕捉經His肽標記之可溶性cynoADAM9或經His肽標記之可溶性huADAM9 (0.5 μg/mL)，且檢查親代hMAB-A (2.2)及Fc變異體之連續稀釋液之結合。結合曲線huADAM9及cynoADAM9分別呈現於圖 5A 及圖 5B 中，且顯示各Fc變異體保留具有野生型Fc區之hMAB-A (2I.2)之結合親和力。實例 7 標靶表現分析
為了評估跨不同適應症之ADAM9表現，首先使用在ImmunoGen開發之ADAM9 IHC檢定評估具有20種不同腫瘤類型之組織微陣列(TMA)以用於初步研究用途。
所有分析樣品為FFPE(福爾馬林固定及石蠟包埋)樣品。500個核心20種癌TMA購自Folio Biosciences (目錄號ARY-HH0212)。具有80個腺癌核心及80個鱗狀細胞癌核心之NSCLC TMA購自US Biomax (目錄號LC1921A)。具有80個腺癌核心之結腸直腸癌TMA購自Pantomics Inc. (目錄號COC1261)。胃癌樣品購自Avaden Biosciences。
使用Ventana Discovery Ultra自動染色儀進行ADAM9之免疫組織化學染色。ADAM9之一級抗體為可商購獲得之兔單株抗體。由受過記分算法訓練的委員會認證之病理學家對所有樣品進行評估並記分。記分需要存在至少100個有活力的腫瘤細胞。以0至3之半定量整數標度對染色強度進行記分，0表示無染色，1表示弱染色，2表示中等，且3表示強染色。記錄在各強度水準下陽性染色之細胞之百分比。記分係基於Adam9至僅細胞膜上之定位，且評估係基於至細胞質及膜之定位。藉由H記分對染色結果進行分析，H記分將染色強度之分量與陽性細胞之百分比組合。其具有介於0與300之間的值，且定義為： 1 * (以1+強度染色之細胞之百分比) + 2 * (以2+強度染色之細胞之百分比) + 3 * (以3+強度染色之細胞之百分比) = H記分。
對於各腫瘤類型，將具有5個正常組織對照之500個核心20種癌TMA染色且以兩種不同的方式記分：(1)單獨基於膜染色或(2)基於膜及細胞質染色。以下表11及圖6A概述針對所有二十種適應症的基於膜染色的ADAM9之盛行率，且表12及圖6B概述針對八種所選適應症的膜及細胞質染色之結果。
基於多發性癌TMA之結果，選擇三種適應症以用於擴大的盛行率分析：非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)及胃癌。對於NSCLC，對一種具有80個腺癌核心及80個鱗狀細胞癌核心之TMA進行染色並評估。對於CRC，分析一種具有80個腺癌核心之TMA，該80個腺癌核心中有78個腺癌核心為可評估的。對於胃癌，分析腺癌之15個全組織切片。對所有此等樣品之膜及細胞質染色進行記分，且結果概述於表13中。此等初步研究之結果顯示，ADAM9在多種多樣的實體癌中表現，且支持抗ADAM9藥物共軛物在許多不同的表現ADAM9之實體瘤中的使用。表 11 ：基於膜染色的 20 種不同適應症中 ADAM9 之盛行率 表 12 ：基於膜及細胞質染色的 8 種所選適應症中 ADAM9 之盛行率 表 13 ：基於膜及細胞質染色的另外的 NSCLC 、 CRC 及胃癌樣品中 ADAM9 之盛行率 實例 8 抗 ADAM9 抗體內化研究
為了評定本發明之抗ADAM9抗體之內化，對共軛至Alexa Fluor 488之hMAB-A(2.2)、hMAB-A(2I.2)及hMAB-A(2I.2)-S442C抗體進行基於流動式細胞測量術的內化實驗。
根據製造商之說明書(Thermofisher)使用Alexa Fluor 488四氟苯基酯產生hMAB-A(2.2)、hMAB-A(2I.2)、hMAB-A(2I.2)-S442C之抗ADAM9 Alexa488抗體共軛物。在不含疊氮化鈉之PBS (pH7.2)中溶離共軛物以實現內化檢定。由280 nm及494 nm處之吸收量測值計算標記之濃度及程度。進行FACS結合檢定以確保Alexa488-標記未不利地影響靶結合。
在連續及脈衝暴露於螢光共軛物之後判定抗ADAM9-Alexa488共軛物之內化。對於連續實驗，在冰上或在37℃下用飽和濃度的指示之經Alexa488標記之抗體處理NCI-H1703細胞達整個指示之時間。而對於脈衝實驗，使抗ADAM9-Alexa488共軛物預先結合至冰上之細胞，且將過量共軛物洗去，之後轉移至37℃並監測內化。在連續或脈衝暴露後指示之時間點，用維耳新(Thermofisher)使細胞提升，並用冰冷的PBS洗滌兩次，且將重複孔重懸浮於不具有(未淬滅樣品)或具有300 nM抗A488抗體(淬滅樣品)的冰冷PBS中。將所有樣品在冰上培育30 m。接著使細胞成團，在1%多聚甲醛中固定且藉由流動式細胞測量術分析。在冰上培育30分鐘且接著與抗Alexa488抗體一起培育之細胞之螢光表示不可淬滅之螢光級分，且自所有其他樣品中減去，之後計算內化。將內化百分比計算為針對不完全表面淬滅進行校正之淬滅樣品之螢光(細胞內螢光)除以未淬滅細胞之螢光(總螢光)。對抗ADAM9抗體共軛物之內化進行作圖，且使用單相指數衰變方程(GraphPad Prism，5.01版)對資料進行擬合。
在NCI-H1703細胞中進行脈衝及連續處理之後，評估表面結合之經Alexa488標記之抗ADAM9抗體之內化。所測試之所有三種抗ADAM9-Alexa488共軛物顯示快速內化，約39%共軛物在第一個15分鐘內經內化，且總計約77%共軛物在6小時後經內化(圖7A)。有趣的是，在連續暴露24小時之後，經內化之螢光訊息為30分鐘後結合至細胞表面之總初始螢光訊息之約7倍大(圖7B)。因此，ADAM9很可能在37℃下的培育期間自細胞內池補充在細胞表面，允許多輪的抗ADAM9抗體共軛物內化。抗ADAM9免疫共軛物之功效依賴於免疫共軛物之內化、細胞內運輸(intracellular trafficking)及降解。抗ADAM9免疫共軛物之效力可部分藉由抗ADAM9免疫共軛物之高度內化來解釋，高度內化可能引起產生大量的細胞毒性分解代謝物。實例 9 抗 ADAM9 抗體細胞加工研究
為了評定chMAB-A之細胞上結合、攝取及溶酶體降解，使用先前描述之經3 H-丙醯胺標記之抗體加工方法(Lai等人, Pharm Res. 2015年11月; 32(11):3593-603)。使用此方法，用氚化丙酸鹽經由離胺酸殘基對靶向ADAM9之chMAB-A抗體進行示蹤標記。先前已顯示，在細胞結合、攝取及向溶酶體運輸時，經[3 H]丙酸鹽標記之Ab (3 H-Ab)經降解，且離胺酸-[3 H]丙醯胺經釋放至細胞生長培養基中。添加有機溶劑使完整的經標記之抗體沉澱，且在溶液中留下離胺酸-[3 H]丙醯胺，允許方便且精確地量測抗體加工之程度。
如先前所述，用[3 H]-丙酸鹽標記chMAB-A。在經由結合曲線判定抗原飽和後，用10 nM3 H-chMAB-A抗體處理NSCLC株NCI-H1703及CRC株DLD-1。將一些細胞樣品用非靶向的氚化同型對照抗體3 H-chKTI處理，而其他細胞樣品未經處理。將細胞鋪板於6孔板中並生長隔夜，且接著如先前所述用一(或多)種試劑進行脈衝處理。簡而言之，將細胞與3 H-chMAB-A抗體或3 H-chKTI一起培育20分鐘，之後在新鮮培養基中洗滌3次。在37℃下、在5% CO2 之情況下培育細胞隔夜。培育20-24小時之後，收穫細胞且用4:3體積丙酮:培養基/細胞混合物使蛋白質沉澱。在-80℃下將樣品冷凍最少1小時，之後解凍且藉由離心來分離。處理團塊以使蛋白質溶解，之後在Tri-Carb液體閃爍計數器(LSC)中計數5分鐘。按照製造商之方案，將1 mL的SOLVABLE (Perkin Elmer)添加至各團塊樣品中，且在50℃水浴中培育隔夜。將樣品自水浴中移除，轉移至20 mL玻璃閃爍小瓶中，且將EDTA及H2 O2 添加至樣品中，隨後再進行1小時的50℃培育。用HCl使樣品淬滅，添加15 mL的Optima Gold液體閃爍液(Perkin Elmer)，且將樣品充分地渦旋。將樣品在黑暗中保持最少4小時，之後藉由LSC進行計數。將不含蛋白質之丙酮提取物樣品在真空下乾燥至＜1 mL體積，且如上文所述使用Solvable加工，之後進行LSC。由所得樣品CPM值計算經結合、經降解且完整的經標記抗體之量。
在脈衝處理且在37℃下培育隔夜之後判定3 H-chMAB-A抗體之加工水準。NCI-H1703細胞顯示出在24小時內93%的3 H-chMAB-A經加工，且DLD-1細胞顯示出在同一時間週期內92%的3 H-chMAB-A經加工。3 H-chKTI之結合及加工可忽略(總CPM低於靶向抗體之CPM＞100倍)。此等細胞株之加工值較高，尤其是相較於先前針對支持本發明抗ADAM9抗體作為作為有效藥物共軛物之其他ADC標靶/抗體報導之24小時脈衝加工值亦然。實例 10 人源化 / 經最佳化抗 ADAM9 抗體及藥物共軛物之結合親和力研究
為了評估共軛對抗原結合之結果，藉由對異位表現人類ADAM9或食蟹獼猴ADAM9之300-19細胞進行FACS分析來判定各抗ADAM9免疫共軛物及其各個未共軛抗體與ADAM9之相對結合親和力。簡而言之，在4℃下將表現ADAM9之300-19細胞與抗ADAM9抗體或免疫共軛物之稀釋系列一起在FACS緩衝液(PBS，0.1% BSA，0.01% NaN3 )中培育30 min。接著將樣品洗滌，且在4℃下與螢光標記之二級抗體一起培育30分鐘。對各濃度下經正規化之螢光強度平均值進行繪圖，且使用非線性迴歸分析(GraphPad Prims 4.0)計算結合之EC50。此研究之結果概述於表14中。
測試之所有抗ADAM9抗體及免疫共軛物以類似親和力與人類ADAM9結合，流動式細胞測量術量測EC50為約1.4 nM，指示共軛未明顯改變抗體結合親和力(參見，圖8A-8D)。雖然相對於嵌合抗體(chMAB-A)，人源化改善與食蟹獼猴ADAM9之結合，但進一步經最佳化變異體(hMAB-A(2C.2)、hMAB-A(2I.2)及hMAB-A(2I.2) S442C)及其免疫共軛物展現出顯著改善的與食蟹獼猴ADAM9之結合。與食蟹獼猴ADAM9結合之顯著改善有利於驗證ADAM9免疫共軛物用作藥物療法的毒理學及安全性研究。表 14 實例11 合成N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-13,13-二甲基-2,5,8-三氧雜-14,15-二硫雜-11-氮雜十九烷-19-醯胺，化合物D6
步驟1：向游離硫醇DGN462 (40 mg，0.042 mmol)及NHS 4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(35 mg，80%純度，0.085 mmol)之無水二氯甲烷(0.5 mL)溶液中添加無水二異丙基乙胺(0.015 mL，0.085 mmol)，且在室溫下攪拌16小時。將反應混合物用飽和氯化銨淬滅並用二氯甲烷稀釋。將獲得之混合物於分液漏斗中分離。將有機層用鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下汽提。藉由半製備型逆相HPLC (C18管柱，CH3 CN/H2 O)純化殘餘物。將含有純產物之級分合併，冷凍且凍乾，得到所要NHS酯，化合物6a (29.7 mg，60%產率)。LCMS = 9.1 min (15 min方法)。MS (m/z)：1157.3 (M + 1)+ 。
步驟2：向NHS酯(化合物6a) (12.3 mg，0.011 mmol)及N-(2-胺乙基)順丁烯二醯亞胺鹽酸鹽(2.0 mg，0.011 mmol)之無水二氯甲烷(0.3 mL)溶液中添加DIPEA(0.0022 mL，0.013 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時，接著將其在減壓下汽提。藉由半製備型逆相HPLC (C18管柱，CH3 CN/H2 O)純化殘餘物。將含有純產物之級分合併，冷凍且凍乾，得到所要順丁烯二醯亞胺，化合物D6 (10 mg，80%產率)。LCMS = 8.3 min (15 min方法)。MS (m/z)：1181.8 (M + 1)+ 。 實例12 合成N1-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基-1-側氧基丙-2-基)己二醯二胺，化合物D5
在室溫下，將NHS酯(化合物5a) (8.2 mg，7.6 µmol)及1-(2-胺乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(2.2 mg，0.011 mmol)溶於無水二氯甲烷(305 µL)中。添加DIPEA (2.66 µL，0.015mmol)，且將反應攪拌3.5小時。將反應混合物濃縮且藉由RPHPLC (C18管柱，CH3 CN/H2 O，梯度，35%至55%)純化。將所要產物級分冷凍且凍乾，得到呈固體白色粉末之順丁烯二醯亞胺，化合物D5 (5.3 mg，58%產率)。LCMS = 5.11 min (8 min方法)。MS (m/z)：1100.6 (M + 1)+ 。 實例13 合成1-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-4-((5-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-2-甲基-5-側氧基戊-2-基)二磺醯基)-1-側氧基丁-2-磺酸，化合物D4
在氮氣下、在室溫下向游離硫醇D1 (88 mg，0.105 mmol)及1-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二磺醯基)丁烷-2-磺酸(磺基-SPDB) (64.0 mg，0.158 mmol)之無水二氯甲烷(2.10 mL)溶液中添加DIPEA (55.0 µL，0.315 mmol)。將混合物攪拌16小時，且接著添加1-(2-胺乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(55.6 mg，0.315 mmol)、無水二氯甲烷(1.0 mL)及DIPEA (0.055 mL，0.315 mmol)。在室溫下再攪拌混合物5小時，之後將反應在真空中 濃縮。藉由RP-HPLC (C18，CH3 CN/H2 O)純化所得殘餘物。將含有所要產物之級分冷凍且凍乾，得到呈白色固體之順丁烯二醯亞胺，D4 (20 mg，16%產率)。LCMS = 4.92 min (8 min方法)。MS (m/z)：1158.6 (M + 1)+ 。 實例14 合成N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮平并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)8-二甲基-2,5,8-三氧雜-11-氮雜十五烷-15-醯胺，化合物D7
在氮氣下向NHS酯7a (5 mg，4.82 µmol)及1-(2-胺乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1.7 mg，9.64 µmol)之無水二氯甲烷(200 µL)溶液中添加DIPEA (1.512 µL，8.68 µmol)。在室溫下攪拌混合物4小時，且接著在真空中 濃縮。藉由RP-HPLC (C18，CH3 CN / H2 O)純化所得殘餘物。將含有所要產物之級分冷凍且凍乾，得到順丁烯二醯亞胺，化合物D7 (3.5 mg，68%產率)。LCMS = 4.61 min (15 min方法)。MS (m/z)：1062.8 (M + 1)+ 。實例 15 製備抗 ADAM9 抗體 hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 之半胱胺酸位點特異性共軛物
hMAB-A(2I.2)-S442C為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68(包含VL序列SEQ ID NO:55)及重鏈序列SEQ ID NO:142(包含VH序列SEQ ID NO:28)之人源化/經最佳化抗體，其包括經工程改造之Cys，該經工程改造之Cys在X為離胺酸時對應於SEQ ID NO:142之第6個至最後一個殘基，或在X不存在時對應於SEQ ID NO:142之第5個至最後一個殘基。
使用標準程序減少hMAB-A(2I.2)-S442C抗體中之兩個未配對半胱胺酸殘基。向此中間體之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、5 mMN,N,N',N' -乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 6.0)溶液中添加N,N -二甲基乙醯胺(DMA)、丙二醇及10莫耳當量之DGN549-C (化合物D5)(呈於DMA中之儲備溶液)，得到最終溶劑組成為2% v/v DMA及38% v/v丙二醇於PBS 5mM EDTA pH 6.0中的反應混合物，且使反應在25℃下進行隔夜。
使用配備有交聯葡聚糖凝膠G-25精細脫鹽管柱之快速蛋白質液相層析(FPLC)系統在流速設定為5 mL/min之情況下將共軛物純化至20 mM琥珀酸鹽、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 4.2)中。接著透過0.22 µm針筒過濾器(syringe filter)過濾共軛物。發現共軛物具有以下平均值：1.9 mol DGN549/mol抗體，藉由UV-vis；97.6%單體，藉由SEC；及0.8%未共軛DGN549，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。實例 16 製備抗 ADAM9 抗體之經離胺酸鍵聯之 IGN 共軛物 a. 製備 hMAB-A(2I.2)-DGN549
hMAB-A(2I.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:52之人源化/經最佳化抗體。向含有hMAB-A(2I.2)抗體之用15 mM 2-[4-(羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)在pH 8.5下緩衝之溶液中添加N,N-二甲基乙醯胺(DMA)連同4.8當量DGN549-L (化合物D2)(呈於DMA中之儲備溶液)，使得最終溶劑組成為10% (v/v) DMA及90% (v/v)水性緩衝液。使反應在25℃下進行4 hr。
經由交聯葡聚糖凝膠G-25脫鹽管柱將共軛物純化至20 mM琥珀酸鹽、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 5.2)中，使用截留分子量(molecular weight cutoff)為10 kDa之膜針對此緩衝液加以透析，且透過0.22 µm針筒過濾器過濾。
共軛物具有以下平均值：2.8 mol DGN549/mol抗體，藉由UV-vis；98.6%單體，藉由SEC；及＜ 0.5%未共軛DGN549，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。b. 製備 hMAB-A(2.2)-DGN549
hMAB-A(2.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:50之人源化抗體。使用與針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述之條件相同的條件將hMAB-A(2.2)抗體共軛至DGN549，例外之處為將4.4當量DGN549-L (化合物D2)添加至反應中。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，以相同方式純化hMAB-A(2.2)-DGN549。
經純化hMAB-A(2.2)-DGN549具有以下平均值：2.7 mol DGN549/mol抗體，藉由UV-vis；95.6%單體，藉由SEC；及0.6%未共軛DGN549，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。c. 製備 hMAB-A(2C.2)-DGN549
hMAB-A(2C.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:51之人源化/經最佳化抗體。
使用與針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述之條件相同的條件將hMAB-A(2C.2)抗體共軛至DGN549，例外之處為將4.9當量DGN549-L (化合物D2)添加至反應中。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，以相同方式純化hMAB-A(2C.2)-DGN549。
經純化hMAB-A(2C.2)-DGN549具有以下平均值：2.8 mol DGN549/mol抗體，藉由UV-vis；98.6%單體，藉由SEC；及＜0.6%未共軛DGN549，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。d. 製備 chMAB-A-DGN549 、 chMAB-A-sSPDB-IGN137 、 chMAB-A-IGN23 及 chMAB-A-sSPDB-DGN462
使用與針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述之條件相同的條件將chMAB-A抗體共軛至DGN549，例外之處為將3.4當量DGN549-L (化合物D2)添加至反應中。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，相同方式純化chMAB-A-DGN549，例外之處為將共軛物純化至20 mM組胺酸、50 mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 6.2)中。經純化chMAB-A-DGN549具有以下平均值：2.7 mol DGN549/mol抗體，藉由UV-vis；94.4%單體，藉由SEC；及＜0.4%未共軛DGN549，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。
如先前在美國專利第9,381,256號中所述，經由磺基-SPDB連接子將chMAB-A抗體共軛至IGN137 (化合物D1)。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，相同方式純化共軛物，例外之處為將共軛物純化至20 mM組胺酸、50 mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 6.2)中。共軛物具有以下平均值：2.9 mol IGN137/mol抗體，藉由UV-vis；88.4%單體，藉由SEC；及≤0.4%未共軛IGN137，藉由串聯SEC/RP-UPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。
如先前在美國專利第8,426,402號中所述，將chMAB-A抗體共軛至IGN23 (化合物D3)。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，相同方式純化共軛物，例外之處為將共軛物純化至20 mM組胺酸、50 mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 6.2)中且未執行透析。共軛物具有以下平均值：3.2 mol IGN23/mol抗體，藉由UV-vis；97.9%單體，藉由SEC；及1.2%未共軛IGN23，藉由逆相HPLC分析。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。
如先前在美國專利第8765740號中所述，經由磺基-SPDB將chMAB-A抗體共軛至DGN462。如針對hMAB-A(2I.2)-DGN549所述，相同方式純化共軛物，例外之處為將共軛物純化至20 mM組胺酸、50 mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50 µM亞硫酸氫鈉(pH 6.2)中且未執行透析。共軛物具有以下平均值：2.8 mol DGN462/mol抗體，藉由UV-vis；95.6%單體，藉由SEC；及0.5%未共軛DGN462，藉由逆相HPLC分析。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。實例 17 製備抗 ADAM9 抗體之經離胺酸鍵聯之 DM 共軛物 a. 製備 hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2I.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:52之人源化/經最佳化抗體。
為了製備hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4共軛物，以逐步方式執行磺基-SPDB (sSPDB)及DM4添加。首先，將含有hMAB-A(2I.2)抗體之用50 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、50 mM氯化鈉在pH 8.1下緩衝之溶液與DMA及來自DMA儲備溶液之11.5當量sSPDB混合，使得最終溶劑組成為10% (v/v) DMA及90% (v/v)水性緩衝液。在使第一反應步驟在25℃下進行4 hr之後，將來自DMA儲備溶液之17.3當量DM4、DMA及500 mM EPPS/500 mM氯化鈉pH 8.1緩衝液添加至反應混合物中，使得維持最終溶劑組成為第一反應步驟之10% (v/v) DMA及90% (v/v)水性緩衝液。使第二反應步驟在25℃下進行隔夜。
經由交聯葡聚糖凝膠G-25脫鹽管柱將共軛物純化至10 mM琥珀酸鹽、250 mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween-20(pH 5.5)中，使用截留分子量為10 kDa之膜針對此緩衝液加以透析，且透過0.22 µm針筒過濾器過濾。
共軛物具有以下平均值：3.5 mol DM4/mol抗體，藉由UV-vis；99.2%單體，藉由SEC；及≤1.7%未共軛DM4，藉由混合模式HPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。b. 製備 hMAB-A(2C.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2C.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:51之人源化/經最佳化抗體。
使用與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方法相同的方法，經由sSPDB連接子將hMAB-A(2C.2)抗體共軛至DM4。以與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方式相同的方式純化共軛物。
共軛物具有以下平均值：3.2 mol DM4/mol抗體，藉由UV-vis；98.9%單體，藉由SEC；及2.6%未共軛DM4，藉由混合模式HPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。c. 製備 hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2.2)為具有輕鏈序列SEQ ID NO:68及重鏈序列SEQ ID NO:50之人源化抗體。
使用與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方法相同的方法，經由sSPDB連接子將hMAB-A(2.2)抗體共軛至DM4。使用配備有交聯葡聚糖凝膠G-25精細脫鹽管柱之快速蛋白質液相層析(FPLC)系統將共軛物純化至10 mM琥珀酸鹽、250 mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween-20(pH 5.5)中，且接著透過0.22 µm針筒過濾器過濾。
共軛物具有以下平均值：3.2 mol DM4/mol抗體，藉由UV-vis；97.4%單體，藉由SEC；及≤1.1%未共軛DM4，藉由混合模式HPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。d. 製備 chMAB-A-sSPDB-DM4 及 chMAB-A-SMCC-DM1
使用與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方法相同的方法，經由磺基-SPDB連接子將chMAB-A抗體共軛至DM4，例外之處為在各個反應步驟中使用6.4當量sSPDB及9.6當量DM4。以與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方式相同的方式純化共軛物，例外之處為未執行透析。共軛物具有以下平均值：3.4 mol DM4/mol抗體，藉由UV-vis；97.0%單體，藉由SEC；及4.7%未共軛DM4，藉由混合模式HPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。
使用美國專利第8624003號中之先前所述方法，經由SMCC連接子將chMAB-A抗體共軛至DM1。以與針對hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4所述之方式相同的方式純化共軛物，例外之處為未執行透析。共軛物具有以下平均值：3.9 mol DM1/mol抗體，藉由UV-vis；99.7%單體，藉由SEC；及4.9%未共軛DM1，藉由混合模式HPLC。未顯示去糖基化共軛物之LC-MS。實例 18 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物之活體外 細胞毒性
將各種抗ADAM9抗體免疫共軛物針對一組表現ADAM9之細胞株的活體外 細胞毒性與非靶向IgG1共軛物比較。具體而言，在處理之前24小時，將500至2000個細胞/孔鋪板在96孔板中。使用3倍稀釋系列將共軛物稀釋至培養基中，且每孔添加100 μL。各檢定板中包括含有細胞但缺乏共軛物之對照孔以及僅含有培養基之孔。一式三份執行各資料點之分析。將板在37℃下在潮濕的5% CO2 培育箱中培育4至5天。接著使用基於WST-8之細胞計數套組-8 (Dojindo Molecular Technologies)判定各孔中有活力之細胞之相對數目。藉由以下計算各孔中細胞之存活分數：首先校正培養基背景吸光度，且接著將各值除以對照孔(未經處理之細胞)之值之平均值。針對共軛物濃度對存活細胞之百分比進行繪圖，且使用非線性迴歸分析(GraphPad Prims 4.0)計算活性之EC50。
此等結果顯示，抗ADAM9免疫共軛物可殺死一大組ADAM9陽性腫瘤細胞株，包括肺腫瘤、胰腺腫瘤、腎腫瘤、前列腺腎腫瘤及結腸腫瘤細胞株(參見，圖9A-9H)。在所測試之各情況下，觀察到良好的特異性窗口，表明細胞毒性為特異性抗ADAM9抗體結合至靶細胞之結果。特別地，抗ADAM9-DGN549共軛物(hMAB-A(2.2)-DGN549及hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549)極為有效，IC50值之範圍為1至115 pM，且活性比非靶向IgG1共軛物多約3個對數(參見，表15)。表 15 實例 19 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物在攜帶 Calu3 人類非小細胞肺腺癌異種移植物之 SCID 小鼠中之抗腫瘤活性
在攜帶Calu3細胞的雌性SCID小鼠(人類肺腺癌皮下異種移植物模型)中評估不同劑量的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4及單劑量的chMAB-A-DGN549共軛物之抗腫瘤活性。
收穫Calu3細胞以進行接種，藉由台盼藍排除判定活力為99%。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用在0.2 ml 50% Matrigel/ 50%無血清培養基中之5 x 106 個Calu3細胞對小鼠進行接種。八十四隻雌性SCID小鼠(6週齡)係獲自Charles River Laboratories。在收到後，先觀察動物9天，之後開始研究。動物在到達時或在處理之前顯示無疾病或病痛之跡象。
將八十四隻小鼠按腫瘤體積隨機分成8個組(每組8只小鼠)。腫瘤體積之範圍為74.09至150.21 (106.41 ± 18.69，平均值± SD) mm3 。在植入後第6天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測及隨機分組。在植入後第7天對小鼠進行給藥。小鼠體重之範圍為16.05至21.72 (18.64 ± 1.03，平均值± SD)公克。藉由打孔法對各組中之小鼠進行鑒別。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml針筒以靜脈內方式進行測試藥劑及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用媒劑(PBS)進行給藥；5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4，qdx1；1.25 mg/kg (以抗體計)的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1；2.5 mg/kg (以抗體計)的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1；5 mg/kg (以抗體計)的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1；及10 µg/kg (以酬載計；0.6 mg/kg，以抗體計)的chMAB-A-DGN549，qdx1。
使用測徑器以三個維度每週量測腫瘤大小兩次。使用式V =長度x寬度x高度x ½以mm3 表述腫瘤體積。認為小鼠在腫瘤體積減小50%或更大時具有部分消退(PR)；在不可偵測到可觸知腫瘤時具有完全腫瘤消退(CR)；且無腫瘤存活者(TFS)為研究結束時無腫瘤小鼠之數目。藉由StudyLog軟體判定腫瘤體積及體重。以式LCK = (T - C) /Td x 3.32計算Log10 細胞殺傷(LCK)，其中(T - C )或腫瘤生長延遲(TGD)為處理組及對照組腫瘤達到預定大小815 mm3 (排除無腫瘤存活者)1 之中值時間(以天計)，Td 為小鼠之腫瘤倍增時間(由對照腫瘤生長之每日中值之非線性指數曲線擬合估計)，且x為每細胞生長對數之細胞倍增數。T/C%(腫瘤生長抑制)為處理組在預定時間(亦即，對照腫瘤之中值TV達到最大腫瘤體積(亦即在約1000 mm3 下之TV)時之時間，或腫瘤變得壞死時之時間，因此該時間為所有對照群組小鼠離開研究時之時間點)時之中值腫瘤體積(TV)與對照在對照之終點時之中值TV之比率。
每週量測所有小鼠之體重兩次，作為藥物毒性之粗略指標。將小鼠之體重(BW)如下表述為與處理前體重之體重變化百分比：BW變化%= [(後BW /前BW) - 1] x 100，其中後BW為處理後之體重，且前BW為處理前之起始體重。將體重損失百分比(BWL)表述為處理後體重之平均變化。當腫瘤體積大於1000 mm3或壞死時，或若體重在研究中之任何點時下降20%以上，則將動物處死。
研究之結果示於圖10中。hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在所有測試劑量下皆為活性的。hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在1.25 mg/kg劑量下腫瘤生長抑制(T/C)值為39%，T-C值為17，且LCK值為0.5 (8只小鼠中有3只為部分消退及完全消退)；在2.5 mg/kg劑量下T/C值為25%，T-C值為22，且LCK值為0.7 (8只小鼠中有3只為部分消退且無完全消退)；且在5 mg/kg劑量下T/C值為14%，T-C值為36，且LCK值為1.1 (8只小鼠中有4只為部分消退，且8只小鼠中有1只為完全消退)。chMAB-A-DGN549在10 µg/kg (以酬載計；0.6 mg/kg，以抗體計)下為高度活性的，8只小鼠中有8只為完全消退。在指示劑量的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4、或chMAB-DGN549、或chKTI-sSPDB-DM4共軛物之情況下未觀察到顯著的體重損失，且因此所有三種共軛物在此研究中在指示劑量下在小鼠中耐受良好。結果顯示，hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在此模型中在不同劑量下為活性的。結果亦顯示，chMAB-A-DGN549在10 µg/kg (以酬載計；0.6 mg/kg，以抗體計)下為高度活性的。
亦在攜帶Calu-3腫瘤異種移植物之雌性SCID小鼠(NSCLC模型)中評估呈單一i.v.劑量之各種劑量hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549之抗腫瘤活性。接種後6天，以腫瘤體積計將小鼠隨機分成8個組(每組n=8)。處理組包括：對照組，以載劑(PBS)進行給藥；hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549共軛物，呈單一i.v.劑量，以0.5 (以酬載計；0.04 mg/kg，以抗體計)、1 (以酬載計；0.08 mg/kg，以抗體計)、3 (以酬載計；0.25 mg/kg，以抗體計)及10 µg/kg (以酬載計；0.8 mg/kg，以抗體計)進行給藥；以及huKTI-S442C-DGN549共軛物之非靶向對照，呈單一i.v.劑量，以1 (以酬載計；0.08 mg/kg，以抗體計)、3 (以酬載計；0.25 mg/kg，以抗體計)及10 µg/kg (以酬載計；0.8 mg/kg，以抗體計)進行給藥。
如以上文所述量測腫瘤體積及體重，且結果示於圖11中。簡而言之，hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在甚至0.5 µg/kg (以酬載計；0.04 mg/kg，以抗體計)之最低劑量下也為高度活性的，且在1 (以酬載計；0.08 mg/kg，以抗體計)、3 (以酬載計；0.25 mg/kg，以抗體計)、10 µg/kg (以酬載計；0.8 mg/kg，以抗體計)劑量下觀察到強效活性。非靶向對照huKTI-S442C-DGN549在此模型中在所有三種測試劑量下皆為非活性的，三種測試劑量亦即1 (以酬載計；0.08 mg/kg，以抗體計)、3 (以酬載計；0.25 mg/kg，以抗體計)及10 ug/kg (以酬載計；0.8 mg/kg，以抗體計)。0.5 µg/kg (以酬載計；0.04 mg/kg，以抗體計)的hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在研究終點時具有7%之T/C，7/8 PR及0/8 CR。1 µg/kg (以酬載計；0.08 mg/kg，以抗體計)的hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在研究終點時具有2%之T/C，8/8 PR及2/8 CR。3 µg/kg (以酬載計；0.25 mg/kg，以抗體計)的hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在研究終點時具有0 %之T/C，8/8 PR及8/8 CR，且10 µg/kg (以酬載計；0.8 mg/kg，以抗體計)的hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在研究終點時具有0%之T/C，8/8 PR及8/8 CR。
hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (0.5、1、3、10 µg/kg，以酬載計)及huKTI-S442C-DGN549 (1、3、10 µg/kg，以酬載計)兩者在此研究中在所有指示劑量下在小鼠中耐受良好。在指示劑量的兩種共軛物中之任一者之情況下未觀察到顯著的體重損失。此研究之結果表明，hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549共軛物顯示引人注目的抗腫瘤活性，且在Calu-3非小細胞肺癌腫瘤異種移植物模型中為高度有效的。實例 20 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物在攜帶 H1703 非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之 SCID 小鼠中之抗腫瘤活性
在攜帶H1703細胞的雌性SCID小鼠(NSCLC鱗狀細胞癌異種移植物模型)中評估不同劑量的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物之抗腫瘤活性。
收穫H1703細胞以進行接種，藉由台盼藍排除判定活力為100%。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用在0.2 ml 50% Matrigel/ 50%無血清培養基中之5 x 106 個H1703細胞對小鼠進行接種。七十二隻雌性裸鼠(6週齡)係於2016年3月24日獲自Charles River Laboratories。在收到後，先觀察動物8天，之後開始研究。動物在到達時或在處理之前顯示無疾病或病痛之跡象。 將四十八隻小鼠按腫瘤體積隨機分成8個組(每組6只小鼠)。腫瘤體積之範圍為76.18至159.00 (115.19 ± 22.08，平均值± SD) mm3 。在植入後第19天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測及隨機分組。在植入後第20天(2016年4月21日)對小鼠進行給藥。小鼠體重之範圍為20.20至29.15 (23.88 ± 1.95，平均值± SD)公克。藉由打孔法對各組中之小鼠進行鑒別。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml針筒以靜脈內方式進行測試藥劑及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用150 µL/小鼠的媒劑(PBS)進行給藥，qdx1；；5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4，qdx1；1.25 mg/kg的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1；2.5 mg/kg的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1；及5 mg/kg的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4，qdx1。
如實例19中所述判定腫瘤大小及體重量測值。研究之結果示於圖12中。hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4在2.5 mg/kg之低劑量下為高度活性的，T/C為6%，T-C為28，且LCK為1.4 (6只小鼠中有3只為部分消退且無完全消退)且在5 mg/kg劑量下為高度活性的，T/C為1%，T-C為63，且LCK為3.2 (6只小鼠中有6只為部分消退，6只小鼠中有3只為完全消退，且1只為無腫瘤存活者)。hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在1.25 mg/kg劑量下為非活性的，且腫瘤生長抑制(T/C)為79%，T-C為4，且LCK為0.2 (6只小鼠中有1只為部分消退且無完全消退)。在指示劑量的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4或chKTI-sSPDB-DM4共軛物之情況下未觀察到顯著的體重損失，且因此兩種共軛物在此研究中在指示劑量下在小鼠中耐受良好。結果顯示，hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在此模型中在低至2.5 mg/kg之劑量下為高度活性的。實例 21 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物在攜帶 Detroit562 鱗狀細胞頭頸癌異種移植物之 SCID 小鼠中之抗腫瘤活性
在攜帶Detroit562細胞的雌性CD-1免疫缺陷小鼠(咽癌異種移植物模型)中評估不同劑量的chMAB-A-sSPDB-DM4共軛物之抗腫瘤活性。
小鼠(6週齡)係於2014年7月1日獲自Charles River Laboratories。在收到後，先觀察動物15天，之後開始研究。動物在到達時或在研究開始之前顯示無疾病或病痛之跡象。收穫Detroit562細胞以進行接種，藉由台盼藍排除判定活力大於90%。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用在0.2 ml 50% Matrigel/ 50%無血清培養基中之5 x 106 個Detroit562細胞對小鼠進行接種。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成6個組(每組7只小鼠)。腫瘤體積之範圍為95.76至450.83 mm3 。在植入後第26天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測及隨機分組。在隨機分組之後第二天(研究第0天)藉由腹膜內注射使用配備有27號½吋針之1.0 ml針筒進行測試藥劑及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用媒劑(PBS)進行給藥；5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4，qdx1；2.5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4，qdx1；5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4，qdx1；2.5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4，qdx1；1.25 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4，qdx1。
如實例19中所述判定腫瘤大小及體重量測值。研究之結果示於圖13中。簡而言之，chMAB-A-sSPDB-DM4在研究時程中在所有3種測試劑量水準(5、2.5及1.25 mg/kg)下為活性的。5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4在研究終點時具有32%之T/C、及6/7 PR及1/7 CR。2.5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4在研究終點時具有27%之T/C、及6/7 PR及2/7 CR。1.25 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4在研究終點時具有37%之T/C、及5/7 PR及0/7 CR。5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4在研究終點時具有89%之T/C、及3/7 PR及0/7 CR。5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4在研究終點時具有80%之T/C、及3/7 PR及1/7 CR。
chMAB-A-sSPDB-DM4在此研究中檢查之所有劑量下在小鼠中皆耐受良好。在指示劑量下未觀察到顯著的體重損失。此研究之結果表明，chMAB-A-sSPDB-DM4共軛物顯示抗腫瘤活性，且在Detroit562咽癌腫瘤異種移植物模型中為有效的。
在第二研究中，在攜帶較大體積Detroit562腫瘤異種移植物的雌性CD-1免疫缺陷小鼠中評估不同劑量的chMAB-A-sSPDB-DM4共軛物之抗腫瘤活性。
小鼠(5週齡)係於2014/9/17獲自Charles River Laboratories。在收到後，先觀察動物7天，之後開始研究。動物在到達時或在研究開始之前顯示無疾病或病痛之跡象。收穫Detroit562細胞以進行接種，藉由台盼藍排除判定活力大於90%。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用在0.2 ml 50% Matrigel/ 50%無血清培養基中之5 x 106 個Detroit562細胞對小鼠進行接種。
將十八隻小鼠按腫瘤體積隨機分成3個組(每組6只小鼠)。腫瘤體積之範圍為277.51至503.49 mm3 。在植入後第35天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測及隨機分組。在隨機分組之後兩天(研究第1天)藉由腹膜內注射使用配備有27號½吋針之1.0 ml針筒進行測試藥劑及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用媒劑(PBS)進行給藥；5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4，qdx1；及1.25 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4，qdx1。
如實例19中所述判定腫瘤大小及體重量測值。研究之結果示於圖14中。簡而言之，chMAB-A-sSPDB-DM4在研究時程中在2種測試劑量水準(5及1.25 mg/kg)下為活性的。5 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4在研究終點時具有3%之T/C、及6/6 PR及1/7 CR。1.25 mg/kg的chMAB-A-sSPDB-DM4在研究終點時具有14%之T/C、及6/6 PR及0/7 CR。
chMAB-A-sSPDB-DM4在此研究中檢查之兩種劑量下在小鼠中耐受良好。在指示劑量下未觀察到顯著的體重損失。此研究之結果表明，chMAB-A-sSPDB-DM4共軛物顯示抗腫瘤活性，且在較大體積Detroit562咽癌腫瘤異種移植物模型中為有效的。實例 22 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物在攜帶 SNU-5 胃癌異種移植物之裸鼠中之抗腫瘤活性
在攜帶Snu-5細胞的雌性裸鼠(人類胃癌異種移植物模型)中評估不同劑量的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4及單劑量的huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549共軛物之抗腫瘤活性。
收穫Snu-5細胞以進行接種，藉由台盼藍排除判定活力為100%。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用在0.1ml 50% Matrigel/ 50%無血清培養基中之5 x 106 個Snu-5細胞對小鼠進行接種。五十六隻雌性裸鼠(6週齡)係於2017年1月25日獲自Charles River Laboratories。在收到後，先觀察動物8天，之後開始研究。動物在到達時或在處理之前顯示無疾病或病痛之跡象。
將五十六隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7個組(每組8只小鼠)。腫瘤體積之範圍為76.29至129.12 (130.58 ± 13.28，平均值± SD) mm3 。在植入後第13天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測及隨機分組。在植入後第14天(2017/2/17)對小鼠進行給藥。小鼠體重之範圍為19.50至26.35 (22.69 ± 1.40，平均值± SD)公克。藉由打孔法對各組中之小鼠進行鑒別。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml針筒以靜脈內方式進行測試藥劑及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用媒劑(PBS)進行給藥；5 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4；2.5 mg/kg的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4；5 mg/kg的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4；10 µg/kg的huKTI-S442C-DGN549；3 µg/kg的huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549；及10 µg/kg的huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549。
使用測徑器以三個維度每週量測腫瘤大小兩次。使用式V =長度x寬度x高度x ½以mm3 表述腫瘤體積。認為小鼠在腫瘤體積減小50%或更大時具有部分消退(PR)；在不可偵測到可觸知腫瘤時具有完全腫瘤消退(CR)；且無腫瘤存活者(TFS)為研究結束時無腫瘤小鼠之數目。藉由StudyLog軟體判定腫瘤體積及體重。以式LCK = (T - C) /Td x 3.32計算Log10 細胞殺傷(LCK)，其中(T - C )或腫瘤生長延遲(TGD)為處理組及對照組腫瘤達到預定大小798 mm3 (排除無腫瘤存活者)1 之中值時間(以天計)，Td 為小鼠之腫瘤倍增時間(由對照腫瘤生長之每日中值之非線性指數曲線擬合估計)，且x為每細胞生長對數之細胞倍增數。T/C%(腫瘤生長抑制)為處理組在預定時間(亦即，對照腫瘤之中值TV達到最大腫瘤體積(亦即在約1000 mm3 下之TV)時之時間，或腫瘤變得壞死時之時間，因此該時間為所有對照群組小鼠離開研究時之時間點)時之中值腫瘤體積(TV)與對照在對照之終點時之中值TV之比率。
每週量測所有小鼠之體重兩次，作為藥物毒性之粗略指標。將小鼠之體重(BW)如下表述為與處理前體重之體重變化百分比：BW變化%= [(後BW /前BW) - 1] x 100，其中後BW為處理後之體重，且前BW為處理前之起始體重。將體重損失百分比(BWL)表述為處理後體重之平均變化。當腫瘤體積大於1000 mm3或壞死時，或若體重在研究中之任何點時下降20%以上，則將動物處死。
研究之結果示於圖15及圖16中。huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在兩種測試劑量下皆為高度活性的。huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在2.5 mg/kg劑量下之腫瘤生長抑制(T/C)值為5% (8只小鼠中有8只為部分消退，且2只為完全消退)；在5 mg/kg下之T/C值為1% (8只小鼠中有8只為部分消退，且6只為完全消退)。huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在兩種測試劑量下皆為高度活性的。huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549共軛物在3 µg/kg劑量下之(T/C)值為7% (8只小鼠中有8只為部分消退，且4只為完全消退)；在5 mg/kg下之T/C值為4% (8只小鼠中有8只為部分消退，且5只為完全消退)。在指示劑量的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4、或huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549、或chKTI-sSPDB-DM4或huKTI-S442C-DGN549共軛物之情況下未觀察到顯著的體重損失，且因此所有共軛物在此研究中在指示劑量下在小鼠中耐受良好。實例 23 抗 ADAM9 抗體藥物共軛物在攜帶 SW48 結腸直腸癌細胞株異種移植物之小鼠中之抗腫瘤活性
在攜帶SW48細胞的雌性裸鼠(結腸直腸癌細胞株異種移植物模型)中評估不同劑量的hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4及huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN649共軛物之抗腫瘤活性。
收穫SW48細胞以進行接種。藉由在右後脅上之區域中之皮下注射來用SW48細胞對小鼠進行接種。動物在自實驗室到達時或在處理之前顯示無疾病或病痛之跡象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7個組(每組6只小鼠)。腫瘤體積之範圍為89至169 mm3 。在植入後第17天，基於腫瘤體積對小鼠進行量測、隨機分組及給藥。藉由耳標對各組中之小鼠進行鑒別。以靜脈內方式進行測試藥物及媒劑之投與。該等組包括：對照組，用媒劑(PBS)進行給藥；10 mg/kg的chKTI-sSPDB-DM4；5 mg/kg的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4；10 mg/kg的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4；5 µg/kg的huKTI-S442C-DGN549；2.5 µg/kg的huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549；及5 µg/kg的huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549。
如實例22中所述判定腫瘤大小及體重量測值。研究之結果示於圖17及圖18中。huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在兩種測試劑量下皆為活性的。huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4共軛物在5 mg/kg劑量下之腫瘤生長抑制(T/C)值為13% (無部分消退或完全消退)；在10 mg/kg下之T/C值為5% (6只小鼠中有6只為部分消退)。huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在5 µg/kg劑量下為活性的，且在所測試之2.5 µg/kg劑量下為非活性的。huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549共軛物在2.5 µg/kg劑量下之(T/C)值為92%；在5 µg/kg下之T/C值為41% (6只小鼠中有2只為部分消退)。在指示劑量的huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4、或huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549、或chKTI-sSPDB-DM4或huKTI-S442C-DGN549共軛物之情況下未觀察到顯著的體重損失，且因此所有共軛物在此研究中在指示劑量下在小鼠中耐受良好(需要由MGNX確認)。實例 24 藉由改善 FcRn 結合來延長抗 ADAM9 抗體美登木素生物鹼共軛物之暴露
為了使抗ADAM9抗體美登木素生物鹼共軛物驅動功效之潛能最大化，將取代M252Y、S254T及T256E(「YTE突變」)引入抗ADAM9抗體、hMAB-A(2I.2)及hMAB-A(2I.2)-S442C之Fc區中，以藉由改善FcRn結合來延長抗體藥物共軛物之暴露。FcRn在維持血清IgG水準方面起主要作用。經非特異性胞吞之IgGs在胞內體中由於pH依賴性相互作用結合至FcRn。FcRn結合之IgG接著經分選至再循環胞內體中，且經運輸回到細胞表面，在細胞表面處IgG由於中性pH而釋放。增強FcRn結合可改善分選及經改善之藥物動力學。
如實例17a中所詳述製備hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4共軛物。如先前在PCT公開案第WO2017/004025號中所述製備hMAB-A(2I.2)-S442C-YTE-sSPDB-DM4共軛物。如在圖19A及19B中所見，YTE突變增加hMAB-A(2I.2)抗體與人類及食蟹獼猴FcRn之結合親和力及親合力。此外，hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4共軛物顯示出與親代hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4共軛物類似的在NCI-H1703、SNU5及Calu3中的活體外及活體內活性。
執行食蟹獼猴PK及耐受性研究以特性化hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4共軛物相較於親代hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4共軛物之耐受性及藥物動力學概況。以4及12 mg/kg之劑量(抗體劑量)呈10分鐘IV輸注向雄性食蟹獼猴投與兩種共軛物，以評定PK概況及急性耐受性。另外，以4 mg/kg之劑量向雄性食蟹獼猴投與裸抗體hMAB-A(2I.2)及hMAB-A(2I.2)-YTE，以解決共軛對PK參數之潛在影響。在28天之時程中收集血液，以允許量測ADC、總抗體及游離酬載濃度。基於存活、臨床觀察、體重及臨床病理學判定耐受性。
如圖20中所見，hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4共軛物相較於親代共軛物之食蟹獼猴PK資料顯示，YTE突變相較於親代共軛物增加暴露。另外，裸hMAB-A(2I.2)抗體及hMAB-A(2I.2)-YTE抗體之食蟹獼猴PK資料顯示，共軛對PK參數具有最小影響，且YTE突變改善裸抗體及共軛物PK參數。此外，hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4及hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4共軛物在高達12 mg/kg之劑量下耐受良好，具有最小皮膚臨床觀察及對血液學參數之劑量依賴性影響。
本說明書中提及之所有公開案及專利皆以引用之方式併入本文，達到如同明確及個別地指示將各個個別公開案或專利申請案以全文引用之方式併入的相同程度。雖然本發明已結合其具體實施例予以描述，但是應理解其能夠進行進一步修改，且希望本申請案涵蓋本發明的通常遵循本發明原則且涉及與本申請案之偏差的任何變化形式、應用或改造，該等偏差處於本發明所屬技術之己知或習慣實務範圍內，且可適用於上文所闡明之基本特徵。
圖 1A-1C 呈現免疫組織化學(IHC)研究之結果，且顯示MAB-A特異性標記多種非小細胞肺癌類型(圖 1A )、乳癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞(圖 1B )及結腸癌細胞(圖 1C )之能力，而同型對照未能特異性標記任何此等癌細胞類型(圖 1A-1C )。
圖 2 呈現細胞染色研究之結果，且顯示MAB-A結合至在293-FT及CHO-K細胞(分別為上圖及下圖)之表面上暫時表現之人類ADAM9(且在較小程度上結合至食蟹獼猴ADAM9)之能力。
圖 3A-3B 描繪與MAB-A之若干人源化/經最佳化變異體(圖 3A ， SEQ ID NO:7 、 16 、 17 、 18 、 19 、 21 、 22 、 23 及28 )比對之鼠抗ADAM9-VH域以及與MAB-A之若干人源化/經最佳化變異體(圖 3B ， SEQ ID NO:11 、 51 、 52 、 53 及54 )比對之鼠抗ADAM9-VL域之胺基酸序列。初始經最佳化期間CDR內經取代之位置如下加下劃線：潛在的脫醯胺及異構化(isomeration)位點用單下劃線指示，離胺酸殘基用雙下劃線指示，另外的不穩定殘基用雙虛下劃線指示。
圖 4A-4B 呈現包含CDRH 3變異體、親代hMAB-A (2.2)及同型對照抗體之十個所選經最佳化hMAB-A殖株之ELISA結合曲線。圖 4A 呈現cynoADAM9之結合曲線，且圖 4B 呈現huADAM9之結合曲線。
圖 5A-5B 呈現Fc變異體之ELISA結合曲線。圖 5A 呈現cynoADAM9之結合曲線，且圖 5B 呈現huADAM9之結合曲線。
圖 6A-6B 分別顯示20個癌組織微陣列中之ADAM9 IHC膜染色以及八個所選適應症中之ADAM9 IHC膜及細胞質染色。
圖 7A-7B 顯示各種抗ADAM9抗體共軛物之脈衝內化及連續內化。
圖 8A-8D 顯示chMAB-A、hMAB-A(2.2)、hMAB-A(2C.2)及hMAB-A(2I.2)抗體及其相應免疫共軛物之FACS結合曲線。
圖 9A-9H 顯示各種抗ADAM9免疫共軛物(hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4、hMAB-A(2.2)-DGN549及hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549)對一大組ADAM9陽性腫瘤細胞株之活體外 細胞毒性。基於非靶向IgG1之共軛物作為陰性對照被包括在內。
圖 10 顯示hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg，以抗體計)及chMAB-A-DGN549 (10 μg/kg，以酬載計)在Calu-3人類非小細胞肺腺癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 11 顯示hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (0.5 µg/kg、1 µg/kg、3 µg/kg及10 µg/kg，以酬載計)在Calu-3人類非小細胞肺腺癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 12 顯示hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg，以抗體計)在H1703非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 13 顯示chMAB-A-sSPDB-DM4(1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg)在Detroit562頭頸鱗狀細胞癌模型(腫瘤體積95.76至450.83 mm3 )中之抗腫瘤活性。
圖 14 顯示chMAB-A-sSPDB-DM4(1.25 mg/kg及5 mg/kg)在Detroi562頭頸鱗狀細胞癌模型(腫瘤體積277.51至503.49 mm3 )中之抗腫瘤活性。
圖 15 顯示huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在SNU-5胃癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 16 顯示huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4在SNU-5胃癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 17 顯示huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549在SW48結腸直腸癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 18 顯示huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4在SW48結腸直腸癌異種移植物模型中之抗腫瘤活性。
圖 19A 顯示在pH 6.0下250 nM及1000 nM huFcRn與經捕捉之具有及沒有YTE突變之抗ADAM9抗體之結合。
圖 19B 顯示在pH 6.0下25 nM及100 nM具有及沒有YTE突變之抗-ADAM9抗體與固定化FcRn之結合。
圖 20 顯示食蟹獼猴中4 mg/kg及12 mg/kg (抗體劑量)的hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4及hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4之抗體-藥物共軛物PK資料。

Claims (115)

  1. 一種包含抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之免疫共軛物： (I) 其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段共軛至藥理學藥劑；且 (II) 其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含輕鏈可變(VL)域及重鏈可變(VH)域，其中該重鏈可變域包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域，且該輕鏈可變域包含CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域，其中： (A) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列；或 (B) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列；或 (C) 該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域之胺基酸序列；且該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域具有MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫共軛物，其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含： (A) (1) MAB-A之該重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (B) (1) MAB-A之該輕鏈可變(VL)域之該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (C) (1) MAB-A之經最佳化變異體之重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之該VH域之該FR1、FR2、FR3及FR4；或 (D) (1) MAB-A之經最佳化變異體之輕鏈可變(VL)域之該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之該VL域之該FR1、FR2、FR3及FR4；或 (E) (1) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之該重鏈可變(VH)域；及 (2) MAB-A之人源化/經最佳化變異體之該VL輕鏈可變(VL)域。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之免疫共軛物，其中MAB-A之該經最佳化變異體之該重鏈可變(VH)域之該CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域分別具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO:47 (SYWX1 H) 其中：X1 為M或I； (2)SEQ ID NO:48 (EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 ) 其中：X2 、X3 、X4 及X5 經獨立地選擇，且 其中：X2 為N或F；X3 為K或R；X4 為K或Q；且X5 為S或G；及 (3)SEQ ID NO:49 (GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY) 其中：X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，且X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得： (A) 當X6 為P時：X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； (B) 當X6 為F、Y或W時：X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； (C) 當X6 為I、L或V時：X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； (D) 當X6 為T時：X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； (E) 當X6 為G時：X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L；且 (F) 當X6 為D時：X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之免疫共軛物，其中MAB-A之該經最佳化變異體之該重鏈可變(VH)域包含胺基酸序列SEQ ID NO:15 之：其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 及X6 經獨立地選擇， 其中：X1 為M或I；X2 為N或F；X3 為K或R；X4 為K或Q；X5 為S或G，且X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇使得： 當X6 為P時；X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； 當X6 為F、Y或W時；X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； 當X6 為I、L或V時；X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； 當X6 為T時；X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； 當X6 為G時；X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L； 當X6 為D時；X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
  5. 如申請專利範圍第4項之免疫共軛物，其中MAB-A之該經最佳化變異體之該重鏈可變(VH)域係選自由以下所組成之群組： (1) hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )； (2) hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )； (3) hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )； (4) hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )； (5) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )； (6) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )； (7) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )； (8) hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )； (9) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )； (10) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )； (11) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )； (12) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )； (13) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 )；及 (14) hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 )。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之免疫共軛物，其中MAB-A之該經最佳化變異體之該輕鏈可變(VL)域之該CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域分別具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO:66 (X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N) 其中：X12 、X13 、X14 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；且X14 為M或L； (2)SEQ ID NO:13 (AASDLES)；及 (3)SEQ ID NO:67 (QQSX15 X16 X17 PFT) 其中：X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之免疫共軛物，其中該輕鏈可變(VL)域包含胺基酸序列SEQ ID NO:53 ：其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；X14 為M或L；X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
  8. 如申請專利範圍第7項之免疫共軛物，其中MAB-A之該經最佳化變異體之該輕鏈可變(VL)域係選自由以下所組成之群組： (1) hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )； (2) hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )； (3) hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )； (4) hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )； (5) hMAB-A VL(2A) (SEQ ID NO:20 )。
  9. 如申請專利範圍第1項之免疫共軛物，其中該CDRH 1域包含胺基酸序列SYWMH (SEQ ID NO:8 )，該CDRH 2域包含胺基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35 )，且該CDRH 3域包含胺基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45 )。
  10. 如申請專利範圍第1項或第9項中任一項之免疫共軛物，其中該CDRL 1域包含胺基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62 )，該CDRL 2域包含胺基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:13 )，且該CDRL 3域包含胺基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14 )。
  11. 如申請專利範圍第9項或第10項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物包含： (A) hMAB-A(2I.2) 之重鏈可變(VH)域(SEQ ID NO:28 )；或 (B) hMAB-A(2I.2) 之輕鏈可變(VL)域(SEQ ID NO:55 )；或 (C) hMAB-A(2I.2) 之重鏈可變(VH)域(SEQ ID NO:28 )及hMAB-A(2I.2) 之輕鏈可變(VL)域(SEQ ID NO:55 )。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物包含Fc區。
  13. 如申請專利範圍第12項之免疫共軛物，其中該Fc區為包含以下之變異體Fc區： (a) 減少該變異體Fc區對FcγR之親和力的一或多個胺基酸修飾；及/或 (b) 引入半胱胺酸殘基的一或多個胺基酸修飾。
  14. 如申請專利範圍第13項之免疫共軛物，其中減少該變異體Fc區對FcγR之親和力的該一或多個胺基酸修飾包含： (A) L234A； (B) L235A；或 (C) L234A及L235A； 其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號。
  15. 如申請專利範圍第13項或第14項中任一項之免疫共軛物，其中引入半胱胺酸殘基的該一或多個胺基酸修飾包含S442C，其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號。
  16. 如申請專利範圍第1項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物包含特異性結合至人類ADAM9及cynoADAM9之人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段共軛至該藥理學藥劑。
  17. 如申請專利範圍第16項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下所組成之群組之序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域： (a) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (c) 分別SEQ ID NO: 8、36及10以及SEQ ID NO: 63、13、14；及 (d) 分別SEQ ID NO: 34、36及10以及SEQ ID NO:64、13、65。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與選自由以下所組成之群組之序列至少90%、至少95%或至少99%一致的序列： (a) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及 (d) 分別SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
  19. 如申請專利範圍第18項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有選自由以下所組成之群組之序列： (a) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及 (d) 分別SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
  20. 如申請專利範圍第16項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段經最佳化以相較於嵌合或鼠親代抗體與cynoADAM9之結合親和力有至少100倍增強並保留與人類ADAM9的高親和力結合。
  21. 如申請專利範圍第20項之免疫共軛物，其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下所組成之群組之序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域： (a) 分別SEQ ID NO: 8、35及37以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別SEQ ID NO: 8、35及38以及SEQ ID NO: 62、13、14； (c) 分別SEQ ID NO: 8、35及39以及SEQ ID NO: 62、13、14； (d) 分別SEQ ID NO: 8、35及40以及SEQ ID NO: 62、13、14； (e) 分別SEQ ID NO: 8、35及41以及SEQ ID NO: 62、13、14； (f) 分別SEQ ID NO: 8、35及42以及SEQ ID NO: 62、13、14； (g) 分別SEQ ID NO: 8、35及43以及SEQ ID NO: 62、13、14； (h) 分別SEQ ID NO: 8、35及44以及SEQ ID NO: 62、13、14； (i) 分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14；及 (j) 分別SEQ ID NO: 8、35及46以及SEQ ID NO: 62、13、14。
  22. 如申請專利範圍第21項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有與選自由以下所組成之群組之序列至少90%、至少95%或至少99%一致的序列： (a) 分別SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
  23. 如申請專利範圍第22項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)具有選自由以下所組成之群組之序列： (a) 分別SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
  24. 如申請專利範圍第16項至第23項中任一項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體為包含Fc區之全長抗體。
  25. 如申請專利範圍第24項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下所組成之群組之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:68； (b) 分別SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:68；及 (c) 分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68。
  26. 如申請專利範圍第16項至第25項中任一項之免疫共軛物，其中該Fc區為包含以下之變異體Fc區： (a) 減少該變異體Fc區對FcγR之親和的之一或多個胺基酸修飾，其選自由以下所組成之群組：L234A、L235A、及L234A及L235A；及/或 (b) 在S442處引入半胱胺酸殘基的胺酸修飾，其中該編號為如Kabat中之EU索引之編號；及/或 (c) 延長該變異體Fc區對FcRn之半衰期的一或多個胺基酸取代，其選自由以下所組成之群組：M252Y、S254T及T256E。
  27. 如申請專利範圍第21項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下所組成之群組之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:68； (b) 分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68； (c) 分別SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:68； (d) 分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68； (e) 分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68； (f) 分別SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:68；及 (g) 分別SEQ ID NO:154及SEQ ID NO:68。
  28. 如申請專利範圍第27項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:154中之X為離胺酸。
  29. 如申請專利範圍第27項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:154中之X不存在。
  30. 如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL1 ； WL 為1至20之整數；且 CyL1 由下式表示：或或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基； L'由下式表示： -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -C(=O)- (B1')；或 -NR5 -P-C(=O)-(CRa Rb )m -S-Zs1 - (B2')； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20之間個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時各獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； m為1至6之整數；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
  31. 如申請專利範圍第30項之免疫共軛物，其中Ra 及Rb 兩者為H；且R5 為H或Me。
  32. 如申請專利範圍第30項或第31項之免疫共軛物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  33. 如申請專利範圍第30項至第32項中任一項之免疫共軛物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  34. 如申請專利範圍第33項之免疫共軛物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  35. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之免疫共軛物，其中Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  36. 如申請專利範圍第30項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：；；；；；；；；；；；；；；；；；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  37. 如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL2 ； WL 為1至20之整數；且 CyL2 由下式表示：；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3 H； Rx1 及Rx2 獨立地為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)；及(b10)， 其中q為1至5之整數。
  38. 如申請專利範圍第37項之免疫共軛物，其中Re 為H或Me；Rx1 及Rx2 獨立地為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，其中Rf 及Rg 各自獨立地為-H或(C1 -C4 )烷基；且p為0、1、2或3。
  39. 如申請專利範圍第38項之免疫共軛物，其中Rf 及Rg 相同或不同，且選自-H及-Me。
  40. 如申請專利範圍第37項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：；；；；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數；N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  41. 如申請專利範圍第30項至第40項之免疫共軛物，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。
  42. 如申請專利範圍第30項至第40項之免疫共軛物，其中N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  43. 如申請專利範圍第42項之免疫共軛物，其中Y為-SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K。
  44. 如申請專利範圍第42項之免疫共軛物，其中Y為-SO3 Na。
  45. 如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第14項及第16項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過離胺酸殘基共價鍵聯至CyL3 ； WL 為1至20之整數； CyL3 由下式表示：， m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 Zs1 係選自下式中之任一者：(b1)；(b2)；(b3)；(b4)；(b5)、(b6)、(b7)；(b8)；(b9)及(b10)， 其中q為1至5之整數。
  46. 如申請專利範圍第45項之免疫共軛物，其中m'為1，且R1 及R2 兩者為H。
  47. 如申請專利範圍第45項之免疫共軛物，其中m'為2，且R1 及R2 兩者為Me。
  48. 如申請專利範圍第45項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：；；或，或或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL 為1至10之整數。
  49. 如申請專利範圍第45項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： WL 為1至10之整數； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  50. 如申請專利範圍第49項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  51. 如申請專利範圍第50項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  52. 如申請專利範圍第49項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  53. 如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC1 ； WC 為1或2； CyC1 由下式表示：；或， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； R5 為-H或(C1 -C3 )烷基； P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Ra 及Rb 在每次出現時獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基、或帶電取代基或可離子化基團Q； W'為-NRe' ， Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx3 為(C1 -C6 )烷基；且， LC 由表示，s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC1 上之-C(=O)-基團之位點；其中： R19 及R20 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； m"為1與10之間的整數；且 Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基。
  54. 如申請專利範圍第53項之免疫共軛物，其中Ra 及Rb 兩者為H；且R5 為H或Me。
  55. 如申請專利範圍第53項或第54項之免疫共軛物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  56. 如申請專利範圍第53項至第55項中任一項之免疫共軛物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  57. 如申請專利範圍第56項之免疫共軛物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  58. 如申請專利範圍第53項至第57項中任一項之免疫共軛物，其中Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  59. 如申請專利範圍第53項至第58項中任一項之免疫共軛物，其中R19 及R20 兩者為H；且m"為1至6之整數。
  60. 如申請專利範圍第59項之免疫共軛物，其中-LC -由下式表示：。
  61. 如申請專利範圍第53項之免疫共軛物，其由下式表示：；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  62. 如申請專利範圍第53項之免疫共軛物，其由下式表示：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  63. 如申請專利範圍第62項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  64. 如申請專利範圍第63項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  65. 如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC2 ； WC 為1或2； CyC2 由下式表示：或， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； Rx1 為(C1 -C6 )烷基； Re 為-H或(C1 -C6 )烷基； W'為-NRe' ； Re' 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為2至6之整數； Rk 為-H或-Me； Rx2 為(C1 -C6 )烷基； LC '由下式表示：；； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC2 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為-H、帶電取代基或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
  66. 如申請專利範圍第65項之免疫共軛物，其中P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  67. 如申請專利範圍第65項或第66項之免疫共軛物，其中P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  68. 如申請專利範圍第67項之免疫共軛物，其中P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  69. 如申請專利範圍第65項之免疫共軛物，其中-LC '-由下式表示：；；或。
  70. 如申請專利範圍第65項至第69項中任一項之免疫共軛物，Re 為H或Me；Rx1 為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，且Rx2 為-(CH2 )p -(CRf Rg )-，其中Rf 及Rg 各自獨立地為-H或(C1 -C4 )烷基；且p為0、1、2或3。
  71. 如申請專利範圍第70項之免疫共軛物，其中Rf 及Rg 相同或不同，且選自-H及-Me。
  72. 如申請專利範圍第65項之免疫共軛物，其由下式表示：；；；； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  73. 如申請專利範圍第53項至第72項之免疫共軛物，其中N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在，且Y為-H。
  74. 如申請專利範圍第53項至第72項之免疫共軛物，其中N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  75. 如申請專利範圍第74項之免疫共軛物，Y為-SO3 H、-SO3 Na或-SO3 K。
  76. 如申請專利範圍第74項之免疫共軛物，其中Y為-SO3 Na。
  77. 如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：， 其中： CBA為如申請專利範圍第1項至第24項及第26項至第29項中任一項之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其透過半胱胺酸殘基共價鍵聯至CyC3 ； WC 為1或2； CyC3 由下式表示：其中： m'為1或2； R1 及R2 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； LC '由下式表示：；； 其中： s1為共價鍵聯至CBA之位點，且s2為共價鍵聯至CyC3 上之-S-基團之位點； Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； Q為H、帶電取代基、或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 、R13 、R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數； m及n各自獨立地為0與10之間之整數； Rh 為-H或(C1 -C3 )烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
  78. 如申請專利範圍第77項之免疫共軛物，其中P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  79. 如申請專利範圍第77項或第78項之免疫共軛物，其中P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  80. 如申請專利範圍第79項之免疫共軛物，其中P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  81. 如申請專利範圍第77項之免疫共軛物，其中-LC '-由下式表示：；；或， 其中M為H+ 或陽離子。
  82. 如申請專利範圍第77項至第81項中任一項之免疫共軛物，其中m'為1，且R1 及R2 兩者為H。
  83. 如申請專利範圍第77項至第81項中任一項之免疫共軛物，其中m'為2，且R1 及R2 兩者為Me。
  84. 如申請專利範圍第77項之免疫共軛物，其中該免疫共軛物由下式表示：；；或； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中DM為由下式表示之藥物部分：。
  85. 一種由下式表示之免疫共軛物：， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： WL 為1至10之整數； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  86. 如申請專利範圍第85項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  87. 如申請專利範圍第86項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  88. 如申請專利範圍第86項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  89. 如申請專利範圍第87項或第88項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X為離胺酸。
  90. 如申請專利範圍第87項或第88項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X不存在。
  91. 一種由下式表示之免疫共軛物：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，其限制條件為，當其為雙鍵時，X不存在，且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  92. 如申請專利範圍第91項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  93. 如申請專利範圍第92項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  94. 如申請專利範圍第92項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  95. 如申請專利範圍第93項或第94項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。
  96. 如申請專利範圍第93項或第94項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。
  97. 一種由下式表示之免疫共軛物：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： wC 為1或2； DM為由下式表示之藥物部分：； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  98. 一種由下式表示之免疫共軛物：； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： wC 為1或2； DM為由下式表示之藥物部分：； CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含具有分別SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14的序列的CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域。
  99. 如申請專利範圍第97項或第98項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有分別SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55的序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  100. 如申請專利範圍第97項或第98項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  101. 如申請專利範圍第97項或第98項之免疫共軛物，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有分別SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68的序列的重鏈及輕鏈。
  102. 如申請專利範圍第100項或第101項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。
  103. 如申請專利範圍第100項或第101項之免疫共軛物，其中SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。
  104. 如申請專利範圍第30項至第103項中任一項之免疫共軛物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉或鉀鹽。
  105. 一種醫藥組成物，其包含有效量如申請專利範圍第1項至第104項中任一項之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  106. 如申請專利範圍第1項至第104項中任一項之免疫共軛物或如申請專利範圍第105項之醫藥組成物在治療與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀中的用途。
  107. 如申請專利範圍第106項之用途，其中與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之該疾病或病狀為癌症。
  108. 如申請專利範圍第107項之用途，其中該癌症係選自由以下所組成之群組：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。
  109. 如申請專利範圍第108項之用途，其中該非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌。
  110. 如申請專利範圍第108項之用途，其中該結腸直腸癌為腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸基質瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌。
  111. 一種用於治療受試者之與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之疾病或病狀的方法，其包含向該受試者投與有效量如申請專利範圍第1項至第104項中任一項之免疫共軛物或如申請專利範圍第105項之醫藥組成物。
  112. 如申請專利範圍第111項之方法，其中與ADAM9表現相關或特徵在於ADAM9表現之該疾病或病狀為癌症。
  113. 如申請專利範圍第112項之方法，其中該癌症係選自由以下所組成之群組：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。
  114. 如申請專利範圍第113項之方法，其中該非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌。
  115. 如申請專利範圍第113項之方法，其中該結腸直腸癌為腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸基質瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌。
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