CN103298489A - 新型egfr结合分子及其免疫偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型抗癌剂，包括但不限于结合EGFR的抗体和免疫偶联物。本发明进一步提供了使用所述抗癌剂、抗体或免疫偶联物的方法，诸如抑制肿瘤生长的方法。

Description

新型EGFR结合分子及其免疫偶联物
发明领域
本发明整体涉及结合到EGFR的抗体、其抗原结合片段、多肽和免疫偶联物。本发明还涉及将此类EGFR结合分子用于诊断和治疗疾病诸如恶性肿瘤的方法。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1或HER1)是由位于7q22染色体中的c-erbB1原癌基因编码的170kDa的跨膜糖蛋白。EGFR是包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)的受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的成员。这些RTK共有由以下结构域组成的同源结构：配体结合胞外结构域(ECD)、单跨跨膜结构域以及包含催化激酶结构域和C端尾的胞内结构域。HER激酶信号转导通路通过胞外配体的结合而引发，这种结合诱导受体同源二聚化或与其他HER激酶成员的异源二聚化以及胞内区域的转磷酸化。这些事件生成初始信号，导致对细胞增殖和存活至关重要的许多下游信号转导通路的激活。
EGFR在许多上皮细胞起源的恶性肿瘤类型如头颈、结直肠、肺、卵巢、肾、胰腺、皮肤和其他实体瘤中过表达。EGFR介导的信号转导通路在肿瘤生长和转移的进展中发挥着重要作用，从而使得EGFR成为肿瘤疗法的良好靶标(Baselga,Oncologist,7:2-8(2002),Yarden和Sliwkowski,Nat Rev Mol Cell Biol,2:127-137(2001))。目前，有四种EGFR靶向剂已得到批准用于治疗结直肠癌、胰腺癌、头颈癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，所述四种EGFR靶向剂包括两种小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(埃罗替尼(Tarceva来自Genentech和OSIPharmaceuticals)和吉非替尼(Iressa来自AstraZeneca和TevaPharmaceuticals))以及两种裸单克隆抗体(西妥昔单抗(Erbitux来自ImClone和BMS)和帕尼单抗(Vectibix来自Amgen))。这些抗EGFR剂强烈抑制EGFR激活和下游信号转导。TKI与ATP竞争对EGFR胞内激酶结构域的结合(Baselga和Arteaga,J Clin Oncol,23:2445-2459(20005))，而两种单克隆抗体则与EGFR配体竞争对受体的结合(Gill等,J Biol Chem,259:7755-7760(1984),Goldstein等,Clin Cancer Res,1:1311-1318(1995),Prewett等,Clin Cancer Res,4:2957-2966(1998))。
抗EGFR疗法并不完美。抑制EGFR信号转导只在某些肿瘤类型中有效。例如，抗EGFR抗体的疗效在具有KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN突变的结直肠癌患者中显著降低(De Roock等,Lancet Oncol,11:753-762(2010),Bardelli和Sienna,J Clin Oncol,28:1254-1261(2010))。另外，小分子EGFR抑制剂的活性也受限于具有激活EGFR突变的NSCLC患者(Linardou等,Nat Rev Clin Oncol,6:352-366(2009),Paz-Ares等,J Cell Mol Med,14:51-69(2009),Mok等,DiscovMed,8:227-231(2009))。EGFR疗法还会导致皮肤毒性。EGFR在皮肤正常基底上皮细胞中的表达在上皮的正常发育和生理机能中发挥着关键作用，而抑制EGFR信号转导会导致多种皮肤毒性，包括痤疮样皮疹、皮肤干燥、瘙痒症、甲沟炎、毛发异常、黏膜炎以及睫毛或面部毛发生长加速(Li和Perez-Soler的综述,Targ Oncol4:107-119(2009))。虽然罕有致命，但是皮肤毒性会导致降低患者生活质量的严重生理和心理不适。另外，在大约10%的患者中，皮肤毒性的严重程度使得需要中断或停止治疗，这会影响EGFR抑制剂的临床结果。
因此，需要改进的抗EGFR疗法，其对正常组织无害但仍能非常有效地治疗EGFR过表达的恶性肿瘤，尤其是抗当前EGFR疗法的肿瘤。为了解决这一特定需求，本发明关注于一类新型的独特EGFR抗体，它们在杀伤EGFR表达肿瘤细胞方面非常有效，但对正常上皮细胞的生长没有影响或几乎没有影响。此外，虽然本发明的EGFR抗体与细胞毒性剂的偶联可加强这些抗体的抗肿瘤活性，但是不会对正常上皮细胞产生附加的毒性。
发明概述
本发明整体涉及结合到EGFR的抗体、其抗原结合片段、多肽和免疫偶联物。本发明还涉及将此类EGFR结合分子用于诊断和治疗疾病诸如恶性肿瘤的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有选自以下的至少一种特征：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。在另一个实施方案中，该抗体具有选自以下的至少两种特征：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段特异性结合到人EGFR，其中所述抗体(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其包含(a)选自SEQ IDNO:19-23和69-73的与参考VH序列至少90%相同的VH序列；以及(b)选自SEQ ID NO:24-30和70的与参考VL序列至少90%相同的VL序列。在另一个实施方案中，VH和VL序列与参考VH和VL序列至少95%相同。在另一个实施方案中，VH和VL序列与参考VH和VL序列至少99%相同。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含(a)选自SEQ ID NO:19-23和69-73的VH序列；以及(b)选自SEQID NO:24-30和70的VL序列。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:24。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:28。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:29。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:30。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:26。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:26。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:73和SEQ IDNO:26。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:73和SEQ ID NO:27。
在一个实施方案中，本发明提供选自由以下的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位的抗体或其抗原结合片段：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。在又一个实施方案中，本发明提供竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位的抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQ ID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；(f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；(g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；(h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；(i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(m)包含SEQ IDNO:73的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；以及(n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：(a)包含SEQID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；(f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；(g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；(h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；(i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；(l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；(m)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ IDNO:26的VL多肽的抗体；以及(n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQID NO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ IDNO:3的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链CDR2序列以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ IDNO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链CDR2序列以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ IDNO:12的参考轻链CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ IDNO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段为鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、表面重塑的或人的。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为全长抗体。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体(minibody)、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
本发明还提供包含本文所述的VH和VL序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供以基本上相似的结合亲和力结合人和恒河猴(macaque)EGFR的抗体或多肽。在一个实施方案中，该抗体或多肽以约1.0nM至约10nM的Kd结合到人和恒河猴EGFR。在另一个实施方案中，该抗体或多肽以约1.0nM或更佳的Kd结合到人和恒河猴EGFR。在另一个实施方案中，结合亲和力通过流式细胞术、Biacore或放射性免疫测定法测量。
在一个实施方案中，本发明提供产生本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的分离的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供制备本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，包括：(a)培养表达该抗体、其抗原结合片段或多肽的细胞，以及(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。在一个实施方案中，该细胞为真核细胞。
在一个实施方案中，本发明提供具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联物，其中：(A)为本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽；(L)为连接子；以及(C)为细胞毒性剂；并且其中所述连接子(L)将(A)连接到(C)。在另一个实施方案中，该连接子选自可裂解的连接子、不可裂解的连接子、亲水性连接子和二羧酸基连接子。在另一个实施方案中，该连接子为不可裂解的连接子。在另一个实施方案中，该连接子选自：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀酰亚胺-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。在进一步的实施方案中，该连接子为N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
在另一个实施方案中，该免疫偶联物包含选自以下的细胞毒性剂：美登木素(maytansinoid)、美登木素类似物、多柔比星、修饰的多柔比星、苯并二氮
Figure GDA00003449447800091
紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、尾海兔素(dolastatin)、尾海兔素类似物、aristatin、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物或所述活性剂的前药。在另一个实施方案中，该细胞毒性剂为美登木素。在进一步的实施方案中，该细胞毒性剂为N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽或本文所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，该药物组合物包含第二抗癌剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含进行了标记的本发明的抗体或其抗原结合片段、多肽或免疫偶联物的诊断试剂。在一个实施方案中，该标记选自放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
在一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗体或其抗原结合片段、多肽或免疫偶联物的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明提供抑制表达EGFR的细胞生长的方法，包括将该细胞与本文所述的免疫偶联物或药物组合物接触。在另一个实施方案中，该细胞为肿瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗具有赘生物的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的免疫偶联物或药物组合物。在另一个实施方案中，该赘生物选自：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝、胰腺、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头颈、中枢神经系统、外周神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用第二抗癌剂。在进一步的实施方案中，第二抗癌剂为化疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患者的细胞增生性病症的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的免疫偶联物或药物组合物。在另一个实施方案中，该细胞增生性病症除了肿瘤形成外还选自：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(赫克病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其他细胞增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码多肽的序列，该序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少90%相同。在另一个实施方案中，该序列与选自SEQ IDNO:39-43、77-80和82-84的序列至少95%相同。在另一个实施方案中，该序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少99%相同。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含与SEQID NO:44-50和81至少90%相同的序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少95%相同的序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少99%相同的序列。在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:39-58和77-84的序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的载体的宿主细胞。
附图说明
图1是表格，描述了指定的抗EGFR抗体对人EGFR(huEGFR)和猴EGFR(moEGFR)抗原的结合亲和力。
图2是蛋白质印迹数据，示出了在MDA-MB468细胞(A)和人原代角质形成细胞(B)中指定的抗EGFR抗体对配体诱导的EGFR磷酸化的影响。
图3是蛋白质印迹数据，示出了在不存在外源EGFR配体的情况下在MDA-MB468细胞中指定的抗EGFR抗体对EGFR磷酸化的影响。
图4是曲线图，示出了在存在指定的抗体的情况下生物素化TGFα(A)和EGF(B)对A431细胞的结合。
图5是曲线图，示出了在存在多种浓度的指定抗体的情况下人原代角质形成细胞的生长。
图6是柱状图，示出了在存在10μg/ml的指定抗体的情况下MCF10A细胞的生长。
图7是曲线图，示出了在存在指定抗体的情况下HCC827细胞(A)和NCI-H292细胞(B)的生长。
图8是曲线图，示出了在存在指定浓度的指定竞争性抗体的情况下生物素化528抗体(A)、生物素化西妥昔单抗(B)和生物素化EGFR-7抗体(C)对MDA-MB468细胞的结合。
图9是鼠EGFR-7变体轻链和重链可变区序列的比对。
图10是表格，示出了在EGFR-7VL(A)和VH(B)的表面重塑中的具体框架表面残基变化。
图11是表格，示出了在EGFR-12VL(A)和VH(B)的表面重塑中的具体框架表面残基变化。
图12是EGFR-7VL(A)、EGFR-7VH(B)、EGFR-12VL(C)和EGFR-12VH(D)的表面重塑序列与鼠对应物的比对。
图13是表格，示出了EGFR-7VL(A)和VH(B)的CDR移植中的具体框架表面残基变化。
图14是EGFR-7VL(A)和EGFR-7VH(B)的CDR移植序列与鼠对应物的比对。
图15显示了曲线图，示出了鼠抗体及其对应的人源化抗体对EGFR-6(A)和EGFR-7(B)的结合竞争。
图16显示了曲线图，示出了鼠抗体及其对应的人源化抗体抑制肿瘤细胞生长的能力。
图17显示了曲线图，示出了人源化EGFR-6和EGFR-7R对A431细胞的NK细胞介导的ADCC活性。
图18示出了指定的抗体以及对应的抗体-美登木素偶联物对EGFR-6(A)和EGFR-7(B)的结合曲线。
图19显示了曲线图，示出了指定的抗体和对应的抗体-美登木素偶联物在FaDu(A)和H292(B)细胞系中的细胞毒活性。
图20显示了曲线图，示出了指定的抗体和对应的抗体-美登木素偶联物在H226(A)和SCC-4(B)细胞系中的细胞毒活性。
图21显示了曲线图，示出了在用单剂量的指定抗体和抗体-美登木素偶联物处理的小鼠中H292肿瘤异种移植物的生长。
图22显示了曲线图，示出了在用单剂量的指定抗体和抗体-美登木素偶联物处理的小鼠中FaDu肿瘤异种移植物的生长。
图23显示了曲线图，示出了指定的抗体和偶联物抑制人原代角质形成细胞(A)和H292肿瘤细胞(B)生长的能力。
图24显示了柱状图，示出了在指定的抗体和抗体-美登木素偶联物存在的情况下人原代角质形成细胞产生的CXCL8、CXCL10、CCL5的量。
图25显示了曲线图，示出了在用单剂量3mg/kg huEGFR-7R抗体或huEGFR-7R-SMCC-DM1、或huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1抗体-美登木素偶联物处理的小鼠中H292肿瘤异种移植物的生长。
图26显示了曲线图，示出了在用单剂量5mg/kg huEGFR-7R抗体或huEGFR-7R-SMCC-DM1、或huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1抗体-美登木素偶联物处理的小鼠中HSC2肿瘤异种移植物的生长。
图27显示了曲线图，示出了在用单剂量5mg/kg huEGFR-7R抗体或huEGFR-7R-SMCC-DM1、或huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1抗体-美登木素偶联物处理的小鼠中FaDu肿瘤异种移植物的生长。
图28显示了人和鼠EGFR胞外结构域(ECD)序列的比对。
图29显示了huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII序列的比对。
图30显示了曲线图，示出了huEGFR-7R抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图31显示了曲线图，示出了huEGFR-6抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图32显示了曲线图，示出了muEGFR-7抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图33显示了曲线图，示出了muEGFR-6抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图34显示了曲线图，示出了muEGFR-12抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图35显示了曲线图，示出了muEGFR-13抗体对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
图36显示了曲线图，示出了西妥昔单抗对huEGFR、huEGFRdIII、muEGFRdIII和chEGFRdIII的结合。
发明详述
本发明提供一类新的EGFR结合分子，其部分抑制EGFR信号转导、对EGFR阳性正常上皮细胞(包括原代角质形成细胞)无影响，但对EGFR过表达的肿瘤细胞具有高细胞毒性。另外，抗EGFR抗体的免疫偶联物可增强抗体的抗肿瘤活性。
I.定义
为了有利于理解本发明，下文定义了多个术语和短语。
如本文所用，“表皮生长因子受体”或“EGFR”是指成熟的酪氨酸激酶细胞表面受体。术语“可溶性EGFR”或“sEGFR”是指含EGFR的胞外配体结合结构域的EGFR的一部分。更具体地讲，sEGFR含成熟EGFR的第1-619位氨基酸(Ullrich等,Human Epidermal GrowthFactor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Genein A-431Epidermoid Carcinoma Cells,Nature,Vol.309,418-25(1986))。
短语“EGFR介导的癌症”是指特征在于上皮性肿瘤的癌症，其中EGFR被异常激活到高于正常对应上皮组织中的水平。这些更高水平的EGFR活性在许多类型的癌症中促进肿瘤生长。此类癌症包括但不限于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌和前列腺癌。EGFR的异常激活可因以下方面所致：受体过表达、基因扩增、激活突变、受体配体过表达和/或丧失EGFR活性的调节因子。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体诸如由至少两个完整的抗体生成的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可以是以下五大类免疫球蛋白的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同型)(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，取决于它们重链恒定结构域的性质，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚单元结构和三维构型。抗体可以是裸抗体或偶联到其他分子，诸如毒素、放射性同位素等。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原诸如EGFR的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗性抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可以降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
如本文所用的关于抗体的短语“抑制EGFR激活的能力”旨在指抗体结合到EGFR导致人EGFR激活受到抑制以及在受体激活时出现的人EGFR生物活性受到抑制。测量EGFR生物活性的一个或多个指标(如使用细胞增殖测定法、细胞凋亡测定法、受体结合测定法、受体磷酸化测定法或小鼠肿瘤模型(参见实施例)而确定)可评估抗体抑制EGFR激活的能力。
术语“抗EGFR抗体”或“结合到EGFR的抗体”是指能够以足够的亲和力结合EGFR使得抗体可用作靶向EGFR的诊断和/或治疗剂的抗体。多种抗EGFR抗体在本领域中是已知的。例如，西妥昔单抗(Ab225)和528Ab在美国专利第4,943,533号中有所描述，该专利以引用的方式并入本文。
抗EGFR抗体与不相关的非EGFR蛋白的结合程度可小于抗体结合到EGFR的约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)所测定。在某些实方案中，结合到EGFR的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。
如本文所用，术语“上皮毒性”是指上皮异常或功能障碍，并可在通过施用EGFR抑制剂治疗癌症的患者中表现为选自以下的一种或多种症状或病状：皮疹、痢疾、角膜变薄、毛发萎缩或脱落、毛囊发育不良、退化、坏死或发炎、毛囊间表皮增生或者受伤后无法愈合或延迟愈合，等等。在一个实施方案中，上皮毒性表现为皮肤毒性，诸如痤疮样皮疹或斑丘疹。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”是指在单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合中涉及到的均质性抗体群。这与多克隆抗体形成对比，多克隆抗体则通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”涵盖完整及全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白质以及任何其他包含抗原识别位点的修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通过任何多种方式制备的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指为含有最少非人(如，鼠)序列的特定免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人(例如，鼠)抗体形式。通常，人源化抗体是其中互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠)的CDR残基替换的人免疫球蛋白(Jones等,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种抗体中的相应残基替换。人源化抗体可在Fv骨架区中和/或被替换的非人残基内进一步通过另外残基的置换而修饰，以改善或优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般来讲，人源化抗体将包含至少一个及通常两个或三个下述可变结构域的基本上全部，所述可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的CDR区的全部或基本上全部，而FR区的全部或基本上全部则为人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体还可以包含通常为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。用于生成人源化抗体的方法的实例在美国专利5,225,539中有所描述。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个骨架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR近距离保持在一起，并通过另一条链的CDR有助于形成抗体的抗原结合位点。至少有两种技术可用于确定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，这两种方法的组合在本领域中有时用于确定CDR。
Kabat编号系统通常用在提及可变结构域中的残基时(大约轻链的第1-107位残基和重链的第1-113位残基)(例如，Kabat等,Sequencesof Immunological Interest.第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat中的氨基酸位置编号是指用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统，见于：Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含与可变结构域FR或CDR的缩短或插入相对应的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在H2的第52位残基后的单个氨基酸插入(根据Kabat的第52a位残基)以及在重链FR第82位残基后的插入残基(例如，根据Kabat的第82a、82b和82c位等残基)。对于给定的抗体，可通过在抗体序列同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行比对而确定残基的Kabat编号。相反，Chothia则是指结构环中的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号约定进行编号时在H32与H34之间根据环的长度而存在差异(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B均不存在，则环在第32位结束；如果仅存在35A，则环在第33位结束；如果35A和35B均存在，则环在第34位结束)。AbM高变区代表了KabatCDR与Chothia结构环之间的妥协，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。
术语“人抗体”意指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。对人抗体的这种定义包括完整的或全长抗体、其片段和/或包含至少一条人重链和/或轻链多肽的抗体，诸如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区都对应于具有所需特异性、亲和力和能力的源自一个哺乳动物物种(如小鼠、大鼠、兔子等)的抗体可变区，而恒定区则与源自另一物种(通常为人)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引起免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文可互换使用，并指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原部分。当抗原为多肽时，表位既可由连续氨基酸形成，也可由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时得以保持，而由三级折叠形成的表位在蛋白质变性时则会丧失。一个表位通常以唯一的空间构象包含至少3个更通常至少5个或8-10个氨基酸。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些方法)进行测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并往往容易解离，而高亲和力抗体则更快地结合抗原并往往保持结合更长的时间。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，它们中的任何一种均可用于本发明的目的。具体的示例性实施方案将在下文描述。
“或更佳的”当在本文用于指代结合亲和力时是指分子与其结合伴侣之间更强的结合。“或更佳的”当在本文用于指代更强的结合时由更小的Kd数值表示。例如，对于具有“0.6nM或更佳的”抗原亲和力的抗体，该抗体的抗原亲和力<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等或小于0.6nM的任何值。
所谓“特异性结合”一般是指抗体通过其抗原结合结构域结合到表位并且该结合在抗原结合结构域与表位之间承担一定的互补性。根据该定义，抗体在通过其抗原结合结构域比将会结合到随机、无关表位更容易地结合到某表位时则称为“特异性结合”到该表位。术语“特异性”在本文用于对某抗体结合到某抗原所依靠的相对亲和力进行描述。例如，抗体“A”对于给定的表位可被视为比抗体“B”具有更高的特异性，或者可称抗体“A”以比对于相关表位“D”所具有的特异性更高的特异性结合到表位“C”。
所谓“优先地结合”是指抗体比将结合到相关、相似、同源或类似表位更容易地特异性结合到某表位。因此，“优先地结合”到给定表位的抗体将比结合到某相关表位更容易地结合到所述表位，即使此抗体可与所述相关表位发生交叉反应。
在以下情况中据称抗体“竞争性抑制”参考抗体与给定表位的结合：如果该抗体优先地结合到该表位，以至于在某种程度上阻断参考抗体与表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法测定，例如竞争性ELISA测定法。可称抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合达至少90%、至少80%、至少70%或至少60%或至少50%。
如本文所用的短语“基本上相似”或“基本上相同”是指两个数值(通常一个与本发明的抗体相关，而另一个则与参考/比较抗体相关)之间足够高的相似程度，使得本领域的技术人员将认识到两个值之间的差异在所述值(例如，Kd值)度量的生物学特征的背景下几乎没有或没有生物学和/或统计学显著性。所述两个值之间的差异根据参考/比较抗体的值可小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%或小于约10%。两“基本上相似的结合亲和力”之间的差异根据参考/比较抗体的值通常小于约10%。
如本文所用的“非配体依赖性结合”是指EGFR结合剂在不存在与EGFR的配体相互作用的情况下结合到人EGFR上的表位的能力。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是指不存在于自然界中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括经过纯化达到已不再为自然界中所见形式的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物为基本上纯的。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50%纯(即，不含污染物)、至少90%纯、至少95%纯、至少98%纯或至少99%纯的材料。
如本文所用的术语“免疫偶联物”或“偶联物”是指连接到细胞结合剂(即，抗EGFR抗体或其片段)的化合物或其衍生物，并由以下通式定义：C-L-A，其中C=细胞毒素，L=连接子以及A=细胞结合剂或抗EGFR抗体或抗体片段。免疫偶联物也可由反向的通式A-L-C定义。
“连接子”是能够将化合物通常为药物(例如美登木素)以稳定的共价方式连接到细胞结合剂(例如抗EGFR抗体或其片段)的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，连接子可容易受以下裂解的影响或基本上耐以下裂解：酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。合适的连接子在本领域中是熟知的，包括例如二硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。连接子还可以包括如本文所述的以及本领域已知的带电连接子及其亲水形式。
术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其中一群细胞的特征在于不受控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。“肿瘤”和“赘生物”是指因良性(非癌的)或恶性(癌的)过度细胞生长或增殖(包括癌前病变)而产生的一个或多个细胞。可以治疗和/或防止的“癌症”或“致瘤”疾病的实例包括以下部分的赘生物：腹腔、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法上等同称谓是指源自肿瘤或癌前病变的总细胞群，包括非致瘤性细胞(包括肿瘤细胞群的大部分)和致瘤性干细胞(癌干细胞)两者。如本文所用，术语“肿瘤细胞”在仅指无更新和分化能力的那些肿瘤细胞时将通过术语“非致瘤性”加以修饰，以将那些肿瘤细胞与癌干细胞区分。
术语“受试者”是指将为特定治疗的受体的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类等等。一般来讲，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文可互换使用。
“联合”一种或多种另外的治疗剂施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其以这种剂型以至于允许活性成分的生物活性发挥效果并且不含对将要施用给的受试者具有无法接受毒性的附加组分。制剂可以为无菌的。
如本文所公开的“有效量”的抗体是足以实现具体指定的目的的量。“有效量”可通过经验确定以及在涉及指定的目的时以常规方式确定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的抗体或其他药物的量。就癌症而言，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓或停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓或停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。参见本文关于“治疗”的定义。在药物可防止现有癌细胞生长和/或杀伤现有癌细胞的程度内，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。“预防有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但非必定地，由于预防剂量在疾病之前或疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将低于治疗有效量。
本文所用的词语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接偶联到抗体以便生成“标记”抗体。标记可以本身即可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
“化疗剂”是可用于治疗癌症而不论作用机理的化合物。化疗剂包括例如CD20拮抗剂诸如利妥昔单抗和环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松、氟达拉滨、依托泊苷、甲氨蝶呤、雷利度胺、苯丁酸氮芥、倍他司汀和/或此类化疗剂的修饰版本。
诸如“治疗的”或“治疗”或“以治疗”或“缓解的”或“以缓解”的术语是指以下两者：1)治愈、减缓、减少所诊断的病理状况或病症的症状和/或阻止所述病理状况或病症的进展的治疗措施；以及2)防止和/或减慢所靶向的病理状况或病症的发展的预防或防止措施。因此，需要治疗的那些包括已患有病症的那些；有患有病症倾向的那些；以及要防止其中的病症的那些。在某些实施方案中，如果患者表现出以下一种或多种情况，则根据本发明的方法成功“治疗”了受试者的癌症：减少癌细胞数量或完全不存在癌细胞；减小肿瘤大小；抑制或不存在癌细胞浸润到周围器官，包括例如癌症扩散到软组织和骨骼；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不存在肿瘤生长；缓解与具体癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；改善生活质量；降低肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；降低肿瘤中癌干细胞的数量或频率；致瘤细胞分化成非致瘤状态；或效果的某些组合。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。核苷酸结构的修饰当存在时可在聚合物组装前或组装后赋予。核苷酸的序列可通过非核苷酸组分而中断。多核苷酸可在聚合反应后进一步修饰，诸如通过与标记组分偶联。其他类型的修饰包括例如：“帽”；用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如具有不带电键合(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、碳酸酯等)以及带电键合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含侧基部分的那些，诸如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)；含嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些；含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些；含烷化剂的那些；含修饰键合(例如α异头核酸等)的那些；以及多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可例如被磷酸酯基团、磷酸基团取代，由标准保护基团保护，或被活化以制备与另外核苷酸的另外键合，或者可偶联到固体载体。5'和3'末端OH可以磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基可以衍生化成标准保护基团。多核苷酸还可以包括在本领域中通常熟知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟代-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(诸如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键合可被可选的连接子团替换。这些可选的连接子团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“formacetal”)替换的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代的或未取代的任选地含醚(--O--)键合的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。不是多核苷酸中的所有键合都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送并任选地表达一个或多个目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，诸如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以指代任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分偶联。该定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本发明的多肽基于抗体，因此在某些实施方案中，多肽可作为单链或关联链存在。
在两个或更多个核酸或多肽背景下的术语“相同的”或百分比“同一性”是指在不考虑作为序列同一性一部分的任何保守氨基酸置换的情况下进行最大对应性比较和比对(必要时引入空位)时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。百分比同一性可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查而测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的多种算法和软件在本领域中是已知的。序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中所述的算法，如在Karlin等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所改进，并且并入NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。在某些实施方案中，可如Altschul等,1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402中所述使用Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是另外的可用于序列比对的公开可用软件程序。在某些实施方案中，两核苷酸序列之间的百分比同一性用GCG软件中的GAP程序测定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些可选的实施方案中，可将包含Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序用于确定两氨基酸序列之间的百分比同一性(例如，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。可选地，在某些实施方案中，核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性用Myers和Miller的算法测定(CABIOS,4:11-17(1989))。例如，百分比同一性可使用ALIGN程序(2.0版)并使用具有残基表的PAM120、12的空位长度罚分和4的空位罚分测定。特定比对软件采用的最大比对的合适参数可通过本领域的技术人员确定。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中，将第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的百分比同一性“X”计算为100×(Y/Z)，其中Y为在第一和第二序列的比对(如通过视觉检查或特定的序列比对软件进行比对)中评为相同匹配的氨基酸残基数，而Z为第二序列中的总残基数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的百分比同一性将大于第二序列与第一序列的百分比同一性。
作为非限制性实例，可在某些实施方案中使用Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包,Unix第8版,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI53711)确定任何特定的多核苷酸是否具有与参考序列的某一百分比序列同一性(例如，至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同，以及在一些实施方案中，至少95%、96%、97%、98%或99%相同)。Bestfit使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics2:482489(1981)的局部同源性算法，以找到两序列之间同源性的最佳片段。当根据本发明使用Bestfit或任何其他序列比对程序确定特定序列例如是否与参考序列95%相同时，对参数的设置使得同一性的百分比在参考核苷酸序列的整个长度上计算，并使得允许在参考序列总核苷酸数最多5%的同源性中存在空位。
在一些实施方案中，本发明的两种核酸或多肽基本上相同，也就是说当使用序列比较算法或通过视觉检查进行最大对应性比较和比对时，它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%并在一些实施方案中至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可存在于长度为至少约10个、约20个、约40-60个或其间的任何整数个残基的序列区域上，并可在长于60-80个残基例如至少约90-100个残基的区域上，并且在一些实施方案中，序列在进行比较的序列(诸如核苷酸序列的编码区)的整个长度上基本上相同。
“保守氨基酸置换”是其中将一个氨基酸残基替换为具有相似侧链的另一氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有所定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。在一些实施方案中，在本发明的多肽和抗体序列中的保守置换不会消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(即多肽或抗体所结合的EGFR)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域中是熟知的(参见例如Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:.412-417(1997))。
如在本公开和权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”、“该/所述”也包括复数形式。
应当理解，无论何处本文用语言“包含”来描述实施方案时，也提供以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其他类似实施方案。
本文用在诸如“A和/或B”的短语中的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，用在诸如“A、B和/或C”的短语中的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)和C(单独的)。
II.EGFR结合剂
肿瘤通常过表达结合多种配体并促使肿瘤无限制生长的生长因子受体。此类生长因子受体的一个实例为表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质家族的受体。
通过表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质家族的成员的信号转导依赖于通过配体结合而触发的同源二聚体或异源二聚体的形成。这一受体家族由四种膜结合蛋白质构成：EGFR、HER2/neu、HER3和HER4。这些蛋白质的过表达已在许多类型的癌症中与不良预后存在关联，这些癌症包括但不限于：乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和唾液腺癌。虽然许多小组已开发了靶向EGFR蛋白质家族的各个成员(例如HER2/neu或EGFR)的策略来抑制肿瘤生长，但是尚未证实这些治疗能最终治愈这些形式的癌症。
根据本发明，提供了特异性结合到人EGFR的新型活性剂(例如抗体)。这些新型活性剂部分抑制EGFR信号转导并且对EGFR阳性的正常上皮细胞(包括原代角质形成细胞)无影响。然而，这些活性剂对EGFR过表达的肿瘤细胞具有高细胞毒性。
因此，本发明提供特异性结合人EGFR的活性剂。这些活性剂在本文称为“EGFR结合剂”。在某些实施方案中，EGFR结合剂为抗体、免疫偶联物或多肽。在一些实施方案中，EGFR结合剂为人源化抗体。
在某些实施方案中，EGFR结合剂具有以下效果中的一种或多种：抑制肿瘤细胞增殖、通过降低肿瘤中癌干细胞的频率而降低肿瘤的致瘤性、抑制肿瘤生长、提高存活率、触发肿瘤细胞的细胞死亡、使致瘤细胞分化成非致瘤状态或防止肿瘤细胞转移。
在一些实施方案中，EGFR结合剂能够减小肿瘤体积。EGFR结合剂减小肿瘤体积的能力可例如通过测量%T/C值而评估，该值是将治疗的受试者的中位肿瘤体积除以对照受试者的中位肿瘤体积。在一些实施方案中，用EGFR结合剂治疗导致小于约55%、小于约50%、小于约45%、小于约40%、小于约35%、小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%的%T/C值。
在某些实施方案中，特异性结合人EGFR的免疫偶联物或其他活性剂通过细胞毒性剂触发细胞死亡。例如，在某些实施方案中，将人EGFR的抗体偶联到美登木素，而美登木素则在表达EGFR的肿瘤细胞中通过蛋白质内化而激活。在某些可选的实施方案中，活性剂或抗体未偶联。
在某些实施方案中，EGFR结合剂能够抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，EGFR结合剂能够在活体内(例如，在异种移植小鼠模型中和/或在患有癌症的人中)抑制肿瘤生长。
EGFR结合剂包括EGFR抗体EGFR-6、EGFR-7和EGFR-12及其片段、变体和衍生物。EGFR结合剂还包括特异性与抗体EGFR-6、EGFR-7和EGFR-12结合到相同的EGFR表位的EGFR结合剂。EGFR结合剂还包括竞争性抑制抗体EGFR-6、EGFR-7和EGFR-12的EGFR结合剂。
EGFR结合剂还包括含有EGFR-6、EGFR-7和EGFR-12的重链和轻链CDR序列的EGFR结合剂。EGFR-7和EGFR-12的CDR序列(鼠和人源化的)在下表1和2中描述。
表1：可变重链CDR氨基酸序列
Figure GDA00003449447800301
Figure GDA00003449447800311
表2：可变轻链CDR氨基酸序列
Figure GDA00003449447800312
EGFR结合分子可以为特异性结合到EGFR的抗体或抗原结合片段，其包含EGFR-6、EGFR-7和EGFR-12的CDR，而每个CDR具有最多四个(即，0、1、2、3或4个)保守氨基酸置换。
多肽可包含本文所述的各条可变轻链或可变重链之一。抗体和多肽还可以同时包含可变轻链和可变重链。鼠和人源化EGFR-7和EGFR-12抗体的可变轻链和可变重链序列提供于下表3和4。
表3：可变重链氨基酸序列
Figure GDA00003449447800321
表4:可变轻链氨基酸序列
Figure GDA00003449447800332
Figure GDA00003449447800341
本发明还提供包括以下的多肽：(a)与SEQ ID NO:19-23、69和71-76具有至少约90%序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ IDNO:24-30和70具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括与SEQ ID NO:19-30和69-76具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，该多肽包括：(a)与SEQ ID NO:19-23、69和71-76具有至少约95%序列同一性的多肽，和/或(b)与SEQ IDNO:24-30和70具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括(a)具有SEQ ID NO:19-23、69和71-76的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:24-30和70的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的抗体和/或多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的鼠、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:19-30和69-76具有某一百分比序列同一性的多肽与SEQ ID NO:19-30和69-76的不同之处仅在于保守氨基酸置换。
表5：全长重链和轻链氨基酸序列
Figure GDA00003449447800351
Figure GDA00003449447800361
Figure GDA00003449447800371
Figure GDA00003449447800381
本发明还提供包括以下的多肽：(a)与SEQ ID NO:31、32和36具有至少约90%序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:33-35、37和38具有至少约90%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括与SEQ ID NO:31-38具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，该多肽包括：(a)与SEQ ID NO:31、32和36具有至少约95%序列同一性的多肽，和/或(b)与SEQ ID NO:33-35、37和38具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括(a)具有SEQ ID NO:31、32和36的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:33-35、37和38的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的抗体和/或多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:31-38具有某一百分比序列同一性的多肽与SEQ IDNO:31-38的不同之处仅在于保守氨基酸置换。
在某些实施方案中，EGFR抗体为选自由以下的杂交瘤产生的抗体：ATCC保藏编号PTA-11331(EGFR-6)，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332(EGFR-7)，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333(EGFR-12)，于2010年10月6日保藏在ATCC。在某些实施方案中，该抗体包含选自PTA-11331、PTA-11332和PTA-11333的由杂交瘤产生的抗体的VH-CDR和VL-CDR。
单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的那些方法。使用杂交瘤方法，将小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物如上所述进行免疫，以引起通过淋巴细胞产生将特异性结合到免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可在体外进行免疫。在免疫后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞，然后可将其从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出。然后，可在使用标准方法的体外培养中(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)或在动物体内作为腹水瘤，使产生如通过免疫沉淀法、免疫印迹或通过体外结合测定法(例如放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA))所测定的特异性针对单克隆抗体的杂交瘤繁殖。然后可如上文针对多克隆抗体所述将单克隆抗体从培养基或腹水中纯化。
可选地，单克隆抗体也可使用如美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法制备。将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离，诸如使用特异性扩增编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸引物通过RT-PCR进行分离，然后使用常规程序测定它们的序列。接着将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆进合适的表达载体，其在转染进原本不会产生免疫球蛋白的诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞的宿主细胞中时，由宿主细胞产生单克隆抗体。另外，可如文献所述从表达所需物种CDR的噬菌体展示文库中分离所需物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等,1990,Nature,348:552-554；Clackson等,1991,Nature,352:624-628；和Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
可使用重组DNA技术以多种不同的方式对编码单克隆抗体的多核苷酸进一步修饰，以生成可选的抗体。在一些实施方案中，可将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域替换为1)例如人抗体的那些区域以生成嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽以生成融合抗体。在一些实施方案中，将恒定区截短或移除以生成单克隆抗体的所需抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施方案中，针对人EGFR的单克隆抗体为人源化抗体。在某些实施方案中，此类抗体在施用给人受试者时在治疗学上用于降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)反应。人源化抗体可使用本领域已知的多种技术产生。在某些可选的实施方案中，EGFR的抗体为人抗体。
人抗体可使用本领域已知的多种技术直接制备。可以生成在体外免疫的或从产生针对靶抗原抗体的免疫个体中分离的永生化人B淋巴细胞(参见例如Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer等,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；和美国专利5,750,373)。另外，人抗体可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如在Vaughan等,1996,Nat.Biotech.,14:309-314；Sheets等,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；以及Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581)中所述。生成和使用抗体噬菌体文库的技术还在以下文献中有所描述：美国专利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963号；以及Rothe等,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(其中的每一篇均以引用方式整体并入)。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等,1992,Bio/Technology10:779-783，以引用方式整体并入)在本领域中是已知的并可用于生成高亲和力人抗体。
人源化抗体也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，该基因座在免疫时能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全谱人抗体。该方法在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中有所描述。
本发明还涵盖特异性识别EGFR的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别和结合至少两个不同的表位的抗体。所述不同的表位可在同一分子(例如同一EGFR)内，或在不同的分子上使得例如抗体既可特异性识别和结合EGFR也可特异性识别和结合例如1)白细胞上的效应分子，诸如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)或2)如下文将详细描述的细胞毒性剂。
示例性双特异性抗体可结合到两个不同的表位，其中至少一个起源于本发明的多肽。可选地，可将免疫球蛋白分子的抗抗原臂与结合到白细胞上的触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体的臂结合，以便使细胞防御机制专注于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂导向表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂以及结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。制备双特异性抗体的技术在本领域中是常见的(Millstein等,1983,Nature305:537-539；Brennan等,1985,Science229:81；Suresh等,1986,Methods in Enzymol.121:120；Traunecker等,1991,EMBO J.10:3655-3659；Shalaby等,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny等,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber等,1994,J.Immunol.152:5368；以及美国专利5,731,168)。还涵盖多于两效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等,J.Immunol.147:60(1991))。因此，在某些实施方案中，EGFR的抗体为多特异性的。
在某些实施方案中，提供了抗体片段以例如增强肿瘤渗透。用于产生抗体片段的多种技术是已知的。常规地，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而产生(例如Morimoto等,1993,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods24:107-117；Brennan等,1985,Science,229:81)。在某些实施方案中，抗体片段通过重组法产生。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达以及由其分泌，从而允许产生大量的这些片段。此类抗体片段也可从上述抗体噬菌体文库中分离。抗体片段也可以为例如美国专利5,641,870中所述的线性抗体，并可以为单特异性的或双特异性的。用于产生抗体片段的其他技术对本领域的技术人员将显而易见。
根据本发明，可使技术适于产生对EGFR特异性单链抗体(参见美国专利第4,946,778号)。此外，可使方法适于构建Fab表达文库(Huse,等,Science246:1275-1281(1989))，以允许快速有效地鉴定具有所需EGFR特异性的单克隆Fab片段，或其衍生物、片段、类似物或同系物。可通过本领域的技术产生抗体片段，包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的二硫桥而生成的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而生成的Fab片段；以及(d)Fv片段。
还可能所需的是，尤其是在抗体片段的情况下，对抗体进行修饰以延长其血清半衰期。这可例如通过以下方式实现：通过抗体片段中合适区域的突变将补救受体结合表位并入抗体片段中；或将表位并入肽标签中，然后将肽标签在任一端或中间融合到抗体片段(例如，通过DNA或肽合成)。
异源偶联(heteroconjugate)抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体构成。此类抗体已例如被提出用于将免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)。据设想，可使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备抗体。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键而构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫代化物(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
出于本发明的目的，应当理解，修饰的抗体可包含任何类型的可变区，其提供抗体与人EGFR的多肽的缔合。就这一点而言，可变区可包含或源自可被诱导以引起体液反应并生成针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的哺乳动物的任何类型。因此，修饰抗体的可变区可例如具有人、鼠、非人灵长类(例如食蟹猴、恒河猴等)或狼起源。在一些实施方案中，修饰免疫球蛋白的可变区和恒定区均为人的。在其他实施方案中，可对相容抗体的可变区(通常源自非人来源)进行工程化处理或专门定制以改善结合特性或降低分子的免疫原性。在此方面，可用于本发明的可变区可以人源化或通过包含导入的氨基酸序列而以其他方式改变。
在某些实施方案中，重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部分地替换一个或多个CDR并在必要时通过部分骨架区替换和序列变化而改变。虽然CDR可源自与骨架区源自的抗体同一类或甚至同一亚类的抗体，但是据设想，CDR将源自不同类的抗体并可能源自不同种的抗体。将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一个时，并不总是需要将所有的CDR都替换成供体可变区的完整CDR。相反，在一些情况下，只需要转移保持抗原结合位点活性所必需的那些残基。考虑到在美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762号中所述的解释，本领域的技术人员完全能够通过执行常规实验或通过试错试验而获得具有降低的免疫原性的功能性抗体。
尽管提到对可变区的改变，但是本领域的技术人员将会认识到，本发明的修饰抗体将包括与包含天然或未改变恒定区的免疫原性大致相同的抗体相比时恒定区结构域的一个或多个的至少一部分发生缺失或以其他方式改变以便提供所需的生化特征(诸如增强的肿瘤定位或缩短的血清半衰期)的抗体(例如，全长抗体或其免疫反应性片段)。在一些实施方案中，修饰抗体的恒定区将包括人恒定区。与本发明相容的对恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或置换。也就是说，本文所公开的修饰抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)和/或对轻链恒定结构域(CL)的一者或多者的改变或修饰。在一些实施方案中，涵盖其中一个或多个结构域部分或完全缺失的修饰恒定区。在一些实施方案中，修饰抗体将包括其中整个CH2结构域都被移除的结构域缺失的构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，省去的恒定区结构域将被短氨基酸间隔物(例如10个残基)替换，该间隔物提供一定程度的通常因不存在恒定区而赋予的分子柔性。
除了它们的构型外，本领域还已知恒定区介导多种效应子功能。例如，与抗体互补的C1组分的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中具有重要意义。补体的激活还刺激炎性反应并且还可涉及自身免疫超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合到细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对不同类的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合触发许多重要而各异的生物学反应，包括抗体包被粒子的吞噬和毁坏、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、释放炎症介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白的产生。
在某些实施方案中，EGFR结合抗体提供改变的效应子功能，继而影响所施用的抗体的生物学特征。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可减少循环性修饰抗体的Fc受体结合，从而增强肿瘤定位。在其他情况下，可能的是，根据本发明的恒定区修饰适度补体结合，并因而缩短血清半衰期以及减少偶联的细胞毒素的非特异性缔合。恒定区的其他修饰可用于消除二硫键或寡糖部分，从而可因增强的抗原特异性或抗体柔性而实现增强的定位。相似地，根据本发明的对恒定区的修饰可使用完全在技术人员能力范围内的熟知的生物化学或分子学工程技术而容易地实现。
在某些实施方案中，为抗体的EGFR结合剂不具有一个或多个效应子功能。例如，在一些实施方案中，抗体不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，抗体不结合到Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，抗体不具有效应子功能。
应当注意，在某些实施方案中，可对修饰的抗体进行工程化处理以将CH3结构域直接融合到相应修饰抗体的铰链区。在其他构建体中，可能所需的是在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间提供肽间隔物。例如，可表达其中CH2结构域缺失而剩余的CH3结构域(修饰或未修饰)通过5-20个氨基酸间隔物连接到铰链区的相容构建体。可添加这样的间隔物，例如以确保恒定结构域的调控元件保持自由并可接近，或确保铰链区保持柔性。然而，应该指出的是，氨基酸间隔物可在一些情况下显示出免疫原性并引起针对构建体不想要的免疫反应。因此，在某些实施方案中，添加到构建体的任何间隔物将相对无免疫原性，或甚至完全没有免疫原性，以便维持修饰抗体的所需生化品质。
除了整个恒定区结构域的缺失外，应当理解，可通过少数或甚至单个氨基酸的部分缺失或置换而提供本发明的抗体。例如，在CH2结构域的所选区域中的单个氨基酸突变可足以实质性减少Fc结合并因而增强肿瘤定位。相似地，可能所需的是，只使控制待调节的效应子功能(例如，补体CLQ结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分缺失。恒定区的此类部分缺失可改善抗体的所选特征(血清半衰期)，而保留与完整的受试者恒定区结构域相关的其他所需功能。此外，如上所述，所公开的抗体的恒定区可通过增强所得构建体特征的一个或多个氨基酸的突变或置换而修饰。在该方面，可能的是破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，而基本上维持修饰抗体的构型和免疫特征。某些实施方案可包括向恒定区添加一个或多个氨基酸，以增强所需的特征，诸如减弱或增强效应子功能或提供更多的细胞毒素或碳水化合物附接。在此类实施方案中，可能所需的是，插入或复制源自所选恒定区结构域的特定序列。
本发明进一步包括基本上与本文所示的嵌合、人源化和人抗体或其抗体片段同源的变体和等同物。这些可包含例如保守置换突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸置换。例如，保守置换是指一个氨基酸被同一大类中的另一氨基酸置换，诸如一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸置换。保守氨基酸置换的目的在本领域中是熟知的。
本发明的多肽可以是包含针对人EGFR的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在本领域中应当认识到，本发明的一些氨基酸序列可在不显著影响蛋白质结构或功能的情况下变化。因此，本发明进一步包括表现出显著活性或包含针对EGFR蛋白质的抗体或其片段的区域的多肽变型形式。此类突变体包含缺失、插入、倒位、重复和类型置换。
多肽和类似物可进一步修饰以包含通常不是蛋白质一部分的另外化学部分。那些衍生化的部分可改善溶解性、生物半衰期或蛋白质吸收。所述部分还可以减少或消除蛋白质的任何不良副作用等。这些部分的概述可见于REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第20版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。
本文所述的分离的多肽可通过本领域已知的任何合适的方法产生。此类方法涵盖了从直接的蛋白质合成方法到构建编码分离多肽序列的DNA序列并将那些序列在合适的转化宿主中表达。在一些实施方案中，使用重组技术通过分离或合成编码目标野生型蛋白质的DNA序列而构建DNA序列。任选地，可通过位点特异性诱变对序列进行诱变处理以提供其功能类似物。参见例如Zoeller等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:5662-5066(1984)和美国专利第4,588,585号。
在一些实施方案中，编码目标多肽的DNA序列将通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成方法构建。此类寡核苷酸可基于以下方面而设计：所需多肽的氨基酸序列，以及选择那些在将要产生目标重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子。可将标准方法用于合成编码目标分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，可将完整的氨基酸序列用于构建反向翻译的基因。另外，可以合成包含编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码所需多肽的多个部分的多个小寡核苷酸，然后进行连接。各个寡核苷酸通常包含5'或3'突出，以用于互补组装。
组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)后，将编码目标特定分离多肽的多核苷酸序列插入表达载体并可操作地连接到适合在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。正确的组装可通过以下方法加以确认：核苷酸测序、限制性酶切作图以及在合适的宿主中表达生物活性多肽。本领域熟知的是，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，必须将基因可操作地连接到在所选的表达宿主中为功能性的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方案中，将重组表达载体用于扩增和表达编码针对人EGFR的抗体或其片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码抗EGFR抗体或其片段的多肽链的合成的或源自cDNA的DNA片段，该片段可操作地连接到源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调控序列。转录单元通常包含以下部分的组合件：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子；(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及(3)合适的转录和翻译起始和终止序列，如将在下文详细描述。此类调控元件可包括控制转录的操纵子序列。另外还可以包含通常由复制起点赋予的在宿主中的复制能力以及有利于识别转化体的选择基因。DNA区域在它们彼此功能相关时则为可操作连接的。例如，如果信号肽的DNA作为参与所述多肽分泌的前体而表达，则所述信号肽的DNA(分泌前导序列)可操作地连接到多肽的DNA；如果启动子控制所述序列的转录，则所述启动子可操作地连接到编码序列；或如果核糖体结合位点的定位可使得允许翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。旨在用于酵母表达系统的结构元件包括使得能够通过宿主细胞在胞外分泌翻译蛋白质的先导序列。可选地，如果重组蛋白在没有先导序列或转运序列的情况下表达，则其可以包含N端甲硫氨酸残基。该残基可任选地随后从所表达的重组蛋白上裂解，以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用多种表达宿主/载体组合。可用于真核宿主的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如得自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物；更宽宿主范围的质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。
适合表达EGFR结合多肽或抗体(或将用作抗原的EGFR蛋白质)的宿主细胞包括受合适启动子控制的原核生物、酵母、昆虫或更高等的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高等的真核细胞包括如下所述的哺乳动物源的确立细胞系。也可采用无细胞的翻译系统。适合与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的克隆和表达载体由Pouwels等(CloningVectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)进行了描述，该文献的相关公开内容据此以引用方式并入。关于产生蛋白质(包括产生抗体)的方法的另外信息可见于例如美国专利公布第2008/0187954号、美国专利第6,413,746和6,660,501号以及国际专利公布第WO04009823号，所述专利中的每一篇据此以引用方式整体并入本文。
多种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也有利地用于表达重组蛋白。可在哺乳动物细胞中进行重组蛋白的表达，因为此类蛋白通常正确折叠、适当修饰并具有完整的功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括Gluzman(Cell23:175,1981)所述的猴肾细胞的COS-7细胞系，以及其他能够表达合适载体的细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适的启动子和增强子、和其他5'或3'侧面非转录序列、以及5'或3'非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统在Luckow和Summers,Bio/Technology6:47(1988)中进行了综述。
通过转化宿主产生的蛋白质可根据任何合适的方法纯化。此类标准方法包括层析(例如，离子交换层析、亲和层析和分级柱层析)、离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。可将诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳蛋白序列和谷胱甘肽-S-转移酶的亲和标签附接到蛋白质，以允许通过经过合适的亲和柱而容易地纯化。分离的蛋白质还可使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线晶体学进行物理表征。
例如，可使用市售蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元首先对将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液进行浓缩。在浓缩步骤后，可将浓缩物施加到合适的纯化基质上。可选地，可以采用离子交换树脂，例如具有二乙氨乙基(DEAE)侧基的基质或基材。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或常用于蛋白质纯化的其他类型。可选地，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的多种不溶性基质。最后，可采用使用疏水性RP-HPLC介质(例如具有甲基或其他脂族侧基的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以进一步纯化EGFR结合剂。还可以按多种组合形式采用某些或全部上述纯化步骤，以提供均质的重组蛋白。
在细菌培养中产生的重组蛋白可例如通过以下方法分离：首先从细胞沉淀中提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。可将高效液相色谱(HPLC)用于最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的微生物细胞可通过任何便利的方法破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。
本领域已知用于纯化抗体和其他蛋白质的方法还包括例如在美国专利公布第2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005号中所述的那些，所述专利公布中的每一篇均据此以引用方式整体并入本文。
在某些实施方案中，EGFR结合剂为非抗体的多肽。用于鉴定和产生以高亲和力结合到蛋白靶标的非抗体多肽的多种方法在本领域中是已知的。参见例如Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007)；Hosse等,Protein Science,15:14-27(2006)；Gill等,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658(2006)；Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008)和Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008)，所述文献中的每一篇均以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，噬菌体展示技术已用于鉴定/产生EGFR结合多肽。在某些实施方案中，多肽包括选自以下类型的蛋白质支架：蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。
在一些实施方案中，所述活性剂为非蛋白质分子。在某些实施方案中，所述活性剂为小分子。可用于鉴定非蛋白质EGFR结合剂的组合化学库和技术对本领域的技术人员是已知的。参见例如Kennedy等,J.Comb.Chem,10:345-354(2008)；Dolle等,J.Comb.Chem.,9:855-902(2007)；和Bhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-404(2001)，所述文献的每一篇均以引用方式整体并入本文。在某些进一步的实施方案中，所述活性剂为碳水化合物、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在某些实施方案中，所述活性剂为核酸适配子。适配子是已基于它们结合到另一分子的能力而加以选择(例如，从随机或经诱变处理的库中)的多核苷酸分子。在一些实施方案中，适配子包括DNA多核苷酸。在某些可选的实施方案中，适配子包括RNA多核苷酸。在某些实施方案中，适配子包含一个或多个经修饰的核酸残基。生成和筛选结合到蛋白质的核酸适配子的方法在本领域中是熟知的。参见例如美国专利第5,270,163号、美国专利第5,683,867号、美国专利第5,763,595号、美国专利第6,344,321号、美国专利第7,368,236号、美国专利第5,582,981号、美国专利第5,756,291号、美国专利第5,840,867号、美国专利第7,312,325号、美国专利第7,329,742号、国际专利公布第WO02/077262号、国际专利公布第WO03/070984号、美国专利申请公布第2005/0239134号、美国专利申请公布第2005/0124565号和美国专利申请公布第2008/0227735号，所述专利中的每一篇均以引用方式整体并入本文。
III.免疫偶联物
本发明还涉及包含连接到或偶联到药物或前药的如本文所公开的抗EGFR抗体、抗体片段及其功能等同物的偶联物(也称为免疫偶联物)。合适的药物或前药在本领域中是已知的。该药物或前药可以是细胞毒性剂。用于本发明的细胞毒性偶联物的细胞毒性剂可以是导致细胞死亡、或诱导细胞死亡或以某一方式降低细胞活力的任何化合物，并包括例如美登木素和美登木素类似物。其他合适的细胞毒性剂为例如苯并二氮类、紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素类和倍癌霉素类似物、烯二炔类(诸如卡利奇霉素)、尾海兔素和尾海兔素类似物(包括auristatin类)、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和吗啉代多柔比星。
此类偶联物可通过使用连接子制备，以便将药物或前药连接到抗体或功能等同物。合适的连接子在本领域中是熟知的，并包括例如二硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。
药物或前药可例如通过二硫键连接到抗EGFR抗体或其片段。连接子分子或交联剂包含可与抗EGFR抗体或其片段反应的反应性化学基团。与细胞结合剂反应的反应性化学基团可以为N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。另外，连接子分子包含可以是可与药物反应形成二硫键的二硫代吡啶基的反应性化学基团。连接子分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(参见例如Carlsson等,Biochem.J.,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利第4,563,304号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见美国专利公布第20090274713号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)(参见例如CAS登录号341498-08-6)、2-亚氨基硫烷或乙酰基琥珀酸酐。例如，抗体或细胞结合剂可通过交联试剂修饰，然后将因此衍生的含有游离或保护硫醇基团的抗体或细胞结合剂与含二硫键或硫醇的美登木素反应，以产生偶联物。偶联物可通过色谱法纯化，包括但不限于HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和亲和捕获、渗析或切向流过滤。
在本发明的另一方面，将抗EGFR抗体通过二硫键和聚乙二醇间隔物连接到细胞毒性药物，以增强免疫偶联物的效力、溶解性或功效。此类可裂解的亲水性连接子在WO2009/0134976中有所描述。此连接子设计的另外有益效果是抗体-药物偶联物的所需高单体比和最少聚集。在该方面涵盖了通过具有聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n=1-14)的二硫基(-S-S-)连接的细胞结合剂与药物的偶联物，其具有2-8的窄范围的载药量，对癌细胞表现出相对强效的生物活性，并具有所需的高偶联得率和高单体比以及最少蛋白质聚集的生化特性。
在该方面涵盖了式(I)的抗EGFR抗体药物偶联物或式(I')的偶联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2O–)n–Y–D]m (I)
[D-Y-(–CH2–CH2O–)n–Xl]m-CB   (I')
其中：
CB代表抗EGFR抗体或片段；
D代表药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键附接到细胞结合剂的脂族、芳族或杂环单元；
Y代表通过二硫键附接到药物的脂族、芳族或杂环单元；
l是0或1；
m是2至8的整数；以及
n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。可选地，如在例如美国专利第6,441,163和7,368,565号中所公开，可首先对药物进行修饰以引入适合与细胞结合剂反应的反应性酯。这些含活化的连接子部分的药物与细胞结合剂的反应提供另一种产生细胞结合剂药物偶联物的方法。还可使用PEG连接子将美登木素类连接到抗EGFR抗体或片段，如例如在美国专利6,716,821中所述。这些PEG不可裂解连接子团既可溶于水也可用于非水性溶剂，并可用于将一种或多种细胞毒性剂连接到细胞结合剂。示例性PEG连接基团包括杂双官能PEG连接子，其通过一端的官能巯基或二硫基以及另一端的活性酯在连接子的相对两端与细胞毒性剂和细胞结合剂反应。作为使用PEG连接基团合成细胞毒性偶联物的一般实例，再次参考以引用方式整体并入本文的美国专利6,716,821。合成始于具有反应性PEG部分的一种或多种细胞毒性剂与细胞结合剂反应，从而导致每个反应性PEG部分的末端活性酯被细胞结合剂的氨基酸残基置换，得到包含通过PEG连接基团共价键合到细胞结合剂的一种或多种细胞毒性剂的细胞毒性偶联物。可选地，可将细胞结合剂用双官能PEG交联剂修饰，以引入反应性二硫基部分(诸如吡啶二巯基)，然后可将其用含硫醇的美登木素处理以提供偶联物。在另一种方法中，可将细胞结合剂用双官能PEG交联剂修饰以引入硫醇部分，然后可将其用含反应性二硫基的美登木素(诸如吡啶二巯基)处理，以提供偶联物。
还可以制备具有不可裂解连接子的抗体-美登木素偶联物。此类交联剂在本领域中有所描述(参见美国专利公布第20050169933号)并包括但不限于N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。在一些实施方案中，将抗体用如文献中所述的诸如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基-SMCC、马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺基-MBS或琥珀酰亚胺基碘醋酸酯的交联试剂修饰，以引入1-10个反应性基团(Yoshitake等,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979)；Hashida等,J.Applied Biochem.,56-63(1984)；和Liu等,Biochem.,18:690-697(1979))。然后使修饰的抗体与含硫醇的美登木素衍生物反应，以产生偶联物。偶联物可通过Sephadex G25柱凝胶过滤法或通过渗析法或切向流过滤法而纯化。将修饰的抗体用含硫醇的美登木素处理(1至2摩尔当量/马来酰亚胺基)，再将抗体-美登木素偶联物通过SephadexG-25柱凝胶过滤法、陶瓷羟磷灰石柱层析法、渗析法或切向流过滤法或这些方法的组合进行纯化。通常，每个抗体平均连接1-10个美登木素。一种方法是将抗体用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰以引入马来酰亚胺基，然后将修饰的抗体与含硫醇的美登木素反应以得到硫醚连接的偶联物。同样，得到每个抗体分子含1至10个药物分子的偶联物。以相同的方式制备抗体、抗体片段和其他蛋白质的美登木素偶联物。
在本发明的另一方面，将EGFR抗体通过居间的PEG间隔物经由不可裂解的键合连接到药物。包含在药物与抗EGFR抗体或片段之间形成连接子的亲水性PEG链的合适交联试剂在本领域中也是熟知的，或者可商购获得(例如得自Quanta Biodesign,Powell,Ohio)。合适的含PEG的交联剂也可通过市售的PEG本身用本领域技术人员已知的标准化学合成技术合成。可通过在美国专利公布20090274713和WO2009/0134976中详述的方法使药物与双官能的含PEG的交联剂反应以得到下式的化合物：Z–Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D，然后可与细胞结合剂反应以提供偶联物。可选地，可将细胞结合剂用双官能的PEG交联剂修饰，以引入硫醇反应性基团(诸如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)，然后可将其用含硫醇的美登木素处理以提供偶联物。在另一种方法中，可将细胞结合剂用双官能的PEG交联剂修饰以引入硫醇部分，然后可将其用硫醇反应性美登木素(诸如具有马来酰亚胺或卤代乙酰胺的美登木素)处理，以提供偶联物。
因此，本发明的另一方面为式(II)或式(II')的抗EGFR抗体药物偶联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D]m (II)
[D-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-CB (II')
其中，CB代表抗EGFR抗体或片段；
D代表药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键键合到细胞结合剂的脂族、芳族或杂环单元；
Y代表通过选自以下的共价键键合到药物的脂族、芳族或杂环单元：硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键；
l是0或1；
p是0或1；
m是2至15的整数；以及
n是1至2000的整数。
在一些实施方案中，m是2至8的整数；以及
在一些实施方案中，n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。合适的含PEG的连接子的实例包括具有以下部分的连接子：与抗EGFR抗体或其片段反应的N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分，以及与化合物反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。PEG间隔物可通过本文所述的方法并入本领域已知的任何交联剂中。
本文所公开的许多交联剂在美国专利公布第20050169933和20090274713号中以及在WO2009/0134976中详细描述；它们的内容整体以引用方式并入本文。
本发明包括其中将约2至约8个药物分子(“载药量”)例如美登木素连接到抗EGFR抗体或其片段的方面，该偶联物的抗肿瘤作用与连接到相同细胞结合剂的更低或更高数量的载药量相比有效得多。如本文所用的“载药量”是指可附接到细胞结合剂(例如，抗EGFR抗体或其片段)的药物分子(例如美登木素)的数量。在一个方面，可附接到细胞结合剂的药物分子的数量可在约2至约8的范围内(例如1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。可以使用N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
抗EGFR抗体或其片段可通过使双官能交联剂与抗EGFR抗体或其片段反应而修饰，从而导致交联剂分子共价附接到抗EGFR抗体或其片段。如本文所用，“双官能交联剂”是将细胞结合剂共价连接到药物(诸如本文所述的药物)的任何化学部分。在另一种方法中，通过药物提供连接部分的一部分。在该方面，药物包含连接部分，其为用于将细胞结合剂连接到药物的更大连接子分子的一部分。例如，为了形成美登木素DM1，对美登素的C-3羟基处的侧链进行修饰，以具有游离的巯基基团(SH)。该美登素的巯基化形式可与修饰的细胞结合剂反应，以形成偶联物。因此，最终的连接子由两种组分组装，其中一种由交联剂提供，而另一种由DM1的侧链提供。
药物分子还可通过居间载体分子诸如血清白蛋白连接到抗体分子。
如本文所用，“连接到细胞结合剂”或“连接到抗EGFR抗体或片段”的表述是指包含通过合适的连接子团或其前体结合到细胞结合剂抗EGFR抗体或片段的至少一种药物衍生物的偶联分子。一个连接基团为SMCC。
在某些实施方案中，可用于本发明的细胞毒性剂为美登木素类和美登木素类似物。合适的美登木素类的实例包括美登木醇(maytansinol)和美登木醇类似物的酯。包括与美登木醇和美登木醇类似物一样的抑制微管形成并对哺乳动物具有高度毒性的任何药物。
合适的美登木醇酯的实例包括具有修饰芳环的那些以及在其他位置具有修饰的那些。此类合适的美登木素类在美国专利第4,424,219、4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,450,254、4,322,348、4,371,533、5,208,020、5,416,064、5,475,092、5,585,499、5,846,545、6,333,410、7,276,497和7,473,796号中有所公开。
在某个实施方案中，本发明的免疫偶联物利用正式名称为N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素的含硫醇的美登木素(DM1)作为细胞毒性剂。DM1由以下结构式(III)表示：
Figure GDA00003449447800581
在另一个实施方案中，本发明的偶联物利用含硫醇的美登木素N2’-去乙酰基-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如DM4)作为细胞毒性剂。DM4由以下结构式(IV)表示：
另一种包含具有空间位阻硫醇键的侧链的美登木素为N2’-去乙酰基-N-2’(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(称为DM3)，其由以下结构式(V)表示：
Figure GDA00003449447800583
在美国专利第5,208,020和7,276,497号中教导的美登木素类的每一种也可用于本发明的偶联物。就这一点而言，5,208,020和7,276,697的整个公开内容以引用方式并入本文。
美登木素类上的许多位置可作为对连接部分进行化学连接的位置。例如，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位以及具有羟基的C-20位均预计可以使用。在一些实施方案中，C-3位作为对连接部分进行化学连接的位置，并且在一些特定实施方案中，美登木醇的C-3位用作对连接部分进行化学连接的位置。
一些偶联物的结构表征显示如下：
Figure GDA00003449447800591
Figure GDA00003449447800601
Figure GDA00003449447800611
用于产生此类抗体-美登木素偶联物的多篇描述在美国专利第6,333,410、6,441,163、6,716,821和7,368,565号中提供，所述专利中的每一篇均整体并入本文中。
一般来讲，可将水性缓冲液中的抗体溶液用摩尔过量的具有带反应性基团的二硫基部分的美登木素类孵育。可将反应混合物通过添加过量的胺(诸如乙醇胺、牛磺酸等)而猝灭。然后可通过凝胶过滤法纯化美登木素-抗体偶联物。
每个抗体分子结合的美登木素分子的数量可通过在252nm和280nm处分光光度测量吸光度比而确定。美登木素分子/抗体的平均数可例如为1-10或2-5。
蒽环类化合物及其衍生物、中间体和修饰版本也可用于制备抗EGFR免疫偶联物。例如，可将多柔比星、多柔比星衍生物、多柔比星中间体和修饰的多柔比星用于抗EGFR偶联物。示例性化合物在WO2010/009124中有所描述，该专利以引用方式整体并入本文。此类化合物包括例如下式的化合物：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，并且R2为C1-Cs烷氧基，或其药学上可接受的盐。
可在体外对抗体与美登木素或其他药物的偶联物抑制多种不想要的细胞系增殖的能力进行评估。例如，可将诸如NCI-H226、NCI-H292和NCI-H322M的细胞系容易地用于评估这些化合物的细胞毒性。可将待评估的细胞暴露于化合物4至5天，然后通过已知的方法在直接测定法中测量细胞的存活分率。然后可通过测定法的结果计算IC50值。
免疫偶联物可根据本文所述的一些实施方案内化到细胞中。因此，免疫偶联物可在通过EGFR表达细胞摄取或内化时发挥治疗作用。在一些特定实施方案中，免疫偶联物包含通过可裂解的连接子连接到细胞毒性剂的抗体、抗体片段或多肽，并且将细胞毒性剂从抗体、抗体片段或多肽裂解，其中其由EGFR表达细胞内化。
在一些实施方案中，免疫偶联物能够减小肿瘤体积。例如，在一些实施方案中，用免疫偶联物治疗导致小于约50%、小于约45%、小于约40%、小于约35%、小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%或小于约5%的%T/C值。
在本发明的另一方面，可将siRNA分子而非药物连接到本发明的抗体。可通过常用于修饰寡核苷酸的方法将siRNA连接到本发明的抗体(参见例如美国专利公布20050107325和20070213292)。因此，可使以其3’或5’-亚磷酰胺形式的siRNA与具有羟基官能团的交联剂的一个末端反应，以在siRNA与交联剂之间形成酯键。相似地，siRNA亚磷酰胺与具有末端氨基的交联剂反应导致交联剂通过胺连接到siRNA。可选地，可将siRNA通过标准化学方法衍生化，以引入硫醇基团。可使该含硫醇的siRNA与经过修饰以引入活性二硫基或马来酰亚胺部分的抗体反应，以产生可裂解的或不可裂解的偶联物。可通过该方法将1-20个siRNA分子连接到抗体。
III.多核苷酸
在某些实施方案中，本发明涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包括编码特异性结合EGFR的多肽或此多肽片段的多核苷酸。例如，本发明提供一种多核苷酸，其包含编码人EGFR抗体或编码此抗体片段的核酸序列。本发明的多核苷酸可以是RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA；以及可以为双链或单链的，并且如果为单链的则可以为编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，多核苷酸为分离的。在某些实施方案中，多核苷酸为基本上纯的。
本发明提供一种多核苷酸，其包括编码含有选自SEQ ID NO:1-38和69-76的序列的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供包含选自下表7-9中所示的那些序列的多核苷酸。
表7：可变重链多核苷酸序列
Figure GDA00003449447800641
Figure GDA00003449447800651
表8：可变轻链多核苷酸序列
Figure GDA00003449447800662
Figure GDA00003449447800671
表9：全长重链和轻链多核苷酸序列
Figure GDA00003449447800681
Figure GDA00003449447800691
Figure GDA00003449447800701
Figure GDA00003449447800711
Figure GDA00003449447800731
Figure GDA00003449447800741
本发明还提供与SEQ ID NO:39-58、77-84具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多核苷酸。因此，在某些实施方案中，该多肽包括：(a)与SEQ IDNO:39-43、51、54、56、77-80或82-84具有至少约95%序列同一性的多肽，和/或(b)与SEQ ID NO:44-50、52、53、55、57、58、81具有至少约95%序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括(a)具有SEQ ID NO:39-43、51、54、56、77-80或82-84的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:44-50、52、53、55、57、58、81的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合到例如有助于从宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸(例如，用作控制多肽从细胞转运的分泌序列的先导序列)。具有先导序列的多肽为前蛋白，并可具有由宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽的先导序列。多核苷酸还可编码为成熟蛋白质外加5'氨基酸残基的前蛋白。具有前序列的成熟蛋白质为前蛋白并为蛋白质的无活性形式。将前序列裂解后，留下活性成熟蛋白质。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合到允许例如纯化编码多肽的标记序列。例如，就细菌宿主而言，标记序列可以是由pQE-9载体提供的六聚组氨酸标签，以提供融合到标记的成熟多肽的纯化；或者当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标记序列可以是源自流感病毒血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
本发明进一步涉及上文所述的编码例如片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含产生沉默置换、添加或缺失但不改变编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，核苷酸变体因遗传密码的简并性通过沉默置换而产生。可出于多种原因产生多核苷酸变体，例如以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主诸如大肠杆菌偏好的那些密码子)。
本发明还提供包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的EGFR结合剂(包括抗体、免疫偶联物和多肽)可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如治疗癌症。在某些实施方案中，所述活性剂可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积和/或降低肿瘤的致肿瘤性。使用方法可以是体外、间接体内或体内方法。在某些实施方案中，EGFR结合剂或抗体或免疫偶联物或多肽不拮抗其所结合到的人EGFR。
在一个方面，本发明的抗EGFR抗体和免疫偶联物可用于检测生物样品中EGFR的存在性。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。
在一个方面，本发明提供检测生物样品中EGFR的存在性的方法。在某些实施方案中，该方法包括将生物样品与抗EGFR抗体在允许抗EGFR抗体结合到EGFR的条件下接触，并检测在抗EGFR抗体与EGFR之间是否形成了复合物。
在一个方面，本发明提供诊断与EGFR的表达增加相关的病症的方法。在某些实施方案中，该方法包括：将供试细胞与抗EGFR抗体接触；通过检测抗EGFR抗体与EGFR的结合测定供试细胞的EGFR表达水平(定量或定性地)；以及将供试细胞的EGFR表达水平与对照细胞(例如，与供试细胞来源于相同组织的正常细胞，或与此正常细胞的EGFR表达水平相当的细胞)的EGFR表达水平进行比较，其中与对照细胞相比供试细胞表达更高水平的EGFR则表示存在与EGFR的表达增加相关的病症。在某些实施方案中，该供试细胞得自疑似患有与EGFR表达增加相关的病症的个体。在某些实施方案中，该病症为细胞增生性病症，诸如癌症或肿瘤。
在某些实施方案中，如上所述的那些诊断或检测方法包括检测抗EGFR抗体与在细胞表面上表达的EGFR的结合或与由在其表面上表达EGFR的细胞获得的细胞膜制备物中的EGFR的结合。在某些实施方案中，该方法包括将细胞与抗EGFR抗体在允许抗EGFR抗体结合到EGFR的条件下接触，并检测在抗EGFR抗体与细胞表面上的EGFR之间是否形成了复合物。用于检测抗EGFR抗体与在细胞表面上表达的EGFR的结合的示例性测定法为“FACS”测定。
某些其他方法可用于检测抗EGFR抗体与EGFR的结合。此类方法包括但不限于在本领域熟知的抗原结合测定法，诸如蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施方案中，对抗EGFR抗体进行标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用而间接检测的部分(诸如酶或配体)。
在某些实施方案中，将抗EGFR抗体固定到不溶性基质上。固定作用使得抗EGFR抗体与在溶液中保持游离的任何EGFR分离。这通常通过以下方式实现：在测定程序前使抗EGFR抗体不溶，如通过吸附到水不溶性基质或表面(Bennich等，美国专利第3,720,760号)或通过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)；或者在抗EGFR抗体与EGFR之间形成复合物后使抗EGFR抗体不溶，例如通过免疫沉淀法。
可替代抗EGFR抗体或除了抗EGFR抗体外，使用本发明的免疫偶联物执行诊断或检测的任何上述实施方案。
在某些实施方案中，用EGFR结合剂或拮抗剂(例如抗EGFR抗体)治疗的疾病为癌症。在某些实施方案中，该癌症的特征在于EGFR结合剂(如抗体)结合到的EGFR表达细胞。
在进一步的方面，本发明涉及用于治疗其中存在EGFR表达，尤其是其中存在EGFR异常表达(例如过表达)细胞增生病症的改进方法，所述细胞增生病症包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌和肾癌，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗EGFR结合剂施用给对其有需要的人受试者。在另一个实施方案中，抗体为人源化的。可通过本发明的抗EGFR结合剂治疗的细胞增生病症的实例包括但不限于位于以下部分中的赘生物：腹腔、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。
相似地，其他细胞增生病症也可通过本发明的抗EGFR结合剂治疗。此类细胞增生病症的实例除了肿瘤形成外还包括但不限于位于上列器官系统中的：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(赫克病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其他细胞增生疾病。
本发明进一步提供使用本文所述的抗体或其他活性剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将细胞与EGFR结合剂(例如抗体)在体外接触。例如，将表达EGFR的永生化细胞系或癌细胞系在向其中加入了抗体或其他活性剂以抑制肿瘤生长的培养基中培养。在一些实施方案中，从患者样本诸如组织活检样本、胸膜积液或血样中分离肿瘤细胞，然后在向其中加入了EGFR结合剂以抑制肿瘤生长的培养基中培养。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将肿瘤或肿瘤细胞与EGFR结合剂(例如抗体)在体内接触。在某些实施方案中，将肿瘤或肿瘤细胞与EGFR结合剂接触在动物模型中进行。例如，可将EGFR结合剂施用给已在免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID小鼠)中生长的表达一种或多种EGFR的异种移植物以抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，从患者样本诸如组织活检样本、胸膜积液或血样中分离癌干细胞，再注射到免疫缺陷小鼠中，然后向其施用EGFR结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，在将致瘤细胞引入动物中的同时或短时间后施用EGFR结合剂，以防止肿瘤生长。在一些实施方案中，在致瘤细胞已长到指定的大小后，将EGFR结合剂作为治疗剂施用。
在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的EGFR结合剂。在某些实施方案中，受试者为人。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤或已摘除了肿瘤。
在某些实施方案中，肿瘤表达EGFR结合剂或抗体结合到的EGFR。
此外，本发明提供一种降低受试者中肿瘤的致肿瘤性的方法，包括向受试者施用治疗有效量的EGFR结合剂。在某些实施方案中，肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方案中，肿瘤中癌干细胞的频率通过施用所述活性剂而降低。
本发明进一步提供将致瘤细胞分化成非致瘤细胞的方法，包括将致瘤细胞与EGFR结合剂接触(例如，通过将EGFR结合剂施用给具有含致瘤细胞的肿瘤或已摘除了这种肿瘤的受试者)。
本发明还提供了本文所述的EGFR结合剂、多肽或抗体诱导细胞(包括但不限于肿瘤细胞)分化的用途。例如，设想了包括将细胞与有效量的本文所述的EGFR结合剂(例如抗EGFR抗体)接触的诱导细胞分化的方法。本发明还提供了包括将治疗有效量的EGFR结合剂、多肽或抗体施用给受试者而诱导受试者中肿瘤细胞分化的方法。在某些实施方案中，肿瘤为胰腺肿瘤。在某些其他实施方案中，肿瘤为结肠肿瘤。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的EGFR结合剂、多肽或抗体。
本发明还提供包含本文所述的EGFR结合剂的一种或多种的药物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的媒介物。这些药物组合可用于抑制肿瘤生长并治疗人患者的癌症。
在某些实施方案中，通过将本发明的纯化抗体或活性剂与药学上可接上的媒介物(例如载体、赋形剂)组合而制备制剂以便储存和使用(Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第20版,MackPublishing,2000)。合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于：无毒缓冲剂，诸如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；以及非离子表面活性剂，诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以任何多种方式施用以用于局部或全身治疗。施用可以经局部(诸如施用到粘膜，包括阴道和直肠递送)，诸如透皮贴片、油膏剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末剂；肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)；口腔；或肠胃外，包括静脉、动脉、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内(如鞘内或心室内)施用。
本发明的抗体或免疫偶联物可在药物复合制剂或给药方案中与具有抗癌性质的第二化合物组合作为联合疗法。药物复合制剂或给药方案的第二化合物可具有与复合制剂的ADC的互补活性，使得它们不对彼此造成不利影响。本发明还提供包含EGFR结合剂和第二种抗癌剂的药物组合物。
对于疾病的治疗，本发明的抗体或活性剂的合适剂量取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重性和病程、疾病的反应性、抗体或活性剂是否用于治疗还是预防目的、之前的疗法、患者的临床史等等，它们均由治疗医生决定。抗体或活性剂可一次性施用或持续数天至数月经一系列治疗而施用，或直到实现治愈或实现疾病状态的缓解(例如，肿瘤体积减小)。最佳给药方案可以通过患者体内药物蓄积的测量值而计算，并将根据各抗体或活性剂的相对效能而变化。施用医生可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，剂量为0.01μg至100mg每kg体重，并可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方案中，抗体或其他EGFR结合剂每两周给予一次或每三周给予一次。在某些实施方案中，抗体或其他EGFR结合剂的剂量为约0.1mg至约20mg每kg体重。治疗医生可以基于药物在体液或组织中测得的停留时间和浓度而估计重复率。
联合治疗可提供“协同效应”以及显示出“协同性”，即当一起使用的活性成分大于单独使用化合物导致的效应总和时而实现的效应。当按以下方式使用活性成分时可以获得协同效应：(1)在复合单位剂量制剂中共配制并同时施用或递送；(2)通过作为单独的制剂交替地或平行地递送；或(3)通过某些其他方案。当在交替疗法中递送时，当将化合物按顺序施用或递送例如通过单独注射器的不同注射而施用时，可获得协同效应。一般来讲，在交替疗法期间，将各活性成分的有效剂量按顺序施用，即连续地施用，而在联合疗法中，将两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。
VI.包含EGFR结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文所述的抗体、免疫偶联物或其他活性剂并可用于执行本文所述的方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种针对EGFR的纯化抗体。在一些实施方案中，该试剂盒包含执行检测测定所必需的和/或足够的所有组成部分，包括执行测定的所有对照、说明书以及分析和展示结果所必需的任何软件。本领域的技术人员将容易地认识到，本发明所公开的抗体、免疫偶联物或其他活性剂可容易地包含于在本领域熟知的既定试剂盒格式的一种中。
本发明进一步提供包含EGFR结合剂(例如EGFR结合抗体)以及第二种抗癌剂的试剂盒。在某些实施方案中，第二种抗癌剂为化疗剂(例如利妥昔单抗)。
实施例
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是用于示例性目的，并且本领域的技术人员将想到对其各种修改或更改，而这些修改或更改也将落在本申请的精神和范围内。
实施例1
产生鼠EGFR抗体
为了产生鼠抗EGFR抗体，以5×106个细胞每只小鼠的剂量每2周一次持续5次，将头颈鳞状细胞癌细胞系诸如CA922(JapaneseCollection of Research Bioresources(JCRB),Shinjuku,Japan)和HSC4(JCRB,Shinjuku,Japan)皮下注射进Balb/c雌性小鼠(Charles RiverLaboratory,Wilmington,MA)。在为了产生杂交瘤而处死的前三天，免疫小鼠接受腹膜内注射另一剂量的抗原。根据标准动物方案采集小鼠脾脏，在两张无菌、磨砂显微载玻片之间磨碎，得到RPMI-1640培养基中的单细胞悬液。在将红细胞用ACK裂解缓冲液裂解后，接下来将脾细胞与鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(P3细胞)(J.F.Kearney等.1979,J Immunol,123:1548-1550)以1个P3细胞:3个脾细胞的比率混合。对脾细胞和P3细胞的混合物进行洗涤，并在室温下在融合培养基(0.3M甘露糖醇/D-山梨醇、0.1mM CaCl2、0.5mM MgCl2和1mg/mlBSA)中用链霉蛋白酶处理3min。通过添加FBS(胎牛血清，Invitrogen)终止反应；然后洗涤细胞，重悬在2ml冷的融合培养基中，用BTXECM2001电融合机(Harvard Apparatus)融合。将融合的细胞轻轻加到含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(Sigma Aldrich)的RPMI-1640选择培养基中，在37℃孵育20min，然后以200μl/孔的密度接种到平底96孔板中。然后将平板在5%CO2培养箱和37℃下孵育，直到杂交瘤克隆可用于抗体筛选。也可以使用用于免疫和杂交瘤产生的其他技术，包括在J.Langone和H.Vunakis(编辑,Methods in Enzymology,Vol.121,"Immunochemical Techniques,Part I";Academic Press,Florida)以及E.Harlow和D.Lane("Antibodies:A Laboratory Manual";1988;Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,NY)中所述的那些技术。
鼠杂交瘤筛选和选择
使用流式细胞术结合测定通过未处理或经EGF(R&D Systems)处理的免疫细胞进行了杂交瘤筛选。由于用EGF孵育下调了细胞表面上的EGFR水平，因此EGFR特异性杂交瘤上清液将只与未处理的细胞反应而不与经EGF处理的细胞反应。将用于筛选的细胞首先在无血清培养基中过夜培养，然后分离成两个部分。将一部分细胞不进行处理，将另一部分在37℃下用EGF处理3小时。将经EGF处理的细胞用CellTraceTM far red DDAO-SE(Invitrogen)标记，与未处理的细胞按1:1的比率混合，然后在冰上用杂交瘤上清液孵育2小时。然后洗涤细胞，用FITC标记的抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch)孵育，洗涤，用福尔马林固定，再使用FACScalibur(BD Bioscience)分析。将EGFR特异性杂交瘤扩增，将上清液通过ELISA使用可溶性重组人EGFR胞外结构域(RELIATech)作为抗原而重新筛选。使用流式细胞术结合测定通过人EGFR表达A431表皮癌细胞系(ATCC)和猴EGFR表达Vero细胞系(非洲绿猴肾上皮细胞系)(ATCC)进行重新筛选阳性杂交瘤。简而言之，将杂交瘤上清液用A431细胞和DDAO标记的Vero细胞在冰上孵育1小时。将细胞洗涤两次，然后用PE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch)在冰上孵育1小时。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤，在福尔马林中固定，再使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析。
对与人和鼠抗原均发生反应的阳性杂交瘤克隆抑制EGFR过表达HCC827细胞(ATCC)基底增殖的能力进行测试。简而言之，将指数生长的HCC827细胞以2000个细胞/孔铺到96孔板的100μl含10%FBS的完整培养基中。将100μl杂交瘤上清液加到细胞中，将混合物在37℃下在潮湿的5%CO2培养箱中孵育5天。使用比色WST-8测定法(Dojindo Molecular Technologies,Rockville,MD)测定了细胞增殖水平。WST-8经活细胞中的脱氢酶还原成可溶于组织培养基的橙色甲臜产物，所产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。将WST-8最终量的10%加到各孔中，将平板在37℃下再孵育2-4h。然后通过在Spectra Max M2酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中在450nm处测量吸光度(A450)对平板进行分析。将仅含培养基和WST-8的孔的背景A450吸光度从所有值中减去。通过将各个经处理的样品的值除以未处理细胞的孔的平均值而计算存活分率(存活分率=(A450处理的样品–A450背景)/(A450未处理的样品–A450背景))。对结果归一化，使得存活分率0表示无细胞的孔的值，而1则表示无任何EGFR抗体的含血清培养基中的细胞增殖水平。通过有限稀释将抑制至少50%HCC827细胞生长的杂交瘤克隆进行亚克隆。从每个杂交瘤中选择一个通过流式细胞术分析而表现出与亲代细胞相同的针对EGFR反应性的亚克隆，用于后续分析。对稳定的亚克隆进行培养，将抗体使用商业分型试剂(Roche)进行分型。
抗体纯化
使用标准方法诸如蛋白A或G层析(HiTrap Protein A或G HP,1mL,Amersham Biosciences)将抗体从杂交瘤亚克隆上清液中纯化。简而言之，通过加入1/10体积的1M Tris/HCl缓冲液(pH8.0)制备层析用上清液。将经过pH调节的上清液通过0.22μm滤膜过滤，然后上样到用结合缓冲液(PBS,pH7.3)平衡的柱子上。将柱子用结合缓冲液洗涤，直到获得在280nm处无吸光度的稳定基线。将抗体用含有0.15M NaCl的0.1M乙酸缓冲液(pH2.8)用0.5mL/min的流速洗脱。收集大约0.25mL的馏分，并通过添加1/10体积的1M Tris/HCl(pH8.0)中和。将峰馏分针对1×PBS过夜渗析两次，再通过0.2μm滤膜过滤而除菌。将纯化的抗体通过A280吸光度定量。
将蛋白A纯化的馏分使用离子交换层析(IEX)进一步提纯，其中将季铵盐(Q)层析用于鼠抗体。简而言之，将蛋白A纯化的样品缓冲交换到结合缓冲液(10mM Tris，10mM氯化钠，pH8.0)中并经0.22μm过滤器过滤。然后将制备好的样品上样到已用120cm/hr流速的结合缓冲液平衡的Q快速流树脂(GE Lifesciences)。对柱子大小进行选择以具有足够的容量结合样品中的所有MAb。然后将柱子用结合缓冲液洗涤，直到得到280nm处无吸光度的稳定基线。将抗体经20倍柱体积(CV)的10mM至500mM氯化钠梯度洗脱。基于280nm处的吸光度测量值(A280)收集峰馏分。使用Agilent HPLC1100系统(Agilent,Santa Clara,CA)在带有SWXL保护柱,6.0×40mm(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)的TSK凝胶G3000SWXL,7.8×300mm柱上通过尺寸排阻色谱(SEC)评估单体的百分比。汇集单体含量高于95%的馏分，使用TFF系统缓冲交换到PBS(pH7.4)中，然后通过经0.2μm滤膜过滤而除菌。使用1.47的消光系数通过A280确定纯化抗体的IgG浓度。将可选的方法诸如陶瓷羟基磷灰石(CHT)也用于以高选择性提纯抗体。将具有40μm粒度的II型CHT树脂(Bio-Rad Laboratories)与针对IEX层析所述的相似方案一起使用。CHT的结合缓冲液对应于20mM磷酸钠(pH7.0)，将抗体经20CV的20-160mM磷酸钠梯度洗脱。
实施例2
对人和猴EGFR抗原的结合亲和力
为了确定EGFR抗体对人和猴抗原的结合亲和力，将EGFR表达人肿瘤细胞系诸如MDA-MB468(ATCC)和A431(ATCC)以及Vero猴肾细胞系(ATCC)用于流式细胞术结合测定。简而言之，将细胞用多种浓度的EGFR抗体在4℃下孵育1h。洗涤细胞，用PE偶联的二抗(Jackson Immunoresearch)在4℃孵育1h。接下来再次洗涤细胞，固定在福尔马林中，在FACSarray(BD Bioscience)中分析。为了确定这些抗体的结合亲和力，在半对数图中针对抗体浓度绘制几何平均荧光强度。通过非线性回归生成剂量反应曲线，使用GraphPad Prism v4(GraphPad software)计算对应于各抗体的表观解离常数(Kd)的曲线的EC50值。本发明的EGFR抗体以及阳性对照抗体西妥昔单抗和帕尼单抗对人肿瘤细胞和猴Vero细胞均表现出强特异性结合。图1所示的表格列出了各抗体对人和猴EGFR的Kd。本发明的EGFR抗体对人和猴抗原均表现出相似的强结合亲和力。
实施例3
配体诱导型EGFR激活的抑制
EGFR配体结合诱导EGFR磷酸化，然后激活下游信号转导通路。为了调查抗EGFR抗体在配体诱导型EGFR激活中的作用，使用MDA-MB468肿瘤细胞系和成人原代角质形成细胞执行了蛋白质印迹分析。简而言之，将细胞以1e6个细胞/孔的密度接种到6孔板中，在正常培养基中过夜培养。洗涤细胞，在37℃下在含有0.1%BSA的无血清培养基中饥饿处理2小时。将10μg/ml的抗体加到细胞中，将混合物在37℃下孵育3小时。将50ng/ml的EGF(R&D Systems)加到混合物中，在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用冰冷的PBS洗涤，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。将蛋白裂解物在SDS-PAGE中分离，然后转移到硝酸纤维素膜。将膜用5%BSA封闭，用抗磷酸酪氨酸抗体(clone4G10,Millipore)在4℃下过夜孵育。对膜进行洗涤，用HRP偶联的抗小鼠抗体(Jackson Immunoresearch)在室温下孵育1小时，然后再次洗涤。将信号用ECL(增强化学发光)系统(GE Healthcare)检测。为了确保将等量的蛋白质上样到各泳道中，将膜洗脱并用抗β-微管蛋白抗体(Sigma Aldrich)重新检测。
如图2所示，EGF刺激在MDA-MB468细胞和人原代角质形成细胞中均导致了强EGFR磷酸化。用西妥昔单抗和帕尼单抗处理细胞强烈抑制了EGF诱导的EGFR磷酸化，而本发明的EGFR抗体未完全抑制EGFR激活。将抗KTI(Kunitz胰蛋白酶抑制剂)抗体(由得自ATCC的杂交瘤产生)用作阴性对照。
实施例4
EGFR抗体的激动活性
为了调查本发明的EGFR抗体在不存在EGFR配体的情况下对EGFR信号转导的作用，将MDA-MB468肿瘤细胞如实施例5中所述在无血清培养基中进行饥饿处理。然后将细胞在37℃下用10μg/ml的EGFR抗体处理3小时。作为阳性对照，将未处理的细胞用50ng/ml的EGF在37℃下孵育15分钟。制备蛋白质裂解物，并如实施例5中所述用蛋白质印迹进行分析。代表性结果在图3中示出。EGF处理明显地诱导了MDA-MB468细胞中的强EGFR磷酸化，而本发明的EGFR抗体在不存在配体的情况下未影响EGFR信号转导。
实施例5
配体结合竞争
EGFR信号转导抑制的一种机理是配体结合的阻断。为了研究EGFR抗体是否抑制配体结合到EGFR，在存在抗EGFR抗体的情况下通过流式细胞术测量生物素化EGFR配体与A431细胞的结合。使用EZ-link Micro Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(Pierce,Rockland,IL)根据制造商的说明进行TGFα的生物素化。生物素化的EGF得自Invitrogen。在竞争测定前，建立生物素化配体的结合曲线。将不同浓度的抗EGFR抗体与生物素化配体在EC50浓度(对于EGF和TGFa分别为1.8nM和10nM)下预混，将混合物与细胞在冰上孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，再用链霉亲和素-APC偶联物(Jackson Immunoresearch)在冰上孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，在FACS Calibur(BD Bioscience)中使用FlowJo程序(Tree Star)进行分析。在半对数图中针对抗体浓度绘制几何平均荧光强度。如图4中所示，阴性对照抗体即抗KTI抗体不影响配体结合，而所有的抗EGFR抗体都通过以下EC50竞争配体结合(表10)。
表10
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本发明的EGFR抗体通过与西妥昔单抗相似的EC50完全阻断了TGFa和EGF结合(图4和表10)。这一结果无法解释西妥昔单抗和本发明的EGFR抗体对配体诱导型EGFR信号转导(实施例3)和正常上皮细胞系(包括人原代角质形成细胞)生长(实施例6)的差异作用。
实施例6
人原代角质形成细胞和正常上皮细胞系的生长抑制测定
皮肤、胃肠道和其他器官中的人正常基底上皮细胞在生理上表达EGFR。这些组织中的EGFR信号转导对于上皮细胞生长至关重要。西妥昔单抗和帕尼单抗以及小酪氨酸激酶抑制剂诸如埃罗替尼和吉非替尼对EGFR信号转导通路的破坏导致显著的皮肤毒性。为了模拟皮肤和其他上皮细胞中的潜在毒性，制定了使用人原代角质形成细胞(Invitrogen)和非致瘤乳腺上皮细胞系MCF10A(ATCC)的增殖测定。在该测定中，按制造商的建议将细胞以1,500-2,000个细胞/孔铺到含有EGFR配体的培养基中，并用抗EGFR抗体在37℃下孵育5天。在角质形成细胞测定中(图5)，使细胞在存在1nM EGF与不同浓度的抗体的情况下生长。而在MCF10A细胞测定中(图6)，使细胞在存在10nM EGF与固定浓度(10μg/ml)的抗体的情况下生长。如实施例1中所述，使用比色WST-8测定法(Dojindo Molecular Technologies,Rockville,MD)测量了细胞增殖水平。通过将各个经处理的样品的值除以未处理细胞的孔的平均值而计算存活分率(存活分率=(A450处理的样品–A450背景)/(A450未处理的样品–A450背景))。对结果归一化，使得0表示不存在EGF时的细胞增殖水平，而1则表示在存在EGF但无任何抗EGFR抗体处理的情况下的细胞增殖水平。
在进行增殖测定前，确认了抗EGFR抗体与人原代角质形成细胞以及MCF10A细胞的结合。角质形成细胞增殖测定的代表性结果在图5中示出。如通过毒性特征所预知，西妥昔单抗和帕尼单抗以剂量反应性方式强烈抑制了角质形成细胞增殖，西妥昔单抗的最大抑制为40%，而帕尼单抗的最大抑制为78%。令人惊讶的是，本发明的EGFR抗体与阴性对照嵌合KTI抗体相似对角质形成细胞几乎无影响或无影响。该结果在MCF10A增殖测定(图6)中得到了确认。西妥昔单抗和帕尼单抗强烈抑制了MCF10A细胞增殖，而本发明的EGFR抗体则对MCF10A细胞生长几乎无影响或无影响。这些数据表明，本发明的EGFR抗体对表达EGFR的正常上皮细胞的毒性低于西妥昔单抗和帕尼单抗。
实施例7
HCC827和NCI-H292细胞系基底增殖的抑制
为了确定抗EGFR抗体在抑制肿瘤细胞基底增殖方面的能力，制定了使用EGFR表达HCC827(ATCC)和NCI-H292(ATCC)肺肿瘤细胞系的增殖测定。将细胞以2,000个细胞/孔铺到含10%FBS的正常生长培养基中，并在37℃下存在不同浓度的抗EGFR抗体的情况下生长5天。使用比色WST-8测定法测定细胞增殖水平。将OD结果归一化，使得存活分率1表示无抗EGFR抗体的正常生长培养基中生长的细胞，而0则表示无细胞的孔的值。
图7A和图7B分别显示了使用HCC827和NCI-H292细胞的代表性增殖测定。在HCC827细胞系中(图7A)，西妥昔单抗以剂量依赖性方式强烈抑制了肿瘤细胞生长。尽管对EGFR表达正常上皮细胞无害，但本发明的抗EGFR抗体表现出与西妥昔单抗相似或更佳的抑制活性。表11描述了各抗体的EC50和最大抑制%。
表11.抗EGFR抗体在HCC827细胞中的抗增殖活性
抗体 EC50(nM) 最大抑制(%)
西妥昔单抗 0.13 65
2 0.32 70
5 1.3 72
6 0.3 72
7 0.03 72
12 0.7 63
13 0.03 69
15 0.7 67
17 0.06 64
在NCI-H292细胞系中(图7B)，西妥昔单抗和帕尼单抗以剂量依赖性方式强烈抑制了基底细胞增殖。本发明的EGFR抗体也在该细胞系中具有显著的活性，其最大增殖抑制与西妥昔单抗和帕尼单抗相似。表12描述了各抗体的EC50和最大抑制%。
表12.抗EGFR抗体在NCI-H292细胞中的抗增殖活性
抗体 EC50(nM) 最大抑制(%)
帕尼单抗 0.039 76
西妥昔单抗 0.035 74
2 1.3 75
5 4.7 60
6 5.6 65
7 0.4 77
13 0.4 78
15 4.7 75
17 1.5 67
这些数据有力地主张本发明的EGFR抗体与西妥昔单抗和帕尼单抗在EGFR过表达细胞中具有一样的活性，然而它们不影响正常上皮细胞生长。
实施例8
抗EGFR抗体结合竞争
为了区分抗EGFR抗体的结合表位，使用流式细胞术进行了抗体结合竞争测定。在本实验中，在存在不同浓度的‘竞争性’抗体的情况下测量了0.3nM生物素化528(图8A)、0.2nM生物素化西妥昔单抗(图8B)和0.2nM生物素化EGFR-7抗体(图8C)与MDA-MB468细胞的结合。简而言之，将生物素化抗体与不同浓度的‘竞争性’抗体预混。然后将抗体混合物与细胞在冰上孵育2h。洗涤细胞，用链霉亲和素-alexa488偶联物在冰上孵育1h。洗涤后，将细胞固定，在FACScalibur中分析。在半对数图中针对抗体浓度绘制几何平均荧光强度，并归一化使得100%表示在不存在其他抗体的情况下生物素化抗体的最大结合，而0%则表示在不存在生物素化抗体的情况下的背景染色。如图8所示，所有EGFR抗体都彼此竞争。西妥昔单抗和帕尼单抗与裸528抗体一样强烈地竞争528抗体结合，而本发明的EGFR抗体与528抗体的竞争能力略低(图8A)。所有EGFR抗体都以相似的方式竞争西妥昔单抗和EGFR-7生物素化抗体的结合(图8B和图8C)。
实施例9
EGFR抗体的VL和VH区的克隆和测序
使用RNeasy试剂盒(QIAgen)根据制造商的方案由EGFR杂交瘤的5×106个细胞制备了总细胞RNA。随后使用SuperScript II cDNA合成试剂盒(Invitrogen)由总RNA合成了cDNA。
对源自杂交瘤细胞的cDNA进行的第一轮简并PCR反应的程序基于Wang等((2000)J Immunol Methods.233:167-77)和Co等((1992)JImmunol.148:1149-54)所述的方法。使用以下简并引物通过PCR扩增VH序列：EcoMH1CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:59)、EcoMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ IDNO:60) 和 BamIgG1GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ IDNO:61)。使用以下简并引物通过PCR扩增VL序列：SacIMKGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO:62)和HindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:85)。(混合碱基定义如下：N=G+A+T+C，S=G+C，Y=C+T，M=A+C，R=A+G，W=A+T)。将PCR反应混合物在1%低熔点琼脂糖凝胶上运行，切下300至400bp条带，使用Zymo DNA微柱纯化，并送往Agencourt Biosciences进行测序。将相应的5’和3’PCR引物用作测序引物，以从两个方向生成可变区cDNA。从DNA测序结果预测了VH和VL区的氨基酸序列。
由于用于克隆VL和VH cDNA序列的简并引物改变5’末端序列，因此需要进行另外的测序努力，以确认完整的序列。将初步cDNA序列用于在NCBI IgBlast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索抗体序列所来源的鼠种系序列。然后设计PCR引物，以退火到鼠抗体的种系相关先导序列，使得此新的PCR反应将得到不被PCR引物改变的完整可变区cDNA序列。如上所述进行PCR反应、条带纯化和测序。
用于序列确认的质量测定
将可变区的cDNA序列信息与种系恒定区序列组合，以得到全长抗体cDNA序列。然后计算重链和轻链的分子量，并与通过鼠EGFR抗体的LC/MS分析得到的分子量进行比较。分子量测量值与EGFR-7和EGFR-12轻链和重链的cDNA序列均一致。
EGFR-7变体的复合CDR序列
对许多鼠抗EGFR杂交瘤进行了测序，并发现它们表达与EGFR-7几乎相同的具有轻链和重链可变区的抗体，但具有一些CDR氨基酸置换，尤其是在重链CDR2中(图9)。由于发现鼠EGFR-7的CDR变体在功能上相同，因此它们提供了对EGFR-7CDR序列柔性的某些结构上的见解。轻链CDR2和3以及重链CDR1在各变体中均相同，然而在轻链CDR1和重链CDR3中以低频率发现了单个残基置换。与具有明显严格的序列保守的CDR相对，EGFR-7的变体通常在重链CDR2中含有多达4个氨基酸置换。EGFR-7的这些序列变体表明，5个严格保守的CDR可提供EGFR结合的结构基础，而重链CDR2则具有一定的序列柔性，从而导致在亲和力成熟过程中的体细胞突变热点。表4提供了基于与上文针对人源化所述的CDR变体一起的EGFR-7变体的复合CDR序列表。源自这些复合CDR的人源化抗体预计将保留EGFR-7的功能属性。
表13
Figure GDA00003449447800931
Figure GDA00003449447800941
实施例10
抗体人源化
按照之前所述的表面重塑方法，诸如在Roguska等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska等,Protein Eng.9(10):895-904(1996)(这两篇文献以引用方式整体并入本文)中所述，使EGFR-7和EGFR-12抗体人源化。表面重塑通常涉及鉴定轻链和重链中的可变区骨架表面残基并通过人等同残基将它们替换。鼠CDR保留在表面重塑的抗体中。EGFR-7和EGFR-12抗体的示例性CDR如表13中所示进行定义。为了最大程度降低对落在CDR中的偶联赖氨酸的影响的担忧，对于人源化版本1.0(以斜体显示)，将鼠EGFR-7抗体轻链CDR1中的第24位赖氨酸用精氨酸替换，因此得到LC CDR1的两种版本。相似地，对于人源化版本1.0(以斜体显示)，将鼠EGFR-12抗体轻链CDR1中的第27位赖氨酸和第31位赖氨酸分别用谷氨酰胺和精氨酸替换。用谷氨酰胺而不是精氨酸替换第27位赖氨酸是因为在人种系序列中在该位置保留了谷氨酰胺。除了用于表面重塑的AbM重链CDR2定义外，表中还提供了EGFR-7和EGFR-12抗体的鼠和人两种版本的示例性Kabat定义的重链CDR2。带下划线的序列标记了不考虑用于表面重塑的CDR的Kabat重链CDR2的部分。
表面残基位置定义为具有30%或更高的相对可及性的任何位置(Pedersen J.T.等,J.Mol.Biol.1994;235:959-973)。然后将计算的表面残基与人种系表面序列进行比对，以鉴定同源性最高的人表面序列。用作EGFR-7抗体的轻链可变结构域的替换表面的人种系序列为IGKV1-12*01，而将IGKV1-16*01用作EGFR-12抗体VL的替换表面。用作EGFR-7和EGFR-12抗体的重链可变结构域的替换表面的人种系序列分别为IGHV1-69*02和IGHV1-69*08。EGFR-7和EGFR-12抗体的具体骨架表面残基变化分别在图10和图11中给出。由于对于优选的版本，两抗体的表面重塑轻链包括CDR1赖氨酸置换，因此还通过保留在CDR-L1中的鼠赖氨酸生成了表面重塑版本(v1.01)。最终，鼠EGFR-7及其变体的重链骨架2包含体细胞W47C突变，从而导致了未配对的赖氨酸残基。为此，还测试了EGFR-7重链W47种系回复突变体版本(v1.11)。图12显示了EGFR-7和EGFR-12抗体轻链和重链可变结构域的表面重塑序列与其鼠对应物的比对。
表14
除了通过可变结构域表面重塑进行人源化外，还按照诸如在Jones等,Nature321:604-608(1986)和Verhoeyen等,Science239:1534-1536(1988)中所述的互补决定区(CDR)移植技术对EGFR-7抗体进行了人源化。CDR移植方法包括将自然进化的鼠抗体的CDR移植到人抗体的Fv骨架区(FR)。该过程的主要步骤是选择合适的人受体骨架。将Kabat编号方案和Kabat CDR定义用于EGFR-7抗体的CDR移植。用于CDR移植的EGFR-7抗体的示例性CDR如表15中所示而定义。通过如Lefranc,Nucleic Acids Res.29:207-209(2001)中所述的International ImMunoGeneTics information 
Figure GDA00003449447800962
(IMGT)(http://imgt.cines.fr/)的交互式工具V-QUEST，鉴定了与鼠EGFR-7抗体具有最高同源性的人免疫球蛋白种系序列。用作EGFR-7抗体的VL和VH结构域的受体骨架的人种系序列分别为IGKV1-33*01和IGHV1-46*03。为了最大程度降低对落在CDR中的偶联赖氨酸的影响的担忧，在CDR移植中将鼠EGFR-7抗体轻链CDR1中的第24位赖氨酸用精氨酸替换(表6)。在EGFR-7抗体的CDR移植中具体的骨架残基变化以及CDR-L1中的置换在图13中给出，EGFR-7抗体可变结构域的CDR移植序列与其鼠对应物的比对在图14中示出。
表15
Figure GDA00003449447800961
人源化EGFR抗体的重组表达
由Blue Heron Biotechnology对huEGFR-7和huEGFR-12的可变区序列进行密码子优化和合成。序列的侧面为限制性酶切位点，用于通过单链哺乳动物表达质粒中的相应恒定系列进行框内克隆。将轻链可变区克隆进pAbKZeo质粒中的EcoRI和BsiWI位点。将重链可变区克隆进pAbG1Neo质粒的HindIII和Apa1位点。将这些质粒用于在瞬时或稳定哺乳动物细胞转染中表达重组抗体。使用改进的PEI程序(Durocher,Y.等.,Nucleic Acids Res.30:E9(2002))，进行了在HEK293T细胞中表达重组抗体的瞬时转染。使用如上针对鼠抗体所述的标准程序通过蛋白A和精制层析步骤纯化上清液。
实施例11
鼠与人源化抗EGFR抗体之间的结合竞争
为了研究人源化抗EGFR抗体的结合，如实施例8中所述进行了抗体竞争测定。由于muEGFR-6和muEGFR-7抗体彼此交叉竞争(图8C)，因此该实验研究EGFR-6(图15A)或EGFR-7(图15B)的鼠或人源化抗体竞争生物素化muEGFR-7抗体与MDA-MB468细胞结合的能力。简而言之，将1nM的生物素化muEGFR-7抗体与多种浓度的‘竞争性’抗体进行预混。然后将抗体混合物与靶细胞在冰上孵育1小时，洗涤，与链霉亲和素-APC偶联物在冰上再孵育一小时，固定，使用流式细胞仪分析。在半对数图中针对抗体浓度绘制几何平均荧光强度，并归一化使得100%表示在不存在其他抗体的情况下生物素化抗体的最大结合，而0%则表示在不存在生物素化抗体的情况下的背景染色。如图15A所示，muEGFR-6和huEGFR-6抗体以相似的EC50(对于muEGFR-6为8.13nM，对于huEGFR-6为11.09nM)竞争muEGFR7的结合。图15B显示了，muEGFR-7、hu-EGFR-7和huEGFR-7R抗体也以相似的EC50(对于muEGFR7为3.54nM，对于huEGFR-7R为3.35nM，以及对于huEGFR-7为4.12nM)竞争muEGFR-7抗体结合。这些结果表明人源化不影响本发明的抗体的结合。
人源化抗EGFR抗体的抗肿瘤活性
为了研究本发明的人源化抗体的抗肿瘤活性，如实施例7中所述执行了H292肿瘤细胞生长抑制测定。如图16中所示，EGFR-6和EGFR-7的鼠和人源化抗体强效抑制了H292肿瘤细胞生长，其EC50包括在表16中。显然的是，所有人源化抗体都维持了鼠对应物的抗肿瘤活性，人源化不影响这些抗体的生物活性。
表16.抗EGFR抗体在NCI-H292细胞中的抗增殖活性
抗体 EC50(nM)
muEGFR-6 2.59
huEGFR-6 1.61
muEGFR-7 0.21
huEGFR-7 0.17
huEGFR-7R 0.11
实施例12
huEGFR抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性
使用新鲜分离的人自然杀伤(NK)细胞作为效应细胞，将乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法用于测量肿瘤细胞系的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Shields RL,J Biol Chem.2001276(9):6591-604)。首先使用NK细胞分离试剂盒II(#130-091-152;Miltenyi Biotec,Auburn,CA)的改进方案，从正常供体(Research Blood Components,Inc.,Brighton,MA)的人外周血液中分离NK细胞。将外周血液用1×PBS稀释2倍。将25mL稀释后的血液小心铺层到50mL锥形管中的25mL Ficoll Paque上，并在室温下400g离心45分钟。从界面处采集外周血单核细胞(PBMC)，转移到新的50mL锥形管中，用1×PBS洗涤一次。对PBMC计数，以2.5×107个细胞/100μl的浓度用MACS缓冲液(1×PBS,0.5%BSA,2mM EDTA)重悬，然后向细胞悬液中加入1/4倍体积的NK细胞生物素-抗体混合物(Biotin-Antibody Cocktail)。NK细胞生物素-抗体混合物包含结合到除了NK细胞的淋巴细胞的生物素化抗体，从而导致NK细胞的阴性选择。将混合物在4℃孵育10分钟，然后加入将结合到生物素化抗体的3/5倍体积的MACS缓冲液和2/5倍体积的NK细胞MicroBead混合物。将细胞-抗体混合物在4℃下再孵育15分钟。接下来，将细胞用50mL的MACS缓冲液洗涤一次，然后重悬在3mL的MACS缓冲液中。使用autoMACS分离机(Miltenyi Biotec)将NK细胞作为阴性部分而分离。将所得的NK细胞铺到30mL完整RPMI培养基(补充了5%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1%100X MEM非必需氨基酸溶液的RPMI-1640)上过夜。后续测定以及所有的稀释均在RHBP培养基(补充了20mM HEPES,pH7.4、0.1%BSA和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基)中进行。
将RHBP培养基中多种浓度的抗体按50μL/孔一式两份地等分到圆底96孔板中。将靶细胞(在该实验中为A431细胞系)以106个细胞/mL重悬在RHBP培养基中，再以100μL/孔添加到含有抗体稀释液的各孔中。将含有靶细胞和抗体稀释液的板在室温下孵育30分钟。然后，将NK细胞以50μL/孔添加到含有靶细胞的孔中。典型的比率为1个靶细胞对应3-4个NK细胞。对于各实验设立了以下对照：仅NK细胞、仅靶细胞(自发LDH释放)、含NK细胞的靶细胞(抗体依赖性LDH释放)、含10%Triton X-100的靶细胞(最大LDH释放)。将混合物在37℃下孵育4h以允许细胞裂解。将平板以1200rpm离心10分钟，将100μL上清液小心转移到新的平底96孔板。将得自细胞毒性检测试剂盒(Roche1644793)的LDH反应混合物(100μL/孔)加到各孔中，并在室温下孵育5至30分钟。在490nm处测量样品的光密度(OD)(OD490)。使用下式确定各样品的百分比特异性裂解：百分比特异性裂解=(样品值-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100。
图17显示了与chKTI抗体相比的huEGFR-6和huEGFR-7R抗体的代表性ADCC活性。huEGFR-6和huEGFR-7R抗体以剂量依赖性方式诱导了靶细胞的NK细胞介导的杀伤，最大特异性杀伤达到了约20%，huEGFR6和huEGFR-7R的EC50分别为22ng/ml和17ng/ml。相比之下，未结合到靶细胞的chKTI抗体未能介导ADCC。
实施例13
huEGFR-7R-SMCC-DM1的制备
将(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC,Pierce Biotechnology,Inc)连接子溶于二甲基乙酰胺(DMA)。通过将50mM磷酸钾、50mM NaCl、2mM EDTA,pH6.5中5mg/mL的抗体用10摩尔过量的SMCC孵育，将huEGFR抗体用SMCC修饰以将马来酰亚胺引入抗体。在环境温度下约100分钟后，将反应混合物用通过相同的磷酸钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化。将含有抗体的馏分汇集，用于后续步骤。
使SMCC修饰的抗体与相对于马来酰亚胺连接子1.7摩尔过量的10mM的DM1溶液反应。将反应物在环境温度下搅拌大约18个小时。将偶联反应混合物通过用1×PBS(pH6.5)平衡的SEPHADEXTMG25凝胶过滤柱过滤。然后将huEGFR抗体-SMCC-DM1偶联物渗析到含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1%蔗糖的缓冲液(pH5.5)中。使用之前报道的抗体和DM1的消光系数(Liu等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-8623(1996))确定每个抗体分子连接的DM1分子的数量。通过将20-50μg偶联物进样到用100mM醋酸铵缓冲液(pH7.0)中的25%乙腈平衡的HiSep柱上，并用乙腈洗脱而测定偶联反应后存在的游离美登木素的百分比。使用设置到252nm波长的吸光度检测器测量了总游离美登木素物质(梯度洗脱并通过与已知标准品比较洗脱时间而鉴定)的峰面积，并与结合的美登木素(在穿柱馏分的偶联物峰中洗脱)的相关峰面积进行比较，以计算总游离美登木素物质的百分比。得到了每个huEGFR抗体具有3.5-4个DM1分子的偶联物，其中<1%作为未偶联的美登木素存在。
huEGFR-7R-SPDB-DM4的制备
将示例性N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)连接子溶于乙醇中。在含有50mM NaCl、2mM EDTA和3%乙醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，将huEGFR抗体以8mg/mL用5.5-5倍摩尔过量的SPDB连接子在室温下孵育大约2小时。将SPDB修饰的抗体在PBS(pH6.5)中稀释2倍，通过添加DM4的二甲基乙酰胺(DMA)浓缩溶液(15-30mM)用1.5倍摩尔过量的美登木素DM4修饰。在室温下过夜孵育后，将偶联的抗体在用10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1%蔗糖(pH5.5)平衡的SEPHADEXTMG25F上通过层析纯化。使用之前报道的抗体和美登木素的消光系数(Widdison WC等J MedChem,49:4392-4408(2006))确定每个抗体分子连接的DM4分子的数量。如上所述确定总游离美登木素物质的百分比。得到了每个huEGFR抗体具有3.5-4个DM4分子的偶联物，其中<1%作为未偶联的美登木素存在。
实施例14
美登木素偶联物的结合亲和力
如实施例2中所述使用MDA-MB468细胞将huEGFR-6和huEGFR-7R抗体美登木素偶联物的结合亲和力与裸抗体的结合亲和力进行比较。从huEGFR-6抗体和偶联物的结合曲线计算的Kd(图18A)对于裸huEGFR-6抗体为0.81nM，对于huEGFR-6-SMCC-DM1偶联物为1.18nM。从huEGFR-7R抗体和偶联物的结合曲线计算的Kd(图18B)对于裸huEGFR-7R抗体为0.67nM，对于huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物为0.83nM。该数据表明DM偶联不显著改变huEGFR-6和huEGFR-7R抗体对huEGFR抗原的结合亲和力。
实施例15
对肿瘤细胞的体外细胞毒性测定
使用体外细胞毒性测定法测量了EGFR抗体美登木素偶联物抑制肿瘤细胞生长的能力。简而言之，将靶细胞以1,500至3,000个细胞/孔铺到含有10%FBS的100μL完整RPMI培养基中。使用5倍连续稀释将偶联物稀释到完整RPMI培养基中，向每个孔加入100μL。最终浓度通常在3×10-8M至8×10-14M的范围内。将细胞在37℃下在潮湿的5%CO2培养箱中孵育5天。通过比色WST-8测定法测定了剩余细胞的活力，在多孔酶标仪中测量了450nm处的吸光度(A450)。通过将各处理样品的值除以未处理对照的平均值而计算存活分率。在各处理的半对数图中，针对抗体-偶联物浓度绘制了存活分率值。
将本发明的裸抗体和抗体-美登木素偶联物的体外细胞毒性与非特异性抗体及其相应的美登木素偶联物诸如chKTI和chKTI-SMCC-DM1的活性进行比较。得自典型细胞毒性测定的结果在图19和图20中示出。
在图19A中，在FaDu细胞系中测试了本发明的裸抗体和美登木素偶联物的活性。huEGFR-6和huEGFR-7R裸抗体分别抑制了40%和55%的H292细胞生长，而chKTI抗体则无活性。美登木素偶联进一步增强了本发明的EGFR抗体的活性。huEGFR-6和huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物均完全破坏了靶细胞，EC50分别为0.22nM和0.06nM。对照chKTI-SMCC-DM1偶联物也杀伤了靶细胞，但EC50低得多(0.59μM)。
在图19B中，在H292细胞系中测试了本发明的裸抗体和美登木素偶联物的活性。huEGFR-6和huEGFR-7R裸抗体抑制了60-70%的H292细胞生长，而chKTI抗体则无活性。美登木素偶联进一步增强了本发明的EGFR抗体的活性。huEGFR-6和huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物均完全破坏了靶细胞，EC50分别为0.16nM和0.03nM。对照chKTI-SMCC-DM1偶联物也杀伤了靶细胞，但EC50低得多(38.51nM)。
在图20A中，在H226细胞系中将本发明的裸抗体和美登木素偶联物的活性与西妥昔单抗进行了比较。西妥昔单抗、huEGFR-6、huEGFR-7R裸抗体以及chKTI对照抗体没有抗增殖活性。huEGFR-6和huEGFR-7R两种抗体的美登木素偶联物均完全消除了靶细胞，EC50分别为0.68nM和0.14nM，而对照chKTI-SMCC-DM1偶联物则未能杀伤靶细胞。
在图20B中，在SCC-4细胞系中将本发明的裸抗体和美登木素偶联物的活性与西妥昔单抗进行了比较。西妥昔单抗、huEGFR-6和huEGFR-7R裸抗体表现出剂量依赖性生长抑制，最大抑制约为30%，而chKTI抗体则无活性。美登木素偶联进一步加强了本发明的EGFR抗体的活性。huEGFR-6和huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物均完全消除了靶细胞，EC50分别为0.07nM和0.03nM。对照chKTI-SMCC-DM1偶联物也杀伤了靶细胞，但EC50低得多(17.62nM)。总之，这些结果表明美登木素偶联物显著增强本发明的EGFR抗体的抗肿瘤活性。
实施例16
比较huEGFR-6和huEGFR-7R抗体和美登木素偶联物的体内疗 效研究
在EGFR表达H292NSCLC(非小细胞肺癌)(图21)和FaDuSCCHN(头颈鳞状细胞癌)(图22)肿瘤异种移植模型中测试了huEGFR-6和huEGFR-7R抗体的裸抗体和抗体-美登木素偶联物的活性。将1×107个肿瘤细胞皮下注射进SCID小鼠。当肿瘤达到约100mm3的平均肿瘤体积时将动物按肿瘤体积随机分成处理组，然后注射一次指定剂量的裸抗体或抗体-美登木素偶联物。针对肿瘤细胞接种后的时间绘制各处理组的中位肿瘤体积(图21和图22)。表17和表18显示了具有完全反应(CR)(无可触摸的肿瘤)的小鼠数量和肿瘤生长抑制百分比(%T/C)，其对应于当对照组的肿瘤体积达到预定大小时各处理组的肿瘤体积的中值除以对照组的中位肿瘤体积。将%T/C值低于42%的处理视为具有活性，而%T/C值低于12%的处理则视为具有高活性。
本发明的裸抗体和抗体美登木素偶联物均具有非常高的活性，它们显著延迟了H292和FaDu肿瘤异种移植物的生长(图21和图22)。在H292肿瘤异种移植研究中(图21和表17)，所有用低至3mg/kg的huEGFR-6-SMCC-DM1和huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物处理的小鼠均表现出完全反应。甚至10mg/kg的huEGFR-6和huEGFR-7R抗体也具有高活性。在FaDu肿瘤异种移植研究中(图22和表18)，10mg/kg的huEGFR-6和huEGFR-7R抗体具有活性，而抗体-美登木素偶联物的活性甚至更高，在一些小鼠中具有完全反应。
表17.EGFR Ab和美登木素偶联物在H292肿瘤异种移植物中的活性
Figure GDA00003449447801041
表18.EGFR Ab和美登木素偶联物在FaDu肿瘤异种移植物中的活性
Figure GDA00003449447801042
比较huEGFR-7R-SMCC-DM1和huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1的 体内疗效研究
在EGFR表达H292NSCLC(非小细胞肺癌)(图25)、HSC2SCCHN(头颈鳞状细胞癌)(图26)和FaDu SCCHN(图27)肿瘤异种移植模型中对裸抗体、huEGFR-7R-SMCC-DM1和huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1偶联物的活性进行了比较。实验和数据分析如上所述进行。
在H292NSCLC肿瘤异种移植研究中(图25和表19)，所有供试品在3mg/kg的单剂量下均具有高活性。所有用huEGFR-7R-SMCC-DM1和huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1偶联物处理的小鼠均表现出完全反应，而用huEGFR-7R抗体处理的小鼠均无完全反应。在HSC2SCCHN肿瘤异种移植研究中(图26和表20)，huEGFR-7R-SMCC-DM1和huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1偶联物均具有高活性，T/C为8%，而huEGFR-7R抗体在5mg/kg单剂量下几乎无活性。在FaDu SCCHN肿瘤异种移植研究中(图27和表21)，huEGFR-7R-SMCC-DM1和huEGFR-7R-PEG-MAL-DM1偶联物均具有活性，T/C分别为15%和28%。huEGFR-7R抗体处理表现出一定的肿瘤生长抑制，但活性不显著。总之，这些结果表明本发明的裸抗体强效抑制了NSCLC和SCCHN肿瘤生长，并且与美登木素偶联进一步增强了抗肿瘤活性。
表19.huEGFR-7R Ab和美登木素偶联物在H292肿瘤异种移植物中的活性
Figure GDA00003449447801051
表20.huEGFR-7R Ab和美登木素偶联物在HSC2肿瘤异种移植物中的活性
Figure GDA00003449447801052
表21.huEGFR-7R Ab和美登木素偶联物在FaDu肿瘤异种移植物中的活性
Figure GDA00003449447801061
实施例17
对人原代角质形成细胞的体外细胞毒性测定
EGFR信号转导在人原代角质形成细胞增殖中起着关键作用。通过小分子酪氨酸激酶抑制剂或拮抗性抗EGFR抗体诸如西妥昔单抗抑制EGFR信号转导在角质形成细胞培养中导致了生长阻滞和细胞凋亡(Stoll等,Oncogene16,1493-1499(1998))。角质形成细胞凋亡被认为是临床中抗EGFR疗法所致的皮肤毒性的潜在机理之一。为了研究皮肤毒性的可能性，在使用人原代角质形成细胞的体外细胞毒性测定中测试了本发明的EGFR抗体和抗体-美登木素偶联物。简而言之，将人原代角质形成细胞(Invitrogen)以1,500至3,000个细胞/孔铺到制造商所建议的含100μL EGF的培养基中。将供试品使用5倍稀释序列在含EGF的培养基中稀释，向各孔中加入100μL。最终浓度通常在3×10-8M至8×10-14M的范围内。将细胞在37℃下在潮湿的5%CO2培养箱中孵育5天。通过比色WST-8测定法测定了剩余细胞的活力，在多孔酶标仪中测量了450nm处的吸光度(A450)。通过将各处理样品的值除以未处理对照的平均值而计算存活分率。在各处理的半对数图中，针对抗体-偶联物浓度绘制了存活分率值。
在相同的实验中将huEGFR-7R裸抗体和huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物的体外细胞毒性与非特异性抗体(chKTI)、chKTI-SMCC-DM1偶联物、非拮抗性抗体(huML66)及其对应的美登木素偶联物对人原代角质形成细胞(图23A)以及H292肿瘤细胞(图23B)的活性进行比较。在H292细胞系中(图23B)，huML66抗体无活性，而huEGFR-7R抗体则抑制了高达55%的细胞生长。huML66和huEGFR-7R的美登木素偶联物具有最佳的活性；它们能够完全抑制肿瘤细胞生长，EC50在0.05nM与0.07nM之间。在人原代角质形成细胞中(图23A)，chKTI和huML66抗体对角质形成细胞增殖无影响。然而，huML66-SMCC-DM1非常强效地杀伤了角质形成细胞，EC50为0.55nM。huEGFR-7R裸抗体对角质形成细胞的几乎没有影响。令人吃惊的是，huEGFR-7R-SMCC-DM1偶联物对角质形成细胞的毒性与huML66-SMCC-DM1偶联物相比低得多。在3.3nM的浓度下，huEGFR-7R裸抗体及其对应的偶联物只抑制了低于40%的角质形成细胞生长。总而言之，本发明的抗体和抗体-美登木素偶联物对人原代角质形成细胞的细胞生长几乎没有影响，而它们对于消除肿瘤细胞非常强效。
实施例18
人原代角质形成细胞的趋化因子/细胞因子产生
主要由角质形成细胞与散置的树突状细胞、黑素细胞以及很少的T淋巴细胞和单核细胞组成的皮肤上皮是宿主防御的主要结构。物理、化学或免疫特异性侵袭快速引起特征在于趋化因子和细胞因子表达增加的表皮反应，这些因子吸引和激活不同的白细胞亚群从而诱导炎性反应。TNFα诱导人角质形成细胞表达多种趋化因子和细胞因子，包括CCL5/RANTES、CXCL10/IFNγ诱导蛋白10和CXCL8/IL-8。CCL5吸引T细胞、单核细胞以及中性粒细胞。CXCL10诱导1型T细胞迁移。CXCL8是在中性粒细胞募集中以及在上皮和内皮细胞增殖中具有活性的化学引诱物。
EGFR信号转导支配自我平衡维持和上皮组织修复。EGFR激活导致角质形成细胞增殖、迁移和受控的分化。响应于TNFα，角质形成细胞产生激活信号转导的EGFR配体。角质形成细胞中增强的EGFR激活增加CXCL8表达并减少CCL5和CXCL10表达。相比之下，EGFR信号转导的损害则导致相反的模式。在皮肤上涂敷选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂导致更严重的接触性超敏反应，使CCL5和CXCL10的表皮水平升高以及皮肤中更高数量的单核细胞/巨噬细胞和T细胞。这些发现表明，EGFR信号转导通过影响角质形成细胞中的趋化因子表达而调节皮肤炎症(Pastore,J.Immunol.,174:5047-5056(2005))。现在认为，在临床中在EGFR疗法后表现的皮肤毒性由皮肤中的细胞凋亡和持续的炎症所致。
在以下体外测定中测试了本发明的抗体和抗体-美登木素偶联物在调节人原代角质形成细胞产生趋化因子/细胞因子方面的影响。以1×105个人原代角质形成细胞/孔(Invitrogen)首先接种到6孔板中。使细胞过夜饥饿，然后用100ng/ml TNFα和10μg/ml的供试抗体在含EGF的培养基中培养14小时。使用得自R&D systems的ELISA试剂盒根据制造商的方案测量培养上清液中的CCL5、CXCL10和CXCL8的量。如图24所示，西妥昔单抗减少了CXCL8表达并增强了CXCL10和CCL5的产生。相比之下，本发明的裸抗体当与chKTI对照相比时不影响或几乎不影响这些趋化因子/细胞因子的表达。令人惊讶的是，本发明的EGFR抗体的美登木素偶联物也对角质形成细胞没有影响或几乎没有影响。总之，实施例17和18中所示的结果强烈表明，本发明的抗体和抗体美登木素偶联物在体外均对人原代角质形成细胞的影响甚微，因此可能对人体皮肤的毒性较低。与对角质形成细胞的影响相反，本发明的抗体和抗体美登木素偶联物在体外和体内杀伤EGFR阳性肿瘤细胞方面非常有效，如实施例7、12、15和16中所示。总而言之，本发明的抗体和抗体细胞毒性剂偶联物是对正常细胞与肿瘤细胞具有不同影响的一类独特的抗EGFR分子。
实施例19
表位作图
人EGFR是一种大型(1186个残基)的单体糖蛋白，具有胞外配体结合区、单个跨膜区和侧面为非催化性调控区的细胞质酪氨酸激酶结构域。人EGFR的胞外结构域(ECD)(第1-618位残基)包含四个亚结构域(图28)，这里称为结构域I(第1-165位氨基酸)、结构域II(第166-309位氨基酸)、结构域III(第310-481位氨基酸)和结构域IV(第482-618位氨基酸)。这些结构域也称为L1、CR1、L2和CR2，其中L和CR分别为大型和富含半胱氨酸的缩略词。通过工程化截短的和嵌合的人/鼠EGFR分子，将本发明的huEGFR-7R的表位主要作图到人EGFR ECD结构域III中含第460-480位氨基酸的限定区。
EGFR变体克隆和表达
将整个人EGFR ECD(第1-618位氨基酸)作为Fc融合蛋白(huEGFR-Fc)进行表达。由Blue Heron Biotechnologies对蛋白质序列进行密码子优化、合成以及通过pmuFc2ANL哺乳动物表达载体中的鼠IgG2A铰链、CH2和CH3区进行框内克隆。由于本发明的抗体与西妥昔单抗竞争与EGFR的结合(图8B)并且西妥昔单抗排他性地结合到结构域III，因此本发明的抗体的表位也可位于结构域III并可能与西妥昔单抗的表位重叠。为了进一步鉴定表位，与huEGFR-Fc相似地构建了含有整个结构域III(第310-481位氨基酸)加20个额外的来自结构域IV的残基(第482-501位氨基酸)的截短人EGFR(huEGFRdIII-Fc)的Fc融合体，经证明其为西妥昔单抗结合所必需。另外，也相似地构建了含有第310-501位氨基酸的截短鼠EGFR(muEGFRdIII-Fc)以及chEGFRdIII-Fc以作为Fc融合蛋白表达(图29)，其中chEGFRdIII-Fc为含有鼠EGFR第310-501位氨基酸的嵌合版本，其中编码第460-481位氨基酸的核苷酸序列被人EGFR的相应序列替代。chEGFRdIII-Fc构建体包含突变为其人对应物的10个氨基酸，包括第460、461、467、468、471、473、474和478-480位残基。将EGFR ECD Fc标签蛋白的所有形式通过HEK293T细胞的瞬时转染而表达，并使用蛋白A亲和层析从转染细胞的上清液中纯化。
与各种EGFR ECD-Fc构建体的抗体结合
以ELISA格式测试了huEGFR-7R对上述各种EGFR-Fc构建体的结合。如图30所示，huEGFR-7R抗体以相似的亲和力结合到人EGFR(huEGFR-Fc)和鼠EGFR结构域III(huEGFRdIII-Fc)。图30还展示了huEGFR-7R抗体实际上不识别鼠EGFR结构域III(muEGFRdIII-Fc)，尽管与人受体具有高序列同源性(在结构域III中88%的序列同一性)。另外，huEGFR-7R抗体结合到人/鼠EGFR嵌合体(chEGFRdIII-Fc)，其主要包含鼠EGFR结构域III序列以及在第460、461、467、468、471、473、474和478-480位突变为其人对应物的十个氨基酸(图30)。这些数据表明，huEGFR-7R抗体排他性地结合到人EGFR的结构域III，结合表位主要局限在第460-480位氨基酸。当比较huEGFR的不同截短格式的结合亲和力时，明显的是，huEGFR-7R抗体与chEGFRdIII-Fc的结合亲和力与huEGFR和huEGFRdIII相比大约有两倍的降低，从而表明huEGFR-7R抗体的表位除了第460-480位的那些氨基酸残基之外还由另外的氨基酸残基组成。该数据通过muEGFR-7抗体结合结果进行了确认(图32)。
平行地，与EGFR-7抗体共有独特的生物活性的本发明的其他抗EGFR抗体表现出与EGFR-7抗体相似的结合性质，本发明的其他抗EGFR抗体诸如huEGFR-6(图31)、muEGFR-6(图33)、muEGFR-12(图34)和muEGFR-13(图35)抗体。它们结合到人EGFR结构域III(huEGFRdIII-Fc)但不结合到鼠EGFR结构域III(muEGFRdIII-Fc)，并且重要的是，它们均以比结合到huEGFRdIII-Fc低的亲和力结合到chEGFRdIII-Fc。这些数据表明由本发明的抗体识别的表位除了第460-480位的氨基酸残基外还构成了结构域III中的其他残基。相比之下，西妥昔单抗以相似的亲和力结合到chEGFRdIII以及野生型人EGFR和huEGFRdIII(图36)，从而表明西妥昔单抗结合表位局限于第460-480位的氨基酸残基。总而言之，huEGFR-7R抗体与本发明的其他抗EGFR抗体排他性地结合到huEGFR胞外结构域的结构域III。此外，通过构建嵌合EGFR，确认了由本发明的抗体识别的表位朝向huEGFR结构域III的C端位移，并与西妥昔单抗结合位点大量重叠但不相同，并且很可能包含另外的重要氨基酸。
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前述具体实施方案的说明因此将全面揭露本发明的一般性质，他人可通过应用本技术领域内的知识不用过度实验在不脱离本发明的一般概念的情况下容易地对此类具体实施方案进行修改和/或使其适应于各种应用。因此，根据本文提供的教导和指导，此类适应和修改旨在落在所公开的实施方案的等同形式的含义和范围内。应当理解，本文的用语或术语是用于说明性目的而非限制性目的，使得本说明书的术语或用语将由技术人员按照教导和指导进行解释。
本发明的宽度和范围不应由任何上述示例性实施方案限制，而是应当根据以下权利要求书及其等同形式加以限定。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，或(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，以及(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含(a)选自SEQ ID NO:19-23、69和71-73的与参考VH序列至少90%相同的VH序列；以及(b)选自SEQ ID NO:24-30和70的与参考VL序列至少90%相同的VL序列。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和VL序列与所述参考VH和VL序列至少95%相同。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和VL序列与所述参考VH和VL序列至少99%相同。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含(a)选自SEQ ID NO:19-23、69和71-73的VH序列；以及(b)选自SEQ IDNO:24-30和70的VL序列。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:19和SEQ ID NO:24。
9.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:20和SEQ ID NO:25。
10.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:21和SEQ ID NO:26。
11.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:21和SEQ ID NO:27。
12.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:22和SEQ ID NO:28。
13.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:23和SEQ ID NO:29。
14.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:23和SEQ ID NO:30。
15.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:69和SEQ ID NO:70。
16.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:71和SEQ ID NO:26。
17.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:71和SEQ ID NO:27。
18.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:72和SEQ ID NO:26。
19.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:72和SEQ ID NO:27。
20.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:73和SEQ ID NO:26。
21.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:73和SEQ ID NO:27。
22.一种竞争性抑制第二抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体包含SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQID NO:26或27的轻链可变区，并且其中第一抗体或抗原结合片段：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，或(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
23.一种选自以下的由杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。
25.一种竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC，并且其中所述抗体或其抗原结合片段：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，或(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
26.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位：
a)包含SEQ ID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；
b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；
c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；
f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；
g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；
h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；
i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
m)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；以及
n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
27.一种竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：
a)包含SEQ ID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；
b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；
c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；
f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；
g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；
h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；
i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
m)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；以及
n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
28.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
29.根据权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQ IDNO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
30.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。
31.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链CDR2序列以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。
32.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
33.根据权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、表面重塑的或人的。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为抗原结合片段。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
38.一种多肽，其包含根据权利要求1-37中任一项所述的VH和VL序列。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体或多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段以基本上相似的结合亲和力结合人和恒河猴EGFR。
40.根据权利要求39所述的抗体或多肽，其以约1.0nM至约10nM的Kd结合到人和恒河猴EGFR。
41.根据权利要求40所述的抗体或多肽，其以约1.0nM或更佳的Kd结合到人和恒河猴EGFR。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的抗体或多肽，其中所述结合亲和力通过流式细胞术、Biacore或放射性免疫测定法测量。
43.一种产生根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的分离的细胞。
44.一种制备根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，包括(a)培养根据权利要求43所述的细胞；以及(b)从所述培养细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
46.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联物，其中：
(A)为根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽；
(L)为连接子；以及
(C)为细胞毒性剂；并且
其中所述连接子(L)将(A)连接到(C)。
47.根据权利要求46所述的免疫偶联物，其中所述连接子选自可裂解的连接子、不可裂解的连接子、亲水性连接子和二羧酸基连接子。
48.根据权利要求47所述的免疫偶联物，其中所述连接子为不可裂解的连接子。
49.根据权利要求48所述的免疫偶联物，其中所述连接子选自：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀酰亚胺-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
50.根据权利要求49所述的免疫偶联物，其中所述连接子为N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂选自：美登木素、美登木素类似物、多柔比星、修饰的多柔比星、苯并二氮紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、尾海兔素、尾海兔素类似物、aristatin、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物或所述活性剂的前药。
52.根据权利要求51所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂为美登木素。
53.根据权利要求52所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂为N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
54.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体。
55.根据权利要求54所述的药物组合物，其进一步包含第二抗癌剂。
56.一种诊断试剂，其包含进行了标记的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物。
57.根据权利要求56所述的诊断试剂，其中所述标记选自放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
58.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物。
59.一种抑制表达EGFR的细胞生长的方法，其包括将所述细胞与至受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物接触。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。
61.一种治疗患有癌症的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的至所述受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二抗癌剂。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述第二抗癌剂为化疗剂。
64.一种治疗细胞增生性病症的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的至所述受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞增生性病症除了肿瘤形成外还选自：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(赫克病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其他细胞增生疾病。
66.一种包含编码多肽的序列的分离的多核苷酸，所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少90%相同。
67.根据权利要求66所述的分离的多核苷酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少95%相同。
68.根据权利要求67所述的分离的多核苷酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少99%相同。
69.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:44-50和81至少90%相同的序列。
70.根据权利要求69所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少95%相同的序列。
71.根据权利要求70所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少99%相同的序列。
72.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:39-58和77-84的序列。
73.一种载体，其包含根据权利要求66-72中任一项所述的多核苷酸。
74.一种宿主细胞，其包含根据权利要求73所述的载体。
75.根据权利要求46所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物在3.3nM的浓度下可消除EGFR阳性肿瘤细胞，但对人原代角质形成细胞生长的抑制仅为40%或更低。
76.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联物，其中：
(A)为包含SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:26或27的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段；
(L)为N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)连接子；以及
(C)为细胞毒性剂N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)。

Claims (76)

1.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有选自以下的至少一种特征：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有选自以下的至少两种特征：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
3.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的EGF和TGFα与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，以及(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含(a)选自SEQ ID NO:19-23、69和71-73的与参考VH序列至少90%相同的VH序列；以及(b)选自SEQ ID NO:24-30和70的与参考VL序列至少90%相同的VL序列。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和VL序列与所述参考VH和VL序列至少95%相同。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和VL序列与所述参考VH和VL序列至少99%相同。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含(a)选自SEQ ID NO:19-23、69和71-73的VH序列；以及(b)选自SEQ IDNO:24-30和70的VL序列。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:19和SEQ ID NO:24。
9.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:20和SEQ ID NO:25。
10.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:21和SEQ ID NO:26。
11.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:21和SEQ ID NO:27。
12.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:22和SEQ ID NO:28。
13.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:23和SEQ ID NO:29。
14.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:23和SEQ ID NO:30。
15.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:69和SEQ ID NO:70。
16.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:71和SEQ ID NO:26。
17.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:71和SEQ ID NO:27。
18.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:72和SEQ ID NO:26。
19.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:72和SEQ ID NO:27。
20.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:73和SEQ ID NO:26。
21.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:73和SEQ ID NO:27。
22.一种竞争性抑制第二抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体包含SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQID NO:26或27的轻链可变区，并且其中第一抗体或抗原结合片段：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，或(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
23.一种选自以下的由杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC。
25.一种竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：ATCC保藏编号PTA-11331，于2010年10月6日保藏在ATCC；ATCC保藏编号PTA-11332，于2010年10月6日保藏在ATCC以及ATCC保藏编号PTA-11333，于2010年10月6日保藏在ATCC，并且其中所述抗体或其抗原结合片段：(a)在10nM或更高的浓度下抑制至少80%的表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)与A431细胞结合，(b)在30nM或更高的浓度下导致抑制至少50%的H292和HCC827肿瘤细胞增殖，或(c)在60nM或更低的浓度下抑制不超过20%的角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的增殖。
26.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合到与选自以下的抗体相同的EGFR表位：
a)包含SEQ ID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；
b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；
c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；
f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；
g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；
h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；
i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
m)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；以及
n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
27.一种竞争性抑制参考抗体与人EGFR结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：
a)包含SEQ ID NO:19的VH多肽和SEQ ID NO:24的VL多肽的抗体；
b)包含SEQ ID NO:20的VH多肽和SEQ ID NO:25的VL多肽的抗体；
c)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
d)包含SEQ ID NO:21的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
e)包含SEQ ID NO:22的VH多肽和SEQ ID NO:28的VL多肽的抗体；
f)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:29的VL多肽的抗体；
g)包含SEQ ID NO:23的VH多肽和SEQ ID NO:30的VL多肽的抗体；
h)包含SEQ ID NO:69的VH多肽和SEQ ID NO:70的VL多肽的抗体；
i)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
j)包含SEQ ID NO:71的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
k)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；
l)包含SEQ ID NO:72的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体；
m)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:26的VL多肽的抗体；以及
n)包含SEQ ID NO:73的VH多肽和SEQ ID NO:27的VL多肽的抗体。
28.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
29.根据权利要求27所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:2、4、6、63或64的参考重链CDR2序列以及SEQ IDNO:3或5的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:10、13或14的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
30.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。
31.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:7、8或9的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:15或16的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:17的参考轻链CDR2序列以及SEQ ID NO:18的参考轻链CDR3序列相同。
32.一种特异性结合到人EGFR的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQ ID NO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
33.根据权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:1的参考重链CDR1序列，SEQ ID NO:65、66或67的参考重链CDR2序列以及SEQ ID NO:3的参考重链CDR3序列相同；以及
b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQ ID NO:68或13的参考轻链CDR1序列，SEQ ID NO:11的参考轻链序列CDR2以及SEQ ID NO:12的参考轻链CDR3序列相同。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、表面重塑的或人的。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为抗原结合片段。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
38.一种多肽，其包含根据权利要求1-37中任一项所述的VH和VL序列。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体或多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段以基本上相似的结合亲和力结合人和恒河猴EGFR。
40.根据权利要求39所述的抗体或多肽，其以约1.0nM至约10nM的Kd结合到人和恒河猴EGFR。
41.根据权利要求40所述的抗体或多肽，其以约1.0nM或更佳的Kd结合到人和恒河猴EGFR。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的抗体或多肽，其中所述结合亲和力通过流式细胞术、Biacore或放射性免疫测定法测量。
43.一种产生根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的分离的细胞。
44.一种制备根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，包括(a)培养根据权利要求43所述的细胞；以及(b)从所述培养细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
46.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联物，其中：
(A)为根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽；
(L)为连接子；以及
(C)为细胞毒性剂；并且
其中所述连接子(L)将(A)连接到(C)。
47.根据权利要求46所述的免疫偶联物，其中所述连接子选自可裂解的连接子、不可裂解的连接子、亲水性连接子和二羧酸基连接子。
48.根据权利要求47所述的免疫偶联物，其中所述连接子为不可裂解的连接子。
49.根据权利要求48所述的免疫偶联物，其中所述连接子选自：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀酰亚胺-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
50.根据权利要求49所述的免疫偶联物，其中所述连接子为N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂选自：美登木素、美登木素类似物、多柔比星、修饰的多柔比星、苯并二氮紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、卡奇霉素、尾海兔素、尾海兔素类似物、aristatin、茅屋霉素衍生物和来普霉素衍生物或所述活性剂的前药。
52.根据权利要求51所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂为美登木素。
53.根据权利要求52所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂为N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
54.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体。
55.根据权利要求54所述的药物组合物，其进一步包含第二抗癌剂。
56.一种诊断试剂，其包含进行了标记的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物。
57.根据权利要求56所述的诊断试剂，其中所述标记选自放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
58.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、或根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物。
59.一种抑制表达EGFR的细胞生长的方法，其包括将所述细胞与至受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物接触。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。
61.一种治疗患有癌症的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的至所述受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二抗癌剂。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述第二抗癌剂为化疗剂。
64.一种治疗细胞增生性病症的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的至所述受试者的根据权利要求1-42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或多肽、根据权利要求46-53中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求54或55所述的药物组合物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞增生性病症除了肿瘤形成外还选自：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(赫克病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其他细胞增生疾病。
66.一种包含编码多肽的序列的分离的多核苷酸，所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少90%相同。
67.根据权利要求66所述的分离的多核苷酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少95%相同。
68.根据权利要求67所述的分离的多核苷酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:39-43、77-80和82-84的序列至少99%相同。
69.一种分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:44-50和81至少90%相同的序列。
70.根据权利要求69所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少95%相同的序列。
71.根据权利要求70所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:44-50和81至少99%相同的序列。
72.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:39-58和77-84的序列。
73.一种载体，其包含根据权利要求66-72中任一项所述的多核苷酸。
74.一种宿主细胞，其包含根据权利要求73所述的载体。
75.根据权利要求46所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物在3.3nM的浓度下可消除EGFR阳性肿瘤细胞，但对人原代角质形成细胞生长的抑制仅为40%或更低。
76.一种具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联物，其中：
(A)为包含SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID NO:26或27的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段；
(L)为N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)连接子；以及
(C)为细胞毒性剂N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)。
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