KR20140008308A - 신규한 egfr-결합 분자 및 이의 면역컨쥬게이트 - Google Patents

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KR20140008308A
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줄리안토 세티아디
피터 유 박
링윤 뤼
토마스 치텐든
질리언 페인
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이뮤노젠 아이엔씨
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Abstract

본 발명에는 EGFR에 결합하는 항체 및 면역컨쥬게이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 신규한 항암제가 제공된다. 상기 작용제, 항체 또는 면역컨쥬게이트를 이용하는 방법, 예를 들어, 종양 성장을 억제시키는 방법이 추가로 제공된다.

Description

신규한 EGFR-결합 분자 및 이의 면역컨쥬게이트{NOVEL EGFR-BINDING MOLECULES AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 EGFR에 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 및 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병, 예를 들어, 악성 질병을 진단하고 치료하기 위해 상기 EGFR-결합 분자를 이용하는 방법에 관한 것이다.
표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR 또는 ErbB1 또는 HER1)는 7q22 염색체에 위치된 c-erbB1 원종양유전자에 의해 암호화되는 170 kDa의 막횡단 당단백질이다. EGFR은 HER2(ErbB2), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4)를 포함하는 수용체 티로신 키나제(RTK)의 인간 표피성장인자 수용체(HER) 족의 일원이다. 이러한 RTK는 리간드-결합 세포외 도메인(ECD), 단일 스팬(span) 막횡단 도메인 및 촉매 키나제 도메인 및 C-말단 꼬리를 함유하는 세포내 도메인으로 구성되는 상동성 구조를 공유한다. HER 키나제 신호전달 경로는 다른 HER 키나제 일원과의 수용체 동종이합체화(homodimerization) 또는 이종이합체화(heterodimerization)를 유도하는 세포외 리간드의 결합 및 세포내 영역의 인산전이(transphosphorylation)에 의해 개시된다. 이러한 사건들은 세포 증식 및 생존에 중요한 다수의 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 유도하는 최초 신호를 발생시킨다.
EGFR은 상피세포 기원의 많은 악성 종양 유형, 예를 들어, 두경부, 결장직장, 폐, 난소, 부신, 췌장, 피부 및 다른 고형 종양에서 과발현된다. EGFR 내지 매개 신호전달 경로는 종양 성장 및 전이의 진행에서 유의한 역할을 하여, EGFR을 종양 요법을 위한 우수한 표적으로 만든다(Baselga, Oncologist, 7:2-8 (2002), Yarden and Sliwkowski, Nat Rev Mol Cell Biol, 2:127-137 (2001)). 현재, 2개의 소분자 티로신 키나제 억제제(TKI)(에를로티니브(erlotinib)(Genentech 및 OSI Pharmaceuticals의 Tarceva) 및 게피티니브(gefitinib)(AstraZeneca 및 Teva Pharmaceuticals의 Iressa)) 및 2개의 네이키드(naked) 모노클로날 항체(세툭시맙(cetuximab)(ImClone 및 BMS의 Erbitux) 및 파니투무맙(panitumumab)(Amgen의 Vectibix))를 포함하는 4개의 EGFR 표적화 작용제가 결장직장암, 췌장암, 두경부, 및 비소세포폐암(NSCLC)의 치료에 대해 승인되었다. 이러한 항-EGFR 작용제는 EGFR 활성화 및 다운스트림 신호전달을 강하게 억제한다. TKI는 EGFR의 세포내 키나제 도메인으로의 결합에 대해 ATP와 경쟁(Baselga and Arteaga, J Clin Oncol, 23:2445-2459 (20005))하는 반면, 2개의 모노클로날 항체는 수용체로의 결합에 대해 EGFR 리간드와 경쟁한다(Gill et al., J Biol Chem, 259:7755-7760 (1984), Goldstein et al., Clin Cancer Res, 1:1311-1318 (1995), Prewett et al., Clin Cancer Res, 4:2957-2966 (1998)).
항-EGFR 요법은 완전하지 않다. EGFR 신호전달의 억제는 특정 종양 유형에서만 효과적이다. 예를 들어, 항-EGFR 항체의 효능은 KRAS, BRAF, PIK3CA 및 PTEN 돌연변이를 갖는 결장직장암 환자에서 현저히 감소된다(De Roock et al., Lancet Oncol, 11:753-762 (2010), Bardelli and Sienna, J Clin Oncol, 28: 1254-1261 (2010)). 또한, 소분자 EGFR 억제제의 활성은 활성화 EGFR 돌연변이를 갖는 NSCLC 환자로 제한된다(Linardou et al., Nat Rev Clin Oncol, 6: 352-366 (2009), Paz-Ares et al., J Cell Mol Med, 14: 51-69 (2009), Mok et al., Discov Med, 8: 227-231 (2009)). EGFR 요법은 또한 피부 독성을 발생시킨다. 피부의 정상 기저 상피세포에서의 EGFR 발현은 표피의 정상 발달 및 생리기능에서 중요한 역할을 하고, EGFR 신호전달의 억제는 여드름모양 피부 발진, 피부 건조, 가려움, 손발톱주위염, 모발 이상, 점막염 및 속눈썹 또는 안면 털의 증가된 성장을 포함하는 다양한 피부 독성을 야기시킨다(Li and Perez-Soler, Targ Oncol 4: 107-119 (2009)에서 개관됨). 생명을 위협하는 것은 드물지만, 피부 독성은 환자의 삶의 질을 감소시키는 유의한 신체적 및 정신-사회적 불편함을 야기시킨다. 또한, 환자의 약 10%에서, 피부 독성은, EGFR 억제제의 임상 경과를 손상시키는 치료 중지 또는 단절을 필요로 할 만큼 중증이다.
따라서, 정상 조직에는 무해하나, EGFR 과발현 악성 종양, 특히, 현재의 EGFR 요법에 내성인 종양을 치료하는데 여전히 매우 효과적인 개선된 항-EGFR 요법이 필요하다. 상기 특정한 요구사항을 충족시키기 위해, 본 발명은 EGFR 발현 종양 세포를 사멸시키는 데에는 매우 효능이 있으나, 정상 상피세포 성장에는 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않는 독특한 신규한 부류의 EGFR 항체에 초점을 맞춘다. 더욱이, 본 발명의 EGFR 항체와 세포독성제의 컨쥬게이션은 상기 항체의 항종양 활성을 강화시키며, 이는 정상 상피세포에 대해 추가적인 독성을 야기시키지 않는다.
본 발명은 일반적으로 EGFR에 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드 및 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병, 예를 들어, 악성 질병을 진단하고 치료하기 위해 상기 EGFR-결합 분자를 이용하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 표피성장인자(EGF) 및 전환성장인자 알파(transforming growth factor alpha, TGFα)를 적어도 80% 억제하는 특징, (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50%의 억제를 야기시키는 특징 및 (c) 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는 특징으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 항체는 (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 EGF(epidermal growth factor) 및 TGFα를 적어도 80% 억제하는 특징, (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50% 억제를 야기시키는 특징 및 (c) 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는 특징으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 특징을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합단편은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하며, 상기 항체는 (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 EGF 및 TGFα를 적어도 80% 억제하고, (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50% 억제를 야기시키고, (c) 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 19 내지 23 및 69 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 VH 서열과 적어도 90% 동일한 VH 서열; 및 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 VL 서열과 적어도 90% 동일한 VL 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, VH 및 VL 서열은 참조 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하다. 또 다른 구체예에서, VH 및 VL 서열은 참조 VH 및 VL 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 19 내지 23 및 69 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 VH 서열; 및 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70으로 구성된 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 19 및 서열번호: 24를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 20 및 서열번호: 25를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 21 및 서열번호: 26을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 21 및 서열번호: 27을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 22 및 서열번호: 28을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 23 및 서열번호: 29를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 23 및 서열번호: 30을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 69 및 서열번호: 70을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 71 및 서열번호: 26을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 71 및 서열번호: 27을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 72 및 서열번호: 26을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 72 및 서열번호: 27을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 73 및 서열번호: 26을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 73 및 서열번호: 27을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 EGFR 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 참조 항체는 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 19의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 24의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (b) 서열번호: 20의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 25의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (c) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (d) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (e) 서열번호: 22의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 28의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (f) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 29의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (g) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 30의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (h) 서열번호: 69의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 70의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (i) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (j) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (k) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (l) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (m) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; 및 (n) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 EGFR 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 참조 항체는 (a) 서열번호: 19의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 24의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (b) 서열번호: 20의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 25의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (c) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (d) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (e) 서열번호: 22의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 28의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (f) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 29의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (g) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 30의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (h) 서열번호: 69의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 70의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (i) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (j) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (k) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (l) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; (m) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; 및 (n) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 2, 4, 6, 63 또는 64의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3 또는 5의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 10, 13 또는 14의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 (a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 2, 4, 6, 63 또는 64의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3 또는 5의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호: 10, 13 또는 14의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 7, 8 또는 9의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 15 또는 16의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 17의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 18의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 (a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 7, 8 또는 9의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호: 15 또는 16의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 17의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 18의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 65, 66 또는 67의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 68 또는 13의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 (a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 65, 66 또는 67의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호: 68 또는 13의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 뮤린, 비-인간(non-human), 인간화, 키메라, 재표면화(resurfaced) 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원 결합 단편이다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGΔCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트라이어바디(triabody), 다이어바디(diabody), 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 또는 scFv-Fc를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 실질적으로 유사한 결합 친화성으로 인간 및 마카크(macaque) EGFR 둘 모두에 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 약 1.0 내지 약 10nM의 Kd로 인간 및 마카크 EGFR에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 약 1.0nM 또는 그 초과의 Kd로 인간 및 마카크 EGFR에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 결합 친화성은 흐름세포측정법, 바이어코어(Biacore) 또는 방사면역측정법에 의해 측정된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드를 생성하는 분리된 세포를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 (a) 본원에 기재된 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 배양하고, (b) 상기 배양 세포로부터 상기 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩타이드를 분리시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 세포는 진핵생물 세포이다.
일 구체예에서, 본 발명은 일반식 (A)-(L)-(C)를 갖는 면역컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 (A)는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드이고, (L)은 링커이고, (C)는 세포독성제이며, 상기 링커 (L)은 (A)를 (C)에 연결시킨다. 또 다른 구체예에서, 링커는 분해성 링커, 비-분해성 링커, 친수성 링커 및 다이카복실산 기반 링커로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 링커는 비-분해성 링커이다. 또 다른 구체예에서, 링커는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP); N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트(SPDB) 또는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)-2-설포뷰타노에이트(설포-SPDB); N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC); N-설포숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(설포SMCC); N-숙신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB); 및 N-숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글라이콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 구체예에서, 링커는 N-숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글라이콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)이다.
또 다른 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 마이탄시노이드(maytansinoid), 마이탄시노이드 유사체, 독소루비신(doxorubicin), 변형된 독소루비신, 벤조다이아제핀, 탁소이드(taxoid), CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카르마이신(duocarmycin), 듀오카르마이신 유사체, 칼리케아마이신(calicheamicin), 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체, 아리스타틴(aristatin), 토마이마이신(tomaymycin) 유도체, 및 렙토마이신(leptomycin) 유도체 또는 상기 작용제의 프로드러그로 구성된 군으로부터 선택된 세포독성제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포독성제는 마이탄시노이드이다. 추가 구체예에서, 세포독성제는 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신(DM1) 또는 N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-마이탄신(DM4)이다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 또는 본원에 기재된 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 제2의 항암제를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 표지되는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 면역컨쥬게이트를 포함하는 진단 시약을 제공한다. 일 구체예에서, 표지는 방사선표지, 형광단, 발색단, 조영제(imaging agent) 및 금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 폴리펩타이드, 또는 면역컨쥬게이트를 포함하는 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 세포와 본원에 기재된 면역컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는, EGFR을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 종양 세포이다.
일 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 면역컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 신생물을 갖는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 신생물은 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 가슴샘, 갑상선, 안구, 두경부, 중추신경계, 말초신경계, 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 가슴 부위 및 비뇨생식계로 구성되는 군의 신생물로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 피검체에 제2의 항암제를 투여하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 제2의 항암제는 화학요법제이다.
일 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 면역컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 세포 증식 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 세포 증식 장애는 부신피질 과다형성(adrenal cortex hyperplasia)(쿠싱병(Cushing's disease)), 선천 부신 과다형성(congenital adrenal hyperplasia), 자궁내막 과다형성(endometrial hyperplasia), 양성 전립선 비대(benign prostatic hyperplasia), 유방 과다형성(breast hyperplasia), 내막 증식(intimal hyperplasia), 국소 상피증식(focal epithelial hyperplasia)(헤크병(Heck's disease)), 피지샘 증식(sebaceous hyperplasia), 보상성 간 과다형성(compensatory liver hyperplasia), 및 임의의 다른 세포 증식 질병뿐만 아니라 신생물로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 서열은 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일하다. 또 다른 구체예에서, 상기 서열은 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 99% 동일하다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 39 내지 58 및 77 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
도 1은 인간 EGFR(huEGFR) 및 원숭이 EGFR(moEGFR) 항원에 대한 표시된 항-EGFR 항체의 결합 친화성을 기재한 표;
도 2는 MDA-MB468 세포(A) 및 인간 일차 각질세포(B)에서 리간드-유도성 EGFR 인산화에서의 표시된 항-EGFR 항체의 효과를 도시한 웨스턴 블롯 데이터;
도 3은 외인성 EGFR 리간드의 부재하에서 MDA-MB468 세포에서의 EGFR 인산화에 대한 표시된 항-EGFR 항체의 효과를 도시한 웨스턴 블롯 데이터;
도 4는 표시된 항체의 존재 하에서 A431 세포에 대한 바이오티닐화된 TGFα(A) 및 EGF(B)의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 5는 다양한 농도의 표시된 항체의 존재 하에서 인간 일차 각질세포의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 6은 표시된 항체 10 ㎍/㎖의 존재 하에서 MCF10A 세포의 성장을 도시한 막대 그래프;
도 7은 표시된 항체의 존재 하에서 HCC827 세포(A) 및 NCI-H292 세포(B)의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 8은 표시된 농도의 표시된 경쟁 항체의 존재 하에서 MDA-MB468 세포에 대한 바이오티닐화된 528 항체(A), 바이오티닐화된 세툭시맙(cetuximab)(B) 및 바이오티닐화된 EGFR-7 항체(C)의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 9는 뮤린 EGFR-7 변이체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 정렬을 도시한 도면;
도 10은 EGFR-7 VL(A) 및 VH(B)의 재표면화에서의 특이적 프레임워크 표면 잔기 변화를 표시한 표;
도 11은 EGFR-12 VL(A) 및 VH(B)의 재표면화에서의 특이적 프레임워크 표면 잔기 변화를 표시한 표;
도 12는 EGFR-7 VL(A), EGFR-7 VH(B), EGFR-12 VL(C) 및 EGFR-12 VH(D)의 재표면화된 서열 및 뮤린 대응물(counterpart)의 정렬을 도시한 도면;
도 13은 EGFR-7 VL(A) 및 VH(B)의 CDR 이식에서의 특이적 프레임워크 표면 잔기 변화를 표시한 표;
도 14는 EGFR-7 VL(A) 및 EGFR-7 VH(B)의 CDR 이식된 서열 및 뮤린 대응물의 정렬을 나타낸 도면;
도 15는 EGFR-6(A) 및 EGFR-7(B)에 대한 뮤린 항체와 이의 상응하는 인간화된 항체 사이의 결합 경쟁을 도시한 선형 그래프;
도 16은 종양 세포 성장 억제에서의 뮤린 항체 및 이의 상응하는 인간화된 항체의 능력을 도시한 선형 그래프;
도 17은 A431 세포에서의 인간화된 EGFR-6 및 EGFR-7R의 NK 세포 매개 ADCC 활성을 도시한 선형 그래프;
도 18은 EGFR-6(A) 및 EGFR-7(B)에 대한 표시된 항체 또는 상응하는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 결합 곡선을 도시한 도면;
도 19는 FaDu(A) 및 H292(B) 세포주에서의 표시된 항체 및 상응하는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성 활성을 도시한 선형 그래프;
도 20은 H226(A) 및 SCC-4(B) 세포주에서의 표시된 항체 및 상응하는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성 활성을 도시한 선형 그래프;
도 21은 표시된 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 단일 용량으로 처리된 마우스에서의 H292 종양 이종이식편의 성장을 선형 그래프를 나타낸 도면;
도 22는 표시된 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 단일 용량으로 처리된 마우스에서의 FaDu 종양 이종이식편의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 23은 인간 일차 각질세포(A) 및 H292 종양 세포(B)의 성장을 억제하는데 있어서 표시된 항체 및 컨쥬게이트의 능력을 도시한 선형 그래프;
도 24는 표시된 항체 및 항체-마이탄시노이드-컨쥬게이트의 존재 하에서 인간 일차 각질세포에 의해 생성되는 CXCL8, CXCL10, CCL5의 양을 도시한 막대 그래프;
도 25는 huEGFR-7R 항체 또는 huEGFR-7R-SMCC-DM1, 또는 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 단일 3 ㎎/㎏ 용량으로 처리된 마우스에서의 H292 종양 이종이식편의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 26은 huEGFR-7R 항체 또는 huEGFR-7R-SMCC-DM1, 또는 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 단일 5 ㎎/㎏ 용량으로 처리된 마우스에서의 HSC2 종양 이종이식편의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 27은 huEGFR-7R 항체 또는 huEGFR-7R-SMCC-DM1, 또는 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 단일 5 ㎎/㎏ 용량으로 처리된 마우스에서의 FaDu 종양 이종이식편의 성장을 도시한 선형 그래프;
도 28은 인간 및 뮤린 EGFR 세포외 도메인(ECD) 서열의 정렬을 나타낸 도면;
도 29는 huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII의 서열의 정렬을 나타낸 도면;
도 30은 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 huEGFR-7R 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 31은 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 huEGFR-6 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 32는 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 muEGFR-7 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 33은 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 muEGFR-6 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 34는 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 muEGFR-12 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 35는 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 muEGFR-13 항체의 결합을 도시한 선형 그래프;
도 36은 huEGFR, huEGFRdIII, muEGFRdIII 및 chEGFRdIII에 대한 세툭시맙(cetuximab)의 결합을 도시한 선형 그래프.
본 발명은 EGFR 신호전달을 부분적으로 억제하고, 일차 각질세포를 포함하는 EGFR-양성의 정상 상피세포에는 효과가 없으나, EGFR-과발현 종양 세포에 대해서는 매우 세포독성인 신규한 부류의 EGFR 결합 분자를 제공한다. 추가로, 항-EGFR 항체의 면역컨쥬게이트는 항체의 항종양 활성을 강화시킨다.
I. 정의
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다양한 용어 및 구(phrase)가 하기에 정의된다.
본원에서 사용되는 "표피성장인자 수용체" 또는 "EGFR"은 성숙한 티로신 키나제 세포 표면 수용체를 나타낸다. 용어 "가용성 EGFR" 또는 "sEGFR"은 EGFR의 세포외 리간드-결합 도메인을 함유하는 EGFR의 부분을 나타낸다. 더욱 특별히, sEGFR은 성숙 EGFR의 아미노산 1 내지 619를 함유한다(Ullrich et al., Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-25 (1986)).
구 "EGFR 매개 암"은 EGFR이 정상의 상응하는 상피조직보다 높은 수준으로 비정상적으로 활성화되는 상피 종양을 특징으로 하는 암을 나타낸다. 상기 EGFR 활성의 보다 높은 수준은 많은 유형의 암에서 종양 성장을 촉진한다. 상기 암은 비소세포폐암, 유방암, 결장직장암, 두경부암 및 전립선암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. EGFR의 비정상적 활성은 수용체의 과발현, 유전자 증폭, 돌연변이 활성화, 수용체 리간드의 과발현, 및/또는 EGFR 활성 조절의 상실로부터 발생할 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인지 부위를 통해 표적, 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 이들의 조합물을 인지하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 폴리클로날 항체, 온전한 모노클로날 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단쇄 Fv(scFv) 돌연변이, 다중특이적 항체, 예를 들어, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 발생된 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인지 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 확인을 기초로 하여 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 임의의 5개의 주요 부류의 면역글로불린, 또는 이들의 하위부류(아이소형(isotype))(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 다양한 부류의 면역글로불린은 다양하고 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 형태를 갖는다. 항체는 네이키드(naked)이거나, 다른 분자, 예를 들어, 독소, 방사성 동위원소 등에 컨쥬게이션될 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 EGFR과 같은 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 구체예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100% 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 항체와 관련된 구 "EGFR 활성화를 억제하는 능력"은 EGFR에 대한 결합이 인간 EGFR 활성화 및 수용체의 활성화 후에 발생하는 인간 EGFR의 생물학적 활성의 억제를 발생시키는 항체를 나타낸다. 세포 증식 검정, 아폽토시스 검정, 수용체 결합 검정, 수용체 인산화 검정 또는 마우스 종양 모델을 이용하여 결정되는 바와 같은 EGFR 생물학적 활성의 하나 이상의 지표를 측정(실시예 참조)하는 것은 EGFR 활성화를 억제하는 항체의 능력을 평가할 수 있다.
용어 "항-EGFR 항체" 또는 "EGFR에 결합하는 항체"는 충분한 친화성으로 EGFR에 결합할 수 있어, EGFR 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용한 항체를 나타낸다. 여러 항-EGFR 항체가 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세툭시맙(Ab 225) 및 528 Ab는 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제4,943,533호에 기재되어 있다.
관련되지 않은 비-EGFR 단백질에 대한 항-EGFR 항체의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사면역측정법(RIA)에 의해 측정되는 바에 따라 EGFR에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다. 특정 구체예에서, EGFR에 결합하는 항체는 ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM 또는 ≤0.1nM의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "상피 독성"은 상피의 이상 또는 기능이상을 나타내며, 이는 EGFR 억제제의 투여에 의해 암에 대해 치료되는 환자에서 피부 발진, 설사, 각막의 얇아짐, 모발 위축 또는 상실, 모낭 형성이상, 변성, 괴사 또는 염증, 모낭간 상피 증식증(interfollicular epidermal hyperplasia), 또는 손상, 특히 증상 후 치유 실패 또는 지연된 치유로부터 선택된 하나 이상의 증상 또는 질환으로 나타날 수 있다. 일 구체예에서, 상피 독성은 여드름모양 또는 피부발진(macro-papular rash)과 같은 피부 독성으로 나타난다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 나타내고, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"모노클로날 항체"는 단일 항원성 결정기, 또는 에피토프의 매우 특이적 인지 및 결합과 관련된 동종 항체 집단을 나타낸다. 이는 다양한 항원성 결정기에 대해 특이적인 다양한 항체를 통상적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 온전한 전장 모노클로날 항체뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄 (scFv) 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인지 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자 전부를 포함한다. 더욱이, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 임의의 수의 방식으로 제조된 상기 항체를 나타낸다.
용어 "인간화된 항체"는 최소 비-인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 이들의 단편인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체 형태를 나타낸다. 통상적으로, 인간화된 항체는 상보성 결정 영역(CDR)로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 항체 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 세밀화시키고 최적화시키기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 적어도 하나, 통상적으로 2 또는 3개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하는 반면, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 FR 영역이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역 또는 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 생성시키는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호에 기재되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독이거나 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 과가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 각 사슬 내의 CDR은 FR에 의해 다른 사슬로부터의 CDR과 근접하여 서로 고정되고, 이는 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 다음과 같은 CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기술이 있다: (1) 종간(cross-species) 서열 변이성을 기초로 한 방법(즉., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 한 방법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec . Biol . 273:927-948)). 또한, 상기 두 방법의 조합이 종종 CDR을 결정하기 위해 당 분야에서 사용된다.
가변 도메인 내의 잔기(대략적으로 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급하는 경우에 케이뱃(Kabat) 넘버링 시스템이 일반적으로 이용된다(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
케이뱃에서의 아미노산 위치 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 상기 가변 도메인의 FR 또는 CDR로의 삽입에 해당하는 보다 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(케이뱃에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들어, 케이뱃에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 케이뱃 넘버링은 항체의 서열과 "표준" 케이뱃 넘버링된 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다. 초티아(Chothia)는 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 케이뱃 넘버링 규칙을 이용하여 넘버링되는 경우 초티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이로 변화한다(이는 케이뱃 넘버링 계획이 H35A 및 H35B에 삽입을 두며, 35A 또는 35B가 존재 하지 않는 경우, 루프는 32에서 끝나고, 35A만 존재 하는 경우, 루프는 33에서 끝나고, 35A 및 35B 둘 모두가 존재 하는 경우, 루프는 34에서 끝나기 때문이다). AbM 과가변 영역은 케이뱃 CDR 및 초티아 구조 루프 사이의 절충을 나타내며, 옥스포드 몰리큘러사(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 이용된다.
Figure pct00001
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성되는 항체, 또는 당 분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조된 인간에 의해 생성되는 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 온전하거나 전장인 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 나타낸다. 통상적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 해당하고, 불변 영역은 상기 종에서 면역 반응을 발생시키는 것을 피하기 위해 또 다른 종(보통 인간)으로부터 유래된 항체 내의 서열과 상동성이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정기"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 특정 항체에 의해 인지되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 일부를 나타낸다. 항원이 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 연속적 아미노산 및 비연속적 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속적 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 단백질 변성 후에 보존되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 단백질 변성 후에 상실된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 형태에서 적어도 3개, 더욱 일반적으로 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총계의 강도를 나타낸다. 달리 표시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화성"은 결합쌍의 일원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 나타낸다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는 당 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 신속히 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 이 중 임의의 방법이 본 발명의 목적에 사용될 수 있다. 특정한 예시적 구체예가 하기에 기재된다.
본원에서 결합 친화성을 나타내기 위해 사용되는 경우 "또는 그 초과"는 분자와 이의 결합 파트너 사이의 보다 강한 결합을 나타낸다. 보다 강한 결합을 나타내기 위해 본원에서 사용되는 경우 "또는 그 초과"는 보다 적은 수의 Kd 값으로 표현된다. 예를 들어, "0.6nM 또는 그 초과"의 항원에 대한 친화성을 갖는 항체에서, 항원에 대한 항체의 친화성은 <0.6nM, 즉 0.59nM, 0.58nM, 0.57nM 등 또는 0.6nM 미만의 임의의 값이다.
"특이적으로 결합"은 일반적으로 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 상기 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 일부 상보성을 필요로 하는 것을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 무작위적인 관련되지 않은 에피토프에 결합하는 것보다 더욱 용이하게 상기 항체의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하는 경우 상기 에피토프에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하게 하는 상대적 친화성을 수식하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 제공된 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
"우선적으로 결합"은 항체가 관련되거나, 유사하거나, 상동성이거나, 동족인 에피토프에 결합하는 것보다 더욱 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 제공된 에피토프에 "우선적으로 결합"하는 항체는, 상기 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있을지라도 관련 에피토프보다 상기 제공된 에피토프에 결합할 가능성이 클 것이다.
항체는, 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 다소 차단하는 정도로 제공된 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우 상기 제공된 에피토프에 대해 참조 항체의 결합을 "경쟁적으로 억제"하는 것으로 언급된다. 경쟁적 억제는 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 제공된 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 2개의 숫자 값(일반적으로, 본 발명의 항체와 관련된 하나의 값 및 참조/비교 항체와 관련된 다른 값) 사이의 유사성의 충분히 높은 정도가 존재 하여, 당업자가 2개의 값 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정되는 생물학적 특징(예를 들어, Kd 값)의 상황에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 없거나 거의 없는 것으로 간주할 수 있게 하는 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교기 항체에 대한 값의 함수에 따라 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 또는 약 10% 미만일 수 있다. 2개의 "실질적으로 유사한 결합 친화성" 사이의 차이는 일반적으로 참조/비교 항체에 대한 값의 함수에 따라 약 10% 미만이다.
본원에서 사용되는 "리간드-독립적 결합"은 EGFR과의 리간드 상호작용의 부재하에서 인간 EGFR 상의 에피토프에 결합하는 EGFR 결합제의 능력을 나타낸다.
"분리된" 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연 상태로 발견되지 않는 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 분리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 자연 상태로 발견되는 형태로 더 이상 존재 하지 않는 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수(즉, 오염물질 비함유), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 순수한 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "면역컨쥬게이트" 또는 "컨쥬게이트"는 세포 결합제(즉, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편)에 연결되는 화합물 또는 이의 유도체를 나타내며, 이는 일반식 C-L-A로 정의되고, 여기서 C는 세포독소, L은 링커, A는 세포 결합제 또는 항-EGFR 항체 또는 항체 단편이다. 면역컨쥬게이트는 또한 역순 A-L-C의 일반식으로 정의될 수 있다.
"링커"는 화합물, 보통 약물, 예를 들어, 마이탄시노이드를 안정적인 공유 방식으로 세포 결합제, 예를 들어, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편에 연결시킬 수 있는 임의의 화학 모이어티(moiety)이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성인 채로 유지되는 조건에서 산-유도성 분해, 광-유도성 분해, 펩타이드분해효소-유도성 분해, 에스터분해효소-유도성 분해 및 이황화결합 분해에 민감하거나, 실질적으로 상기 분해들에 대해 내성일 수 있다. 적합한 링커는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 다이설파이드 기, 티오에터기, 산 불안정 기, 광 불안정 기, 펩타이드분해효소 불안정 기 및 에스터분해효소 불안정 기를 포함한다. 링커는 또한 본원에 기재된 바와 같고 당 분야에 공지된 하전된 링커, 및 이의 친수성 형태를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 세포의 집단이 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 질환을 나타내거나, 이를 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "종양" 및 "신생물"은 전암성 병변을 포함하는 양성(비암성) 또는 악성(암성)인 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 발생하는 하나 이상의 세포를 나타낸다. 치료되고/되거나 예방될 수 있는 "암" 또는 "종양형성" 질병의 예는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비샘(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 안구, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 가슴 부위 및 비뇨생식계의 신생물을 포함한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법상 동등부는 종양 세포 집단의 벌크를 포함하는 비-종양형성 세포, 및 종양형성 줄기세포(암 줄기세포) 둘 모두를 포함하는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 세포의 전체 집단을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 세포"는 암 줄기세포로부터의 종양 세포를 구별하기 위해 재생되고 분화되는 능력이 결핍된 종양 세포를 단독으로 언급하는 경우 용어 "비-종양형성"에 의해 변형될 것이다.
용어 "피검체"는 특정 치료의 수용자가 되는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 나타낸다. 통상적으로, 용어 "피검체" 및 "환자"는 인간 피검체에 대한 언급에서 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
하나 이상의 추가 치료제와 "조합된" 투여는 동시(동반) 투여 및 임의의 순서의 연속적 투여를 포함한다.
용어 "약학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이 되도록 하는 형태로 존재 하고, 제형이 투여되는 피검체에 허용되지 않는 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 나타낸다. 제형은 살균될 수 있다.
본원에 개시된 항체의 "유효량"은 특별히 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적 및 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 피검체 또는 포유동물의 질병 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항체 또는 다른 약물의 양을 나타낸다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; 주위 기관으로의 암세포 침윤을 억제(즉, 다소 늦추거나 정지시킴)할 수 있고/있거나; 종양 전이를 억제(즉, 다소 늦추거나 정지시킴)할 수 있고/있거나; 종양 성장을 다소 억제할 수 있고/있거나; 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 다소 경감시킬 수 있다. "치료하는"의 본원의 정의를 참조하면 된다. 약물이 존재 하는 암 세포의 성장을 예방할 수 있고/있거나 존재 하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 한, 이는 세포증식 억제이고/이거나 세포독성일 수 있다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 요망되는 예방적 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 통상적으로, 그러나 필수적이지는 않지만, 예방적 용량이 질병 전 또는 질병의 초기 단계에서 피검체에 사용되므로, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 경우 단어 "표지"는 항체에 직접적 또는 간접적으로 컨쥬게이션되어 "표지된" 항체를 발생시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 자체로 검출(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)될 수 있거나, 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
"화학요법제"는 작용 메커니즘에 상관 없이 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제는, 예를 들어, CD20의 길항제, 예를 들어, 리툭시맙(Rituximab) 및 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine), 프레디니손(predinisone), 플루다라빈(fludarabine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 레날리도미드(lenalidomide), 클로람부실(chlorambucil), 벤타무스틴(bentamustine) 및/또는 이러한 화학요법제들의 변형된 형태를 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병리 질환 또는 장애의 증상을 치료하고/하거나, 늦추고/거나, 감소시키고/시키거나, 진단된 병리 질환 또는 장애의 진행을 정지시키는 치료 수단 및 2) 표적화된 병리 질환 또는 장애의 발달을 예방하고/하거나 늦추는 예방적 또는 방지 수단 둘 모두를 나타낸다. 따라서, 치료를 필요로 하는 사람들은 장애를 이미 갖는 사람들; 장애를 갖기 쉬운 사람들; 및 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다. 특정 구체예에서, 피검체는 환자가 암세포 수의 감소 또는 암세포의 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 예를 들어, 연조직 및 뼈로의 암의 전파를 포함하는 주위 기관으로의 암세포 침윤의 억제 또는 암세포 침윤의 부재; 종양 전이의 억제 또는 종양 전이의 부재; 종양 성장의 억제 또는 종양 성장의 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 경감; 감소된 이환률 및 사망률; 삶의 질의 개선; 종양의 종양형성, 종양형성 빈도 또는 종양형성 능력의 감소; 종양에서의 암 줄기세포의 수 또는 빈도의 감소; 종양형성 세포의 비-종양형성 상태로의 분화; 또는 상기 효과들의 일부 조합 중 하나 이상을 나타내는 경우 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료"된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 나타내며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재시, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 제공될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 중합화 후에 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은, 예를 들어, "캡(cap)", 자연 발생 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어, 하전되지 않은 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 변형 및 하전된 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)을 갖는 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 핵산분해효소, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-리신 등)을 함유하는 변형, 인터켈레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘(acridine), 프소랄렌(psoralen) 등)를 갖는 변형, 킬레이트제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬화제를 함유하는 변형, 변형된 결합(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 변형뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 또한, 당에 보통 존재 하는 하이드록실기 중 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 추가 뉴클레오타이드에 대한 추가 결합을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 지지체에 컨쥬게이션될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 또한 표준 보호기에 대해 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당-유사체, .알파.-아노머당, 에피머 당, 예를 들어, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스(lyxose), 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 무고리 유사체 및 어베이직(abasic) 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어, 메틸 리보시드를 포함하는 당 분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 결합은 대안적 결합기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적 결합기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), "(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈(formacetal)"(여기서, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H, 또는 에터(--O--) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜(araldyl)을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20 C)임)에 의해 대체되는 구체예를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오타이드 내 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 포함하는 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 임의로 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 축합제와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵생물 세포, 예를 들어, 제작 세포(producer cell)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 변형되거나, 개재(intervention), 예를 들어, 이황화결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함함)를 함유하는 폴리페티드뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형이 상기 정의에 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 항체를 기초로 하므로, 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 단쇄 또는 결합된 사슬로 발생할 수 있음이 이해된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드의 상황에서의 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 아미노산 치환을 고려하지 않고 최대 일치에 대해 비교되고 정렬(필요시, 갭 도입)되는 경우 동일하거나, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열들 또는 부분서열들을 나타낸다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하거나, 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 수득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당 분야에 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 하나의 비제한적인 예는 문헌[Karlin et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci ., 90:5873-5877]에서 변형된 바와 같은 문헌[Karlin et al, 1990, Proc . Natl . Acad , Sci ., 87:2264-2268]에 기재된 알고리즘이며, 이는 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)에 포함된다. 특정 구체예에서, 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같은 갭이 도입되는 BLAST가 이용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460 내지 480), ALIGN, ALIGN-2(Genentech, 캘리포니아주의 사우스 샌프란시스코시에 소재) 또는 Megalign(DNASTAR)이 서열을 정렬시키기 위해 사용될 수 있는 공적으로 이용가능한 추가적인 소프트웨어 프로그램이다. 특정 구체예에서, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트웨어 내의 GAP 프로그램(예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 90의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용함)을 이용하여 결정된다. 특정한 대안적 구체예에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(J Mol . Biol. (48):444-453 (1970))을 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램이 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 이용(예를 들어, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치를 이용함)될 수 있다. 대안적으로, 특정 구체예에서, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Myers 및 Miller의 알고리즘(CABIOS, 4:11-17 (1989))을 이용하여 결정된다. 예를 들어, 동일성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 및 잔기 표를 갖는 PAM120, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하여 결정될 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위한 적절한 파라미터가 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다. 특정 구체예에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 동일성 백분율 "X"는 100×(Y/Z)로 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬(시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 매치로 스코어링되는 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열 내의 잔기의 전체 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 퍼센트는 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 퍼센트보다 클 것이다.
비제한적 예로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오타이드가 참조 서열에 대해 특정 서열 동일성 백분율(예를 들어, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일하고, 일부 구체예에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함)을 갖는지의 여부는, 특정 구체예에서, Bestfit 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 위스콘신주 53711 매디슨시 사이언스 드라이브 575에 소재)을 이용하여 결정될 수 있다. Bestfit은 2개의 서열 사이의 상동성의 최적 세그먼트를 찾기 위해 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이, 예를 들어, 본 발명에 따른 참조 서열과 95% 동일한 지의 여부를 결정하기 위해 Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오타이드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고, 참조 서열 내의 뉴클레오타이드의 전체 수의 5% 이하의 상동성 갭이 허용되도록 파라미터가 설정된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적 검사에 의해 측정되는 바와 같이 최대 일치에 대해 비교되고 정렬되는 경우 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 구체예에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 것을 의미한다. 동일성은 적어도 약 10개, 약 20개, 약 40 내지 60개의 잔기 길이 또는 이 사이의 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐 존재할 수 있고, 60 내지 80개의 잔기보다 긴 영역, 예를 들어, 적어도 약 90 내지 100개의 잔기에 걸쳐 존재할 수 있으며, 일부 구체예에서, 서열은 비교되는 서열, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열의 코딩 영역의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존성 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체된 치환이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족이 당 분야에 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존성 치환이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체의 서열에서의 보존성 치환은 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드 또는 항체의 항원(들), 즉, 폴리펩타이드 또는 항체가 결합하는 EGFR로의 결합을 파기시키지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존성 치환을 확인하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng . 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:.412-417 (1997) 참조).
본 발명의 개시 및 청구항에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지정하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
구체예가 용어 "포함하는"으로 본원 어디에든지 기재되어도, "~으로 구성되는" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성되는"에 의해 기재되는 다른 유사한 구체예가 또한 제공되는 것이 이해된다.
본원의 "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B" 모두를 포함한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음과 같은 구체예 각각을 포함한다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
II . EGFR 결합제
종양은 종종 다양한 리간드에 결합하고, 제한 없는 종양 성장을 촉진시키는 성장인자 수용체를 과발현한다. 상기 성장인자 수용체의 한 예는 표피성장인자 수용체(EGFR) 단백질 족의 수용체이다.
표피성장인자 수용체(EGFR) 단백질 족의 일원을 통한 신호전달은 리간드의 결합에 의해 촉발되는 동종이합체 또는 이종이합체의 형성에 의존된다. 이러한 수용체 족은 4개의 막-결합 단백질 EGFR, HER2/neu, HER3 및 HER4으로 구성된다. 상기 단백질의 과발현은 유방암, 결장암, 난소암, 자궁내막암, 위암, 췌장암, 전립선암 및 타액선암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 다수의 유형의 암에서 불량한 예후와 관련된다. 종양 성장을 억제하기 위해 EGFR 단백질 족의 개별적 일원(예를 들어, HER2/neu 또는 EGFR)을 표적으로 하는 방법의 다수의 그룹이 개발되었으나, 상기 암의 형태를 궁극적으로 치료하는 것으로 증명된 치료는 없다.
본 발명에 따르면, 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 신규한 작용제(예를 들어, 항체)가 제공된다. 이러한 신규한 작용제는 EGFR 신호전달을 부분적으로 억제하고, 일차 각질세포를 포함하는 EGFR-양성의 정상 상피세포에는 영향을 미치지 않는다. 그러나, 이러한 작용제는 EGFR-과발현 종양 세포에 대해서는 매우 세포독성이다.
따라서, 본 발명은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 이러한 작용제는 본원에서 "EGFR 결합제"로 언급된다. 특정 구체예에서, EGFR 결합제는 항체, 면역컨쥬게이트 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, EGFR 결합제는 인간화된 항체이다.
특정 구체예에서, EGFR-결합제는 종양 세포의 증식을 억제하는 효과, 종양에서의 암 줄기세포의 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양형성능(tumorigenicity)을 감소시키는 효과, 종양 성장을 억제하는 효과, 생존을 증가시키는 효과, 종양 세포의 세포 사멸을 촉발시키는 효과, 종양형성 세포를 비-종양형성 상태로 분화시키는 효과, 또는 종양 세포의 전이를 예방하는 효과 중 하나 이상을 갖는다.
일부 구체예에서, EGFR-결합제는 종양 부피를 감소시킬 수 있다. 종양 부피를 감소시키는 EGFR-결합제의 능력은, 예를 들어, 대조 피검체의 중간 종양 부피에 의해 나누어진 치료되는 피검체의 중간 종양 부피인 %T/C 값을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, EGFR-결합제를 이용한 치료는 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만인 %T/C 값을 발생시킨다.
특정 구체예에서, 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 면역컨쥬게이트 또는 다른 작용제는 세포독성제를 통한 세포 사멸을 촉발시킨다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 인간 EGFR 항체에 대한 항체는 단백질 내재화에 의해 EGFR을 발현하는 종양 세포에서 활성화되는 마이탄시노이드에 컨쥬게이션된다. 특정한 대안적 구체예에서, 작용제 또는 항체는 컨쥬게이션되지 않는다.
특정 구체예에서, EGFR-결합제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 구체예에서, EGFR-결합제는 생체내(예를 들어, 이종이식 마우스 모델 및/또는 암을 갖는 인간 내)에서 종양 성장을 억제할 수 있다.
EGFR-결합제는 EGFR 항체 EGFR-6, EGFR-7 및 EGFR-12 및 이들의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. EGFR-결합제는 또한 항체 EGFR-6, EGFR-7 및 EGFR-12와 동일한 EGFR 에피토프에 특이적으로 결합하는 EGFR-결합제를 포함한다. EGFR-결합제는 또한 항체 EGFR-6, EGFR-7 및 EGFR-12를 경쟁적으로 억제하는 EGFR-결합제를 포함한다.
EGFR-결합제는 또한 EGFR-6, EGFR-7 및 EGFR-12의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는 EGFR-결합제를 포함한다. 뮤린 및 인간화된 CDR 서열인 EGFR-7 및 EGFR-12의 CDR 서열은 하기 표 1 및 2에 기재되어 있다.
표 1: 가변 중쇄 CDR 아미노산 서열
Figure pct00002
표 2: 가변 경쇄 CDR 아미노산 서열
Figure pct00003
EGFR 결합 분자는 CDR 당 4개 이하(즉, 0, 1 , 2, 3 또는 4개)의 보존성 아미노산 치환을 갖는 EGFR-6, EGFR-7 및 EGFR-12의 CDR을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
폴리펩타이드는 본원에 기재된 개별적 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 중 하나를 포함할 수 있다. 항체 및 폴리펩타이드는 또한 가변 경쇄 및 가변 중쇄 둘 모두를 포함할 수 있다. 뮤린 및 인간화된 EGFR-7 및 EGFR-12 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열이 하기 표 3 및 4에 제공된다.
표 3: 가변 중쇄 아미노산 서열
Figure pct00004
표 4: 가변 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00005
(a) 서열번호: 19 내지 23, 69 및 71 내지 76과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드가 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 19 내지 30 및 69 내지 76과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 19 내지 23, 69 및 71 내지 76과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 및/또는 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 19 내지 23, 69 및 71 내지 76의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 항체이고/이거나, 폴리펩타이드는 EGFR에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 EGFR에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라 또는 인간화된 항체이다. 특정 구체예에서, 서열번호: 19 내지 30 및 69 내지 76에 대해 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 단지 보존성 아미노산 치환에 의해 서열번호: 19 내지 30 및 69 내지 76과 상이하다.
표 5: 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00006
Figure pct00007
(a) 서열번호: 31, 32 및 36과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 서열번호: 33 내지 35, 37 및 38과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드가 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 31 내지 38과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 31, 32 및 36과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 및/또는 (b) 서열번호: 33 내지 35, 37 및 38과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 31, 32 및 36의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 서열번호: 33 내지 35, 37 및 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 항체이고/이거나, 폴리펩타이드는 EGFR에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 EGFR에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체이다. 특정 구체예에서, 서열번호: 31 내지 38에 대한 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 단지 보존성 아미노산 치환에 의해 서열번호: 31 내지 38과 상이하다.
특정 구체예에서, EGFR 항체는 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331(EGFR-6), 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332(EGFR-7) 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333(EGFR-12)로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 생성된 항체이다. 특정 구체예에서, 항체는 PTA-11331, PTA-11332 및 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 생성된 항체의 VH-CDR 및 VL-CDR을 포함한다.
모노클로날 항체는 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 것과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물이 상기 기재된 바와 같이 면역화되어, 림프구에 의한 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성이 유도된다. 림프구는 또한 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구는 분리되고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜을 이용하여 적합한 골수종 세포주와 융합되어, 이후에 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선별될 수 있는 하이브리도마 세포가 형성된다. 면역침전, 면역블로팅, 또는 시험관내 결합 검정(예를 들어, 방사면역측정법(RIA); 효소결합면역흡착측정법(ELISA))에 의해 결정되는 바와 같은 선택 항원에 대해 특별히 특이적인 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마가 이후 표준 방법(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 이용하여 시험관내 배양으로 또는 동물에서의 복수 종양(ascites tumor)과 같이 생체내에서 증식될 수 있다. 이후, 모노클로날 항체는 상기 폴리클로날 항체에 대해 기재된 바와 같이 배양 배지 또는 복수로부터 정제될 수 있다.
대안적으로, 모노클로날 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 분리되고, 이들의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 이후 적합한 발현 벡터로 클로닝되고, 이러한 발현 벡터가 트랜스펙션되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션되는 경우, 모노클로날 항체가 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 요망되는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 단편은 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 바와 같이 요망되는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
모노클로날 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)은 대안적 항체를 생성시키기 위해 재조합 DNA 기술을 이용하는 다수의 상이한 방식으로 추가로 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은, 1) 키메라 항체를 생성시키기 위해, 예를 들어, 인간 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로 치환될 수 있거나, 2) 융합 항체를 생성시키기 위해 비-면역글로불린 폴리펩타이드로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 모노클로날 항체의 요망되는 항체 단편을 생성시키기 위해 트렁케이션되거나 제거된다. 가변 영역의 부위-특이적 또는 고-밀도 돌연변이유발이 모노클로날 항체의 특이성, 친화성 등을 최적화시키기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 EGFR에 대한 모노클로날 항체는 인간화된 항체이다. 특정 구체예에서, 이러한 항체는 인간 피검체에 투여되는 경우 항원성 및 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 이용된다. 인간화된 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 특정한 대안적 구체예에서, EGFR에 대한 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 직접 제조될 수 있다. 표적 항원에 특이적인 항체를 생성하는, 시험관내 면역화되거나 면역화된 개체로부터 분리된 무한증식 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조). 또한, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있고, 이러한 파지 라이브러리는, 예를 들어, 문헌[Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]에 기재된 바와 같이 인간 항체를 발현한다. 항체 파지 라이브러리의 생성 기술 및 용도가 또한 미국 특허 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호, 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963호; 및 문헌[Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018](이들 각각은 전체내용이 참조로서 포함됨)에 기재되어 있다. 친화성 성숙 방법 및 사슬 셔플링(chain shuffling) 방법(Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, 전체내용이 참조로서 포함됨)이 당 분야에 공지되어 있고, 고 친화성 인간 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있다.
인간화된 항체는 또한 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에서 면역화 후에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 제조될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 EGFR을 특이적으로 인지하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인지하고 결합할 수 있다. 상이한 에피토프는 동일 분자(예를 들어, 동일한 EGFR) 내에 존재 하거나 상이한 분자 상에 존재할 수 있고, 둘 모두에서 항체는 EGFR뿐만 아니라, 예를 들어, 1) 백혈구 상의 효과기 분자, 예를 들어, T-세포 수용체(예를 들어, CD3) 또는 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 2) 하기 상세히 기재되는 바와 같은 세포독성제를 특이적으로 인지하고 이에 결합할 수 있다.
예시적 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는데, 상기 2개의 상이한 에피토프 중 적어도 하나는 본 발명의 폴리펩타이드에서 생성된다. 대안적으로, 면역글로불린 분자의 항-항원 아암(arm)은 특정 항원을 발현하는 세포에 대한 세포 방어 메커니즘에 집중하기 위해 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어, T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7) 또는 IgG에 대한 Fc 수용체에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포로 유도하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터, 예를 들어, EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체를 제조하는 기술은 당 분야에서 통상적이다(Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; 및 미국 특허 제5,731,168호). 2개 초과의 결합가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). 따라서, 특정 구체예에서, EGFR에 대한 항체는 다중특이적이다.
특정 구체예에서, 예를 들어, 종양 침투를 증가시키기 위한 항체 단편이 제공된다. 항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유도된다(예를 들어, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81 참조). 특정 구체예에서, 항체 단편은 재조합적으로 생성된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있고, 이에 따라 상기 단편의 많은 양의 생성이 가능해진다. 이러한 항체 단편은 또한 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 항체 단편은 또한, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 선형 항체일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따르면, EGFR에 특이적인 단쇄 항체의 생성을 위해 기술이 적합화될 수 있다(미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, EGFR, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대해 요망되는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 가능케 하는 Fab 발현 라이브러리의 작제를 위해 방법이 적합화될 수 있다(Huse, et al., Science 246: 1275-1281 (1989)). 항체 단편은, (a) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성되는 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 환원시킴에 의해 생성되는 Fab 단편, (c) 파파인 및 환원제를 이용한 항체 분자의 처리에 의해 생성되는 Fab 단편 및 (d) Fv 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 당 분야의 기술에 의해 생성될 수 있다.
특히, 항체 단편의 경우, 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체를 변형시키는 것이 추가로 요망될 수 있다. 이는, 예를 들어, 항체 단편 내의 적절한 영역의 돌연변이에 의한 항체 단편으로의 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프의 포함, 또는 어느 한 말단 또는 중간에서 항체 단편에 이후에 융합되는 펩타이드 태그로의 에피토프의 포함(예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의함)에 의해 달성될 수 있다.
헤테로컨쥬게이트 항체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 2개의 공유적으로 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어, 원치 않는 세포로 면역 세포를 표적화시키기 위해 제안되었다(미국 특허 제4,676,980호). 항체가 가교제를 수반하는 방법을 포함하는 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 다이설파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에터 결합을 형성시킴으로써 작제될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 발명의 목적상, 변형된 항체가 항체와 인간 EGFR의 폴리펩타이드의 회합을 제공하는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있는 것이 인지되어야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 반응을 마운팅(mounting)시키고 요망되는 종양 관련 항원에 대한 면역글로불린을 생성시키기 위해 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유동물을 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 이와 같이, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어, 인간, 뮤린, 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 이리(lupine) 기원일 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 면역글로불린의 가변 및 불변 영역 둘 모두는 인간 가변 및 불변 영역이다. 다른 구체예에서, 양립되는 항체의 가변 영역(보통 비-인간 소스로부터 유래됨)은 결합 특성을 개선시키거나, 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 조작되거나 특이적으로 맞춤화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 유용한 가변 영역은 도입되는 아미노산 서열의 포함을 통해 인간화되거나 달리 변경될 수 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적 대체, 및 필요 시 부분적 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경된다. CDR은 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있으나, CDR이 다양한 부류의 항체, 및 가능하게는 다양한 종으로부터의 항체로부터 유래되는 것이 예견된다. 항상 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 CDR 모두를 공여 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 대체할 필요는 없다. 오히려, 일부 경우에, 단지 항원 결합 부위의 활성을 유지시키는데 필요한 잔기를 전달하는 것이 필요하다. 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호에 기재된 설명이 제공되는 경우, 상기 작업은 감소된 면역원성을 갖는 기능성 항체를 수득하기 위해 통상적인 실험을 수행하거나, 시험 및 오차 시험(error testing)에 의해 당업자의 능력 범위 내에서 잘 이루어질 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 변형된 항체가, 적어도 불변 영역 도메인 중 하나 이상의 분획이 자연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체와 비교하는 경우 증가된 종양 국소화 또는 감소된 혈청 반감기와 같은 요망되는 생화학적 특징을 제공하기 위해 결실되거나 달리 변경된 항체(예를 들어, 전장 항체 또는 이의 면역반응 단편)를 포함할 것을 인지할 것이다. 일부 구체예에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 양립되는 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인(CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 도메인이 부분적 또는 전체적으로 결실된 변형된 불변 영역이 고려된다. 일부 구체예에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 작제물 또는 변이체(ΔCH2 작제물)를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역에 의해 통상적으로 제공되는 분자 유연성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예를 들어, 10개의 잔기)로 대체될 것이다.
형태 외에, 불변 영역은 여러 효과기 기능을 매개하는 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 옵소닌화 및 세포 병원체의 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민성과 관련될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하고, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위는 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하는 항체의 다양한 부류에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 탐식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 청소, 살세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성 또는 ADCC로 지칭됨), 염증 매개체의 방출, 면역글로불린 생성의 태반이동 및 조절을 포함하는 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
특정 구체예에서, EGFR-결합 항체는 이후에 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미치는 변경된 효과기 기능을 제공한다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 비활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통함)는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있어, 이에 의해 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 경감시키고, 이에 따라 혈청 반감기 및 컨쥬게이션된 세포독소의 비특이적 회합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형은 이황화결합 또는 올리고당류 모이어티를 제거하는데 사용될 수 있고, 이는 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 향상된 국소화를 가능케 한다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 당업자의 이해 범위 내의 널리 공지된 생화학 또는 분자 조작 기술을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서, 항체인 EGFR-결합제는 하나 이상의 효과기 기능을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 활성 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖지 않는다. 특정 구체예에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 구체예에서, 항체는 효과기 기능을 갖지 않는다.
특정 구체예에서, 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접적으로 CH3 도메인을 융합시키기 위해 변형된 항체가 조작될 수 있음이 인지될 것이다. 다른 작제물에서, 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩타이드 스페이서를 제공하는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 나머지 CH3 도메인(변형되거나 변형되지 않음)이 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 갖는 힌지 영역에 연결된 양립된 작제물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서는, 예를 들어, 불변 도메인의 조절 성분이 자유롭고 접근가능하게 남아 있거나, 힌지 영역이 유연성인 채로 남아있는 것을 보장하기 위해 첨가될 수 있다. 그러나, 일부 경우에, 아미노산 스페이서가 면역원성으로 입증되고, 작제물에 대해 원치않는 면역 반응을 유도할 수 있음이 인지되어야 한다. 따라서, 특정 구체예에서, 작제물에 첨가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 요망되는 생화학 특성을 유지시키기 위해 비교적 비-면역원이거나, 심지어 전부 생략될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 외에, 본 발명의 항체는 소수 또는 심지어 단일한 아미노산의 부분적 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역 내의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키고, 이에 의해 종양 국소화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조절되는 효과기 기능(예를 들어, 보체 CLQ 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 요망될 수 있다. 불변 영역의 이러한 부분적 결실은 본 발명의 불변 영역 도메인과 관련된 다른 요망되는 기능을 온전하게 남겨두면서 항체의 선택된 특징(혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 더욱이, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성된 작제물의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 형태 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지시키면서 보존된 결합 부위(예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 붕괴시키는 것이 가능할 수 있다. 특정 구체예는 효과기 기능을 감소시키거나 증가시키는 것과 같은 요망되는 특징을 향상시키기거나 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해, 불변 영역으로의 하나 이상의 아미노산의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입하거나 복제시키는 것이 요망될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 동등물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어, 보존성 치환 돌연변이, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존성 치환은 한 아미노산의 동일한 전반적 부류 내의 또 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어, 하나의 산성 아미노산의 또 다른 산성 아미노산으로의 치환, 하나의 염기성 아미노산의 또 다른 염기성 아미노산으로의 치환, 또는 하나의 중성 아미노산의 또 다른 중성 아미노산으로의 치환을 나타낸다. 보존성 아미노산 치환이 의도하는 바는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 인간 EGFR에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드, 자연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 유의한 영향 없이 변경될 수 있음이 당 분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적 활성을 나타내거나, EGFR 단백질에 대한 항체 또는 이의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 돌연변이는 결실, 삽입, 역전(inversion), 반복 및 유형 치환을 포함한다.
폴리펩타이드 및 유사체는 보통 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 개선시킬 수 있다. 모이어티는 또한 단백질의 임의의 요망되는 부작용 등을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 모이어티에 대한 개관은 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 발견될 수 있다.
본원에 기재된 분리된 폴리펩타이드는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법으로부터 분리된 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 서열의 작제 및 적합한 형질전환된 숙주에서의 상기 서열의 발현까지 이른다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 관심 야생형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 분리시키거나 합성함으로써 재조합 기술에 의해 작제된다. 임의로, 서열은 이의 기능적 유사체를 제공하기 위해 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) 및 미국 특허 제4,588,585호]을 참조하면 된다.
일부 구체예에서, 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용하여 화학적 합성에 의해 작제될 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 요망되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 및 관심 재조합 폴리펩타이드가 생성되는 숙주 세포 내에서 선호되는 코돈의 선택을 기초로 하여 설계될 수 있다. 분리된 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성하기 위해 표준 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 역번역된 유전자를 작제하기 위해 완전한 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 추가로, 특정한 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 여러 작은 올리고뉴클레오타이드가 합성된 후, 라이게이션될 수 있다. 개별적 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 상보적 어셈블리를 위해 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 함유한다.
어셈블리(합성, 부위-특이적 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함)된 후, 특정한 분리된 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터에 삽입되고, 요망되는 숙주 내에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 적절한 어셈블리는 뉴클레오타이드 서열분석, 제한 맵핑(restriction mapping), 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩타이드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서 트랜스펙션된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
특정한 구체예에서, 인간 EGFR에 대한 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA를 증폭시키고 발현시키기 위해 재조합 발현 벡터가 사용된다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항-EGFR 항체 또는 이의 단편의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 작제물이다. 전사 단위는 일반적으로 하기에 상세하게 기재되는 바와 같은, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종료 서열의 어셈블리를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 조절하기 위해 작동자(operator) 서열을 포함할 수 있다. 보통 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인지를 돕는 선별 유전자가 추가로 포함될 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 관련이 있는 경우에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 신호 펩타이드(분비 선도)에 대한 DNA는 이러한 DNA가 폴리펩타이드의 분비와 관련된 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터는 이러한 프로모터가 서열의 전사를 조절하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 이러한 리보솜 결합 부위가 번역을 가능케 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 효모 발현 시스템에서 사용하기 위한 구조 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능케 하는 선도 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 선도 또는 운반 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 임의로 최종 생성물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 이후에 분해될 수 있다.
발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵생물 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예를 들어, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함하는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터의 플라스미드, 보다 폭넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예를 들어, M13 및 섬유상 단일-가닥 DNA 파지를 포함한다.
EGF-결합 폴리펩타이드 또는 항체(또는 항원으로서 사용하기 위한 EGFR 단백질)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 조절 하에서의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 보다 고등한 진핵생물 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 대장균 또는 바실러스를 포함한다. 보다 고등한 진핵생물 세포는 하기 기재되는 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포-비함유 번역 시스템이 또한 이용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 관련 개시가 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)]에 기재되어 있다. 항체 생성을 포함하는 단백질 생성의 방법에 관한 추가 정보는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 공개 제2008/0187954호, 미국 특허 제6,413,746호 및 제6,660,501호 및 국제 특허 공개 WO 04009823호에서 발견될 수 있다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 유리하게는 재조합 단백질을 발현시키는데 이용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 수행될 수 있는데, 이는 상기 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절히 변형되고, 완전히 기능성이 되기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 문헌[Gluzman (Cell 23: 175, 1981)]에 기재된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주, 및, 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는 적절한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 전사되지 않는 요소, 예를 들어, 복제 기점, 발현되는 유전자에 연결되는 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3'의 측면에 존재 하는 전사되지 않는 서열, 및 5' 또는 3'의 번역되지 않는 서열, 예를 들어, 필수 리보솜 결합 부위, 아데닐중합체형성 부위, 스플라이스(splice) 공여 및 수용 부위, 및 전사 종료 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 생성을 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌[Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에 개관되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성되는 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성 및 사이징(sizing) 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화성 태그, 예를 들어, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-전이효소가 단백질에 부착되어, 적절한 친화성 칼럼 상에서의 통과에 의해 용이한 정제가 가능하게 될 수 있다. 분리된 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특성규명될 수 있다.
예를 들어, 배양 배지로 재조합 단백질을 분비하는 시스템으로부터의 상층액은 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초여과 유닛을 이용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 후, 농축액은 적합한 정제 매트릭스로 적용될 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트(pendant) 다이에틸아미노에틸(DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 이용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에서 통상적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 이용될 수 있다. 적합한 양이온 교환은 설포프로필 또는 카복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계가 EGFR-결합제를 추가로 정제하는데 사용될 수 있다. 다양한 조합의 상기 정제 단계의 일부 또는 전부가 또한 균일한 재조합 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다.
박테리아 배양에서 생성된 재조합 단백질은, 예를 들어, 세포 펠릿(pellet)으로부터의 최초 추출 후, 1회 이상의 농축, 염석(salting-out), 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 주기, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 분쇄될 수 있다.
항체 및 다른 단백질을 정제하기 위한 당 분야에 공지된 방법은 또한, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 제2008/0312425호, 제2008/0177048호 및 제2009/0187005호에 기재된 방법을 포함한다.
특정 구체예에서, EGFR-결합제는 항체가 아닌 폴리펩타이드이다. 단백질 표적에 고 친화성으로 결합하는 비-항체 폴리펩타이드를 확인하고 생성하기 위한 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008) 및 Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008)]을 참조하면 된다. 특정 구체예에서, EGFR-결합 폴리펩타이드를 확인/생성하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용되었다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 단백질 A, 리포칼린(lipocalin), 섬유결합소 도메인, 앙키린 컨센서스 반복 도메인 및 타이오레독신으로 구성된 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
일부 구체예에서, 작용제는 비-단백질 분자이다. 특정 구체예에서, 작용제는 소분자이다. 비-단백질 EGFR-결합제의 확인에 유용한 조합 화학 라이브러리 및 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007) 및 Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8: 1383-404 (2001)]을 참조하면 된다. 특정한 추가 구체예에서, 작용제는 탄수화물, 글라이코사미노글라이칸, 당단백질 또는 프로테오글라이칸이다.
특정 구체예에서, 작용제는 핵산 앱타머(aptamer)이다. 앱타머는 또 다른 분자에 결합하는 능력을 기초로 하여 선택(예를 들어, 무작위 또는 돌연변이화된 푸울(pool)로부터 선택)된 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 일부 구체예에서, 앱타머는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 대안적 구체예에서, 앱타머는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 구체예에서, 앱타머는 하나 이상의 변형된 핵산 잔기를 포함한다. 단백질에 대한 결합에 대해 핵산 앱타머를 생성시키고 스크리닝하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,270,163호, 미국 특허 제5,683,867호, 미국 특허 제5,763,595호, 미국 특허 제6,344,321호, 미국 특허 제7,368,236호, 미국 특허 제5,582,981호, 미국 특허 제5,756,291호, 미국 특허 제5,840,867호, 미국 특허 제7,312,325호, 미국 특허 제7,329,742호, 국제 특허 공개 WO 02/077262호, 국제 특허 공개 WO 03/070984호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0239134호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0124565호 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0227735호를 참조하면 된다.
III. 면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 약물 또는 프로드러그에 연결되거나 컨쥬게이션된 본원에 개시된 바와 같은 항-EGFR 항체, 항체 단편, 및 이들의 기능성 동등물을 포함하는 컨쥬게이트(본원에서 면역컨쥬게이트로도 지칭됨)에 관한 것이다. 적합한 약물 또는 프로드러그는 당 분야에 공지되어 있다. 약물 또는 프로드러그는 세포독성제일 수 있다. 본 발명의 세포독성 컨쥬게이트에서 사용되는 세포독성제는 세포의 사멸을 발생시키거나, 세포 사멸을 유도하거나, 일부 방식에서 세포 생활력을 감소시키는 임의의 화합물일 수 있고, 이는, 예를 들어, 마이탄시노이드 및 마이탄시노이드 유사체를 포함한다. 다른 적합한 세포독성제는, 예를 들어, 벤조다이아제핀, 탁소이드(taxoid), CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 듀오카르마이신 유사체, 에네디인(enediyne), 예를 들어, 칼리케아마이신(calicheamicin), 돌라스타틴(dolastatin) 및 돌라스타틴 유사체, 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 토마이마이신(tomaymycin) 유도체, 렙토마이신(leptomycin) 유도체, 메토트렉세이트(methotrexate), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil) 및 모르폴리노 독소루비신(morpholino doxorubicin)이다.
이러한 컨쥬게이트는 약물 또는 프로드러그를 항체 또는 기능성 동등물에 연결시키기 위해 연결기를 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 연결기는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 다이설파이드 기, 티오에터기, 산 불안정 기, 광 불안정 기, 펩타이드분해효소 불안정 기 및 에스터분해효소 불안정 기를 포함한다.
약물 또는 프로드러그는, 예를 들어, 이황화결합을 통해 항-EGFR 항체 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 링커 분자 또는 가교제는 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과 반응할 수 있는 반응성 화학기를 포함한다. 세포-결합제와의 반응을 위한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스터 및 N-설포숙신이미딜 에스터일 수 있다. 또한, 링커 분자는 약물과 반응하여 이황화결합을 형성할 수 있는 다이티오피리딜기일 수 있는 반응성 화학기를 포함한다. 링커 분자는, 예를 들어, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP)(예를 들어, Carlsson et al., Biochem. J, 173: 723-737 (1978) 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트 (SPDB)(예를 들어, 미국 특허 제4,563,304호 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)2-설포뷰타노에이트(설포-SPDB)(미국 특허 공개 제20090274713호 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 펜타노에이트(SPP)(예를 들어, CAS 등록 번호 341498-08-6 참조), 2-이미노티올란 또는 아세틸숙신산 무수물을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 세포 결합제는 가교 시약으로 변형될 수 있고, 이에 따라 유도된 자유 또는 보호된 티올기를 함유하는 항체 또는 세포결합제는 이후에 컨쥬게이트를 생성시키기 위해 다이설파이드-함유 또는 티올-함유 마이탄시노이드와 반응된다. 컨쥬게이트는 HPLC, 크기-배제, 흡착, 이온 교환 및 친화성 포획, 투석 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항-EGFR 항체는 면역컨쥬게이트의 역가, 용해도 또는 효능을 향상시키는데 있어서 이황화결합 및 폴리에틸렌 글라이콜 스페이서를 통해 세포독성 약물에 연결된다. 이러한 분해성 친수성 링커는 WO2009/0134976호에 기재되어 있다. 이러한 링커 디자인의 추가 이점은 요망되는 높은 단량체 비 및 항체-약물 컨쥬게이트의 최소 응집이다. 2-8의 협소한 범위의 약물 로드(drug load)를 갖는 다이설파이드 기(-S-S-) 함유 폴리에틸렌 글라이콜 스페이서((CH2CH2O)n=1-14)를 통해 연결된 약물 및 세포-결합제의 컨쥬게이트가 본 양태에서 특히 고려되며, 상기 컨쥬게이트는 암세포에 대한 비교적 매우 효능이 있는 생물학적 활성을 나타내고, 높은 컨쥬게이션 수율 및 최소 단백질 응집을 갖는 높은 단량체 비의 요망되는 생화학 특성을 갖는다.
하기 화학식 (I)의 항-EGFR 항체 약물 컨쥬게이트 또는 하기 화학식 (I')의 컨쥬게이트가 본 양태에서 특별히 고려된다:
Figure pct00008
상기 식에서,
CB는 항-EGFR 항체 또는 단편을 나타내고;
D는 약물을 나타내고;
X는 티오에터 결합, 아미드 결합, 카바메이트 결합 또는 에터 결합을 통해 세포-결합제에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
Y는 이황화결합을 통해 약물에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
l은 0 또는 1이고;
m은 2 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 24의 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 6의 정수이다.
일부 구체예에서, m은 3 내지 5의 정수이다.
일부 구체예에서, n은 2 내지 8의 정수이다. 대안적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,441,163호 및 제7,368,565호에 개시된 바와 같이, 약물은 세포-결합제와 반응하기에 적합한 반응성 에스터를 도입시키기 위해 먼저 변형될 수 있다. 활성화된 링커 모이어티를 함유하는 상기 약물과 세포-결합제의 반응은 세포-결합제 약물 컨쥬게이트를 생성시키는 또 다른 방법을 제공한다. 마이탄시노이드는 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,716,821호에 기재된 바와 같이 PEG 연결기를 이용하여 항-EGFR 항체 또는 단편에 연결될 수 있다. 이러한 PEG 비-분해성 연결기는 물 및 비-수성 용매 둘 모두에서 가용성이고, 하나 이상의 세포독성제를 세포 결합제에 연결시키는데 사용될 수 있다. 예시적 PEG 연결기는 한 말단에서 기능성 설프하이드릴 또는 다이설파이드기, 및 다른 말단에서 활성 에스터를 통해 링커의 반대 말단에서 세포독성제 및 세포 결합제와 반응하는 이종이기능성 PEG 링커를 포함한다. PEG 연결기를 이용하는 세포독성 컨쥬게이트의 합성의 일반적 예로서, 본원에 참조로서 전체적으로 포함되는 미국 특허 제6,716,821호가 다시 참조된다. 합성은 반응성 PEG 모이어티를 갖는 하나 이상의 세포독성제와 세포-결합제의 반응으로 시작하고, 이는 세포 결합제의 아미노산 잔기에 의해 각각의 반응성 PEG 모이어티의 말단 활성 에스터의 치환을 발생시켜, PEG 연결기를 통해 세포 결합제에 공유적으로 결합된 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트가 생성된다. 대안적으로, 세포 결합은 반응성 다이설파이드 모이어티(예를 들어, 피리딜다이설파이드)를 도입시키기 위해 이기능성 PEG 가교제로 변형될 수 있고, 이후에 티올-함유 마이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포 결합은 티올 모이어티를 도입시키기 위해 이기능성 PEG 가교제로 변형될 수 있고, 이후에 반응성 다이설파이드-함유 마이탄시노이드(예를 들어, 피리딜다이설파이드)로 처리되어 컨쥬게이트가 제공될 수 있다.
비-분해성 링크를 갖는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 가교제는 당 분야에 기재(미국 특허 공개 제20050169933호 참조)되어 있고, 이는 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 문헌에 기재된 바와 같이 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 설포-SMCC, 말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(MBS), 설포-MBS 또는 숙신이미딜-아이오도아세테이트와 같은 가교 시약으로 변형되어, 1-10개의 반응성 기가 도입된다(Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); 및 Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). 이후, 변형된 항체는 티올-함유 마이탄시노이드 유도체와 반응되어 컨쥬게이트가 도입된다. 컨쥬게이트는 세파덱스(Sephadex) G25 칼럼을 통한 겔 여과 또는 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 정제될 수 있다. 변형된 항체는 티올-함유 마이탄시노이드(1 내지 2 몰당량/말레이미도기)로 처리되고, 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 세파덱스 G-25 칼럼을 통한 겔 여과, 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 상에서의 크로마토그래피, 투석 또는 접선 유동 여과 또는 이들 방법의 조합에 의해 정제된다. 통상적으로, 항체 당 평균 1-10개의 마이탄시노이드가 연결된다. 한 방법은 말레이미도기를 도입시키기 위해 항체를 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)로 변형시킨 후, 변형된 항체와 티올-함유 마이탄시노이드의 반응으로 티오에터-연결된 컨쥬게이트를 생성시키는 것이다. 다시 항체 당 1 내지 10개의 약물 분자를 갖는 컨쥬게이트가 생성된다. 항체, 항체 단편, 및 다른 단백질의 마이탄시노이드 컨쥬게이트가 동일 방식으로 제조된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, EGFR 항체는 PEG 스페이서의 연계성(intermediacy)을 통한 비-분해성 결합을 통해 약물에 연결된다. 약물과 항-EGFR 항체 또는 단편 사이에 링커를 형성하는 친수성 PEG 사슬을 포함하는 적합한 가교 시약이 또한 당 분야에 널리 공지되어 있거나, 시판(예를 들어, 오하이오주의 파월시에 소재한 Quanta Biodesign에서 시판)된다. 적합한 PEG-함유 가교제가 또한 당업자에게 공지된 표준 합성 화학 기술을 이용하여 시판되는 PEG 자체로부터 합성될 수 있다. 약물은 미국 특허 공개 제20090274713호 및 WO2009/0134976호에 상세히 기재된 방법에 의해 이기능성 PEG-함유 가교제와 반응되어 화학식
Figure pct00009
의 화합물이 생성될 수 있고, 이는 이후 세포 결합제와 반응되어 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 대안적으로, 세포 결합은 티올-반응성 기(예를 들어, 말레이미드 또는 할로아세트아미드)를 도입시키기 위해 이기능성 PEG 가교제로 변형될 수 있고, 이는 이후 티올-함유 마이탄시노이드로 처리되어 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포 결합은 티올 모이어티를 도입시키기 위해 이기능성 PEG 가교제로 변형될 수 있고, 이는 이후 티올-반응성 마이탄시노이드(예를 들어, 말레이미드 또는 할로아세트아미드를 갖는 마이탄시노이드)로 처리되어 컨쥬게이트가 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 하기 화학식 (II) 또는 화학식 (II')의 항-EGFR 항체 약물 컨쥬게이트이다:
Figure pct00010
상기 식에서, CB는 항-EGFR 항체 또는 단편을 나타내고;
D는 약물을 나타내고;
X는 티오에터 결합, 아미드 결합, 카바메이트 결합 또는 에터 결합을 통해 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
Y는 티오에터 결합, 아미드 결합, 카바메이트 결합, 에터 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 하이드라존 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 공유 결합을 통해 약물에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 단위를 나타내고;
l은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
m은 2 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 2000의 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 8의 정수이다.
일부 구체예에서, n은 1 내지 24의 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 6의 정수이다.
일부 구체예에서, m은 3 내지 5의 정수이다.
일부 구체예에서, n은 2 내지 8의 정수이다. 적합한 PEG-함유 링커의 예는 항-EGFR 항체 또는 이의 단편과의 반응을 위한 N-숙신이미딜 에스터 또는 N-설포숙신이미딜 에스터 모이어티뿐만 아니라 화합물과의 반응을 위한 말레이미도-기반 또는 할로아세틸-기반 모이어티를 갖는 링커를 포함한다. PEG 스페이서는 본원에 기재된 방법에 의해 당 분야에 공지된 임의의 가교제로 포함될 수 있다.
본원에 개시된 링커 중 다수의 링커가 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 제20050169933호 및 제20090274713호, 및 WO2009/0134976호에 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 약 2 내지 약 8개의 약물 분자("약물 로드"), 예를 들어, 마이탄시노이드가 항-EGFR 항체 또는 이의 단편에 연결되고, 컨쥬게이트의 항-종양 효과가 동일한 세포 결합제에 연결된 보다 적거나 많은 수의 약물의 약물 로드에 비해 훨씬 더 효과적인 양태를 포함한다. 본원에서 사용되는 "약물 로드"는 세포 결합제(예를 들어, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편)에 부착될 수 있는 약물 분자(예를 들어, 마이탄시노이드)의 수를 나타낸다. 일 양태에서, 세포 결합제에 부착될 수 있는 약물 분자의 수는 평균 약 2 내지 약 8(예를 들어, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1)일 수 있다. N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신(DM1) 및 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸) 마이탄신(DM4)이 사용될 수 있다.
항-EGFR 항체 또는 이의 단편은 이기능성 가교제와 항-EGFR 항체 또는 이의 단편을 반응시켜, 이에 의해 항-EGFR 항체 또는 이의 단편에 대한 링커 분자의 공유 부착을 발생시킴으로써 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "이기능성 가교 시약"은 약물, 예를 들어, 본원에 기재된 약물에 세포-결합제를 공유적으로 연결시키는 임의의 화학적 모이어티이다. 또 다른 방법에서, 연결 모이어티의 일부는 약물에 의해 제공된다. 이러한 양태에서, 약물은 약물에 세포-결합제를 연결시키는데 사용되는 보다 큰 링커 분자의 부분인 연결 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 마이탄시노이드 DM1을 형성시키기 위해, 마이탄신의 C-3 하이드록실기에서의 측쇄는 자유 설프하이드릴기(SH)를 갖도록 변형된다. 마이탄신의 이러한 티올화된 형태는 변형된 세포-결합제와 반응하여 컨쥬게이트가 형성될 수 있다. 따라서, 최종 링커는 2개의 성분으로부터 어셈블리되고, 이 중 하나는 가교 시약에 의해 제공되는 한편, 다른 하나는 DM1으로부터의 측쇄에 의해 제공된다.
약물 분자는 또한 혈청 알부민과 같은 중간 담체 분자를 통해 항체 분자에 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "세포-결합제에 연결된" 또는 "항-EGFR 항체 또는 단편에 연결된"은 적합한 연결기를 통해 세포-결합제 항-EGFR 항체 또는 단편에 결합된 적어도 하나의 약물 유도체를 포함하는 컨쥬게이트 분자, 또는 이의 전구체를 나타낸다. 하나의 연결기는 SMCC이다.
특정 구체예에서, 본 발명에 유용한 세포독성제는 마이탄시노이드 및 마이탄시노이드 유사체이다. 적합한 마이탄시노이드의 예는 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체의 에스터를 포함한다. 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체와 같이, 미세관 형성을 억제하고, 포유동물 세포에 대해 고도로 독성인 임의의 약물이 포함된다.
적합한 마이탄시놀 에스터의 예는 변형된 방향족 고리를 갖는 마이탄시놀 에스터 및 다른 위치에 변형을 갖는 마이탄시놀 에스터를 포함한다. 이러한 적합한 마이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,333,410호; 제7,276,497호 및 제7,473,796호에 개시되어 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 면역컨쥬게이트는 세포독성제로서 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신으로 정식으로 지칭되는 티올-함유 마이탄시노이드(DM1)를 이용한다. DM1은 하기 구조식 (III)으로 표현된다:
Figure pct00011
또 다른 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 티올-함유 마이탄시노이드 N2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신(예를 들어, DM4)을 이용한다. DM4는 하기 구조식 (IV)로 표현된다:
Figure pct00012
입체구조적으로 방해된 티올 결합을 함유하는 측쇄를 포함하는 또 다른 마이탄시노이드는 하기 구조식 (V)로 표현되는 N2'-데아세틸-N-2'(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신(DM3로 지칭됨)이다:
Figure pct00013
미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,497호에 교시된 마이탄시노이드 각각이 또한 본 발명의 컨쥬게이트에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 제5,208,020호 및 제7,276,697호의 전체 개시가 참조로서 본원에 포함된다.
마이탄시노이드 상의 많은 위치가 연결 모이어티를 화학적으로 연결시키기는 위치로 작용할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시기를 갖는 C-20 위치가 모두 유용한 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, C-3 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결시키는 위치로 작용하고, 일부 특정 구체예에서, 마이탄시놀의 C-3 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결시키는 위치로 작용한다.
일부 컨쥬게이트의 대표 구조가 하기에 제시된다:
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트를 생성시키는 여러 기재가 각각의 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제6,333,410호, 제6,441,163호, 제6,716,821호 및 제7,368,565호에 제공된다.
일반적으로, 수성 완충액 중의 항체의 용액은 반응성 기를 갖는 다이설파이드 모이어티를 갖는 몰 과량의 마이탄시노이드와 함께 인큐베이션될 수 있다. 반응 혼합물은 과량의 아민(예를 들어, 에탄올아민, 타우린 등)의 첨가에 의해 켄칭될 수 있다. 마이탄시노이드-항체 컨쥬게이트는 이후 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
항체 분자 당 결합된 마이탄시노이드 분자의 수는 252㎚ 및 280㎚에서의 흡광도의 비를 분광광도적으로 측정함으로써 결정될 수 있다. 마이탄시노이드 분자/항체의 평균 수는, 예를 들어, 1 내지 10 또는 2 내지 5일 수 있다.
안트라사이클린 화합물뿐만 아니라 이의 유도체, 중간체 및 변형된 형태가 또한 항-EGFR 면역컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 독소루비신, 독소루비신 유도체, 독소루비신 중간체, 및 변형된 독소루비신이 항-EGFR 컨쥬게이트에서 사용될 수 있다. 예시적 화합물이 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 2010/009124호에 기재되어 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00017
상기 식에서, R1은 수소 원자, 하이드록시 또는 메톡시기이고, R2는 C1-C8 알콕시기이다.
항체와 마이탄시노이드 또는 다른 약물의 컨쥬게이트는 시험관내에서 다양한 원치않는 세포주의 증식을 억제하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, NCI-H226, NCI-H292 및 NCI-H322M과 같은 세포주가 상기 화합물의 세포독성의 평가에 용이하게 사용될 수 있다. 평가되는 세포는 4 내지 5일 동안 화합물에 노출될 수 있고, 세포의 생존 분획이 공지된 방법에 의해 직접 검정으로 측정된다. IC50 값은 이후에 검정 결과로부터 계산될 수 있다.
본원에 기재된 일부 구체예에 따라 면역컨쥬게이트가 세포로 내재화될 수 있다. 따라서, 면역컨쥬게이트는 EGFR-발현 세포에 의해 흡수되거나 내재화되는 경우에 치료 효과를 발휘할 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 분해성 링커에 의해 세포독성제에 연결된 항체, 항체 단편 또는 폴리펩타이드를 포함하고, 세포독성제는 항체, 항체 단편 또는 폴리펩타이드로부터 분해되고, 이는 EGFR-발현 세포에 의해 내재화된다.
일부 구체예에서, 면역컨쥬게이트는 종양 부피를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 면역컨쥬게이트를 이용한 처리는 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만인 %T/C 값을 발생시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, siRNA 분자는 약물 대신 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. siRNA는 올리고뉴클레오타이드의 변형에 통상적으로 사용되는 방법에 의해 본 발명의 항체에 연결될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20050107325호 및 제20070213292호 참조). 따라서, 3' 또는 5'-포스포로마이다이트 형태의 siRNA는 하이드록실 작용기를 갖는 가교제의 한 말단과 반응되어, siRNA와 가교제 사이에 에스터 결합이 생성될 수 있다. 유사하게, siRNA 포스포라미다이트와 말단 아미노기를 갖는 가고제의 반응은 아민을 통해 siRNA에 대한 가교제의 결합을 발생시킨다. 대안적으로, siRNA는 티올기를 도입시키기 위해 표준 화학 방법에 의해 유도체화될 수 있다. 이러한 티올-함유 siRNA는 활성 다이설파이드 또는 말레이미드 모이어티를 도입시키기 위해 변형된 항체와 반응되어, 분해성 또는 비-분해성 컨쥬게이트가 생성될 수 있다. 1 내지 20개의 siRNA 분자가 상기 방법에 의해 항체에 연결될 수 있다.
III. 폴리뉴클레오타이드
특정 구체예에서, 본 발명은 EGFR에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 EGFR에 대한 항체를 암호화하거나 이러한 항체의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 cDNA, 유전체 DNA 및 합성 DNA를 포함하고; 이는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 분리된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
본 발명은 서열번호: 1 내지 38 및 69 내지 76으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 하기 표 7 내지 표 9에 제시된 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.
표 7: 가변 중쇄 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
표 8: 가변 경쇄 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure pct00020
표 9: 전장 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
서열번호: 39 내지 58, 77 내지 84와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 39 내지 43, 51, 54, 56, 77 내지 80 또는 82 내지 84와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 및/또는 (b) 서열번호: 44 내지 50, 52, 53, 55, 57, 58, 81과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드는 (a) 서열번호: 39 내지 43, 51, 54, 56, 77 내지 80 또는 82 내지 84의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및/또는 (b) 서열번호: 44 내지 50, 52, 53, 55, 57, 58, 81의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드(예를 들어, 세포로부터의 폴리펩타이드의 운반을 조절하기 위한 분비 서열로서 작용하는 선도 서열)의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오타이드에 동일한 해독틀로 융합된 성숙 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 선도 서열을 갖는 폴리펩타이드는 프레단백질(preprotein)이고, 이는 폴리펩타이드의 성숙 형태를 형성시키기 위해 숙주 세포에 의해 분해되는 선도 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 성숙 단백질에 추가 5' 아미노산 잔기가 더해진 프로단백질(proprotein)을 암호화할 수 있다. 프로서열(prosequence)을 갖는 성숙 단백질은 프로단백질이고, 이는 단백질의 비활성 형태이다. 프로서열이 분해된 후, 활성 성숙 단백질이 남는다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드의 정제를 가능케 하는 마커 서열에 동일한 해독틀로 융합된 성숙 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙 폴리펩타이드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 마커 서열은 포유동물 숙주(예를 들어, COS-7 세포)가 사용되는 경우 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래되는 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다.
본 발명은 추가로, 예를 들어, 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 본원의 상기 기재된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 모두에서 변경을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 발생시키나, 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 변경을 함유한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오타이드 변이체는 유전 부호의 축퇴성(degeneracy)으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화(인간 mRNA 내의 코돈을 대장균와 같은 박테리아 숙주에 의해 선호되는 코돈으로 변경)시키는 것과 같은 다양한 이유로 생성될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다.
IV. 사용 방법 및 약학적 조성물
본 발명의 EGFR-결합제(항체, 면역컨쥬게이트 및 폴리펩타이드를 포함함)는 암의 치료와 같은 치료적 치료 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 다양한 적용에서 유용하다. 특정 구체예에서, 상기 작용제는 종양 성장을 억제하고/하거나, 분화를 유도하고/하거나, 종양 부피를 감소시키고/시키거나, 종양의 종양형성능(tumorigenicity)을 감소시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다. 특정 구체예에서, EGFR-결합제 또는 항체 또는 면역컨쥬게이트 또는 폴리펩타이드는 이들이 결합하는 인간 EGFR에 길항적이지 않다.
일 양태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 및 면역컨쥬게이트는 생물학적 샘플 내의 EGFR의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플을 세포 또는 조직을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내의 EGFR의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 생물학적 샘플과 항-EGFR 항체를 접촉시키고, 항-EGFR 항체와 EGFR 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 EGFR의 증가된 발현과 관련된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 시험 세포와 항-EGFR 항체를 접촉시키고; EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의한 EGFR의 발현 수준을 결정(정량적 또는 정성적)하고; 시험 세포에 의한 EGFR의 발현 수준과 대조군 세포(예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 상기 정상 세포와 동등한 수준으로 EGFR을 발현하는 세포)에 의한 EGFR의 발현 수준을 비교하는 것을 포함하며, 여기서 대조군 세포에 비한 시험 세포에 의한 보다 높은 수준의 EGFR의 발현은 EGFR의 증가된 발현과 관련된 장애의 존재를 나타낸다. 특정 구체예에서, 시험 세포는 EGFR의 증가된 발현과 관련된 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된다. 특정 구체예에서, 장애는 세포 증식 장애, 예를 들어, 암 또는 종양이다.
특정 구체예에서, 상기 기재된 것과 같은 진단 또는 검출 방법은 세포의 표면 상에서 발현된 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 검출하거나, 세포의 표면 상에서 EGFR을 발현하는 세포로부터 수득된 막 제조물 내에서의 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 세포와 항-EGFR 항체를 접촉시키고, 복합체가 항-EGFR 항체와 세포 표면 상의 EGFR 사이에 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 세포의 표면 상에서 발현된 EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 검출하는 예시적 검정은 "FACS" 검정이다.
EGFR에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 검출하기 위해 특정한 다른 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법은 당 분야에 널리 공지된 항원-결합 검정, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사면역측정법, ELISA(효소결합면역흡착측정법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 검정, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 면역조직화학(IHC)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 항-EGFR 항체는 표지된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들어, 형광, 발색단, 전자-밀집, 화학발광, 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하나, 이들 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 항-EGFR 항체가 불용성 매트릭스 상에 고정된다. 고정은 용액 중에 자유롭게 남아있는 임의의 EGFR로부터 항-EGFR 항체를 분리시키는 것을 수반한다. 이는 통상적으로 수-불용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착(Bennich et al., 미국 특허 제3,720,760호), 또는 공유 커플링(예를 들어, 글루타르알데하이드 가교를 이용함)에 의해서와 같이 검정 절차 전에 항-EGFR 항체를 불용성화시키거나, 예를 들어, 면역침전에 의해 항-EGFR 항체와 EGFR 사이의 복합체의 형성 후에 항-EGFR 항체를 불용성화시킴으로써 달성된다.
진단 또는 검출의 상기 구체예 중 임의의 구체예가 항-EGFR 항체 대신 또는 항-EGFR 항체에 더하여 본 발명의 면역컨쥬게이트를 이용하여 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, EGFR-결합제 또는 길항제(예를 들어, 항-EGFR 항체)로 치료되는 질병은 암이다. 특정 구체예에서, 암은 EGFR-결합제(예를 들어, 항체)가 결합하는 EGFR을 발현하는 세포를 특징으로 한다.
추가 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 항-EGFR 결합제를 이를 필요로 하는 인간 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선, 피부 및 신장의 암을 포함하는 EGFR이 발현되고, 특히 EGFR이 비정상적으로 발현(예를 들어, 과발현)되는 세포 증식 장애를 치료하는 개선된 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 인간화된 항체이다. 본 발명의 항-EGFR 결합제에 의해 치료될 수 있는 세포 증식 장애의 예는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비샘(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 안구, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 가슴 부위 및 비뇨생식계에 위치된 신생물을 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다.
유사하게, 다른 세포 증식 장애가 또한 본 발명의 항-EGFR 결합제에 의해 치료될 수 있다. 상기 세포 증식 장애의 예는 부신피질 과다형성(쿠싱병), 선천 부신 과다형성, 자궁내막 과다형성, 양성 전립선 비대, 유방 과다형성, 내막 증식, 국소 상피증식(헤크병), 피지샘 증식, 보상성 간 과다형성, 및 임의의 다른 세포 증식 질병뿐만 아니라 상기 나열된 기관계에 위치된 신생물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 다른 작용제를 이용하여 종양 성장을 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구체예에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 시험관내에서 세포와 EGFR-결합제(예를 들어, 항체)를 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, EGFR을 발현하는 무한증식 세포주 또는 암세포주가 종양 성장을 억제하기 위해 항체 또는 다른 작용제가 첨가되는 배지에서 배양된다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 환자 샘플, 예를 들어, 조직 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플로부터 분리되고, 종양 성장을 억제하기 위해 EGFR-결합제가 첨가되는 배지에서 배양된다.
일부 구체예에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 생체내에서 종양 또는 종양 세포와 EGFR-결합제(예를 들어, 항체)를 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 종양 또는 종양 세포와 EGFR-결합제를 접촉시키는 것이 동물 모델에서 수행된다. 예를 들어, EGFR-결합제는 종양 성장을 억제하기 위해 면역손상 마우스(예를 들어, NOD/SCID 마우스)에서 성장된 하나 이상의 EGFR을 발현하는 이종이식편에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 암 줄기세포는 환자 샘플, 예를 들어, 조직 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플로부터 분리되고, 종양 세포 성장을 억제하기 위해 EGFR-결합제가 이후에 투여되는 면역손상 마우스에 주입된다. 일부 구체예에서, EGFR-결합제는 종양 성장을 예방하기 위해 동물로의 종양형성 세포의 도입과 동시에 또는 직후에 투여된다. 일부 구체예에서, EGFR-결합제는 종양형성 세포가 특정 크기로 성장한 후에 치료제로서 투여된다.
특정 구체예에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 피검체에 치료적 유효량의 EGFR-결합제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 피검체는 인간이다. 특정 구체예에서, 피검체는 종양을 갖거나, 종양이 제거된 적이 있는 피검체이다.
특정 구체예에서, 종양은 EGFR-결합제 또는 항체가 결합하는 EGFR을 발현한다.
또한, 본 발명은 치료적 유효량의 EGFR-결합제를 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 종양의 종양형성능을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 종양은 암 줄기세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 종양에서의 암 줄기세포의 빈도는 상기 작용제의 투여에 의해 감소된다.
본 발명은, 예를 들어, 종양형성 세포를 포함하는 종양을 갖거나 이러한 종양이 제거된 적이 있는 피검체에 EGFR-결합제를 투여함으로써 종양형성 세포와 EGFR-결합제를 접촉시키는 것을 포함하는, 종양형성 세포를 비-종양형성 세포로 분화시키는 방법을 추가로 포함한다.
종양 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 세포의 분화를 유도하기 위한 본원에 기재된 EGFR-결합제, 폴리펩타이드 또는 항체의 용도가 또한 제공된다. 예를 들어, 세포와 본원에 기재된 유효량의 EGFR-결합제(예를 들어, 항-EGFR 항체)를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 분화를 유도하는 방법이 계획된다. 치료적 유효량의 EGFR-결합제, 폴리펩타이드 또는 항체를 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 종양 내 세포를 분화시키는 방법이 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정한 다른 구체예에서, 종양은 결장 종양이다. 일부 구체예에서, 치료 방법은 치료적 유효량의 EGFR-결합제, 폴리펩타이드 또는 항체를 피검체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 EGFR-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 이러한 약학적 조성물은 인간 환자에서 종양 성장을 억제하고 암을 치료하는데 사용된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 정제된 항체 또는 작용제와 약학적으로 허용되는 비히클(예를 들어, 담체, 부형제)을 조합시킴으로써 저장 및 사용을 위한 제형이 제조된다(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 약학적으로 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 염, 예를 들어, 염화나트륨; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들어, 질내 및 직장 전달을 포함하는 점막으로의 국소 투여), 예를 들어, 경피 패치(patch), 연고, 로션, 크림, 겔, 점적액, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말; 폐(예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐 투여; 기관내, 비내, 표피 및 경피); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구; 또는 두개내(예를 들어, 수막강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 약학적 조합 제형, 또는 조합 요법으로서의 투여 요법제에서 항-암 특성을 갖는 제2의 화합물과 조합될 수 있다. 약학적 조합 제형 또는 투여 요법제의 제2의 화합물은 조합의 ADC에 대해 상보적 활성을 가질 수 있어, 이들은 서로에 대해 해로운 영향을 미치지 않는다. EGFR-결합제 및 제2의 항암제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다.
질병의 치료를 위한, 본 발명의 항체 또는 작용제의 적절한 투여량은 치료 의사의 판단에서 치료되는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 질병의 반응, 항체 또는 작용제가 치료 또는 예방 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 등 모두에 좌우된다. 항체 또는 작용제는 한번에 투여되거나, 수일 내지 수개월에 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 투여되거나, 치료가 달성되거나 질병 상태의 감소(예를 들어, 종양 크기의 감소) 때까지 투여될 수 있다. 최적 투여 스케줄은 환자의 체내의 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있고, 이는 개별적 항체 또는 작용제의 상대 역가에 따라 다양할 것이다. 투여 의사는 최적 투여량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 투여량은 체중 ㎏ 당 0.01㎍ 내지 100㎎이고, 이는 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 또는 다른 EGFR-결합제는 2주에 1회 또는 3주에 1회 제공된다. 특정 구체예에서, 항체 또는 다른 EGFR-결합제의 투여량은 체중 ㎏ 당 약 0.1㎎ 내지 약 20㎎이다. 치료 의사는 체액 또는 조직에서의 약물의 측정된 체류 시간 및 농도를 기초로 하여 투여 반복률을 판단할 수 있다.
조합 요법은 "상승작용"을 제공할 수 있고, "상승작용성", 즉, 함께 사용되는 활성 성분이 화합물을 별개로 사용하는 것으로부터 발생되는 효과의 합계보다 큰 경우에 달성되는 효과를 나타낼 수 있다. 상승작용성 효과는, 활성 성분이 (1) 조합된 단위 투여 제형으로 공동 제형화되고 투여되거나, 동시에 전달되거나; (2) 별개의 제형으로서 교대로 또는 동시에 전달되거나; (3) 일부 다른 요법에 의해 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우, 상승작용 효과는, 화합물이, 예를 들어, 별개의 주사기에서의 상이한 주사에 의해 연속적으로 투여되거나 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안, 각각의 활성 성분의 유효 투여량은 연속적, 즉, 순차적으로 투여되는 반면, 조합 요법에서, 2개 이상의 활성 성분의 유효 투여량은 함께 투여된다.
VI. EGFR 결합제를 포함하는 키트
본 발명은 본원에 기재된 항체, 면역컨쥬게이트 또는 다른 작용제를 포함하고, 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 EGFR에 대한 적어도 하나의 정제된 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 검정을 수행하기 위한 대조군, 설명서, 및 결과의 분석 및 표시를 위한 임의의 필수 소프트웨어를 모두 포함하는, 검출 검정을 수행하는데 필요하고/하거나 충분한 구성요소 모두를 함유한다. 당업자는 본 발명의 개시된 항체, 면역컨쥬게이트 또는 다른 작용제가 당 분야에 널리 공지된 확립된 키트 형태 중 하나에 용이하게 포함될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
EGFR-결합제(예를 들어, EGFR-결합 항체)뿐만 아니라 제2의 항암제를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 특정 구체예에서, 제2의 항암제는 화학요법제(예를 들어, 리툭시맙)이다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 실시예 및 구체예에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이며, 이들이 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되는 것이 이해된다.
실시예 1
뮤린 EGFR 항체의 생성
뮤린 항-EGFR 항체를 생성시키기 위해, 두경부 편평 암종 세포주, 예를 들어, CA922(Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB), Shinjuku, Japan) 및 HSC4(JCRB, 일본 신주쿠구에 소재)를 격주로 5회 마우스 당 5×106개 세포의 용량으로 Balb/c 암컷 마우스(Charles River Laboratory, 매사추세츠주의 윌밍턴시에 소재)에 피하 주사하였다. 하이브리도마 생성을 위해 희생되기 3일 전, 면역화된 마우스에 또 다른 용량의 항원을 복막내 주사하였다. 마우스로부터의 비장을 표준 동물 프로토콜에 따라 수거하고, 2개의 멸균되고 동결된 현미경 슬라이드 사이에서 연마하여, RPMI-1640 배지 중의 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 적혈구 세포를 ACK 용해 완충액으로 용해시킨 후, 비장 세포를 1 P3 세포: 3 비장 세포의 비율로 뮤린 골수종 P3X63Ag8.653 세포(P3 세포)(J. F. Kearney et al. 1979, J Immunol , 123: 1548-1550)와 혼합하였다. 비장 세포 및 P3 세포의 혼합물을 세척하고, 3분 동안 실온에서 융합 배지(0.3M 만니톨/D-솔비톨, 0.1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 및 1 ㎎/㎖ BSA) 중의 프로나제(pronase)로 처리하였다. FBS(소 태아 혈청, Invitrogen)의 첨가에 의해 반응을 중지시킨 후; 세포를 세척하고, 2㎖ 냉각 융합 배지에 재현탁시키고, BTX ECM 2001 전기융합(electrofusion) 기계(Harvard Apparatus)로 융합시켰다. 융합된 세포를 하이포크산틴-아미놉테린-티미딘(HAT)을 함유하는 RPMI-1640 선별 배지(Sigma Aldrich)에 서서히 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 200 ㎕/웰로 편평 바닥 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후, 플레이트를, 하이브리도마 클론이 항체 스크리닝에 대해 준비될 때까지 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 문헌[J. Langone and H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, "Immunochemical Techniques, Part I"; Academic Press, Florida) 및 E. Harlow and D. Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual"; 1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY)]에 기재된 기술을 포함하는 면역화 및 하이브리도마 생성의 다른 기술이 또한 사용될 수 있다.
뮤린 하이브리도마 스크리닝 및 선별
처리되지 않거나 EGF(R&D Systems)로 처리된 면역화 세포를 이용한 흐름세포측정 결합 검정을 이용하여 하이브리도마 스크리닝을 수행하였다. EGF와의 인큐베이션이 세포 표면 상의 EGFR 수준을 하향조절하므로, EGFR 특이적 하이브리도마 상층액은 처리되지 않은 세포하고만 반응할 것이고, EGF-처리된 세포와는 반응하지 않을 것이다. 스크리닝을 위한 세포를 먼저 밤새 혈청 비함유 배지에서 배양하고, 2개의 부분으로 나누었다. 세포의 한 부분을 처리되지 않은 채로 두고, 나머지 부분을 37℃에서 3시간 동안 EGF로 처리하였다. EGF 처리된 세포를 CellTrace(상표명) 원적외부 DDAO-SE(Invitrogen)로 표지하고, 1:1의 비율로 미처리된 세포와 혼합하고, 얼음 상에서 2시간 동안 하이브리도마 상층액과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 세척하고, FITC-표지된 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch)와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 포르말린으로 고정시키고, FACS칼리버(FACScalibur)(BD Bioscience)를 이용하여 분석하였다. EGFR 특이적 하이브리도마를 확장시키고, 상층액을 항원으로서 가용성 재조합 인간 EGFR 세포외 도메인(RELIATech)을 이용하여 ELISA로 재스크리닝하였다. 양성 하이브리도마를 인간 EGFR-발현 A431 표피 암종 세포주(ATCC) 및 원숭이 EGFR-발현 베로(Vero) 세포주(아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 상피세포주)(ATCC)를 이용한 흐름세포측정 결합 검정을 이용하여 재스크리닝하였다. 요컨대, 하이브리도마 상층액을 1시간 동안 얼음 상에서 A431 세포 및 DDAO-표지된 베로(Vero) 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 2회 세척하고, 얼음 상에서 1시간 동안 PE-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG 항체(Jackson Immunoresearch)와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 포르말린에서 고정시키고, FACS칼리버(FACSCalibur) 흐름세포측정기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
인간 및 원숭이 항원 둘 모두와 반응하는 양성 하이브리도마 클론을 EGFR-과발현 HCC827 세포(ATCC)의 기본 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 요컨대, 지수적으로 성장하는 HCC827 세포를 96 웰 플레이트에서 2000개의 세포/웰로 10% FBS를 함유하는 100㎕ 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 100㎕의 하이브리도마 상층액을 세포에 첨가하고, 혼합물을 5일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 증식의 수준을 비색 WST-8 검정(Dojindo Molecular Technologies, 매릴랜드주의 로크빌시에 소재)을 이용하여 결정하였다. WST-8은 살아있는 세포내에서 탈수소효소에 의해 조직 배양 배지에서 가용성인 오렌지 색의 포르마잔(formazan) 생성물로 환원되고, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다. WST-8의 최종 부피의 10%를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가 2 내지 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 스펙트라 맥스(Spectra Max M2) 플레이트 판독기(Molecular Devices, 캘리포니아주의 서니베일시에 소재)에서 450㎚에서의 흡광도(A450)를 측정함으로써 플레이트를 분석하였다. 배지 및 WST-8만 갖는 웰의 백그라운드 A450 흡광도를 모든 값으로부터 공제하였다. 각각의 처리된 샘플 값을 미처리된 세포를 갖는 웰의 평균값으로 나누어 생존 분획(생존 분획 = (A450 처리된 샘플 - A450 백그라운드)/(A450 미처리된 샘플 - A450 백그라운드))을 계산하였다. 생존 분획 0이 세포가 없는 웰의 값을 나타내고, 1이 임의의 EGFR 항체가 없는 혈청 함유 배지에서의 세포 증식의 수준을 나타내도록 결과를 표준화시켰다. 적어도 50%의 HCC827 세포 성장을 억제한 하이브리도마 클론을 한계희석에 의해 서브클로닝시켰다. 흐름세포측정법에 의해 모 세포와 동일한 EGFR에 대한 반응성을 나타낸 각 하이브리도마로부터의 하나의 서브클론을 이후의 분석을 위해 선택하였다. 안정적 서브클론을 배양하고, 항체를 시판되는 아이소타이핑(isotyping) 시약(Roche)을 이용하여 아이소타이핑하였다.
항체 정제
항체를 표준 방법, 예를 들어, 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(HiTrap Protein A 또는 G HP, 1㎖, Amersham Biosciences)를 이용하여 하이브리도마 서브클론 상층액으로부터 정제하였다. 간단히, 1/10 부피의 1M Tris/HCl 완충액, pH 8.0의 첨가에 의해 크로마토그래피를 위한 상층액을 제조하였다. pH-조정된 상층액을 0.22 ㎛ 필터 막을 통해 여과시키고, 결합 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화된 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 280㎚에서 흡광도가 없는 안정적 기준선이 수득될 때까지 결합 완충액으로 세척하였다. 항체를 0.5㎖/분의 유속을 이용하여 0.15M NaCl, pH 2.8을 함유하는 0.1M 아세트산 완충액으로 용리시켰다. 약 0.25㎖의 분획을 수거하고, 1/10 부피의 1M Tris/HCl, pH 8.0의 첨가에 의해 중화시켰다. 피크 분획(들)을 1×PBS에 대해 밤새 2회 투석시키고, 0.2㎛ 필터 막을 통한 여과에 의해 살균시켰다. 정제된 항체를 A280에서의 흡광도에 의해 정량하였다.
단백질 A 정제된 분획을 뮤린 항체에 대한 4차 암모늄(Q) 크로마토그래피와 함께 이온 교환 크로마토그래피(IEX)를 이용하여 추가로 폴리싱(polishing)시켰다. 간단히, 단백질 A 정제로부터의 샘플을 결합 완충액(10mM Tris, 10mM 염화나트륨, pH 8.0)으로 완충액 교환시키고, 0.22㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 이후, 제조된 샘플을 120㎝/hr의 유속으로 결합 완충액으로 평형화된 Q 패스트 플로우 레진(fast flow resin)(GE Lifesciences)에 로딩하였다. 샘플 내의 모든 MAb에 결합하기에 충분한 능력을 갖는 칼럼 크기를 선택하였다. 이후, 칼럼을 280㎚에서 흡광도가 없는 안정적 기준선이 수득될 때까지 결합 완충액으로 세척하였다. 항체를 20 칼럼 부피(CV)로 10mM 내지 500mM의 염화나트륨 구배를 개시시켜 용리시켰다. 피크 분획을 280㎚에서의 흡광도 측정(A280)을 기초로 하여 수거하였다. 단량체의 백분율을 아질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템(Agilent, 캘리포니아주의 산타클라라시에 소재)을 이용하여 SWXL 가드 칼럼, 6.0×40㎜를 지닌 TSK 겔 G3000SWXL, 7.8×300㎜(Tosoh Bioscience, 팬실베니아주의 몽고메리빌시에 소재) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가하였다. 95%를 초과하는 단량체 함량을 갖는 분획을 푸울링시키고, TFF 시스템을 이용하여 PBS(pH 7.4)로 완충액 교환하고, 0.2㎛ 필터 막을 통한 여과에 의해 살균시켰다. 정제된 항체의 IgG 농도를 1.47의 흡광계수를 이용한 A280에 의해 결정하였다. 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT)와 같은 대안적 방법을 또한 우수한 선별성을 갖는 항체를 폴리싱시키는데 사용하였다. 40 ㎛ 입자 크기를 갖는 Type II CHT 수지(Bio-Rad Laboratories)를 IEX 크로마토그래피에 대해 기재된 것과 유사한 프로토콜과 함께 사용하였다. CHT에 대한 결합 완충액은 20mM 인산나트륨, pH 7.0에 해당하며, 항체를 20 CV 상에서 20-160mM 인산나트륨의 구배로 용리시켰다.
실시예 2
인간 및 원숭이 EGFR 항원에 대한 결합 친화성
인간 및 원숭이 항원에 대한 EGFR 항체의 결합 친화성을 결정하기 위해, EGFR 발현 인간 종양 세포주, 예를 들어, MDA-MB468(ATCC) 및 A431(ATCC), 및 베로(Vero) 원숭이 신장 세포주(ATCC)를 흐름세포측정 결합 검정에서 사용하였다. 요컨대, 세포를 4℃에서 1시간 동안 다양한 농도의 EGFR 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 PE-컨쥬게이션된 2차 항체(Jackson Immunoresearch)와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 세척하고, 포르말린에서 고정시키고, FACSarray(BD Bioscience)로 분석하였다. 이러한 항체의 결합 친화성을 결정하기 위해, 기하 평균 형광 강도를 반-로그 플롯(semi-log plot)으로 항체 농도에 대해 플로팅하였다. 용량-반응 곡선을 비-선형 회귀에 의해 생성시키고, 각각의 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 해당하는 곡선의 EC50 값을 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) v4(GraphPad 소프트웨어)를 이용하여 계산하였다. 본 발명의 EGFR 항체뿐만 아니라 양성 대조군 항체, 세툭시맙 및 파니투무맙은 인간 종양 세포 및 원숭이 베로(Vero) 세포 둘 모두에 대해 강한 특이적 결합을 나타내었다. 도 1에 제시된 표에는 인간 및 원숭이 EGFR에 대한 각각의 항체의 Kd가 나열되어 있다. 본 발명의 EGFR 항체는 인간 및 원숭이 항체 둘 모두에 대해 유사하게 강한 결합 친화성을 나타내었다.
실시예 3
리간드 -유도성 EGFR 활성화의 억제
EGFR 리간드 결합은 EGFR 인산화 후 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 유도한다. 리간드-유도성 EGFR 활성화에서의 항-EGFR 항체의 효과를 연구하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 MDA-MB468 종양 세포주 및 인간 일차 성인 각질세포를 이용하여 수행하였다. 요컨대, 세포를 6 웰 플레이트에서 1e6 세포/웰로 시딩하고, 밤새 일반 배지에서 배양하였다. 세포를 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 0.1% BSA를 함유하는 혈청 비함유 배지에서 스타빙(starving)시켰다. 10 ㎍/㎖의 항체를 세포에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 50 ng/㎖ EGF(R&D Systems)를 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 얼음-냉각된 PBS로 세척하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액 중에서 용해시켰다. 단백질 용해질을 SDS-PAGE에서 분리시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% BSA로 차단시키고, 4℃에서 밤새 동안 항-포스포티로신 항체(clone 4G10, Millipore)와 함께 인큐베이션하였다. 막을 세척하고, 실온에서 1시간 동안 HRP 컨쥬게이션된 항-마우스 항체(Jackson Immunoresearch)와 함께 인큐베이션시키고, 다시 세척하였다. 신호를 ECL(향상된 화학발광) 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 검출하였다. 각각의 레인으로 로딩되는 단백질의 동일량을 보장하기 위해, 막을 벗겨내고, 항-β-튜불린 항체(Sigma Aldrich)로 재프로빙(reprobing)하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, EGF 자극은 MDA-MB468 세포 및 인간 일차 각질세포 둘 모두에서 강한 EGFR 인산화를 발생시켰다. 세툭시맙 및 파니투무맙을 이용한 세포의 처리는 EGF-유도성 EGFR 인산화를 강하게 억제한 반면, 본 발명의 EGFR 항체는 EGFR 활성화를 완전히 억제하지 않았다. 항-KTI(쿤니츠(Kunitz) 트립신 억제제) 항체(ATCC로부터 수득된 하이브리도마로부터 생성됨)를 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 4
EGFR 항체의 효능 활성
EGFR 리간드의 부재하에서 EGFR 신호전달에 대한 본 발명의 EGFR 항체의 효과를 연구하기 위해, MDA-MB468 종양 세포를 실시예 5에 기재되는 바와 같이 혈청 비함유 배지에서 스타빙시켰다. 이후, 세포를 37℃에서 3시간 동안 10 ㎍/㎖ EGFR 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서, 미처리 세포를 37℃에서 15분 동안 50 ng/㎖ EGF와 함께 인큐베이션시켰다. 단백질 용해질을 제조하고, 실시예 5에 기재되는 바와 같이 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 대표적 결과가 도 3에 도시된다. EGF 처리는 MDA-MB468 세포에서 강한 EGFR 인산화를 명백히 유도한 반면, 본 발명의 EGFR 항체는 리간드의 부재하에서 EGFR 신호전달에 영향을 미치지 않았다.
실시예 5
리간드 결합 경쟁
EGFR 신호전달 억제의 한 메커니즘은 리간드 결합의 봉쇄이다. EGFR 항체가 EGFR에 대한 리간드 결합을 억제하는지 시험하기 위해, A431 세포에 대한 바이오티닐화된 EGFR 리간드의 결합을 항-EGFR 항체의 존재 하에서 흐름세포측정법에 의해 측정하였다. TGFα의 바이오티닐화를 제조업체의 설명서에 따라 EZ-링크 마이크로 설포-NHS-LC-바이오티닐화 키트(Pierce, 일리노이주의 록크랜드시에 소재)를 이용하여 수행하였다. 바이오티닐화된 EGF를 인비트로겐사(Invitrogen)로부터 수득하였다. 경쟁 검정 전, 바이오티닐화된 리간드의 결합 곡선을 확립하였다. 다양한 농도의 항-EGFR 항체를 EC50 농도(EGF 및 TGFa 각각에 대해 1.8nM 및 10nM)로 바이오티닐화된 리간드와 예비-혼합시키고, 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 얼음 상에서 15분 동안 스트렙타비딘-APC 컨쥬게이트(Jackson Immunoresearch)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, FlowJo 프로그램(Tree Star)을 이용하여 FACS 칼리버(BD Bioscience)에서 분석하였다. 기하 평균 형광 강도를 반-로그 플롯으로 항체 농도에 대해 플로팅하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 음성 대조군 항체 항-KTI 항체는 리간드 결합에 영향을 미치지 않은 반면, 모든 항-EGFR 항체는 하기 EC50(표 10)으로 리간드 결합과 경쟁한다.
표 10
Figure pct00025
본 발명의 EGFR 항체는 세툭시맙과 유사한 EC50으로 TGFa 및 EGF 결합을 완전히 차단하였다(도 4 및 표 10). 이러한 결과는 리간드 유도성 EGFR 신호전달(실시예 3) 및 인간 일차 각질세포를 포함하는 정상 상피세포주의 성장(실시예 6)에 대한 세툭시맙 및 본 발명의 EGFR 항체의 차별적 효과를 설명할 수 없다.
실시예 6
인간 일차 각질세포 및 정상 상피세포주의 성장 억제 검정
피부, 위장관 및 다른 기관에서의 인간 정상 기저 상피세포는 EGFR을 생리학적으로 발현한다. 상기 조직에서의 EGFR 신호전달은 상피세포 성장에 중요하다. 세툭시맙 및 파니투무맙뿐만 아니라 작은 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 에를로티니브 및 게피티니브에 의한 EGFR 신호전달 경로의 붕괴는 유의한 피부 독성을 야기시킨다. 피부 및 다른 상피세포에서의 잠재적 독성을 모방하기 위해, 인간 일차 각질세포(Invitrogen) 및 비-종양형성 유방 상피세포주, MCF10A(ATCC)를 이용한 증식 검정을 확립시켰다. 이러한 검정에서, 세포를 제조업체에 의해 제안되는 EGFR 리간드 함유 배지에 웰당 1,500-2,000개의 세포로 플레이팅하고, 5일 동안 37℃에서 항-EGFR 항체와 함께 인큐베이션하였다. 각질세포 검정(도 5)에서, 세포를 다양한 농도의 항체와 함께 1nM EGF의 존재 하에서 성장시켰다. MCF10A 세포 검정(도 6)에서, 세포를 고정된 농도(10 ㎍/㎖)의 항체와 함께 10nM EGF의 존재 하에서 성장시켰다. 세포 증식의 수준을 실시예 1에 기재된 바와 같이 비색 WST-8 검정(Dojindo Molecular Technologies, 매릴랜드주의 로크빌시에 소재)을 이용하여 결정하였다. 각각의 처리된 샘플 값을 미처리된 세포를 갖는 웰의 평균값으로 나누어 생존 분획(생존 분획 = (A450 처리된 샘플 - A450 백그라운드)/(A450 미처리된 샘플 - A450 백그라운드))을 계산하였다. 0이 EGF의 부재하에서의 세포 증식의 수준을 나타내고, 1이 임의의 항-EGFR 항체 처리 없이 EGF의 존재 하에서의 세포 증식의 수준을 나타내도록 결과를 표준화시켰다.
인간 일차 각질세포뿐만 아니라 MCF10A 세포에 대한 항-EGFR 항체의 결합을 증식 검정을 수행하기 전에 확인하였다. 각질세포 증식 검정의 대표적 결과는 도 5에 도시되어 있다. 독성 프로파일로부터 예상되는 바와 같이, 세툭시맙 및 파니투무맙은 용량 의존 방식으로 각질세포 증식을 강하게 억제하였으며, 최대 억제는 세툭시맙에 대해 40%였고, 파니투무맙에 대해 78%였다. 놀랍게도, 음성 대조군 키메라 KTI 항체와 유사하게 본 발명의 EGFR 항체는 각질세포에 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 MCF10A 증식 검정에서 확인되었다(도 6). 세툭시맙 및 파니투무맙은 MCF10A 세포 증식을 강하게 억제한 반면, 본 발명의 EGFR 항체는 MCF10A 세포 성장에 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않았다. 이러한 데이터는 본 발명의 EGFR 항체가 EGFR을 발현하는 정상 상피세포에 대해 세툭시맙 및 파니투무맙보다 덜 독성인 것을 암시한다.
실시예 7
HCC827 및 NCI - H292 세포주의 기본 증식의 억제
종양 세포의 기본 증식을 억제하는데 있어서의 항-EGFR 항체의 능력을 결정하기 위해, EGFR-발현 HCC827(ATCC) 및 NCI-H292(ATCC) 폐 종양 세포주를 이용한 증식 검정을 확립시켰다. 세포를 10% FBS를 함유하는 일반 성장 배지에서 웰 당 2,000개의 세포로 플레이팅하고, 다양한 농도의 항-EGFR 항체의 존재 하에서 5일 동안 37℃에서 성장시켰다. 세포 증식의 수준을 비색 WST-8 검정을 이용하여 결정하였다. 생존 분획 1이 항-EGFR 항체를 갖지 않는 일반 성장 배지에서 성장한 세포를 나타내고, 0이 세포가 없는 웰의 값을 나타내도록 OD 결과를 표준화시켰다.
도 7A 및 7B는 HCC827 및 NCI-H292 세포를 이용한 대표적 증식 검정 결과를 각각 도시한다. HCC827 세포주(도 7A)에서, 세툭시맙은 용량 의존 방식으로 종양 세포 성장을 강하게 억제하였다. EGFR 발현 정상 상피세포에 대해 무해함에도 불구하고, 본 발명의 항-EGFR 항체는 세툭시맙과 유사하거나 더 나은 억제 활성을 나타내었다. 표 11은 각각의 항체의 EC50 및 최대 억제 %를 기재한다.
표 11. HCC827 세포에서의 항-EGFR 항체의 항-증식 활성
Figure pct00026
NCI-H292 세포주(도 7B)에서, 세툭시맙 및 파니투무맙은 용량 의존 방식으로 기본 세포 증식을 강하게 억제하였다. 본 발명의 EGFR 항체가 또한 상기 세포주에서 유의하게 활성이었고, 최대 증식 억제는 세툭시맙 및 파니투무맙과 유사하였다. 표 12는 각각의 항체의 EC50 및 최대 억제 %를 기재한다.
표 12. NCI-H292 세포에서의 항-EGFR 항체의 항-증식 활성
Figure pct00027
상기 데이터는 본 발명의 EGFR 항체가 EGFR 과발현 세포에서 세툭시맙 및 파니투무맙만큼 활성이면서, 이들이 정상 상피세포 성장에는 영향을 미치지 않는 것을 강하게 입증한다.
실시예 8
항- EGFR 항체 결합 경쟁
항-EGFR 항체의 결합 에피토프를 구별하기 위해, 흐름세포측정법을 이용하여 항체 결합 경쟁 검정을 수행하였다. 이러한 실험에서, MDA-MB468 세포에 대한 0.3nM의 바이오티닐화된 528(도 8A), 0.2nM의 바이오티닐화된 세툭시맙(도 8B) 및 0.2nM의 바이오티닐화된 EGFR-7 항체(도 8C)의 결합을 다양한 농도의 '경쟁' 항체의 존재 하에서 측정하였다. 요컨대, 바이오티닐화된 항체를 다양한 농도의 '경쟁' 항체와 예비-혼합시켰다. 이후, 항체 혼합물을 2시간 동안 얼음 상에서 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 1시간 동안 얼음 상에서 스트렙타비딘-알렉사(alexa) 488 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 고정시키고, FACS칼리버로 분석하였다. 기하 평균 형광 강도를 반-로그 플롯으로 항체 농도에 대해 플로팅하고, 100%가 다른 항체의 부재하에서의 바이오티닐화된 항체의 최대 결합을 나타내고, 0%가 바이오티닐화된 항체의 부재하에서의 백그라운드 염색을 나타내도록 표준화시켰다. 도 8에 도시된 바와 같이, 모든 EGFR 항체는 서로 경쟁한다. 세툭시맙 및 파니투무맙은 네이키드(naked) 528 항체만큼 강하게 528 항체 결합과 경쟁한 반면, 본 발명의 EGFR 항체는 528 항체와 경쟁하는 능력이 약간 덜하였다(도 8A). 모든 EGFR 항체는 유사한 방식으로 세툭시맙 및 EGFR-7 바이오티닐화된 항체의 결합과 경쟁하였다(도 8B 및 8C).
실시예 9
EGFR 항체의 VL 및 VH 영역의 클로닝 및 서열분석
전체 세포 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트(QIAgen)를 이용하여 5×106개 세포의 EGFR 하이브리도마로부터 제조하였다. 이후, cDNA를 Superscript II cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용하여 전체 RNA로부터 합성하였다.
하이브리도마 세포로부터 유래된 cDNA에 대한 첫번째 라운드의 축퇴성 PCR 반응에 대한 절차는 문헌[Wang et al. ((2000) J Immunol Methods . 233: 167-77) 및 Co et al. ((1992) J Immunol . 148:1149-54)]에 기재된 방법을 기초로 하였다. VH 서열을 축퇴성 프라이머: EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(서열번호: 59), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(서열번호: 60) 및 BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(서열번호: 61)을 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. VL 서열을 축퇴성 프라이머: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(서열번호: 62) 및 HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(서열번호: 85)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다(혼합된 염기는 N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T와 같이 정의된다). 이후, PCR 반응 혼합물을 1% 저 용해 아가로스 겔 상에서 영동시키고, 300 내지 400 bp 밴드를 절제하고, 지모 DNA 미니(Zymo DNA mini) 칼럼을 이용하여 정제하고, 서열분석을 위해 아젠코트 바이오사이언시스(Agencourt Biosciences)에 보냈다. 각각의 5' 및 3' PCR 프라이머를 서열분석 프라이머로 사용하여, 둘 모두의 방향으로부터 가변 영역 cDNA를 발생시켰다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이 DNA 서열분석 결과로부터 예측되었다.
VL 및 VH cDNA 서열을 클로닝하기 위해 사용되는 축퇴성 프라이머는 5' 말단 서열을 변경시키므로, 완전한 서열을 확인하기 위해 추가 서열분석 노력이 필요하였다. 항체 서열이 유래되는 뮤린 점라인(germline) 서열에 대해 NCBI IgBlast 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에서 조사하기 위해 예비 cDNA 서열을 사용하였다. 이후, 뮤린 항체의 점라인 연결된 선도 서열로 어닐링되도록 PCR 프라이머를 설계하여, 이러한 새로운 PCR 반응이 PCR 프라이머에 의해 변경되지 않은 완전한 가변 영역 cDNA 서열을 생성하도록 하였다. PCR 반응, 밴드 정제 및 서열분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
서열 확인을 위한 질량 결정
가변 영역에 대한 cDNA 서열 정보를 점라인 불변 영역 서열과 조합하여 전장의 항체 cDNA 서열을 수득하였다. 이후, 중쇄 및 경쇄의 분자량을 계산하고, 뮤린 EGFR 항체의 LC/MS 분석에 의해 수득된 분자량과 비교하였다. 분자량 측정치는 EGFR-7 및 EGFR-12 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 대한 cDNA 서열과 일치한다.
EGFR -7 변이체에 대한 복합 CDR 서열
다수의 뮤린 항-EGFR 하이브리도마를 서열분석하였고, EGFR-7과 거의 동일하나, 특히 중쇄 CDR2에서 일부 CDR 아미노산 치환을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체를 발현하는 것을 발견하였다(도 9). 뮤린 EGFR-7의 상기 CDR 변이체가 기능적으로 동일한 것으로 밝혀졌으므로, 이들은 EGFR-7 CDR의 서열 유연성에 대한 일부 구조적 통찰을 제공한다. 경쇄 CDR2 및 3뿐만 아니라 중쇄 CDR1은 변이체 각각에서 동일한 반면, 경쇄 CDR1 및 중쇄 CDR3에서 낮은 빈도로 단일 잔기 치환이 발견되었다. 명백히 엄격한 서열 보존성을 갖는 CDR과 반대로, EGFR-7의 변이체는 중쇄 CDR2에서 4개의 아미노산만큼 많은 치환을 종종 함유하였다. 이러한 EGFR-7의 서열 변이체는 5개의 엄격히 보존된 CDR이 EGFR 결합을 위한 구조적 기초를 제공할 수 있는 반면, 중쇄 CDR2는 친화성 성숙 동안 체세포 성숙 핫스팟(hotspot)을 발생시키는 일부 서열 유연성을 갖는 것을 암시한다. 표 4는 인간화를 위한 상기 기재된 CDR 변이체와 함께 EGFR-7 변이체를 기초로 한 복합 CDR 서열 목록을 제공한다. 상기 복합 CDR로부터 유래된 인간화된 항체는 EGFR-7의 기능적 특성을 보존할 것이 예상된다.
표 13
Figure pct00028
실시예 10
항체 인간화
EGFR-7 및 EGFR-12 항체를, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]에서와 같이 기존에 기재된 재표면화 방법에 따라 인간화시켰다. 재표면화는 일반적으로 경쇄 및 중쇄 둘 모두에서의 가변 영역 프레임워크 표면 잔기의 확인 및 이들의 인간 동등물로의 대체를 수반한다. 뮤린 CDR은 재표면화된 항체에서 보존된다. EGFR-7 및 EGFR-12 항체의 예시적 CDR이 표 13에 나타낸 바와 같이 규정된다. CDR 내에 속하는 컨쥬게이션되는 리신의 영향에 관한 우려를 최소화시키기 위해, 뮤린 EGFR-7 항체 경쇄 CDR1 내의 리신 24를 인간화된 형태 1.0(이탤릭체로 표시됨)에 대한 아르기닌으로 대체하여, LC CDR1의 둘 모두의 형태가 제공된다. 유사하게, 뮤린 EGFR-12 항체 경쇄 CDR1 내의 리신 27 및 리신 31을 인간화된 형태 1.0(이탤릭체로 표시됨)에 대한 글루타민 및 아르기닌으로 각각 대체하였다. 리신 27을 아르기닌 대신 글루타민으로 대체하였는데, 이는 글루타민이 상기 위치에서 인간 점라인 서열에서 보존되기 때문이다. 재표면화에 이용되는 AbM 중쇄 CDR2 규정에 더하여, 표는 EGFR-7 및 EGFR-12 항체의 뮤린 및 인간 형태 둘 모두에 대한 예시적인 케이뱃 규정 중쇄 CDR2를 제공한다. 밑줄친 서열은 재표면화를 위한 CDR로 간주되지 않은 케이뱃 중쇄 CDR2의 부분을 표시한다.
표면 잔기 위치는 30% 또는 그 초과의 상대 접근성(relative accessibility)을 갖는 임의의 위치로 규정되었다(Pedersen J.T. et. Al, J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). 이후, 계산된 표면 잔기를 인간 점라인 표면 서열과 정렬시켜 대부분의 상동성 인간 표면 서열을 확인하였다. EGFR-7 항체의 경쇄 가변 도메인에 대한 대체 표면으로 사용된 인간 점라인 서열은 IGKV1-12*01인 반면, EGFR-12 항체 VL에 대한 대표 표면으로서 IGKV1-16*01을 사용하였다. EGFR-7 및 EGFR-12 항체의 중쇄 가변 도메인에 대한 대체 표면으로 사용된 인간 점라인 서열은 각각 IGHV1-69*02 및 IGHV1-69*08이었다. EGFR-7 및 EGFR-12 항체에 대한 특이적 프레임워크 표면 잔기 변화는 각각 도 10 및 11에 제공된다. 둘 모두의 항체의 재표면화된 경쇄는 바람직한 형태에 대한 CDR1 리신 치환(들)을 포함하므로, CDR-L1 내에 보존된 뮤린 리신(들)을 갖는 재표면화된 형태(v1.01)가 또한 생성되었다. 최종적으로, 뮤린 EGFR-7 및 이의 변이체에 대한 중쇄 프레임워크 2는 쌍을 이루지 않는 시스테인 잔기를 발생시키는 체세포 W47C 돌연변이를 함유하였다. 이러한 이유로, EGFR-7 중쇄 W47 점라인 복귀돌연변이주 형태(v1.11)를 또한 시험하였다. 도 12는 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 EGFR-7 및 EGFR-12 항체 가변 도메인에 대한 재표면화된 서열과 이들의 뮤린 대응물의 정렬을 도시한다.
표 14
Figure pct00029
가변 도메인 재표면화에 의한 인간화에 더하여, EGFR-7 항체를 또한, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321: 604-608 (1986) 및 Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]에 기재된 상보성 결정 영역(CDR) 이식 기술에 따라 인간화시켰다. CDR 이식 방법은 자연 진화된 뮤린 항체로부터 인간 항체의 Fv 프레임워크 영역(FR)으로의 CDR의 이식으로 구성된다. 상기 과정의 주요 단계는 적절한 인간 수용체 프레임워크를 선택하는 것이었다. EGFR-7 항체의 CDR 이식을 위해 케이뱃 넘버링 계획 및 케이뱃 CDR 규정을 이용하였다. CDR 이식을 위한 EGFR-7 항체의 예시적 CDR은 표 15에 표시된 바와 같이 규정된다. 뮤린 EGFR-7 항체와 가장 높은 상동성을 갖는 인간 면역글로불린 점라인 서열을 문헌[Lefranc, Nucleic Acids Res. 29: 207-209 (2001)]에 기재된 바와 같이 인터내셔널 임뮤노제네틱스 정보 시스템(International ImMunoGeneTics information system)(등록상표)(IMGT (http://imgt.cines.fr/)의 상호작용 툴 V-QUEST를 통해 확인하였다. EGFR-7 항체의 VL 및 VH 도메인에 대한 수용체 프레임워크로 사용된 인간 점라인 서열은 각각 IGKV1-33*01 및 IGHV1-46*03이었다. CDR 내에 속하는 컨쥬게이션되는 리신의 영향에 관한 우려를 최소화시키기 위해, 뮤린 EGFR-7 항체 경쇄 CDR1의 리신 24를 CDR 이식에서 아르기닌으로 대체하였다(표 6). EGFR-7 항체의 CDR-이식에서 특이적 프레임워크 잔기 변화뿐만 아니라 CDR-L1 내의 치환이 도 13에 제공되며, EGFR-7 항체 가변 도메인에 대한 CDR-이식된 서열과 이의 뮤린 대응물의 정렬이 도 14에 예시된다.
표 15
Figure pct00030
인간화된 EGFR 항체의 재조합 발현
huEGFR-7 및 huEGFR-12에 대한 가변 영역 서열을 블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology)로 코돈-최적화시키고, 합성하였다. 상기 서열을 단쇄 포유동물 발현 플라스미드 내의 각각의 불변 서열과 함께 인-프레임(in-frame)으로 클로닝을 위한 제한 효소 부위 측면에 위치시켰다. 경쇄 가변 영역을 pAbKZeo 플라스미드 내의 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝시켰다. 중쇄 가변 영역을 pAbG1Neo 플라스미드 내의 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝시켰다. 이러한 플라스미드를 일시적 또는 안정적 포유동물 세포 트랜스펙션으로 재조합 항체를 발현시키는데 사용하였다. HEK 293T 세포에서 재조합 항체를 발현시키기 위한 일시적 트랜스펙션을 변형된 PEI 절차(Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res . 30:E9 (2002))를 이용하여 수행하였다. 상층액을 뮤린 항체에 대해 상기 기재된 바와 같은 표준 절차를 이용하여 단백질 A 및 폴리싱(polishing) 크로마토그래피 단계로 정제하였다.
실시예 11
뮤린 및 인간화된 항- EGFR 항체 사이의 결합 경쟁
인간화된 항-EGFR 항체의 결합을 시험하기 위해, 항체 경쟁 검정을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. muEGFR-6 및 muEGFR-7 항체는 서로 교차-경쟁하므로(도 8C), 본 실험은 MDA-MB468 세포에 대한 바이오티닐화된 muEGFR-7 항체의 결합과 경쟁하는 EGFR-6(도 15A) 또는 EGFR-7(도 15B)의 뮤린 또는 인간화된 항체의 능력을 시험한다. 요컨대, 1nM의 바이오티닐화된 muEGFR-7 항체를 다양한 농도의 '경쟁' 항체와 예비-혼합하였다. 이후, 항체 혼합물을 1시간 동안 얼음 상에서 표적 세포와 인큐베이션시키고, 세척하고, 또 다른 시간 동안 얼음 상에서 스트렙타비딘-APC 컨쥬게이트와 인큐베이션시키고, 세척하고, 고정시키고, 흐름세포측정기를 이용하여 분석하였다. 기하 평균 형광 강도를 반-로그 플롯으로 항체 농도에 대해 플로팅하고, 100%가 다른 항체의 부재하에서의 바이오티닐화된 항체의 최대 결합을 나타내고, 0%가 바이오티닐화된 항체의 부재하에서의 백그라운드 염색을 나타내도록 표준화시켰다. 도 15A에 도시된 바와 같이, muEGFR-6 및 huEGFR-6 항체 둘 모두는 유사한 EC50(muEGFR-6에 대해 8.13nM 및 huEGFR-6에 대해 11.09nM)으로 muEGFR7의 결합과 경쟁한다. 도 15B는 muEGFR-7, hu-EGFR-7 및 huEGFR-7R 항체가 또한 유사한 EC50(muEGFR7에 대해 3.54nM, huEGFR-7R에 대해 3.35nM 및 huEGFR-7에 대해 4.12nM)으로 muEGFR-7 항체 결합과 경쟁하는 것을 도시한다. 이러한 결과는 인간화가 본 발명의 항체의 결합에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다.
인간화된 항- EGFR 항체의 항-종양 활성
본 발명의 인간화된 항체의 항-종양 활성을 시험하기 위해, H292 종양 세포 성장 억제 검정을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, EGFR-6 및 EGFR-7의 뮤린 및 인간화 항체는 표 16에 포함된 EC50으로 H292 종양 세포 성장을 억제하는데 효능이 있었다. 모든 인간화된 항체가 뮤린 대응물의 항-종양 활성을 유지하고, 인간화가 상기 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 것이 명백하다.
표 16. NCI-H292 세포에서의 항-EGFR 항체의 항-증식 활성
Figure pct00031
실시예 12
huEGFR 항체의 항체-의존성-세포-세포독성( ADCC ) 활성
효과기 세포로서 새로이 분리된 인간 자연살세포(NK)를 이용하여 종양 세포주의 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 측정하기 위해 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 검정을 이용하였다(Shields RL, J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604). NK 세포를 먼저 NK 세포 Isolation Kit II(#130-091-152; Miltenyi Biotec, 캘리포니아주의 오번시에 소재)에 대한 변형된 프로토콜을 이용하여 정상 공여체로부터의 인간 말초 혈액(Research Blood Components, Inc., 매사추세츠주의 브라이톤시에 소재)으로부터 분리시켰다. 말초 혈액을 1× PBS로 2배 희석시켰다. 25㎖의 희석 혈액을 50㎖ 코니컬 튜브(conical tube) 내의 25㎖의 Ficoll Paque 상에 조심스럽게 층화시키고, 실온에서 45분 동안 400g에서 원심분리시켰다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 접촉면으로부터 수거하고, 새로운 코니컬 50㎖ 튜브로 옮기고, 1× PBS로 1회 세척하였다. PBMC를 계수하고, MACS 완충액(1× PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)과 함께 2.5×107개의 세포/100㎕의 농도로 재현탁시킨 후, 1/4× 부피의 NK 세포 비오틴-항체 칵테일을 세포 현탁액에 첨가하였다. NK 세포 비오틴-항체 칵테일은 NK 세포를 제외하고는 림프구에 결합하는 바이오티닐화된 항체를 함유하여, NK 세포의 음성 선별을 발생시킨다. 혼합물을 10분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, 3/5× 부피의 MACS 완충액 및 바이오티닐화된 항체에 결합하는 2/5× 부피의 NK 세포 마이크로비드(MicroBead) 칵테일을 첨가하였다. 세포-항체 혼합물을 4℃에서 또 다른 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 50㎖의 MACS 완충액으로 1회 세척하고, 3㎖의 MACS 완충액에 재현탁시켰다. NK 세포를 autoMACS 분리기(Miltenyi Biotec)를 이용하여 음성 분획으로 분리시켰다. 생성된 NK 세포를 밤새 30㎖의 완전 RPMI 배지(5% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1mM HEPES, 1mM 피루브산나트륨, 1% 100X MEM 비-필수 아미노산 용액이 보충된 RPMI-1640)에 플레이팅하였다. 이후의 검정 및 모든 희석을 RHBP 배지(20mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수행하였다.
RHBP 배지 중의 다양한 농도의 항체를 50 ㎕/웰로 이중으로 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 분취하였다. 표적 세포(본 실험에서, A431 세포주)를 RHBP 배지에 106개의 세포/㎖로 재현탁시키고, 항체 희석액을 함유하는 각각의 웰에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 표적 세포 및 항체 희석액을 함유하는 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, NK 세포를 50 ㎕/웰로 표적 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 통상적인 비율은 1 표적 세포 대 3-4 NK 세포이다. 하기 대조군을 각 실험에 대해 설정하였다: NK 세포 단독, 표적 세포 단독(자발적 LDH 방출), NK 세포를 갖는 표적 세포(항체 독립적 LDH 방출), 10% 트리톤(Triton) X-100을 갖는 표적 세포(최대 LDH 방출). 혼합물을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 세포 용해시켰다. 플레이트를 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, 100㎕의 상층액을 새로운 편평-바닥 96-웰 플레이트에 조심스럽게 옮겼다. 세포독성 검출 키트(Roche 1 644 793)로부터의 LDH 반응 혼합물(100 ㎕/웰)을 각각의 웰에 첨가하고, 5 내지 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플의 광학 밀도(OD)를 490㎚(OD490)에서 측정하였다. 각각의 샘플의 특이적 용해 퍼센트를 다음과 같은 식을 이용하여 결정하였다: 특이적 용해 퍼센트 = (샘플 값-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)*100.
도 17은 chKTI 항체의 ADCC 활성과 비교한 huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체의 대표적 ADCC 활성을 도시한다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체는 용량 의존 방식으로 표적 세포의 NK 세포 매개 사멸을 유도하였고, 최대 특이적 사멸은 약 20%에 도달하였고, huEGFR6 및 huEGFR-7R 각각에 대해 EC50은 22 ng/㎖ 및 17 ng/㎖였다. 대조적으로, 표적 세포에 결합하지 않은 chKTI 항체는 ADCC를 매개하는데 실패하였다.
실시예 13
huEGFR -7R- SMCC - DM1 의 제조
(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) 링커를 다이메틸아세트아미드(DMA)에 용해시켰다. huEGFR 항체를 10 몰과량의 SMCC를 갖는 50mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 6.5 중 5 ㎎/㎖로 항체를 인큐베이션함으로써 항체로 말레이미드를 도입시키기 위해 SMCC로 변형시켰다. 주위 온도에서 약 100분 후, 반응 혼합물을 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 세파덱스(SEPHADEX)(상표명) G25 칼럼을 이용하여 정제하였다. 항체를 함유하는 분획을 푸울링시키고, 이후 단계에 사용하였다.
SMCC-변형된 항체를 말레이미드 링커와 관련하여 1.7 몰과량으로 DM1의 10mM 용액과 반응시켰다. 반응물을 약 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 컨쥬게이션 반응 혼합물을 pH 6.5에서 1× PBS로 평형화된 세파덱스(상표명) G25 겔 여과 칼럼을 통해 여과시켰다. 이후, huEGFR 항체-SMCC-DM1 컨쥬게이트를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스 pH 5.5를 함유하는 완충액으로 투석시켰다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수를 항체 및 DM1에 대한 기존에 보고된 흡광계수를 이용하여 결정하였다(Liu et al, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). 컨쥬게이션 반응 후에 존재 하는 자유 마이탄시노이드의 백분율을, 100mM 암모늄 아세테이트 완충액, pH 7.0 중 25% 아세토니트릴로 평형화된 HiSep 칼럼에 20-50 ㎍의 컨쥬게이트를 주입하고, 아세토니트릴 중에서 용리시킴으로써 결정하였다. 전체 자유 마이탄시노이드 종(구배에서 용리되고, 공지된 표준을 이용한 용리 시간의 비교에 의해 확인됨)의 피크 영역을 252㎚의 파장으로 설정된 흡광 검출기를 이용하여 측정하고, 결합된 마이탄시노이드(칼럼 플로우-쓰루(flow-through) 분획에서 컨쥬게이트 피크에서 용리됨)와 관련된 피크 영역과 비교하여 전체 자유 마이탄시노이드 종의 백분율을 계산하였다. huEGFR 항체 당 3.5-4개의 DM1 분자를 갖는 컨쥬게이트를 컨쥬게이션되지 않은 마이탄시노이드가 <1%로 존재 하도록 수득하였다.
huEGFR -7R- SPDB - DM4 의 제조
예시적 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 뷰타노에이트(SPDB) 링커를 에탄올에 용해시켰다. huEGFR 항체를 50mM NaCl, 2mM EDTA 및 3% 에탄올을 함유하는 50mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5) 중에서 실온에서 약 2시간 동안 5.5-5배 몰과량의 SPDB 링커와 함께 8 ㎎/㎖로 인큐베이션시켰다. SPDB 변형된 항체를 PBS, pH 6.5에서 2배 희석시키고, 다이메틸아세트아마이드(DMA) 중 DM4의 농축된 용액(15-30mM)의 첨가에 의해 마이탄시노이드 DM4의 1.5배 몰과량으로 변형시켰다. 실온에서 밤새 인큐베이션 후, 컨쥬게이션된 항체를 10mM 히스티딘, 250mM 글리신, 1% 수크로스 pH 5.5로 평형화된 세파덱스(상표명) G25F 상에서의 크로마토그래피로 정제하였다. 항체 분자 당 연결된 DM4 분자의 수를 항체 및 마이탄시노이드에 대해 기존에 보고된 흡광계수를 이용하여 결정하였다(Widdison WC et al. J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). 전체 자유 마이탄시노이드 종의 백분율을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. huEGFR 항체 당 3.5 내지 4개의 DM4 분자를 갖는 컨쥬게이트를 컨쥬게이션되지 않은 마이탄시노이가 1% 미만으로 존재 하도록 수득하였다.
실시예 14
마이탄시노이드 컨쥬게이트의 결합 친화성
huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 결합 친화성을 실시예 2에 기재된 바와 같이 MDA-MB468 세포를 이용하여 네이키드 항체의 결합 친화성과 비교하였다. huEGFR-6 항체 및 컨쥬게이트의 결합 곡선으로부터 계산된 Kd(도 18A)는 네이키드 huEGFR-6 항체에 대해 0.81nM이었고, huEGFR-6-SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대해 1.18nM이었다. huEGFR-7R 항체 및 컨쥬게이트의 결합 곡선으로부터 계산된 Kd(도 18B)는 네이키드 huEGFR-7R 항체에 대해 0.67nM이었고, huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트에 대해 0.83nM이었다. 이러한 데이터는 DM 컨쥬게이션이 huEGFR 항원에 대한 huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체의 결합 친화성을 현저하게 변경시키지 않는 것을 입증한다.
실시예 15
종양 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정
종양 세포 성장을 억제하는 EGFR 항체 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 능력을 시험관내 세포독성 검정을 이용하여 측정하였다. 간단히, 표적 세포를 10% FBS를 함유하는 100㎕ 완전 RPMI 배지 중에 웰 당 1,500 내지 3,000개의 세포로 플레이팅하였다. 컨쥬게이트를 5배 희석 시리즈를 이용하여 완전 RPMI 배지로 희석시키고, 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 최종 농도는 통상적으로 3×10-8 M 내지 8×10-14 M 범위였다. 세포를 5일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 남아있는 세포의 생활력을 비색 WST-8 검정으로 결정하고, 450㎚에서의 흡광도(A450)를 다중웰 플레이트 판독기에서 측정하였다. 각각의 처리된 샘플 값을 미처리된 대조군의 평균값으로 나누어 생존 분획을 계산하였다. 생존 분획 값을 각각의 처리에 대한 반-로그 플롯으로 항체-컨쥬게이트 농도에 대해 플로팅하였다.
본 발명의 네이키드 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성을 비-특이적 항체 및 이의 상응하는 마이탄시노이드 컨쥬게이트, 예를 들어, chKTI 및 chKTI-SMCC-DM1의 활성과 비교하였다. 통상적인 세포독성 검정으로부터의 결과가 도 19 및 도 20에 도시된다.
도 19A에서, 본 발명의 네이키드 항체 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성을 FaDu 세포주에서 시험하였다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R 네이키드 항체는 각각 40% 및 55%로 H292 세포 성장을 억제한 반면, chKTI 항체는 활성을 갖지 않았다. 마이탄시노이드 컨쥬게이션은 본 발명의 EGFR 항체의 활성을 추가로 향상시킨다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트 둘 모두는 각각 0.22nM 및 0.06nM의 EC50으로 표적 세포를 완전히 폐기시켰다. 대조군 chKTI-SMCC-DM1 컨쥬게이트가 또한 표적 세포를 사멸시켰으나, EC50은 훨씬 낮았다(0.59μM).
도 19B에서, 본 발명의 네이키드 항체 및 마이탄시노이드의 활성을 H292 세포주에서 시험하였다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R 네이키드 항체는 60 내지 70%로 H292 세포 성장을 억제한 반면, chKTI 항체는 활성을 갖지 않았다. 마이탄시노이드 컨쥬게이션은 본 발명의 EGFR 항체의 활성을 추가로 향상시킨다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트 둘 모두는 각각 0.16nM 및 0.03nM의 EC50으로 표적 세포를 완전히 폐기시켰다. 대조군 chKTI-SMCC-DM1 컨쥬게이트가 또한 표적 세포를 사멸시켰으나, EC50은 훨씬 낮았다(38.51nM).
도 20A에서, 본 발명의 네이키드 항체 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성을 H226 세포주에서 세툭시맙과 비교하였다. 세툭시맙, huEGFR-6, huEGFR-7R 네이키드 항체뿐만 아니라 chKTI 대조군 항체는 항-증식 활성을 갖지 않았다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체 둘 모두의 마이탄시노이드 컨쥬게이트는 각각 0.68nM 및 0.14nM의 EC50로 표적 세포를 완전히 제거한 반면, 대조군 chKTI-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 표적 세포를 사멸시키는데 실패하였다.
도 20B에서, 본 발명의 네이키드 항체 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성을 SCC-4 세포주에서 세툭시맙과 비교하였다. 세툭시맙, huEGFR-6 및 huEGFR-7R 네이키드 항체는 약 30%의 최대 억제로 용량 의존적 성장 억제를 나타낸 반면, chKTI 항체는 활성을 갖지 않았다. 마이탄시노이드 컨쥬게이션은 본 발명의 EGFR 항체의 활성을 추가로 강화시킨다. huEGFR-6 및 huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트 둘 모두는 각각 0.07nM 및 0.03nM의 EC50으로 표적 세포를 완전히 제거하였다. 대조군 chKTI-SMCC-DM1 컨쥬게이트가 또한 표적 세포를 사멸시켰으나, EC50은 훨씬 낮았다(17.62nM). 전체적으로, 상기 결과는 마이탄시노이드 컨쥬게이션이 본 발명의 EGFR 항체의 항-종양 활성을 크게 향상시키는 것을 나타낸다.
실시예 16
huEGFR -6 및 huEGFR -7R 항체와 마이탄시노이드 컨쥬게이트를 비교하는 생체 내 효능 연구
huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체의 네이키드 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성을 EGFR 발현 H292 NSCLC(비소세포폐암)(도 21) 및 FaDu SCCHN(두경부의 편평세포암종)(도 22) 종양 이종이식 모델에서 시험하였다. 1×107개의 종양 세포를 SCID 마우스에 피하 주사하였다. 동물을 종양의 평균 종양 부피가 약 100㎣에 도달하는 경우 처리군으로 종양 부피에 의해 무작위화시키고, 네이키드 항체 또는 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 표시된 투여량으로 1회 주사하였다. 각각의 처리군의 중간 종양 부피를 종양 세포 접종 후 시간에 대해 플로팅하였다(도 21 및 22). 표 17 및 18은 완전 반응(CR)(촉진가능한 종양이 없음) 및 대조군의 종양 부피가 소정의 크기에 도달하는 경우 대조군의 중간 종양 부피로 나누어진 각각의 처리군의 중간 종양 부피에 해당하는 종양 성장 억제 퍼센트(% T/C)를 갖는 마우스의 수를 제시한다. 42% 미만의 % T/C 값을 갖는 처리를 활성으로 간주하는 한편, 12% 미만의 % T/C 값을 갖는 처리를 매우 활성인 것으로 간주하였다.
본 발명의 네이키드 항체 및 항체 마이탄시노이드 컨쥬게이트 둘 모두는 매우 활성이었고, 이들은 H292 및 FaDu 종양 이종이식편 둘 모두의 성장을 현저히 지연시켰다(도 21 및 22). H292 종양 이종이식 연구(도 21 및 표 17)에서, 3 ㎎/㎏만큼 낮은 huEGFR-6-SMCC-DM1 및 huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트로 처리된 모든 마우스는 완전한 반응을 나타내었다. 10 ㎎/㎏의 huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체도 매우 활성이었다. FaDu 종양 이종이식 연구(도 22 및 표 18)에서, 10 ㎎/㎏의 huEGFR-6 및 huEGFR-7R 항체는 활성이었고, 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 일부 마우스에서 완전한 반응으로 훨씬 더 활성이었다.
표 17. H292 종양 이종이식편에서의 EGFR Ab 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성
Figure pct00032
표 18. FaDu 종양 이종이식편에서의 EGFR Ab 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성
Figure pct00033
huEGFR -7R- SMCC - DM1 및 huEGFR -7R- PEG - MAL - DM1 을 비교하는 생체내 효능 연구
네이키드 항체, huEGFR-7R-SMCC-DM1 및 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 컨쥬게이트의 활성을 EGFR 발현 H292 NSCLC(비소세포폐암)(도 25), HSC2 SCCHN(두경부의 편평세포 암종)(도 26) 및 FaDu SCCHN(도 27) 종양 이종이식 모델에서 비교하였다. 실험 및 데이터 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
H292 NSCLC 종양 이종이식 연구(도 25 및 표 19)에서, 모든 시험 목록은 3 ㎎/㎏ 단일 용량에서 매우 활성이었다. huEGFR-7R-SMCC-DM1 및 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 컨쥬게이트 둘 모두로 처리된 모든 마우스는 완전한 반응을 나타낸 반면, huEGFR-7R 항체로 처리된 마우스는 완전한 반응을 나타내지 않았다. HSC2 SCCHN 종양 이종이식 연구(도 26 및 표 20)에서, huEGFR-7R-SMCC-DM1 및 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 컨쥬게이트 둘 모두는 8%의 T/C로 매우 활성인 반면, huEGFR-7R 항체는 5 ㎎/㎏ 단일 용량에서 거의 활성이 없었다. FaDu SCCHN 종양 이종이식 연구(도 27 및 표 21)에서, huEGFR-7R-SMCC-DM1 및 huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1 컨쥬게이트 둘 모두는 각각 15% 및 28%의 T/C로 활성이었다. huEGFR-7R 항체 처리는 일부 종양 성장 억제를 나타내었으나, 이는 현저한 활성은 아니었다. 결론적으로, 상기 결과는 본 발명의 네이키드 항체가 NSCLC 및 SCCHN 종양의 성장을 억제하는데 효능이 있으며, 마이탄시노이드와의 컨쥬게이션이 항-종양 활성을 추가로 향상시키는 것을 나타낸다.
표 19. H292 종양 이종이식편에서의 huEGFR-7R Ab 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성
Figure pct00034
표 20. HSC2 종양 이종이식편에서의 huEGFR-7R Ab 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성
Figure pct00035
표 21. FaDu 종양 이종이식편에서의 huEGFR-7R Ab 및 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성
Figure pct00036
실시예 17
인간 일차 각질세포에 대한 시험관내 세포독성 검정
EGFR 신호전달은 인간 일차 각질세포 증식에서 중요한 역할을 한다. 소분자 티로신 키나제 억제제 또는 길항성 항-EGFR 항체, 예를 들어, 세툭시맙에 의한 EGFR 신호전달의 억제는 각질세포 배양에서 성장 정지 및 아폽토시스를 발생시킨다(Stoll et al., Oncogene 16, 1493-1499 (1998)). 각질세포 아폽토시스는 임상에서 항-EGFR 요법에 의해 야기되는 피부과 독성의 기초가 되는 메커니즘 중 하나인 것으로 생각된다. 피부 독성의 잠재성을 시험하기 위해, 본 발명의 EGFR 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트를 인간 일차 각질세포를 이용한 시험관내 세포독성 검정에서 시험하였다. 간단히, 인간 일차 각질세포(Invitrogen)를 제조업체에 의해 권고되는 100㎕ EGF 함유 배지 중에 웰 당 1,500 내지 3,000개의 세포로 플레이팅하였다. 시험 목록을 5배 희석 시리즈를 이용하여 EGF 함유 배지에서 희석시키고, 웰 당 100㎕를 첨가하였다. 최종 농도는 통상적으로 3×10-8M 내지 8×10-14M 범위였다. 세포를 5일 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 남아있는 세포의 생활력을 비색 WST-8 검정으로 결정하고, 450㎚에서의 흡광도(A450)를 다중웰 플레이트 판독기에서 측정하였다. 생존 분획을, 각각의 처리된 샘플 값을 미처리된 대조군의 평균값으로 나눔으로써 계산하였다. 생존 분획 값을 각각의 처리에 대한 반-로그 플롯으로 항체-컨쥬게이트 농도에 대해 플로팅하였다.
huEGFR-7R 네이키드 항체 및 huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성을 동일 실험에서 인간 일차 각질세포(도 23A)뿐만 아니라 H292 종양 세포(도 23B)에 대한 비-특이적 항체(chKTI), chKTI-SMCC-DM1 컨쥬게이트, 비 길항성 항체(huML66) 및 이의 상응하는 마이탄시노이드 컨쥬게이트의 활성과 비교하였다. H292 세포주(도 23B)에서, huML66 항체는 활성이 없는 반면, huEGFR-7R 항체는 세포 성장을 55%까지 억제하였다. huML66 및 huEGFR-7R의 마이탄시노이드 컨쥬게이트는 최적 활성을 가졌고, 이들은 0.05 내지 0.07nM의 EC50으로 종양 세포 성장을 완전히 억제할 수 있었다. 인간 일차 각질세포(도 23A)에서, chKTI 및 huML66 항체는 각질세포 증식에 대해 효과가 없었다. 그러나, huML66-SMCC-DM1은 0.55nM EC50으로 각질세포를 사멸시키는데 매우 효능이 있었다. huEGFR-7R 네이키드 항체는 각질세포에 대해 효과가 매우 적었다. 놀랍게도, huEGFR-7R-SMCC-DM1 컨쥬게이트는 huML66-SMCC-DM1 컨쥬게이트에 비해 각질세포에 대해 훨씬 독성이 덜했다. 3.3nM의 농도에서, huEGFR-7R 네이키드 항체 및 이의 상응하는 컨쥬게이트는 단지 각질세포 성장의 40% 미만을 억제하였다. 요컨대, 본 발명의 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 인간 일차 각질세포 세포 성장에 대해 거의 효과가 없는 반면, 이들은 종양 세포를 제거하는데 매우 효능이 있었다.
실시예 18
인간 일차 각질세포에 의한 케모카인 /사이토카인 생성
수지상 세포, 멜라닌세포, 및 드물게 T 림프구 및 단핵구가 산재된 각질세포로 주로 구성되는 피부 상피는 숙주 방어에 매우 기여한다. 물리적, 화학적 또는 면역 특이적 손상은 다른 백혈구 하위집단을 유인하고 활성화시켜 염증 반응을 유도하는 케모카인 및 사이토카인의 증가된 발현을 특징으로 하는 표피 반응을 신속하게 발생시킨다. TNFα는 인간 각질세포가 CCL5/RANTES, CXCL10/IFNγ-유도성-단백질 10 및 CXCL8/IL-8을 포함하는 다수의 케모카인 및 사이토카인을 발현하는 것을 유도한다. CCL5는 T 세포, 단핵구뿐만 아니라 호중구를 유인한다. CXCL10은 타입 1 T 세포의 이동을 유도한다. CXCL8은 호중구 점증뿐만 아니라 상피 및 내피 세포 증식에서 활성인 화학유인물질이다.
EGFR 신호전달은 항상성 유지 및 상피 조직의 복구를 관리한다. EGFR 활성화는 각질세포 증식, 이동 및 조절된 분화를 발생시킨다. TNFα에 대한 반응에서, 각질세포는 EGFR 신호전달을 활성화시키는 EGFR 리간드를 생성한다. 각질세포에서 향상된 EGFR 활성화는 CXCL8 발현을 증가시키고, CCL5 및 CXCL10 발현을 감소시킨다. 대조적으로, EGFR 신호전달의 손상은 반대 패턴을 발생시킨다. 선택적 EGFR 티로신 키나제 억제제의 피부 적용은 CCL5 및 CXCL10의 증가된 상피 수준, 및 피부에서의 단핵구/대식세포 및 T 세포의 높은 수와 함께 더욱 중증의 접촉 과민 반응을 발생시켰다. 이러한 발견은 EGFR 신호전달이 각질세포에서의 케모카인 발현에 영향을 미침으로써 피부 염증을 조절하는 것을 암시한다(Pastore, J. Immunol ., 174: 5047-5056 (2005)). EGFR 요법시 임상에서 나타나는 피부 독성이 피부에서의 아폽토시스 및 지속된 염증에 의해 야기되는 것으로 현재 생각된다.
인간 일차 각질세포에 의한 케모카인/사이토카인 생성의 조절에서의 본 발명의 항체 및 항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 효과를 하기 시험관내 검정에서 시험하였다. 1×105개의 인간 일차 각질세포/웰(Invitrogen)을 먼저 6 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 밤새 스타빙시킨 후, 14시간 동안 EGF 함유 배지 중 100 ng/㎖ TNFα 및 10 ㎍/㎖ 시험 항체와 함께 배양하였다. 배양 상층액 중 CCL5, CXCL10 및 CXCL8의 양을 제조업체의 프로토콜에 따라 R&D systems로부터의 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 세툭시맙은 CXCL8의 발현을 감소시켰고, CXCL10 및 CCL5의 생성을 증가시켰다. 대조적으로, 본 발명의 네이키드 항체는 chKTI 대조군과 비교 시 상기 케모카인/사이토카인의 발현에 대해 영향이 없거나 거의 영향이 없었다. 놀랍게도, 본 발명의 EGFR 항체의 마이탄시노이드 컨쥬게이트가 또한 각질세포에 대해 영향이 없거나 거의 영향이 없었다. 전체적으로, 실시예 17 및 18에 제시된 결과는 본 발명의 항체 및 항체 마이탄시노이드 컨쥬게이트 둘 모두가 시험관내에서 인간 일차 각질세포에 대해 최소의 영향을 미치고, 이에 따라 인간의 피부에 독성이 덜할 수 있음을 강하게 암시한다. 각질세포에 대한 효과와 대조적으로, 본 발명의 항체 및 항체 마이탄시노이드 컨쥬게이트는 실시예 7, 12, 15 및 16에 제시된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 EGFR 양성 종양 세포를 사멸시키는데 매우 효능이 있었다. 요컨대, 본 발명의 항체 및 항체 세포독성제 컨쥬게이트는 정상 대 종양 세포에 대해 별개의 영향을 미치는 독특한 부류의 항-EGFR 분자이다.
실시예 19
에피토프 맵핑( Epitope mapping )
인간 EGFR은 세포외 리간드 결합 영역, 단일한 막횡단 영역 및 비촉매 조절 영역의 측면에 존재 하는 세포질 티로신 키나제 도메인을 갖는 큰(1186개의 잔기) 단량체 당단백질이다. 인간 EGFR의 세포외 도메인(ECD)(잔기 1 내지 618)는 도메인 I(아미노산 1 내지 165), 도메인 II(아미노산 166 내지 309), 도메인 III(아미노산 310 내지 481) 및 도메인 IV(아미노산 482 내지 618)로 본원에서 언급되는 4개의 서브도메인(도 28)을 함유한다. 이러한 도메인은 또한 L1, CR1, L2 및 CR2로 지칭되고, 여기서 L 및 CR은 각각 큰(large) 및 Cys-풍부(Cys-rich)에 대한 두문자어(acronym)이다. 본 발명의 huEGFR-7R의 에피토프는 주로 트렁케이션된 키메라 인간/뮤린 EGFR 분자를 조작함으로써 인간 EGFR ECD 도메인 III에 아미노산 460 내지 480을 함유하는 규정된 영역으로 맵핑되었다.
EGFR 변이체 클로닝 및 발현
전체 인간 EGFR ECD(아미노산 1 내지 618)를 Fc 융합 단백질(huEGFR-Fc)로 발현시켰다. 단백질 서열을 코돈 최적화시키고, 합성하고, Blue Heron Biotechnologies에 의해 pmuFc2ANL 포유동물 발현 벡터에 뮤린 IgG2A 힌지, CH2 및 CH3 도메인과 함께 인 프레임으로 클로닝시켰다. 본 발명의 항체는 EGFR에 결합하는 세툭시맙과 경쟁하고(도 8B), 세툭시맙이 도메인 III에만 결합함에 따라, 본 발명의 항체의 에피토프는 또한 도메인 III에 위치될 수 있고, 세툭시맙의 에피토프와 중첩될 수 있다. 에피토프를 추가로 확인하기 위해, 세툭시맙의 결합에 필요한 것으로 제안된 전체 도메인 III(아미노산 310 내지 481) 및 도메인 IV로부터의 20개의 여분의 잔기(아미노산 482 내지 501)를 함유하는 트렁케이션된 인간 EGFR(huEGFRdIII-Fc)의 Fc 융합체를 huEGFR-Fc와 유사하게 작제하였다. 추가로, 아미노산 310-501을 함유하는 트렁케이션된 뮤린 EGFR(muEGFRdIII-Fc), 및 chEGFRdIII-Fc, 아미노산 460 내지 481을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 인간 EGFR로부터의 상응하는 서열로 대체된 뮤린 EGFR 아미노산 310 내지 501을 함유하는 키메라 형태를 또한 Fc 융합 단백질로서 발현되도록 하기 위해 유사하게 작제하였다(도 29). chEGFRdIII-Fc 작제물은 잔기 460, 461, 467, 468, 471, 473, 474 및 478 내지 480을 포함하는 인간 대응물에 대한 10개의 아미노산 돌연변이로 구성된다. EGFR ECD Fc 태깅된 단백질의 모든 형태를 HEK 293T 세포의 일시적 트랜스펙션을 통해 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 트랜스펙션된 세포의 상층액으로부터 정제하였다.
다양한 EGFR ECD - Fc 작제물에 대한 항체 결합
huEGFR-7R을 상기 기재된 다양한 EGFR-Fc 작제물에 대한 결합에 대해 ELISA 포맷으로 시험하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, huEGFR-7R 항체는 인간 EGFR(huEGFR-Fc) 및 인간 EGFR 도메인 III(huEGFRdIII-Fc) 둘 모두에 유사한 친화성으로 결합한다. 도 30은 또한 huEGFR-7R 항체가 인간 수용체와의 높은 서열 상동성(도메인 III에서 88%의 서열 동일성)에도 불구하고 뮤린 EGFR 도메인 III(muEGFRdIII-Fc)를 인지하지 않는 것을 나타낸다. 또한, huEGFR-7R 항체는 인간 대응물로 돌연변이된 위치 460, 461, 467, 468, 471, 473, 474 및 478 내지 480의 10개의 아미노산을 갖는 뮤린 EGFR 도메인 III 서열을 주로 함유하는 인간/뮤린 EGFR 키메라(chEGFRdIII-Fc)에 결합한다(도 30). 이러한 데이터는 huEGFR-7R 항체가 인간 EGFR의 도메인 III에만 결합하고, 결합 에피토프가 주로 아미노산 위치 460 내지 480 내에 제한되는 것을 나타낸다. huEGFR의 다양한 트렁케이션된 포맷에 대한 결합 친화성이 비교되는 경우, huEGFR 및 huEGFRdIII와 비교시 chEGFRdIII-Fc에 대한 huEGFR-7R 항체의 결합 친화성에서의 약 2배의 감소가 존재 하는 것이 명백하고, 이는 huEGFR-7R 항체의 에피토프가 위치 460 내지 480 내의 아미노산 잔기 외에 추가적인 아미노산 잔기로 구성되는 것을 암시한다. 이러한 데이터를 muEGFR-7 항체 결합 결과로 확인하였다(도 32).
동시에, 본 발명의 다른 항-EGFR 항체, 예를 들어, EGFR-7 항체와 독특한 생물학적 활성을 공유하는 huEGFR-6(도 31), muEGFR-6(도 33), muEGFR-12(도 34) 및 muEGFR-13(도 35) 항체는 EGFR-7 항체와 유사한 결합 특성을 나타낸다. 이들은 인간 EGFR 도메인 III(huEGFRdIII-Fc)에는 결합하지만, 뮤린 EGFR 도메인 III(muEGFRdIII-Fc)에는 결합하지 않고, 중요하게는, 이들은 모두 huEGFRdIII-Fc보다 낮은 친화성으로 chEGFRdIII-Fc에 결합한다. 이러한 데이터는 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프가 위치 460 내지 480의 아미노산 잔기에 더하여 도메인 III의 다른 잔기로 구성되는 것을 암시한다. 대조적으로, 세툭시맙은 유사한 친화성으로 chEGFRdIII뿐만 아니라 야생형 인간 EGFR 및 huEGFRdIII에 결합하고(도 36), 이는 세툭시맙 결합 에피토프가 위치 460 내지 480의 아미노산 잔기로 제한되는 것을 암시한다. 요컨대, 본 발명의 다른 항-EGFR 항체와 함께 huEGFR-7R 항체는 huEGFR 세포외 도메인의 도메인 III에만 결합한다. 또한, 키메라 EGFR 작제를 통해, 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프가 huEGFR 도메인 III의 C-말단으로 대체되고, 이는 세툭시맙 결합 부위와 대부분 중첩되지만 동일하지는 않고, 추가의 중요한 아미노산으로 구성될 가능성이 매우 높은 것으로 확인되었다.
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특정 구체예의 상기 기재는 또한 당 분야의 기술 내의 지식을 적용시킴으로써 본 발명의 전반적 개념으로부터 벗어남이 없이 과도한 실험을 거치지 않고 상기 특정 구체예를 용이하게 변형시키고/시키거나 다양한 적용을 적합화시킬 수 있는 본 발명의 전반적 특성을 충분히 나타낼 것이다. 따라서, 상기 적합화 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침을 기초로 하여 개시된 구체예의 동등부의 의미 및 범위 내에 속한다. 본원의 표현 또는 술어는 기재를 목적으로 하고 제한하려는 것이 아니며, 이에 본 출원의 술어 또는 표현은 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 하는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 상기 기재된 예시적 구체예 중 임의의 구체예로 제한되지 않아야 하며, 하기 청구항 및 이의 동등부에 따라서만 규정되어야 한다.
ATCC PTA-11331,PTA-11332,PTA-11333 20101006
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNOGEN, INC. <120> NOVEL EGFR-BINDING MOLECULES AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF <130> WO2012/058588 <140> PCT/US2011/058378 <141> 2011-10-28 <150> 61/477,086 <151> 2011-04-19 <150> 61/408,497 <151> 2010-10-29 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-7 VH-CDR1 <400> 1 Thr Ser Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-7 VH-CDR2 <400> 2 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-7 VH-CDR3 <400> 3 Tyr Asp Ala Pro Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-7 VH-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = T, R, or S <400> 4 Xaa Xaa Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 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ggggtgtcgt tttggc 36 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SacIMK primer <400> 62 gagctcgaya ttgtgmtsac mcarwctmca 30 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Murine HC CDR2 <400> 63 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized HC CDR2 <400> 64 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-6 VH-CDR2 <400> 65 Ala Leu Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg 1 5 10 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Kabat HC (murine) VH-CDR2 <400> 66 Ala Leu Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Kabat HC (resurfaced) VH-CDR2 <400> 67 Ala Leu Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFR-6 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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 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tctgaagact ccgccgtgta ctattgtgcc 360 cgctacgacg cccccggcta tgcaatggat tactggggcc agggtactct ggtcacagtg 420 tcctccgcct ctacaaaggg ccc 443 <210> 81 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> muEGFR-6 VL <400> 81 gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60 atcacttgca aggcaagcca agacattaac aactatatag cttggtacca acacaagcct 120 ggaaaaggtc ctaggctgct cattcattac acatctacat tacatccagg catcccatca 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240 gaagatattg caacttatta ttgtctacag tatgataatc ttctgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 82 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> huEGFR-6 HC v1.0 <400> 82 aagcttgcca ccatggggtg gagttgtatc atcctcttcc ttgtcgctac cgccactgga 60 gtgcattccc aggtgcagtt ggtgcaatct ggcgccgagg tggccaagcc cggtgcctcc 120 gtaaaattga gttgtaaagc ctctggctat acatttacat cttattggat gcagtgggtc 180 aagcagcgcc ctggtcaagg cctggagtgc atcggagctc tgtatcctgg cgacggggac 240 gcccgttaca ctcagaaatt tcagggcaaa 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atacattgcc cccatctaga 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgagtctc acttgtctgg tcaaggggtt ttacccttct 1200 gacattgctg tagagtggga gtctaacgga cagccagaaa acaactacaa gacaactccc 1260 ccagtgctgg acagcgacgg gagcttcttc ctctactcca agttgactgt agacaagtct 1320 agatggcagc aaggaaacgt tttctcctgc tcagtaatgc atgaggctct gcacaatcac 1380 tatacccaga aatcactgtc ccttagccca gggtgactcg ag 1422 <210> 83 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> huEGFR-6 HC v1.11 <400> 83 aagcttgcca ccatggggtg gagttgtatc atcctcttcc ttgtcgctac cgccactgga 60 gtgcattccc aggtgcagtt ggtgcaatct ggcgccgagg tggccaagcc cggtgcctcc 120 gtaaaattga gttgtaaagc ctctggctat acatttacat cttattggat gcagtgggtc 180 aagcagcgcc ctggtcaagg cctggagtgg atcggagctc tgtatcctgg cgacggggac 240 gcccgttaca ctcagaaatt tcagggcaaa gctaccctca ccgcagatac atccagcagc 300 actgcttata tgcaacttag tagcctccgc agcgaggata gtgccgtgta ctactgtgcc 360 agatatgacg ccccaggtta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtgacagtg 420 tcaagcgcta gcacaaaggg cccatcagtt ttccccttgg ctccaagttc taaatccaca 480 agcggtggaa cagctgcact gggatgcctc gttaaagatt atttccctga gcctgtgaca 540 gtgagctgga atagcggagc attgacttca ggtgtgcaca cttttcccgc tgtgttgcag 600 tcctccggtc tgtactcact gtccagtgtc gtaaccgtcc cttctagcag cttgggaacc 660 cagacctaca tctgtaacgt caaccataaa ccatccaaca caaaggtgga taagaaggtt 720 gaaccaaaga gctgtgataa gacacataca tgccctcctt gtcctgcacc agagctcctc 780 ggaggtccat ctgtgttcct gtttcccccc aaacccaagg acactcttat gatctctcgt 840 actccagagg tcacctgtgt tgttgtcgac gtgagccatg aagatcccga ggttaaattc 900 aactggtacg tggatggagt cgaggttcac aatgccaaga ccaagcccag ggaggagcaa 960 tataattcta catatcgggt agtgagcgtt ctgaccgtgc tccaccaaga ttggctcaat 1020 ggaaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggctcttc ccgctcccat tgagaaaact 1080 atctccaaag ccaaggggca gccacgggaa ccccaggtgt atacattgcc cccatctaga 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgagtctc acttgtctgg tcaaggggtt ttacccttct 1200 gacattgctg tagagtggga gtctaacgga cagccagaaa acaactacaa gacaactccc 1260 ccagtgctgg acagcgacgg gagcttcttc ctctactcca agttgactgt agacaagtct 1320 agatggcagc aaggaaacgt tttctcctgc tcagtaatgc atgaggctct gcacaatcac 1380 tatacccaga aatcactgtc ccttagccca gggtgactcg ag 1422 <210> 84 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> huEGFR-7 HC v1.11 <400> 84 aagcttgcca ccatgggctg gtcatgtatc attctgttcc tggtggccac cgcaaccggt 60 gtccattccc aggtgcagct cgtgcagagc ggggctgaag tggccaagcc aggtgcttct 120 gtcaaattgt cttgtaaggc cagtgggtac accttcacaa gctactggat gcagtgggtt 180 aagcaacgcc caggccaggg actggagtgg atcggcacca tttatccagg ggatggagat 240 accacttata cacaaaagtt tcaaggcaaa gccaccctga ccgccgacaa atccagcagc 300 acagcataca tgcagctttc tagcctcagg tctgaagact ccgccgtgta ctattgtgcc 360 cgctacgacg cccccggcta tgcaatggat tactggggcc agggtactct ggtcacagtg 420 tcctccgcct ctacaaaggg cccatcagtt ttccccttgg ctccaagttc taaatccaca 480 agcggtggaa cagctgcact gggatgcctc gttaaagatt atttccctga gcctgtgaca 540 gtgagctgga atagcggagc attgacttca ggtgtgcaca cttttcccgc tgtgttgcag 600 tcctccggtc tgtactcact gtccagtgtc gtaaccgtcc cttctagcag cttgggaacc 660 cagacctaca tctgtaacgt caaccataaa ccatccaaca caaaggtgga taagaaggtt 720 gaaccaaaga gctgtgataa gacacataca tgccctcctt gtcctgcacc agagctcctc 780 ggaggtccat ctgtgttcct gtttcccccc aaacccaagg acactcttat gatctctcgt 840 actccagagg tcacctgtgt tgttgtcgac gtgagccatg aagatcccga ggttaaattc 900 aactggtacg tggatggagt cgaggttcac aatgccaaga ccaagcccag ggaggagcaa 960 tataattcta catatcgggt agtgagcgtt ctgaccgtgc tccaccaaga ttggctcaat 1020 ggaaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggctcttc ccgctcccat tgagaaaact 1080 atctccaaag ccaaggggca gccacgggaa ccccaggtgt atacattgcc cccatctaga 1140 gacgagctga ccaagaacca ggtgagtctc acttgtctgg tcaaggggtt ttacccttct 1200 gacattgctg tagagtggga gtctaacgga cagccagaaa acaactacaa gacaactccc 1260 ccagtgctgg acagcgacgg gagcttcttc ctctactcca agttgactgt agacaagtct 1320 agatggcagc aaggaaacgt tttctcctgc tcagtaatgc atgaggctct gcacaatcac 1380 tatacccaga aatcactgtc ccttagccca gggtgactcg ag 1422 <210> 85 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HindKL primer <400> 85 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46

Claims (76)

  1. 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 EGF 및 TGFα를 적어도 80% 억제하는나, 또는 (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50% 억제를 야기시키는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 EGF 및 TGFα를 적어도 80% 억제하고, 또한 (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50% 억제를 야기시키는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 (a) 서열번호: 19 내지 23, 69 및 71 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 VH 서열과 적어도 90% 동일한 VH 서열; 및 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 VL 서열과 적어도 90% 동일한 VL 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 VH 및 VL 서열은 참조 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일한 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 VH 및 VL 서열은 참조 VH 및 VL 서열과 적어도 99% 동일한 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, (a) 서열번호: 19 내지 23, 69 및 71 내지 73으로 구성된 군으로부터 선택된 VH 서열; 및 (b) 서열번호: 24 내지 30 및 70으로 구성된 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호: 19 및 서열번호: 24를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제7항에 있어서, 서열번호: 20 및 서열번호: 25를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제7항에 있어서, 서열번호: 21 및 서열번호: 26을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제7항에 있어서, 서열번호: 21 및 서열번호: 27을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제7항에 있어서, 서열번호: 22 및 서열번호: 28을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제7항에 있어서, 서열번호: 23 및 서열번호: 29를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제7항에 있어서, 서열번호: 23 및 서열번호: 30을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제7항에 있어서, 서열번호: 69 및 서열번호: 70을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제7항에 있어서, 서열번호: 71 및 서열번호: 26을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제7항에 있어서, 서열번호: 71 및 서열번호: 27을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제7항에 있어서, 서열번호: 72 및 서열번호: 26을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제7항에 있어서, 서열번호: 72 및 서열번호: 27을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제7항에 있어서, 서열번호: 73 및 서열번호: 26을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제7항에 있어서, 서열번호: 73 및 서열번호: 27을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 인간 EGFR에 대한 제2의 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 제2의 항체는 서열번호: 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 26 또는 27의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제1의 항체 또는 항원 결합 단편이, (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 표피성장인자(EGF) 및 전환성장인자 알파(TGFα)를 적어도 80% 억제하거나, (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50%의 억제를 야기시키거나, (c) 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된 하이브리도마에 의해 생성된, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 EGFR 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 인간 EGFR에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 참조 항체는 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11331, 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11332 및 2010년 10월 6일에 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 지정번호 PTA-11333으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이, (a) 10nM 또는 그 초과의 농도에서 A431 세포에 결합하는 표피성장인자(EGF) 및 전환성장인자 알파(TGFα)를 적어도 80% 억제하거나, (b) 30nM 또는 그 초과에서 H292 및 HCC827 종양 세포 증식의 적어도 50%의 억제를 야기시키거나, (c) 60nM 또는 그 미만에서 각질세포 및 MCF-10A 상피세포의 증식을 20%보다 많이 억제하지 않는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. a) 서열번호: 19의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 24의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    b) 서열번호: 20의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 25의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    c) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    d) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    e) 서열번호: 22의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 28의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    f) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 29의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    g) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 30의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    h) 서열번호: 69의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 70의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    i) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    j) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    k) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    l) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    m) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; 및
    n) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 EGFR 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 인간 EGFR에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 참조 항체는,
    a) 서열번호: 19의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 24의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    b) 서열번호: 20의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 25의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    c) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    d) 서열번호: 21의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    e) 서열번호: 22의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 28의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    f) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 29의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    g) 서열번호: 23의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 30의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    h) 서열번호: 69의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 70의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    i) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    j) 서열번호: 71의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    k) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    l) 서열번호: 72의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체;
    m) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 26의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체; 및
    n) 서열번호: 73의 VH 폴리펩타이드 및 서열번호: 27의 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 2, 4, 6, 63 또는 64의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3 또는 5의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 10, 13 또는 14의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제27항에 있어서,
    a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 2, 4, 6, 63 또는 64의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3 또는 5의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열번호: 10, 13 또는 14의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 7, 8 또는 9의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 15 또는 16의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 17의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 18의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제30항에 있어서,
    a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 7, 8 또는 9의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열번호: 15 또는 16의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 17의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 18의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    a) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 65, 66 또는 67의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고는, 서열번호: 68 또는 13의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제32항에 있어서,
    a) 서열번호: 1의 참조 중쇄 CDR1 서열, 서열번호: 65, 66 또는 67의 참조 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 3의 참조 중쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열번호: 68 또는 13의 참조 경쇄 CDR1 서열, 서열번호: 11의 참조 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호: 12의 참조 경쇄 CDR3 서열과 각각 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤린, 비-인간(non-human), 인간화, 키메라, 재표면화(resurfaced), 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGΔCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트라이어바디(triabody), 다이어바디(diabody), 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 또는 scFv-Fc를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실질적으로 유사한 결합 친화성으로 인간 및 마카크(macaque) EGFR 둘 모두에 결합하는 것인 항체 또는 폴리펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, 약 1.0 내지 약 10nM의 Kd로 인간 및 마카크 EGFR에 결합하는, 항체 또는 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 약 1.0nM 또는 그 초과의 Kd로 인간 및 마카크 EGFR에 결합하는, 항체 또는 폴리펩타이드.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 친화성은 흐름세포측정법, 바이어코어(Biacore) 또는 방사면역측정법에 의해 측정되는 것인 항체 또는 폴리펩타이드.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드를 생성하는, 분리된 세포.
  44. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, (a) 제43항의 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포로부터 상기 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 분리시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 세포는 진핵생물 세포인 것인 방법.
  46. 일반식 (A)-(L)-(C)를 갖는 면역컨쥬게이트로서,
    (A)는 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드이고,
    (L)이 링커이며,
    (C)는 세포독성제이며,
    상기 링커 (L)은 (A)를 (C)에 연결시키는 것인 면역컨쥬게이트.
  47. 제46항에 있어서, 상기 링커는 분해성 링커, 비-분해성 링커, 친수성 링커 및 다이카복실산 기반 링커로 구성된 군으로부터 선택된 것인 면역컨쥬게이트.
  48. 제47항에 있어서, 상기 링커는 비-분해성 링커인 것인 면역컨쥬게이트.
  49. 제48항에 있어서, 상기 링커는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP); N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)뷰타노에이트(SPDB) 또는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오)-2-설포뷰타노에이트(설포-SPDB); N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC); N-설포숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(설포SMCC); N-숙신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB); 및 N-숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글라이콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 면역컨쥬게이트.
  50. 제49항에 있어서, 상기 링커는 N-숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글라이콜] 에스터(NHS-PEG4-말레이미드)인 것인 면역컨쥬게이트.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제는 마이탄시노이드(maytansinoid), 마이탄시노이드 유사체, 독소루비신(doxorubicin), 변형된 독소루비신, 벤조다이아제핀, 탁소이드(taxoid), CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카르마이신(duocarmycin), 듀오카르마이신 유사체, 칼리케아마이신(calicheamicin), 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체, 아리스타틴(aristatin), 토마이마이신(tomaymycin) 유도체 및 렙토마이신(leptomycin) 유도체 또는 상기 작용제의 프로드러그로 구성된 군으로부터 선택된 것인 면역컨쥬게이트.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포독성제는 마이탄시노이드인 것인 면역컨쥬게이트.
  53. 제52항에 있어서, 상기 세포독성제는 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신(DM1) 또는 N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-마이탄신(DM4)인 것인 면역컨쥬게이트.
  54. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 또는 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 제2의 항암제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  56. 표지되는 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 또는 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트를 포함하는 진단 시약.
  57. 제56항에 있어서, 상기 표지는 방사선표지, 형광단, 발색단, 조영제(imaging agent) 및 금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 진단 시약.
  58. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 또는 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트를 포함하는 키트.
  59. EGFR을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 세포를, 피검체에 대한 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 또는 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트, 또는 제54항 또는 제55항의 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포인 것인 방법.
  61. 암 환자를 치료하는 방법으로서, 피검체에 대한 치료적 유효량의 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트, 또는 제54항 또는 제55항의 약학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 제2의 항암제를 피검체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 제2의 항암제는 화학요법제인 것인 방법.
  64. 세포 증식 장애를 치료하는 방법으로서, 피검체에 대한 치료적 유효량의 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩타이드, 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 면역컨쥬게이트, 또는 제54항 또는 제55항의 약학적 조성물을 세포 증식 장애를 갖는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 세포 증식 장애는 부신피질 과다형성(adrenal cortex hyperplasia)(쿠싱병(Cushing's disease)), 선천 부신 과다형성(congenital adrenal hyperplasia), 자궁내막 과다형성(endometrial hyperplasia), 양성 전립선 비대(benign prostatic hyperplasia), 유방 과다형성(breast hyperplasia), 내막 증식(intimal hyperplasia), 국소 상피증식(focal epithelial hyperplasia)(헤크병(Heck's disease)), 피지샘 증식(sebaceous hyperplasia), 보상성 간 과다형성(compensatory liver hyperplasia), 및 임의의 다른 세포 증식 질병뿐만 아니라 신생물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  66. 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  67. 제66항에 있어서, 상기 서열은 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 것인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  68. 제67항에 있어서, 상기 서열은 서열번호: 39 내지 43, 77 내지 80 및 82 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 99% 동일한 것인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  69. 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  70. 제69항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  71. 제70항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44 내지 50 및 81과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  72. 서열번호: 39 내지 58 및 77 내지 84로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  74. 제73항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  75. 제46항에 있어서, 상기 면역컨쥬게이트는 EGFR 양성 종양 세포를 제거할 수 있으나, 3.3nM의 농도에서 인간 일차 각질세포의 성장을 단지 40% 또는 그 미만으로 억제하는 것인 면역컨쥬게이트.
  76. 일반식 (A)-(L)-(C)를 갖는 면역컨쥬게이트로서,
    (A)는 서열번호: 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 26 또는 27의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    (L)은 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸) 사이클로헥산카복실레이트(SMCC) 링커이며;
    (C)는 세포독성제 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신(DM1)인 것인 면역컨쥬게이트.
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