CN110248963A - 抗ccr7抗体药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本申请披露了抗CCR7抗体、其抗原结合片段、以及所述抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。本发明还涉及使用这些抗体、抗原结合片段和抗体药物缀合物治疗或预防癌症的方法。本文还披露了制备这些抗体、抗原结合片段和抗体药物缀合物的方法，以及使用这些抗体和抗原结合片段作为诊断试剂的方法。

Description

抗CCR7抗体药物缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月3日提交的美国临时申请号62/454,476的权益，将其内容特此通过引用以其全文并入。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。创建于2018年1月10日的所述ASCII副本名为PAT057594-WO-PCT_SL.txt且大小为387,054字节。
技术领域
本发明总体上涉及抗CCR7抗体、抗体片段及其免疫缀合物，以及它们用于治疗或预防癌症的用途。
背景技术
CC-趋化因子受体7(CCR7)最初在1993年鉴定为淋巴细胞特异性受体(参见例如，Birkenbach等人,J Virol.[病毒学杂志]1993年4月；67(4):2209-20)。其表达局限于免疫细胞的亚群，如初始T细胞、中枢记忆T细胞(Tcm)、调节性T细胞(Treg)、初始B细胞、NK细胞和成熟抗原呈递树突细胞(DC)。CCR7调节免疫细胞向淋巴器官的和在淋巴器官内的归巢，并且因此在平衡免疫和耐受中起关键作用(参见例如等人,Nat Rev Immunol.[天然免疫学评论]2008年5月；8(5):362-71)。
CCR7是A类视紫红质样G蛋白偶联受体(GPCR)，具有两个配体CCL21和CCL19。CCR7结构尚未完全解析，然而，已发现某些基序对受体活性至关重要(参见例如，Legler等人,Int J Biochem Cell Biol.[国际生物化学与分子生物学杂志]2014年7月1日)。
CCR7和癌症
还已知CCR7(也称为EBI1、BLR2、CC-CKR-7、CMKBR7、CD197和CDw197)在许多恶性肿瘤中过表达，这些恶性肿瘤包括B细胞恶性肿瘤(例如，CLL、MCL、伯基特淋巴瘤)、T细胞恶性肿瘤(例如，ATLL)、HNSCC、ESCC、胃癌、NSCLC、结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和宫颈癌等。CCR7在例如结肠直肠癌、ESCC、胰腺癌、HNSCC和胃癌中的过表达与晚期肿瘤阶段、淋巴结转移和生存率低相关(参见例如，Malietzis等人,Journal of Surgical Oncology[外科肿瘤学杂志]2015；112:86-92；Irino等人,BMC Cancer[BMC癌症]2014,14:291；Guo等人,Oncology Letters[肿瘤学快报]5:1572-1578,2013；Xia等人,Oral Dis.[口腔疾病]2015年1月；21(1):123-31；Du等人,Gastric Cancer.[胃癌]2016年3月16日)。
此外，已显示在例如HNSCC中的CCR7表达在对化学疗法的抗性中起作用(参见例如，Wang等人,JNCI J Natl Cancer Inst[美国癌症研究所杂志](2008)100(7):502-512。)。在某些癌症类型，如胰腺癌和鼻咽癌(NPC)中，已知CCR7促进癌症干细胞样细胞转移和球体形成(参见例如，Zhang等人,PLOS ONE[公共科学图书馆综合]11(8)；Lun等人,PLOSONE[公共科学图书馆综合]7(12))。CCR7在细胞迁移、侵袭性和EMT(上皮-间充质转化)中的作用在体外和体内的各种癌症类型，如乳腺癌和胰腺癌中进行了描述(参见例如，Pang等人,Oncogene[癌基因](2015),1-13；Sperveslage等人,Int.J.Cancer[国际癌症杂志]:131,E371-E381(2012))。已被描述为CCR7信号传导必需的关键途径包括b-抑制蛋白(Arrestin)介导的p38/ERK1/2和Rho信号传导(参见例如，Noor等人,J Neuroinflammation[神经炎症杂志]2012年4月25日；9:77)。
已知许多癌症相关过程诱导CCR7表达。在HNSCC中，显示CCR7表达由NF-kB和AP1转录因子经由直接结合CCR7启动子中的位点诱导(Mburu等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2012,287:3581-3590)。特别地，CCR7表达受肿瘤微环境中的各种因素调节。在该背景下，已知CCR7表达在HNSCC中经由b-防御素3/NF-kB途径诱导(参见例如，Mburu等人,Carcinogenesis[癌变]第32卷第2期第168-174页,2010)并且在乳腺肿瘤细胞中经由内皮素受体A和缺氧诱导因子-1诱导(参见例如，Wilson等人,Cancer Res[癌症研究]2006；66:11802-11807)。
抗体药物缀合物
抗体药物缀合物(“ADC”)已用于在癌症治疗中局部递送细胞毒性剂(参见例如，Lambert,Curr.Opinion In Pharmacology[药理学新见]5:543-549,2005)。ADC允许靶向递送药物部分，其中可以实现具有最小毒性的最大功效。ADC包含针对结合经靶向用于治疗干预的细胞的能力而选择的抗体，该抗体与针对其细胞抑制或细胞毒活性而选择的药物连接。从而，抗体与靶细胞的结合将药物递送至需要其治疗效果的位点。
已经披露了许多识别并选择性结合靶细胞(例如，癌细胞)的抗体用于在ADC中使用。尽管对ADC进行了大量工作，但与特定的目的靶标结合的抗体不足以预测ADC应用的成功。可以影响ADC治疗效果的因素(除了靶标内在特征之外)的实例包括需要定制微调的各个方面，如作为靶介导处置(TMDD)与功效驱动暴露之间平衡的最佳抗体亲和力、对Fc介导的功能(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC)的评价、缀合方法(位点特异性与否)、与每种抗体缀合的药物/有效负载分子的比率(“DAR”或“药物抗体比率”)、接头的可裂解性或稳定性、ADC的稳定性、以及ADC聚集的趋势。
仍然需要具有改善特性的抗体、连接方法和细胞毒性有效负载，以用作有效的ADC治疗组合物和方法。
发明内容
本申请披露了一种结合人CCR7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与相同同种型的野生型抗体相比具有降低的或没有显著的效应子功能。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段具有降低的或没有显著水平的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含沉默的Fc区。在一些实施例中，该抗体在该Fc区中包含选自以下的突变：D265A；P329A；P329G；N297A；D265A和P329A；D265A和N297A；L234和L235A；P329A、L234A和L235A；以及P329G、L234A和L235A。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段没有显著的细胞杀伤活性。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段以相对于表达较低水平的CCR7的细胞更大的亲和力结合表达较高水平的CCR7的细胞。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段以相对于表达较低水平的CCR7的正常细胞更大的亲和力结合表达较高水平的CCR7的癌细胞。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段未显著消耗表达CCR7的正常造血细胞。
在一个实施例中，本申请披露了一种结合CCR7的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
a.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:1的HCDR1(重链互补性决定区1)、SEQ ID NO:2的HCDR2(重链互补性决定区2)、和SEQ ID NO:3的HCDR3(重链互补性决定区3)；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17的LCDR1(轻链互补性决定区1)、SEQ IDNO:18的LCDR2(轻链互补性决定区2)、和SEQ ID NO:19的LCDR3(轻链互补性决定区3)；
b.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:4的HCDR1、SEQ ID NO:5的HCDR2、和SEQ ID NO:6的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:20的LCDR1、SEQ IDNO:21的LCDR2、和SEQ ID NO:22的LCDR3；
c.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、和SEQ ID NO:9的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的LCDR1、SEQ IDNO:24的LCDR2、和SEQ ID NO:25的LCDR3；
d.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2、和SEQ ID NO:12的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:26的LCDR1、SEQ IDNO:27的LCDR2、和SEQ ID NO:28的LCDR3；
e.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:33的HCDR1、SEQ ID NO:34的HCDR2、和SEQ ID NO:35的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的LCDR1、SEQ IDNO:50的LCDR2、和SEQ ID NO:51的LCDR3；
f.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的HCDR1、SEQ ID NO:37的HCDR2、和SEQ ID NO:38的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:52的LCDR1、SEQ IDNO:53的LCDR2、和SEQ ID NO:54的LCDR3；
g.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:39的HCDR1、SEQ ID NO:40的HCDR2、和SEQ ID NO:41的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的LCDR1、SEQ IDNO:56的LCDR2、和SEQ ID NO:57的LCDR3；
h.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:42的HCDR1、SEQ ID NO:43的HCDR2、和SEQ ID NO:44的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:58的LCDR1、SEQ IDNO:59的LCDR2、和SEQ ID NO:60的LCDR3；
i.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:65的HCDR1、SEQ ID NO:66的HCDR2、和SEQ ID NO:67的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:81的LCDR1、SEQ IDNO:82的LCDR2、和SEQ ID NO:83的LCDR3；
j.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:68的HCDR1、SEQ ID NO:69的HCDR2、和SEQ ID NO:70的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:84的LCDR1、SEQ IDNO:85的LCDR2、和SEQ ID NO:86的LCDR3；
k.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:71的HCDR1、SEQ ID NO:72的HCDR2、和SEQ ID NO:73的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:87的LCDR1、SEQ IDNO:88的LCDR2、和SEQ ID NO:89的LCDR3；
l.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:74的HCDR1、SEQ ID NO:75的HCDR2、和SEQ ID NO:76的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:90的LCDR1、SEQ IDNO:91的LCDR2、和SEQ ID NO:92的LCDR3；
m.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:596的HCDR1、SEQ ID NO:597的HCDR2、和SEQ ID NO:598的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:612的LCDR1、SEQ ID NO:613的LCDR2、和SEQ ID NO:614的LCDR3；
n.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:599的HCDR1、SEQ ID NO:600的HCDR2、和SEQ ID NO:601的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:615的LCDR1、SEQ ID NO:616的LCDR2、和SEQ ID NO:617的LCDR3；
o.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:602的HCDR1、SEQ ID NO:603的HCDR2、和SEQ ID NO:604的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:618的LCDR1、SEQ ID NO:619的LCDR2、和SEQ ID NO:620的LCDR3；或
p.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:605的HCDR1、SEQ ID NO:606的HCDR2、和SEQ ID NO:607的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:621的LCDR1、SEQ ID NO:622的LCDR2、和SEQ ID NO:623的LCDR3。
本申请的结合CCR7的抗体或其抗原结合片段还可以包含：
a.包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
b.包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
c.包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或
d.包含SEQ ID NO:608的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:624的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在另一个实施例中，该结合CCR7的抗体或其抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链；
b.包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链；
c.包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；或
d.包含SEQ ID NO:610的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:626的氨基酸序列的轻链。
如本文所述的抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个半胱氨酸取代。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代，该一个或多个半胱氨酸取代选自该抗体或其抗原结合片段的重链的S152C、S375C、或S152C和S375C两者，其中该位置是根据EU系统编号的。如本文披露的抗体可以是单克隆抗体。
本申请披露了一种抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物包括下式：
Ab-(L-(D)m)n
或其药学上可接受的盐；其中
Ab是如本文披露的抗体或其抗原结合片段；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1至12的整数。
在一些实施例中，m是1。在一个实施例中，n是约3至约4。在一个实施例中，该接头选自下组，该组由以下组成：可裂解接头、不可裂解接头、亲水性接头、预先带电荷(procharged)的接头、和基于二羧酸的接头。
在一个实施例中，该接头衍生自交联试剂，该交联试剂选自下组，该组由以下组成：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEGNHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
在其他实施例中，该接头具有以下式(IIA)：
其中*与该抗体上的硫醇官能团连接，并且**与药物部分的硫醇官能团连接；并且其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的。
在另一个实施例中，该接头具有以下式：
其中y是1至11；*与该抗体上的硫醇官能团连接，并且**与该药物部分的硫醇官能团连接。
在一个实施例中，该药物部分选自下组，该组由以下组成：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、鹅膏蕈碱、吡咯苯并二氮杂卓、RNA聚合酶抑制剂、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。在一些实施例中，该细胞毒性剂是类美登素，其中该类美登素是N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(DM1)、N(2’)-去乙酰基-N(2”)-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
在一个实施例中，本文披露的抗体药物缀合物包括以下式(VIII)：
其中L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；并且其中n是约3至约4；或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本文披露的抗体药物缀合物具有以下式：
其中n是约3至约4，并且Ab是抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链；或其药学上可接受的盐。
本申请还披露了药物组合物，该药物组合物包含本文披露的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载剂。本申请还披露了药物组合物，该药物组合物包含如本文披露的抗体药物缀合物。
本申请还披露了在有需要的患者中治疗或预防癌症的方法，这些方法包括向所述患者给予本文披露的抗体药物缀合物或药物组合物，其中该癌症表达CCR7。
在这些治疗或预防癌症的方法的一些实施例中，将该抗体药物缀合物或药物组合物与一种或多种另外的治疗性化合物组合给予至该患者。在一个实施例中，该一种或多种另外的治疗性化合物选自标准护理化学治疗剂、共刺激分子或检查点抑制剂。在一个实施例中，该共刺激分子选自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配体的激动剂。在另一个实施例中，该检查点抑制剂选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制剂。
本申请还披露了本文披露的抗体药物缀合物或药物组合物，用于作为药物使用。在一个实施例中，本文披露的抗体药物缀合物或药物组合物用于在有需要的患者中治疗或预防表达CCR7的癌症。
在一个实施例中，本申请披露了如本文披露的抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、或药物组合物用于在有需要的患者中治疗或预防表达CCR7的癌症的用途。
在一个实施例中，本申请披露了如本文披露的抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、或药物组合物在制造药物中的用途。
在一个实施例中，该癌症选自下组，该组由以下组成：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、鼻咽癌(NPC)、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、肾细胞癌和宫颈癌。在特定实施例中，该癌症选自下组，该组由以下组成：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、和非小细胞肺癌。
本申请还披露了核酸，这些核酸编码如本文披露的抗体或抗原结合片段。在一个实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:14、16、30、32、46、48、62、64、78、80、94、96、481、483、497或499的核苷酸序列。本申请还披露了包含这些核酸的载体、和包含这些载体或核酸的宿主细胞。本申请还披露了一种用于产生本文披露的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括培养该宿主细胞并且从细胞培养物回收该抗体。在一个实施例中，从细胞培养物回收该抗体的方法包括以下步骤：
a)回收细胞并且过滤该培养物；
b)通过亲和色谱纯化该培养物；
c)通过将pH调整至3.4-3.6将该培养物中的任何病毒灭活，然后将pH再调整至5.8-6.2并且过滤该培养物；
d)通过阳离子交换色谱纯化该培养物并且对该培养物进行柱上还原；
e)对该培养物进行阴离子交换色谱；
f)通过纳米过滤去除病毒；
g)过滤含有该抗体的该培养物；并且
h)获得经纯化的抗体。
在又另一个实施例中，本文披露了一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
其中：
该药物部分是DM1、DM3或DM4并且该药物部分经由其硫醇官能团连接至该接头；
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；
(b)将所述接头-药物部分与本文披露的从该细胞培养物回收的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
在一个实施例中，该方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
并且
(b)将所述接头-药物部分与本文披露的从该细胞培养物回收的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
在另一个实施例中，用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
其中：
该药物部分是DM1、DM3或DM4并且该药物部分经由其硫醇官能团连接至该接头；
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；
(b)将所述接头-药物部分与如本文披露的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
在另一个实施例中，用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
(b)将所述接头-药物部分与如本文披露的抗体或其抗原结合片段缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
在另一个实施例中，预先形成所述接头-药物部分的步骤包括：
a)使药物部分经由其硫醇官能团与以下反应：
以形成：
b)使该形成的
与以下反应：
以形成该接头-药物部分：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
RG1和RG2是形成基团X的2个反应性基团。
在另一个实施例中，预先形成所述接头-药物部分的步骤包括：
a)使该药物部分经由其硫醇官能团与以下反应：
以形成：
b)使该形成的
与以下反应：
以形成该接头-药物部分：
在一些实施例中，根据上述方法产生的抗体药物缀合物具有约3至约4的用UV分光光度计测量的平均DAR。
在另一个实施例中，本申请披露了一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)将SMCC或MPET与药物部分DM-1或DM-4化学连接以形成接头-药物；
(b)将所述接头-药物与如本文披露的抗体或其抗原结合片段缀合；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
在一个实施例中，根据该方法产生的抗体药物缀合物具有约3至约4的用UV分光光度计测量的平均DAR。
本申请还披露了一种诊断试剂，该诊断试剂包含如本文披露的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段用放射标记物、荧光团、发色团、成像剂或金属离子标记。
附图说明
图1绘示了关于使用替代物ADCC报告基因测定的呈CysMab形式的非人源化和人源化抗CCR7抗体的体外ADCC活性的实验数据。
图2绘示了关于使用替代物ADCC报告基因测定的非人源化抗CCR7抗体的DAPA Fc突变形式的体外ADCC活性的实验数据。
图3绘示了关于使用基于ELISA的测定的呈CysMab.DAPA形式的抗CCR7抗体与重组hCCR7的结合的实验数据。
图4A-4C绘示了关于在激动模式(图4A)和拮抗剂模式(如4B、图4C)中使用β-抑制蛋白测定的亲本抗CCR7抗体的功能性的实验数据。
图5绘示了关于使用FACS测定的呈CysMab.DAPA形式的抗CCR7抗体与CCR7配体的竞争的实验数据。
图6绘示了关于使用突变型CCR7蛋白表位映射亲本抗CCR7抗体的实验数据。
图7A-7B绘示了与有效负载缀合的第二抗体片段复合的亲本抗CCR7抗体的背驮式(piggyback)ADC(pgADC)测定的实验数据。
图8绘示了关于使用靶阴性细胞系的与有效负载缀合的第二抗体片段复合的121G12亲本Ab的细胞毒性效应的背驮式ADC(pgADC)杀伤测定的实验数据。
图9绘示了说明使用呈CysMab野生型Fc形式的小鼠CCR7交叉反应性121G12亲本Ab的CD4+和CD8a+T细胞消耗的图，该121G12亲本Ab作为单独的抗体或与澳瑞司他汀细胞毒素缀合，其效应通过转换至DAPA沉默的Fc形式来挽救。
图10绘示了说明抗体药物缀合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4在KE97多发性骨髓瘤异种移植模型中的剂量应答功效的图。
图11绘示了说明抗体药物缀合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.sSPDB.DM4在KE97多发性骨髓瘤模型中的活性的图，其中给药以大于图10的起始肿瘤负荷开始。
图12绘示了说明缀合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在原发性非小细胞肺肿瘤模型HLUX1934中的体内活性的图。
图13绘示了说明经缀合的亲本684E12.SMCC.DM1在KE97多发性骨髓瘤异种移植模型中的活性的图。
图14A-14B绘示了在单剂量的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2、5或10mg/kg或同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以10mg/kg治疗后在48小时处KE97肿瘤上的磷酸化组蛋白H3IHC图像(图14A)和定量的磷酸化组蛋白H3信号(图14B)，这证明在用抗CCR7ADC治疗后诱导有丝分裂阻滞(磷酸化组蛋白H3)。
图15绘示了说明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对OCI-LY3ABC-DLBCL异种移植模型的剂量应答功效的图。
图16绘示了说明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对ToledoGCB-DLBCL异种移植模型的剂量应答功效的图。
图17绘示了说明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对DEL ALCL异种移植模型的功效的图。
图18绘示了说明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对HLUX1787NSCLC患者衍生的异种移植模型的剂量应答功效的图。
具体实施方式
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
术语“烷基”是指具有指定碳原子数目的单价饱和烃链。例如，C1-6烷基是指具有从1至6个碳原子的烷基基团。烷基基团可以是直链的或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个分支。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)以及己基。术语“亚烷基”是“烷基”的二价形式。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，该多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
“互补性决定结构域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地是指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，该结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15％-20％的可变结构域。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。剩余的VL或VH区段(所谓的框架区)表现出较少的氨基酸序列变异(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章,W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],纽约,2000)。
CDR和框架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定，例如，卡巴特(Kabat)、乔西亚(Chothia)、国际免疫遗传学数据库(IMGT)(在互联网以下网址：www.imgt.org/)和AbM(参见例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991)；和Rees等人,于：Sternberg M.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction[蛋白质结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],Oxford[牛津],141-172(1996)。
可以将轻链和重链两者分成结构同源性区和功能同源性区。术语“恒定”和“可变”是以功能方式使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远，它的编号越大。N末端是可变区并且在C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端结构域。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)、骆驼抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242:423-426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883,1988)。术语“抗原结合片段”也意在涵盖此类单链抗体。这些抗原结合片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、单结构域抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗原结合片段掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,Protein Eng.[蛋白质工程]8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有基本上相同的氨基酸序列或衍生自相同遗传源的多肽，包括抗体和抗原结合片段等。此术语还包括具有单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区均衍生自人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。还包括衍生自人序列的抗体，其中已经为了亲和力成熟或出于制造/有效负载缀合目的突变一个或多个CDR。参见Kilpatrick等人,“Rapid development of affinity matured monoclonalantibodies using RIMMS[使用RIMMS进行的亲和成熟单克隆抗体的快速开发],”Hybridoma[杂交瘤].1997年8月；16(4):381-9。
本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。
如本文所用，术语“识别”是指发现其表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”是指抗原上与本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般丧失。表位典型地包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，x射线结晶学和二维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology[分子生物学中的方法中的表位映射协议],第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一种抗原的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的其他全部可变区氨基酸序列相比，该人可变区氨基酸序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列共有确定的最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以是指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是框架区、仅是互补性决定区、是框架区和互补性决定区、可变区段(如上文所定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列，确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。可以例如通过可公开获得的国际免疫遗传学数据库(IMGT)(在互联网上以下网址：www.imgt.org/)和V-碱基(在互联网上以下网址：vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)，确定相应的人种系序列。
在描述抗原(例如，蛋白质)与抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”是指确定抗原在蛋白质异质群体和其他生物制品中例如在生物样品(例如，血液、血清、血浆或组织样品)中存在的结合反应。因此，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少两倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在一个实施例中，在指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少十(10)倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在此类条件下与抗体或结合剂特异性结合可能需要已经就其针对特定蛋白质的特异性选择的抗体或结合剂。如果需要或适当，可以通过扣除与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体，实现这种选择。可替代地，在一些实施例中，选择与某些所期望分子交叉反应的抗体或抗体片段。
多种免疫测定方式可以用来选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册](1998))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更典型地高于背景至少10至100倍的信号。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域的任何已知方法，测量平衡解离常数。本发明的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些实施例中，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”是指给予至患者的给定量的药物的全身性利用率(即，血液/血浆水平)。生物利用率是一个绝对术语，该绝对术语指示从所给予剂型到达总循环的药物时间(速率)和总量(程度)的度量。
如本文所用，短语“基本上由……组成”是指方法或组合物中所包含的活性药剂以及对该方法或组合物的预期目的而言无活性的任何赋形剂的类属或物种。在一些实施例中，短语“基本上由……组成”明确排除包含除本发明的抗体药物缀合物之外的一种或多种另外的活性剂。在一些实施例中，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本发明的抗体药物缀合物和第二共同给予的药剂之外的一种或多种另外的活性剂。
术语“氨基酸”是指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG--通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG--通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这种保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一些实施例中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用，术语“优化的”是指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物体(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲本”序列。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的语境中，术语“相同百分比”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在正在比较的区域上具有相同的氨基酸序列或核苷酸序列，则它们是“相同的”。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以寻求使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或当没有规定时则在整个序列上，60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括提及选自下组的多个邻接位置中的任何一个的区段，该组由从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成，其中在两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数量的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。例如通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c(1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法研究，通过这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或通过手动比对和目测检查(参见例如，Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南],2003)，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，所述长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似度量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17(1988)的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入GCG软件包中的GAP程序(可从www.gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch,J.Mol,Biol.[分子生物学杂志]48:444-453,(1970)算法，利用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。
除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，该核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98)。
术语“可操地连接”在核酸的语境中是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。典型地，它是指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调控序列增强其转录的编码序列的位置。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守性修饰的变体。
如本文所用，术语“抗体药物缀合物”或“免疫缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等连接。该连接可以是共价键或非共价相互作用，如借助静电力。可以采用本领域已知的多种接头以形成抗体药物缀合物。另外，可以将抗体药物缀合物以可能是从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”是指通过连接最初编码分离的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”是指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何药剂。
如本文所用，术语“抗癌剂”是指可以用来治疗或预防细胞增殖性障碍如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
如本文所用，术语“药物部分”或“有效负载”是指与本发明的抗体或抗原结合片段缀合的化学部分，并且可包括任何治疗剂或诊断剂，例如抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)或麻醉剂。例如，药物部分可以是抗癌剂，如细胞毒素。在某些实施例中，药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、RNA聚合酶抑制剂、吡咯苯并二氮杂卓(PBD)、鹅膏蕈碱、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。用于将这些药物中每种药物连接至与本发明抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。例如参见，Singh等人,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols[治疗性抗体：方法和方案],第525卷,445-457。此外，有效负载可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记、红外探针、亲和探针、螯合剂、光谱探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖。
术语“类美登素药物部分”意指具有类美登素化合物结构的抗体-药物缀合物的亚结构。美登素首次分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。已经报道合成性美登醇和美登醇类似物。参见美国专利号4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663、和4,371,533，以及Kawai等人,(1984)Chem.Pharm.Bull.[化学与药学通报]3441-3451)，这些文献中的每一个明确地通过引用并入。可用于缀合的具体类美登素的实例包括DM1、DM3和DM4。
“肿瘤”是指无论是恶性还是良性的赘生性细胞生长和增殖，以及所有癌变前和癌变的细胞和组织。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞的增殖速率、活力或转移活性的降低。例如，抗肿瘤活性可以由治疗期间出现的异常细胞的生长速率下降或肿瘤尺寸稳定或减小或与无治疗的对照相比因治疗所致的存活期更长显示。这种活性可使用公认的体外或体内肿瘤模型评估，这些肿瘤模型包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域已知的用于研究抗肿瘤活性的其他已知模型。
术语“恶性肿瘤”是指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞未移行至受试者身体中除原始肿瘤部位之外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞移行至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。
术语“CCR7”(也称为BLR2、CC-CKR-7、CCR-7、CD197、CDw197、CMKBR7、EBI1或C-C基序趋化因子受体7)是指G蛋白偶联受体家族的成员。人CCR7的核酸和氨基酸序列已以以下登录号公布于GenBank中：NP_001829、NP_001288643、NP_001288645、NP_001288646、NP_001288647(氨基酸序列)、和NM_001838、NM_001301714、NM_001301716、NM_001301717、NM_001301718(核苷酸序列)。如本文所用，将术语“CCR7”用于共同指CCR7蛋白的所有天然存在的同种型、或其变体。
术语“变体”是指与参考多肽具有基本上相同的氨基酸序列、或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考多肽的一种或多种活性的多肽。例如，变体与参考多肽可以具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，同时保留参考多肽的一种或多种活性。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个实施例中，是指减轻疾病或障碍(即，减慢或停滞或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“预防(prevent、preventing或prevention)”是指疾病或障碍的预防性治疗；或延迟疾病或障碍的发作或进展。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所期望结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些实施例中，治疗上可接受的量不诱导或不引起不期望的副作用。在一些实施例中，治疗上可接受的量诱导或引起副作用，但仅是由医疗服务提供者就患者的状况而言可接受的那些。可以通过首先给予低剂量并且随后递增地增加该剂量直至实现所期望效果来确定治疗上可接受的量。本发明分子的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状发作或导致疾病症状的严重程度下降，这些疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“共同给予”是指个体的血液中存在两种活性药剂。共同给予的活性药剂可以并行或依序递送。
本发明提供了结合CCR7的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)、及其药物缀合物，即抗体药物缀合物或ADC。特别地，本发明提供了结合CCR7并且在这种结合时内化的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。本发明的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)可用于产生抗体药物缀合物。此外，本发明提供了抗体药物缀合物，这些抗体药物缀合物具有期望的药代动力学特征和其他期望属性，并且因此可用于治疗或预防表达CCR7的癌症。本发明进一步提供了包含本发明的抗体药物缀合物的药物组合物、以及制备此类药物组合物和使用它们治疗或预防癌症的方法。
抗体药物缀合物
本发明提供了抗体药物缀合物，也称作免疫缀合物，其中特异性结合CCR7的抗体、抗原结合片段或其功能等同物与药物部分连接。在一个方面，本发明的抗体、抗原结合片段或其功能等同物通过接头经由共价连接与作为抗癌剂的药物部分连接。本发明的抗体药物缀合物可以递送有效剂量的抗癌剂(例如，细胞毒性剂)至表达CCR7的肿瘤组织，由此可以实现较大的选择性(和较低的有效剂量)。
在一个方面，本发明提供了一种具有式(I)的免疫缀合物：
Ab-(L-(D)m)n
其中Ab表示本文所述的CCR7结合抗体；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1-20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8、或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是2、3或4。在一些实施例中，m是1；在其他实施例中，m是2、3或4。
虽然对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率具有确切值(例如，在式(I)中为n乘以m)，但是应理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，这归因于典型地与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。免疫缀合物样品的平均载量在本文中称为药物对抗体比率或“DAR”。在一些实施例中，当药物是类美登素时，将它称为“MAR”。在一些实施例中，DAR在约2与约6之间，并且典型地是约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0。在一些实施例中，按重量计至少50％的样品是具有平均DAR加或减2的化合物，并且优选地至少50％的样品是含有平均DAR加或减1的缀合物。实施例包括其中DAR是约3.5、3.6、3.7、3.8或3.9的免疫缀合物。在一些实施例中，‘约n’的DAR意指DAR的测量值在n的20％内。
本发明还涉及免疫缀合物，这些免疫缀合物包含与药物部分连接或缀合的如本文披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)及其功能等同物。在一个实施例中，药物部分D是类美登素药物部分，包括具有以下结构的那些：
其中波浪线指示类美登素的硫原子与抗体药物缀合物的接头共价连接。R在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基。将酰胺基团连接至硫原子的亚烷基链可以是甲基、乙基或丙基，即，r是1、2或3。(美国专利号633,410；美国专利号5,208,020；Chari等人(1992)CancerRes.[癌症研究]52；127-131；Lui等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]93:8618-8623)。
对于本发明的免疫缀合物，设想类美登素药物部分的全部立体异构体，即在类美登素的手性碳处R构型和S构型的任何组合。在一个实施例中，类美登素药物部分具有以下立体化学。
在一个实施例中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(也称作DM1)。DM1由以下结构式表示。
在另一个实施例中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(也称作DM3)。DM3由以下结构式表示。
在另一个实施例中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(也称作DM4)。DM4由以下结构式表示。
药物部分D可以通过接头L与抗体Ab连接。L是能够通过共价键使药物部分与抗体连接的任何化学部分。交联试剂是可以用来连接药物部分和抗体以形成抗体药物缀合物的双官能或多官能试剂。可以使用具有能够与药物部分和抗体两者结合的反应性官能团的交联试剂来制备抗体药物缀合物。例如，半胱氨酸、硫醇或胺，例如抗体的N末端或氨基酸侧链如赖氨酸，可以与交联试剂的官能团形成键。可替代地，抗体药物缀合物可以通过以下方式制备：预先形成接头-药物部分(或药物-接头部分，两个术语可互换使用)，并且使接头-药物部分与抗体反应。在一些情况下，使用若干个连接部分将接头部分逐步构建在药物上，直到获得所期望的接头-药物部分。
在一个实施例中，L是可裂解接头。在另一个实施例中，L是不可裂解接头。在一些实施例中，L是酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶可裂解接头、酯酶可裂解接头、二硫键可裂解接头、亲水性接头、预先带电荷的接头、糖苷酶可裂解接头、磷酸二酯酶可裂解接头、磷酸酶可裂解接头、或基于二羧酸的接头。
在药物部分(例如类美登素)与抗体之间形成不可裂解接头的合适的交联试剂是本领域熟知的，并且可以形成包含硫原子(如SMCC)的不可裂解接头或无硫原子的那些不可裂解接头。在药物部分(例如类美登素)与抗体之间形成不可裂解接头的优选交联试剂包含基于马来酰亚胺基或基于卤代乙酰基的部分。根据本发明，将此类不可裂解接头描述为衍生自基于马来酰亚胺基或基于卤代乙酰基的部分。
包含基于马来酰亚胺基的部分的交联试剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(它是SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰亚胺基酯(EMCS)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMSA)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(-p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMIP)和含有聚乙二醇间隔团的基于马来酰亚胺基的交联试剂，如MAL-PEG-NHS。这些交联试剂形成衍生自基于马来酰亚胺基的部分的不可裂解接头。基于马来酰亚胺基的交联试剂的代表性结构在下文示出。
在另一个实施例中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)或MAL-PEG-NHS。
包含基于卤代乙酰基的部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。这些交联试剂形成衍生自基于卤代乙酰基的部分的不可裂解接头。基于卤代乙酰基的交联试剂的代表性结构在下文示出。
在一个实施例中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。
在药物部分(例如类美登素)与抗体之间形成可裂解接头的合适交联试剂是本领域熟知的。含有二硫化物的接头是通过在生理条件下可以发生的二硫化物交换可裂解的接头。根据本发明，将此类可裂解接头描述为衍生自基于二硫化物的部分。合适的二硫化物交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)，其结构在下文示出。这些二硫化物交联试剂形成衍生自基于二硫化物的部分的可裂解接头。
N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)以及
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
在一个实施例中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)。
在药物部分(例如类美登素)与抗体之间形成带电荷接头的合适交联试剂称作预先带电荷的交联试剂。在一个实施例中，接头L衍生自预先带电荷的交联试剂CX1-1。CX1-1的结构如下。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)
上文绘示的每种交联试剂在交联试剂的一端含有与抗体的伯胺反应以形成酰胺键的NHS-酯并且在另一端含有与类美登素药物部分的巯基反应以形成硫醚或二硫键的马来酰亚胺基团或吡啶基二硫化物基团。
在另一个实施例中，在药物部分(例如类美登素)与抗体之间形成可裂解接头的合适交联部分由以下式(II)表示：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中亚烷基是直链或支链的。
在该实施例的一个方面，y是5、7、9或11。在该实施例的另一个方面，y小于5。
在又另一个实施例中，根据式I的合适交联部分选自下组，该组由以下组成：
其中y是1至11。
对于上文绘示的交联部分(即MBT、MPET、MEPET；MMTBT、MPPT、MPBT)，马来酰亚胺基团允许与抗体中半胱氨酸的巯基(或硫醇)反应，从而形成硫醚键；并且交联部分的硫醇官能团与类美登素药物部分的硫醇连接，形成可裂解二硫键。鉴于具有式(I)的连接部分的交叉反应性质(硫醇和马来酰亚胺可以交叉反应)，本领域普通技术人员应理解，连接部分必须逐步构建在药物部分上，如方案1中绘示的。
根据以上实施例，由交联部分(即MBT、MPET、MEPET)产生的接头可如下绘示：
其中*与抗体上的硫醇官能团连接，并且**与药物部分(例如类美登素药物部分DM1、DM3或DM4)的硫醇官能团连接。
根据以上实施例，由交联部分(即MBT、MPET、MEPET)产生的接头可如下绘示：
其中y是1至11；*与抗体上的硫醇官能团连接，并且**与药物部分(例如类美登素药物DM1、DM3或DM4)的硫醇官能团连接。
在一个优选的实施例中，接头具有以下式：
其中*与抗体上的硫醇官能团连接，并且**与类美登素药物(DM1、DM3或DM4)的硫醇官能团连接。
在一个实施例中，本发明涉及具有下式的接头-药物部分：
其中
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中亚烷基是直链或支链的。
在另一个实施例中，本发明涉及如本文方案1中披露的以上接头-药物缀合物的逐步形成。
在一个实施例中，本发明涉及具有以下式(III)、(IV)和(V)之一的接头-药物部分化合物：
其中L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中亚烷基是直链或支链的。
在一个实施例中，本发明涉及接头-药物部分化合物，这些接头-药物部分化合物选自以下式：
在另一个实施例中，本发明涉及接头-药物部分化合物，这些接头-药物部分化合物选自以下式：
在另一个实施例中，本发明的接头-药物由以下式中任一个表示：
其中y是1至11，优选1至5。
在一个实施例中，本发明的接头-药物由以下结构式中任一个表示：
在一个实施例中，本发明的缀合物由以下结构式中任一个表示：
其中：
Ab是特异性结合CCR7的抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接至Ab的接头-药物(L-D-)基团的数量，是从1至20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物由以下式(VI)、(VII)和(VIII)中任一个表示：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接至Ab的接头-药物(L-D-)基团的数量，是从1至20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物具有对应于具有式(VI)的缀合物的琥珀酰亚胺的打开形式的式(VIA)或(VIB)：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
Ab是抗体或抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接至Ab的接头-药物(L-D-)基团的数量，是从1至20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物具有对应于具有式(VII)的缀合物的琥珀酰亚胺的打开形式的式(VIIA)或(VIIB)：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接至Ab的接头-药物(L-D)基团的数量，是从1至20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物具有对应于具有式(VIII)的缀合物的琥珀酰亚胺的打开形式的式(VIIIA)、(VIIIB)：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接至Ab的接头-药物(L-D-)基团的数量，是从1至20的整数。在一个实施例中，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一个实施例中，本文披露的其中接头-药物部分经由琥珀酰亚胺连接至抗体的每种抗体药物缀合物还可以作为如在式(VIA)、(VIB)、(VIIA)、(VIIB)、(VIIIA)和(VIIIB)中大体绘示的琥珀酰亚胺的打开形式存在。
在又另一个实施例中，本发明的缀合物由以下结构式中任一个表示：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的巯基形成硫酯键而连接至Ab的D-L基团的数量，是从1至12、或1至8、或优选1至4的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物由以下结构式中任一个：
以及琥珀酰亚胺的相应打开形式表示；
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的巯基形成硫酯键而连接至Ab的D-L基团的数量，是从1至12、或1至8、或优选1至4的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一个实施例中，本发明的缀合物由以下结构式中任一个：
以及琥珀酰亚胺的相应打开形式表示；
其中：
y是1至11，优选1至5；
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的巯基形成硫酯键而连接至Ab的D-L基团的数量，是从1至12、或1至8、或优选1至4的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在又另一个实施例中，本发明的缀合物由以下式：
以及琥珀酰亚胺的相应打开形式表示；
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的巯基形成硫酯键而连接至Ab的D-L基团的数量，是从1至12、或1至8、或优选1至4的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一个优选的实施例中，本发明的缀合物由以下式表示：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
n，指示通过与Ab的巯基形成硫酯键而连接至Ab的D-L基团的数量，是从1至20的整数。在一些实施例中，n是从1至12的整数。在一些实施例中，n是从1至8的整数。在一些实施例中，n是从1至4的整数。在一个具体实施例中，n是3或4。在另一个实施例中，平均n值是约3至约4。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合CCR7。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段特异性结合P-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一个实施例中，缀合物中药物(例如，DM1、DM3或DM4)对抗体的平均摩尔比(即，平均n值，也称为类美登素抗体比率(MAR))是约1至约10、约2至约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1)、约2.5至约7、约3至约5、约2.5至约4.5(例如，约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0至约4.0、约3.2至约4.2、或约4.5至5.5(例如，约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5)。
在本发明的一个方面，本发明的缀合物具有实质上高的纯度并且具有以下特征中的一个或多个：(a)大于约90％(例如，大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)、优选大于约95％的缀合物种类是单体的，(b)缀合物制剂中的未缀合的接头水平小于约10％(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)(相对于总接头)，(c)小于10％的缀合物种类是交联的(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)，(d)缀合物制剂中的游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)水平小于约2％(例如，小于或等于约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0％)(相对于总细胞毒性剂的mol/mol)和/或(e)储存时(例如在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后)，游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)的水平未实质性增加。游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)的水平“实质性增加”意指在某一储存时间(例如约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年)后，游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)的水平增加小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.2％、约2.5％、约2.7％、约3.0％、约3.2％、约3.5％、约3.7％、或约4.0％。
如本文所用，术语“未缀合的接头”是指与衍生自交联试剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)的接头共价连接的抗体，其中抗体未通过接头共价偶联至药物(例如，DM1、DM3或DM4)(即，“未缀合的接头”可以由Ab-MCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1表示)。
1.药物部分
本发明提供了特异性结合CCR7的免疫缀合物。本发明的抗体药物缀合物包含与药物部分，例如抗癌剂、自身免疫治疗剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或麻醉剂缀合的抗CCR7抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物。可以使用本领域已知的任何方法，将本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与若干个相同或不同的药物部分缀合。
在某些实施例中，本发明的免疫缀合物的药物部分选自下组，该组由以下组成：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、吡咯苯并二氮杂卓、澳瑞司他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、Eg5抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
在某些实施例中，本发明的免疫缀合物的药物部分是以以下PCT公开号披露的澳瑞司他汀：WO 2015/095301和WO 2015/189791，这两个申请据此通过引用并入。澳瑞司他汀药物部分-接头构建体的非限制性实例是：
(其是如本申请中披露的AURIX2)；和
(其是如本申请中披露的AURIX1)。
在一个实施例中，本发明的免疫缀合物的药物部分是类美登素药物部分，如但不限于DM1、DM3或DM4。
此外，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物可以与调节给定生物学应答的药物部分缀合。药物部分不应该解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望生物活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、凋亡剂、抗血管生成剂；或生物应答调节剂如淋巴因子。
在一个实施例中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与药物部分，如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的实例包括但不限于紫杉烷(参见例如，国际(PCT)专利号申请号WO 01/38318和PCT/US03/02675)、DNA-烷基化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素(tubulysin)类似物、多卡米星类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂(参见例如，Sasse等人,J.Antibiot.[抗生素杂志](东京),53,879-85(2000)；Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.[生物有机医学与化学],8,2175-84(2000)；Ichimura等人,J.Antibiot.[抗生素杂志](东京),44,1045-53(1991)；Francisco等人,Blood[血液学](2003)(电子出版先于印刷出版)；美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923 A1、等待审批的美国专利申请序列号10/024,290和10/116,053，以及国际(PCT)专利申请号WO 01/49698)、泰素(taxon)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、消融剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑(meiphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类(例如，柔红霉素(旧称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如更生霉素(旧称放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。(参见例如，西雅图遗传学公司(Seattle Genetics)US 20090304721)。
可以与本发明的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等同物缀合的细胞毒素的其他实例包括多卡米星、加利车霉素(calicheamicin)、美登素和澳瑞司他汀及其衍生物。
多种类型的细胞毒素、接头和用于将治疗剂与抗体缀合的方法是本领域已知的，参见例如，Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物递送综述]55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学和免疫治疗]52:328-337；Payne,(2003)Cancer Cell[癌症细胞]3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer[自然综述：癌症]2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs[药物调研新见]3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物递送综述]53:247-264。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，称之为放射免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的实例包括但不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是可商业获得的，包括ZevalinTM(DEC制药公司(DEC Pharmaceuticals))和BexxarTM(科里克萨制药公司(Corixa Pharmaceuticals))，并且可以利用本发明的抗体使用类似方法来制备放射免疫缀合物。在某些实施例中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子连接至抗体。此类接头分子是本领域公知的，并且描述于Denardo等人,(1998)Clin Cancer Res.[临床癌症研究]4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.[核医学和生物学]26(8):943-50，每一篇文献均通过引用以其全文并入。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物还可以与异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合以产生融合蛋白。特别地，本发明提供了融合蛋白，这些融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的融合蛋白。可采用DNA改组来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten等人,(1997)Curr.Opinion Biotechnol.[当前生物技术观点]8:724-33；Harayama,(1998)Trends Biotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82；Hansson等人,(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998)Biotechniques[生物技术]24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一篇均据此通过引用以其全文并入)。抗体或其片段、或编码的抗体或其片段可以通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变。编码特异性结合抗原的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物可以与标志物序列如肽缀合以促进纯化。在优选的实施例中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ IDNO:628)，如pQE载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.),伊顿大街(Eton Avenue)9259号,查茨沃思(Chatsworth),加利福尼亚州,91311)等，其中许多是商购可得的。如Gentz等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述，例如六组氨酸(SEQ ID NO:628)为纯化融合蛋白提供便利。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于，对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的血凝素(“HA”)标签(Wilson等人,(1984)Cell[细胞]37:767)和“FLAG”标签(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods[生化和生物物理方法杂志]49:455-465,2001)。根据本发明，抗体或抗原结合片段也可以与渗透肿瘤的肽缀合以提高它们的功效。
在其他实施例中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与诊断剂或可检测剂缀合。此类免疫缀合物可用于监测或预后疾病或障碍的发作、发展、进展和/或严重程度以作为临床试验程序(如确定特定疗法的功效)的一部分。这种诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来实现，这些可检测物质包括但不限于各种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料，如但不限于Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、AlexaFluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，如但不限于鲁米诺；生物发光材料，如但不限于荧光素酶、荧光素和水母素；放射性材料，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物也可以连接至特别可用于靶抗原的免疫测定法或纯化的固体支持物。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
2.接头
如本文所用，“接头”是能够将抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等同物与另一个部分如药物部分连接的任何化学部分。接头可以在化合物或抗体仍保持活性的条件下易于裂解(可裂解接头)，如，酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解、糖苷酶诱导的裂解、磷酸二酯酶诱导的裂解、磷酸酶诱导的裂解和二硫键裂解。可替代地，接头可以对裂解有实质性抗性(例如，稳定接头或不可裂解接头)。在一些方面，接头是预先带电荷的接头、亲水性接头或基于二羧酸的接头。
在一方面，用于本发明中的接头衍生自交联试剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
不可裂解接头是能够使药物如类美登素与抗体以稳定、共价方式连接的任何化学部分并且不归入上文对可裂解接头所列的分类。因此，不可裂解接头对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解有实质性抗性。此外，不可裂解是指接头中或毗邻接头的化学键在药物如类美登素或抗体不丧失其活性的条件下经受住酸、光不稳定性裂解剂、肽酶、酯酶或裂解二硫键的化学或生理学化合物诱导的裂解的能力。
酸不稳定性接头是在酸性pH下可裂解的接头。例如，某些细胞内区室如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)并且提供适于裂解酸不稳定性接头的条件。
光不稳定性接头是在体表和在光可抵达的许多体腔中可用的接头。此外，红外线可穿透组织。
一些接头可以被肽酶裂解，即肽酶可裂解接头。仅某些肽易于在细胞内部或外部被裂解，参见例如，Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],626-629(1982)和Umemoto等人43Int.J.Cancer[国际癌症杂志],677-684(1989)。此外，肽由α-氨基酸和肽键组成，这些肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根与第二个氨基酸的氨基基团之间的酰胺键。将其他酰胺键，如赖氨酸的羧酸根与ε-氨基基团之间的键不理解为是肽键并且视为不可裂解的。
一些接头可以由酯酶裂解，即酯酶可裂解接头。同样，仅某些酯可以被细胞内部或外部存在的酯酶裂解。酯由羧酸和醇的缩合形成。简单酯是用简单醇如脂族醇和小环状醇和小芳族醇产生的酯。
预先带电荷的接头衍生自带电荷交联试剂，这些带电荷交联试剂掺入到抗体药物缀合物中后保持其电荷。预先带电荷的接头的实例可以在US 2009/0274713中找到。
3.ADC的缀合和制备
将接头-有效负载与抗原结合部分缀合的许多方法是本领域已知的(例如综述于：Antibody-Drug Conjugate[抗体-药物缀合物],Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第1045卷,L.Ducry编辑,Humana Press[胡马纳出版社](2013))。传统上，将药物与抗体的天然赖氨酸或天然半胱氨酸残基缀合。所得制剂是复合混合物。最近，采用位点特异性缀合方法来改善ADC制剂的治疗指数和均质性(对于综述：Panowski,S.；Bhakta,S.；Raab,H.；Polakis,P.；Junutula,J.R.mAbs[单克隆抗体]2014,6,34)。除了糖工程化之外(Zhou,Q.等人Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2014,25,510；Zhu,Z.等人mAbs[单克隆抗体]2014,6,1190)；制备位点特异性ADC的一些更常见方法是基于向抗体骨架中掺入工程化半胱氨酸(Junutula,J.R.等人,Nature biotechnology[自然生物技术]2008,26,925；Shinmi,D.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2016,27,1324)、非经典氨基酸(Tian,F.等人,Proceedings National Academy of Sciences USA[美国国家科学院院刊]2014,111,1766；Axup,J.Y.等人,Proceedings National Academy of Sciences USA[美国国家科学院院刊]2012,109,16101)或短肽序列(Drake,P.M.等人,Bioconjugatechemistry[生物缀合化学]2014,25,1331；Strop,P.等人,Chemistry&biology[化学与生物学]2013,20,161；Beerli,R.R.等人,PloS one[公共科学图书馆综合]2015,10,e0131177；Grunewald,J.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2015,26,2554)。这些方法提供了对细胞毒素的化学计量和连接位点的控制，从而使得缀合物相对于传统制备的ADC具有较佳的药代动力学(PK)、安全性和功效曲线。
本发明的缀合物可以通过本领域已知的任何方法来制备，这些方法如在美国专利号7,811,572、6,411,163、7,368,565和8,163,888，美国申请公开2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100，和PCT公开WO 2014/124316和WO 2015/138615中描述的那些方法。这些专利和专利申请公开的完整教导通过引用并入本文。
用于与工程化半胱氨酸抗体残基缀合的方法
可以使用通过例如定点诱变工程化到抗体中的半胱氨酸残基来制备本发明的缀合物。此类位点特异性缀合物是均质的并且具有改善的特性(Junutula JR,Raab H,ClarkS,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,Tsai SP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,Ng C,Yang J,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,Kim A,McDorman K,Flagella K,Venook R,Ross S,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,Polakis P,Mallet W.(2008)Nature Biotechnology[自然生物技术]26:925-932)。
因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化半胱氨酸在其生物合成期间通过加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰(Chen等人2009)，所以最初表达的产物中的工程化半胱氨酸残基对硫醇反应性试剂(如马来酰亚胺基或溴乙酰胺或碘乙酰胺基团)不起反应。为了将有效负载与表达后的工程化半胱氨酸缀合，需要通过还原这些二硫化物加合物去除谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常还需要还原表达的蛋白质中的天然二硫化物。经加合的工程化半胱氨酸的脱保护可以通过以下方式完成：首先将抗体暴露于还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、TCEP、或还原的半胱氨酸，然后是允许再氧化抗体的所有天然二硫键以恢复和/或稳定化功能性抗体结构的程序。
可以采用若干种方法来还原和再氧化具有工程化Cys残基以用于制备抗体药物缀合物的抗体。尝试使用高浓度的CuSO4遵循文献中先前描述的再氧化方案导致蛋白质沉淀(Junutula JR,Raab H,Clark S,Bhakta S,Leipold DD,Weir S,Chen Y,Simpson M,TsaiSP,Dennis MS,Lu Y,Meng YG,Ng C,Yang J,Lee CC,Duenas E,Gorrell J,Katta V,KimA,McDorman K,Flagella K,Venook R,Ross S,Spencer SD,Lee Wong W,Lowman HB,Vandlen R,Sliwkowski MX,Scheller RH,Polakis P,Mallet W.(2008)NatureBiotechnology[自然生物技术]26:925)。我们已经用若干种不同的还原和抗体再氧化方法成功制备并获得了抗体药物缀合物。
在一个实例中，将新鲜制备的DTT添加到纯化的Cys突变型抗体中至最终浓度为10mM。在与DTT在室温下孵育1小时后，将混合物在4℃下用PBS透析3天，每天更换缓冲液以去除DTT并再氧化抗体的天然二硫键。一种替代性方法是通过用PBS平衡的脱盐柱如Sephadex G-25去除还原剂。一旦蛋白质完全还原，任选地将1mM氧化的抗坏血酸盐(脱氢-抗坏血酸)添加到脱盐样品，并且进行再氧化孵育20-24小时。
在另一个示例性方法中，通过将20mM浓度的完全还原的半胱氨酸添加到与蛋白A-琼脂糖树脂结合的抗体来完成工程化Cys残基的脱保护。通过以下方式来实现对Cys加合物的还原：在室温下孵育大约30-60分钟，然后通过用50个床的PBS洗涤树脂来快速去除还原剂。通过在添加或不添加50-2000nM CuCl2作为加速剂的情况下在室温下孵育洗涤的浆液来实现对还原的抗体的再氧化。除了使用硫酸铜之外，本文的实例使用本文所述的每种方案，具有类似的结果。再氧化恢复链内二硫化物，而透析、脱盐或蛋白A色谱去除还原剂以及最初与抗体的一个或多个工程化半胱氨酸连接的半胱氨酸和谷胱甘肽。HPLC反相色谱典型地用于监测再氧化过程：将抗体加载到加热至80℃的PLRP-S柱(50mm x 2.1mm，安捷伦(Agilent))上，并且使用含有0.1％TFA的30％-45％CH3CN的水溶液的线性梯度以1.5mL/min洗脱，并且在215、254和280nm处进行峰值检测。
在再氧化后，将抗体与预先形成的接头-药物部分缀合。举例来说，将预先形成的接头-药物部分(例如像MMTBT-DM4；MPET-DM4；MBT-DM4；MEPET-DM4；MPBT-DM1；和如本文所述的其他接头-药物部分)以相对于PBS缓冲液(pH 7.2)中的抗体的10摩尔当量添加到再氧化的Cys突变型抗体中。进行孵育1小时。通过反相HPLC监测缀合过程，该反相HPLC能够将缀合的抗体与非缀合的抗体分离。将缀合反应混合物在加热至80℃的PRLP-S柱(50mm x 2.1mm，安捷伦)上分析，并且通过含有0.1％TFA的30％-60％乙腈的水溶液的线性梯度进行柱洗脱，流速为1.5ml/min。在280nm、254nm和215nm处监测来自柱的蛋白质的洗脱。
在一个实施例中，可以根据方案1至3制备用于半胱氨酸缀合的接头-药物部分的实例：
其中：
药物部分经由硫醇官能团连接至接头；
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
RG1和RG2是形成基团X的2个反应性基团。
形成酰胺或三唑的反应基团是本领域熟知的。
预先形成接头-药物部分的一个实例在方案2中表示，其中药物部分是DM4；RG1是氨基基团并且RG2是活化酸，导致酰胺键(X)的形成：
预先形成接头-药物部分的另一个实例在方案3中表示，其中药物部分是DM4；RG1是叠氮基团并且RG2是炔烃基团，导致四唑(X)的形成：
具有连接的马来酰亚胺的各种药物部分与Cys突变型抗体的缀合效率根据所用药物部分的溶解度而变化，然而，许多反应导致超过90％的缀合物。为了评价聚集状态，将所得的缀合物在尺寸排阻色谱柱(通用电气公司(GE)，Superdex200，3.2/30)中以0.1ml/min的流速在PBS中分析。所有缀合物主要是单体的。大多数缀合物含有少于3％的二聚体和寡聚体材料，这表明具有连接的马来酰亚胺的药物部分与Cys突变型抗体的缀合不会引起聚集。
免疫缀合物的特征还在于药物部分与抗体结合部分的平均负载量，通常称为药物对抗体比率(DAR)。例如，从还原和去糖基化样品的LC-MS数据外推出DAR值。LC/MS允许定量ADC中连接至抗体的有效负载(药物部分)分子的平均数。HPLC将抗体分离成轻链和重链，并且还根据每条链的接头-有效负载基团的数量分离重链(HC)和轻链(LC)。质谱数据能够鉴定混合物中的组分种类，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。根据LC和HC链的平均负载量，可以计算ADC的平均DAR。给定免疫缀合物样品的DAR表示连接至含有两条轻链和两条重链的四聚体抗体的药物(有效负载)分子的平均数。
用于与天然半胱氨酸抗体残基缀合的方法
如本文所述的接头-药物部分也可以使用涉及部分还原抗体的程序与非工程化抗体的天然半胱氨酸残基缀合(Doronina,S.O.,Toki,B.E.,Torgov,M.Y.,Mendelsohn,B.A.,Cerveny,C.G.,Chace,D.F.,DeBlanc,R.L.,Gearing,R.P.,Bovee,T.D.,Siegall,C.B.,Francisco,J.A.,Wahl,A.F.,Meyer,D.L.,and Senter,P.D.(2003)Development ofpotent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy[用于癌症疗法的有效单克隆抗体澳瑞司他汀缀合物的开发].Nat.Biotechnol.[自然生物技术]21,778-784)。以下方案是如何制备此类缀合物的非限制性实例：首先通过添加TCEP至最终浓度为10mM并且在37℃下孵育混合物1小时来将抗体(浓度典型地为5至10mg/ml)的链间和链内二硫键在含有2mM EDTA的PBS中部分还原。在脱盐并添加1％w/v PS-20洗涤剂后，将部分还原的抗体(1-2mg/ml)在4℃下与每10mg抗体0.5至1mg的含马来酰亚胺的接头有效负载化合物反应过夜。将所得的缀合物通过蛋白A色谱通过标准方法纯化并将缓冲液更换为PBS，并且典型地通过质谱(MS)、分析型尺寸排阻色谱(AnSEC)和分析型疏水相互作用色谱(AnHIC)针对其药物对抗体比率、聚集倾向和疏水性以及通过活性测定进行概要分析。
用于交联至赖氨酸抗体残基的单步骤法
在一个实施例中，本发明的缀合物可以通过用于将药物交联至抗体上的赖氨酸残基的单步骤法制备。该方法包括在合适的pH下将抗体、药物和交联剂在基本上水性的介质中合并，该介质任选地含有一种或多种共溶剂。在一个实施例中，该方法包括以下步骤：在具有约4至约9的pH的溶液中使本发明的抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物的第一混合物，并且然后使包含抗体和药物的第一混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以提供包含(i)缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)、和(iii)反应副产物的混合物。
在一个实施例中，单步骤法包括在具有约6或更大(例如，约6至约9、约6至约7、约7至约9、约7至约8.5、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约8.0至约9.0、或约8.5至约9.0)的pH的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，本发明的方法包括在具有约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、或约9.0的pH的溶液中使细胞结合剂与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在一个具体实施例中，本发明的方法包括在具有约7.8的pH(例如，7.6至8.0的pH或7.7至7.9的pH)的溶液中使细胞结合剂与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
单步骤法(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1接触)可以在本领域已知的任何合适温度下进行。例如，单步骤法可以在约20℃或更低(例如，约-10℃(条件是防止溶液冻结，例如通过存在用来溶解细胞毒性剂的有机溶剂和双官能交联试剂)至约20℃、约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)下、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)下、或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)下发生。在一个实施例中，单步骤法在约16℃至约24℃(例如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、或约25℃)的温度下发生。在另一个实施例中，单步骤法在约15℃或更低(例如，约-10℃至约15℃、或约0℃至约15℃)的温度下进行。例如，该方法包括在约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、约-1℃、约-2℃、约-3℃、约-4℃、约-5℃、约-6℃、约-7℃、约-8℃、约-9℃、或约-10℃的温度下使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，条件是防止溶液冻结，例如通过存在用来溶解交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、磺基-SPDB、SPDB或CX1-1)的一种或多种有机溶剂。在一个实施例中，该方法包括在约-10℃至约15℃、约0℃至约15℃、约0℃至约10℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约10℃至约15℃、或约5℃至约10℃的温度下使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在另一个实施例中，该方法包括在约10℃的温度(例如，8℃至12℃的温度或9℃至11℃的温度)下使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在一个实施例中，通过以下方式实现上述的接触：提供抗体，然后使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的第一混合物，并且然后使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的第一混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，在一个实施例中，在反应容器中提供抗体，添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器中(从而与抗体接触)，并且然后将交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加到包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物中(从而与包含抗体和药物的混合物接触)。在一个实施例中，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后立即添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器中。在另一个实施例中，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后某个时间区间(例如，在向该空间提供细胞结合剂后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟，约1小时、约1天或更长时间)之后添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器中。可以迅速(即，在短时间区间，如约5分钟、约10分钟内)或缓慢(如通过使用泵)添加药物(例如，DM1或DM4)。
然后可以将包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后立即接触或在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后的某个更晚时间点(例如，约5分钟至约8小时或更长时间)接触。例如，在一个实施例中，在添加药物(例如，DM1或DM4)至包含抗体的反应容器中后立即添加交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)至包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物中。可替代地，包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物可以在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长时间与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后，使反应推进约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或更长(例如约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、或约48小时)。
在一个实施例中，单步骤法进一步包括使任何未反应的药物(例如，DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)淬灭的淬灭步骤。淬灭步骤典型地在纯化缀合物之前进行。在一个实施例中，通过使混合物与淬灭试剂接触来使混合物淬灭。如本文所用，“淬灭试剂”是指与游离药物(例如，DM1或DM4)和/或游离交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应的试剂。在一个实施例中，马来酰亚胺或卤乙酰胺淬灭试剂，如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰胺基丙酸，可以用来确保药物(例如，DM1或DM4)中的任何未反应基团(如硫醇)淬灭。淬灭步骤可以帮助防止药物(例如，DM1)二聚化。二聚化的DM1可能难以去除。一旦用极性、带电荷的硫醇淬灭试剂(如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)淬灭，多余的未反应DM1转化成极性、带电荷的水溶性加合物，该加合物可以在纯化步骤期间容易地与共价连接的缀合物分离。也可以使用非极性和中性硫醇淬灭试剂淬灭。在一个实施例中，通过使混合物与淬灭试剂接触来使混合物淬灭，该淬灭试剂与未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应。例如，可以将亲核试剂添加到混合物中以淬灭任何未反应的SMCC。亲核试剂优选地是含有氨基基团的亲核试剂，如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。
在一个优选实施例中，在使混合物与淬灭试剂接触之前，允许反应(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且然后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触)推进至完成。在这个方面，在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或约25小时至约48小时)将淬灭试剂添加到混合物中。
可替代地，通过将混合物的pH降低至约5.0(例如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)来使混合物淬灭。在另一个实施例中，通过将pH降低至小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0来使混合物淬灭。可替代地，将pH降低至约4.0(例如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至约6.0(例如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、约4.0至约5.0、约4.5(例如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至约5.0。在一个实施例中，通过将混合物的pH降低至4.8来使混合物淬灭。在另一个实施例中，通过将混合物的pH降低至5.5来使混合物淬灭。
在一个实施例中，单步骤法进一步包括从抗体释放不稳定结合的接头的保持步骤。保持步骤包括在纯化缀合物之前(例如，在反应步骤后、在反应步骤与淬灭步骤之间、或在淬灭步骤后)保持混合物。例如，该方法包括(a)在具有约4至约9的pH的溶液中使抗体与药物(例如，DM1、DM3或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1、DM3或DM4)的混合物；并且然后使包含抗体和药物(例如，DM1、DM3或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)、和(iii)反应副产物的混合物，(b)保持在步骤(a)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，并且(c)纯化混合物以提供纯化的缀合物。
在另一个实施例中，该方法包括(a)在具有约4至约9的pH的溶液中使抗体与药物(例如，DM1、DM3或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1、DM3或DM4)的混合物；并且然后使包含抗体和药物(例如，DM1、DM3或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物、(ii)游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)、和(iii)反应副产物的混合物，(b)淬灭在步骤(a)中制备的混合物以淬灭任何未反应的药物(例如，DM1、DM3或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)，(c)保持在步骤(b)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，并且(d)纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)。
可替代地，保持步骤可以在纯化缀合物后进行，随后进行额外的纯化步骤。
在一个优选实施例中，在保持步骤之前允许反应推进至完成。在这个方面，在包含抗体和药物(例如，DM1、DM3或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或约24小时至约48小时)可以进行保持步骤。
保持步骤包括将溶液维持在合适的温度(例如，约0℃至约37℃)持续合适的时间段(例如，约1小时至约1周、约1小时至约24小时、约1小时至约8小时或约1小时至约4小时)以从抗体释放不稳定结合的接头，同时基本上不从抗体释放稳定结合的接头。在一个实施例中，保持步骤包括将溶液维持在约20℃或更低(例如，约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)下、室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)下、或升高的温度(例如，约30℃至约37℃)下。在一个实施例中，保持步骤包括将溶液维持在约16℃至约24℃(例如，约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、或约25℃)的温度下。在另一个实施例中，保持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃(例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、或约10℃)的温度下。在另一个实施例中，保持步骤包括将溶液维持在约37℃(例如，约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、或约40℃)的温度下。
保持步骤的持续时间取决于进行保持步骤的温度和pH。例如，可以通过在升高的温度下进行保持步骤大幅度减少保持步骤的持续时间，最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性限制。保持步骤可以包括将溶液维持约1小时至约1天(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、或约24小时)、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约14小时至约24小时、约16小时至约24小时、约18小时至约24小时、约20小时至约24小时、约5小时至约1周、约20小时至约1周、约12小时至约1周(例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天)、或约1天至约1周。
在一个实施例中，保持步骤包括将溶液在约2℃至约8℃的温度下维持至少约12小时、至多一周的时段。在另一个实施例中，保持步骤包括将溶液在约2℃至约8℃的温度下维持过夜(例如，约12至约24小时，优选地约20小时)。
用于保持步骤的pH值优选地是约4至约10。在一个实施例中，用于保持步骤的pH值是约4或更大，但是小于约6(例如，4至5.9)或约5或更大，但是小于约6(例如，5至5.9)。在另一个实施例中，用于保持步骤的pH值范围为从约6至约10(例如，约6.5至约9、约6至约8)。例如，用于保持步骤的pH值可以是约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、或约10。
在具体实施例中，保持步骤可以包括将混合物在25℃下、在约6-7.5的pH下孵育约12小时至约1周，将混合物在4℃下、在约4.5-5.9的pH下孵育约5小时至约5天，或将混合物在25℃下、在约4.5-5.9的pH下孵育约5小时至约1天。
单步骤法可以任选地包括向反应步骤添加蔗糖以增加溶解度和缀合物的回收率。合乎需要地，将蔗糖以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)(例如约0.1％(w/v)、1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)、或20％(w/v))的浓度添加。优选地，将蔗糖以约1％(w/v)至约10％(w/v)(例如约0.5％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)、或约11％(w/v))的浓度添加。此外，反应步骤还可以包括添加缓冲剂。可以使用本领域已知的任何合适缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在一个实施例中，缓冲剂选自下组，该组由以下组成：HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、及其组合。
在一个实施例中，单步骤法可以进一步包括纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)的步骤。本领域已知的任何纯化方法可以用来纯化本发明的缀合物。在一个实施例中，使用切向流过滤(TFF)、非吸附性色谱、吸附性色谱、吸附性过滤、选择性沉淀或任何其他合适的纯化过程以及其组合纯化本发明的缀合物。在另一个实施例中，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之前，首先将缀合物通过一个或多个PVDF膜过滤。可替代地，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之后，将缀合物通过一个或多个PVDF膜过滤。例如，在一个实施例中，将缀合物通过一个或多个PVDF膜过滤并且然后使用切向流过滤纯化。可替代地，将缀合物使用切向流过滤纯化并且然后通过一个或多个PVDF膜过滤。
任何合适的TFF系统可以用于纯化，包括Pellicon型系统(密理博公司(Millipore)，比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州(MA))、Sartocon膜包系统(赛多利斯公司(Sartorius AG)，埃奇伍德(Edgewood)，纽约)、和Centrasette型系统(颇尔公司(PallCorp.)，东希尔斯(East Hills)，纽约)。
任何合适的吸附性色谱树脂可以用于纯化。优选的吸附性色谱树脂包括羟基磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱、及其组合。合适的羟基磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟基磷灰石(CHT I型和II型，伯乐生命医学产品有限公司(Biorad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州(CA))、HAUltrogel羟基磷灰石(颇尔公司，东希尔斯，纽约)和陶瓷氟磷灰石(CFT I型和II型，伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。合适的HCIC树脂的实例是MEPHypercel树脂(颇尔公司，东希尔斯，纽约)。合适的HIC树脂的实例包括丁基-琼脂糖凝胶、己基-琼脂糖凝胶、苯基-琼脂糖凝胶和辛基琼脂糖凝胶树脂(全部来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)，以及Macro-prep甲基树脂和Macro-prep叔丁基树脂(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖凝胶、CM-琼脂糖凝胶和Q-琼脂糖凝胶树脂(全部来自通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)和Unosphere S树脂(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。合适的混合模式离子交换剂的实例包括Bakerbond ABx树脂(马林克罗特贝克有限公司(JT Baker)，菲利普斯堡(Phillipsburg)，新泽西州)。合适的IMAC树脂的实例包含螯合琼脂糖凝胶树脂(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)和Profinity IMAC树脂(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。合适的染料配体树脂的实例包含蓝色琼脂糖凝胶树脂(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)和Affi-凝胶蓝色树脂(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)。合适的亲和树脂的实例包括蛋白A琼脂糖凝胶树脂(例如，MabSelect，通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)和凝集素亲和树脂，例如兵豆凝集素琼脂糖凝胶树脂(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)，其中抗体携带适当的凝集素结合位点。合适的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂(格雷斯(Grace)Vydac，希斯皮里亚(Hesperia)，加利福尼亚州)。
任何合适的非吸附性色谱树脂可以用于纯化。合适的非吸附性色谱树脂的实例包括但不限于SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂(例如S-200和S-300)、SUPERDEXTM树脂(例如SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200)、树脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60和P-100)和本领域普通技术人员已知的其他树脂。
用于交联至赖氨酸抗体残基的两步骤法和单罐法
在一个实施例中，本发明的缀合物可以如美国专利7,811,572和美国专利申请公开号2006/0182750中所述制备。该方法包括以下步骤：(a)使本发明的抗体与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以将接头(即Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1)共价连接至抗体并且从而制备包含具有与之结合的接头的抗体的第一混合物；(b)任选地使第一混合物经历纯化过程以制备具有与之结合的接头的抗体的经纯化的第一混合物；(c)通过在具有约4至约9的pH的溶液中使具有与之结合的接头的抗体与药物(例如，DM1、DM3、或DM4)反应，使药物(例如，DM1、DM3或DM4)与第一混合物中具有与之结合的接头的抗体缀合以制备包含(i)缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1、DM3或DM4)、和(iii)反应副产物的第二混合物；和(d)使第二混合物经历纯化过程以将缀合物从第二混合物的其他组分纯化。可替代地，可以省略纯化步骤(b)。本文所述的任何纯化方法均可以用于步骤(b)和(d)。在一个实施例中，将TFF用于步骤(b)和步骤(d)。在另一个实施例中，将TFF用于步骤(b)并且将吸附性色谱(例如CHT)用于步骤(d)。
用于交联至赖氨酸抗体残基的单步骤试剂和原位法
在一个实施例中，可以通过以下方式制备本发明的缀合物：使预先形成的接头-药物化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)与本发明的抗体缀合，如美国专利6,441,163和美国专利申请公开号2011/0003969和2008/0145374中所述，随后进行纯化步骤。可以使用本文所述的任何纯化方法。通过使药物(例如，DM1、DM3或DM4)与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应制备接头-药物化合物。使接头-药物化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)任选地在与抗体缀合之前经历纯化。
抗CCR7抗体
本发明提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。本发明的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括但不限于如实例中所述那样分离的人单克隆抗体或其片段。
在某些实施例中，本发明提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:13、45、77或608的氨基酸序列的VH结构域。在某些实施例中，本发明还提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有下文表1和表4中列出的任一VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。在具体实施例中，本发明提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体包含以下(或可替代地，由以下组成)：一个、两个、三个、四个、五个或更多个具有下文表1和表4中列出的任一VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。
本发明提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:29、61、93或624的氨基酸序列的VL结构域。本发明还提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有下文表1和表4中列出的任一VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。特别地，本发明提供了特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含以下(或可替代地，由以下组成)：一个、两个、三个或更多个具有下文表1和表4中列出的任一VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。
本发明的其他抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含如下氨基酸，这些氨基酸已经突变，但在CDR区中与表1和表4中所述序列中绘示的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性。在一些实施例中，抗体包含突变氨基酸序列，其中当与表1和表4中所述序列中绘示的CDR区相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变。
本发明还提供了核酸序列，这些核酸序列编码特异性结合CCR7的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链。此类核酸序列可以针对哺乳动物细胞中的表达进行优化。
贯穿在本申请的全文中，如果说明书的文本与序列表之间存在差异，则以说明书的文本为准。
表1.本发明的抗CCR7抗体的实例
本发明的其他抗体包括如下那些抗体，其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经突变，但与表1和表4中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性。在一些实施例中，当与表1和表4中所述序列中绘示的可变区相比时，在可变区中1、2、3、4或5个氨基酸已经突变，但同时保留与表1和表4中列出的抗体基本上相同的治疗活性。
由于这些抗体中的每一种都可以结合CCR7，因此VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以是“混合且匹配的”以产生本发明的其他CCR7结合抗体。可以使用本领域已知的结合测定(例如，ELISA和实例部分中描述的其他测定)来测试此类“混合且匹配的”CCR7结合抗体。当这些链被混合且匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当用结构上相似的VH序列替代。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当用结构上相似的全长重链序列替代。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当用结构上相似的VL序列替代。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当用结构上相似的全长轻链序列替代。因此，在一个方面，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合区，该单克隆抗体或其抗原结合区具有：重链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO:13、45、77和608组成的组的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:29、61、93和624组成的组的氨基酸序列；其中抗体特异性结合CCR7。
在另一个方面，本发明提供了(i)一种分离的单克隆抗体，该单克隆抗体具有：全长重链，该全长重链包含选自由SEQ ID NO:15、47、79和610组成的组、已针对在哺乳动物表达系统的细胞中的表达进行优化的氨基酸序列；和全长轻链，该全长轻链包含选自由SEQID NO:31、63、95和626组成的组、已针对在哺乳动物细胞中的表达进行优化的氨基酸序列；或(ii)一种包含其抗原结合部分的功能性蛋白。
在另一个方面，本发明提供了CCR7结合抗体，该CCR7结合抗体包含如表1和表4中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3、或其组合。抗体的VH CDR1的氨基酸序列例如示于SEQID NO:1、4、7、10、33、36、39、42、65、68、71和74中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列例如示于SEQ ID NO:2、5、8、11、34、37、40、43、66、69、72和75中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列例如示于SEQ ID NO:3、6、9、12、35、38、41、44、67、70、73和76中。抗体的VL CDR1的氨基酸序列例如示于SEQ ID NO:17、20、23、26、49、52、55、58、81、84、87和90中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列例如示于SEQ ID NO:18、21、24、27、50、53、56、59、82、85、88和91中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列例如示于SEQ ID NO:19、22、25、28、51、54、57、60、83、86、89和92中。
鉴于这些抗体中的每一种都可以结合CCR7并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合且匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合且匹配)。可以使用本领域已知的结合测定和实例中描述的那些结合测定(例如，ELISA)来测试此类“混合且匹配的”CCR7结合抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替代为一种或多种结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替代为一种或多种结构上相似的CDR序列。对于普通技术人员来说容易清楚的是，可以通过用来自本文针对本发明单克隆抗体所示的CDR序列的结构相似序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新颖的VH和VL序列。
因此，在一些实施例中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合区，该分离的单克隆抗体或其抗原结合区包含重链CDR1，该重链CDR1包含选自由SEQ ID NO:1、4、7、10、33、36、39、42、65、68、71、74、596、599、602和605组成的组的氨基酸序列；重链CDR2，该重链CDR2包含选自由SEQ ID NO:2、5、8、11、34、37、40、43、66、69、72、75、597、600、603和606组成的组的氨基酸序列；重链CDR3，该重链CDR3包含选自由SEQ ID NO:3、6、9、12、35、38、41、44、67、70、73、76、598、601、604和607组成的组的氨基酸序列；轻链CDR1，该轻链CDR1包含选自由SEQ ID NO:17、20、23、26、49、52、55、58、81、84、87、90、612、615、618和621组成的组的氨基酸序列；轻链CDR2，该轻链CDR2包含选自由SEQ ID NO:18、21、24、27、50、53、56、59、82、85、88、91、613、616、619和622组成的组的氨基酸序列；以及轻链CDR3，该轻链CDR3包含选自由SEQ ID NO:19、22、25、28、51、54、57、60、83、86、89、92、614、617、620和623组成的组的氨基酸序列；其中抗体特异性结合CCR7。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:1的重链CDR1；SEQ ID NO:2的重链CDR2；SEQ ID NO:3的重链CDR3；SEQ IDNO:17的轻链CDR1；SEQ ID NO:18的轻链CDR2；和SEQ ID NO:19的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:4的重链CDR1；SEQ ID NO:5的重链CDR2；SEQ ID NO:6的重链CDR3；SEQ IDNO:20的轻链CDR1；SEQ ID NO:21的轻链CDR2；和SEQ ID NO:22的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:7的重链CDR1；SEQ ID NO:8的重链CDR2；SEQ ID NO:9的重链CDR3；SEQ IDNO:23的轻链CDR1；SEQ ID NO:24的轻链CDR2；和SEQ ID NO:25的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:10的重链CDR1；SEQ ID NO:11的重链CDR2；SEQ ID NO:12的重链CDR3；SEQ IDNO:26的轻链CDR1；SEQ ID NO:27的轻链CDR2；和SEQ ID NO:28的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:33的重链CDR1；SEQ ID NO:34的重链CDR2；SEQ ID NO:35的重链CDR3；SEQ IDNO:49的轻链CDR1；SEQ ID NO:50的轻链CDR2；和SEQ ID NO:51的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:36的重链CDR1；SEQ ID NO:37的重链CDR2；SEQ ID NO:38的重链CDR3；SEQ IDNO:52的轻链CDR1；SEQ ID NO:53的轻链CDR2；和SEQ ID NO:54的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:39的重链CDR1；SEQ ID NO:40的重链CDR2；SEQ ID NO:41的重链CDR3；SEQ IDNO:55的轻链CDR1；SEQ ID NO:56的轻链CDR2；和SEQ ID NO:57的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:42的重链CDR1；SEQ ID NO:43的重链CDR2；SEQ ID NO:44的重链CDR3；SEQ IDNO:58的轻链CDR1；SEQ ID NO:59的轻链CDR2；和SEQ ID NO:60的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:65的重链CDR1；SEQ ID NO:66的重链CDR2；SEQ ID NO:67的重链CDR3；SEQ IDNO:81的轻链CDR1；SEQ ID NO:82的轻链CDR2；和SEQ ID NO:83的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:68的重链CDR1；SEQ ID NO:69的重链CDR2；SEQ ID NO:70的重链CDR3；SEQ IDNO:84的轻链CDR1；SEQ ID NO:85的轻链CDR2；和SEQ ID NO:86的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:71的重链CDR1；SEQ ID NO:72的重链CDR2；SEQ ID NO:73的重链CDR3；SEQ IDNO:87的轻链CDR1；SEQ ID NO:88的轻链CDR2；和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含SEQ ID NO:74的重链CDR1；SEQ ID NO:75的重链CDR2；SEQ ID NO:76的重链CDR3；SEQ IDNO:90的轻链CDR1；SEQ ID NO:91的轻链CDR2；和SEQ ID NO:92的轻链CDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:596的HCDR1、SEQ ID NO:597的HCDR2、和SEQID NO:598的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:612的LCDR1、SEQ ID NO:613的LCDR2、和SEQ ID NO:614的LCDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:599的HCDR1、SEQ ID NO:600的HCDR2、和SEQID NO:601的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:615的LCDR1、SEQ ID NO:616的LCDR2、和SEQ ID NO:617的LCDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:602的HCDR1、SEQ ID NO:603的HCDR2和SEQID NO:604的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:618的LCDR1、SEQ ID NO:619的LCDR2、和SEQ ID NO:620的LCDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:605的HCDR1、SEQ ID NO:606的HCDR2、和SEQID NO:607的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:621的LCDR1、SEQ ID NO:622的LCDR2、和SEQ ID NO:623的LCDR3。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:608的氨基酸序列的重链可变区(VH)、和含有SEQ ID NO:624的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链、和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链、和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链、和含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链。
在一个具体实施例中，特异性结合CCR7的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含含有SEQ ID NO:610的氨基酸序列的重链、和含有SEQ ID NO:626的氨基酸序列的轻链。
在某些实施例中，特异性结合CCR7的抗体是表1和表4中所述的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
1.对表位和结合相同表位的抗体的鉴定
本发明还提供了特异性结合与表1和表4中所述的抗CCR7抗体相同的表位、或与表1和表4中所述的抗体交叉竞争的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。因此可以基于在CCR7结合测定(例如，经由BIACORE或本领域技术人员已知用于测量结合的测定)中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定另外的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。测试抗体抑制本发明的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)与CCR7(例如，人CCR7)结合的能力表明，测试抗体可以与这种抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)竞争结合CCR7；根据非限制性理论，这种抗体可以结合CCR7蛋白上与该抗体竞争的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近或重叠)的表位。在某些实施例中，结合CCR7上与表1和表4中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)相同的表位结合的抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。可如本文所述那样制备和分离此类人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
2.对Fc框架的进一步改变
本发明的免疫缀合物可以包含经修饰的抗体或其抗原结合片段，这些经修饰的抗体或其抗原结合片段进一步在VH和/或VL内部包含对框架残基的修饰，例如以改善抗体的特性。在一些实施例中，进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更确切地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列恢复为其种系构型，可以通过例如定点诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。此类“回复突变的”抗体也旨在为本发明所涵盖。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步详细描述。
除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或在于框架或CDR区内进行的修饰的替代方案中，可以将本发明的抗体工程化以包含Fc区内的修饰，典型地是为了改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，本发明的抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。以下更详细地描述了这些实施例中的每一个。
在一个实施例中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如有利于轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗体片段包含经修饰或工程化的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，以作为用于与药物部分缀合的位点(Junutula JR等人:Nat Biotechnol[自然生物技术]2008,26:925-932)。在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的抗体或抗体片段，该经修饰的抗体或抗体片段包含在本文所述的位置处用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。用于半胱氨酸取代的位点是在抗体或抗体片段的恒定区中并且因此适用于多种抗体或抗体片段，并且选择位点以提供稳定且均质的缀合物。经修饰的抗体或片段可以具有一个、两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于将半胱氨酸插入在抗体的特定位置处的方法是本领域已知的，参见例如Lyons等人,(1990)Protein Eng.[蛋白质工程],3:703-708、WO2011/005481、WO 2014/124316、WO 2015/138615。在某些实施例中，经修饰的抗体包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中位置是根据EU系统编号的。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203，其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代组合，其中组合包括在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、或抗体轻链的位置107处的取代，并且其中位置是根据EU系统编号的。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中取代是抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、抗体轻链的位置107、抗体轻链的位置165或抗体轻链的位置159并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。在具体实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个氨基酸的取代组合，其中组合包括在抗体重链的位置375和抗体重链的位置152处的取代，其中位置是根据EU系统编号的。在具体实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体重链的位置360处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中位置是根据EU系统编号的。在其他具体实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体轻链的位置107处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在另外的实施例中，可用于本发明的免疫缀合物的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括经修饰或工程化的抗体，如以下抗体，该抗体经修饰以引入一个或多个其他反应性氨基酸(除半胱氨酸外)(包括Pcl、吡咯赖氨酸、肽标签(如S6、A1和ybbR标签)和非天然氨基酸)以替代天然序列的至少一个氨基酸，从而在抗体或抗原结合片段上提供用于与具有互补反应性的药物部分或接头-药物部分缀合的反应位点。例如，可以修饰抗体或抗体片段以掺入Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou等人,(2011)PNAS[美国国家科学院院刊]108(26),10437-10442；WO 2014124258)或非天然氨基酸(J.Y.Axup等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊],109(2012),第16101-16106页；对于综述，参见Liu和P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem[生物化学年评]79,413-444；C.H.Kim等人,(2013)Curr Opin ChemBiol.[化学生物学新见]17,412-419)作为用于与药物缀合的位点。类似地，可以将用于酶学缀合方法的肽标签引入到抗体中(Strop P.等人,Chem Biol.[化学生物学]2013,20(2):161-7；Rabuka D.,Curr Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2010年12月；14(6):790-6；Rabuka D等人,Nat Protoc.[自然实验手册]2012,7(6):1052-67)。一个其他实例是使用4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)用于辅酶A类似物的缀合(WO 2013184514)和(Grünewald等人,(2015)Bioconjugate Chem.[生物缀合化学]26(12),2554-62)。用于将此类经修饰或工程化的抗体与有效负载或接头-有效负载组合缀合的方法是本领域已知的。
在另一个实施例中，使抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得抗体具有相对于天然Fc铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在又其他实施例中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中得到描述。
在另一个实施例中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替代，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中得到描述。
在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中得到描述。异型氨基酸残基包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如由Jefferis等人,MAbs.[单克隆抗体]1:332-338(2009)所述的。
含有此类突变的抗体融合蛋白复合物介导降低的或没有的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为A234和A235。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基N267被取代为A267。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基D265和P329被取代为A265和A329。在某些实施例中，免疫球蛋白重链任选地包含选自以下中任一种的赋予降低的效应子功能的突变或突变组合：D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A。在具体实施例中，免疫缀合物包含这样的免疫球蛋白重链，该免疫球蛋白重链包含选自以下中任一种的赋予降低的效应子功能的突变或突变组合：D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A。
在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中得到描述。在一个具体实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被一个或多个异型氨基酸残基替代。异型氨基酸残基也包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如由Jefferis等人,MAbs.[单克隆抗体]1:332-338(2009)所述的。
在还另一个实施例中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。这种方法在例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中得到描述。
在另一个实施例中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
3.CCR7抗体的产生
可以通过本领域已知的任何手段产生抗CCR7抗体及其抗体片段(例如，抗原结合片段)，这些手段包括但不限于重组表达、化学合成和酶促消化抗体四聚体，而全长单克隆抗体可以通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本披露进一步提供了编码本文所述的抗体的多核苷酸，例如，编码包含如本文所述的互补性决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些实施例中，编码重链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:14、46、78和609组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施例中，编码轻链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:30、62、94和625组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施例中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:16、48、80或611的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施例中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:32、64、96或627的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本发明的多核苷酸可以仅编码抗CCR7抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含一种所例举小鼠抗CCR7抗体的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与一种小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区基本上相同的两个多肽区段。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗CCR7抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实例中所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，如Narang等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90,1979的磷酸三酯方法；Brown等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,Tetra.Lett.[四面体快报],22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体支持方法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以如以下文献中所述进行，例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification[PCR技术：DNA扩增的原理和应用],H.A.Erlich(编辑),Freeman Press[弗里曼出版社],纽约,纽约州,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南],Innis等人,(编辑),Academic Press[学术出版社],San Diego[圣地亚哥],加利福尼亚州,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]19:967,1991；以及Eckert等人,PCR Methods and Applications[PCR方法和应用]1:17,1991。
本发明中还提供了用于产生上文描述的抗CCR7抗体的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码抗CCR7抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)以及人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,Nat Genet.[自然遗传学]15:345,1997)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达抗CCR7多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNATM3.1/His、pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的载体。参见Brent等人,同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143,1992。
表达载体的选择取决于待表达该载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码抗CCR7抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施例中，采用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件以高效表达抗CCR7抗体链或片段。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与通过插入的抗CCR7抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，所插入的抗CCR7抗体序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码抗CCR7抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整抗体或其片段。典型地，此类恒定区是人类的。
用于携带并表达抗CCR7抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本发明多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草杆菌)和其他肠杆菌科(如沙门氏菌属、沙雷氏菌属)以及各种假单胞菌属的种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，这些表达载体典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制的起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选使用操纵基因序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达本发明的抗CCR7多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一些优选实施例中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗CCR7多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养物表达多肽在例如Winnacker,From Genes to Clones[从基因到克隆],VCH Publishers[VCH出版商],纽约,纽约州,1987中进行了大体论述。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如，Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68,1986)，和必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或衍生自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第4版)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、冲击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell[细胞]88:223,1997)、药剂增强的DNA摄取和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量生产，通常期望稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标志物基因的本发明表达载体来制备稳定表达抗CCR7抗体链或结合片段的细胞系。在引入载体之后，可以使细胞在富集的培养基中生长1-2天，之后将它们转换至选择性培养基。选择性标志物的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表达引入的序列的细胞的生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
治疗用途
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于多种应用，包括但不限于治疗或预防癌症，如实体癌症或血基质恶性肿瘤。在某些实施例中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积、和/或降低肿瘤的致瘤性。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一个方面，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于检测CCR7在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织。在某些实施例中，此类组织包含相对于其他组织以较高水平表达CCR7的正常组织和/或癌性组织。
在一个方面，本发明提供了一种检测CCR7在生物样品中的存在的方法。在某些实施例中，该方法包括使生物样品与抗CCR7抗体在允许抗体与抗原结合的条件下接触，并且检测是否在抗体与抗原之间形成复合物。
在一个方面，本发明提供了一种诊断与CCR7表达增加相关的障碍的方法。在某些实施例中，该方法包括使测试细胞与抗CCR7抗体接触；通过检测抗CCR7抗体与CCR7抗原的结合，(定量或定性地)测定测试细胞上的CCR7表达水平；并且比较测试细胞中的CCR7表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞相同的组织来源的正常细胞或以与这种正常细胞相当的水平表达CCR7的细胞)上的CCR7表达水平，其中与对照细胞相比，测试细胞上CCR7的更高表达水平指示存在与CCR7表达增加相关的障碍。在某些实施例中，测试细胞从疑似患有与CCR7表达增加相关的障碍的个体获得。在某些实施例中，障碍是细胞增殖性疾病，如癌症或肿瘤。在某些实施例中，该方法包括测量CCR7基因在测试细胞中的拷贝数。
在某些实施例中，诊断或检测方法(如上文所述的那些)包括检测抗CCR7抗体与细胞表面上表达的或膜制备物中的CCR7的结合，该膜制备物从在其表面上表达CCR7的细胞获得。用于检测抗CCR7抗体与细胞表面上表达的CCR7结合的示例性测定是“FACS”测定。
某些其他方法可以用来检测抗CCR7抗体与CCR7的结合。此类方法包括但不限于本领域熟知的抗原结合测定，如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施例中，抗CCR7抗体是标记的。标记包括但不限于直接检测到的标记或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测到(例如通过酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。
在某些实施例中，抗CCR7抗体固定在不溶性基质上。固定化能够将抗CCR7抗体与在溶液中保持游离的任何CCR7蛋白分离。通过使抗CCR7抗体在测定程序之前不溶，如通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等人,美国专利号3,720,760)、或通过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)，或通过在抗CCR7抗体与CCR7蛋白之间形成复合物之后使抗CCR7抗体不溶(例如，通过免疫沉淀)，常规地完成这一点。
可以使用本发明的免疫缀合物替代抗CCR7抗体或除抗CCR7抗体外还使用本发明的免疫缀合物，进行诊断或检测的任一个以上实施例。
在一个实施例中，本发明提供了一种治疗或预防疾病的方法，该方法包括将本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物给予至患者。本发明还提供了本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物治疗或预防患者的疾病的用途。在一些实施例中，本发明提供了本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物，用于治疗或预防患者的疾病。在另外的实施例中，本发明提供了本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物在制造用于治疗或预防患者的疾病的药物中的用途。
在某些实施例中，用本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物治疗的疾病是癌症。在某些实施例中，癌症的特征在于表达CCR7的细胞，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物结合这些细胞。在某些实施例中，癌症的特征在于相对于健康患者CCR7表达增加。在一些实施例中，可以通过CCR7RNA的增加测量CCR7的表达。在其他实施例中，癌症的特征在于CCR7的DNA拷贝数增加。测量或测定CCR7表达水平的其他方法是本领域技术人员已知的。可以治疗和/或预防的疾病的实例包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、鼻咽癌(NPC)、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、肾细胞癌和宫颈癌。
本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，这些方法包括给予治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些实施例中，癌症是实体癌症。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，癌症是抗性癌症和/或复发性癌症。在某些方面，例如，抗性癌症对酪氨酸激酶抑制剂，EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂有抗性。
在某些实施例中，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法，这些方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，受试者具有肿瘤或已去除肿瘤。在某些实施例中，肿瘤对其他酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂有抗性。
在某些实施例中，肿瘤表达抗CCR7抗体结合的CCR7。在某些实施例中，肿瘤过表达人CCR7。在某些实施例中，肿瘤具有增加的CCR7基因拷贝数。
本发明还提供了用于选择患者以用本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物治疗的方法，这些方法包括给予治疗有效量的所述抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面，该方法包括选择患有酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症的患者。在某些方面，设想了酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症对EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和/或Met抑制剂有抗性。在某些方面，设想了抗性癌症是Her2抗性癌症。在某些方面，设想了癌症是从头抗性癌症，并且在仍其他方面，设想了癌症是复发性癌症。在本发明的某些方面，这些方法包括选择患有从头抗性癌症或复发性癌症的患者并且测量CCR7的表达。设想了在某些方面，复发性癌症或肿瘤起初不是表达CCR7的癌症或肿瘤，但是用酪氨酸激酶抑制剂治疗后变成CCR7阳性癌症，该CCR7阳性癌症是酪氨酸激酶抑制剂抗性癌症或肿瘤或复发性癌症或肿瘤。
为了治疗或预防疾病，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的适当剂量取决于多种因素，如待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、疾病的应答性、既往疗法、患者临床史等。抗体或药剂可以一次性或经一系列治疗给予，持续几日至几个月或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如，肿瘤尺寸减小)。最佳给药方案可以从测量患者体内的药物累积量计算出并且将根据单独抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的相对效力变化。治疗医师可以基于药物在体液或组织中的所测停留时间和浓度，估计重复给药率。
组合疗法
在某些情况下，将本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物与其他治疗剂组合，这些其他治疗剂如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或抗呕剂)、镇痛药、细胞保护剂及其组合。
在一个实施例中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物在药物组合配制品或作为组合疗法的给药方案中与具有抗癌特性的第二化合物组合。药物组合配制品或给药方案的第二化合物可以对该组合的抗体或免疫缀合物具有互补活性，使得它们不彼此不利地影响。例如，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物可以与但不限于化学治疗剂、酪氨酸激酶抑制剂、CCR7下游信号传导途径抑制剂、IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、Mcl1抑制剂和其他CCR7抑制剂组合给予。
如本文所用，术语“药物组合”是指在一个剂量单位形式中的固定组合、或用于组合给予的非固定组合或成套药盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地给予或在时间间隔内分别给予，特别地其中这些时间间隔允许组合配偶体显示合作性例如协同效应。
术语“组合疗法”是指给予两种或更多种治疗剂以治疗或预防本披露中描述的治疗性病症或障碍。这种给予涵盖以基本上同时的方式共同给予这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊给予。可替代地，这种给予涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同给予。可以将粉末和/或液体在给予之前重构或稀释到所需的剂量。此外，这种给予也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗或预防本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
组合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当活性成分一起使用时所实现的效应大于由分别使用这些化合物所产生的效应的总和。当将活性成分为下述情形时可以获得协同效应：(1)共同配制并以组合的单位剂量配制品的形式同时给予或递送；(2)以单独配制品的形式交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案进行。当以交替疗法递送时，可以在依序(例如通过在单独注射器中不同的注射)给予或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依序地即顺次地给予，而在组合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起给予。
考虑用于组合疗法中的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博莱霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺或阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(双氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌mylotarg、紫杉醇菲尼克斯(phoenix)(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物枸橼酸他莫西芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸托泊替康长春花碱长春新碱和长春瑞滨以及培美曲塞(pemetrexed)。
在一个方面，本发明提供了一种通过向有需要的受试者给予与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂组合的本发明抗体药物缀合物来治疗或预防癌症的方法，该一种或多种酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于BTK抑制剂、EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
例如，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于依鲁替尼(Ibrutinib)(PCI-32765)；盐酸厄洛替尼(Erlotinib)利尼法尼(Linifanib)(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称为ABT869，可购自基因泰克公司(Genentech))；苹果酸舒尼替尼柏舒替尼(Bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，也称为SKI-606，并且描述于美国专利号6,780,996)；达沙替尼帕唑帕尼索拉非尼凡德他尼(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼和
表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼吉非替尼N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3”S”)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺，)；凡德他尼(Vandetanib)拉帕替尼(Lapatinib)(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；二盐酸卡纳替尼(Canertinib)(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788，CAS 497839-62-0)；木利替尼(Mubritinib)(TAK165)；培利替尼(Pelitinib)(EKB569)；阿法替尼(BIBW2992)；来那替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊二烯并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS 187724-61-4)。
EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗帕尼单抗马妥珠单抗(EMD-72000)；尼妥珠单抗(hR3)；扎鲁木单抗(Zalutumumab)；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS 339151-96-1)；和ch806(mAb-806，CAS 946414-09-1)。
人表皮生长因子受体2(Her2受体)(也称为Neu、ErbB-2、CD340或p185)抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗帕妥珠单抗恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)来那替尼(HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺，并且描述于PCT公开号WO 05/028443)；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW-2992，CAS 850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS 599626，CAS 714971-09-2)；二盐酸卡纳替尼(PD183805或CI-1033)；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊二烯并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)。
Her3抑制剂包括但不限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111和MEHD-7945A。
MET抑制剂包括但不限于卡博替尼(Cabozantinib)(XL184，CAS 849217-68-1)；弗瑞替尼(Foretinib)(GSK1363089，旧称XL880，CAS 849217-64-7)；替万替尼(ARQ197，CAS1000873-98-2)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺(AMG 458)；克里唑替尼(Cryzotinib)(PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605，CAS 943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903，CAS 956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚二烯并[1,2-b]吡啶-7-基]硫酰胺(MK2461，CAS 917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523，CAS1022150-57-7)；和(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752，CAS 477575-56-7)。
IGF1R抑制剂包括但不限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。对于综述，参见例如，Yee,JNCI,104；975(2012)。
在另一个方面，本发明提供了一种通过向有需要的受试者给予与一种或多种CCR7下游信号传导途径抑制剂组合的本发明抗体药物缀合物来治疗或预防癌症的方法，该一种或多种CCR7下游信号传导途径抑制剂包括但不限于β-抑制蛋白抑制剂、GRK抑制剂、MAPK抑制剂、PI3K抑制剂、JAK抑制剂等。
例如，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于艾拉利司(Idelalisib)(Zydelig，GS-1101，Cal-101)、4-[2-(1H-吲哚-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称为GDC 0941并且描述于PCT公开号WO 09/036082和WO09/055730)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也称为BEZ 235或NVP-BEZ 235，并且描述于PCT公开号WO 06/122806)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(也称为BKM120或NVP-BKM120，并且描述于PCT公开号WO2007/084786)；陶扎色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS 958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊二烯并[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS 502632-66-8)；和8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色烯-4-酮(LY294002，CAS 154447-36-6)。
在又另一个方面，本发明提供了一种通过向有需要的受试者给予与一种或多种促凋亡剂组合的本发明抗体药物缀合物来治疗或预防癌症的方法，该一种或多种促凋亡剂包括但不限于IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、MCl1抑制剂、Trail剂、Chk抑制剂。
例如，IAP抑制剂包括但不限于LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406和TL32711。IAP抑制剂的其他实例包括但不限于披露于以下中的那些：WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295和WO 08/134679，所有专利均通过引用并入本文。
BCL-2抑制剂包括但不限于维奈妥拉(Venetoclax)(也称为GDC-0199、ABT-199、RG7601)；4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯基硫)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺(也称为ABT-263并且描述于PCT公开号WO 09/155386中)；替曲卡星(Tetrocarcin)A；抗霉素；棉酚((-)BL-193)；奥巴妥拉(Obatoclax)；乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-甲酸酯(HA14-1)；奥利默森(Oblimersen)(G3139，)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-二苯基]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737，CAS 852808-04-9)；和那维妥拉(Navitoclax)(ABT-263，CAS 923564-51-6)。
促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAILR1)和DR5(TRAILR2)，包括但不限于度拉纳明(Dulanermin)(AMG-951，RhApo2L/TRAIL)；马帕木单抗(Mapatumumab)(HRS-ETR1，CAS658052-09-6)；来沙木单抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2，CAS 845816-02-6)；阿泊单抗(Apomab)可那木单抗(Conatumumab)(AMG655，CAS 896731-82-1)；和替加珠单抗(Tigatuzumab)(CS1008，CAS 946415-34-5，可购自第一三共株式会社(DaiichiSankyo))。
检查点激酶(CHK)抑制剂包括但不限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776，CAS891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762，CAS860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3-基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR 124，CAS 405168-58-3)；7-氨基更生霉素(7-AAD)、Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618，CAS 911222-45-2)；萝卜硫素(Sulforaphane)(CAS 4478-93-7，4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸酯)；9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二吖辛因-1,3(2H)-二酮(SB-218078，CAS 135897-06-2)；和TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL(SEQID NO:629))、和CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过向有需要的受试者给予与一种或多种免疫调节剂(例如共刺激分子的激活剂或免疫检查点分子的抑制剂中一者或多者)组合的本发明抗体药物缀合物来治疗或预防癌症的方法。
在某些实施例中，免疫调节剂是共刺激分子的激活剂。在一个实施例中，共刺激分子的激动剂选自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段、或可溶性融合物)。
在某些实施例中，免疫调节剂是免疫检查点分子的抑制剂。在一个实施例中，免疫调节剂是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂抑制PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或CTLA4或其任何组合。术语“抑制”或“抑制剂”包括给定分子(例如，免疫检查点抑制剂)的某些参数(例如，活性)的减小。例如，该术语包括至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的活性(例如，PD-1或PD-L1活性)的抑制。因此，抑制不必是100％。
对抑制性分子的抑制可以在DNA、RNA或蛋白质水平进行。在一些实施例中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可以用来抑制抑制性分子的表达。在其他实施例中，抑制性信号的抑制剂是结合抑制性分子的多肽，例如，可溶性配体(例如，PD-1-Ig或CTLA-4Ig)、或抗体或其抗原结合片段；例如，结合PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ或其组合的抗体或其片段(本文中也称为“抗体分子”)。
在一个实施例中，抗体分子是完全抗体或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、或单链Fv片段(scFv))。在又其他实施例中，抗体分子具有重链恒定区(Fc)，该重链恒定区(Fc)选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重链恒定区；具体地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的重链恒定区，更具体地，选自IgG1或IgG4(例如人IgG1或IgG4)的重链恒定区。在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1或人IgG4。在一个实施例中，改变(例如突变)恒定区以修饰抗体分子的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能)。
在某些实施例中，抗体分子呈双特异性或多特异性抗体分子的形式。在一个实施例中，双特异性抗体分子具有针对PD-1或PD-L1的第一结合特异性和第二结合特异性(例如，针对TIM-3、LAG-3或PD-L2的第二结合特异性)。在一个实施例中，双特异性抗体分子结合PD-1或PD-L1和TIM-3。在另一个实施例中，双特异性抗体分子结合PD-1或PD-L1和LAG-3。在另一个实施例中，双特异性抗体分子结合PD-1和PD-L1。在又另一个实施例中，双特异性抗体分子结合PD-1和PD-L2。在另一个实施例中，双特异性抗体分子结合TIM-3和LAG-3。可以在多特异性抗体分子(例如，三特异性抗体)中产生前述分子的任何组合，该三特异性抗体包含针对PD-1或PD-1的第一结合特异性和针对以下两者或更多者的第二结合特异性和第三结合特异性：TIM-3、LAG-3或PD-L2。
在某些实施例中，免疫调节剂是PD-1，例如人PD-1的抑制剂。在另一个实施例中，免疫调节剂是PD-L1，例如人PD-L1的抑制剂。在一个实施例中，PD-1或PD-L1的抑制剂中是针对PD-1或PD-L1的抗体分子。PD-1或PD-L1抑制剂可以单独给予、或与其他免疫调节剂组合，例如与LAG-3、TIM-3或CTLA4的抑制剂组合给予。在一个示例性实施例中，PD-1或PD-L1的抑制剂，例如抗PD-1或PD-L1抗体分子与LAG-3抑制剂，例如抗LAG-3抗体分子组合给予。在另一个实施例中，PD-1或PD-L1的抑制剂，例如抗PD-1或PD-L1抗体分子与TIM-3抑制剂，例如抗TIM-3抗体分子组合给予。在又其他实施例中，PD-1或PD-L1的抑制剂，例如抗PD-1抗体分子与LAG-3抑制剂(例如抗LAG-3抗体分子)和TIM-3抑制剂(例如抗TIM-3抗体分子)组合给予。免疫调节剂与PD-1抑制剂(例如，PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR中一者或多者)的其他组合还处于本发明范围内。本领域已知的或本文披露的任何抗体分子可以用于检查点分子的抑制剂的前述组合中。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或皮地利珠单抗(Pidilizumab)的抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代性名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗是特异性阻断PD1的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号8,008,449和PCT公开号WO2006/121168中。
在其他实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(商品名KEYTRUDA，旧称兰布罗利珠单抗(Lambrolizumab)，也称为Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)是结合PD1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗例如披露于Hamid,O.等人(2013)New England Journal ofMedicine[新英格兰医学杂志]369(2):134-44、PCT公开号WO 2009/114335和美国专利号8,354,509中。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是皮地利珠单抗。皮地利珠单抗(CT-011；Cure Tech公司)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。皮地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体披露于PCT公开号WO 2009/101611中。其他抗PD1抗体披露于美国专利号8,609,089、美国公开号2010028330、和/或美国公开号20120114649中。其他抗PD1抗体包括AMP 514(安普利穆尼公司(Amplimmune))。
在一些实施例中，PD-1抑制剂是PDR001或WO 2015/112900中披露的任何其他抗PD-1抗体。
在一些实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抑制剂选自例如WO 2013/0179174中披露的，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)的YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736或MDX-1105MSB-0010718C(也称为A09-246-2)。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105，也称为BMS-936559，是PCT公开号WO 2007/005874中描述的抗PD-Ll抗体。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是PCT公开号WO 2010/077634中描述的抗PD-Ll(重链可变区序列和轻链可变区序列分别示于SEQ IDNo.20和21中)。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(基因泰克公司/罗氏公司(Roche))。MDPL3280A是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号：7,943,743和美国公开号:20120039906中。
在其他实施例中，PD-L2抑制剂是AMP-224。AMP-224是阻断PD1与B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体(B7-DCIg；安普利穆尼公司；例如披露于PCT公开号WO 2010/027827和WO 2011/066342中)。
在一个实施例中，LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子。在一个实施例中，LAG-3抑制剂是BMS-986016。
药物组合物
为了制备包含免疫缀合物的药物组合物或无菌组合物，将本发明的免疫缀合物与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。组合物可以另外地含有一种或多种适于治疗或预防表达CCR7的癌症(包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、鼻咽癌(NPC)、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、肾细胞癌和宫颈癌)的其他治疗剂。
治疗剂和诊断剂的配制品可以通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等人,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约,纽约州,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践],Lippincott,Williams,and Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],纽约,纽约州,2000；Avis等人(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications[药物剂型：肠胃外药物],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,1993；Lieberman等人(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:tablets[药物剂型：片剂],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,1990；Lieberman等人(编)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems[药物剂型：分散系统],Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司],纽约州,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety[赋形剂毒性和安全性],MarcelDekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州,2000)。
为治疗剂选择给予方案取决于若干种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的靶细胞可及性。在某些实施例中，给予方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于具体实体和正在治疗的病症的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy[抗体疗法],BiosScientific Pub.Ltd[Bios科学出版社有限公司],Oxfordshire[牛津郡],英国,1996；Kresina(编辑),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州,1991；Bach(编辑),Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自免疫疾病中的单克隆抗体和肽疗法],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州,1993；Baert等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608,2003；Milgrom等人,NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619,2000；Ghosh等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602,2000)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预防或预计影响治疗或预防的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所期望的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和给药方式的所期望的治疗应答，而对患者没有毒性。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史、以及医学领域中已知的类似因素。
包含本发明的抗体或其片段的组合物可通过连续输注提供，或通过例如一天、一周、或每周1-7次、每一周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、或每八周一次的间隔剂量提供。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻、直肠、肌内、脑内或通过吸入来提供剂量。特定剂量方案是一个涉及避免明显不希望的副作用的最大剂量或给药频率的方案。
对于本发明的免疫缀合物，给予至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。该剂量可以在0.0001mg/kg患者体重与30mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重与20mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重与10mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重与5mg/kg患者体重之间、在0.0001患者体重与2mg/kg患者体重之间、在0.0001患者体重与1mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重与0.75mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重与0.5mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重至0.25mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重至0.15mg/kg患者体重之间、在0.0001mg/kg患者体重至0.10mg/kg患者体重之间、在0.001mg/kg患者体重至0.5mg/kg患者体重之间、在0.01mg/kg患者体重至0.25mg/kg或0.01mg/kg患者体重至0.10mg/kg患者体重之间。可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待给予的剂量，计算本发明的抗体或其片段的剂量。
可以重复本发明的免疫缀合物的剂量并且各次给予可以相隔少于1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月、4个月、5个月、或至少6个月。在一些实施例中，本发明的免疫缀合物可以每周给予两次、每周给予一次、每两周给予一次、每三周给予一次、每四周给予一次或较小频率地给予。在一个具体实施例中，本发明的免疫缀合物的剂量每2周重复一次。
特定患者的有效量可以根据如以下的因素改变：所治疗的病症、患者的总体健康状况、给予的方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见例如，Maynard等人,A Handbookof SOPs for Good Clinical Practice[用于良好临床实践的SOP指南],InterpharmPress[国际药物出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州波卡拉顿],1996；Dent,GoodLaboratory and Good Clinical Practice[良好实验和良好临床实践],Urch Publ.[厄奇出版社],伦敦,英国,2001)。
给予途径可以是通过例如局部或皮肤应用、通过皮下、静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内给予进行的注射或输注、或通过持续释放系统或植入物(参见例如，Sidman等人,Biopolymers[生物聚合物]22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包含增溶剂或用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因，或两者。此外，也可以采用肺部给予，例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的配制品。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，将这些专利中的每一个通过引用以其全文并入本文。
本发明的组合物还可以经由一种或多种给予途径、使用在本领域中已知的各种方法中的一种或多种来给予。如本领域技术人员将理解的，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。所选择的用于本发明的免疫缀合物的给予途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注。肠胃外给予可以代表除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，本发明的组合物可以经由非肠胃外途径，如局部、表皮或黏膜给予途径给予，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给予。在一个实施例中，通过输注给予本发明的免疫缀合物。在另一个实施例中，皮下给予本发明的免疫缀合物。
如果本发明的免疫缀合物在控制释放或持续释放系统中给予，则可以使用泵来实现控制释放或持续释放(参见Langer,同上；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.[CRC关键引用生物医学工程]14:20,1987；Buchwald等人,Surgery[外科学]88:507,1980；Saudek等人,N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]321:574,1989)。可以使用聚合物材料来实现本发明的疗法的控制释放或持续释放(参见例如，Medical Applications of ControlledRelease[控制释放的医学应用],Langer和Wise(编辑),CRC Pres.[CRC出版社],BocaRaton[波卡拉顿],Fla.[佛罗里达州],1974；Controlled Drug Bioavailability,DrugProduct Design and Performance[控制药物生物利用率、药物产品设计和性能],Smolen和Ball(编辑),Wiley[威利公],纽约,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.[高分子科学杂志，高分子化学评论]23:61,1983；还参见Levy等人,Science[科学]228:190,1985；During等人,Ann.Neurol.[神经学记录]25:351,1989；Howard等人,J.Neurosurg.[神经外科杂志]7 1:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。持续释放配制品中使用的聚合物的实例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施例中，在持续释放配制品中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的杂质、储存时稳定、无菌且可生物降解。可以将控制释放系统或持续释放系统放置在预防性或治疗性靶附近，因此仅要求全身性剂量的一部分(参见例如，Goodson,于：Medical Applications of ControlledRelease[控制释放的医学应用],同上,第2卷,第115-138页,1984)。
在Langer,Science[科学]249:1527-1533,1990的综述中讨论了其他控制释放系统。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含本发明的一种或多种免疫缀合物的持续释放配制品。参见例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO96/20698；Ning等人,Radiotherapy&Oncology[放射疗法与肿瘤学]39:179-189,1996；Song等人,PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology[PDA药物科学与技术杂志]50:372-397,1995；Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.[控制释放生物活性材料的国际研讨会会议记录]24:853-854,1997；和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.[控制释放生物活性材料的国际研讨会会议记录]24:759-760,1997，这些文献中的每一篇均通过引用以其全文并入。
如果局部给予本发明的免疫缀合物，则可以将它们以油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms[雷明顿氏制药科学和药物剂型引言],第19版,MackPub.Co.[马克出版公司],Easton[伊斯顿],Pa.[宾夕法尼亚州](1995)。对不可喷雾的局部剂型，典型地采用粘性至半固体或固体形式，这些形式包含与局部施用相容的载剂或一种或多种赋形剂，并且在某些情况下具有大于水的动力学粘度。合适的配制品包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、散剂、搽剂、药膏剂等，如果需要，将它们灭菌或与影响各种特性(例如像渗透压)的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其他合适的局部剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中与固体或液体惰性载剂组合的活性成分在一些情况下包装在具有加压的挥发性物质(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物中或挤瓶中。如果需要，也可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型。此类另外的成分的实例是本领域熟知的。
如果鼻内给予包含免疫缀合物的组合物，则可以将它以气溶胶形式、喷雾剂、雾化剂或以滴剂形式配制。特别地，根据本发明使用的预防剂或治疗剂可以在使用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压的气溶胶的情况下，可通过提供阀门来确定剂量单位，以递送经计量的量。在吸入器或吹入器中使用的胶囊剂和药筒(由例如明胶组成)可以配制成含有化合物和合适散剂基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
与第二治疗剂(例如，细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射)共同给予或治疗的方法在本领域中是已知的(参见例如，Hardman等人,(编辑)(2001)Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],第10版,McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约,纽约州；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach[药物治疗学高级实践：实用方法],利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),费城,宾夕法尼亚州；Chabner和Longo(编辑)(2001)CancerChemotherapy and Biotherapy[癌症化学疗法和生物疗法],利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),费城,宾夕法尼亚州)。治疗剂的有效量可以将症状减少至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％、或至少50％。
可以与本发明的免疫缀合物组合给予的另外疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以与本发明的免疫缀合物相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时、或相隔96小时至120小时进行给予。两种或更多种疗法可以在同一患者访视中给予。
在某些实施例中，可以配制本发明的免疫缀合物以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如，美国专利号4,522,811、5,374,548、和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见例如，Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.[临床药理学杂志]29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.[FEBS快报]357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.[美国生理学杂志]1233:134)；第120页(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.[FEBS快报]346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods[免疫方法]4:273。
本发明提供了用于向有需要的受试者单独或与其他疗法组合给予包含本发明的免疫缀合物的药物组合物的方案。本发明的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时或依序给予至受试者。本发明的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)也可以循环给予。循环疗法涉及给予第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后给予第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间并重复这种依序给予，即，该循环，以减少对一种疗法(例如，药剂)的耐药性形成，以避免或减少一种疗法(例如，药剂)的副作用和/或以改善疗法的功效。
本发明的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以并行给予至受试者。
术语“并行”不限于在完全相同的时间给予疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将包含抗体或其片段的药物组合物以这样的顺序并在这样的时间间隔内给予至受试者，该顺序和该时间间隔使得本发明的抗体药物缀合物可以与一种或多种其他疗法一起发挥作用，以提供与如果另外给予它们相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何次序依序在不同的时间点给予至受试者；然而，如果不在相同的时间给予，则它们应当在时间上充分接近地给予，从而以提供所期望的治疗性或预防性效果。可以将每种疗法以任何适当的形式和通过任何合适的途径分别给予至受试者。在各种实施例中，将疗法(例如，预防剂或治疗剂)相隔少于5分钟、相隔少于15分钟、相隔少于30分钟、相隔少于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时、或相隔1周给予至受试者。在其他实施例中，将两种或更多种疗法(例如，预防剂或治疗剂)在同一患者访视中给予。
组合疗法的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中给予至受试者。可替代地，组合疗法的预防剂或治疗剂可以在单独的药物组合物中并行给予至受试者。预防剂或治疗剂可以通过相同或不同给予途径给予至受试者。组合疗法的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中给予至受试者。可替代地，组合疗法的预防剂或治疗剂可以在单独的药物组合物中并行给予至受试者。预防剂或治疗剂可以通过相同或不同给予途径给予至受试者。
实例
实例1：抗CCR7抗体的产生
人、大鼠、小鼠和食蟹猴CCR7的表达构建体的产生
基于来自GenBank或Uniprot数据库的氨基酸序列(SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101)，合成全长人、食蟹猴和小鼠CCR7基因。基于使用从各种大鼠组织分离的mRNA所生成的氨基酸序列信息(SEQ ID NO:103)，基因合成大鼠CCR7cDNA模板。将所有合成的DNA片段克隆到合适的表达载体中。
表2：CCR7的氨基酸和核苷酸序列信息
稳定表达CCR7的细胞系的产生
使用逆转录病毒转导产生稳定表达CCR7的细胞系。遵循制造商的建议使用Fugene6转染试剂(普洛麦格公司(Promega)，美国，目录号E2692)、用CCR7逆转录病毒表达载体和pCL-Eco或pCL-10A1包装载体(诺维斯公司(Novus)，美国，目录号NBP2-29540或NBP2-2952)共转染293T细胞。将细胞在37℃的湿润CO2培养箱中孵育，并且在转染后48小时收集病毒上清液。使NIH/3T3和300.19细胞生长至接近汇合的单层。从细胞去除生长培养基，并且在8ug聚凝胺/ml(最终浓度)(EMD密理博公司(EMD Millipore)，目录号TR-1003-G)的存在下添加病毒上清液。在37℃下孵育3-6小时后，添加新鲜的培养基。然后在适当的选择条件下培养细胞以产生稳定表达CCR7的细胞系。
病毒样颗粒(VLP)的产生、表达和纯化
将HEK293T或NIH/3T3细胞维持在具有10％FBS的DMEM中。为制备VLP，将细胞交换到具有4％FBS的DMEM中，然后与CCR7表达质粒和逆转录病毒Gag表达质粒按μg比率为3:2共转染。转染后48小时，收集细胞上清液，并在台式离心机中通过以2500x g离心5min使上清液澄清，并保持在冰上。在Sorvall RC 6+超速离心机中的贝克曼(Beckman)Coulter SW32Ti转头中，通过在贝克曼Ultra-Clear 38ml离心管(目录号344058)中的20％蔗糖垫、通过以100,000x g超速离心将VLP进行纯化。将所得沉淀重悬于300μl冷的无菌PBS中，并使用BCA测定(Pierce目录号23225)进行定量。
CCR7免疫原支架的结构衍生性产生
G偶联蛋白受体家族的成员是含有7个跨膜螺旋(TM1…TM7)的膜蛋白，每个跨膜螺旋通过不同长度的连接序列连接。蛋白质的氨基末端在细胞表面的外侧，这表明蛋白质的4个区域潜在地暴露在细胞表面上，即氨基末端(N末端)和3个细胞外环区(EC1、EC2和EC3)。因此，这些区域可用作抗体的抗原。
设想，可以将这4个条目中的一个或多个的组合插入到可溶性蛋白质支架中，以在结构上接近CCR7的细胞外暴露区域。
为了确定CCR7的最佳细胞外区域，使用紧密同源物CXCR4的晶体结构(Wu等人,“Structures of the CXCR4chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptideantagonists[具有小分子和环肽拮抗剂的CXCR4趋化因子GPCR的结构].”(2010)Science[科学]330:1066-1071)，使用CXCR4结构与蛋白质数据库条目(3ODU、3OE0、3OE6、3OE8、3OE9)的组合和建模软件建立模型。从模型推断连接的跨膜螺旋间隙的氨基酸暴露于蛋白质的表面上。这些区域在下表3中鉴定。
表3：CCR7免疫原支架的氨基酸和核苷酸序列信息
环EC1和EC3的小尺寸以及EC3与其他三个区域的空间分离优先使用N末端和EC2环作为候选表位。
对N末端序列到小鼠Fab(其中EC2序列插入到Fab的各个环区中，如在框架1、CDR-H3或CDR3-H1中)的晶体结构中的融合物建模显示如果假设在两个序列中具有一定程度的灵活性，则这些可以是CCR7中这些区域的结构的合理近似。
用于小鼠免疫的免疫原支架产生
用于小鼠免疫的移植构建体通过以下方式产生：将来自表3的N末端序列与小鼠Fab支架的重链的N末端融合(命名为MGFTX1)并且将EC2序列的修饰形式(其中位置24处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸)(表3和SEQ ID NO:113的加下划线+加粗的序列)移植到MGFTX1支架的CDR3中，然后产生重链免疫球蛋白链和轻链免疫球蛋白链以生成最终的蛋白质构建体。因此，命名为FabCCR7M1的构建体含有小鼠框架，该小鼠框架应是免疫耐受的、与小鼠免疫应答所针对的人序列结合。
将N末端序列与MGFTX1支架的重链直接融合。基于可用的结构或同源性模型数据，选择EC2的插入点作为CDR环的中点。使用标准分子生物学方法、利用编码相关序列的重组DNA产生Fab移植蛋白。
例如，将含有EC2的每种抗体的可变区插入到合成的重链CDR3中。经由PCR扩增编码可变区的DNA，并且将所得的片段亚克隆到含有轻链恒定区或重链恒定区和Fc区的载体中。以这种方式产生FabCCR7M1蛋白，这些蛋白对应于N末端的融合和EC2到H3中的插入。所得的构建体示于表3中。重链载体和轻链载体的适当组合的转染导致含有一个N末端和一个EC2分子的重组Fab的表达。
选择哪个CDR用于移植是基于环的暴露和N末端的接近度的参数来确定。此时，由于融合和移植后环的灵活性，建模软件仅部分地用于预测哪个CDR和CDR内的哪个位置将提供所需参数。MGFTX1支架与EC2_C24S(表3，SEQ ID NO:110)组合的结构显示了序列是暴露的和灵活的，如通过缺乏大多数序列的电子密度判断的。
总之，CDR中的插入点是在结构基础上选择的，假设了移植到CDR中将提供与天然抗原一定程度的结构相似性。
杂交瘤的产生
使用要求在多个位点处重复免疫(RIMMS)的程序(McIntyre GD.Hybridoma[杂交瘤]1997)，将Bcl-2转基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22WEHI菌株)用抗原进行免疫。简而言之，在外周淋巴结(PLN)近侧的8个特定位点处向小鼠注射用1-3μg CCR7免疫原。将该程序在12天时段内重复8次。在第12天，收集测试出血并通过FACS分析血清抗体滴度。在一些情况下，将BALB/c和/或C57Bl/6小鼠用稳定过表达人CCR7(SEQ ID NO:97)的NIH3T3或300.19细胞免疫。向动物皮下注射在PBS中的5X 106个细胞，一个月一次，持续3个月，随后用25μg表达人CCR7的VLP静脉内增强。增强后两天，收集测试出血并通过FACS分析血清抗体滴度。从高滴度小鼠中取出脾脏和汇集的PLN。为收获淋巴细胞，将脾和PLN用DMEM洗涤两次，并然后通过70微米筛网(Falcon#352350)解离。将所得淋巴细胞在Cytofusion培养基(BTXpress电穿孔培养基，目录号47001)中融合之前再洗涤2次。
对于融合，将F0骨髓瘤细胞与淋巴细胞按1:4比率混合。将细胞混合物离心，悬浮在Cytofusion培养基中，并随后添加到电融合室(哈佛仪器同轴腔室9ML部件编号470020)中。按照制造商的说明书，使用CEEF-50B杂交免疫(Hybrimune)/杂交瘤系统(细胞波科学公司(Cyto Pulse Sciences,Inc))进行电融合。允许融合的细胞在室中恢复5min，在不含HAT的融合培养基(DMEM+20％FBS，1％青/链霉素/葡萄糖，1X NEAA，0.5X HFCS)中1/10稀释并在37℃下放置1小时。添加4X HAT培养基(DMEM+20％FBS，1％青/链霉素/葡萄糖，1X NEAA，4X HAT，0.5X HFCS)以制得1X溶液，并且调整密度至1.67X 104个细胞/ml。将细胞以60μl/孔铺板于384孔板中。
FACS筛选
融合后10天，使用流式细胞术筛选杂交瘤板中CCR7特异性抗体的存在，以确认候选抗体与稳定过表达或内源性表达CCR7的细胞系的特异性结合。将细胞用PBS彻底冲洗并且用Accutase(密理博公司#SCR005)处理以从生长板上提起并重悬于冷的PBS中。根据制造商的指导，将细胞生物素化、用荧光染料(FluoReporter细胞表面生物素化试剂盒，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)目录号F-20650；PE-Cy7链霉亲和素，赛默飞世尔科技公司目录号SA1012)标记。将细胞以大约1X 106个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(1XDPBS，3％FBS，5mM EDTA，0.1％叠氮化钠)中。在384孔板中，将20μL的杂交瘤上清液预接种并添加20μL的细胞悬浮液。将细胞在4℃下孵育1小时，用冷的FACS缓冲液洗涤两次，并重悬于20μL的1:400第二抗体FACS缓冲液(别藻蓝素缀合的F(ab')2山羊抗人IgG，Fcγ特异性；杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)，目录号109-136-098)中。在4℃下再孵育45min后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次并重悬于20uL FACS缓冲液+2μg/ml碘化丙啶(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)目录号P4864-10ML)中。使用FlowJoTM软件在活的单一细胞上计算几何平均荧光强度。
抗体纯化
制备包含鼠类可变区和人恒定区的嵌合抗体。另外，设计包含半胱氨酸突变(例如，重链的位置K360C、或位置E152C和S375C处的半胱氨酸)的嵌合形式以用于如本文中进一步详细描述那样缀合药物部分和制备ADC。获得杂交瘤的可变区(VH和VL)DNA序列用于产生针对选择的杂交瘤mAb121G12、mAb506E15、mAb674J13和mAb684E12中的每一种的优化序列(例如，优选特征人源化)。使用标准方法，通过RACE从获自每种所选杂交瘤细胞系的RNA扩增来自鼠单克隆抗体的可变区DNA。分别针对674J13、121G12、506E15和684E12杂交瘤中每一种的每条鼠类可变重链/轻链的多肽序列示出在SEQ ID NO:128/SEQ ID NO:144、SEQID NO:160/SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:192/SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:224/SEQ ID NO:240中。针对每一种杂交瘤的对应衍生的可变重链/轻链核苷酸序列示出在SEQ ID NO:129/SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:161/SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:193/SEQ ID NO:209和SEQ IDNO:225/SEQ ID NO:241中。为了制备嵌合抗体，将编码杂交瘤VL和VH结构域的DNA序列亚克隆到表达载体中，这些表达载体含有对应的人野生型或工程化Cys或D265A/P329A(DAPA)突变重链和人轻链恒定区序列(IgG1，κ)。
抗体的人源化
设计可变区构建体以实现序列的人源化和优化(例如，去除翻译后修饰、非优选位点等)，从而包含半胱氨酸突变(例如重链的位置K360C、或位置E152C和S375C处的半胱氨酸)用于如本文进一步详细描述那些缀合药物部分和制备ADC；以及Fc效应子突变的修饰(例如Fc区中的D265A/P329A)，从而包含具有降低的Fc效应子功能的构建体，及其组合。
编码人源化VL和VH结构域的DNA序列以GeneArt(生命技术公司(LifeTechnologies Inc.)，雷根斯堡(Regensburg)，德国)订购，包含针对灰仓鼠(Cricetulusgriseus)优化的密码子。将编码VL和VH结构域的序列从GeneArt来源的载体亚克隆到适于在哺乳动物细胞中产生蛋白质的表达载体中。将重链和轻链克隆到单独的表达载体中以允许共转染。
通过使用PEI(聚乙烯亚胺，MW 25,000线性，Polysciences公司，美国，目录号23966)作为转染试剂将载体共转染到FreestyleTM293表达细胞(英杰公司，美国)中来产生重组抗体(IgG1，κ)。通过在室温(RT)下将1g PEI溶解在900ml细胞培养级水中来制备PEI原液。为了有利于PEI溶解，通过添加HCl将溶液酸化至pH 3-5，然后用NaOH中和至最终pH为7.05。最终，将体积调整至1L并且将溶液通过0.22um过滤器无菌过滤、等分并且冷冻在80℃下，直到进一步使用。
将FreestyleTM293细胞(GibcoTM，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号R79007)在37℃湿润的培养箱中在5％CO2下、在轨道式振荡器(100-120rpm)上的振荡烧瓶(康宁公司(Corning)，图克斯伯里(Tewksbury)，马萨诸塞州)中、在FreestyleTM293培养基(GibcoTM，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号12338018)中培养。对于瞬时转染，将细胞生长至大约3x106个细胞/ml的密度，并且然后将1ug过滤器灭菌的DNA/ml培养物(0.5ug重链+0.5ug轻链)添加到OptiMem(赛默飞世尔科技公司，美国，#11058021)溶液中的2ug PEI/1ug DNA并且在RT下孵育8分钟。将混合物逐滴添加到FreestyleTM293细胞中，伴有轻轻涡旋。转染后，将细胞培养一至两周，然后从上清液中纯化抗体。为了产生用于抗体产生的稳定细胞系，使用制造商的建议将载体通过核转染(NucleofectorTM96孔shuttleTM；龙沙集团(Lonza))共转染到CHO细胞中，并且在振荡烧瓶中在选择条件下培养长达四周。通过离心收获细胞，并且回收上清液用于抗体纯化。使用蛋白A、蛋白G或MabSelect SuRe(通用电气医疗生命科学部门(GE Healthcare Life Sciences))柱纯化抗体。在加载上清液之前，用PBS平衡树脂。结合样品后，用PBS洗涤柱，并且用赛默(Thermo)(Pierce)IgG pH 2.8(目录号21004)洗脱抗体。将洗脱液级分用柠檬酸三钠脱水缓冲液，pH 8.5(西格玛奥德里奇公司目录号S4641-1Kg)中和，并且然后在PBS，pH 7.2中透析过夜。
抗体汇总
表4阐述了衍生自鼠类杂交瘤的亲本抗CCR7抗体和人源化抗CCR7抗体的有关序列信息。贯穿本申请，当描述抗体时，术语“杂交瘤”和“亲本”可互换使用并且是指衍生自杂交瘤的Ab。
表4：杂交瘤和人源化抗CCR7抗体的氨基酸和核苷酸序列
实例2：对抗体诱导的ADCC活性的体外评估
使用替代物ADCC报道基因测定评估候选抗体介导ADCC的能力。将表达CCR7和CD20的JVM2细胞用作靶细胞。将JVM2细胞洗涤并以8x 104个细胞/ml重悬。该测定中的效应细胞是稳定表达CD16V158和NFAT依赖性荧光素酶报告基因的Jurkat细胞系(Jurkat-V158)；荧光素酶的表达是通过CD16进行经典ADCC信号传导的替代物。简而言之，将悬浮生长的Jurkat-V158细胞旋转沉降以去除用过的培养基，将沉淀重悬于测定培养基中并调整至1.6x 106个细胞/ml。混合等体积的效应细胞和靶细胞以制备细胞的主混合物，产生靶细胞与效应细胞比率为1:5或1:20。在测定培养基中稀释滴定抗体，在测定孔中最终最高浓度为50ug/mL。将12.5uL Ab溶液添加到384孔圆底板中，并且然后添加12.5ul主细胞混合物。通过移液将抗体和细胞充分混合，并且在37℃下在5％CO2中孵育4小时。孵育后，向每个孔中添加15uL Bright Glo底物(普洛麦格公司#G7572)并且在RT下以1050rpm振荡5min。在Envision读板器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上读取发光信号。
包括CD20靶向抗体作为阳性对照，并且如通过荧光素酶活性所测量显示出大量的NFAT信号传导。类似地，候选物抗CCR7抗体诱导显著的ADCC活性(图1)。
下表汇总了使用JVM2和Jurkat-V158细胞在ADCC测定中运行的各种抗体形式的代表性结果。
表5：非人源化和人源化抗CCR7抗体的ADCC活性
ADCC活性；IC50(nM)
121G12非人源化CysMab 0.077
506E15非人源化CysMab 0.131
674J13非人源化CysMab 1.09
684E12非人源化CysMab 2.63
121G12人源化CysMab 有，但曲线拟合不足
506E15人源化CysMab 0.054
674J13人源化CysMab 有，但曲线拟合不足
CD20对照ADCC 0.132
使用非人源化506E15抗体作为代表性有ADCC能力的抗CCR7抗体在具有一系列CCR7受体数量的各种细胞系中进行ADCC测定，以确定ADCC活性所需的最小受体密度和是否对正常的CCR7+T细胞有足够的安全限度。下表汇总了一些数据。
表6：非人源化506E15抗体的ADCC活性
细胞系 CCR7受体数量 506E15IC50(nM) 506E15(max RLU)
JVM2 66,500 0.046 5840
MOTN-1 64,600 0.077 5387
DEL 62,000 0.074 6480
CMLT-1 29,000 0.011 4400
SR786 27,800 0.011 4067
PEER 8,700 0.038 3360
ALL-SIL 6,200 0.008 3720
Jurkat V158 3,400 0.004 3267
DND-41 1,700 0.002 3733
正常T细胞 <1.5K 体内消耗 n.a.
数据显示，甚至与正常T细胞上的CCR7受体水平相当的非常低的CCR7受体水平也足以实现显著的ADCC活性。还使用NK细胞与CCR7+癌细胞的共培养活力测定评估ADCC，并且收集到类似的发现(在此未讨论)。
这符合下面描述的观察结构，即在体内观察到T细胞消耗并且发现T细胞消耗是基于ADCC机制的。这些发现证实：从安全角度来看，ADCC模式不适于CCR7。因此，将所有候选物均转换为Fc沉默(DAPA)形式，以提高整体中靶安全性。
重复ADCC体外报告基因测定并且确认DAPA Fc突变形式的非人源化抗CCR7抗体缺乏ADCC活性(图2)。
实例3：抗体的生物化学表征
抗CCR7抗体对CCR7的亲和力
各种抗体和ADC对CCR7及其物种直向同源物的亲和力使用FACS测定。将纯化的IgG滴定以确定结合细胞表面表达的CCR7的EC50值。
为此目的，将CCR7阳性细胞收获(用Accutase分离粘附细胞)，用FACS缓冲液(PBS/3％FCS/0.02％叠氮化钠)洗涤两次，并且在FACS缓冲液中稀释至大约2x 106个细胞/ml。所有随后的步骤在冰上进行以防止受体内化。将100μl细胞悬浮液/孔转移到96孔U形底板(Falcon)中。将2x 105个细胞/孔与目的抗CCR7抗体的抗体浓度的系列稀释液在4℃下一起孵育60分钟，轻轻振荡，这些抗体浓度跨越数个对数变化，从100nM的高值开始。孵育后，将细胞旋转沉降(1200rpm，2min，4℃)并用FACS缓冲液洗涤三次。以1:400添加荧光团缀合的抗hFcγ-APC(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))检测抗体，并且将样品在黑暗中在冰上孵育1h，轻轻振荡。最终洗涤后，将细胞重悬于100μl含有0.2μg/ml DAPI的FACS缓冲液中，然后在流式细胞术机器(BD LSRFortessa细胞分析仪；目录号647177)上读取。在Flowjo 10.0.8中计算活的单一细胞的平均荧光强度(MFI)，并且输出到GraphpadPrism6中用于EC50测定。
通过测量对被工程化为过表达CCR7的同基因细胞对以及表达CCR7旁系同源物(例如CCR9、CCR6、CXCR4和CCR8)的细胞系的表观结合亲和力来评估选择性。所有抗CCR7抗体以特异性方式仅与表达CCR7的细胞结合，如下表7所示。
表7：各种抗CCR7抗体与表达CCR7的细胞的结合
在类似的实验中，使用工程化的同基因匹配细胞系组(NIH3T3系列)和CD4+T细胞测试抗体的交叉反应性，这些CD4+T细胞从健康供体以及食蟹猴、维斯塔尔(Wistar)大鼠和CD-1小鼠的若干个PBMC批次中纯化。发现所有抗体以相似的表观亲和力特异性结合人和食蟹猴CCR7，如下表8和9所示。只有非人源化121G12抗体具有啮齿动物交叉反应性。
表8：各种非人源化抗CCR7抗体的交叉反应性
表9：各种人源化抗CCR7抗体的交叉反应性
为了确定受体密度对表观亲和力的影响，并因此确定亲合力对抗体的细胞结合作出的贡献，对具有不同表达水平的人的表达CCR7的癌细胞系和正常CCR7阳性PBMC衍生的T细胞进行FACS滴定实验。使用来自Bangs Laboratories公司的微球作为计数标准并遵循制造商的说明书，经由FACS进行受体定量。示例性结果示出在下表10中。
表10：与受体密度相关的亲合力对表观亲和力的贡献
所有抗CCR7抗体显示出亲合力对表观亲和力的显著贡献，并且结合强度与受体密度相关性降低。与指示代表性DEL癌细胞相比，特别是121G12在正常CD4+T细胞所代表的低表达CCR7的细胞上显示出显著较弱的结合。
特别是121G12的亲和力相对较弱，在抗CCR7抗体中显示出最强的亲合力效应，这对于利用正常细胞与癌细胞之间的受体密度差异作为偏向抗体与癌细胞结合的方式是最佳的。
在ELISA中与重组hCCR7的结合
还使用重组CCR7(傲锐东源公司(Origene)#TP306614)在基于ELISA的测定中评估了结合和亲和力。将MaxisorpTM384孔板(赛默Nunc)用稀释于PBS中的3.5μg/ml的重组CCR7包被。在室温下在PBS中用3％BSA(牛血清白蛋白)阻断1小时，用PBS-T(PBS中的0.01％吐温20)将板洗涤3x后，以系列稀释液添加第一抗体并且在室温下孵育1小时。将板再次洗涤，并且通过以下方式来检测结合的抗体：与缀合至辣根过氧化物酶(HRP；杰克森免疫研究公司，目录号115-035-098)的1:5000抗hFcγ在室温下孵育1小时，随后用PBS-T洗涤并之后添加SureBlue过氧化物酶底物(KPL，目录号#52-00-03)底物。15min后，记录在650nM处的吸光度并在GraphPad Prism6中分析。
所有测试的抗CCR7抗体能够结合重组hCCR7(表11；图3)。
表11：人源化抗CCR7抗体对重组hCCR7的结合亲和力
人源化CysMab抗体 亲和力，Kd(nM)
121G12.DAPA 0.677
506E15.DAPA 5.731
674J13.DAPA 0.006
与双Fab移植物(FabGraft)的结合
进行Fab移植物ELISA以评估与最小表位空间的结合，该最小表位空间包含CCR7的N末端和EC2。简言之，将MaxisorpTM384孔板(赛默Nunc)用5μg/ml的Fab移植物包被。在其他方面遵循上文所述的通用ELISA方案说明书。所有抗CCR7抗体均能够结合双Fab移植物，如下表12中所示。
表12：人源化抗CCR7抗体对Fab移植物的结合亲和力
人源化CysMab抗体 ELISA；Kd(nM)
121G12.DAPA 0.023
506E15.DAPA 0.025
674J13.DAPA 0.023
用VLP的pH依赖性ELISA
已知CCR7结合的CCL19内化受体-配体复合物。然而，当CCR7再循环回细胞表面时，CCL19被分选到溶酶体中进行降解，这显示出内吞CCR7及其配体的相反命运(Otero等人,JImmunol[免疫学杂志]2006；177:2314-2323)。对于成功的抗CCR7ADC，优选抗体表现与配体相似，例如快速内化，但不循环回退出CCR7。为了实现这一目标，我们确保选择ph依赖性抗体，这些抗体在低pH条件下显示出与CCR7的较弱结合。
为了评估抗CCR7抗体的pH依赖性，使用表达CCR7的病毒样颗粒(VLP)进行ELISA。简言之，将MaxisorpTM384孔板(赛默Nunc)用25μg/ml的VLP包被。将第一抗体在pH5.8(1:1；dH2O:0.1M柠檬酸盐缓冲液，150mM NaCl)或pH7.4缓冲液中孵育。在其他方面遵循上文所述的通用ELISA方案说明书。
在针对每种候选物的多种人源化变体中，在中性(7.4)和酸性(5.8)pH下抗体结合的比较显示所有CCR7候选抗体在pH 7.4下具有改善的亲和力(表13)。以下实体是基于其优越的ph依赖性以及其他特征而选择的。
表13：人源化抗CCR7抗体对表达CCR7的VLP的pH依赖性
b抑制蛋白测定
为了确定抗CCR7抗体的功能性，将β-抑制蛋白测定使用来自DiscoverX公司的PathHunter快速检测试剂盒(#93-0247)以激动模式进行以评估激动性功能或以拮抗模式进行以评估拮抗功能。
在激动模式中，将CHO-flpin-hCCR7(由DiscoverX产生的表达带ProLink、β-抑制蛋白-EA标签的hCCR7的细胞系)以8x 104个细胞/孔、以20μl/孔接种于384孔板中的具有阿霉素100ng/ml的生长培养基(Ham's F-12/Glutamax培养基；英杰公司+10％FBS+0.5mg/mlG418+0.2mg/ml潮霉素B；英杰公司+5μg/ml杀稻瘟菌素；吉博克公司(Gibco))中，用金属盖覆盖，在37℃ 5％CO2孵育过夜。第二天，使用配体hCCL19(安迪生物(R&D)，361/MI-025/CF)，用测试抗体或阳性对照在1x测定缓冲液(20mM HEPES/0.1％BSA/1x HBSS pH7.4)中产生5x工作溶液的系列稀释液。向每个孔中添加5μl抗体或配体的5x工作溶液，短暂旋转沉降，并且在37℃/5％CO2下孵育2h。孵育后，向每个孔中添加25μl检测试剂，在室温下在黑暗中孵育，同时振荡20min。然后，在Envision机器上测量针对酶活性的发光信号。最后，使用Excel分析酶活性。
在拮抗模式中，如上所述那样接种CHO-flpin-hCCR7细胞。第二天，对于每种测试抗体或阳性对照MAB197(安迪生物参考抗体；配体拮抗剂)或阴性对照hIgG，在1x测定缓冲液中产生6x工作溶液(0.5μM x 6＝3.0μM)。向每个孔中添加5μl抗体或对照的6x工作溶液，短暂旋转沉降，并且在37℃/5％CO2下孵育30min。在孵育期间，对于hCCL19，在1x测定缓冲液中产生6x工作溶液的系列稀释液。孵育后，向每个孔中添加5μl hCCL19的6x工作溶液，短暂旋转沉降，并且在37℃/5％CO2下孵育90min。孵育后，向每个孔中添加25μl检测试剂，在室温下在黑暗中孵育，同时振荡20min。然后，在Envision机器上测量针对酶活性的发光信号并且在Excel中分析。
亲本抗CCR7抗体中没有一个在激动模型中显示出活性(图4A)。然而，当以拮抗形式运行时，506E15和121G12被鉴定为强拮抗剂，例如配体阻断性抗体(图4B，4C)。674J12是中性的非配体阻断性抗体。684E12是弱拮抗剂。
与配体的FACS竞争测定
为了确认与CCR7配体的抗体竞争，在过量配体浓度存在下进行FACS测定。如上所述进行FACS测定。对方案进行了一些改变，例如，将CCL19保持在1μM的恒定浓度下，同时将第一抗体同时施加至DEL细胞，该第一抗体跨越数个对数变化，从100nM的高值开始。在冰冷的FACS缓冲液中孵育30min的时间后，洗涤细胞，施加二级抗-hFc.PE抗体15min，并且如上所述测定MFI。
图5显示人源化CysMab.DAPA 674J13不受过量CCL19存在的影响，这确认了其中性功能。人源化CysMab.DAPA 121G12和506E15的结合亲和力确实因存在过量配体受到强烈影响。
在具有一系列受体密度的细胞系上的内化能力
成功的抗CCR7ADC的另一个方面是确保CCR7的差异表达分布的最佳使用。作为正常的表达CCR7的细胞的代表，从健康供体PBMC分离CD4+T细胞。此外，选择了多种CCR7阳性癌细胞系，它们展示出一系列受体密度。我们特意选择了对CCR7+T细胞具有比CCR7+癌细胞更弱的表观FACS结合亲和力的抗体。此外，在此描述的pHrodo测定利用在抗CCR7抗体上的低pH激活的荧光团标记来评估如通过荧光测量的细胞中的抗体摄入是否与受体密度相关。优选使对正常细胞的抗体摄取最小化以使治疗窗最大化。
简而言之，遵循制造商的说明书，用马来酰亚胺-pHrodo(赛默飞世尔公司)标记CysMab形式的抗CCR7抗体，得到DAR＝4(药物，例如荧光团对抗体比率)实体。如上所述进行FACS测定。对方案进行了一些改变，例如，为了允许内化，将第一抗体以5μg/ml与细胞在37℃下在培养基中孵育6h，然后用含有叠氮化钠的冰冷FACS缓冲液洗涤以停止反应。
下表14汇总了三种抗体在一组细胞系上的内化能力。使用非靶向pHrodo标记的抗体作为对照，并且发现高达400MFI构成信号的背景噪音，例如非靶标介导的抗体-缀合物摄取。数据显示，所有三种抗CCR7抗体均需要CCR7受体水平在大多数CCR7+癌细胞系的典型范围内，例如，高于20,000个受体，以高效地内化和累积缀合物质，同时使正常的CD4+T细胞不受伤害。
表14：各种抗CCR7抗体的内化能力
使用Octet Red96系统的表位分级(Epitope binning)
使用测量生物膜层干涉技术(BLI)的Octet Red96系统(ForteBio公司，美国)进行抗hCCR7亲本抗体的表位分级。根据制造商的建议(Avidity有限公司，美国目录号BirA500)，经由AviTagTM，利用BirA生物素连接酶将CCR7免疫原支架生物素化。将生物素化的免疫原支架以1.5μg/ml加载到预平衡的链霉亲和素传感器(ForteBio公司，美国)上。然后将传感器转移到在1X动力学缓冲液(ForteBio公司，美国)中含有100nM抗体A的溶液中。将传感器在1X动力学缓冲液中简单洗涤并转移至含有100nM竞争者抗体的第二溶液中。使用Octet Red96系统分析软件(版本6.3，ForteBio公司，美国)根据原始数据测定结合动力学。在所有成对组合(作为抗体A和作为竞争者抗体)中测试抗体。
表15：抗体分级结果
表位仓 抗体
1 684E12；MAB197
2 674J13
3 506E15
4 121G12
使用CCR7突变的表位映射
利用突变型CCR7细胞系进行另外的表位映射。产生表达人CCR7的突变变体的NIH/3T3细胞系。在特定位置引入突变以将人CCR7残基交换成相应的鼠类CCR7残基。产生的突变包括D35E、F44Y、L47V、S49F、D198G、R201K、S202N、S204G、Q206D、A207T、M208L、I213V、T214S、E215A和H216Q。通过定点诱变产生突变型CCR7质粒构建体，并且将这些构建体引入到NIH/3T3细胞中以产生稳定表达的细胞系。通过流式细胞术评估候选抗体与每种突变型CCR7细胞系的特异性结合。将细胞用PBS彻底冲洗，并且用Accutase(密理博公司#SCR005)处理以从生长板上提起，并以大约1*105个细胞/90μL重悬于1x FACS缓冲液(PBS中2％FBS+0.1％NaN3)中。在96孔U形底板中，将10μL的FACS缓冲液中的10x抗体溶液预接种并且添加90μL的细胞悬浮液。将细胞在4℃下孵育30分钟，用冷的PBS洗涤1x，并重悬于100μL的1:500第二抗体1x FACS缓冲液(别藻蓝素缀合的F(ab’)2山羊抗人IgG，Fcγ特异性；杰克逊免疫研究公司，目录号109-136-098)中。在4℃下再孵育15min后，将细胞用PBS洗涤两次并重悬于100μL的1xFACS缓冲液+4μg/mL碘化丙啶(生命技术公司(Life Technologies)，目录号P3566中)。使用FlowJo在活的单一细胞上计算几何平均荧光强度并且作为WT CCR7几何平均荧光强度的％进行绘图。
对点突变CCR7的基于EC50的亲和力显示，所有测试的抗体均具有不同的结合谱，这暗示构象表位的不同利用(图6)。在所有显示的抗体中，506E15具有与MAB197最相似的结合模式，例如，当CCR7的N末端中的残基F44或L47突变时，二者均显示出结合亲和力的显著下降，但当EC2环中的M208或I213突变时，并非如此。121G12和674J13似乎利用构象表位空间内的一组不同的关键接触点，因为它们在8个测试点突变中的至少4个中与MAB197不同。
实例4：CCR7抗体药物缀合物的产生和表征
在下面的部分中，uL和μL可互换地用来指微升。类似地，uM和μM可互换的用来指微 摩尔；并且um用来指微米。
实例4A：抗体药物缀合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4的制备
经纯化的121G12.CysMab.DAPA和MPET.DM4的缀合：
起始材料是在10mM组氨酸盐酸盐缓冲液中的127mg/ml(OD280，对于10mg/ml IgG溶液具有13.7的消光系数)的121G12.CysMab.DAPA抗体。向7.9ml抗体(1003mg)中添加16ml0.5M磷酸钠pH 8(泰克诺瓦公司(Teknova)S1280)，验证pH为>7，然后在室温下在轻轻涡旋下将抗体吸收到100.3ml RMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团(GE Healthcare)1-223BPO/I)上，持续25分钟。将装载在10mg Ab/ml床上的树脂用15个床体积的1xPBS缓冲液(海克隆公司(Hyclone)SH30256.02)通过穿过瓶顶0.2um过滤装置(Nalgene 567-0020)真空过滤进行洗涤，然后重悬于100.3ml 1x PBS，得到50％浆液。
向浆液中添加4329ul的在0.5M磷酸盐pH 8(向其中以13.6g/L的比率添加NaOH(阿法埃莎公司(Alfa Aesar)A16037))中配制的0.5M半胱氨酸(西格玛G121-03)。将浆液在室温下不时地涡旋30分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于100.3ml 1xPBS(50％浆液)中，并且添加1003ul 100uM CuCl2(奥德里奇751944)(净500nM Cu2+)以引发再氧化。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的参考马来酰亚胺(WO 2015/095301的实例3，第110页)的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)21009)，14,000xg旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为60分钟)，添加3010ul在DMSO中的20mM MPET.DM4原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋30分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(201ml)用20.1ml 0.5M磷酸钠pH 8中和，然后使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至60ml。然后将浓缩物施加到平衡至1xPBS的24x PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml浓缩物并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。
对于稳定性研究，将材料与相同制备的批次汇集以提供2克起始材料。将汇集的材料用10mM组氨酸氯化物缓冲液pH 5(来自JT贝克公司(JTBaker)2080-05的组氨酸)进行彻底透析(Slidealyzer烧瓶，赛默科技公司87762)，浓缩至约30mg/ml，然后分别将蔗糖(密理博公司1.00892.1003)和吐温20(JT贝克公司4116-04)添加到240mM和0.02％(v/v)。将相对于稳定性研究所需材料过量的材料交换回至1xPBS。将样品等分并用液氮快速冷冻并且储存在-80℃下。对于配制用于稳定性测试的材料，最终浓度为23.9mg/ml，并且对于在1xPBS中配制的材料，最终浓度为18.9mg/ml。
对所得样品的分析如下：
分析方法：通过OD280测定浓度，对于10mg/ml IgG溶液消光系数为13.7。使用在TECAN Safire读板器上读取的动力学QCL测定(龙沙沃克斯维尔公司(LonzaWalkersville)50-650H)测定热原。通过在Shodex KW-G保护柱(汤姆森仪器公司(ThomsonInstrument Company)目录号6960955)和KW-803柱(TIC目录号6960940)上的分析型尺寸排阻色谱测定聚集体百分比，该柱用流动相[20mM Tris约pH7.65(用10mM Tris pH7.4，10mMTris pH8制备)，200mM NaCl，0.02％叠氮化钠]平衡，在280nm处数据采集。通过以下方式制备样品的等分试样用于DAR测定：将样品在1xPBS中稀释至2mg/ml，用PNGaseF(内部)在50℃下将样品去糖基化10分钟，通过与蛋白A结合去除PNGaseF，用1xPBS洗涤，用1％甲酸洗脱。然后将样品注射到2.1x 50mm PLRP-S柱(8μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在20％CH3CN/水(英杰公司)中的0.1％甲酸，以0.5ml/min运行。将柱以20％CH3CN/水洗涤3分钟，然后用0.1分钟梯度洗脱至0.1％甲酸90％CH3CN/水，维持1.9分钟。质谱数据在安捷伦1260仪器上获得，并且用MassHunter定性分析B.05.00在110-180kDa范围内解卷积。将对应于各种计算的DAR态的峰面积根据每个峰的DAR进行加权，然后将DAR4峰的求和且加权的面积除以所有加权峰的总和，以获得DAR值。
接头有效负载MPET.DM4的制备：
分析方法
除非另有说明，否则将以下HPLC和HPLC/MS方法用于制备中间体和实例。
LC/MS分析在安捷伦1200sl/6140系统上进行。
柱：沃特世(Waters)Acquity HSS T3C18，50x 2.0，1.8um
流动相：A)H2O+0.05％TFA；B:乙腈+0.035％TFA
泵方法：
时间 A％ B％ 流速(mL/min)
0 90 10 0.9
1.35 0 100 0.9
1.36 0 100 0.9
1.95 0 100 0.9
1.96 90 10 0.9
2.0 90 10 0.9
检测：UV二极管阵列在190nm-400nm
MS扫描：200-1350amu
ELSD：60℃
MS参数：
极性 阳性
干燥气体 12
雾化器压力 50
干燥气体温度 350
毛细管电压 3000
(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-氧氮杂环己烷(oxazinana)-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯环十四蕃-10,12-二烯-4-基N-(4-((2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙基)二硫烷基)-4-甲基戊酰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯
步骤1：(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-氧氮杂环己烷-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯环十四蕃-10,12-二烯-4-基N-(4-((2-氨基乙基)二硫烷基)-4-甲基戊酰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯的制备
在室温下，向溶解在PBS缓冲液(10.5mL)和无水THF(21mL)中的DM4(480mg，0.62mmol)中添加2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙-1-胺(151mg，0.68mmol)和DIEA(0.27mL，1.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30min并真空浓缩。将水性残余物用CH3CN(1mL)和H2O(2mL)稀释，并通过反相ISCO(用含有0.05％TFA的10％-60％乙腈-H2O洗脱)纯化。将含有所希望的产物的级分冻干以获得所希望的产物(555mg，93％产率)。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δppm 0.83(s,3H)1.21(d,J＝5.0Hz,3H)1.25(s,3H)1.28(s,3H)1.30(d,J＝5.0Hz,3H)1.45-1.55(m,3H)1.67(s,3H)1.84-1.88(m,1H)1.95-2.01(m,1H)2.14(dd,J＝5.0和15.0Hz,1H)2.37-2.43(m,1H)2.53-2.59(m,1H)2.64(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H)2.82-2.89(m,5H)2.91(d,J＝10.0Hz,1H)3.16(dd,J＝5.0和10.0Hz,2H)3.20(s,3H)3.23(d,J＝10.0Hz,1H)3.35(s,3H)3.55(d,J＝5.0Hz,1H)3.58(d,J＝10.0Hz,1H)4.15-4.20(m,1H)4.64(dd,J＝5.0和10.0Hz,1H)5.43(q,J＝5.0Hz,2H)5.66(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H))6.58(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H)6.65(d,J＝10.0Hz,1H)6.66(s,1H)7.11(bs,1H)7.28(bs,1H)；MS m/z 855.3(M+H)，保留时间0.988分钟。
步骤2：(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-氧氮杂环己烷-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯环十四蕃-10,12-二烯-4-基N-(4-((2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙基)二硫烷基)-4-甲基戊酰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯的制备
在室温下，向溶解在无水DMSO(7mL)中的(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-氧氮杂环己烷-3(2,3)-环氧乙烷-8(1,3)-苯环十四蕃-10,12-二烯-4-基N-(4-((2-氨基乙基)二硫烷基)-4-甲基戊酰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯(555mg，0.57mmol)中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸酯(171mg，0.63mmol)和DIEA(249mL，1.43mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15min，并使用TFA中和。将混合物用冰浴冷却至0℃，然后添加CH3CN(2mL)和H2O(7mL)，并且然后通过反相ISCO(用含有0.05％TFA的10％-70％乙腈-H2O洗脱)纯化。将含有所希望的产物的级分冻干以获得所希望的产物(430mg，66％产率)。)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 0.81(s,3H)1.23(s,3H)1.24(s,3H)1.25(s,1H)1.28(d,J＝5.0Hz,3H)1.31(d,J＝5.0Hz,3H)1.43-1.49(m,1H)1.61(d,J＝15.0Hz,1H)1.64(s,3H)1.81-1.87(m,1H)1.94-2.01(m,1H)2.19(dd,J＝5.0和15.0Hz,1H)2.30-2.36(m,1H)2.54(t,J＝5.0Hz,2H)2.61(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H)2.70(t,J＝5.0Hz,2H)2.88(s,3H)3.00(d,J＝10.0Hz,1H)3.13(d,J＝10.0Hz,1H)3.21(s,3H)3.55(s,3H)3.45(q,J＝5.0Hz,2H)3.49(d,J＝5.0Hz,1H)3.62(d,J＝10.0Hz,1H)3.83(t,J＝5.0Hz,1H)3.98(s,3H)4.32(m,1H)4.80(dd,J＝5.0和10.0Hz,1H)5.28(d,J＝5.0Hz,1H)5.66(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H))6.22(bs,1H)6.42(dd,J＝10.0和15.0Hz,1H)6.50(s,1H)6.63(s,1H)6.66(d,J＝10.0Hz,1H)6.70(s,2H)6.83(s,1H)；MS m/z 988.3(M+H-H2O)，保留时间1.145分钟。
实例4B：抗体药物缀合物121G12.DAPA.sSPDB.DM4的制备
在22℃下向25mM HEPES缓冲液pH 7.6(3ml；无菌)和二甲基乙酰胺(DMAc；0.12ml)的搅拌溶液中添加121G12..DAPA；MW约145546g/mol；62mg(0.426μmol))在磷酸钾缓冲液(10mM，pH6；无菌)中的溶液(1.695ml)。添加溶解在0.242ml DMAc中的类美登素DM4(2.42mg(3.101μmol)。添加溶解在0.970ml DMAc中的接头磺基SPDB(0.970mg(2.386μmol，校正用于测定)。18h后，通过SEC-UV和HPLC分析反应混合物的反应完成性。
从小分子副产物中纯化反应混合物，并且通过在Amicon膜单元；截留值30kDa上过滤进行缓冲液交换，使用10mM PBS-pH7.4缓冲液(无菌)用于洗涤。将得到的Amicon-渗余物合并，并且稀释至10mg/ml(UV)，得到2.9ml的抗体药物缀合物121G12.DAPA.sSPDB-DM4在10mM PBS-pH7.4缓冲液中的溶液(49％蛋白质回收率)。
通过SEC-UV，将药物抗体比率确定为n＝3.6，并且单体纯度为98.7％。内毒素水平为0.14EU/mg(BET Endosafe-测试)。
实例4C：抗体药物缀合物684E12.SMCC.DM1的制备
向抗体(亲本684E12)溶液(7.1mg/mL，3.4mL，约47μM，PBS，pH 7.4)中添加100μL的2mM DM1(0.17mg)的DMA溶液和50μL的4mM磺基-SMCC(0.15mg)的DMA溶液并且将混合物在4℃下孵育并轻轻搅拌过夜。孵育后，将反应混合物经由在HiPrep 26/10脱盐柱(通用电气医疗集团)上使用PBS，pH 7.4作为运行缓冲液进行脱盐来纯化并无菌过滤。通过MALDI-MS分析纯化的缀合物，并且估计DAR为2.6。分析型SEC显示样品中存在3.7％的聚集体(或96.3％单体)，并且LAL测试(PTS，查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))确定内毒素值为0.36EU/mg。
实例4D：抗体药物缀合物506E15.AURIX1的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的18.8mg/ml(OD280，对于10mg/mlIgG溶液具有13.7的消光系数)的506E15.CysMab(WT Fc)抗体。将1.76ml的抗体吸收到3mlRMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)上，并且向所得浆液中添加240ul的在0.5M磷酸盐pH8(向其中以13.6g/L的比率添加NaOH(阿法埃莎公司A16037))中配制的0.5M半胱氨酸(西格玛G121-03)。将浆液在室温下不时地涡旋30分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于2ml 1xPBS(50％浆液)中，并且添加60ul 100uM CuCl2(奥德里奇751944)(净100nM Cu2+)以引发再氧化。在420分钟后，再添加90ul的100uM CuCl2以进一步加速再氧化。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的参考马来酰亚胺：(WO 2015/095301的实例3，第110页)的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为565分钟)，添加220ul在DMSO中的20mM AURIX1原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋70分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(6ml)用0.6ml0.5M磷酸钠pH 8中和，使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至2.5ml，施加到平衡至1xPBS的PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml浓缩物并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为22mg(66％)。
实例4E：抗体药物缀合物506E15.CysMab.DAPA.AURIX2的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的10mg/ml(OD280，对于10mg/ml IgG溶液具有13.7的消光系数)的506E15.CysMab.DAPA抗体。将2.0ml的抗体吸收到2ml RMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)上，并且向所得浆液中添加160ul的在0.5M磷酸盐pH8(向其中以13.6g/L的比率添加NaOH(阿法埃莎公司A16037))中配制的0.5M半胱氨酸(西格玛G121-03)。将浆液在室温下不时地涡旋30分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于2ml 1xPBS(50％浆液)中，并且添加10ul 100uM CuCl2(奥德里奇751944)(净250nM Cu2+)以引发再氧化。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的参考马来酰亚胺(WO 2015/095301的实例3，第110页)的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为295分钟)，添加80ul在DMSO中的20mM AURIX2原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋85分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(4ml)用0.4ml0.5M磷酸钠pH 8中和，施加到平衡至1xPBS的2x PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml洗脱液并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为13.3mg(67％)。
实例4F：抗体药物缀合物674J13.CysMab.AURIX1的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的9mg/ml(OD280，对于10mg/ml IgG溶液具有13.7的消光系数)的674J13.CysMab(WT Fc)抗体。向57.6ml抗体中添加DTT至200mM(英杰公司15508-013)并且将溶液孵育75分钟以强烈还原Ab。然后将经还原的Ab施加到平衡至1xPBS的PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml浓缩物并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。将来自PD10的洗脱液汇集，然后重新施加到新鲜的PD10柱上以更完全地去除DTT。需注意，在单独的实验中，PD10色谱柱在去除DTT方面比仅通过尺寸排除机制所看到的更有效，条件是色谱柱仅使用一次。
通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的AURIX1的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为180分钟)，添加290ul在DMSO中的20mM AURIX1原液以及6ml RMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)。将浆液在室温下不时地轻轻涡旋40分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(11.5ml)用1.2ml 0.5M磷酸钠pH 8中和，使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至2.5ml，施加到平衡至1xPBS的PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml浓缩物并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为26mg(41％)
实例4G：抗体药物缀合物674J13.CysMab.DAPA.AURIX2的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的31.7mg/ml(OD280，对于10mg/mlIgG溶液具有13.7的消光系数)的674J13.CysMab.DAR4.DAPA抗体。将9.5ml的抗体吸收到30.1ml RMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)上并且向所得浆液中添加1800mgDTT(英杰公司15508-013)以强烈还原Ab(净200mM DTT)。将浆液在室温下涡旋20分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于2ml 1xPBS中并且在室温下涡旋-不添加铜(该添加加速再氧化太严重)。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的参考马来酰亚胺(WO 2015/095301的实例3，第110页)的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为80分钟)，添加903ul在DMSO中的20mM AURIX2原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋50分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(60.2ml)用6.0ml 0.5M磷酸钠pH 8中和，使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至17.5ml，施加到平衡至1xPBS的7个PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml浓缩物并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为243mg(81％)
实例4H：抗体药物缀合物121G12.CysMab.DAPA.AURIX1的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的16.7mg/ml(OD280，对于10mg/mlIgG溶液具有13.7的消光系数)的121G12.CysMab.DAPA抗体。将3.6ml的抗体吸收到6ml RMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)上，并且将所得浆液在室温下涡旋125分钟，然后添加544ul的在0.5M磷酸盐pH 8(向其中以13.6g/L的比率添加NaOH(阿法埃莎公司A16037))中配制的0.5M半胱氨酸(西格玛G121-03)。将浆液在室温下不时地涡旋60分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于2ml 1xPBS(50％浆液)中，并且添加16ul 100uMCuCl2(奥德里奇751944)(净250nM Cu2+)以引发再氧化。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的AURIX1的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为170分钟)，添加67ul在DMSO中的20mM AURIX1原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋120分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(15ml)用1.5ml0.5M磷酸钠pH 8中和，使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至5ml，施加到平衡至1xPBS的2x PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml洗脱液并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为54mg(92％)。
实例4I：抗体药物缀合物121G12.CysMab.AURIX1的制备
起始材料是在1x磷酸盐缓冲盐水(1xPBS)中的12.5mg/ml(OD280，对于10mg/mlIgG溶液具有13.7的消光系数)的121G12.CysMab(Fc WT)抗体。将4.8ml的抗体吸收到6mlRMP蛋白A树脂(通用电气医疗集团1-223BPO/I)上，并且将所得浆液在室温下涡旋125分钟，然后添加592ul的在0.5M磷酸盐pH 8(向其中以13.6g/L的比率添加NaOH(阿法埃莎公司A16037))中配制的0.5M半胱氨酸(西格玛G121-03)。将浆液在室温下不时地涡旋60分钟，然后通过穿过瓶顶0.2um过滤装置真空过滤、在至少10个过滤和添加的循环中用50个床体积的1xPBS洗涤。将经洗涤的树脂重悬于2ml 1xPBS(50％浆液)中，并且添加16ul 100uMCuCl2(奥德里奇751944)(净250nM Cu2+)以引发再氧化。通过以下方式测试抗体的再氧化：取出浆液的30ul等分试样，添加1ul已知使RPLC的抗体峰偏移的AURIX1的20mM原液，混合1分钟，7,000x g旋转10秒，去除上清液，添加60ul赛默IgG洗脱缓冲液(赛默科技公司21009)，14,000x g旋转10秒，对上清液取样并如下通过RPLC分析产物：将2ul样品注射到加热的(80℃)4.6x 50mm安捷伦PLRP-S柱(5μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在29.5％CH3CN/水中的0.1％三氟乙酸(密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4)，以1.5ml/min运行。用5分钟梯度洗脱柱至44.5％CH3CN/水，维持1.9分钟，并且在280nm处检测峰。将缀合的最佳时间定义为主要产物峰最大、后期洗脱峰最小化并且早期洗脱峰尚未增加的时间。
当RPLC测定表明再氧化是最佳的时(在这种情况下为160分钟)，添加67ul在DMSO中的20mM AURIX1原液，并且不时地在室温下将浆液轻轻涡旋120分钟。然后在至少10个过滤和添加的循环中用20个床体积的1xPBS洗涤浆液。
然后将浆液转移到烧结柱(Pierce 7375021)上，用0.5个床体积的赛默IgG洗脱缓冲液预洗脱(丢弃)，然后用2个床体积的相同缓冲液洗脱。将全部的洗脱液(15ml)用1.5ml0.5M磷酸钠pH 8中和，使用旋转浓缩器(Amicon UFC905024)以3,000x g浓缩至5ml，施加到平衡至1xPBS的2x PD-10缓冲液交换柱(通用电气医疗集团17-0851-01)上，加载2.5ml洗脱液并按照制造商用3.5ml 1xPBS洗脱。产率为52mg(89％)。
分析方法：通过OD280测定浓度，对于10mg/ml IgG溶液消光系数为13.7。使用在TECAN Safire读板器上读取的动力学QCL测定(龙沙沃克斯维尔公司50-650H)测定热原。通过在Shodex KW-G保护柱(汤姆森仪器公司目录号6960955)和KW-803柱(TIC目录号6960940)上的分析型尺寸排阻色谱测定聚集体百分比，该柱用流动相[20mM Tris约pH7.65(用10mM Tris pH7.4，10mM Tris pH8制备)，200mM NaCl，0.02％叠氮化钠]平衡，在280nm处数据采集。通过以下方式制备样品的等分试样用于DAR测定：将样品在1xPBS中稀释至2mg/ml，用PNGaseF(内部)在50℃下将样品去糖基化10分钟，通过与蛋白A结合去除PNGaseF，用1xPBS洗涤，并且用1％甲酸洗脱。将样品通过以下方式还原：添加1/4体积的含有0.5M TCEP的5M乙酸铵pH 5.0并且在室温下孵育30分钟。然后将样品注射到2.1x 50mmPLRP-S柱(8μm颗粒，孔径)上，该柱平衡至在20％CH3CN/水(英杰公司)中的0.1％甲酸，以0.5ml/min运行。将柱以20％CH3CN/水洗涤3分钟，然后用0.1分钟梯度洗脱至0.1％甲酸90％CH3CN/水，维持1.9分钟。质谱数据在安捷伦1260仪器上获得，并且用MassHunter定性分析B.05.00在15-60kDa范围内解卷积。将对应于各种计算的DAR态的峰面积根据每个峰的DAR进行加权，然后将DAR4峰的求和且加权的面积除以所有加权峰的总和，以获得DAR值。
对所得样品的分析如下：
实例4J:使用其他CysMab抗体制备另外的缀合物
将实例4A中描述的方法也用于用其他半胱氨酸工程化抗体产生MPET.DM4缀合物。
将这些方法用于使用PCT公开号WO 2016/203432中披露的以下抗体产生抗P-钙粘着蛋白Ab.CysMab.MPET.DM4：抗体NOV169N31Q(E152C-S375C)、NEG0012(E152C-S375C)、NEG0013(E152C-S375C)、NEG0016(E152C-S375C)、NEG0064(E152C-S375C)、NEG0067(E152C-S375C)、NOV169N31Q(K360C(HC)-K107C(LC))、NEG0012(K360C(HC)-K107C(LC))、NEG0013(K360C(HC)-K107C(LC))、NEG0016(K360C(HC)-K107C(LC))、NEG0064(K360C(HC)-K107C(LC))和NEG0067(K360C(HC)-K107C(LC))。
实例5：体外ADC表征
通过各种功能性和分析型方法表征抗体药物缀合物(ADC)。如通过FACS所评估，ADC保持与细胞上的靶CCR7蛋白结合。对于所有ADC，FACS结合测定中的几何平均荧光强度在未缀合抗体的值的20％内。通过分析型SEC，显示ADC为在所期望分子量下的>95％材料；在对于初始反应产物未观察到该结果的情况下，制备型SEC的使用达到了必要的规格。药物抗体比率(DAR)通过以下方式评估：对去糖基化的还原抗体样品进行LCMS，对各个DAR种类的丰度求和并根据每个DAR种类上药物分子的数量进行加权(例如，单个DAR2离子计数为2，单个DAR1离子计数为1)。包含含有两个半胱氨酸突变的恒定区的缀合物至少等于或高于DAR 3.4，且最常见的是等于或高于DAR 3.8。这与报道的缀合物一致。
实例6：对细胞增殖的抑制/细胞活力测定
在上面我们显示出所有三种抗CCR7抗体的荧光团-缀合形式在一组细胞系中可以内化CCR7并且在细胞的低pH部分有效地累积缀合的荧光团。在此我们显示了抗体在缀合物质是有毒有效负载的环境中内化和细胞内累积缀合物质的能力。
在背驮式ADC(pgADC)环境中，通过在治疗四天后评估细胞活力来研究与有效负载缀合的第二抗体片段复合的抗CCR7抗体的细胞毒性作用。制备CCR7特异性IgG的三倍稀释液并且与恒定量的有效负载偶联的Fab片段混合。有效负载偶联的Fab片段的最终浓度为0.5μg/ml。Fab试剂是与MMAF或皂草素(Advanced Targeting Systems公司，Fab-Zap)缀合的抗小鼠Fc定向的Fab。在室温下预孵育30min后，将10μl/孔的抗体-有效负载复合物一式三份地添加到384孔底白板中。接种对应的CCR7(+)细胞，使得它们的密度对于悬浮细胞小于1x 106个/ml并且对于粘附细胞达到80％汇合。收获细胞(用Accutase分离粘附细胞)并重悬至大约2x 104个细胞/ml。将细胞添加到384孔板中、在抗体-有效负载复合物(20μl/孔)之上。将板在37℃和5％CO2下孵育4天。随后，制备20μl/孔的CellTiter-Glo溶液(发光细胞活力测定；普洛麦格公司，#G7571)并且添加到细胞中。只有活细胞产生ATP，ATP是荧光素酶反应(由CellTiter-Glo提供)所需的，从而导致发光。据此，通过发光信号确定细胞活力，在22℃和400rpm下孵育10min后使用Envision 2104多标签读取器测量该发光信号。使用Graphpad Prism软件计算IC50值。
图7A和图7B显示所有四种抗CCR7抗体均能够使用MMAF缀合的试剂以背驮式测定形式对CCR7+KE97细胞进行浓度依赖性细胞杀伤。下表汇总了使用MMAF或皂草素作为工具背驮式有效负载的实验结果。
表16：pgADC细胞毒性测定中抗CCR7抗体的IC50和AMAX
使用靶阴性细胞系评估pgADC杀伤的特异性。在图8中示出了使用FabZap试剂的一个实例。与CCR7阴性NIH3T3亲代细胞或mIgG对照抗体相比，在KE97和NIH3T3.hCCR7细胞中观察到121G12pgADC活性的特异性CCR7依赖性增加。
实例7：小鼠交叉反应性非缀合或AURIX1缀合的抗CCR7抗体对体内正常小鼠造血 细胞的影响
跨物种的正常组织表达限于造血来源的细胞，包括血液和淋巴器官中的CD4+和CD8+T细胞，这呈现出靶向CCR7的ADC的潜在安全性不利因素，特别是在可能导致ADCC和淋巴细胞消耗的野生型Fc形式中。
为了确定用ADC靶向CCR7对体内正常造血细胞的影响，在健康雌性6-8周龄CD-1小鼠中以野生型或沉默(DAPA)Fc形式评价与AURIX1未缀合或缀合的小鼠交叉反应性121G12亲本Ab。使小鼠接受121G12亲本Cys-Mab.野生型Fc.hIgG1(121G12.wt.Fc)、121G12亲本Cys-Mab.DAPA.hIgG1(121G12.DAPA.Fc)、121G12亲本.Cys-Mab.野生型Fc.hIgG1.AURIX1(121G12.wt.Fc.AURIX1)或121G12.亲本.Cys-Mab.DAPA.hIgG1.AURIX1(121G12.DAPA.Fc.AURIX1)的单一IV治疗，最终剂量为10mg/kg。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
在治疗后第25天，提取脾并且使用gentleMACS解离器(美天旎公司(MiltenyiBiotec Inc)，圣地亚哥，加利福尼亚州)解离成单细胞悬浮液。然后将每个样品的100万个细胞用Ab的混合物染色以确定单独治疗对CD4+和CD8a+T细胞的影响，该混合物包含BUV737大鼠抗小鼠CD8a抗体、克隆53-6.7(1:100)(BD生物科学事业部(BD Biosciences)，圣何塞(San Jose)，加利福尼亚州，目录号564297)和BV510大鼠抗小鼠CD4，克隆RM4-5(1:200)(BD生物科学事业部，圣何塞，加利福尼亚州，目录号563106)。将样品在4℃下孵育30min，在冰冷的海克隆磷酸盐缓冲盐水(海克隆实验室公司(Hyclone Laboratories)，洛根(Logan)，犹他州(Utah))中洗涤，并且在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD生物科学事业部，圣何塞，加利福尼亚州)上评价。使用总脾细胞计数来确定CD4+或CD8a+T细胞消耗。使用T检验来确定组间的显著性。
如表17和图9中所示，在用121G12.wt.FC或121G12.wt.Fc.AURIX1 Ab以10mg/kg治疗的第3天观察到脾脏中CD4+(FC 0.5-0.6)和CD8a+T细胞(FC 0.3-0.5)的强烈减少，这表明T细胞消耗影响独立于AURIX1有效负载的存在。通过引入DAPA突变使Fc沉默，挽救了这些效应。相对于未治疗组，121G12.DAPA.Fc和121G12.DAPA.Fc.AURIX1均未能影响T细胞群。这些数据表明抗CCR7ADC可能具有T细胞消耗安全性不利因素，该不利因素可通过Fc的DAPA沉默来挽救。
表17：121G12抗体对CD-1小鼠中的CD4+和CD8a+T细胞群的影响
在治疗第25天评价实验。倍数变化(FC)＝对于所指示治疗组的第25天的平均脾细胞计数/对于未治疗对照组的第3天的平均脾细胞计数。使用T检验来确定相对于未治疗组的显著性(*p<0.05，***p<0.001；NS＝不显著)。
实例8：直接缀合物的抗CCR7ADC活性
通过在治疗4天后评估细胞活力来研究在与各种有效负载直接缀合的抗体(ADC)结合并内化到CCR7(+)细胞中后的细胞毒性作用。将ADC的三倍稀释液一式三份地(10μl/ml)添加到384孔底白板中。接种对应的CCR7(+)细胞，使得它们的密度对于悬浮细胞小于1x106个/ml并且对于粘附细胞达到80％汇合。收获细胞(用Accutase分离粘附细胞)并重悬至大约2x 104个细胞/ml。将细胞添加到384孔板中、在抗体(20μl/孔)之上。将板在37℃和5％CO2下孵育4天。随后，制备20μl/孔的CellTiter-Glo溶液(发光细胞活力测定；普洛麦格公司，#G7571)并且添加到细胞中。通过发光信号确定细胞活力，在22℃和400rpm下孵育10min后使用Envision读取器测量该发光信号。使用Graphpad Prism软件计算IC50值。
下表示出了用与AURIX1或AURIX2缀合、呈野生型Fc或沉默(DAPA)Fc形式的抗CCR7CysMab抗体测量细胞活力效应的实例。
表18：细胞毒性测定中抗CCR7ADC的IC50
为了评估ADC的靶特异性和受体水平依赖性，在具有不同CCR7受体水平的细胞系中测试ADC活性。下表示出了呈CysMab.DAPA形式并与AURIX2缀合的人源化674J13抗体的实例。基于对有效负载的类似敏感性选择细胞系。
表19：呈DAPA形式并与AURIX2缀合的人源化674J13抗体的IC50
如在pHrodo实验中所见，ADC活性需要比ADCC模式更高程度的受体数量。确切的受体截止值取决于各种参数(例如，抗体亲合力、有效负载效力)，但是此处示出的数据描述了一般概念。使用DAPA形式的亲合力依赖性抗CCR7抗体，使ADC活性对癌症细胞的偏倚超过正常CCR7+PBMC，这些正常CCR7+PBMC在此由具有少于2,000个CCR7受体的癌细胞系代表。
实例9：位点特异性MPET.DM4ADC的引入
DM4缀合的ADC在ADC领域中已很好地建立。在此，我们描述了使用抗体的CysMab形式对位点特异性缀合的MPET.DM4的产生和使用，该CysMab形式具有产生其中DAR(药物对抗体比率)是约4的可重复均质、DAR控制的ADC批次的优点。已经描述了非位点特异性缀合物通常含有具有高DAR的显著群体，这与不利的生物物理特征相关，这些不利的生物物理特征包括增加的疏水性、并且因此包括更快速的清除率、差的PK曲线和增加的毒性。下面我们示出了基于MPET.DM4的抗CCR7ADC相对于其sSPDB.DM4对应物的各种体外和体内评估。
实例10：MPET.DM4相对于sSPDB.DM4ADC的FACS结合亲和力
与非位点特异性缀合相比，位点特异性缀合的另一个潜在改进可能是结构上在必需CSD残基附近的赖氨酸缀合位点的潜在干扰。可以预期到此类赖氨酸位点的有效负载缀合影响ADC的结合亲和力。为了使用在此描述的CysMab缀合的MPET.DM4相对于内源性赖氨酸缀合的sSPDB.DM4测试ADC的结合亲和力，通过如上所述的FACS测定结合亲和力。下表汇总了一些代表性亲和力数据，该数据显示出sSPDB.DM4ADC相对于MPET.DM4ADC的结合亲和力轻微下降。
表20：抗CCR7ADC的结合亲和力
实例11：MPET.DM4相对于sSPDB.DM4ADC的体外活性
如上所述，在体外活力测定中评估ADC121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR3.9)的细胞毒性作用。下表显示了与sSPDB.DM4相比MPET.DM4缀合物的类似的略微改善的活性。这可能是保守亲和力较佳或其他因素的结果。
表21：抗CCR7ADC的体外细胞毒活性
将121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4ADC在涵盖各种适应症环境的多种癌细胞系中进一步测试，其中实现了与受体密度相关的实质性细胞杀伤。
表22：抗CCR7ADC在细胞系中的体外细胞毒活性
实例12：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4对SCID-Beige 小鼠中KE97多发性骨髓瘤异种移植模型的剂量依赖性体内功效
为了证实121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4在体内的靶向抗肿瘤活性，在雌性SCID-beige小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立KE97异种移植模型。一旦肿瘤达到大约135mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝8只/组)。使小鼠接受最终剂量为0.5、2或5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)、0.5、2或5mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR3.9)、或5mg/kg的非特异性同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
所有测试药剂在研究中均耐受，并且在任何治疗组中均未观察到毒性或体重减轻的明显临床症状(表23)。
表23：在KE97异种移植模型中的抗CCR7ADC剂量应答功效
在治疗第9天(移植后第23天)评价实验，*p<0.001，相对于对照未治疗组(单向方差分析/Tukey多重比较检验)。％ΔT/ΔC＝100ΔT/ΔC其中：ΔT＝在研究的D23药物治疗组的平均肿瘤体积-在初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；ΔC＝在研究的D23对照组的平均肿瘤体积-在初始给药日D14对照组的平均肿瘤体积。消退％＝(1-T最终/T初始)x100，其中T最终是D23平均肿瘤体积并且T初始定义为在移植后D14的肿瘤体积。Δ体重(％)＝(D23平均体重-D14平均体重)*100/治疗D14的平均体重。
在用非特异性同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以5mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗产生剂量依赖性抗肿瘤功效，其中ΔT/ΔC值为78.62％(0.5mg/kg)，而2和5mg/kg的剂量在第一次给药后D9(植入后D23)分别导致33％和54％的平均消退。121G12.DAPA.sSPDB.DM4治疗也展示出剂量依赖性抗肿瘤功效，其中ΔT/ΔC值为85.38％(0.5mg/kg)和13.77％(2mg/kg)，而5mg/kg剂量在第一次给药后D9(植入后D23)导致33％的平均消退。在植入后D23-D25，使对照组和0.5mg/kg治疗组安乐死，并且使其余组在植入后D28接受2或5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4或2或5mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4的第二剂量。直到在植入后D42的研究结束时，对于2和5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4，以及5mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4观察到持续的肿瘤消退。以2mg/kg使用121G12.DAPA.sSPDB.DM4时，应答更加异种，其中大约25％的小鼠显示出持续的肿瘤消退，而该组的其余小鼠显示出稳定的疾病或肿瘤进展(图10，表23)。
实例13：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4相对于121G12.DAPA.sSPDB.DM4在较大起 始肿瘤体积下的KE97多发性骨髓瘤模型中的功效评估
使用KE97多发性骨髓瘤细胞系建立较高障碍的体内模型，以进一步区分不同的可裂解接头的抗肿瘤功效，比较了121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR3.9)在第一次剂量下在具有较大起始肿瘤体积的肿瘤中的功效。在雌性SCID-beige小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立KE97异种移植模型。一旦肿瘤达到大约450mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入两个治疗组(n＝8)。使小鼠接受2mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4或121G12.DAPA.sSPDB.DM4的IV治疗。
用121G12.DAPA.sSPDB.DM4以2mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗在单剂量治疗下导致75％(8只中的6只)小鼠的部分消退/延长停滞(图11)。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在该模型中强烈优于121G12.DAPA.sSPDB.DM4(D25平均肿瘤体积分别为524.83±143.20相对于1337.13±35.13，p<0.001；非配对T检验)。
实例14：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对原发性患者衍生非小细胞肺癌 HLUX1934肿瘤模型的体内功效
在表达CCR7的HLUX1934原发性非小细胞肺癌异种移植模型中评价121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4的抗肿瘤活性。使雌性无胸腺裸鼠皮下植入肿瘤片段到每只小鼠的右胁部中。一旦肿瘤达到大约100mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝8)。使小鼠接受10mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)、或10mg/kg的非特异性同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治疗。2周后递送每种抗体的第二剂量。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
10mg/kg的非特异性同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4相对于未治疗组显现出略微延迟的肿瘤生长(ΔT/ΔC值53.07％)，这可能是由于抗体与HLUX1934模型中的脱靶的非特异性结合。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗导致更明显的功效，该功效通过给予第二剂量而维持。10mg/kg剂量的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗耐受性良好，植入后D34没有明显的体重减轻并且ΔT/ΔC值为18.83％。(图12，表24)。
表24：HLUX1934NSCLC患者衍生模型中的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4功效。在植入后第34天(治疗后D23)评价实验。
*p<0.001，相对于对照未治疗组(单向方差分析/Tukey多重比较检验)。％ΔT/ΔC＝100ΔT/ΔC其中：ΔT＝在研究的D34药物治疗组的平均肿瘤体积-在初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；ΔC＝在研究的D34对照组的平均肿瘤体积-在初始给药日对照组的平均肿瘤体积。Δ体重(％)＝(D34平均体重-D11平均体重)*100/治疗D11的平均体重。*未治疗组中的由于治疗后D25-D27过度肿瘤负荷而安乐死的小鼠。
实例15：684E12.SMCC.DM1对SCID-Beige小鼠中KE97多发性骨髓瘤异种移植模型 的体内功效
为了证实684E12.SMCC.DM1在体内的靶向抗肿瘤活性，在雌性SCID-beige小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立KE97异种移植模型。一旦肿瘤达到大约200mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝8只/组)。使小鼠接受最终剂量为2或6mg/kg的亲本684E12.SMCC.DM1(DAR2.6)、或6mg/kg的非特异性同种型对照IgG1.SMCC.DM1的IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
所有测试药剂在研究中均耐受，并且在任何治疗组中均未观察到毒性或体重减轻的明显临床症状。在用非特异性同种型对照IgG1.SMCC.DM1或亲本684E12.SMCC.DM1以2mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。亲本684E12.SMCC.DM16mg/kg治疗在剂量后D11导致ΔT/ΔC值6.72％(p<0.0001，单向方差分析/Tukey多重比较检验)(图13)。
实例16：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在KE97肿瘤模型中产生的体内中靶药效 动力学标志物调节
利用在用121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗后磷酸化组蛋白H3标志物阳性肿瘤细胞的累积评估抗CCR7ADC在体内诱导G2/M阻滞的能力。
进行研究，其中在雌性SCID-beige小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立KE97异种移植模型。一旦肿瘤达到大约140mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝3只/组)。使小鼠接受最终剂量为2、5或10mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4、或10mg/kg的非特异性同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的单一IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。治疗后48小时收集肿瘤用于通过下述免疫组织化学染色评估磷酸化组蛋白H3水平。
为了通过免疫组织化学测量磷酸化组蛋白H3阳性细胞核的累积，从文塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems)(图森(Tuscon)，亚利桑那州(AZ)，目录号760-4591)获得靶向人组蛋白H3的磷酸化丝氨酸10周围的残基的兔多克隆抗体。IHC方案包括对文塔纳Discovery细胞调理剂1抗原修复试剂的加热和温和暴露(32min)。将样品在室温下与第一抗体(由制造商预稀释)一起孵育60min。随后与OmniMap抗兔HRP第二Ab(文塔纳，图森，亚利桑那州，目录号760-4311)(由制造商预稀释)一起孵育12min。
在图14A中，尽管代表性的未治疗和同种型对照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4显示偶然的磷酸化组蛋白H3阳性肿瘤细胞，但在给予121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4后48小时检测到磷酸化组蛋白H3免疫染色的稳健剂量依赖性增加。使用MatLab(迈斯沃克公司(MathWorks)，纳蒂克马萨诸塞州)进行信号的定量，其中将磷酸化组蛋白H3信号的总面积(μm2)通过细胞核的总面积(μm2)归一化，产生以下针对每个治疗组所示的磷酸化组蛋白H3比率(％)值。图14B中的这些数据表明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4能够在肿瘤异种移植物中引发强烈的G2/M阻滞，这与有效负载的预期作用机制一致。
实例17：用于产生121G12.CysMab.DAPA抗体的方法
该实例描述了用于从细胞培养物中产生CCR7抗体121G12.CysMab.DAPA的方法，其中Ab由编码Ab的载体表达。一旦Ab在细胞培养物中表达，将Ab如下从细胞培养物中纯化：
121G12.CysMab.DAPA抗体药物物质中间体的纯化方法中的第一步包括通过串联的深层过滤然后0.2μm过滤去除细胞。
第二步包括蛋白A亲和液相色谱步骤。根据整体产品的总量，将该步骤分若干次运行进行。每次运行允许最大加载量为大约20g/L柱体积。用大约pH 3.0下的50mM乙酸进行洗脱。操作温度为18℃-28℃。将所有洗脱液汇集并且在病毒灭活步骤之前储存在2℃-8℃下。
第三步是“低pH处理”病毒灭活。将步骤2的中间体溶液调整至18℃-28℃并将pH调整至3.5(范围3.4-3.6)。然后保持产物中间体溶液以进行病毒灭活，持续70分钟(范围60-90分钟)。保持时间之后，将溶液调整至pH 6.0(范围5.8-6.2)。在该步骤结束时，对溶液进行深层过滤、串联有0.2μm过滤，并且储存在2℃-8℃下。
第四步是处于结合/洗脱模式的阳离子交换色谱，包括整合的柱上还原。根据滴度，将该步骤分若干次运行进行。每次运行允许加载量为大约30g/L柱体积。用含有20mM琥珀酸钠，pH 6.0的缓冲液A平衡柱。使用20mM磷酸钠、1mM EDTA、7mM L-半胱氨酸，pH 7.1作为还原缓冲液进行柱上还原。用缓冲液A去除还原缓冲液，并且用缓冲液A和含有10mM琥珀酸钠、300mM氯化钠，pH 6.0的缓冲液B以从10％至90％的线性梯度进行洗脱。在多模式阴离子交换色谱步骤之前，可以将洗脱液和汇集物储存在2℃-8℃下。
该方法的第五步是处于流通模式的阴离子交换色谱。根据滴度，将该步骤分若干次运行进行。每次运行允许最大加载量为大约350g/L柱体积。操作温度为18℃-28℃。使用20mM琥珀酸钠、119mM氯化钠，pH 6.0进行平衡。在病毒去除步骤之前，将最终的渗滤液储存在2℃-8℃下。
步骤六病毒过滤包括用0.1μm过滤器预过滤，然后用Planova 20N纳米过滤器进行病毒过滤。在病毒过滤之前，将来自步骤5的中间体溶液的温度调整至18℃-28℃。操作温度为18℃-28℃。纳米过滤后，将中间体储存在2℃-8℃或18℃-28℃下。
第七步超滤/渗滤包括进行上浓缩步骤至大约70g/L，然后用10mM磷酸钾，pH 6.0进行第1次渗滤步骤。将至少7的渗滤交换因子定为目标，然后稀释至大约50g/L。将最终的药物物质中间体进行0.2μm过滤并且储存在2℃-8℃下。
在第八步和最后一步中，将最终的整体药物物质中间体等分填充到合适的容器中，并且在冷冻后储存在-60℃以下。
表25纯化和还原过程的流程图
实例18：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对NSG小鼠中的OCI-LY3ABC-DLBCL异种移 植模型的剂量依赖性体内功效。
为了证实121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在ABC-DLBCL模型中的体内靶向抗肿瘤活性，在雌性NSG小鼠中通过将10x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立OCI-LY3异种移植模型。一旦肿瘤达到大约140mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝6只/组)。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最终剂量为0.5、1或2mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)、或2mg/kg的非特异性同种型对照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。所有测试药剂在研究中均耐受，并且在任何治疗组中均未观察到毒性或体重减轻的明显临床症状(表26)。
在用非特异性同种型对照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗产生剂量依赖性抗肿瘤功效，其中ΔT/ΔC值为74.6％(0.5mg/kg)和10.7％(1mg/kg)，而2mg/kg剂量在研究的第28天导致65.9％的平均消退。在121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2mg/kg组中6只小鼠中有3只显示出完全消退(图15)。
表26：在治疗的第28天OCI-LY3异种移植模型中的抗CCR7ADC剂量应答功效。
在治疗第28天评价实验，**p<0.005，相对于对照未治疗组(单向方差分析/Tukey多重比较检验)。％ΔT/ΔC＝100ΔT/ΔC其中：ΔT＝在研究的D28药物治疗组的平均肿瘤体积-在初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；ΔC＝在研究的D28对照组的平均肿瘤体积-在初始给药日D1对照组的平均肿瘤体积。如果ΔT<0，则计算消退％＝(1-T最终/T初始)x 100，其中T最终是D28平均肿瘤体积并且T初始定义为在治疗D1的肿瘤体积。Δ体重(％)＝(D28平均体重-D1平均体重)*100/治疗D1的平均体重。
实例19：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对SCID-bg小鼠中的Toledo GCB-DLBCL异 种移植模型的剂量依赖性体内功效。
为了证实121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在GCB-DLBCL模型中的体内靶向抗肿瘤活性，在雌性Scid-bg小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立Toledo异种移植模型。一旦肿瘤达到大约100mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝4只/组)。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最终剂量为2或5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)、或5mg/kg的非特异性同种型对照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。所有测试药剂在研究中均耐受，并且在任何治疗组中均未观察到毒性或体重减轻的明显临床症状(表27)。
在用非特异性同种型对照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以5mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗产生剂量依赖性抗肿瘤功效，其中ΔT/ΔC值为52.7％(2mg/kg)和20.6％(5mg/kg)(图16，表27)。
表27：在治疗的第20天Toledo异种移植模型中的抗CCR7ADC剂量应答功效。
在治疗第20天评价实验，*p<0.05，**p<0.005相比于对照未治疗组(单向方差分析/Tukey多重比较检验)。％ΔT/ΔC＝100ΔT/ΔC其中：ΔT＝在研究的D20药物治疗组的平均肿瘤体积-在初始给药日药物治疗组的平均肿瘤体积；ΔC＝在研究的D20对照组的平均肿瘤体积-在初始给药日D1对照组的平均肿瘤体积。Δ体重(％)＝(D20平均体重-D1平均体重)*100/治疗D1的平均体重。
实例20：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对SCID-bg小鼠中的DEL ALCL异种移植模 型的体内功效。
为了证实121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在CCR7阳性ALCL模型中的体内靶向抗肿瘤活性，在雌性Scid-bg小鼠中通过将3x 106个细胞皮下注射到每只小鼠的右肋部中建立DEL异种移植模型。一旦肿瘤达到大约100mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝4只/组)。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最终剂量为2mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)、或2mg/kg的非特异性同种型对照同种型.MPET.DM4的IV治疗。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
在用非特异性同种型对照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2mg/kg治疗后未观察到显著的抗肿瘤功效。用121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM42mg/kg的治疗在单一剂量后在研究的第14天导致40.2％的平均消退(p<0.01)。使小鼠在第15天接受第二剂量并且监测超过三周。一只异常动物未能对第二剂量的治疗产生应答并且由于肿瘤负荷，必须在第28天进行安乐死。另外一只动物显示疾病进展缓慢，并且在第28天也被取下用于靶标表达随访。四只小鼠中的两只继续显示对肿瘤生长的持续影响(图17)。所有治疗均耐受良好，没有明显的体重减轻。
实例21：121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4对原发性患者衍生非小细胞肺癌 HLUX1787肿瘤模型的体内功效
在表达CCR7的HLUX1787原发性非小细胞肺癌异种移植模型中评价121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4的抗肿瘤活性。使雌性NSG小鼠皮下植入肿瘤片段到每只小鼠的右胁部中。一旦肿瘤达到大约150mm3时，根据肿瘤体积将小鼠随机分入治疗组(n＝6只/组)。使小鼠在第1天接受0.5、2或5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)的IV治疗并且2周后在第15天递送第二剂量。将所有剂量针对个体小鼠体重进行调整。
对于低剂量的经缀合的Ab未观察到显著的抗肿瘤功效，然而对于5mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治疗观察到部分消退或稳定疾病。第二剂量后两周观察到持续的肿瘤功效，在治疗的D30产生1.3％的ΔT/ΔC值(p<0.001；单向方差分析/Tukey多重比较检验)(图18)。所有治疗均耐受良好，没有明显的体重减轻。

Claims (57)

1.一种结合人CCR7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与相同同种型的野生型抗体相比具有降低的或没有显著的效应子功能。
2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段具有降低水平的或没有显著水平的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含沉默的Fc区。
4.如权利要求3所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段在该Fc区中包含选自以下的突变：D265A；P329A；P329G；N297A；D265A和P329A；D265A和N297A；L234和L235A；P329A、L234A和L235A；以及P329G、L234A和L235A。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段没有显著的细胞杀伤活性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段以相对于表达较低水平的CCR7的细胞更大的亲和力结合表达较高水平的CCR7的细胞。
7.如权利要求6所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段以相对于表达较低水平的CCR7的正常细胞更大的亲和力结合表达较高水平的CCR7的癌细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段未显著消耗表达CCR7的正常造血细胞。
9.一种结合CCR7的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
a.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:1的HCDR1(重链互补性决定区1)、SEQ IDNO:2的HCDR2(重链互补性决定区2)、和SEQ ID NO:3的HCDR3(重链互补性决定区3)；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:17的LCDR1(轻链互补性决定区1)、SEQ ID NO:18的LCDR2(轻链互补性决定区2)、和SEQ ID NO:19的LCDR3(轻链互补性决定区3)；
b.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:4的HCDR1、SEQ ID NO:5的HCDR2、和SEQID NO:6的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:20的LCDR1、SEQ ID NO:21的LCDR2、和SEQ ID NO:22的LCDR3；
c.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、和SEQID NO:9的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、和SEQ ID NO:25的LCDR3；
d.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:10的HCDR1、SEQ ID NO:11的HCDR2、和SEQ ID NO:12的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:26的LCDR1、SEQ IDNO:27的LCDR2、和SEQ ID NO:28的LCDR3；
e.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:33的HCDR1、SEQ ID NO:34的HCDR2、和SEQ ID NO:35的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:49的LCDR1、SEQ IDNO:50的LCDR2、和SEQ ID NO:51的LCDR3；
f.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:36的HCDR1、SEQ ID NO:37的HCDR2、和SEQ ID NO:38的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:52的LCDR1、SEQ IDNO:53的LCDR2、和SEQ ID NO:54的LCDR3；
g.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:39的HCDR1、SEQ ID NO:40的HCDR2、和SEQ ID NO:41的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55的LCDR1、SEQ IDNO:56的LCDR2、和SEQ ID NO:57的LCDR3；
h.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:42的HCDR1、SEQ ID NO:43的HCDR2、和SEQ ID NO:44的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:58的LCDR1、SEQ IDNO:59的LCDR2、和SEQ ID NO:60的LCDR3；
i.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:65的HCDR1、SEQ ID NO:66的HCDR2、和SEQ ID NO:67的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:81的LCDR1、SEQ IDNO:82的LCDR2、和SEQ ID NO:83的LCDR3；
j.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:68的HCDR1、SEQ ID NO:69的HCDR2、和SEQ ID NO:70的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:84的LCDR1、SEQ IDNO:85的LCDR2、和SEQ ID NO:86的LCDR3；
k.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:71的HCDR1、SEQ ID NO:72的HCDR2、和SEQ ID NO:73的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:87的LCDR1、SEQ IDNO:88的LCDR2、和SEQ ID NO:89的LCDR3；
l.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:74的HCDR1、SEQ ID NO:75的HCDR2、和SEQ ID NO:76的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:90的LCDR1、SEQ IDNO:91的LCDR2、和SEQ ID NO:92的LCDR3；
m.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:596的HCDR1、SEQ ID NO:597的HCDR2、和SEQ ID NO:598的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:612的LCDR1、SEQ IDNO:613的LCDR2、和SEQ ID NO:614的LCDR3；
n.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:599的HCDR1、SEQ ID NO:600的HCDR2、和SEQ ID NO:601的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:615的LCDR1、SEQ IDNO:616的LCDR2、和SEQ ID NO:617的LCDR3；
o.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:602的HCDR1、SEQ ID NO:603的HCDR2、和SEQ ID NO:604的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:618的LCDR1、SEQ IDNO:619的LCDR2、和SEQ ID NO:620的LCDR3；或
p.重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:605的HCDR1、SEQ ID NO:606的HCDR2、和SEQ ID NO:607的HCDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:621的LCDR1、SEQ IDNO:622的LCDR2、和SEQ ID NO:623的LCDR3。
10.一种结合CCR7的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
b.包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
c.包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或
d.包含SEQ ID NO:608的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:624的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
11.一种结合CCR7的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
a.包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链；
b.包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链；
c.包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链；或
d.包含SEQ ID NO:610的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:626的氨基酸序列的轻链。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代。
13.如权利要求12所述的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代，该一个或多个半胱氨酸取代选自该抗体或其抗原结合片段的S152C、S375C、或S152C和S375C两者，其中该位置是根据EU系统编号的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.一种抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物包括下式
Ab-(L-(D)m)n
或其药学上可接受的盐；其中
Ab是根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1至12的整数。
16.如权利要求15所述的抗体药物缀合物，其中所述m是1。
17.如权利要求15或16中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述n是约3至约4。
18.如权利要求15-17中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述接头选自下组，该组由以下组成：可裂解接头、不可裂解接头、亲水性接头、预先带电荷的接头、和基于二羧酸的接头。
19.如权利要求18所述的抗体药物缀合物，其中该接头衍生自交联试剂，该交联试剂选自下组，该组由以下组成：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEGNHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
20.如权利要求18所述的抗体药物缀合物，其中所述接头具有以下式(IIA)：
其中*与该抗体上的硫醇官能团连接，并且**与药物部分的硫醇官能团连接；并且其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的。
21.如权利要求20所述的抗体药物缀合物，其中所述接头具有以下式：
以及
其中y是1至11；*与该抗体上的硫醇官能团连接，并且**与该药物部分的硫醇官能团连接。
22.如权利要求15-21中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分选自下组，该组由以下组成：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、澳瑞司他汀、鹅膏蕈碱、吡咯苯并二氮杂卓、RNA聚合酶抑制剂、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
23.如权利要求22所述的抗体药物缀合物，其中该细胞毒性剂是类美登素。
24.如权利要求23所述的抗体药物缀合物，其中该类美登素是N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(DM1)、N(2’)-去乙酰基-N(2’)-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
25.如权利要求15-24中任一项所述的抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物具有以下式(VIII)：
其中L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；并且其中n是约3至约4；或其药学上可接受的盐。
26.一种抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物具有以下式：
其中n是约3至约4，并且Ab是抗体，该抗体包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链，和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链；或其药学上可接受的盐。
27.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。
28.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物，以及药学上可接受的载剂。
29.一种在有需要的患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括向所述患者给予如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27或28中任一项所述的药物组合物，其中该癌症表达CCR7。
30.如权利要求29所述的方法，其中将该抗体药物缀合物或药物组合物与一种或多种另外的治疗性化合物组合给予至该患者。
31.如权利要求30所述的方法，其中该一种或多种另外的治疗性化合物选自标准护理化学治疗剂、共刺激分子或检查点抑制剂。
32.如权利要求31所述的方法，其中该共刺激分子选自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配体的激动剂。
33.如权利要求31所述的方法，其中该检查点抑制剂选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制剂。
34.如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27或28中任一项所述的药物组合物，用于作为药物使用。
35.如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27或28中任一项所述的药物组合物，用于在有需要的患者中治疗或预防表达CCR7的癌症。
36.如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27或28中任一项所述的药物组合物用于在有需要的患者中治疗或预防表达CCR7的癌症的用途。
37.如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求15-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27或28中任一项所述的药物组合物在制造药物中的用途。
38.如权利要求29至33所述的方法、如权利要求34或35所述的抗体药物缀合物、或如权利要求36-37所述的用途，其中该癌症表达CCR7。
39.如权利要求38所述的方法、抗体药物缀合物或用途，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、鼻咽癌(NPC)、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、肾细胞癌和宫颈癌。
40.如权利要求39所述的方法、抗体药物缀合物或用途，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、和非小细胞肺癌。
41.一种核酸，该核酸编码如权利要求1-14中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
42.如权利要求41所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:14、16、30、32、46、48、62、64、78、80、94、96、481、483、497或499的核苷酸序列。
43.一种载体，该载体包含如权利要求41或42所述的核酸。
44.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求43所述的载体、或根据权利要求41或42所述的核酸。
45.一种用于产生抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括培养如权利要求44所述的宿主细胞并且从细胞培养物中回收该抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其中从细胞培养物回收该抗体包括以下步骤：
a)回收细胞并且过滤该培养物；
b)通过亲和色谱纯化该培养物；
c)通过将pH调整至3.4-3.6将该培养物中的任何病毒灭活，然后将pH再调整至5.8-6.2并且过滤该培养物；
d)通过阳离子交换色谱纯化该培养物并且对该培养物进行柱上还原；
e)对该培养物进行阴离子交换色谱；
f)通过纳米过滤去除病毒；
g)过滤含有该抗体的该培养物；并且
h)获得经纯化的抗体。
47.一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
其中：
该药物部分是DM1、DM3或DM4并且该药物部分经由其硫醇官能团连接至该接头；
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；
(b)将所述接头-药物部分与如权利要求46所述的从该细胞培养物回收的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
48.根据权利要求47所述的方法，该方法包括：
(b)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
并且
(b)将所述接头-药物部分与如权利要求46所述的从该细胞培养物回收的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
49.一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
其中：
该药物部分是DM1、DM3或DM4并且该药物部分经由其硫醇官能团连接至该接头；
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；并且亚烷基是直链或支链的；
(b)将所述接头-药物部分与如权利要求1-14中任一项所述的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
50.一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)预先形成具有以下式的接头-药物部分：
(b)将所述接头-药物部分与如权利要求1-14中任一项所述的抗体缀合以产生抗体药物缀合物；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
51.根据权利要求47或49所述的方法，其中该预先形成所述接头-药物部分的步骤包括：
c)使药物部分经由其硫醇官能团与以下反应：
以形成：
d)使该形成的
与以下反应：
以形成该接头-药物部分：
其中：
L1是C1-6亚烷基，其中亚甲基基团之一可以被氧替代；
L2是C1-6亚烷基或者是-(CH2CH2O)y-CH2-CH2-，其中y是1至11；并且
X是-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；
其中该亚烷基是直链或支链的；并且
RG1和RG2是形成基团X的2个反应性基团。
52.根据权利要求48或50所述的方法，其中该预先形成所述接头-药物部分的步骤包括：
e)使该药物部分经由其硫醇官能团与以下反应：
以形成：
f)使该形成的
与以下反应：
以形成该接头-药物部分：
53.根据权利要求47-52中任一项产生的抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物具有约3至约4的用UV分光光度计测量的平均DAR。
54.一种用于产生抗CCR7抗体药物缀合物的方法，该方法包括：
(a)将SMCC或MPET与药物部分DM-1或DM-4化学连接以形成接头-药物；
(b)将所述接头-药物与如权利要求1-14中任一项所述的抗体缀合；并且
(c)纯化该抗体药物缀合物。
55.根据权利要求54产生的抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物具有约3至约4的用UV分光光度计测量的平均DAR。
56.一种诊断试剂，该诊断试剂包含如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
57.如权利要求56所述的诊断试剂，其中该抗体或其抗原结合片段用放射标记物、荧光团、发色团、成像剂或金属离子标记。
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