CN105188763B - 抗体药物缀合物和相应的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗FGFR2和FGFR4抗体、抗体片段、抗体药物缀合物和它们用于治疗癌症的用途。

Description

抗体药物缀合物和相应的抗体
技术领域
本发明总体上涉及抗FGFR2和FGFR4抗体、抗体片段、抗体药物缀合物和它们治疗癌症的用途。
背景技术
成纤维细胞生长因子受体
通过FGF受体(FGFR)发送信号的成纤维细胞生长因子(FGF)调节基础性发育途径并且在广泛类型的组织中表达。FGF刺激增殖、细胞迁移、分化并且在骨骼和肢体发育，伤口愈合、组织修复、造血、血管生成和肿瘤形成中发挥主要作用(参见，例如，Turner和Crose,Nature Reviews Cancer 10:116–129(2010))。
哺乳动物FGF家族包括许多配体，它们通过四种高度保守的跨膜酪氨酸激酶受体FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4发挥其作用。一种常见FGFR具有一个被切去的信号肽、三个免疫球蛋白(Ig)样结构域(Ig结构域I、II和III)、一个酸性框、一个跨膜结构域和一个分立的酪氨酸激酶结构域(参见，例如，Ullrich和Schlessinger,Cell 61:203(1990)；Johnson和Williams,Adv.Cancer Res.60:1-41(1992))。
另外，转录的受体基因的可变剪接产生多种受体同种型，包括可溶、分泌型FGFR、COOH端结构域截短的FGFR、具有两个或三个Ig样结构域的FGFR，以及因可变剪接第三Ig样结构域而产生的FGFR同种型仅就FGFR1、FGFR2和FGFR3而言出现并且决定第三Ig样结构域的后半部分，产生该受体的IIIb或IIIc同种型。受体的第二和第三Ig样结构域是必需的并足够用于配体结合，其中认为第一Ig样结构域在受体自我抑制过程中发挥作用。因此，不同的受体及其同种型显示不同的配体-结合特异性(参见，例如，Haugsten等人,Mol.CancerRes.8:1439-1452(2010))。
除了与不同FGFR及其剪接变体结合之外，FGF还可以与硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)结合。因而二聚体FGF-FGFR-HSPG三元复合物在细胞表面上形成。该三元复合物通过该复合物中不同组分之间的多重相互作用稳定化。已经在该受体Ig样结构域II和III的内部鉴定到两个FGF结合位点：肝素结合位点和受体-受体相互作用位点。(Haugsten等人,2010)。
FGF与FGFR的结合诱导受体二聚化，这使得激酶结构域的活化环中酪氨酸的转磷酸化成为可能。已经显示活性FGFR使多种胞内蛋白如FRS和PLCγ磷酸化(Eswarakumar等人,Cytokine Growth Factor Rev16:139-149(2005))。FGFR信号传导在不同细胞类型中产生不同生物学反应，范围从刺激细胞增殖和存活到生长停滞、迁移和分化。
FGFR和癌
FGF信号传导介导强力的效应组合：生长/存活、新血管生成和肿瘤细胞迁移方面的自足性。因此，一旦对其生理功能所作出的严密调节作用丧失，则FGF信号传导具有强烈致癌的潜力(参见，例如，Heinzle等人,Expert Opin.Ther.Targets 15(7):829-846(2011))。
FGFR1、FGFR2和FGFR4的基因扩增和/或过量表达已经涉及乳腺癌(Penault-Llorca等人,Int J Cancer 1995；Theillet等人,Genes Chrom.Cancer 1993；Adnane等人,Oncogene 1991；Jaakola等人,Int J Cancer1993；Yamada等人,Neuro Res 2002)。FGFR1和FGFR4的过量表达还与胰腺腺癌和星形细胞瘤相关(Kobrin等人,Cancer Research 1993；Yamanaka等人,Cancer Research 1993；Shah等人,Oncogene 2002；Yamaguchi等人,PNAS1994；Yamada等人,Neuro Res 2002)。前列腺癌还已经与FGFR1过量表达相关(Giri等人,Clin Cancer Res1999)。FGFR4过量表达已经涉及横纹肌肉瘤(Khan等人,Nature Medicine2001，Baird等人,Cancer Res 2005)。一个肺泡横纹肌肉瘤亚类携带产生新融合蛋白的PAX3-FOXO易位，所述的新融合蛋白直接转录性激活FGFR4并导致FGFR4蛋白表达增加(Cao等人,Cancer Res 2010；Davicioni等人,Cancer Res 2006)。
通常，FGFR2和FGFR1更常见地被基因扩增去调节。在胃癌中，扩增的FGFR2基因与不良预后相关(Kunii等人,Cancer Res.68:2340-2348(2008))。FGFR2-IIIb向IIIc转换也可能是膀胱癌和前列腺癌中肿瘤进展、上皮-间充质转变和高侵入性的迹象。在这种情况下的转换将行使抗肿瘤活性的IIIb受体变体替换为促肿瘤生成性IIIc受体(参见，例如，Heinzle等人,2011)。迄今，FGFR2突变已经涉及皮肤癌、子宫内膜癌、卵巢癌和肺癌。FGFR4突变已经涉及横纹肌肉瘤、肺和乳腺癌(参见，例如，Heinzle等人,2011)。
抗体药物缀合物
抗体药物缀合物(“ADs”)已经用于治疗癌症中细胞毒性药物的局部递送(参见例如，Lambert,Curr.Opinion In Pharmacology 5:543-549,2005)。ADC允许定向递送药物部分，其中可以实现最大效力，同时毒性最小。由于更多的ADC显示有前景的临床结果，因此开发新治疗药用于癌疗法的需求增加。
发明简述
本发明提供式Ab—(L—(D)m)n的抗体药物缀合物或其可药用盐，其中Ab是同时与人FGFR2和FGFR4特异性结合的抗体或其抗原结合片段；L是接头；D是药物部分；m是从1至8的整数；并且n是从1至10的整数。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，n是3或4。在一个具体实施方案中，m是1并且n是3或4。
本发明提供与人FGFR2和人FGFR4特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与人FGFR4和人FGFR2的全部同种型特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与人FGFR2上包含SEQ ID NO:137的氨基酸残基176(Lys)和210(Arg)的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:137的氨基酸残基173(Asn)、174(Thr)、175(Val)、176(Lys)、178(Arg)、208(Lys)、209(Val)、210(Arg)、212(gln)、213(His)、217(Ile)和219(Glu)。本发明还提供包含本文所述的抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:136或SEQID NO:141或由其组成的人FGFR2表位特异性结合。本发明还提供包含本文所述的抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
本发明的抗体、抗原结合片段和抗体药物缀合物还与人FGFR4特异性结合。在一些实施方案中，它们与人FGFR4的D1和D2结构域特异性结合。在一些实施方案中，它们与人FGFR4的D1或D2结构域特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与人FGFR4上包含SEQ ID NO:142的氨基酸残基169(Lys)和203(Arg)的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:142的氨基酸残基150(Thr)、151(His)、154(Arg)、157(Lys)、160(His)、166(Asn)、167(Thr)、168(Val)、169(Lys)、171(Arg)、173(Pro)、174(Ala)、201(Arg)、202(Leu)、203(Arg)、204(His)、205(gln)、206(His)、207(Trp)、210(Val)和212(Glu)。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133或由其组成的人FGFR4表位特异性结合。本发明还提供包含本文所述的抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:137的氨基酸残基176(Lys)和210(Arg)的人FGFR2表位和人FGFR4上包含SEQ ID NO:142的氨基酸残基169(Lys)和203(Arg)的表位特异性结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:137的氨基酸160-189和/或SEQ ID NO:137的氨基酸198-216表位特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:142的氨基酸150-174和/或SEQ ID NO:142的氨基酸201-212的表位特异性结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:137的氨基酸160-189和/或SEQ ID NO:137的氨基酸198-216的表位和包含SEQ ID NO:142的氨基酸150-174和/或SEQ ID NO:142的氨基酸201-212的第二表位特异性结合。
在一些实施方案中，本发明提供表1中描述的抗体、其抗原结合片段和包含这类抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区的抗体和抗原结合片段，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:1的VH CDR1、(b)SEQ ID NO:2的VH CDR2和(c)SEQ ID NO:3的VH CDR3，其中CDR根据Kabat定义限定。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:1的VH CDR1、(b)SEQ ID NO:2的VH CDR2，和(c)SEQ ID NO:3的VH CDR3；所述轻链可变区包含：(a)SEQ ID NO:11的VL CDR1，(b)SEQ ID NO:12的VL CDR2，和(c)SEQ IDNO:13的VL CDR3，其中CDR根据Kabat定义限定。本发明还提供包含这类抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的VH区和SEQ ID NO:17的VL区。在一些实施方案中，本文所述的抗体由SEQ ID NO:9的重链和SEQ IDNO:19的轻链组成。本发明还提供包含这类抗体或其抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段是与由SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:19的轻链组成的抗体交叉竞争与人FGFR2和FGFR4结合的抗体或抗原片段。本发明还提供包含这类抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，与由SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:19的轻链组成的抗体相比，本文所述的抗体或抗原结合片段具有增强的ADCC活性。在一些实施方案中，与由SEQID NO:9的重链和SEQ ID NO:19的轻链组成的抗体相比，本文所述的抗体或抗原结合片段不具有增强的ADCC活性。本发明还提供包含这类抗体或抗原结合片段的抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是人或人源化抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体是单克隆人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的抗体或抗原结合片段和药物部分的抗体药物缀合物，其中药物部分经接头与抗体或抗原结合片段连接，并且其中所述接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。在一些实施方案中，接头衍生自选自以下的交联试剂：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CX1-1)。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗体或抗原结合片段和药物部分的抗体药物缀合物，其中所述药物部分选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。在一个具体实施方案中，本发明抗体药物缀合物的药物部分是类美登素(maytansinoid)。在另一个具体实施方案中，本发明抗体药物缀合物的药物部分是N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-l-氧代丙基)-美坦辛(DM)或N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM)。
在一个实施方案中，本发明提供具有以下式的抗体药物缀合物：
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2、SEQ ID NO:3的重链CDR3以及SEQ ID NO:11的轻链CDR1、SEQ ID NO:12的轻链CDR2、SEQ ID NO:13的轻链CDR3，其中CDR根据Kabat定义限定；并且n是1至10；或其可药用盐。在一个具体实施方案，n是3或4。在一个实施方案中，Ab是包含SEQ ID NO:7的VH区和SEQ ID NO:17的VL区的抗体。在另一个实施方案中，Ab是由SEQ IDNO:9的重链和SEQ ID NO:19的轻链组成的抗体。
本发明还提供包含本文所述的抗体药物缀合物和可药用载体的药物组合物。在一些实施方案中，将本发明的药物组合物作为冷冻干燥物制备。在一些实施方案中，冷冻干燥物包含本文所述的抗体药物缀合物、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20。
本发明提供治疗有需要的患者中FGFR2阳性或FGFR4阳性癌的方法，所述方法包括向所述患者施用本文所述的抗体药物缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，癌选自胃癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、肾上腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌和子宫内膜癌。在某些实施方案中，癌症选自肺泡横纹肌肉瘤和胚胎横纹肌肉瘤。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法还包括向所述患者施用酪氨酸激酶抑制剂、IAP抑制、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂或另一种FGF2抑制剂。在一个具体实施方案中，该治疗方法包括向有需要的患者施用与3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1甲基-脲或其可药用盐(例如其磷酸盐)组合的本文所述的抗体药物缀合物。在某些方面本发明还提供治疗抵抗其他酪氨酸激酶抑制剂的癌的方法，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
本发明还提供本文所述的抗体药物缀合物用作药物。本发明提供抗体药物缀合物或药物组合物用于治疗FGFR2阳性或FGFR4阳性癌。本发明提供抗体药物缀合物或药物组合物用于治疗抗性癌，例如，抵抗其他酪氨酸激酶抑制剂的癌，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段是单链抗体(scFv)。
本发明还提供编码本文所述的抗体或抗原结合片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供编码抗体或抗原结合片段(如表1中描述的那些)的核酸。本发明还提供包含本文所述的核酸的载体和包含这类载体的宿主细胞。
本发明提供用于产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培育本文所述的宿主细胞并从培养物回收抗体。
在一个实施方案中，本发明提供用于产生抗FGFR2和FGFR4抗体药物缀合物的方法，所述方法包括：(a)化学地将SMCC与药物部分DM-1连接；(b)使所述接头-药物与从细胞培养物回收的抗体缀合；和(c)纯化抗体药物缀合物。在一些实施方案中，根据该方法产生的抗体药物缀合物具有用UV分光光度计测量的约3.5的平均DAR。
本发明还提供诊断试剂，其包含标记的本文所述的抗体或抗原结合片段或本文所述的抗体药物缀合物。在一些实施方案中，标记物选自放射标记物、荧光团、生色团、成像剂和金属离子。
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
术语“烷基”指具有指定碳原子数目的单价饱和烃链。例如，C1-6烷基指具有1个至6个碳原子的烷基。烷基可以是直链或支链的。代表性支链烷基具有一个、两个或三个分支。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基、和叔-丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)和己基。
如本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽，所述多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的四聚体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定域由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补性决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基端至羧基端排列的3个CDR和4个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补系统的第一组分(C1q))结合。
术语“抗体”包括，但不限于，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
“互补性决定结构域”或“互补决定区(“CDR”)可互换地指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，其携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15-20％的可变结构域。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余片段(所谓的构架区)显示出较小的氨基酸序列变异性(Kuby,Immunology,第4版,第4章,W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。
CDR和构架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定，例如，Kabat、Chothia、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)、和AbM(参见，例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268–9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121–153(1991)；和Rees等人,引自Sternberg M.J.E.(编著),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141–172(1996)。
轻链和重链均分成具有结构同源性和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”以功能方式使用。在这个方面，将可以理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物学特性如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合作用等。按常规，恒定区结构域的编号随着它们变得距抗体的抗原结合位点或氨基端更远而增加。N端是可变区并且在C端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端结构域。
如本文所用，术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。结合片段的例子包括但不限于单链Fvs(scFv)、骆驼抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；由VH域组成的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。
另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等人,Science242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988。术语“抗原结合片段”也意在涵盖这类单链抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗原结合片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。
也可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单体抗体)。
可以将抗原结合片段掺入单链分子中，其中所述单链分子包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,ProteinEng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本上相同的氨基酸序列或从相同遗传源衍生的多肽，包括抗体和抗原结合片段等。这个术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制备物。一种单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中构架和CDR区均从人源序列衍生。另外，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这类人序列，例如，人种系序列、或者突变形式的人种系序列或含有从人构架序列分析导出的共有构架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述。
本发明的人抗体可以包括人序列不编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变，或促进稳定性或制造的保守性取代)。
如本文所用的术语“亲和力”指抗体和抗原之间在单一抗原性位点处相互作用的强度。在每个抗原位点内部、抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
因此，术语“分离的抗体”指一种抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，与一种抗原特异性结合的分离抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。另外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“相应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，其中与人种系免疫球蛋白可变区序列编码的其他全部其他已知可变区氨基酸序列相比，所述人可变区氨基酸序列或子序列与参比可变区氨基酸序列或子序列共有确定的最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参比可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是构架区、仅是互补决定区、是构架区和互补性决定区、可变区段(如上文定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列，确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参比可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。可以例如通过可公开获得的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(万维网上以下网址：imgt.cines.fr/)和V-碱基(万维网上以下网址：vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)，确定相应的人种系序列。
在描述抗原(例如，蛋白质)和抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”指确定抗原在蛋白质异质群体和其他生物制品中例如在生物样品(例如，血液、血清、血浆或组织样品)中存在的结合反应。因此，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少两倍于背景并且所述抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在一个实施方案中，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少10倍于背景并且所述抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在这类条件下与抗体或结合剂特异性结合可能需要抗体或结合剂已经就其针对选择特定蛋白质的特异性被选择。根据需要或适宜的，可以通过扣除与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体，实现这种选择。备选地，在一些实施方案，选择与某些所需分子交叉反应的抗体或抗体片段。
在描述表位和抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境下使用时，术语“特异性结合”指找到其表位并与之相互作用(例如：结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是线性的还是构象的。术语“表位”指抗原上与本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的第三折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因第三折叠形成的表位一般用变性溶剂处理时丧失。表位一般包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象构象的方法包括本领域中的技术，例如，X射线结晶学和2-二维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris编著(1996))。
多种免疫测定法可以用来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规地用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。一般，特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更一般高于背景至少10至100倍的信号
术语“平衡解离常数(KD(M)”指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域的任何已知方法，测量平衡解离常数。本发明的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些实施方案中，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”指施用至患者的药物的给定量的全身性利用率(即，血液/血浆水平)。生物利用率是一个绝对术语，其表示从所施用剂量形式到达总循环的药物时间(速率)和总量(程度)的度量。
如本文所用，短语“基本上由……组成”指方法或组合物中所包含的活性药用物质以及对该方法或组合物的预期目的而言无活性任何赋形剂的类属或物种。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本发明的抗体药物缀合物之外的一种或多种额外活性物质。在一些实施方案中，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本发明的抗体药物缀合物和第二共同施用的物质之外的一种或多种额外活性物质。
术语“氨基酸”指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后经修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。
术语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列，保守性修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任何给出的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因而，在其中丙氨酸由某个密码子指定的每个位置，可以将该密码子变成任一个所述的相应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默性变异”，它们是一个种类的保守性修饰变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每种可能沉默变异。技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(例外是AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默性变异内含于每个描述的序列中。
对于多肽序列，“保守性修饰的变体”包括对多肽序列的各个取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性取代表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排除它们。以下8个组含有彼此互为保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守性序列修饰”用来指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用的术语“优化的”指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列经工程化以完全或尽可能保留由起始核苷酸序列最初编码的起始氨基酸序列，也称作“亲本”序列。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，术语“相同百分数”或“同一性百分数”指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在正在比较的区域范围内具有相同的氨基酸序列或核苷酸序列，则它们是“相同的”。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于具有至少约30个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域内，或更优选地存在于具有100个至500个或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)长度的区域内。
对于序列比较，一般地一个序列充当检验序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，根据需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。
如本文所用，“比较窗口”包括涉及一段任意的连续位置数，所述的连续位置数选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中一个序列可以与具有相同连续位置数的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(见，例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology，2003)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法涉及首先通过查询序列中长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，其中所述短字与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配或满足某些正值阈评分T。将T称作相邻字评分阈值(Altschul等人，上文)。这些初始相邻字命中充当种子用于启动检索以找到含有这些种子的更长HSP。所述字命中在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可以提高累积比对评分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的报酬评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在以下情况时停止：累积比对评分从其最大实现值跌落达量X；累积评分因积累一个或更多负评分残基比对而达到或低于零；或抵达两个序列中任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915)、比对(B)50、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配会因偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则将认为核酸相似于参考序列。
还可以使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
除上文所示的序列同一性的百分数之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫杂交反应，如下文描述。因此，在两种肽仅因保守性取代而不同的情况下，一个多肽一般与第二多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指标是这两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两个核酸序列基本上相同的又一个指标是相同的引物可以用来扩增该序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用并且指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链形式或双链形式的聚合物。本术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰型主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似参考核苷酸的方式代谢。这类类似物的例子包括而不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，实现简并密码子取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
术语“有效连接”在核酸的语境下指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。一般，它指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列有效连接。通常，与已转录的序列有效连接的启动子转录调节序列物理地与已转录的序列连续，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要物理上与它们增强其转录的编码序列连续或与之紧邻。
术语“多肽”和“蛋白质”在此互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，特定多肽序列还内在包括其保守性修饰的变体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”或“缀合物”指抗体或其抗原结合片段与另一种药物如化疗药、毒素、免疫治疗剂、成像探针等连接。该连接可以是共价键或非共价相互作用，如借助静电力。可以使用本领域已知的多种接头以形成免疫缀合物。额外地，可以将免疫缀合物以可以是从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”指通过连接最初编码分离的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。
术语“盐”或“盐类”指一种化合物(例如，作为与本发明抗体药物缀合物组合施用的另一种治疗药的化合物)的酸加成盐或碱加成盐。“盐”包括尤其“可药用盐”。术语“可药用盐”指保留化合物的生物学作用和特性并且一般不是生物学或其它方面不利的盐。在许多情况下，化合物能够因存在氨基和/或羧基或与之类似的基团而形成酸盐和/或碱盐。
术语“对象”包括人类和非人类动物。术语“非人其动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人的灵长类、绵羊、犬、牛、鸡、两栖类和爬行类。除非指出时，否则术语“患者”或“对象”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何物质。
如本文所用，术语“抗癌剂”指可以用来治疗细胞增殖性疾病如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放疗法和放疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
如本文所用，术语“药物部分”或“有效载荷”指与本发明的抗体或抗原结合片段缀合的化学部分，并且可以包括任何治疗剂或诊断剂，例如，抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病剂药)或麻醉剂。例如，药物部分可以是抗癌药，如细胞毒素。在某些实施方案中，药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。用于将这些药物中每种药物连接至与本发明抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。参见，例如，Singh等人,(2009)TherapeuticAntibodies:Methods and Protocols,第525卷,445-457。此外，有效载荷可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记物、红外探针、亲和力探针、螯合剂、分光探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记物，DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖。
术语“类美登素(maytansinoid)药物部分”意指具有类美登素化合物结构的抗体-药物缀合物的亚结构。美坦辛首次从非洲灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。已经报道合成性美登醇和美登醇类似物。参见美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663和4,371,533，和Kawai等人(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451)，所述文献各自明确地通过引用的方式并入。可用于缀合的具体类美登素的例子包括DM1、DM3和DM4。
“肿瘤”指肿瘤细胞生长和增殖，无论为恶性或良性，以及全部癌前和癌性细胞及组织。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞的增殖速率、存活力或转移活性的降低。例如，抗肿瘤活性可以由治疗期间出现的异常细胞的生长速率减少或肿瘤尺寸稳定或缩减或与在无治疗情况下对照相比因治疗所致的存活期更长显示。这种活性可使用公认的体外或体内肿瘤模型评估，包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域公知的用于研究抗肿瘤活性的其他已知模型。
术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”包括以失调节或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞已经不迁移至对象身体中除原始肿瘤部位之外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。
术语“FGFR2”指作为受体酪氨酸激酶超家族成员的成纤维细胞生长因子受体2。FGFR2的核酸序列和氨基酸序列是已知的，并且已经以Genbank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2公开。结构上，FGFR2氨基酸序列是一种受体酪氨酸激酶蛋白质，其具有一个被切去的信号肽、至少一个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域、一个酸性框、一个跨膜结构域和一个分立的抗原酪氨酸激酶结构域并在其全长范围内与GenBank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。结构上，FGFR2核酸序列在其全长范围内与GenBank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
术语“FGFR4”指作为受体酪氨酸激酶超家族成员的成纤维细胞生长因子受体4。FGFR4的核酸序列和氨基酸序列是已知的，并且已经以Genbank登录号NM_002011.3、NM_022963.2、NM_213647.1公开。结构上，FGFR4氨基酸序列是一种受体酪氨酸激酶蛋白质，其具有一个被切去的信号肽、三个免疫球蛋白(Ig)样结构域、一个酸性框、一个跨膜结构域和一个分立的抗原酪氨酸激酶结构域并在其全长范围内与NM_002011.3、NM_022963.2、NM_213647.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。结构上，FGFR4核酸序列在其全长范围内与GenBank登录号NM_002011.3、NM_022963.2、NM_213647.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
术语“FGFR2/4”在本文中用来指FGFR2和FGFR4。例如，结合FGFR2/4的抗体指结合FGFR2和FGFR4的抗体。
术语“表达FGFR2的癌”或“FGFR2阳性癌”指在癌细胞表面上表达FGFR2或FGFR2突变形式的癌。术语“表达FGFR4的癌”或“FGFR4阳性癌”指在癌细胞表面上表达FGFR4或FGFR4突变形式的癌。
术语“酪氨酸激酶抗性癌”或“酪氨酸激酶抗性肿瘤”指(1)一开始就不响应于医护酪氨酸激酶治疗标准并称作“从头抗性”的癌或肿瘤；或(2)起初响应于医护酪氨酸激酶治疗标准并且此后进展如通过老病灶和/或新病灶复现或扩展确定的癌或肿瘤，这又称作“继发抗性”或“复发癌”。
术语“抗Her2的癌”或“抗Her2的肿瘤”指(1)一开始就不响应于医护Her2治疗标准并称作“从头抗性”的癌或肿瘤；或(2)起初响应于医护Her2治疗标准并且此后进展如通过老病灶和/或新病灶复现或扩展确定的癌或肿瘤，这又称作“继发抗性”或“复发癌”。
如本文所用，术语对任何疾病或病症的“治疗”或“治疗”在一个实施方案中指改善该疾病或病症(即，延缓或停滞或减少疾病或其至少一个临床症状的形成)。在另一个实施方案中，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指缓和或改善至少一个身体参数，包括患者可能不可察觉的那些身体参数。在又一个实施方案中，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指在身体上(例如，稳定可察觉症状)、生理上(例如，稳定身体参数)或这两方面或生理上调节疾病或病症。在又一个实施方案中，“治疗”、“治疗着”或“治疗”指延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所需结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些实施方案中，治疗可接受量不诱导或不造成不利副作用。在一些实施方案中，治疗可接受的量诱导或造成副作用，但仅是由医疗服务提供者就患者的病况而言可接受的那些。可以通过首先施用低剂量并且随后递增增加该剂量直至实现所需效果，确定治疗可接受量。本发明的分子的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状发作或导致疾病症状的严重程度下降，所述疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“共同施用”指个体的血液中存在两种活性剂。共同施用的活性剂可以同时或依次递送。
附图简述
图1显示一组抗体对重组人FGFR2IIIb的亲和力估计值。
图2(A)-(B)显示抗FGFR抗体在Baf-FGFR2受体系统中的充当激动剂的能力。
图3(A)-(B)显示抗FGFR抗体在Baf-FGFR2受体系统中的充当拮抗剂的能力。
图4(A)-(B)显示抗FGFR2-和抗FGFR2/4-MCC-DM1ADC在SNU16肿瘤异体移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性；(C)显示12433抗体作为与SMCC-DM1和SPDB-DM4接头-有效负载缀合的ADC的抗肿瘤活性；(D)–(E)显示抗FGFR2-和抗FGFR2/4-MCC-DM1ADC的药代动力学特性；(F)显示对于一组抗FGFR2-和抗FGFR2/4-MCC-DM1ADC的针对ADC清除过程的抗肿瘤活性。
图5(A)-(C)是显示抗FGFR抗体或ADC在2小时后(A)、2-72小时(B)的FGFR2扩增的细胞系SNU16中或在Kato-III细胞(C)中调节FGFR信号传导和总受体表达的能力的蛋白质印迹。
图6(A)-(D)显示12425-MCC-DM1相对IgG和游离有效负载对照而言抑制SNU-16(A)、Kato-III(B)或NUGC3(C)细胞增殖的能力；(D)显示未缀合的抗体12425没有任何可评估的抗增殖作用。
图7(A)-(B)是用12425-MCC-DM1处理后SNU-16(A)或NUGC3(B)肿瘤异体移植物的图像，所述图像显示pHH3和切割的胱天蛋白酶3表达的评定。
图8(A)-(F)显示抗FGFR2-和/或抗FGFR2/4-MCC-DM1ADC在NCI-H716(A)、MFM223(B)、人原发性胃肿瘤异体移植物(CHGA-010)(C)、人原发性肺肿瘤异体移植物模型(HLUX1228)(D)、人原发性乳腺癌异体移植物模型(E)和人原发性乳腺导管癌异体移植物模型(F)中的抗肿瘤活性。
图9显示单独和与FGFR酪氨酸激酶抑制剂BGJ398组合的抗FGFR2/4ADC(12425-MCC-DM1)在CHGA-119肿瘤异体移植物模型中的抗肿瘤活性。
图10显示抗FGFR2/4ADC(12425-MCC-DM1)按不同剂量和方案在SNU-16肿瘤异体移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性。
图11(A)-(C)显示对抗FGFR2抗体在Kato III细胞中体外诱导ADCC(A)、与C1q结合(B)、在Kato III细胞中诱导CDC(C)的能力的评定。(D)显示耗尽ADCC的变体作为未缀合抗体或MCC-DM1缀合的ADC在体内的作用。
图12(A)-(B)是显示抗FGFR抗体或ADC在2小时后(A)或经过某个时间过程(B)在表达FGFR4的细胞系MDA-MB453中调节FGFR信号传导和总受体表达的能力的蛋白质印迹。
图13(A)-(D)显示FGFR2或FGFR2/4抗体(未缀合或作为MCC-DM1ADC)抑制MDA-MB453(A)、RH4(B)、JR细胞(C)或一组癌细胞系(D)增殖的能力。
图14(A)-(C)是用12425-MCC-DM1处理后MDA-MB453((A)和(B))或RH4(C)肿瘤异体移植物的图像，这些图像显示pHH3和/或切割的胱天蛋白酶3表达的评定结果。
图15(A)-(B)显示抗FGFR2-和抗FGFR2/4-MCC-DM1ADC在MDA-MB453(A)、RH4(B)肿瘤异体移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性。
图16(A)-(D)显示12425-MCC-DM1在小鼠((A)-(B))、大鼠(C)或食蟹猴(D)中的PK谱。
图17(A)-(B)显示12425(20562-MCC-DM1)的工程化变体抑制SNU-16细胞体外(A)和体内(B)增殖的能力。
图18(A)-(B)显示10164(20809-MCC-DM1)和12425(20811-MCC-DM1)的亲和力成熟变体抑制SNU-16细胞体外(A)和体内(B)增殖的能力。
图19显示FGFR2的氘交换实验结果。(A)显示FGFR2在不存在(对照)和存在六种治疗性mAb情况下的绝对氘摄取量。条的高度是三次测量的平均数并且误差条是一个标准偏差；(B)显示除以测量中标准误的结合mAb的FGFR2和对照FGFR2之间的氘摄取量差异；(C)显示定位到FGFR2IIIc:FGFR2晶体结构(PDB ID:1EV2)上的mAb与FGFR2结合时高度保护的区域；和(D)显示定位到FGFR2IIIb:FGFR1晶体结构(PDB ID:3OJM)上的mAb与FGFR2结合时高度保护的区域
图20显示来自X射线结晶学表位定位研究的结果。(A)显示与FGFR2结合的12425Fab的总体结构(左小图)和标记出表位残基的FGFR2上详解相互作用表面(右小图)；(B)显示与FGFR4结合的12425 Fab的总体结构(左小图)和标记出表位残基的FGFR4上详解相互作用表面(右小图)；并且(C)显示人FGFR2和FGFR4在D2结构域中的序列比对结果。完全保守的残基以深灰色加阴影显示，部分保守的残基以浅灰色加阴影显示。划虚线的框是与12425Fab接触的FGFR2残基，连同FGFR4中其对齐的对应物。
图21显示比较SNU 16细胞和BGJ398抗性SNU 16细胞对BGJ398或吉非替尼(IC50＝16.7nM)的体外敏感性的增殖步幅(proliferation stides)结果。
发明详述
本发明提供同时与FGFR2和FGFR4(“FGFR2/4”)结合的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物。特别地，本发明提供与FGFR2/4结合并一旦结合则内化的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。本发明的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)可以用于产生抗体药物缀合物。另外，本发明提供抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物具有合乎需要的药代动力学特征和其他所需属性，并且因此可以用于治疗表达FGFR2和/或FGFR4的癌，如胃癌，乳腺癌、横纹肌肉瘤(例如：肺泡的横纹肌肉瘤或胚胎横纹肌肉瘤)、肝癌、肾上腺癌、肺癌、结肠癌和子宫内膜癌。本发明还提供包含本发明抗体药物缀合物的药物组合物，以及制造这类药物组合物及使用它们治疗癌症的方法。
抗体药物缀合物
本发明提供抗体药物缀合物，其中与FGFR2/4特异性结合的抗体、抗原结合片段或其功能等价物与药物部分连接。在一个方面，通过接头借助共价连接，本发明的抗体、抗原结合片段或它们的功能等价物连接至作为抗癌剂的药物部分。本发明的抗体药物缀合物可以选择性地递送有效剂量的抗癌剂(例如，细胞毒性剂)至表达FGFR2和/或FGFR4的肿瘤组织，因而可以实现更大的选择性(和较低的有效剂量)。
在一个方面，本发明提供式(I)的免疫缀合物：
Ab—(L—(D)m)n
其中Ab表示本文所述的结合FGFR2/4的抗体；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1-20的整数。在一个实施方案，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施方案中，n是2、3或4。在一些实施方案中，m是1。在其它实施方案中，m是2、3或4。
尽管对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率特定具有确切的值(例如，在式(I)中n乘以m)，但是可以理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，原因在于一般与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。免疫缀合物样品的平均载量在本文中称作药物对抗体比率或“DAR”。在一些实施方案中，当药物是类美登素时，将它称作“MAR”。在一些实施方案中，DAR在约1和约5之间，并且一般是约3、3.5、4、4.5或5。在一些实施方案中，以重量计至少50％的样品是化合物，具有加或减2的平均DAR，并且优选地至少50％的样品是含有平均DAR加或减1的缀合物。优选的实施方案包括其中DAR是约3.5的免疫缀合物。在一些实施方案中，‘约n’的DAR意指DAR的测量值在n的20％内。
本发明还涉及包含与药物部分连接或缀合的如本文中公开的抗体，抗体片段(例如，抗原结合片段)及其功能等价物物的免疫缀合物。在一个实施方案中，药物部分D是类美登素药物部分，所述类美登素药物部分包括具有以下结构的那些：
其中波浪线表示类美登素的硫原子与抗体药物缀合物的接头共价连接。R在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基。使酰胺基团与硫原子连接的亚烷基链可以是亚甲基、亚乙基或丙基，即，m是1、2或3。(美国专利号633,410、美国专利号5,208,020，Chari等人,(1992)Cancer Res.52；127-131，Lui等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:8618-8623)。
对于本发明的免疫缀合物，构思类美登素药物部分的全部立体异构体，即在类美登素的手性碳处R构型和S构型的任何组合。在一个实施方案中，类美登素药物部分具有以下立体化学。
在一个实施方案中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(也称作DM1)。DM1由以下结构式代表。
在另一个实施方案中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美坦辛(也称作DM3)。DM3由以下结构式代表。
在另一个实施方案中，类美登素药物部分是N2’-去乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美坦辛(也称作DM4)。DM4由以下结构式代表。
药物部分D可以通过接头L与抗体Ab连接。L是能够通过共价键使药物部分与抗体连接的任何化学部分。交联试剂是可以用来连接药物部分和抗体以形成抗体药物缀合物的双官能或多官能试剂。可以使用具有能够与药物部分和抗体结合的反应性官能团的交联试剂，制备抗体药物缀合物。例如，半胱氨酸、硫醇或胺，例如抗体的N末端或氨基酸侧链如赖氨酸，可以与交联试剂的官能基团形成键。
在一个实施方案中，L是可切割接头。在另一个实施方案中，L是不可切割接头。在一些实施方案中，L是酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶可切割接头、酯酶可切割接头、二硫键可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头或基于二羧酸的接头。
在药物部分(例如类美登素)和抗体之间形成不可切割接头的合适性交联试剂是本领域熟知的并且可以形成包含硫原子(如SMCC)的不可切割接头或无硫原子的那些不可切割接头。在药物部分(例如类美登素)和抗体之间形成不可切割接头的优选交联试剂包含基于马来酰亚胺或基于卤代乙酰基的部分。根据本发明，将这类不可切割接头描述为衍生自基于马来酰亚胺或基于卤代乙酰基的部分。
包含基于马来酰亚胺的部分的交联试剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(其是SMCC(LC-SMCC)的“长链”类似物)、κ-马来酰亚胺十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMSA)、琥珀酰亚胺基-6-(-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(-p-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMIP)和含有聚乙二醇间隔基的基于马来酰亚胺的交联试剂，如MAL-PEG-NHS。这些交联试剂形成从基于马来酰亚胺的部分衍生的不可切割接头。下文显示基于马来酰亚胺的交联试剂的代表性结构。
在另一个实施方案中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)或MAL-PEG-NHS。
包含基于卤代乙酰基的部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酸基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。这些交联试剂形成从基于卤代乙酰基的部分衍生的不可切割接头。下文显示基于卤代乙酰基的交联试剂的代表性结构。
或
在一个实施方案中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酸基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。
在药物部分(例如类美登素)和抗体之间形成可切割接头的合适交联试剂是本领域熟知的。含有二硫键的接头是通过可以在生理条件下发生二硫键交换的可切割的接头。根据本发明，将这类可切割接头描述为衍生自基于二硫键的部分。合适的二硫键交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)，下文显示其结构。这些二硫键交联试剂形成从基于二硫键的部分衍生的可切割接头。
N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和
N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
在一个实施方案中，接头L衍生自N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)。
在药物部分(例如类美登素)和抗体之间形成带电荷的接头的合适交联试剂称作预先带电荷的交联试剂。在一个实施方案中，从预先带电荷的交联试剂CX1-1衍生接头L。CX1-1的结构如下。
2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)
上述的每种交联试剂在交联试剂的一个末端处含有与抗体的伯胺反应以形成酰胺键的NHS-酯并且在另一端处含有与类美登素药物部分的硫氢基反应以形成硫醚或二硫键的马来酰亚胺基或吡啶基二硫化物基团。
在一个实施方案中，本发明的缀合物由以下任一个结构式代表：
其中：
Ab是与人FGFR2和FGFR4同时特异性结合的抗体或其抗原结合片段；
n，表示通过与Ab的伯胺形成酰胺键与D-L基团连接的数目，是从1至20的整数。在一个方面，n是从1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体实施方案中，n是3或4。
在一个实施方案中，缀合物中药物(例如，DM1或DM4)对抗体的平均摩尔比(即，平均n值，也称作类美登素对抗体比率(MAR))是约1至约10、约2至约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1)、约2.5至约7、约3至约5、约2.5至约4.5(例如、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5)、约3.0至约4.0、约3.2至约4.2，或约4.5至5.5(例如,约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5)。
在本发明的一个方面，本发明的缀合物具有实质高的纯度并具有以下一种或多种特征：(a)大于约90％(例如，大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，优选地大于约95％的缀合物种类是单体，(b)缀合物制品中的未缀合接头水平小于约10％(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)(相对于总接头)，(c)小于10的缀合物种类是交联的(例如，小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)，(d)缀合物制品中的游离药物(例如，DM1或DM4)水平小于约2％(例如，小于或等于约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％)(mol/mol相对总细胞毒性剂)，和/或(e)储存时(例如，在约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后)，游离药物(例如，DM1或DM4)水平未出现实质性增加。游离药物(例如，DM1或DM4)的水平“实质性增加”意指在某段储存时间(例如，约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年)后，游离药物(例如，DM1或DM4)水平增加小于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.2％、约2.5％、约2.7％、约3.0％、约3.2％、约3.5％、约3.7％或约4.0％。
如本文所用，术语“未缀合的接头”指与从交联试剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)衍生的接头共价连接的抗体，其中抗体不通过接头共价偶联于药物(例如，DM1或DM4)(即，“未缀合的接头”可以由Ab-MCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1代表)。
1.药物部分
本发明提供与FGFR2/4特异性结合的免疫缀合物。本发明的免疫缀合物包含与药物部分，例如抗癌剂、自身免疫治疗剂、抗炎性剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或麻醉剂缀合的抗FGFR2/4抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物。可以使用本领域已知的任何方法，将本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物与几个相同或不同的药物部分缀合。
在某些实施方案中，本发明的免疫缀合物的药物部分选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTOR抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物的药物部分是类美登素药物部分，如但不限于DM1、DM3或DM4。
进一步，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物可以与调节给定生物学反应的药物部分缀合。药物部分不得解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素、蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活物、细胞因子、凋亡物质、抗血管生成物质、或生物学反应调节物，例如淋巴因子。
在一个实施方案中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物与药物部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的例子包括但不限于紫杉烷(参见例如，国际(PCT)专利号申请号WO 01/38318和PCT/US03/02675)、DNA-烷基化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂(参见例如，Sasse等人,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)、Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)、Ichimura等人,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991)、Francisco等人,Blood(2003)(出版公开前的电子公开)、美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、待决美国专利申请系列号10/024,290和10/116,053和国际(PCT)专利号申请号WO 01/49698)、紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如，氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环类(例如，佐柔比星(以前称作柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称作放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂药(例如，长春新碱和长春碱)。(参见例如，Seattle Genetics US20090304721)。
可以与本发明的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等价物缀合的细胞毒素的其他例子包括多卡米星、刺孢霉素、美坦辛和澳瑞司他汀及其衍生物。
多种类型的细胞毒素、接头和用于使治疗药与抗体缀合的方法是本领域已知的，参见，例如，Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括，但不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的例子是可商业获得的，包括(DEC Pharmaceuticals)和(Corixa Pharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来使用本发明的抗体制备放射免疫缀合物。在某些实施方案中，大环螯合剂是可以经接头分子与抗体连接的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)。这类接头分子是本领域共知的并且在Denardo等人(1998)Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物还可以与异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合以产生融合蛋白。特别地，本发明提供融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白、多肽或肽。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组技术(统称为“DNA改组”)产生额外的融合蛋白。DNA改组可以用来改变本发明的抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,(1997),Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,(1998),Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物的每篇因而通过引用方式完整地并入)。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法经历随机诱变，改变抗体或其片段或编码的抗体或其片段。编码与抗原特异性结合的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
另外，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物可以与标记序列如肽缀合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标签，可商业获得其中许多标记。如Gentz等人,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的便利纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell 37:767)，和“”标签(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods 49:455–465,2001)。根据本发明，抗体或抗原结合片段也可以与渗透肿瘤的肽缀合以提高它们的效力。
在其他实施方案中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物与诊断物质或可检测物质缀合。这类免疫缀合物可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的功效)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。这类诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来完成，所述可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于、萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物也可以与特别可用于靶抗原的免疫测定法或纯化的固相支持体连接。这类固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
2.接头
如本文所用，“接头”是能够使抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等价物与另一个部分如药物部分连接的任何化学部分。在一些情况下，接头的部分由类美登素提供。例如，DM1，一种含硫醇的类美登素，是天然类美登素的衍生物，并且提供接头的部分。在美坦辛C-3羟基处的侧链以CO-CH3结尾，DM1的侧链以CO-CH2-CH2-SH结尾。因此，最终接头装配自两个小片：引入抗体中的交联试剂和来自DM1的侧链。接头可以在化合物或抗体仍保持活性的条件易于切割(可切割接头)，如，酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。备选地，接头可以基本上抵抗切割(例如，稳定接头或不可切割接头)。在一些方面，接头是预先带电荷的接头、亲水接头或基于二羧酸的接头。
不可切割接头是能够使药物如类美登素与抗体以稳定、共价方式连接并且不脱离上文对可切割接头所列分类的任何化学部分。因此、不可切割接头基本上抵抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键裂解。另外，不可切割指接头中或毗邻接头的化学键在药物如类美登素或抗体不丧失其活性的条件经受住酸、光不稳定性切割剂、肽酶、酯酶或切割二硫键的化学或生理学化合物诱导的切割作用的能力。
含有二硫键的接头是通过可以在生理条件下发生的二硫键交换可切割的接头。酸不稳定接头是在酸性pH可切割的接头。例如，某些胞内区室如内体和溶酶体具有酸性pH(pH4-5)，并且提供合适切割酸不稳定接头的条件。
光不稳定接头是在体表在光可抵达的许多体腔中可用的接头。另外，红外光可以穿透组织。
一些接头可以被肽酶切割，即肽酶可切割接头。仅某些肽轻易地在细胞内部或外部被切割，参见例如Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人,43Int.J.Cancer,677-684(1989)。另外，肽由α-氨基酸和肽键组成，所述肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根和第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键。将其他酰胺键，如赖氨酸的羧酸根和ε-氨基之间的键，理解为不是肽键并且视为不可切割的。
一些接头可以被酯酶切割，即酯酶可切割接头。再次，仅某些酯可以被细胞内部或外部存在的酯酶切割。酯由羧酸和醇的缩合形成。简单酯是以简单醇如脂族醇和小环状醇和小芳族醇产生的酯。
预先带电荷的接头衍生自带电荷交联试剂，所述带电荷交联试剂在掺入抗体药物缀合物后保持其电荷。预先带电荷的接头的例子可以在US2009/0274713中找到。
在一个方面，本发明所用的接头衍生自交联试剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。在另一个方面，本发明所用的接头衍生自交联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)或2,5-二氧吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
3.ADC的缀合和制备
本发明的缀合物可以通过本领域已知的任何方法(如在美国专利号7,811,572、6,411,163、7,368,565和8,163,888，以及美国申请公开2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100中描述的那些方法)制备。这些专利和专利申请公开的完整教导通过引用方式并入本文。
单步骤法
在一个实施方案中，本发明的缀合物可以通过单步骤法制备。该方法包括在合适的pH将抗体、药物和交联剂在基本上水性的介质中合并，所述介质任选地含有一种或多种共溶剂。在一个实施方案中，该方法包括步骤：在具有pH约4至约9的溶液中使本发明的抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物的第一混合物，并且随后使包含抗体和药物的第一混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以提供包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)和(iii)反应副产物的混合物。
在一个实施方案中，单步骤法包括在具有约6或更大(例如、约6至约9、约6至约7、约7至约9、约7至约8.5、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约8.0至约9.0，或约8.5至约9.0)pH的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，本发明的方法包括使细胞结合剂在具有pH约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的溶液中与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在特定的实施方案中，本发明的方法包括在具有pH约7.8(例如，pH 7.6至8.0或pH 7.7至7.9)的溶液中使细胞结合剂与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
单步骤法(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1接触)可以在本领域已知的任何合适温度实施。例如，单步骤法可以在约20℃或更低温度(例如，约-10℃(前提是防止溶液冻结，例如，因存在用来溶解细胞毒性剂和双官能交联试剂的有机溶剂防止溶液冻结)至约20℃、约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)，或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)进行。在一个实施方案中，单步骤法在约16℃至约24℃(例如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)的温度进行。在另一个实施方案中，单步骤法在约15℃或更低(例如，约-10℃至约15℃或约0℃至约15℃)的温度实施。例如，该方法包括在约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、约-1℃、约-2℃、约-3℃、约-4℃、约-5℃、约-6℃、约-7℃、约-8℃、约-9℃或约-10℃的温度使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，前提是防止溶液冻结，例如，通过存在用来溶解交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、磺基-SPDB、SPDB或CX1-1)的有机溶剂防止溶液冻结。在一个实施方案中，该方法包括在约-10℃至约15℃、约0℃至约15℃、约0℃至约10℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约10℃至约15℃或约5℃至约10℃的温度使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。在另一个实施方案中，该方法包括在约10℃的温度(例如，8℃至12℃的温度或9℃至11℃的温度)使抗体与药物(例如，DM1或DM4)并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在一个实施方案中，通过以下方式实现上述的接触：提供抗体，随后使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的第一混合物，并且随后使包含抗体和药物的第一混合物(例如，DM1或DM4)与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，在一个实施方案中，在反应容器中提供抗体，添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器(因而与抗体接触)，并且随后将交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加至包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物(因而与包含抗体和药物的混合物接触)。在一个实施方案中，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后立即添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器。在另一个实施方案中，在反应容器中提供抗体，并且向容器提供抗体后某个时间区间(例如，在向该空间提供细胞结合剂后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟，约1小时、约1天或更长时间)之后添加药物(例如，DM1或DM4)至反应容器。药物(例如，DM1或DM4)可以迅速(即，在短时间区间，如约5分钟、约10分钟内)或缓慢(如通过使用泵)添加。
包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物随后可以与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后立即接触或在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后的某个更晚时间点(例如，约5分钟至约8小时或更长时间)接触。例如，在一个实施方案中，在添加药物(例如，DM1或DM4)至包含抗体的反应容器后立即添加交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)至包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物。备选地，包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物可以在使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长时间与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后，使反应推进约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更长时间(例如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时)。
在一个实施方案中，单步骤法还包括使任何未反应的药物(例如，DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)猝灭的猝灭步骤。猝灭步骤一般在纯化缀合物之前进行。在一个实施方案中，通过使混合物与猝灭试剂接触，使混合物猝灭。如本文所用，“猝灭试剂”指与游离药物(例如，DM1或DM4)和/或游离交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应的试剂。在一个实施方案中，马来酰亚胺或卤乙酰胺猝灭试剂，如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰氨基丙酸，可以用来确保猝灭药物(例如，DM1或DM4)中的任何未反应基团(如巯基)。猝灭步骤可以帮助防止药物(例如，DM1)二聚化。二聚化DM1可能难以移除。一旦用极性、带电荷的巯基猝灭试剂(如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)猝灭，多余的未反应DM1转化成极性、带电荷的水溶性加合物，其中所述加合物可以在纯化步骤期间容易地与共价连接的缀合物分离。也可以使用用非极性和中性巯基猝灭试剂猝灭。在一个实施方案中，使混合物与猝灭试剂接触，使混合物猝灭，其中所述猝灭试剂与未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应。例如，可以添加亲核试剂至混合物以猝灭任何未反应的SMCC。亲核试剂优选地是含有氨基的亲核试剂，如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。
在优选的实施方案中，在使混合物与猝灭试剂接触之前，允许反应(即，使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触并且随后与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触)推进至完成。在这个方面，将猝灭试剂在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或约25小时至约48小时)添加至混合物。
备选地，通过降低混合物pH至约5.0(例如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)，使混合物猝灭。在另一个实施方案中，通过降低混合物pH至小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0，使混合物猝灭。备选地，将pH降低至约4.0(例如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至约6.0(例如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、约4.0至约5.0、约4.5(例如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至约5.0。在一个实施方案中，通过降低混合物pH至4.8，使混合物猝灭。在另一个实施方案中，通过降低混合物pH至5.5，使混合物猝灭。
在一个实施方案中，单步骤法还包括从抗体释放不稳定结合的接头的维持步骤。维持步骤包括在纯化缀合物之前(例如，在反应步骤后，在反应步骤和猝灭步骤之间，或在猝灭步骤后)维持混合物。例如，该方法包括(a)在具有pH约4至约9的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物；并且随后使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1，Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)，(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)，和(iii)反应副产物的混合物，(b)维持在步骤(a)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，和(c)纯化混合物以提供纯化的缀合物。
在另一个实施方案中，该方法包括(a)在具有pH约4至约9的溶液中使抗体与药物(例如，DM1或DM4)接触以形成包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物；并且随后使包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以提供包含(i)缀合物、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)和(iii)反应副产物的混合物，(b)淬灭在步骤(a)中制备的混合物以猝灭任何未反应的药物(例如，DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)，(c)维持在步骤(b)中制备的混合物以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，和(d)纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)。
备选地，维持步骤可以在纯化缀合物后进行，随后进行额外的纯化步骤。
在优选的实施方案中，在维持步骤之前允许反应推进至完成。在这个方面，维持步骤可以在包含抗体和药物(例如，DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触后约1小时至约48小时(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或约24小时至约48小时)后进行。
维持步骤包括将溶液维持在合适的温度(例如，约0℃至约37℃)持续合适的时间段(例如，约1小时至约1周、约1小时至约24小时、约1小时至约8小时或约1小时至约4小时)以从抗体释放不稳定结合的接头，同时基本上不从抗体释放稳定结合的接头。在一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约20℃或更低温度(例如，约0℃至约18℃、约4℃至约16℃)、在室温(例如，约20℃至约30℃或约20℃至约25℃)，或在升高的温度(例如，约30℃至约37℃)。在一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约16℃至约24℃(例如，约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)的温度。在另一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃(例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃)的温度。在另一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约37℃(例如，约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃)的温度。
维持步骤的持续时间取决于实施维持步骤的温度和pH。例如，可以通过在升高的温度实施维持步骤大幅度减少维持步骤的持续时间，最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性限制。维持步骤可以包括将溶液维持约1小时至约1天(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时，或约24小时)、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约14小时至约24小时、约16小时至约24小时、约18小时至约24小时、约20小时至约24小时、约5小时至约1周、约20小时至约1周、约12小时至约1周(例如、约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)或约1天至约1周。
在一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃的温度持续至少约12小时、至多1周的时间。在另一个实施方案中，维持步骤包括将溶液维持在约2℃至约8℃的温度过夜(例如，约12至约24小时，优选地约20小时)。
用于维持步骤的pH值优选地是约4至约10。在一个实施方案中，用于维持步骤的pH值是约4或更大，但是小于约6(例如，4至5.9)或约5或更大，但是小于约6(例如，5至5.9)。在另一个实施方案中，用于维持步骤的pH值范围从约6至约10(例如，约6.5至约9、约6至约8)。例如，用于维持步骤的pH值可以是约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。
在特定的实施方案中，维持步骤可以包含将混合物在25℃在pH约6-7.5温育约12小时至约1周，将混合物在4℃在pH约4.5-5.9温育约5小时至约5天，或将混合物在25℃在pH约4.5-5.9温育约5小时至约1天。
单步骤法可以任选地包括向反应步骤添加蔗糖以增加溶解度和回收缀合物。合乎需要地，蔗糖以约0.1％(w/v)至约20％(w/v)(例如，约0.1％(w/v)、1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)或20％(w/v))的浓度添加。优选地，蔗糖以约1％(w/v)至约10％(w/v)(例如，约0.5％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、约10％(w/v)或约11％(w/v))的浓度添加。此外，反应步骤还可以包括添加缓冲剂。可以使用本领域已知的任何合适缓冲剂。合适的缓冲剂例如包括柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂选自HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸)去水合物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)及其组合。
在一个实施方案中，单步骤法还可以包括纯化混合物以提供纯化的缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)的步骤。本领域已知的任何纯化方法可以用来纯化本发明的缀合物。在一个实施方案中，本发明的缀合物使用切线流过滤(TFF)、非吸附性层析、吸附性层析、吸附性过滤、选择性沉淀或任何其他合适的纯化过程以及其组合。在另一个实施方案中，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之前，首先通过一个或多个PVDF膜过滤缀合物。备选地，在使缀合物经历上文描述的纯化过程之后，通过一个或多个PVDF膜过滤缀合物。例如，在一个实施方案中，将缀合物通过一个或多个PVDF膜过滤并且随后使用切线流过滤法纯化。备选地，将缀合物使用切线流过滤法纯化并且随后通过一个或多个PVDF膜过滤。
任何合适的TFF系统可以用于纯化，包括型系统(Millipore，Billerica，MA)、Cassette系统(Sartorius AG，Edgewood，NY)，和CentrasetteTM型系统(PallCorp.，East Hills，NY)。
任何合适的吸附性层析树脂可以用于纯化。优选的吸附性层析树脂包括羟基磷灰石层析、疏水性电荷诱导色谱(HCIC)、疏水相互作用层析(HIC)、离子交换层析、混合模式离子交换层析、固定化金属亲和层析(IMAC)、染料配体层析、亲和层析、反相层析及其组合。合适的羟基磷灰石树脂的例子包括陶瓷羟基磷灰石(CHTI型和II型，Biorad Laboratories，Hercules，CA)、HA羟基磷灰石(PallCorp.，East Hills，NY)和陶瓷氟磷灰石(CFTI型和II型，Biorad Laboratories，Hercules，CA)。合适的HCIC树脂的例子是MEPHypercelTM树脂(PallCorp.，East Hills，NY)。合适的HIC树脂的例子包括丁基-己基-苯基-和辛基树脂(全部来自GE Healthcare，Piscataway，NJ)以及Macro-prep甲基树脂和Macro-Prep叔丁基树脂(Biorad Laboratories，Hercules，CA)。合适的离子交换树脂的例子包括SP-CM-和Q-树脂(全部来自GE Healthcare，Piscataway，NJ)和UnosphereTM S树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的混合模式离子交换剂的例子包括ABx树脂(JT Baker，Phillipsburg NJ)。合适的IMAC树脂的例子包括螯合树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)和Profinity IMAC树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的染料配体树脂的例子包括蓝色树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)和Affi-gel树脂(Biorad Laboratoriess，Hercules，CA)。合适的亲和树脂的例子包括蛋白A树脂(例如，MabSelect，GE Healthcare，Piscataway，NJ)和凝集素亲和树脂，例如兵豆凝集素树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，其中抗体携带适宜的凝集素结合位点。合适的反相树脂的例子包括C4、C8、和C18树脂(Grace Vydac，Hesperia，CA)。
任何合适的非吸附性层析树脂可以用于纯化。合适的非吸附性层析树脂的例子包括但不限于、SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂(例如，S-200和S-300)、SUPERDEXTM树脂(例如，SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200)、树脂(例如，P-6、P-10、P-30、P-60、和P-100)和本领域普通技术人员已知的其他树脂。
两步骤法和单罐法
在一个实施方案中，本发明的缀合物可以如美国专利7,811,572和美国专利申请公开号2006/0182750中所述制备。这种方法包括步骤：(a)使本发明的抗体与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，以将接头(即，Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1)共价连接至抗体并因而制备包含具有与之结合的接头的抗体的第一混合物结合；(b)任选地使第一混合物经历纯化过程以制备具有与之结合的接头的抗体的纯化的第一混合物；(c)通过在具有pH约4至约9的溶液中使具有与之结合的接头的抗体与药物(例如，DM1或DM4)反应，使药物(例如，DM1或DM4)与第一混合物中具有与之结合的接头的抗体缀合以制备包含(i)缀合物(例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离药物(例如，DM1或DM4)；和(iii)反应副产物的第二混合物；和(d)使第二混合物经历纯化过程以将缀合物从第二混合物的其他组分纯化出来。备选地，可以省略纯化步骤(b)。本文所述的任何纯化方法可以用于步骤(b)和(d)。在一个实施方案中，TFF用于步骤(b)和步骤(d)。在另一个实施方案中，TFF是用于步骤(b)并且吸附性层析(例如，CHT)用于步骤(d)。
单步骤试剂和原位法
在一个实施方案中，可以通过如下方式制备本发明的缀合物：使预先形成的药物-接头化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)与本发明的抗体缀合，如美国专利6,441,163和美国专利申请公开号2011/0003969和2008/0145374中所述，随后实施纯化步骤。可以使用本文所述的任何纯化方法。通过使药物(例如，DM1或DM4)与交联剂(例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应制备药物-接头化合物。药物-接头化合物(例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)任选地与抗体缀合之前经历纯化。
4.表征和选择所希望的抗体和抗体药物缀合物
可以通过本领域已知的多种测定法，表征本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物并选择它们的物理/化学特性和/或生物活性。
例如，可以通过已知的方法如ELISA、FACS、或蛋白质印迹法，对本发明的抗体测试其抗原结合活性。
转基因动物和细胞系特别可用于筛选具有预防性或治疗性治疗过量表达肿瘤相关抗原和细胞表面受体的癌的潜力的抗体药物缀合物(ADC)。筛选有用ADC可以涉及在一系列剂量范围内施用候选ADC至转基因动物，并且在各种时间点分析ADC对正在评价的疾病或病症的影响。备选地或额外地，如果适用，药物可以在疾病暴露于诱导物之前或与之同时施用。可以连续和独立地筛选或在中等通量或高通量筛选模式下平行筛选候选ADC。
一个实施方案是一种筛选方法，所述筛选方法包括(a)将来自表达FGFR2或FGFR4的稳定癌细胞系或人类患者肿瘤的细胞(例如，乳腺癌细胞系或肿瘤片段、胃癌细胞系或肿瘤片段)移植到非人动物中，(b)施用ADC候选药物至非人动物并且(c)确定候选物抑制来自所移植细胞系的肿瘤生长的能力。本发明还涵盖一种筛选ADC候选物用于治疗以过量表达FGFR2或FGFR4为特征的疾病或病症的的方法，所述方法包括(a)使来自表达FGFR2或FGFR4的稳定癌细胞系的细胞与候选药物接触，和(b)评价ADC候选物抑制稳定细胞系生长的能力。
一个实施方案是一种筛选方法，所述方法包括(a)使来自表达FGFR2或FGFR4的稳定癌细胞系的细胞与ADC候选药物接触和(b)评价ADC候选物阻断FGFR2或FGFR4的配体激活作用的能力。在另一个实施方案中，评价了ADC候选物阻断配体刺激的酪氨酸磷酸化的能力。
另一个实施方案是一种筛选方法，所述方法包括(a)使来自表达FGFR2或FGFR4的稳定癌细胞系的细胞与ADC候选药物接触和(b)评价ADC候选物诱导细胞死亡的能力。在一个实施方案中，评价了ADC候选物诱导凋亡的能力。
在一个实施方案中，通过在一系列剂量范围内向转基因动物施用并且评价动物随时间推移对化合物的生理学反应，筛选候选ADC。在一些情况下，可能适宜的是将化合物连同将增强化合物效力的辅因子一起施用。如果衍生自对象转基因动物的细胞系用来筛选可用于治疗与过量表达FGFR2或FGFR4相关的多种病症的ADC，则将试验ADC在适宜的时间添加至细胞培养基，并且使用适宜的生物化学测定法和/或组织学测定法，评价随时间推移细胞对ADC的反应。
因此，本发明提供用于鉴定特异性靶向FGFR2和FGFR4并与之同时结合的ADC的测定法，在肿瘤细胞上所述FGFR2和FGFR4的过量表达和扩增与异常细胞功能相关。在一个实施方案中，本发明提供ADC，所述ADC包含具有以下属性的抗FGFR2/4抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)：与MCC-DM1或SPDB-DM4缀合之后，对人FGFR2的亲和力小于10nM、以小于2nM的IC50抑制生长FGFR2/4扩增和/或过量表达的细胞的能力、缓慢清除率，例如，在小鼠中单次3mg/kg IV给药之后小于45ml/d/kg。
FGFR2/4抗体
本发明提供与人FGFR2和FGFR4(FGFR2/4)特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。本发明的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括但不限于如以下实施例中所述那样分离的人单克隆抗体或其片段(参见下文第6节)。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合FGFR2/4的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:7、27、47、67、87或107的氨基酸序列的VH结构域。在某些实施方案中，本发明还提供与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有表1中所列任一个VH CDR的氨基酸序列的VH CDR，等等。在具体的实施方案中，本发明提供与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体包含(或备选地，由其组成)一个、两个、三个、四个、五个或更多个具有下表1中所列任意VH CDR的氨基酸序列的VH CDR，等等。
本公开提供与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含VL结构域，其具有SEQ ID NO:17、37、57、77、97或117的氨基酸序列。本发明还提供与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有下表1中所列任一个VL CDR的氨基酸序列的VL CDR，等等。特别地，本发明提供与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含(或备选地，由其组成)一个、两个、三个或更多具有表1中所列任意VL CDR的氨基酸序列的VL CDR，等等。
本发明的其他抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含已经被突变，然而在CDR区内具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性的氨基酸，其中所述CDR区以表1中所述的序列描述。在一些实施方案中，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表1所述序列中描述的CDR区相比时，已经突变CDR区内不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
本发明还提供了编码与FGFR2/4特异性结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。这些核酸序列可以为哺乳动物细胞中的表达而优化。
表1.本发明的抗FGFR2/4抗体的例子
其他本发明的抗体包括这些抗体，其中所述氨基酸或编码所述氨基酸的核酸已经被突变，仍与表1中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，它包括这样的突变氨基酸序列，其中与表1所述序列中描述的可变区相比时，可变区内不多于1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变，同时保留基本上相同的治疗活性。
由于这些抗体的每一种可以与FGFR2/4结合，可以“混合并匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)以产生本发明的其他结合FGFR2/4的抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA，和实施例部分中描述的其他测定法)测试这类“混合和匹配的”结合FGFR2/4的抗体。当这些链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当替换为结构上相似的VH序列。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当替换为结构上相似的全长重链序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当替换为结构上相似的VL序列。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当替换为结构上相似的全长轻链序列。因此，在一个方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO:7,27,47,67,87和107的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ ID NO:17,37,57,77,97和117的氨基酸序列的轻链可变区；其中抗体与FGFR2/4特异性结合。
在另一个方面，本发明提供(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含已经优化用于哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长重链，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:9,29,49,69,89,和109；和包含已经优化用于哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长轻链，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:19,39,59,79,99和119；或(ii)包含其抗原结合部分的有功能的蛋白质。
在另一个方面，本发明提供结合FGFR2/4的抗体，所述抗体包含如表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合。所述抗体的VH CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:1,21,41,61,81,和101中显示。所述抗体的VH CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:2,22,42,62,82,和102中显示。所述抗体的VH CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:3,23,43,63,83,和103中显示。所述抗体的VL CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:11,31,51,71,91,和111中显示。所述抗体的VL CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:12,32,52,72,92,和112中显示。所述抗体的VLCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:13,33,53,73,93,和113中显示。
鉴于这些抗体的每一种均可以与FGFR2/4结合以及抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，不过每种抗体必须含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3以产生本发明的其他结合C5的结合分子。可以使用本领域已知的结合测定法和实施例中描述的那些测定法(例如，ELISA)测试这类“混合和匹配的”结合FGFR2/4的抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替换为结构上相似的CDR序列。普通技术人员将轻易地明白，可以通过将一个或多个VH和/或VLCDR区序列取代为来自本文中对本发明单克隆抗所显示的CDR序列的结构上相似的序列，产生新的VH和VL序列。
因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其包含重链CDR1，所述重链CDR1包含选自SEQ ID NO:1,21,41,61,81,和101的氨基酸序列；重链CDR2，所述重链CDR2包含选自SEQ ID NO:2,22,42,62,82,和102的氨基酸序列；重链CDR3，所述重链CDR3包含选自SEQ ID NO:3,23,43,63,83,和103的氨基酸序列；轻链CDR1，所述轻链CDR1包含选自SEQ ID NO:11,31,51,71,91,和111的氨基酸序列；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含选自SEQID NO:12,32,52,72,92,和112的氨基酸序列；轻链CDR3，所述轻链CDR3包含选自SEQ IDNO:13,33,53,73,93,和113的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合FGFR2/4。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2；SEQ ID NO:3的重链CDR3；SEQ ID NO:11的轻链CDR1；SEQ ID NO:12的轻链CDR2；和SEQ ID NO:13的轻链CDR3。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:22的重链CDR2；SEQ ID NO:23的重链CDR3；SEQ ID NO:31的轻链CDR1；SEQ ID NO:32的轻链CDR2；和SEQ ID NO:33的轻链CDR3。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:41的重链CDR1、SEQ ID NO:42的重链CDR2；SEQ ID NO:43的重链CDR3；SEQ ID NO:51的轻链CDR1；SEQ ID NO:52的轻链CDR2；和SEQ ID NO:53的轻链CDR3。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:61的重链CDR1、SEQ ID NO:62的重链CDR2；SEQ ID NO:63的重链CDR3；SEQ ID NO:71的轻链CDR1；SEQ ID NO:72的轻链CDR2；和SEQ ID NO:73的轻链CDR3。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:81的重链CDR1、SEQ ID NO:82的重链CDR2；SEQ ID NO:83的重链CDR3；SEQ ID NO:91的轻链CDR1；SEQ ID NO:92的轻链CDR2；和SEQ ID NO:93的轻链CDR3。
在一个具体实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含SEQ ID NO:101的重链CDR1、SEQ ID NO:102的重链CDR2；SEQ ID NO:103的重链CDR3；SEQ ID NO:111的轻链CDR1；SEQ ID NO:112的轻链CDR2；和SEQ ID NO:113的轻链CDR3。
在某些实施方案中，与FGFR2/4特异性结合的抗体是在表1中描述的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
1.鉴定表位和与相同表位结合的抗体
在一个实施方案中，本发明提供人FGFR2上包含SEQ ID NO:137的氨基酸176(Lys)和210(Arg)的表位特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。在一些方面，本发明提供了特异性结合如SEQ ID NO:137中所示的人FGFR2的位置173(Asn)、174(Thr)、175(Val)、176(Lys)、178(Arg)、208(Lys)、209(Val)、210(Arg)、212(Gln)、213(His)、217(Ile)、219(Glu)处氨基酸的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供了与人FGFR2(根据P21802-3编号；SEQ ID NO:137)的氨基酸160-189(KMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMR；SEQ ID NO:136)和/或氨基酸198-216(KMEKRLHAVPAANTVKFRC；SEQ ID NO:141)的表位结合的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供与人FGFR4上包含SEQ ID NO:142的氨基酸169(Lys)和203(Arg)的表位特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。在一些方面，本发明提供了特异性结合如SEQ ID NO:142中所示的人FGFR4的位置150(Thr)、151(His)、154(Arg)、157(Lys)、160(His)、166(Asn)、167(Thr)、168(Val)、169(Lys)、171(Arg)、173(Pro)、174(Ala)、201(Arg)、202(Leu)、203(Arg)、204(His)、205(Gln)、206(His)、207(Trp)、210(Val)和212(Glu)处氨基酸的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供了与人FGFR4(编号根据P22455-1；SEQ ID NO:142)的氨基酸150-174(THPQRMEKKLHAVPAGNTVKFRCPA；SEQ ID NO:132)和/或氨基酸201-212(RLRHQHWSLVME；SEQ ID NO:133)的表位结合的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供与人FGFR2上包含SEQ ID NO:137的氨基酸176(Lys)和210(Arg)的表位并与人FGFR4上包含SEQ ID NO:142的氨基酸169(Lys)和203(Arg)的表位特异性结合的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供了与人FGFR2(根据P21802-3编号；SEQ ID NO:137)的氨基酸160-189(KMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMR；SEQ ID NO:136)和氨基酸198-216(KMEKRLHAVPAANTVKFRC；SEQ ID NO:141)的表位以及人FGFR4(编号根据P22455-1；SEQID NO:142)的氨基酸150-174(THPQRMEKKLHAVPAGNTVKFRCPA；SEQ ID NO:132)和氨基酸201-212(RLRHQHWSLVME；SEQ ID NO:133)的表位结合的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。
本发明还提供抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)，其特异性结合与表1中描述的抗FGFR2/4抗体相同的表位，或与表1中所述的抗体交叉竞争。可以因此基于其在FGFR2和/或FGFR4结合测定法中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性抑制结合作用)的能力，鉴定额外的抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)。试验抗体抑制本发明抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段)与FGFR2和/或FGFR4蛋白(例如，人FGFR2和/或FGFR4)结合的能力表明试验抗体可以与这种抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)竞争与FGFR2和/或FGFR4结合；根据非限制的理论，这种抗体可以与该抗体竞争的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)结合FGFR2和/或FGFR4蛋白上相同或相关(例如，结构上相似或空间接近的)的表位。在某些实施方案中，与表1中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)结合FGFR2和/或FGFR4上相同的表位的抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。可以本文所述制备并分离这类人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
2.Fc区构架的进一步改变
本发明的免疫缀合物可以包含修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段还在VH和/或VL内部包含对构架残基的修饰，例如以改善抗体的特性。在一些实施方案中，进行这种构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，已经历过体细胞突变的抗体可以含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可以通过将抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列比较而鉴定这类残基。为了使构架区序列恢复其种系构型，可以例如通过位点定向诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。本发明还意在涵盖这类“回复突变”的抗体。
另一个类型的构架修饰涉及使构架区内部、或甚至一个或多个CDR区内部的一个或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫化”并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中更详细地描述。
除了在构架区或CDR区内部作出修饰之外或作为替代，本发明的抗体还可以经工程化以在Fc区内部包含修饰，一般旨在改变抗体的一种或多种功能特征，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。另外，本发明的抗体可以经化学修饰(例如一种或多种化学部分可以与抗体连接)或经修饰以改变其糖基化作用，这再次旨在改变抗体的一个或多个功能特征。下文进一步详细描述这些实施方案的每一项。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如，增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以便例如促进轻链和重链的装配或增加或减少抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以减少抗体的生物半寿期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合作用，抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合作用。在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述这种方法。
在另外的其他实施方案中，通过以下方式改变Fc区：将至少一个氨基酸残基替换为一个不同氨基酸残基以改变抗体的效应功能。例如，可以将一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的效应子配体亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中描述。
在另一个实施方案中，可以将选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的C1q结合作用和/或减少或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。在例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中描述这种方法。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。在例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中描述这种方法。在一个具体实施方案中，对于IgG1亚类和κ同种型，将本发明的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸替换为一个或多个同种异型氨基酸残基，例如如图4所示的那些。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述。
在又一个实施方案中，修饰Fc区以增加该抗体介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的能力和/或以通过修饰一个或多个氨基酸而增加抗体对Fcγ受体的亲和力。在例如Presta的PCT公开WO 00/42072中描述这种方法。另外，已经定位人IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合作用的变体(见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
在又一个实施方案中，调节抗体的糖基化。例如，可以产生去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以便例如增加抗体对“抗原”的亲和力。这类糖类修饰也可以通过例如改变抗体序列内部的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以产生一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除在这个位点处的糖基化。这种去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中描述这种方法。
额外或备选地，可以产生一种抗体，所述抗体具有改变的糖基化类型，如岩藻糖残基数量减少的过低岩藻糖化的抗体或对分型GlcNac结构增加的抗体。这类改变的糖基化模式已经展示增加抗体的ADCC能力。这类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化装置的宿主细胞中表达这种抗体而完成。本领域中已经描述了具有改变的糖基化装置的细胞并且它们可以用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上遭破坏的细胞系，从而在这种细胞系中表达的抗体显示过低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了一种变异CHO细胞系(Lecl3细胞)，所述细胞系具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)连接的糖的能力，这也导致在这种宿主细胞中表达的抗体过低岩藻糖化(还见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在这种工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的对分GlcNac结构物，这导致抗体的增加的ADCC活性(还参见Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物半寿期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。备选地，为了增加生物半寿期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvage receptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
3.FGFR2/4抗体的产生
可以通过本领域已知的任何手段产生抗FGFR2/4抗体及其抗体片段(例如，抗原结合片段)，所述手段包括但不限于重组表达、化学合成和酶消化抗体四聚体，其中可以通过例如杂交瘤或重组产生获得全长单克隆抗体。重组表达可以来自本领域已知的任何适宜宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本发明进一步提供编码本文所述抗体的多核苷酸，例如，编码包含如本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些实施方案中，编码重链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:8,28,48,68,88和108的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:18,38,58,78,98,和118的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些实施方案中，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:10,30,50,70,90或110的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些实施方案中，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:20,40,60,80,100或120的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本发明的多核苷酸可以仅编码抗FGFR2/4抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含一种所例举小鼠抗FGFR2和/或FGFR4抗体的重链和轻链的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与一种小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区基本上相同的两个多肽区段。
可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗FGFR2/4抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实施例中所述的序列)产生这些多核苷酸序列。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，如Narang等人,Meth.Enzymol.68:90,1979的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持体法。例如可以如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编著),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Innis等人(编著),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；and Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述，通过PCR向多核苷酸序列引入突变。
在本发明中还提供了用于产生上文描述的抗FGFR2/4抗体的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码抗FGFR2/4抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体均可以用来在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体，一般具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人类人工染色体(参见，例如，Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达抗FGFR2/4多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNATM3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen，圣迭戈，CA)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。可用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒的载体、痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)载体。参见，Brent等人,上文；Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于其中载体待表达的预期宿主细胞。一般，表达载体含有与编码抗FGFR2/4抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖启动子、lacZ启动子、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩大转化生物的培养物，而不偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体。除启动子之外，也可能要求或需要其他调节元件用于高效表达抗FGFR2/4抗体链或片段。这些元件一般包括ATG起始密码子和毗邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过纳入适用于所用细胞系统的增强子增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置以形成含有多肽的融合蛋白，其中所述多肽由插入的抗FGFR2/4抗体序列编码。更经常地，插入的抗FGFR2/4抗体序列在纳入载体之前与信号序列连接。待用来接受编码抗FGFR2/4抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。这类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，因而导致产生完整抗体或其片段。一般，这类恒定区属于人类。
用于携带并表达抗FGFR2/4抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本发明多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以产生一般含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)的表达载体。此外，将存在任何数目的多种熟知启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子一般控制表达，任选地连同操纵基因序列，并具有用于启动并完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。其他微生物，如酵母，也可以用来表达本发明的抗FGFR2/4多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一些优选的实施方案中，哺乳动物宿主细胞用来表达并产生本发明的抗FGFR2/4多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常非永生的或正常或异常的永生动物或人细胞。例如，已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的众多合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途通常例如在Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、阶段特异的和/或可调控或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变动。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理法或电穿孔法可以用于其他细胞宿主(总体上参见Sambrook等人，上文)。其他方法包括例如电穿孔法、磷酸钙处理法、脂质体介导的转化法、注射法和显微注射法、生物射弹法、病毒体法、免疫脂质体法、聚阳离子：核酸缀合物法、裸DNA法、人工病毒粒法、疱疹病毒结构蛋白VP22融合法(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、试剂增强的DNA摄取法和离体转导法。为了长期、高产率产生重组蛋白，将经常需要稳定表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体，制备稳定表达抗FGFR2和/或FGFR4抗体链或结合片段的细胞系。在引入该载体之后，可以允许细胞在加富培养基中生长1-2日，之后将它们转换至选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。抗性、稳定转染的细胞可以使用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。
治疗性和诊断性用途
本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于多种应用，包括但不限于治疗癌症，如实体癌。在某些实施方案中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)，和抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、缩减肿瘤体积和/或减少肿瘤的致瘤性。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一个方面，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于检测FGFR2或FGFR4在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。在某些实施方案中，这类组织包含相对于其他组织以较高水平表达FGFR2或FGFR4的正常组织和/或癌组织。
在一个方面，本发明提供一种检测FGFR2或FGFR4在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与抗FGFR2/4抗体在允许抗体与抗原结合的条件下接触，并且检测复合物是否在抗体和抗原之间形成。
在一个方面，本发明提供了一种诊断与FGFR2或FGFR4表达增加相关的病症的的方法。在某些实施方案中，该方法包括使检验细胞与抗FGFR2/4抗体接触；通过检测抗FGFR2/4抗体与FGFR2/4抗原的结合，(定量或定性)确定检验细胞上的FGFR2或FGFR4表达水平；并且比较检验细胞中的FGFR2或FGFR4表达水平与对照细胞(例如，与检验细胞相同的组织来源的正常细胞或按照与这种正常细胞可比较的水平表达FGFR2或FGFR4的细胞)中的FGFR2或FGFR4表达水平，其中与对照细胞相比，检验细胞上FGFR2或FGFR4的更高表达水平表示存在与FGFR2或FGFR4表达增加相关的病症。在某些实施方案中，检验细胞从疑似患有与FGFR2或FGFR4表达增加相关的病症的个体获得。在某些实施方案中，病症是细胞增殖性疾病，如癌症或肿瘤。在某些实施方案中，该方法包括测量检验细胞中FGFR2基因的拷贝数。在某些实施方案中，该方法包括检测PAX-FOXO易位突变。可以使用本领域已知的标准方法，例如，PCR、RTPCR等，检测基因的拷贝数和/或易位突变。
在某些实施方案中，诊断或检测方法，如上文描述的那些，包括检测抗FGFR2/4抗体与细胞表面上或膜制备物中表达的FGFR2或FGFR4的结合，所述膜制备物从在其表面上表达FGFR2或FGFR4的细胞获得。用于检测抗FGFR2或FGFR4抗体与细胞表面上表达的FGFR2或FGFR4结合的示例性测定法是“FACS”测定法。
某些其他方法可以用来检测抗FGFR2/4抗体与FGFR2或FGFR4的结合。这类方法包括但不限于本领域熟知的抗原结合测定法，如蛋白质印迹法、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和免疫组织化学(IHC)。
在某些实施方案中，抗FGFR2/4抗体是标记的。标记物包括但不限于直接检测到的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。
在某些实施方案中，抗FGFR2/4抗体固定在不溶性基质上。固定能够将抗FGFR2/4抗体与在溶液中保持游离的任何FGFR2或FGFR4蛋白分离。通过使抗FGFR2/4抗体在分析流程之前不溶，如通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等人，美国专利号3,720,760)，或通过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)，或通过使在抗FGFR2/4抗体和FGFR2或FGFR4蛋白之间形成复合物后抗FGFR2/4抗体不溶(例如，通过免疫沉淀法)，常规地完成这一点。
可以使用本发明的免疫缀合物替代抗FGFR2/4抗体或除抗FGFR2/4抗体外还使用本发明的免疫缀合物，实施诊断或检测的前述任一实施方案。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括施用本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物至患者。在某些实施方案中，用本发明抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物治疗的疾病是癌症。可以治疗和/或预防的疾病的例子包括但不限于肾上腺皮质癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、中枢神经系统非典型畸胎样肿瘤/杆状瘤、结肠癌、结直肠癌、胚胎瘤、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、卡波齐肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、直肠癌、横纹肌肉瘤、小细胞肝癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌。在某些实施方案中，癌以本发明抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物所结合的表达FGFR2或FGFR4的细胞为特征。在某些实施方案中，癌症以FGFR2或FGFR4的DNA拷贝数增加为特征。在某些实施方案中，癌以FGFR2或FGFR4表达增加为特征，例如，如分别通过FGFR2RNA或FGFR4RNA增加所测量。本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些实施方案中，癌是实体癌。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，癌症是抗性癌和/或复发癌。在某些方面，例如，抗性癌抵抗酪氨酸激酶抑制剂，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。在某些实施方案中，癌是Her2抗性癌。
在某些实施方案中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，所述方法包含向对象施用治疗有效量的本发明抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，对象具有肿瘤或已经摘出肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤抵抗其他酪氨酸激酶抑制剂，所述其他酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
在某些实施方案中，肿瘤表达与抗FGFR2/4抗体结合的FGFR2或FGFR4。在某些实施方案中，肿瘤过量表达人FGFR2或FGFR4。在某些实施方案中，肿瘤具有拷贝数增加的FGFR2基因。在某些实施方案中，肿瘤具有造成FGFR4过量表达的PAX-FOXO易位突变。
本发明还提供选择患者以便用本发明抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物治疗的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面，该方法包括选择具有抗酪氨酸激酶抑制剂的癌的患者。在某些方面构思了抗酪氨酸激酶抑制剂的癌抵抗EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和/或Met抑制剂。在某些方面，构思了抗性癌是Her2抗性癌。更具体地构思了Her2抗性癌不响应于曲妥珠单抗或曲妥珠单抗emtansine。在某些方面构思了癌症是从头抗性癌，并且在仍然其他方面，构思了癌是复发癌，例如Her2复发癌。在本发明的某些方面，该方法包括选择患有从头抗性癌或复发癌的患者并测量FGFR2和/或FGFR4的表达。构思了在某些方面，复发癌或肿瘤起初不是表达FGFR2或FGFR4的癌或肿瘤，但是用酪氨酸激酶抑制剂(例如，曲妥珠单抗或曲妥珠单抗emtansine)治疗后，变成FGFR2和/或FGFR4阳性癌，所述阳性癌是抵抗酪氨酸激酶抑制剂的癌或肿瘤或复发癌或肿瘤。
为了治疗疾病，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的适宜剂量取决于多种因素，如待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和过程、疾病的反应性、既往治疗，患者临床史等。抗体或药物可以一次性或经一系列治疗施用，持续几日至几个月或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如，肿瘤尺寸减少)。最佳给药方案可以从测量患者身体内的药物蓄积量计算出来并且将根据各自抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物的相对效力而变动。在某些实施方案中，剂量是每kg体重0.01mg至10mg(例如，0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、7mg、8mg、9mg或10mg)，并且可以每日、每周、每月或每年一次或多次给予。在某些实施方案中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物每两周一次或每三周一次给予。治疗医师可以基于药物在体液或组织中的实测停留时间和浓度，评估重复给药率。
联合疗法
在某些情况下，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物与其他治疗剂如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或镇吐药)、镇痛药、细胞保护剂及其组合组合。
考虑用于联合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑()、比卡鲁胺()、硫酸博来霉素()、白消安()、白消安注射液()、卡培他滨(希罗达)、N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂()、卡莫司汀()、苯丁酸氮芥()、顺铂()、克拉屈滨()、环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖苷()、阿糖胞苷脂质体注射液()、达卡巴嗪()、更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸佐柔比星()、柠檬酸佐柔比星脂质体注射剂()、地塞米松、多西紫杉醇()、盐酸多柔比星( )、依托泊苷()、磷酸氟达拉滨()、5-氟尿嘧啶()、氟他胺()、替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(difluorodeoxycitidine)、羟基脲()、伊达比星()、异环磷酰胺()、伊立替康()、L-天冬酰胺酶()、甲酰四氢叶酸钙、美法仑()、6-巯基嘌呤()、甲氨蝶呤()、米托蒽醌()、米罗他(mylotarg)、紫杉醇()、phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20连同卡莫司汀植入物()、柠檬酸他莫昔芬()、替尼泊苷()、6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明()、注射用盐酸拓扑替康()、长春碱()、长春新碱()和长春瑞滨()。
在一个实施方案中，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物在作为联合疗法的药物联合制剂或给药方案中与具有抗癌特性的第二化合物组合。药物联合制剂或给药方案的第二化合物可以对该联合的抗体或免疫缀合物具有互补活性，从而它们没有彼此不利地影响。例如，本发明的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或抗体药物缀合物可以与但不限于化疗剂、酪氨酸激酶抑制剂，例如FGF下游信号传导途径抑制剂、IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、Mcl1抑制剂和其他FGF2抑制剂组合施用。
如本文所用，术语“药物联合”指在一个剂量单位形式中的固定组合或用于联合施用的非固定组合或试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以在相同时间独立地施用或在各时间区间内分别施用，特别地其中这些时间区间允许联合配偶体显示合作性例如协同效应。
术语“联合疗法”指施用两种或更多治疗剂以治疗本公开中描述的治疗性病状或病症。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率活性成分的单个胶囊施用。备选地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所需的剂量。此外，这类施用也包括在大致相同的时间或在不同的时间顺序使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病状或病症方面提供药物联合的有益作用。
联合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当所述活性成分一起使用时所实现的作用大于因分别使用这些化合物所产生的作用的总和。当将活性成分(1)共配制并且以组合的单位剂量剂型同时施用或递送；(2)作为分立的制剂交替或同时递送；或(3)通过一些其他方案施用时，可以获得协同效应。以交替疗法递送时，可以在依次(例如通过在独立注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依次地即顺次地施用，而在联合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
在一个方面，本发明提供一种通过向有需求的对象施用与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂组合的本发明的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂。
例如，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼()；利尼伐尼(Linifanib)(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称作ABT869，从Genentech可获得)；苹果酸舒尼替尼()；博舒替尼(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，也称作SKI-606，并且在美国专利号6,780,996中描述)；达沙替尼()；帕唑帕尼()；索拉替尼()；Zactima(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(和)。
表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼()、吉非替尼(Gefitnib)()；N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3”S”)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺，)；凡德他尼()；拉帕替尼()；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；二盐酸卡纽替尼(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯乙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺(AEE788，CAS497839-62-0)；木利替尼(mubritinib)(TAK165)；培利替尼(Pelitinib)(EKB569)；阿法替尼(BIBW2992)；来那替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS187724-61-4)。
EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗()；帕尼单抗()；马妥珠单抗(EMD-72000)；曲妥珠单抗()；尼妥珠单抗(hR3)；扎鲁木单抗；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS339151-96-1)；和ch806(mAb-806，CAS946414-09-1)。
人表皮生长因子受体2(Her2受体)(也称作Neu，ErbB-2、CD340或p185)抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗()；培妥珠单抗()；曲妥珠单抗emtansine()；来那替尼(HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧喹啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺，并在PCT公开号WO05/028443中描述)；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼()；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW-2992，CAS850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸，(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626，CAS714971-09-2)；卡纽替尼二盐酸盐(PD 183805或CI-1033)；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS781613-23-8)。
Her3抑制剂包括但不限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111和MEHD-7945A。
MET抑制剂包括但不限于卡博替尼(cabozantinib)(XL184，CAS849217-68-1)；Foretinib(GSK1363089，以前的XL880，CAS849217-64-7)；Tivantinib(ARQ197，CAS1000873-98-2)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-甲酰胺(AMG458)；克里唑替尼(Cryzotinib)(PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605，CAS943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903，CAS956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]硫酰胺(MK2461，CAS917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523，CAS1022150-57-7)；和(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752，CAS477575-56-7)。
IGF1R抑制剂包括但不限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。综述参见例如，Yee,JNCI,104；975(2012)。
在另一个方面，本发明提供一种通过向有需求的对象施用与一种或多种FGF下游信号传导途径抑制剂组合的本发明的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述FGF下游信号传导途径抑制剂包括但不限于MEK抑制剂、BRAF抑制剂、PI3K/Akt抑制剂、SHP2抑制剂并且还包括mTOR。
例如，促分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂包括但不限于XL-518(也称作GDC-0973，Cas编号1029872-29-4，从ACC Corp.可获得)；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也称作CI-1040或PD 184352并且在PCT公开号WO2000035436中描述)；N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(也称作PD 0325901并且在PCT公开号WO 2002006213中描述)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(也称作U0126并且在美国专利号2,779,780中描述)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟基丙基]-环丙磺酰胺(也称作RDEA119或BAY869766并且在PCT公开号WO 2007014011中描述)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环十四烷-1,7(8H)-二酮](也称作E6201并且在PCT公开号WO 2003076424中描述)；2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也称作PD 98059，从Biaffin GmbH&Co.,KG，德国可获得的)；威罗菲尼(PLX-4032，CAS918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS1035555-63-5)；Pimasertib(AS-703026，CAS1204531-26-9)；和曲美替尼二甲基亚砜(GSK-1120212，CAS1204531-25-80)。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称作GDC0941并且在PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730中描述)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也称作BEZ235或NVP-BEZ235，并且在PCT公开号WO 06/122806中描述)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4基)吡啶-2-胺(也称作BKM120或NVP-BKM120，并且在PCT公开号WO 2007/084786中描述)；陶扎色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS502632-66-8)；和8-苯基-2-(吗啉-4基)-色烯-4-酮(LY294002，CAS154447-36-6)。
mTOR包括但不限于坦罗莫司()；地磷莫司(正式地称作deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669，并且在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；Simapimod(CAS164301-51-3)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰-丝氨酸-内盐(SF1126，CAS936487-67-1)。
在又一个方面，本发明提供一种通过向有需求的对象施用与一种或多种促凋亡剂组合的本发明的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述促凋亡剂包括但不限于IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、MCl1抑制剂、Trail剂、Chk抑制剂。
例如，IAP抑制剂包括但不限于LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406和TL32711。IAP抑制剂的其他例子包括但不限于WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295和WO 08/134679中公开的那些，全部文献均通过引用方式并入本文。
BCL-2抑制剂包括但不限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-[(三氟甲基)磺酰]苯基]磺酰]苯甲酰胺(也称作ABT-263并且在PCT公开号WO 09/155386中描述)；替曲卡星(Tetrocarcin A)；抗霉素；棉酚((-)BL-193)；Obatoclax；乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-羧酸酯(HA14–1)；奥利默森(Oblimersen)(G3139，)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-联苯基]-2-基)甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲氨基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰]-苯甲酰胺(ABT-737，CAS852808-04-9)；和Navitoclax(ABT-263，CAS923564-51-6)。
促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAIL)和DR5(TRAIL)，包括但不限于度拉纳明(Dulanermin)(AMG-951，RhApo2L/TRAIL)；马帕木单抗(mapatumumab)(HRS-ETR1，CAS658052-09-6)；来沙木单抗(HGS-ETR2，CAS845816-02-6)；Apomab()；可那木单抗(conatumumab)(AMG655，CAS896731-82-1)；和替加珠单抗(tigatuzumab)(CS1008，CAS946415-34-5，从Daiichi Sankyo可获得)。
检查点激酶(CHK)抑制剂包括但不限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776，CAS891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762，CAS860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮杂双环并[2.2.2]辛-3基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR124，CAS405168-58-3)；7-氨基更生霉素(7-AAD)、Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618，CAS911222-45-2)；莱菔硫烷(Sulforaphane)(CAS4478-93-7，4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸酯)；9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3.4-i][1,6]苯并二吖辛因-1,3(2H)-二酮(SB-218078，CAS135897-06-2)；和TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL),和CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在一个方面，本发明提供一种通过向有需求的对象施用与一种或多种FGFR抑制剂组合的本发明的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法。例如，FGFR抑制剂包括但不限于丙氨酸布立尼布(BMS-582664，(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；尼达尼布(Vargatef)(BIBF1120，CAS928326-83-4)；二乙酸多韦替尼(TKI258，CAS852433-84-2)；3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(BGJ398，CAS872511-34-7)；达鲁舍替(Danusertib)(PHA-739358)；和N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]-6-(3,5-二甲氧苯基)吡啶[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-脲(PD173074，CAS219580-11-7)。在一个具体实施方案中，本发明提供一种通过向有需求的对象施用与另一种FGFR2抑制剂组合的本发明的抗体药物缀合物而治疗癌症的方法，所述FGFR2抑制剂如3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6((4-(4-乙基哌嗪-1基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(也称作BGJ-398)或4-氨基-5-氟-3-(5-(4-甲基哌嗪1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(也称作多韦替尼(dovitinib)或TKI-258)AZD4547(Gavine等人,2012,Cancer Research 72,2045-56，N-[5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基]-4-(3R,5S)-二甲基哌嗪-1基)苯甲酰胺)、普纳替尼(Ponatinib)(AP24534；Gozgit等人,2012,Mol Cancer Ther.,11；690-99；3-[2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3基)乙炔基]-4-甲基-N-{4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基}苯甲酰胺，CAS943319-70-8)。
药物组合物
为了制备包含免疫缀合物的药物组合物或无菌组合物，将本发明的免疫缀合物与可药用载体或赋形剂混合。该组合物可以额外地含有一种或多种其他治疗剂，所述治疗剂适于治疗或预防癌症(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食道癌、Barretts食道癌、成胶质细胞瘤、软组织的透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症(gynacomastica)、横纹肌肉瘤和子宫内膜异位症)。
可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干粉剂、膏剂、水溶液剂、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman等人,Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等人,(编著),Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；Lieberman等人,(编著),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY,1990；Lieberman等人,(编著)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,2000)。
在一个具体实施方案中，本发明的抗体药物缀合物的临床使用形式(CSF)是小瓶中含有ADC、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20的冷冻干燥物。冷冻干燥物可以用注射用水重构，溶液包含ADC、琥珀酸钠、蔗糖和聚山梨醇酯20，pH约5.0。为了随后静脉内施用，将获得的溶液通常进一步稀释于载体溶液中。
为治疗剂选择施用方案取决于几种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的靶细胞可及性。在某些实施方案中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于具体实体和正在治疗的病状的严重程度。选择适宜剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见，例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios ScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编著),Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(编著),Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等人,New Engl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等人,New Engl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等人,New Engl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.343:1594-1602,2000)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的的参数或因素确定适宜的剂量。通常，剂量始于或多或少小于最佳剂量的量并此后将它以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所需的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以变动活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而以获得活性成分的量，其中对于特定患者、组合物和施用模型，所述的量有效实现所需的治疗反应，同时对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域已知的因素。
可以通过连续输注或通过以例如1日、1周或每周1-7次，每隔一周1次、每三周1次、每四周1次、每五周1次、每六周1次、每七周1次或每八周1次的时间间隔，提供本发明的包含抗体或其片段的组合物。可以静脉内、皮下、局部、经口、经鼻、直肠、肌内、脑内、或通过吸入提供剂量。特定剂量方案是一个涉及最大剂量或给药频率的方案，其避免明显不希望的副作用。
对于本发明的免疫缀合物，施用至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。该剂量可以在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计待施用的剂量，计算本发明的抗体或其片段的剂量。
可以重复本发明的免疫缀合物的剂量并且各施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3个月或至少6个月。在一个具体实施方案中，每3周重复本发明免疫缀合物的剂量。
特定患者的有效量可以根据多种因素变动，如正在治疗的病状、患者的总体健康、施用方法、途径和剂量和副作用的严重程度(参见，例如，Maynard等人,A Handbook ofSOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,2001)。
施用途径可以是通过例如局部或皮肤应用、通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内注射或输注或通过缓释系统或植入物(参见例如，Sidman等人,Biopolymers 22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包含增溶剂或用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因或两者。此外，也可以利用肺部施用法，例如，通过使用吸入器或雾化器和具有雾化剂的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，每份专利通过引用方式完整并入本文。
也可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用本发明的组合物。如技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变动。选择用于本发明的免疫缀合物的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括，而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，本发明的组合物可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。在一个实施方案中，通过输注法施用本发明的免疫缀合物。在另一个实施方案中，皮下施用本发明的免疫缀合物。
如果本发明的免疫缀合物在控释或缓释系统中施用，泵可以用来实现控释或缓释(参见Langer，上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14:20,1987；Buchwald等人,Surgery 88:507,1980；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。聚合材料可以用来实现本发明的治疗剂的控释或缓释(参见例如，Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编著),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.,1974；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编著),Wiley,New York,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；还参见Levy等人,Science 228:190,1985；During等人,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等人,J.Neurosurg.71:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质、储存时稳定、无菌并且是生物可降解的。可以将控释或持续释放系统靠近预防靶或治疗靶布置，因此仅需要全身性剂量的一部分(见，例如，Goodson,引自Medical Applications of Controlled Release,上文,第2卷,第15-138页,1984)。
控释系统在Langer,Science 249:1527-1533,1990的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可以用来产生包含本发明的一种或多种免疫缀合物的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO 91/05548，PCT公开WO 96/20698，Ning等人,Radiotherapy&Oncology39:179-189,1996；Song等人,PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397,1995；Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,1997，所述的每篇文献通过引用方式完整并入本文。
如果局部施用本发明免疫缀合物，则可以将它们按油膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶剂、溶液剂、乳剂的形式或本领域技术人员熟知的其他形式配制。见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷雾局部用剂型，一般使用包含载体或一种或多种赋形剂的粘稠至半固体或固体形式，其与局部施加相容并在一些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括而不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、油膏剂、粉剂、搽剂、药膏剂等，如果需要，它们进行消毒或与影响多种特性(例如，渗透压)的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其他合适的局部用剂型包括可喷雾气溶胶制品，其中与固体或液体惰性载体组合的活性成分在一些情况下包装在具有加压的挥发性物质(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物中或挤瓶中。如果需要，也可以将润湿剂或湿润剂添加至药物组合物和剂型。这类额外成分的例子是本领域熟知的。
如果鼻内施用包含免疫缀合物的组合物，则可以将它以气溶胶剂、喷雾剂、雾化剂形式或以滴剂形式配制。具体而言，根据本发明使用的预防剂或治疗剂可以在使用合适推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)的情况下，以从加压的包装或雾化器中提供的气溶胶喷雾剂形式便利地递送。在加压气溶胶剂的情况下，可以通过提供递送计量数量的阀确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊剂和套筒剂(cartridge)(由例如明胶组成)，其含有所述化合物及合适粉剂基料(powder base)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
以第二治疗剂例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或辐射共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如，Hardman等人,(编著)(2001)Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,第10增补版,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole和Peterson(编著)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:APractical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编著)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可以减少症状至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％或至少50％。
可以与本发明的免疫缀合物组合施用的额外治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)，可以按照与本发明的免疫缀合物间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时，按间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时、或间隔96小时至120小时施用。可以在一个相同的患者就诊内施用两种或更多种治疗剂。
在某些实施方案中，可以配制本发明的免疫缀合物以确保正确的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)；可以将它们例如配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中的部分，因而增强靶向的药物递送(参见，例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白质A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134；p120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本发明提供向有需求的对象单独或与其他疗法组合下施用包含本发明的免疫缀合物的药物组合物的方案。本发明的联合疗法的治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)可以同时或依次向对象施用。本发明的联合疗法的治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)也可以是循环施用的。循环治疗涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间并重复这种依次施用，即，该循环，以减少对一种治疗剂(例如药物)的抗性形成，以避免或减少一种治疗剂(例如药物)的副作用和/或以改善疗法的效力。
本发明联合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以同时施用至对象。
术语“同时”不限于在完全相同的时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将本发明的包含抗体或其片段的药物组合物以这样的顺序并在这样的时间间隔内部施用至对象，从而本发明的抗体可以与其他疗法一起发挥作用，以提供与另外施加它们相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何顺序依次在不同的时间点施用至对象；然而，如果不在相同的时间施用，则它们应当在时间上充分接近地施用，从而以提供所需的治疗作用或预防作用。可以将每种疗法以任何适宜的形成和通过任何合适的途径分别施用至对象。在多个实施方案中，将疗法(例如，预防剂或治疗剂)相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、48小时、72小时或1周施用至对象。在其他实施方案中，将两种或更多种治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)在相同的患者就诊内施用。
联合疗法的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中施用至对象。备选地，联合疗法的预防剂或治疗剂可以在分立的药物组合物中同时施用至对象。预防剂或治疗剂可以通过相同或不同施用途径施用至对象。
实施例
以下实施例和中间物在不限制本发明范围的情况下起到示例本发明的作用。
实施例1：筛选抗FGFR2/4抗体
细胞系
Ba/F3细胞购自DSMZ、KatoIII、SNU16、SNU5并且HCI-H716细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATC)并且NUGC3细胞从日本研究用生物资源保藏中心(JCRB)细胞库获得。全部细胞系如它们的相应供应商所推荐均在补充有胎牛血清(FBS)的适宜生长培养基中常规培养。
重组人、食蟹猴、小鼠和大鼠FGFR载体的产生
基于来自GenBank或Uniprot数据库的氨基酸序列，将人、小鼠和大鼠FGFR胞外结构域进行基因合成(参见表2)。基于使用来自各种食蟹猴组织的mRNA所生成的氨基酸序列信息，将食蟹猴FGFR2和FGFR4ECD cDNA模板进行基因合成(例如Zyagen Laboratories；表3)。将全部合成的DNA片段克隆至带有C末端标签以允许纯化的适宜表达载体中，例如基于CMV的载体或pCDNATM3.1。
表2：FGFR表达载体的产生。氨基酸编号基于本表中提供的登录号或seq ID
表3:食蟹猴FGFR2和FGFR4蛋白的序列
重组FGFR蛋白的表达
在HEK293衍生细胞系(293T)中表达所需的FGFR重组蛋白，所述细胞系事先被改造适应于悬浮培养并且在无血清培养基、无L-谷氨酰胺(HyCloneTM)的50％HyCloneTMSFM4Transfx-293和50％FreeStyle-293()的混合物中培育。小规模和大规模蛋白质生产均通过瞬时转染进行并且在各自至多1L的多个摇瓶中实施()，以聚乙烯亚胺(PEI，25K，)作为质粒载体。当生物素酰化的蛋白质待借助C末端Avi标签表达时，将携带BirA酶基因的质粒相对于ECD蛋白质质粒按1:2纳入。总DNA和聚乙烯亚胺按1:3(w:w)比例使用。DNA对培养物比率是1mg/L。转染后6天，将细胞培养上清液收获、离心并在纯化之前无菌过滤。
加标签的蛋白质纯化
通过收集细胞培养上清液，纯化重组加标签的FGFR2和FGFR4ECD蛋白(例如，APP-FGFR2和APP-FGFR4ECD)。通过将抗APP单克隆抗体按每mL树脂10mg抗体的最终比例与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联，制备抗APP柱。将表达上清液以流速1-2mL/分钟或通过重力流施加至抗APP柱。在用PBS基线洗涤后，将结合的材料用100mM甘氨酸(pH2.7)洗脱并且立即对PBS透析过夜并且随后无菌过滤。通过测量280nm处的吸光度并使用基于各个蛋白质的氨基酸序列所计算的蛋白质消光系数换算，确定蛋白质浓度。随后通过SDS-PAGE、分析性大小排阻色谱(HPLC-SEC)表征纯化的蛋白质。对于亲和纯化的制备物中具有大于>10％聚集物的那些蛋白质，进行第二步骤SEC纯化，接着进行证实表征。
Ba/F3FGFR2细胞系的产生
为了产生这些细胞，将人FRGR2-IIIb-C3(NM_022970)克隆至pENTRTM 载体(Invitrogen目录号K2400-20)中并且随后克隆至处于CMV启动子控制下的pLenti6DES载体(Invitrogen目录号V49610)。随后包装出病毒，并将Ba/F3细胞(DSMZ目录号ACC)用慢病毒离心感染，随后用20μg杀稻瘟素(例如Invitrogen，目录号A11139-03或目录号30-100-RB)处理并以IL3(R&D systems目录号403-ml-010)在37℃和5％CO2在组织培养箱中选择5天。随后将存活的细胞在补充有10％FBS(Clontech目录号631101)、2μg/ml肝素(Sigma，目录号H3149)和20μg/ml杀稻瘟素(例如Invitrogen，目录号A11139-03或目录号30-100-RB))、但不含IL3的培养基(RPMI(Invitrogen目录号11875-093)中培育1个月。随后将存活的细胞稀释克隆以产生随后用于后续研究的克隆性细胞群体。
HuCAL 淘选
为了选择识别人FGFR2的抗体，利用多种淘选策略。使用市售噬菌体展示文库Morphosys HuCAL文库作为抗体变体蛋白的来源，通过选择与FGFR2结合的克隆，产生了针对人FGFR蛋白的治疗性抗体。该噬菌粒文库基于概念(Knappik等人,2000,J Mol Biol 296:57-86)并利用在噬菌体表面上展示Fab的CysDisplayTM技术(WO 01/05950)。
为了分离抗FGFR2抗体，利用固相、溶液、完整细胞和差异性完整细胞方案，使用几种不同淘选策略。
对重组FGFR2的固相淘选
在抗原选择过程之前，进行包被检验ELISA以确定抗原的最佳包被浓度。通过在MaxisorpTM平板()上包被或者通过被动吸附或通过靶向抗原上相应标签的捕获抗体，在固相淘选方案中使用具有各种标签的不同重组FGFR2蛋白。备选地，Reacti-BindTM中性抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯板条(Pierce)用来捕获生物素酰化的FGFR2抗原。将96孔MaxisorpTM平板()的适宜数目(取决于子文库汇集物的数目)的孔在4℃用抗原包被过夜。包被的孔用PBS(磷酸缓冲盐溶液)/5％乳粉封闭。对于每次淘选，封闭约HuCAL噬菌体-抗体。在封闭操作后，将预封闭的噬菌体混合物添加至抗原包被和封闭的每个孔并且在室温(RT)在微量滴定板(MTP)摇床上温育2小时(h)。此后，通过几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体。为了洗脱特异性结合的噬菌体，添加25mM DTT(二硫苏糖醇)在室温持续10分钟(min)。DTT洗脱物用于感染大肠杆菌(Escherichiacoli)TG-1细胞。感染后，将细菌铺种在LB(溶源性培养液)/Cam(氯霉素)琼脂平板上并在30℃温育过夜。将菌落从平板刮下并用于噬菌体拯救、多克隆扩增选择的克隆和噬菌体产生。每种FGFR2固相淘选策略包含于独立的淘选轮次并且含有独特的抗原、抗原浓度、缓冲液组成和洗涤严格性。
用链霉亲和素-偶联的磁珠对重组FGFR2进行的溶液淘选
溶液淘选方案的前提是抗原的生物素酰化和证实生物素酰化抗原保留活性。在溶液淘选期间，将展示Fab的噬菌体和生物素酰化抗原在促进噬菌体接近抗原的溶液中温育。
对于每种噬菌体汇集物，将链霉亲和素珠(M-280链霉亲和素；Invitrogen)在1x ChemiblockerTM中封闭。同时，对于每种淘选，将大约HuCAL噬菌体-抗体用等体积的2xChemiblockerTM/0.1％Tween 20封闭。随后，将某个浓度的生物素酰化抗原(例如100nM)添加至预吸附且封闭的噬菌体粒子并且在室温在摇床上温育1-2小时。使用封闭的链霉亲和素珠，捕获噬菌体-抗原复合物并用磁分离器收集与链霉亲和素珠结合的噬菌体粒子。通过几个洗涤步骤洗去非特异性结合的噬菌体。为了从链霉亲和素珠洗脱特异性结合的噬菌体，添加25mMDT在室温持续10分钟。如对固相淘选所述那样处理DTT洗脱物。
每种FGFR2溶液淘选策略包含于独立的淘选轮次并且含有独特的抗原、抗原浓度和洗涤严格性。
对过量表达FGFR2的细胞的完整细胞淘选
对于每种细胞淘选，在PBS/FCS中预封闭HuCAL噬菌体-抗体。同时，在冰上于PBS/FCS中重悬每种噬菌体汇集物0.5-1.0x 107个显示过量表达FGFR2的靶细胞(用FGFR2、Kato-III、SNU16、H716稳定转染的Ba/F3细胞)。
将封闭的靶细胞离心、重悬于预封闭的噬菌体粒子中并在4℃在摇床上温育2小时。在PBS/FCS中洗涤噬菌体-细胞复合物。通过用甘氨酸缓冲液pH 2.2进行酸性洗脱，从靶细胞洗脱特异性结合的噬菌体。在离心后，通过添加缓冲的Tris，中和上清液(洗脱物)。含有噬菌体的最终上清液用于感染大肠杆菌TG1培养物。以下步骤如“固相淘选”节下所述那样进行。
更详细地，进行完整细胞淘选，其中用细胞进行每个淘选轮次，或备选地，进行差异性完整细胞淘选，这意指在连续淘选轮次中使用细胞或重组蛋白。如对固相或溶液淘选所述那样在重组抗原上进行选择轮次。
成熟淘选
为了获得亲和力增加的FGFR2特异性抗体，进行成熟淘选(Prassler等人,2009,Immunotherapy,1:571-583)。为此目的，如上文所述，用不同的FGFR2抗原进行标准淘选(固相和溶液相淘选)。
在淘选后，噬菌体衍生的载体DNA的Fab编码片段用不同的特异性限制性酶消化以产生LCDR3或HCDR2成熟的文库。使用TRIMTM技术(Virnekas等人,NucleicAcids Research 22:5600-5607)，更换插入物。
将生成的文库扩增并经历洗涤严格性增加和抗原浓度减少的另外两个淘选轮次。
亚克隆和微量表达选择的Fab片段
为了促进可溶性Fab的快速表达，将选择的HuCAL噬菌体的编码Fab的插入物从30展示载体亚克隆入x11表达载体x11_FH中。
在转化大肠杆菌TG1-F-单个克隆后，含有-Fab片段的周质提取物的表达和制备如先前所描述进行(Rauchenberger等人,2003J Biol Chem 269:24870-24877)。
ELISA筛选
使用ELISA筛选，从淘选输出结果鉴定单个Fab克隆以便与靶抗原结合。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab。
将MaxisorpTM()384孔平板用PBS中的FGFR目的抗原(通过被动吸附或通过靶向抗原上相应标签的捕获抗体)以其先前确定的饱和浓度包被。备选地，Reacti-BindTM中性抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯板条(Pierce)用来捕获生物素酰化的FGFR2抗原。
用PBS中的5％脱脂乳粉封闭平板后，添加含有Fab的大肠杆菌裂解物。使用Atto荧光底物(Roche，目录号11681982001)，通过与碱性磷酸酶缀合的F(ab)2特异性山羊抗人IgG(1:5000稀释)检测Fab的结合。记录在535nm的荧光发射，在430nm激发。
FACS筛选(荧光激活的细胞分选法)
在FACS筛选时，从淘选输出结果鉴定与细胞表面表达的抗原结合的单个Fab克隆。使用含有Fab的粗制大肠杆菌裂解物测试Fab的细胞结合作用。
在这些研究中，将100μl细胞悬液转移入一块新的96孔板(产生1x105个细胞/孔)。将含有靶细胞悬液的平板离心并且抛弃上清液。重悬剩余的细胞沉淀物并且将50μl含有Fab的细菌提取物添加至相应的孔。
备选地，重悬细胞沉淀物并将50μl FACS缓冲液(PBS，3％FCS)和相同体积含有Fab的细菌提取物添加入相应的孔。
随后将细胞-抗体悬液在冰上温育1小时。在温育后，将细胞离心并用200μl FACS缓冲液洗涤3次。在每个洗涤步骤后，将细胞离心并小心地重悬。
添加第二检测抗体(PE缀合的山羊抗人IgG；Dianova)并且将样品在冰上温育并随后根据Fab温育洗涤。在FACSArrayTM仪中确定荧光强度。
Fab片段的表达和纯化
在大肠杆菌TG1F-细胞中进行Fab片段的表达。将培养物在30℃振摇18小时。收获细胞并使用溶菌酶和Bug蛋白质提取试剂(Novagen，德国)的组合破碎之。借助IMAC(德国)分离加His6标签的Fab片段并通过UV-分光光度法确定蛋白质浓度。在变性、还原型15％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)中分析代表性选择的样品的纯度。
在天然状态下通过大小排阻层析(HP-SEC)以校正标准品确定Fab制备物的均匀性。
转换成IgG和IgG表达
为了表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆入用于人IgG1的适宜_hIg载体中。备选地，将真核HKB11细胞用4表达载体DNA转染。转染后3天或7天收获细胞培养上清液。在无菌过滤后，使用液体处理站，使溶液经受蛋白A亲和层析(MabSelect SURETM，GE Healthcare)。若非另外说明，则将缓冲液交换成1x Dulbecco PBS(pH 7.2，Invitrogen)并将样品无菌过滤(0.2μm孔径)。通过UV-分光光度法确定蛋白质浓度并且在变性、还原条件下使用卡尺Caliper系统或在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分析IgG纯度。
生物测定法
在下文例举的测定法中评价遵循上文所述淘选获得的抗FGFR抗体：
BaF3/CMV-FGFRIIIB-C3细胞增殖测定法
为了确定抗FGFR2抗体抑制FGF1依赖性细胞增殖的能力，使用工程化Ba/F3细胞系(BaF3/CMV-FGFRIIIB-C3)进行增殖测定法，所述细胞系用全长FGFR2IIIb受体ECD和携带各自激酶结构域的FGFR1胞内结构域嵌合体稳定转导。添加人FGF1在这个细胞系中促进细胞增殖。
将细胞重悬于全生长培养基(RPMI+10％FCS+30ng/ml FGF1+2μg/ml肝素+20μg/ml杀稻瘟素)中并以细胞密度8x 103个细胞/孔按80μl接种至平底白色96孔分析平板(CorningCostar，#3903)中并且在37℃和5％CO2温育过夜。
次日，将抗体(Fab或IgG)在全生长培养基中稀释至所需的浓度(5倍浓缩)。添加20μl抗体溶液至前一日接种的细胞并将细胞培育72小时。在72小时后，将100μlCell Titer-GloTM发光细胞生存力分析试剂(#G7571；Promega)添加至每个孔并在室温略微振摇下温育15分钟，接着在照度计(GeniosPro，Tecan)中读出发光。为了确定最大半数抑制浓度(IC50值)，进行Fab/IgG滴定并使用GraphPad Prism计算IC50。
为了评价IgG的潜在激动活性，如通过抗体在不存在外源FGF1情况下促进工程化BaF/3细胞增殖的能力所测定，将该细胞和IgG稀释于稀释培养基(不含FGF1的全生长培养基)中。细胞接种和添加IgG在同一日进行。
亲和力测定
对于KD测定，使用抗体蛋白的单体级分(至少90％单体含量，通过分析性SEC分析；对于Fab，用SuperdexTM75(Amersham Pharmacia)分析，或对IgG，用Tosoh G3000SWXL(TosohBioscience)分析)。(a)使用成像仪6000(Mesoscale)，用于KD测定的溶液平衡滴定(SET)法
溶液中的亲和力测定基本上如文献(Friguet等人,1985J Immunol Methods 77:305-319)中所述进行。为了改善SET法的灵敏度和准确度，将它从经典ELISA转移至基于ECL的技术(Haenel等人,2005Anal Biochem 339:182-184)。_IgG的KD测定如所述那样使用以下试剂进行：将生物素酰化的hFGFR2按PBS中的0.5μg/ml在4℃在标准MS平板上包被过夜。
在洗涤MSD平板并添加30μl/孔含表面活性剂的MSD读数缓冲液T后，使用成像仪6000(MesoScaleGaithersburg,MD,美国)检测电化学发光信号。
采用定制的拟合模型，用XLfitTM(IDBS)软件评价数据。对于Fab分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据(Haenel等人,2005Anal Biochem339:182-184)：
[Fab]t：施加的总Fab浓度
x：施加的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时Fab的最大信号
KD：亲和力。
对于IgG分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据Piehler等人,1997J ImmunolMethods 201:189-206修改)并且图1中展示数据总结：
[IgG]：施加的总IgG浓度
x：施加的可溶性抗原总浓度(结合位点)
Bmax：无抗原时IgG的最大信号
KD：亲和力。
淘选策略和筛选的总结
总体上，使用重组抗原材料以及如上文概述的细胞系，使用了28种不同的淘选策略。使用上文描述的测定法，对淘选输出结果筛选特异性和交叉反应性，并且选出935个克隆进行测序。在描述的筛选过程之后，选择15种抗体以便如以下实施例中所述进一步表征。这些抗体当中，发现12433、12947、10846和12931与FGFR2IIIb同种型(Uniprot登录号P21802-3)结合，发现10164、11725、10220、11723和12944与人FGFR2IIIb(Uniprot登录号#P21802-3)和IIIc同种型(Uniprot登录号#P21802-1)同时结合，并且发现12425、12422、12439、10918、10923和11722与人FGFR2IIIb(Uniprot登录号#P21802-3)和IIIc同种型(Uniprot登录号#P21802-1)同时结合并且还与人FGFR4(Uniprot登录号#P22455)结合。
实施例2：亲和力确定
使用T100仪(GE Systems)及采用CM5传感芯片，使用技术测定抗体对FGFR2物种直向同源物的亲和力及还对FGFR4的亲和力。
简而言之，使用补充有0.5mg/ml BSA和10μg/ml肝素的Hb-EP(0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P2)作为全部实验的运行缓冲液。通过响应单位(RU)计量固定化水平和分析物相互作用。进行预试以检验和证实固定抗人Fc抗体及捕获试验抗体的可行性。
对于动力学测量，进行实验，其中将抗体固定至传感芯片表面并且测定表1中列出的上文所述FGFR蛋白在自由溶液中结合的能力。简而言之，在全部4个流动小室上通过胺偶联法以流速10μl/分钟，将50μg/ml抗人Fc抗体在pH 4.75固定在CM5传感芯片上以实现600RU。随后以10μl/分钟注射3μg/ml试验抗体10秒。通常保持抗体的固定水平低于250RU。随后，按照2倍系列稀释的0.078-100nM FGFR受体以流速80μl/分钟在参比流动小室和检验流动小室上注射7分钟。使用补充有0.5mg/ml BSA和10μg/ml肝素的HBS-EP+作为运行缓冲液，跟踪结合作用的解离10分钟。在每个注射循环后，将芯片表面用10mM甘氨酸pH 2.0以60μl/分钟再生70秒。全部实验均在25℃进行并且响应数据总体上用简单1:1相互作用模型拟合(使用评价软件版本1.1(GE Systems))以获得结合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和力(KD)的估计值。
表4中呈献针对FGFR2IIIb物种直向同源物和FGFR4获得的亲和力估计值的总结。发现全部抗体均与评价的FGFR2物种直向同源物结合并且一部分抗体还与人FGFR4结合。此外，一些抗体(10846、12433、12931和12947)不能与人FGFR2的IIIc同种型(Uniprot登录号#P21802)结合。全部抗体均对FGFR2特异或与FGFR2和FGFR4同时结合，并且没有发现抗体明显地与FGFR1或FGFR3结合。
表4.针对FGFR2IIIb物种直向同源物和FGFR4获得的亲和力评估值
实施例3：评定抗FGFR抗体的功能活性
使用Baf细胞系统评价纯化抗体充当FGFR2激动剂或拮抗剂的能力，其中Baf细胞经转导以过量表达FGFR2。
为了评价抗体的潜在激动特性，将Baf-FGFR2细胞在PBS中洗涤2次并重悬于稀释培养基(补充有10％FBS、2μg/ml肝素(Sigma，目录号H3149)和20μg/ml杀稻瘟素(例如Invitrogen，目录号A11139-03或目录号30-100-RB)的RPMI中，之后在90μl稀释培养基中以8000个细胞/孔接种于96孔平板(Costar目录号3904)中。在每种测定法中，将一块平板命名为“第0日”平板：向这些平板的每个孔，添加额外的10μl稀释培养基，接着添加80μl/孔细胞滴定试剂(Promega#G7573)。将分析平板温和振摇10分钟并且使用Perkin Elmer2101平板读数仪，测量所产生的发光强度。为每种抗体制备连续稀释物作为稀释培养基中的10X溶液，并且将10μl添加至适宜的孔。除试验抗体之外，包含FGF1(Peprotech，目录号100-17A；分析终浓度0-30nM)、一种市售抗FGFR2抗体(R&Dsystems，目录号MAB6841)和一种不结合FGFR2的抗体作为对照试剂。将分析平板在37℃，5％CO2温育3天。在这种温育后，使平板达到室温持续约30分钟并且添加80μl/孔细胞滴定试剂(Promega#G7573)。随后将平板温和振摇10分钟并且使用Perkin Elmer2101平板读数仪，测量所产生的发光强度。为了确定抗体对细胞增殖的影响，将原始发光值在各重复间平均化并且与第0日对照比较。在这些研究中未评价10846、11725和12439，不过测试的其他抗体均不能够替代FGF1及维持细胞生长。图2(A)/(B)中展示数据总结。
Baf细胞系统还用来评估抗体充当FGFR2受体信号传导的拮抗剂的潜力。在这些研究中，Baf-FGFR2细胞如以上激动作用研究中所述铺种，同时添加30μg/ml FGF1(Peprotech，目录号100-17A)至稀释培养基。为每种抗体制备连续稀释物作为含30μg/mlFGF1的稀释培养基中的4X溶液，并且添加25μl至适宜的孔。除试验抗体之外，包括一种市售抗FGFR2抗体(R&D systems，目录号MAB6841)和一种不结合FGFR2的抗体作为对照试剂。将分析平板在37℃，5％CO2温育3天。在这种温育后，使平板达到室温持续约30分钟并且添加80μl/孔细胞滴定试剂(Promega#G7573)。随后将平板温和振摇10分钟并且使用Perkin Elmer2101平板读数仪，测量所产生的发光强度。为了确定抗体对相对细胞增殖的影响，将原始发光值在各重复间平均化并比较。在这些研究中未评价10846、11725和12439。测试的其他抗体的影响在图3(A)/(B)中展示，并且显示，评价的克隆当中，10918、10923、12931、12944、12947和12422在小于100nM的浓度抑制工程化Baf细胞的增殖超过50％。
实施例4：ADC的制备
通过单步骤法制备DM1缀合物
在开始缀合反应之前，将抗体12425借助切线流过滤(TFF#1)渗滤到反应缓冲液(15mM磷酸钾，2mM EDTA，pH 7.6)中。随后，将抗体12425(5.0mg/mL)与DM1(相对抗体数量，5.6倍摩尔过量)混合并且随后与SMCC(相对抗体数量，4.7倍摩尔过量)混合。反应在20℃在含有2mM EDTA和10％DMA的15mM磷酸钾缓冲液(pH 7.6)中进行大约16小时。通过添加1M乙酸以调节pH至5.50，使反应猝灭。在pH调整后，将反应混合物通过一个多层(0.45/0.22μm)PVDF滤器过滤并且使用切线流过滤(TFF#2)，纯化及渗滤到含有8.22％蔗糖的20mM琥珀酸盐缓冲液(pH 5.0)中。下表5中列出用于切线流过滤的仪器参数。
表5.用于切线流过滤的仪器参数
通过以下方式分析从上文所述方法获得的缀合物：用于细胞毒性剂载量(类美登素对抗体比率，MAR)的UV光谱法；用于测定缀合物单体的SEC-HPLC；用于游离类美登素百分数的反相HPLC或疏水性屏蔽相(Hisep)-HPLC。表6中显示数据。
表6.12425-MCC-DM1的特性
通过原位法制备DM1缀合物
也可以通过原位法根据以下程序制备本发明的缀合物。使用磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)接头，将抗体(21个克隆)与DM1缀合。在DMA中制备DM1和磺基-SMCC异双官能接头的母液。将磺基-SMCC和DM1硫醇混合在一起，以在25℃在含有40％v/v 50mM琥珀酸酯水性缓冲液、2mM EDTA，pH 5.0的DMA中按DM1对接头比率1.3:1摩尔当量和DM1终浓度1.95mM反应10分钟。随后抗体与反应物的等分试样反应，以在50mMEPPS，pH 8.0和10％DMA(v/v)中2.5mg/mL抗体的最终缀合条件下产生SMCC对抗体摩尔当量比率约6.5:1。在25℃大约18小时后，使用SEPHADEXTMG25柱纯化缀合反应混合物，其中所述柱用10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween 20，pH 5.5平衡。
表7.DM1缀合的抗体的特性
用SPDB接头制备ADC
在25℃在含有50mM NaCl、2mM EDTA和5％DMA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，将抗体12422、12425和12433(8mg/ml)用N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB，分别5.0倍、5.5倍和4.9倍摩尔过量)修饰120分钟。随后在25℃在含有50mM NaCl、2mM EDTA和5％DMA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，将修饰的Ab在不纯化的情况下以修饰的抗体最终浓度4mg/mL与DM4(相对未结合的接头1.7倍摩尔过量)缀合18小时。使用SEPHADEXTMG25柱纯化缀合反应混合物，其中所述柱用10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween20，pH 5.5平衡并洗脱。
表8.DM4缀合的抗体的特性
用CX1-1接头制备ADC
将抗体12425(5.0mg/mL)与DM1(相对于抗体数量，7.15倍摩尔过量)混合并且随后与CX1-1(相对于抗体数量，5.5倍摩尔过量)混合。反应在25℃在含有2mM EDTA和5％DMA的60mM EPPS[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸]缓冲液(pH 8.5)中进行大约16小时。随后使用SEPHADEXTMG25柱纯化反应混合物，其中所述柱在10mM琥珀酸酯，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％Tween 20，pH 5.5中平衡并洗脱。
表9.CX1-1/DM1缀合的12425的特性
实施例5：ADC相对于亲本抗体的亲和力
使用技术，使用T100仪器(GE Systems)和CM5传感芯片，使用与以上实施例2中所述相似的方法学，测定与SMCC-DM1缀合后抗体对FGFR2和FGFR4的亲和力。
就所评估的抗体而言，相对于未缀合的亲本抗体，对SMCC-DM1缀合抗体获得了与人FGFR2IIIb结合的相似亲和力估计值，显示缀合并未明显影响抗体结合作用(表10)。
表10.未缀合的抗体和SMCC-DM1缀合的抗体的亲和力评估值
N.D.＝未测定
此外，测定了几种SMCC-DM1缀合的抗体对FGFR2和FGFR4种直向同源物的亲和力。在这些研究中，在缀合的抗体和未缀合的抗体之间未发现可察觉的亲和力差异(表11)。
表11.SMCC-DM1缀合的抗体对FGFR2和FGFR4种直向同源物的亲和力
N.D.＝未确定的
实施例6：ADC在SNU16和Kato-III细胞中的体外活性
与SMCC-DM1接头-有效负载缀合之后，测定抗体药物缀合物(ADC)抑制FGFR2扩增的细胞系SNU16(ATC目录号CR-5974)和Kato-III(ATC目录号HTB-103)增殖的能力。简而言之，将细胞在组织培养箱中在37℃，5％CO2在如供应商推荐的培养基中培养。在分析当日，将细胞用PBS洗涤2次(Lonza，目录号17516C)，之后用0.25％胰蛋白酶-EDTA(目录号25300)处理5分钟并且重悬在推荐的培养基中。随后将细胞计数并在100μl细胞培养基中以密度2600-3600个细胞/孔接种在96孔平板(Costar目录号3940或Corning目录号3340)中。产生一块重复平板用于第0日测量并且将全部平板在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育过夜。还产生仅含培养基的孔以充当阴性对照。在这种温育之后，将50μl/孔细胞滴定试剂(Promega目录号G7573)添加至第0日平板，随后温和振摇所述平板10分钟，并且使用Perkin Elmer2101平板读数仪，测量所产生的发光强度。将试验ADC在适宜的细胞培养基中一式两份连续稀释至2X母液，并且从每块剩余测试平板移除50μl培养基后，添加50μl 2X连续稀释的ADC(分析终浓度0.2-50nM DM1当量)，之后在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育5天。在这个温育时间之后，通过添加如上文所述的细胞滴定试剂测定相对细胞生存力。使用重复平板的平均数如下计算ADC对细胞增殖的影响：
抑制％＝(ADC处理-未处理)/(未处理–第0日)*100。
将抑制％数据对4-参数对数方程拟合并测定IC50值。不同于IgG对照ADC，发现测试的ADC是Kato-III和SNU16细胞增殖的强力抑制剂，IC50小于3nM(表12:)。
表12.作为MCC-DM1ADC时的抗体效力
还评价了借助SPDB-DM4接头-有效负载缀合的几种抗FGFR抗体的能力。如上文所述实施的这些研究揭示，评价的抗体还如SPDB-DM4ADC那样是细胞增殖的强力抑制剂，从而显示它们成功递送有效负载以杀伤细胞的能力不限于MCC-DM1。SNU16细胞系的数据汇总于表13中。
表13.作为SPDB-DM4ADC时的抗体效力
实施例7：评定抗FGFR2/4ADC的体内活性
在胃部、FGFR2扩增(CN＝31)、表达FGFR2IIIb同种型的SNU16异体移植肿瘤模型中评价了15种抗FGFR2或抗FGFR2/FGFR4交叉反应性ADC的抗肿瘤活性。在两项独立研究中，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后8天在平均肿瘤体积为192.9mm3时，小鼠入选于第一研究中。在随机分配到9个组之一(n＝8只/组)后，对小鼠施用PBS或以下抗体药物缀合物之一的单次3mg/kg静脉内(i.v.)注射：12433-MCC-DM1、10164-MCC-DM1、10220-MCC-DM1、10918-MCC-DM1、10923-MCC-DM1、11722-MCC-DM1、12422-MCC-DM1或12425-MCC-DM1。植入后7天在平均肿瘤体积为223.4mm3时，小鼠入选于第二研究中。在随机分配到9个组之一(n＝8只/组)后，对小鼠施用PBS或以下抗体药物缀合物之一的单次3mg/kg静脉内注射：12433-MCC-DM1、12947-MCC-DM1、12931-MCC-DM1、12944-MCC-DM1、12439-MCC-DM1、10846-MCC-DM1、11725-MCC-DM1或11723-MCC-DM1。纳入12433-MCC-DM1作为两项研究之间的联系以促进直接比较两项研究中的抗体药物缀合物。每周2次卡尺测量肿瘤。给药后23天至24天，这些研究中所评价的ADC显示出广谱抗肿瘤活性(范围从33.2％T/C至77.8％消退)(图4(A)和(B))。
在SNU16异体移植肿瘤模型中评价了基于可切割性二硫键接头的SPDB-DM4FGFR2ADC的抗肿瘤活性。在这些研究中，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后11天在平均肿瘤体积为223mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到5个组之一(n＝7/组)后，对小鼠施用PBS(10ml/kg)、12433-MCC-DM1或对照IgG-MCC-DM1单次15mg/kg静脉内注射或12433-SPDB-DM4或IgG-SPDB-DM4单次5mg/kg静脉内注射。每周2次卡尺测量肿瘤。在这项研究中对照ADC均未显示出抗肿瘤活性(图4(C))。然而，与之相反，12433-MCC-DM1和12433-SPDB-DM4均在施用的剂量针对SNU16异体移植模型具有高度活性，显示抗FGFR ADC的抗肿瘤作用可以用不同接头获得。
在SNU16带瘤小鼠中单次IV给药3mg/kg后评价抗FGFR ADC的药代动力学(PK)。在给药后1小时、24小时、72小时、168小时和336小时采集PK样品。在全部研究中，使用经验证的ELISA方法测量在全部动物物种中“总”抗体和“抗体药物缀合物(ADC)”的血清浓度。“总”分数指在具有或没有缀合的DM1情况下抗体的量值，而ADC分数指仅DM1缀合的抗体的量值(≥1个DM1分子)。在全部研究中，未观察到ADC分数和总抗体分数的清除之间可察觉的差异。图4(D)–(E)中展示ADC的PK特性总结。当携带SNU16肿瘤的小鼠中单次3mg/kg剂量后的ADC清除率与观察到的抗肿瘤作用比较时，发现具有最大抗肿瘤活性(>40％肿瘤消退)的ADC都以小于45ml/d/kg的速率被清除(图4(F))。
实施例8：使用FGFR2扩增的细胞系体外评定未缀合的抗体和缀合的抗体的信号传导活性
在FGFR2扩增的细胞系中评价了未缀合和SMCC-DM1缀合的抗FGFR2抗体调节FGFR信号传导的能力。在初始研究中，确定12433、12425和10164抗体在SNU16(ATC目录号CR-5974)细胞中的影响。简而言之，将细胞接种在12孔CellBindTM平板(Costar目录号3336)中补充有10％FBS的RPMI内并在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育过夜。在实验当日，将细胞培养基吸出并以试验抗体或小分子FGFR抑制剂BGJ398更换，所述试验抗体或BGJ398均以终浓度(13-130nM，抗体/ADC；500nM，BGJ398)稀释于补充有10％FBS的RPMI中。随后将细胞在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育2小时。在这个温育之后，将细胞用冷PBS(Lonza，目录号17516C)洗涤两次，置于冰上，并且添加300μl裂解缓冲液(CST目录号9803，PhosphoSTOPRoche目录号04906237001)。通过BCA测定法(Pierce目录号23228)测定蛋白质浓度。随后将60μg蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上并用针对pFRS2(Cell SignalingTechnology，目录号3861)、总FGFR2(例如Santa Cruz Biotechnology，目录号SC-122或R&Dsystems目录号6841)和β-肌动蛋白(Bethyl，目录号A300-485A)或细胞角蛋白(Dako目录号M3515)的抗体探测。图5(A)中展示结果并且发现全部抗体(未缀合或作为MCC-DM1ADC)在2小时处均不能够调节pFRS2信号。用12425抗体(4.3nM)和12425-MCC-DM1ADC(4.3nM抗体，13nMDM1等价物)实施进一步实验，其中在SNU16细胞并且还在Kato-III(ATC目录号HTB-103)细胞中评价额外的时间点(4、24和72小时)。图5(B)(SNU16)和图5(C)(Kato-III)中展示结果。在SNU16细胞中直到48小时或在Kato-III细胞中直到72小时未观察到裸抗体或ADC的作用。12425-MCC-DM1处理后在SNU16细胞中相对于细胞角蛋白在72小时观察到pFRS2和tFGFR2信号减少。如以下实施例9中所述，12425-MCC-DM1在72小时时间点是SNU16增殖的强力抑制剂并且这种减少可能反映SNU16细胞群体中FGFR2表达的异质性。
实施例9：在细胞增殖方面评定ADC和未缀合的抗体
评价了未缀合和SMCC-DM1缀合的抗FGFR抗体抑制一组FGFR2扩增的细胞系、过量表达的细胞系和裸细胞系增殖的能力。在这些研究中，将细胞在组织培养箱中在37℃，5％CO2在如供应商推荐的培养基中培养。在分析当日，将细胞用PBS洗涤2次(Lonza，目录号17516C)，之后用0.25％胰蛋白酶-EDTA(目录号25300)处理5分钟并且重悬在推荐的培养基中。随后将细胞计数并在55-100μl细胞培养基中以密度800-3600个细胞/孔接种在96孔或384孔平板(例如，Costar目录号3940、Corning目录号3340、Costar目录号3707)中。产生一块重复平板用于第0日测量并且将全部平板在组织培养箱中在37℃，5％CO2温育过夜。还产生仅含培养基的孔以充当阴性对照。在这种温育之后，将30-50μl/孔细胞滴定试剂(Promega目录号G7573)添加至第0日平板，随后温和振摇所述平板10分钟，并且使用Perkin Elmer2101平板读数仪，测量所产生的发光强度。将试验ADC在适宜的细胞培养基中一式两份连续稀释成2X或10X母液。对于使用2X ADC母液的测定法，将一半分析培养基移除并更换为等体积的2X连续稀释的ADC。在使用10X ADC母液情况下，这按1:10稀释入测试平板(例如5μl至55μl)，之后在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育5天或6天。ADC的分析终浓度范围从0.005-100nM DM1等价物。在这个温育时间之后，通过添加如上文所述的细胞滴定试剂测定相对细胞生存力。使用重复平板的平均数如下计算ADC对细胞增殖的影响：
抑制％＝(ADC处理-未处理)/(未处理–第0日)*100。
将抑制％数据对4-参数对数方程拟合并测定IC50值。图6(A)中展示12425-MCC-DM1的代表性数据。发现这种ADC在SNU16细胞系(图6(A))和Kato-IIIFGFR2扩增的细胞系(图6(B))中均是强力细胞增殖抑制剂。这些细胞系经证实对类美登素有效负载(L-Me-DM1；游离DM1在中的图6(A)–(C))敏感，但对借助SMCC-DM1按相似类美登素抗体比率缀合的非靶向性ADC(指向鸡溶菌酶)不敏感。12425-MCC-DM1还对胃癌细胞系NUGC3没有活性，所述NUGC3缺少可察觉的FGFR2表达，但是对类美登素有效负载敏感(图6(C))。此外，发现未缀合的抗体12425在SNU16细胞(图6(D))和Kato-III细胞((数据未显示))中均缺少抗增殖性活性。表14中显示了几种抗FGFR-MCC-DM1ADC在FGFR2扩增的细胞系中抗增殖性活性的总结，所述细胞系包括SNU16、Kato-III、SUM-52、MFM223和H716细胞(Kunii等人,2008Cancer Res 68:2340-2348；Turner等人,201029:2013-2023；Mathur等人,2010.Proceedings of the 101stAnnual Meeting of the American Association for Cancer Research,海报#284)。此外，发现ADC对一组肿瘤细胞系均无活性，所述细胞系包括AZ521、CAL-51、KYSE-150、TE-6、SNU-1041、TT、CHL-1、G401和HEC59。
表14.几种抗FGFR-MCC-DM1ADC在FGFR2基因扩增的细胞系及未扩增的细胞系中的抗增殖性活性
实施例10：FGFR ADC的体内PK-PD
实施多项研究以评定12425-MCC-DM1在体内调节药效动力学标志物的能力。这些研究的目的是评价FGFR2或FGFR4表达和G2/M细胞周期停滞之间的关系。使用pHH3阳性胞核的堆积(如通过免疫组织化学所评估)作为G2/M停滞的标志物。
通过用从Cell Signaling Technology(Danvers，MA)获得的合成性磷酸肽免疫动物，产生兔多克隆抗体，所述的合成性磷酸肽与围绕人组蛋白H3的Ser10的残基相对应。简而言之，IHC方法包括加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂。将第一抗体稀释至1:100并在37℃温育60分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4311)温育4分钟。
为了评定FGFR2扩增的SNU16异体移植模型中的PD，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3/组)，则将六小鼠随机分配以接受12425-MCC-DM1(10mg/kg)或PBS(10ml/kg)静脉内给药。与类美登素有效负载的预期作用机理一致，相对于PBS处理的对照，12425-MCC-DM1在给药后24小时产生明显的时间依赖性核pHH3阳性增加(图7(A)中显示的代表性图像)。还评价了切割的胱天蛋白酶3的时间依赖性变化。在这些研究中，通过用从Cell Signaling Technology(Danvers,MA)获得的合成肽免疫动物，产生兔多克隆抗体，所述的合成肽与毗邻于人胱天蛋白酶-3中(Asp175)的氨基端残基相对应。IHC方法包括非加热和标准暴露于Ventana细胞条件化#1抗原修复试剂。将第一抗体稀释至1:300并在室温温育60分钟。随后，与Ventana UltraMap预先稀释的HRP缀合的抗兔抗体(目录号#760-4311)温育4分钟。与pHH3相似，还观察到切割的胱天蛋白酶3的时间依赖性变化(图7(A))。还对其他抗FGFR2ADC例如12433-MCC-DM1获得相似的数据。
为了评估ADC特异性，在FGFR2/FGFR4阴性NUGC3异体移植模型中评价PD。在这些研究中，对雌性裸鼠皮下注射Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的1x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3/组)，则将9只小鼠随机分配以接受单次静脉内15mg/kg剂量的12425-MCC-DM1、对照IgG-MCC-DM1或PBS(10ml/kg)。在FGFR2和FGFR4阴性NUGC3异体移植物中，相对于15mg/kg对照IgG-MCC-DM1静脉内给药，12425-MCC-DM1未能调节pHH3水平(图7(B)中所示的代表性图像)。还对其他抗FGFR2ADC例如12433-MCC-DM1获得相似的数据。
总之，这些数据显示12425-MCC-DM1能够激发稳健的体内细胞PD作用，所述PD作用依赖于FGFR2或FGFR4表达并且与类美登素有效负载的作用机理一致。
实施例11：抗FGFR ADC的体内效力
在几种肿瘤异体移植物模型中评价抗FGFR2和/或抗FGFR2/4ADC的抗肿瘤活性。
存在FGFR2基因组扩增的异体移植物模型
模型1：在胃NCI-H716结直肠异体移植肿瘤模型、FGFR2扩增的NCI-H716结直肠异体移植肿瘤模型(拷贝数＝31，SNP6.0)、表达FGFR2IIIc同种型的NCI-H716结直肠异体移植肿瘤模型中评价三种抗FGFR2或抗FGFR2/FGFR4双靶向性ADC的抗肿瘤活性。对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的5x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。
植入后4天在平均肿瘤体积为171.7mm3时，小鼠入选于研究中(图8(A))。在随机分配到8个组(n＝6/组)之一后，对小鼠施用PBS(10ml/kg)、单次静脉内剂量的对照IgG-MCC-DM1(15mg/kg)、12422-MCC-DM1(5或15mg/kg)、12425-MCC-DM1(5或15mg/kg)或10164-MCC-DM1(5或15mg/kg)。每周2次卡尺测量肿瘤。对照IgG-MCC-DM1在15mg/kg没有活性。10164-MCC-DM1在5mg/kg没有活性。10164-MCC-DM1(15mg/kg)、12422-MCC-DM1(5和15mg/kg)和12425-MCC-DM1(5和15mg/kg)已经显示出相似的活性直至给药后14天。12425-MCC-DM1(5mg/kg和15mg/kg)和10164-MCC-DM1(仅15mg/kg)产生最持久的反应直至给药后18天(分别是23％、21％和31％T/C)。
模型2：还在FGFR2扩增的、表达的FGFR2IIIb同种型的MFM223ER/PR/Her2阴性乳腺异体移植肿瘤模型中评价三种抗FGFR2或抗FGFR2/FGFR4ADC的剂量反应抗肿瘤活性。建立MFM223模型作为基于片段的模型。在片段植入之前1天，对雌性裸鼠皮下植入0.72mg、60天缓释17β-雌二醇丸粒剂(Innovative Research of America)以维持血清雌激素水平。在植入17β-雌二醇丸粒剂后1日，将从供体小鼠收获的异体移植物切成3X 3mm3片段，皮下植入至雌性受体裸小鼠中。植入后21天在平均肿瘤体积为208.4mm3时，小鼠入选于研究中(图8(B))。在随机分配到5个组(n＝8/组)之一后，对小鼠施用PBS(10ml/kg)或单次10mg/kg静脉内剂量的对照IgG-MCC-DM1、12433-MCC-DM1、10164-MCC-DM1或12425-MCC-DM1。每周2次卡尺测量肿瘤。IgG-MCC-DM1在这个模型中没有活性。单次10mg/kg静脉内剂量的12433-MCC-DM1、12425-MCC-DM1和10164-DM1在施用后18天产生37％、24％和7％T/C。
模型3：还在患者衍生的FGFR2扩增的原发性胃肿瘤异体移植物模型CHGA-010(FGFR2拷贝数＝48，(SNP6.0))中评价12425-MCC-DM1作为单一药物的活性。在这些研究中，对雌性nu/nu无胸腺小鼠皮下植入DMEM中含有50％无酚红基质胶TM(BDBiosciences)的3x3x 3mm肿瘤片段。肿瘤成活率是>80％并且在植入后4周达到大约250mm3。在单次给药10mg/kg IV 12425-MCC-DM1后，实现肿瘤停滞直至给药后大约16至20天(图8(C))。还对FGFR2特异性ADC12433-MCC-DM1获得相似的单次给药数据(数据未显示)。此外，接受10mg/kg q3w*2IV的组大致维持肿瘤停滞直至初始给药后37天，而接受单次10mg/kg剂量的组中的肿瘤截止初始给药后37天平均为1588mm3。这些数据显示CHGA010异体移植物能够响应于12425-MCC-DM1的第二剂。
具有正常FGFR2和/或FGFR4拷贝数的异体移植物模型
还在具有正常FGFR2拷贝数和一系列FGFR2和FGFR4mRNA表达的23例人肺原发肿瘤异体移植物和22例人乳腺原发肿瘤异体移植物中评价12425-MCC-DM1的抗肿瘤活性。通过将人肺原发肿瘤片段皮下植入雌性裸鼠中，建立人原发性异体移植模型。通过将3mm3片段皮下植入雌性裸鼠中，将所产生的肿瘤异体移植物在体内传代。对动物植入肿瘤片段并通过滚动入选，分配它们接受处理(未处理或12425-MCC-DM1，15mg/kg静脉内q2w)；即一旦肿瘤达到大约250mm3即分配，而不必要在肿瘤片段植入后的相同时间分配。将每种异体移植模型一只动物分配至两个处理组之一。每周2次卡尺测量肿瘤并且分析作为肿瘤体积变化百分数的数据。
23例肺原发肿瘤异体移植模型中8例和22例乳腺原发肿瘤异体移植模型中8例响应于12425-MCC-DM1。响应范围从短暂肿瘤生长抑制到肿瘤异体移植物完全消退。图8(D)和图8(E)中分别显示响应于12425-MCC-DM1的一种肺原发肿瘤异体移植模型和一种乳腺原发肿瘤异体移植模型的例子。总之，数据显示，可以通过12425-MCC-DM1处理抑制FGFR2或FGFR4mRNA表达升高的人肺和乳腺原发肿瘤异体移植物的体内生长。
还在表达FGFR2但具有该基因正常拷贝数的乳腺异体移植模型中评价抗FGFR2/FGFR4ADC 12425-MCC-DM1的剂量反应抗肿瘤活性。该模型从52岁患有导管癌的女性作为基于片段的异体移植模型建立并且在雌性裸鼠中扩充。将从供体小鼠收获的异体移植物切割成3X3mm3片段并且皮下植入雌性受体裸小鼠中，对所述小鼠补充0.0085mg/ml 17β-雌二醇富集的水以维持血清雌激素水平并支持异体移植物生长。植入后26天在平均肿瘤体积为198mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到三个组(n＝6/组)之一，对小鼠施用单次15mg/kg静脉内剂量的对照IgG-MCC-DM1或以15或5mg/kg施用单个静脉内剂量的12425-MCC-DM1(图8(F))。每周2次卡尺测量肿瘤。单次15mg/kg静脉内剂量的12425-MCC-DM1产生6.5％T/C，而5mg/kg剂量无活性。这些数据支持在表达FGFR2的无基因扩增的肿瘤中使用12425-MCC-DM1。
总之，这些模型支持在FGFR2基因扩增存在或不存在情况下在细胞表面表达FGFR2的肿瘤中使用12425-MCC-DM1。
实施例12：具有小分子FGFR抑制剂，BGJ398(也称作3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲)的FGFR ADC的改进抗肿瘤活性
在FGFR2扩增的CHGA119患者衍生型原发性胃肿瘤异体移植物模型(FGFR2拷贝数＝22(SNP6.0))中评价单独和与FGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(Guagnano等人,2011J Med Chem 54:7066-7083)组合的FGFR2/4抗体药物缀合物12425-MCC-DM1的抗肿瘤活性。在这些研究中，将大小2mm x 2mm x 2mm的CHGA119肿瘤片段皮下(s.c.)植入雌性nu/nu无胸腺小鼠中。植入后40天，携带CHGA119肿瘤(n＝8，平均251mm3；范围：104-382mm3)小鼠分别用(乙酸/乙酸盐缓冲液中的50％PEG)溶媒经口借助管饲(pH 4.6，10ml/kg，口服，每日一次)处理、用对照IgG-3207-DM1(10mg/kg，静脉内，每两周一次)、12425-MCC-DM1(10mg/kg，静脉内，每两周一次)、3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲磷酸盐(10mg/kg，口服，每日一次)处理或用2425-MCC-DM1和3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲磷酸盐的组合处理。一周2次卡尺测量肿瘤肿瘤。12425-MCC-DM1和3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲磷酸盐各自作为单一药物导致肿瘤停滞或部分缓解(T/C分别为4％或33％，p<0.05)，而以12425-MCC-DM1和3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲磷酸盐组合的处理在处理5周后引起几乎完全肿瘤消退(消退＝-94％，p<0.05)(参见图9和表15)。在单一药物治疗或联合治疗之后观察到小于10％的体重减轻(表15)。这些数据表明FGFR ADC与FGFR信号传导的小分子抑制剂(例如3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲磷酸盐、TKI258、普纳替尼(ponatinib)、AZD4547)组合可以改善抗肿瘤反应。
表15.抗FGFR剂对携带CHGA119肿瘤的小鼠中肿瘤和宿主参数的影响
实施例13：剂量分级对FGFR ADC体内效力的影响
为了更好地理解12425-MCC-DM1Cmax(峰暴露量)或Cavg(给药间隔时间内的平均暴露量)在其抗肿瘤活性中发挥的作用，使用SNU16异体移植模型实施时间-剂量分级实验。研究了在固定的治疗持续时间范围内产生预测的固定总暴露量的一系列给药方案间隔时间和剂量水平。在某些剂量水平，FGFR2ADC显示出归因于TMDD的非线性PK(参见实施例19)。因此，为了在全部给药方案间隔时间和剂量水平之间维持固定的总暴露，因为TMDD将在较低剂量更明显，所以PK建模预测以较低、更频繁给药方案施用时，将需要较大的12425-MCC-DM1总剂量。PK建模预测，按3mg/kg q3w*2，2.5mg/kg q2w*3、1.5mg/kg qw*6和0.7mg/kgq3d*14施用的12425-MCC-DM1将实现相似的总暴露量。
对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BDBiosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后10天在平均肿瘤体积为181.7mm3时，小鼠入选于第一研究中。
为了评估PK参数，通过切尾或眶后采血法采集血清并通过ELISA分析。总抗体PK测定法测量总抗体浓度，伴以/不伴比色ELISA测量DM1。将平板用(Fc特异性)抗人IgG包被，并用驴抗人IgG-HRP检测，之后在适宜的平板读数仪上读数。缀合物PK测定法通过比色ELISA测量与至少一种DM1分子结合的抗体。在这种样式，将平板用抗DM1抗体包被，并用驴抗人IgG-HRP检测。血清在初始给药后的以下时间点采集：3mg/kg q3w*2(2、6、24、48、96、168、240、336、503小时)；2.5mg/kg q2w*3(2、6、24、48、96、168、240、335、503小时)；1.5mg/kgqw*6(2、6、24、48、96、167、335、503、671、839小时)；0.7mg/kg q3d*14(2、6、24、48、71、143、215、287、359、431、503、575、647、719、791、863、935小时)。
在随机分配到5个组(n＝7/组)之一后，对小鼠施用PBS(10ml/kg)或按3mg/kgq3w*2、2.5mg/kg q2w*3、1.5mg/kg qw*6或0.7mg/kg q3d*14静脉内施用12425-MCC-DM1。如预计，Cmax在各治疗方案间变动，而Cavg稳定(表16)。全部治疗方案均有效并产生相似的肿瘤生长抑制作用，表明12425-MCC-DM1的平均暴露量是抗肿瘤活性的主要驱动力(图10)。这些研究结果显示多种给药方案可以在不损害有效性的情况下用于门诊。
表16.向携带SNU16肿瘤的小鼠施用12425-MCC-DM1不同剂量和方案之后的PK参数
实施例14：评价体外和体内ADCC活性
相对于Kato-III细胞(靶细胞；ATC目录号HTB-103)，与NK3.3细胞(杀伤细胞或效应子细胞；来自San Louis大学的Jacky Kornbluth友好提供)共温育时确定未缀合的抗FGFR2抗体(12433、10164、12425，N297A_12425(ADCC耗尽的变体(Bolt等人,2003Eur JImmunol 23:403-411)))介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力。简言之，将Kato-III细胞用钙黄绿素乙酰氧基-甲酯染色(钙黄绿素-AM；Sigma-Aldrich目录号17783-5MG)，洗涤2次，以每孔5000个细胞的浓度吸入96孔微量滴定板(96孔，U形底，透明塑料；Costar，目录号650,160)中并且与上文提到的抗体和蛋白质的连续稀释物(从50,000至0.003μg/ml)预温育10分钟，之后添加效应子细胞。为了计算靶细胞的抗体特异性溶解，在没有充当基线和阴性对照的抗体或效应子细胞的情况下平行温育仅靶细胞，而通过用1％Triton-XTM 100溶液裂解仅靶细胞，确定阳性对照或最大溶解或特异性裂解％。在靶细胞和效应子细胞按比率1:5共温育之后，将微量滴定板离心并将等分试样的上清液转移至另一块微量滴定板(96孔，平底，黑色透明底(Costar，目录号3904)，并且用荧光计数器(VictorTM多标记计数器，Perkin Elmer)确定溶液中游离钙黄绿素的浓度。图11(A)中展示结果并且观察到全部测试的抗体均可变程度地介导ADCC。在抗体Fc部分不携带糖基化并且因此缺少与效应子细胞的CD16a受体的结合作用的N297A_12425不介导任何ADCC并且充当特异性阴性对照。靶细胞的恒定和蛋白质浓度非依赖性杀伤作用归因于NK3.3细胞针对Kato-III细胞的非特异性背景、天然杀伤活性。抗体12433以约60％介导最高的靶细胞特异性溶解(从NK3.3细胞的背景Kato-III细胞溶解作用推导的信号)，而抗体12425和10164达到约55％的特异性溶解(从NK3.3细胞的背景Kato-III细胞溶解作用推导的信号)。全部三种分子的效力(在每条剂量反应曲线的最大半数杀死作用处的浓度；有效浓度50，EC50)是相似的。在一系列相似实验中，裸抗体12425诱导ADCC的能力与12425-MCC-DM1比较。在12425裸抗体和12425-MCC-DM1之间未观察到差异(数据未显示)，表明DM1缀合未明显破坏裸抗体诱导ADCC的能力。
在额外的研究中，评价了未缀合的抗FGFR2抗体结合补体因子C1q的能力。对补体因子C1q的结合是在体内导致补体依赖细胞毒性(CDC)和细胞溶解的起始步骤。在这些研究中，96孔微量滴定板( 目录号439454)的各孔的表面用抗体12433、12425、N297A_12425和10164的连续稀释物(均处于25至0.02μg/ml的浓度范围内)在4℃在暗处包被过夜。市售抗体利妥昔单抗充当阳性对照。为了监测微量滴定板上结合的抗体分析物的量，利用第二稀释物(一式三份)每平板进行这种程序2以确定分析物包被平板的有效性。通过添加恒定浓度的C1q(Sigma；补体组分C1q，目录号C1740-1mg)，对C1q结合作用定量并使用与辣根过氧化物酶HRP缀合的多克隆山羊抗人C1q抗体(AbD Serotec；羊抗人C1q：HRP；目录编号2221-5004P)检测。在第二稀释系列中以过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体片段(Jackson ImmunoResearch；目录号109-036-003；AffiniPure F(ab’2)片段山羊抗人IgG(H+L))确定包被效率的对照。二者均用TMB底物(TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒；Bio-Rad；目录号172-1067)可视化，随后在450nm用紫外可见光光度计(MolecularDevices；Pro 340)测量光密度。图11(B)中展示结果。对于全部分析物，与所测试抗体结合的C1q蛋白质的最大数量是相同的。对于全部分析物，与微量滴定板结合的抗体的数量是相同的，例外是10164抗体，该抗体仅达到其他分子的约50％。12433、10164和利妥昔单抗的效力(在每条剂量反应曲线的最大半数结合作用时的浓度；有效浓度50，EC50)大致相同。12425抗体的EC50是高3倍并且N297A_12425的EC50高约8倍。鉴于下述结果即10164并未与其他抗体同等良好地包被微量滴定板，C1q结合中观察到的结果提示10164与C1q蛋白结合的大约2倍能力。
进一步评定C1q结合作用，评价了未缀合的抗FGFR2抗体12433、1016412425和N297A_12425触发补体依赖细胞毒性(CDC)的能力。将Kato-III细胞(靶细胞；ATC目录号HTB-103)以10000个细胞/孔的浓度均等分配至各孔中96孔微量滴定板(Costar；无菌，白色，96孔平底细胞培养平板，目录号3610)并与上述抗体的连续稀释物预温育10分钟，之后添加效应子试剂。这项研究中使用的效应子试剂是以最终稀释度1:6抽吸到Kato-III细胞上的兔补体(PelFreez；目录号31060-1)。在37℃于增湿的细胞培养物培养箱中温育两小时后，将微量滴定板离心，弃去上清液，并将细胞沉淀物溶解于复水的(Promega；发光试剂盒，目录号G7572)中。在多标记读数仪(PerkinElmer；VictorTM3)中定量发光。图11(C)中展示全部所测试抗体的结果。没有观察到所测试抗体(图11(C))或额外对照(市售抗体和数据未显示)的CDC证据。
为了评定ADCC在12425-MCC-DM1体内活性中的作用，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后7天在平均肿瘤体积为201.4mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到5个组(n＝6/组)之一后，小鼠接受10mg/kg静脉内剂量的裸对照IgG、裸N297A_12425、裸12425、N297A_12425-MCC-DM1或12425-MCC-DM1。每周2次卡尺测量肿瘤(图11(D))。在给药后25天，ADCC耗尽的裸12425变体(裸N297A_12425)比ADCC有效的亲本12425显示较低的抗肿瘤活性(分别是61％和13％T/C)。这些数据表明亲本12425的效应子细胞功能可能在裸抗体体内抗肿瘤活性中发挥作用。ADCC有效的12425-MCC-DM1和ADCC耗尽的N297A_12425-MCC-DM1在给药后25天显示出相似的抗肿瘤活性(分别45％和32％消退)。这些数据表明尽管ADCC活性是可牺牲的，但是对于12425-MCC-DM1的稳健体内抗肿瘤活性，类美登素有效负载是需要的和足够的。
实施例15：对抗FGFR抗体和ADC调节过量表达FGFR4的细胞系中信号传导的评价
在过量表达FGFR4的细胞系中评价了未缀合和缀合的抗FGFR抗体调节FGFR信号传导的能力。在初始研究中，确定10164(FGFR2特异性)、12433(FGFR2特异性)、12425(FGFR2/4交叉反应性)和相关的MCC-DM1缀合物在MDA-MB453(ATC目录号HTB-131)细胞中的作用。简而言之，将细胞接种在CellBindTM12孔平板(Costar目录号3336)中补充有10％FBS的RMPI内并在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育过夜。在实验当日，将细胞培养基吸出并以试验抗体或小分子FGFR抑制剂BGJ398更换，所述试验抗体或BGJ398均以终浓度(13-130nM，抗体/ADC；500nM，BGJ398)稀释于补充有10％FBS的RPMI中。随后将细胞在37℃，5％CO2在组织培养箱中温育2小时。在这个温育之后，将细胞用冷PBS(Lonza，目录号17516C)洗涤两次，置于冰上，并且添加300μl裂解缓冲液(Cell Signaling Technology，目录号9803，PhosphoSTOPRoche目录号04906237001)。通过BCA测定法(Pierce，目录号23228)测定蛋白质浓度。通过BCA测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。随后将60μg蛋白质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到硝酸纤维素膜上并用针对pFRS2(Cell SignalingTechnology，目录号3864)、总FGFR4(R&D Systems，目录号8652)和β-肌动蛋白(Bethyl，目录号A300-485A)或细胞角蛋白(Dako目录号M3515)的抗体探测。图12(A)中展示结果并且发现全部抗体(未缀合或作为MCC-DM1ADC)在2小时处均不能够调节pFRS2信号。用12425抗体(4.3nM)和12425-MCC-DM1ADC(4.3nM抗体，13nMDM1等价物)实施进一步实验，其中评价额外的时间点(4、24和72小时)。图12(B)中展示结果。还在RH4横纹肌肉瘤细胞系中获得相似的数据。
实施例16：评价抗FGFR抗体和ADC在过量表达FGFR4的细胞系中的抗增殖作用
使用与上述实施例9中使用的相似方法学评价，未缀合的和SMCC-DM1缀合的抗FGFR抗体抑制一组过量表达FGFR4的细胞系增殖的能力。
与其对FGFR4的交叉反应性一致，发现12425-MCC-DM1是MDA-MB453细胞的生长的强力抑制剂，所述MDA-MB453细胞以组成型方式过量表达有活性的FGFR4突变体形式(Roidl等人,2010,Oncogene,29,1543-1552)。使用抗FGFR4抗体(Biolegend目录号324306；图13(A))，通过FACS分析法证实FGFR4表达。12425不仅在MDA-MB453中、还在其他过量表达FGFR4的细胞系中展示相似的Biolegend抗体结合特性(数据未显示)。这种作用是对ADC特异的，因为未缀合的12425抗体无活性(图13(A))。另外，在施用FGFR2特异性抗体(10164)或ADC(10164-MCC-DM1)后未观察到活性，表明该作用受FGFR4表达驱动(图13(A))。这与如通过FACS所评估的在这些细胞上缺少可检出的FGFR2表达相一致(数据未显示)。还在过量表达FGFR4的横纹肌肉瘤细胞系RH4(图13(B))和JR(图13(C))中观察12425-MCC-DM1和12425的相似作用。当扩展到额外的细胞系时，在一个过量表达FGFR4的乳腺和横纹肌肉瘤细胞系亚类中观察到12425-MCC-DM1活性(图13(D))。
实施例17：FGFR ADC和未缀合的抗体在过量表达FGFR4的肿瘤中的体内PK-PD
为了在FGFR4阳性MDA-MB-453异体移植模型中评定PD调节作用，利用雌性NSG小鼠。在植入细胞之前1日，对雌性NS小鼠皮下植入0.36mg，90天缓释17β-雌二醇丸粒剂(Innovative Research of America)。在植入17β-雌二醇丸粒剂后1日，皮下注射Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到300至500mm3(n＝3/组)，则将6只小鼠随机分配以接受单次静脉内15mg/kg剂量的12425-MCC-DM1或对照IgG-MCC-DM1。相对于接受IgG-MCC-DM1的对照小鼠，12425-MCC-DM1在给药后96小时产生明显的核pHH3阳性增加(图14(A)中所示的代表性图像)。
为了在FGFR4阳性MDA-MB-453异体移植模型中评定PD调节作用的时间过程，利用雌性NS小鼠。在植入细胞之前1日，对雌性NS小鼠皮下植入0.36mg，90天缓释17β-雌二醇丸粒剂(Innovative Research of America)。在植入17β-雌二醇丸粒剂后1日，皮下注射Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。随机分配小鼠以接受单次静脉内15mg/kg剂量的12425-MCC-DM1(处理施用后24、48、72、96和168小时每组采集三只小鼠)或PBS(10ml/kg)。在随机分配后肿瘤体积范围在300和500mm3之间。与类美登素有效负载的预期作用机理一致，相对于PBS处理的对照，12425-MCC-DM1产生明显的时间依赖性核pHH3阳性增加，这种增加在给药后约72-96小时达到最大。切割的胱天蛋白酶3免疫反应性的峰值在给药后约96小时和168小时出现。图14(B)中显示代表性图像。
一部分的肺泡横纹肌肉瘤，包括RH4细胞系，携带导致FGFR4mRNA和蛋白质表达升高的Pax3/7-FOXO1A易位。为了评定RH4异体移植模型中的PD调节作用，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。一旦肿瘤达到300至700mm3(n＝3/组)，则将6只小鼠随机分配以接受单次静脉内15mg/kg剂量的12425-MCC-DM1、对照IgG-MCC-DM1或PBS(10ml/kg)。相对于接受IgG-MCC-DM1的对照小鼠，12425-MCC-DM1在给药后96小时产生明显的核pHH3阳性增加(图14(C)中所示的代表性图像)。这些研究结果显示12425-MCC-DM1在这种FGFR4阳性异体移植模型中造成G2/M细胞周期停滞。
实施例18：抗FGFR ADC在过量表达FGFR4的肿瘤中的体内效力
在FGFR4阳性MDA-MB-453乳腺癌异体移植模型中评价12425-MCC-DM1的剂量反应抗肿瘤活性。在植入细胞之前1日，对雌性NS小鼠皮下植入0.36mg，90天缓释17β-雌二醇丸粒剂(Innovative Research of America)。在植入17β-雌二醇丸粒剂后1日，皮下注射Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后12天在平均肿瘤体积为197.9mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到5个组(n＝5/组)之一后，对小鼠静脉内施用PBS(10ml/kg)、对照IgG-MCC-DM1(15mg/kg)、未缀合的12425 IgG(15mg/kg)或12425-MCC-DM1(5、10或15mg/kg)(图15(A))。对照IgG-MCC-DM1在这个模型中没有活性。15mg/kg裸IgG 12425或5mg/kg 12425-MCC-DM1单次给药在给药后29天显示出相似的活性(分别具有25％和24％T/C)。按10mg/kg和15mg/kg施用的12425-MCC-DM1产生肿瘤消退(分别为72％和92％消退)。
在FGFR4阳性、Pax 3/7-FOXO1A阳性RH4异体移植模型中评价12425-MCC-DM1的剂量反应抗肿瘤活性。对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BDBiosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后11天在平均肿瘤体积为200.8mm3时，小鼠入选于研究中(图15(B))。在随机分配到5个组(n＝8/组)之一后，对小鼠静脉内施用PBS(10ml/kg)、对照IgG-MCC-DM1(15mg/kg)、未缀合的12425 IgG(15mg/kg)或12425-MCC-DM1(5、10或15mg/kg)。对照IgG-MCC-DM1在这个模型中没有活性。类似地，单次15mg/kg剂量的裸IgG12425显示出有限的活性。作为5、10和15mg/kg单次给药，12425-MCC-DM1显示出抗肿瘤活性(分别产生36％、24％、26％T/C)。这些研究结果证实Pax3/7-FOXO1A易位导致足够的FGFR4表达以使RH4细胞系对12425-MCC-DM1敏感。因此，12425-MCC-DM1可以用于治疗患有Pax3/7-FOXO1A易位阳性横纹肌肉瘤的患者。
实施例19：评价抗FGFR ADC在小鼠、大鼠和食蟹猴中的药代动力学
在携瘤和非携瘤小鼠中在范围1-15mg/kg的几个剂量水平、在非携瘤大鼠中在1、5和45mg/kg和在食蟹猴中在30mg/kg评价抗FGFR ADC的药代动力学(PK)。在全部研究中，使用经验证的ELISA方法测量在全部动物物种中“总”抗体和“抗体药物缀合物(ADC)”的血清浓度。“总”分数指在具有或没有缀合的DM1情况下抗体的量值，而ADC分数指仅DM1缀合的抗体的量值(≥1个DM1分子)。在全部研究中，未观察到ADC分数和总抗体分数的清除之间可察觉的差异。
在携带SNU16肿瘤的小鼠中单次IV给药3mg/kg后研究12425-MCC-DM1PK。在给药后1小时、24小时、72小时、168小时和336小时采集PK样品并且总ADC和ADC部分的血清浓度在这个剂量重叠(图16(A))。在SNU16异体移植物存在下，12425-MCC-DM1半寿期是约1.5天。
还在非携瘤小鼠中在单次IV给药1、5、10或15mg/kg后研究12425-MCC-DM1PK。在给药后1小时、6小时、24小时、72小时、96小时、168小时、240小时、336小时和540小时采集PK样品。总ADC和ADC部分的血清浓度在这些剂量可重叠(图16(B))并且相对于携瘤动物，非携瘤动物中的PK特性似乎相似。
还测定携带SNU16肿瘤的小鼠中12433-MCC-DM1和10164-MCC-DM1的PK。这些ADC的总体PK谱类似于12425-MCC-DM1并且获得的数据汇总于表17中。
表17：小鼠中12433-、12425-和10164-MCC-DM1在3mg/kg剂量时的药代动力学特性
在非携瘤大鼠中在IV施用的两个剂量水平1mg/kg和5mg/kg研究了12425-MCC-DM1PK。在0.5小时、1小时、2小时、6小时、8小时和在第1、2、4、8、11、14、21和35日采集PK样品。“总ADC”和“ADC”种类的浓度-时间曲线在两种剂量水平几乎重叠(图16(C))。终末消除相在1mg/kg剂量组中略陡，并且这可能因稍晚时间点处靶介导的药物分布(TMD)所致。类似地，总ADC和ADC部分的清除率值在1mg/kg剂量时分别是0.757±0.088mL/h/kg和0.813±0.041mL/h/kg，而在5mg/kg剂量时分别指出略微较低的值0.623±0.027mL/h/kg和0.607±0.019mL/h/kg。12425-MCC-DM1ADC种类在5mg/kg剂量水平具有终末半寿期约3.9天。在额外的研究中，还在5mg/kg和45mg/kg剂量水平测定大鼠PK。在5mg/kg剂量时的半寿期类似于上文所示的值，而在45mg/kg剂量时，总ADC和ADC部分的半寿期分别是163.9小时、121.3小时(约5天)，并且这些值类似于非FGFR2/4交叉反应性对照ADC的观察结果，提示任何可能的TMD清除途径饱和。
还在相似的研究中测定12433-MCC-DM1和10164-MCC-DM1的PK并且表18中展示获得的PK参数。发现在使用的剂量水平，对测试的全部3种ADC，均获得相似的总ADC和ADC半寿期和清除率估计值。
表18：大鼠中12433-、12425-和10164-MCC-DM1的药代动力学特性
向一组三只食蟹猴(1只雄猴，2只雌猴)施用单次30mg/kg IV剂量后，研究12425-MCC-DM1PK。在第1日-0小时(在给药前)和在给药后0.25小时、2小时、4h、6小时、24小时、48小时、72小时、168小时和240小时采集血清样品。在IV注射后立即(即在0.25小时，这是第一采样时间点)观察到12425-MCC-DM1的最大暴露量。该时间过程以消除阶段长为特征，并且总ADC和ADC部分的曲线在采样时间过程期间可重叠(图16(D))。终末半寿期是大约6-7天。
向一组三只食蟹猴施用单次30 mg/kg IV剂量后，研究10164-MCC-DM1 PK。这种药物的时间过程也以消除阶段长为特征(终末半寿期6-7天)并且在表19中展示10164-MCC-DM1和12425-MCC-DM1的PK参数。
表19.30 mg/kg IV剂量后食蟹猴中12425-MCC-DM1和10164-MCC-DM1的药代动力学特性
实施例20：在体外和在体内评定序列修饰的抗FGFR抗体和ADC的活性
认识到潜在的结构不稳定性可能存在于治疗性抗体的序列中，这些结构不稳定性可能影响最终蛋白质的异质性并可能影响例如抗体易制性和免疫原性。这类不稳定性可以包括糖基化位点、未配对的半胱氨酸、潜在的脱酰胺化位点等。为了减少这类潜在不稳定性的风险，可以引入突变以移除移走一个或多个这些不稳定性。例如，可以单独连同其他结构性改变一起更换潜在脱酰胺化位点。潜在脱酰胺化位点的例子包含10164和12425的重链CDR2中的DG(参见表1)。这些残基可以突变成其他适宜的氨基酸。通过非限制性举例方式，10164HCDR2中的天冬氨酸(D)可以突变成谷氨酸(E)或苏氨酸(T)。在12425中，HCDR2甘氨酸(G)可以突变成另一种氨基酸，如丙氨酸(A)。
还应当认识到，在抗体在氨基酸水平不同于其相应种系序列的情况下，可以将该抗体突变返回至其种系序列。这类校正性突变可以出现在一个或多个位置并使用标准分子生物学技术或通过基因合成产生。通过非限制性举例方式，12425重链的重链序列(SEQ IDNO:9，参见表1)与相应的种系序列差异在于位置1处E变成Q，并且轻链(SEQ ID No:17)与相应的种系序列差异在于位置85处T变成V。因此，12425中的氨基酸可以在任何或全部的这些位点被修饰。
用来产生本申请中描述的抗体药物缀合物的化学依赖于缀合至抗体序列中的赖氨酸(K)残基。在这些赖氨酸残基存在在参与表位识别的区域内部，例如，位于CDR区的情况下，如果明显缀合出现在这些位点，则抗体药物缀合物与其预期靶结合的能力可能改变。为了减轻这个潜在风险，可以将这类赖氨酸残基突变成另外的适宜氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。一个赖氨酸存在于12425的重链CDR2和CDR3区域中。可以将这些赖氨酸的一个或多个突变成另外的残基，如精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
将上文描述的几种变化引入12425抗体中以产生抗体20562(表1)。将这种抗体与12425比较其结合FGFR2的能力、其抑制FGFR2扩增的细胞系(如SNU16)增殖的能力和在体内引起抗SNU16细胞的抗肿瘤作用的能力。发现在相似的分析条件下20562对人FGFR2IIIb和FGFR4的亲和力类似于12425(20562FGFR2IIIb亲和力估计值：9nM；人FGFR4亲和力估计值：3.3nM)。使用实施例6中描述的方法学，类似于12425-MCC-DM1，20562-MCC-DM1也是SNU16细胞体外增殖的强力抑制剂(图17(A))。为了评定20437-MCC-DM1的体内效力，对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后7天在平均肿瘤体积为217.1mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到5个组(n＝6/组)之一后，小鼠接受PBS(10ml/kg)或3mg/kg静脉内剂量的12425-MCC-DM1或20562-MCC-DM1。每周2次卡尺测量肿瘤(图17(B))。12425-MCC-DM1和其变体20562-MCC-DM1均对FGFR2扩增的SNU16异体移植物具有相似的体内活性。这些数据表明可以在不影响作为ADC的体内活性的情况下移除亲本抗体的DG位点。
实施例21：亲和力成熟的FGFR ADC的产生和表征
为了评价亲和力对所选择的抗FGFR抗体生物活性的影响，对12433、10164和12425克隆进行亲和力优化。在这些研究中，使用三核苷酸定向诱变(Virnekas等人,1994NucleicAcids Research 22:5600-5607)，通过盒诱变法同时优化L-CDR3和H-CDR2区，而构架区保持恒定。在用于亲和力成熟的克隆之前，通过XbaI/EcoRI，将亲本Fab片段从相应的表达载体x11转移到CysDisplayTM载体30。
为了优化亲本Fab片段的L-CDR3，将结合物的L-CDR3移除并更换为多样化L-CDR3库。对于每种亲本Fab，已经产生配有多样化H-CDR2的第二文库。对于每个成熟文库(LCDR3和HCDR2)，制备展示抗体的噬菌体并且通过点滴定法测定噬菌体滴度。文库扩增如其他地方所述那样进行(Rauchenberger等人,2003J Biol Chem 278:38194-38205)。为了质量控制，随机挑取单个克隆并测序。
为了选择亲和力改善的结合物，使用生物素酰化的人FGFR2，对衍生自成熟文库的噬菌体进行三轮溶液淘选。通过降低每个淘选轮次中抗原浓度，增加严格性(Low等人,1996J Mol Biol 260(3):359-368)。除减少抗原之外，进行解离速率选择(Hawkins等人,1992J Mol Biol 226:889-896)。这与室温时延长洗涤步骤组合。一般淘选程序如上文所述进行(溶液淘选)。
对于选出的子代码，将所实施的H-CDR2亲和力成熟淘选的第二轮淘选输出结果额外地在L-CDR3中多样化。文库生成完全如上文所述那样进行。为了选择改善的结合物，新生成的文库经历额外两轮溶液淘选。
将鉴定的序列独特克隆表达为IgG，并且使用与实施例1和2中描述的那些相似的SET或方法学，测定对人FGFR2的亲和力。评价了来自3个亲本抗体的超过80个克隆，并且对于来自12433抗体的克隆，获得3-6倍亲和力改善，对于来自10164的克隆，获得27倍亲和力改善，并且对于来自12425的克隆，获得68倍亲和力改善。来自10164的最高亲和力克隆命名为20809并且测定其对人FGFR2的亲和力是450pM。有趣地，这种抗体还以亲和力评估值7.4nM与人FGFR4结合。衍生自12425的最高亲和力抗体命名为20811(表1)并且测定其对人FGFR2的亲和力是110pM。测定这种抗体对FGFR4的亲和力是75pM。
在额外的研究中，20809和20811均与SMCC-DM1直接缀合以产生20809-MCC-DM1和20811-MCC-DM1。图18(A)中显示这些ADC抑制SNU16细胞生长的能力。在FGFR2扩增的SNU16异体移植模型中评定亲和力对体内抗肿瘤活性的影响。对雌性裸鼠皮下植入Hank平衡盐溶液中含有50％无酚红基质胶TM(BD Biosciences)的悬液内的10x 106个细胞。悬液中含有细胞的总注射体积是200μl。植入后7天在平均肿瘤体积为217.6mm3时，小鼠入选于研究中。在随机分配到5个组(n＝6/组)之一后，小鼠接受PBS(10ml/kg)或3mg/kg静脉内剂量的12425-MCC-DM1、20811-MCC-DM1、10164-MCC-DM1或20809-MCC-DM1。每周2次卡尺测量肿瘤(图18(B))。10164-MCC-DM1和其亲和力成熟变体20809-MCC-DM1针对SNU16异体移植物展示相似的活性。就抗肿瘤活性而言，12425-MCC-DM1展示胜过其亲和力成熟变体20811-MCC-DM1的优越性。这些数据表明亲和力成熟没有像MCC-DM1ADC那样产生改进的体内活性。
实施例22：通过氘交换质谱法(HD-MS)对FGFR2和其抗体复合物的表位定位
氘交换质谱法(HDx-MS)测量蛋白质的酰胺主链上的氘摄取量。这些量值对酰胺的溶剂可及性和主链酰胺的氢键网络的变化敏感。HDx-MS经常用来比较处于两个不同状态(如结合apo和结合配体)的蛋白质并且与胃蛋白酶快速消化法偶联。在这类实验中，可以定位显示两个不同状态之间差异性氘摄取量的区域，其一般具有10至15个氨基酸。受到保护的区域直接参与配体结合或以变构方式受配体的结合影响。
在这些实验中，在不存在和存在三种治疗性抗体：12425、10164、和12433情况下测量大肠杆菌衍生的FGFR2D2-D3蛋白(SEQ ID NO:135，见下文)的氘摄入。FGFR2中当抗体结合时显示氘摄入下降的区域可能参与表位；然而，归因于测量的性质，还可能检测远离直接结合位点的变化(变构效应)。通常，具有最大数量保护作用的区域参与直接结合，不过并非总是如此。为了阐明来自变构效应的直接结合事件，要求正交测量(例如X射线结晶学、丙氨酸诱变)。
表20.FGFR2 D2-D3构建体
在WatersHD-MS平台上进行这个实施例中描述的表位定位实验，所述平台包括LEAP自动采样器、nanoACQUITY UPLC系统和Synaptg质谱仪。通过LeapShell软件运行的LEAP自动采样器，使研究自动化，所述软件执行氘交换反应启动、反应时间控制、猝灭反应、上样到UPLC系统上和消化时间控制。Leap自动采样器配备了温度受控制的两个堆垛(stack)，所述堆垛分别维持在25℃用于HDx反应和维持在2℃用于储存蛋白质和猝灭溶液。按氘交换时间25分钟对抗原实施一式三份对照实验。HDx用猝灭缓冲液(6M脲和1M TCEP pH＝2.5)猝灭。在猝灭后，将抗原注入UPLC系统，在那里它在12℃受到在线胃蛋白酶消化，随后在Waters BEH C 181x 100mm柱(维持在1℃)经历流速40μL/分钟的8分钟2至35％快速乙腈梯度。正如对照实验那样对抗原-mAb复合物实施一式三份实验，例外是在这些实验中，在氘交换之前抗原与抗体在25℃温育30分钟。
这些测量的结果总结于图19(A)和图19(B)中。在图19(A)中，显示了在mAb不存在(对照)和存在下FGFR2肽的平均氘摄入。在这张图中有用的是检查以下两种差异：对照和mAb之间的差异和各mAb组之间的差异。在图19(B)中，mAb和对照样品之间氘摄入的差异除以测量中的标准误。如果差异按绝对标度大于0.5Da(图19(A))并且如果差异对标准误的比例小于或等于-3.0(图19(B))，则认为差异显著。从这项分析中，我们可以将受mAb结合保护的FGFR2区域按高度、中度和低度保护量的类别排序。高度保护的FGFR2区域可能参与特异性抗体的表位形成，虽然人们不能排除对受保护较少区域的其他贡献。
当10164与FGFR2结合时，我们在以下两个FGFR2区域中观察到高程度保护作用：SEQ ID NO:137的残基174-189和198-216。这些区域位于D2结构域中，所述D2结构域具体由相对于βC之N末端侧的βB和相对于βE的βC’环组成(图19(C)和(D))。区域222-231中存在一个低保护区域。然而，当全部研究的抗体结合时，这个区域受到保护；这个观察结果表明该区域发生了本质上可能是非特异和变构性的其局部氢键网络稳定化。抗体12425与FGFR2的结合还在SEQ ID NO:137的残基174-189和198-216区域引起高程度的保护。此外，对于12425家族，还在SEQ ID NO:137残基160-173的区域内(图19(A)和(B))观察到高程度保护。这些区域包括从公开的结晶学数据已知与FGF2和FGF1相互作用的FGFR2区域(Plotnikov等人,M.Cell 2000,101,413-424；Beenken等人,M.J.Biol.Chem.2012,287,3067-3078)。这个区域内的保护作用是12425抗体家族独有的。在研究的抗体当中，12433的独特性在于通过与FGFR2的D3结构域相互作用，它特异性靶向FGFR2的IIIb同种型。对于12433，在肽338-354中观察到高程度的保护作用(约2Da)，并且在来自338-345的较短N末端片段中观察到不明显程度的保护作用。这个观察结果表明，338-354肽中12433结合时受保护的部分是区域346-354(图19(A)和(B))。区域346至354含有相对于IIIc同种型而言对IIIb同种型特异的4个残基；这些残基包括：Q348、A349、N350和Q351。在额外的研究中，评价了10164和12425的亲和力成熟形式(参见以下实施例23)并且发现就观察到的受保护区域而言，它们与其相应的亲本抗体相似。
另外，使用相似的方法，进行了在FGFR2/4交叉反应性抗体12425存在下检验FGFR4保护作用的氘交换研究。使用FGFR4 D1-D3构建体(SEQ ID NO:124，见下文)的初步分析表明，12425的结合没有在D3区域引起任何保护作用。保护作用似乎限于D1和D2结构域内部的区域。
表21.FGFR4 D1-D3构建体
实施例23：人FGFR2/12425 Fab和FGFR4/12425 Fab复合物的X射线结晶学结构测定
测定了与12425的Fab片段(表22)结合的人FGFR2 ECD片段(FGFR2结构域2，或FGFR2 D2，SEQ ID NO:138，表22)或人FGFR4ECD片段(FGFR4结构域2，或FGFR4 D2，SEQ IDNO:143，表22)的晶体结构。如下文详述，将FGFR2 D2或FGFR4 D2表达、纯化并与12425 Fab混合以形成复合物。随后使用蛋白质结晶学以产生与12425 Fab结合的FGFR2 D2或FGFR4D2的原子解析数据以确定表位。通过突变关键的表位残基并用表面等离子体共振(SPR)技术测量突变体FGFR2与12425的结合，进一步验证FGFR2结晶学表位。
产生用于结晶学和SPR的蛋白质
表22中显示产生用于结晶学和SPR的蛋白质的序列。FGFR2 D2构建体包含人FGFR2(UniProt识别码P21802-3，SEQ ID NO:137)的残基146至249(加下划线)，连同来自重组表达载体的N末端和C末端残基(以小写字母显示，SEQ ID NO:137)。FGFR4 D2构建体(SEQ IDNO:143)包含人FGFR4(UniProt识别码P22455-1，SEQ ID NO:142)的残基140至242(加下划线)，连同来自重组表达载体的N末端和C末端残基(以小写字母显示)。FGFR2结构域2至结构域3(D2D3)的构建体包含残基140至369(SEQ ID NO:137中的斜体字母)。产生野生型(WT)和K176A/R201A双突变体形式的FGFR2 D2D3以便通过SPR进行表位验证(分别是SEQ ID NO:144和145；小写字母是来自重组表达载体的N末端和C末端残基)。对于12425 Fab，显示重链和轻链的序列(分别是SEQ ID NO:139和140)。
表22：用于结晶学和SPR的蛋白质的序列
FGFR2 D2在大肠杆菌BL21(DE)(NovagenR，EMMillipore)中表达。在18℃用IPTG过夜诱导后，将细胞收获，冷冻在-80℃并裂解。将包涵体用20mM磷酸钠pH 7.5、300mM NaCl和8M脲提取，并加载于相同缓冲液中预平衡的Ni-NTA柱上。将柱用20mM磷酸钠pH 7.5、300mMNaCl、50mM硫酸铵和20mM咪唑洗涤，随后用20mM磷酸钠pH 7.5、300mM NaCl、50mM硫酸铵和300mM咪唑洗脱。随后将洗脱的蛋白质用20mM磷酸钠pH 6.5(缓冲液A)稀释12倍，并加载于缓冲液A加2％20mM磷酸钠pH 6.5、1.5M NaCl、50mM硫酸铵(缓冲液B)中预平衡的HiTrap SHP柱(GE Healthcare)上。通过缓冲液A加2％-100％缓冲液B的梯度洗脱S柱。将含有FGFR2D2的主峰收集、浓集并加载于20mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl中平衡的16/60SuperdexTM 75(GE Healthcare)上。通过SDS-PAGE和LC分析峰级分并且随后将它们汇集以与12425 Fab形成复合物。
FGFR4 D2在大肠杆菌菌株T7Express(New England BioLabs)中表达。在18℃用IPTG诱导过夜后，将细胞收获并在50mM磷酸钠pH 7.5，300mM NaCl加0.1mg/ml来自牛胰的脱氧核糖核酸酶I(Sigma)和1片cOmplete蛋白酶抑制剂混合片()/50ml裂解缓冲液中裂解。通过在15,000转/分钟离心1小时使裂解物澄清；随后添加TalonR树脂()至上清液用于在4℃过夜分批结合。次日，将树脂装填至柱中，用50mM磷酸钠pH 7.5、300mM NaCl、20mM咪唑洗涤，并用50mM磷酸钠pH 7.5、300mM NaCl、300mM咪唑洗脱。随后将洗脱的蛋白质用50mM磷酸钠pH 7.5(缓冲液C)稀释12倍，并加载于缓冲液C加2％50mM磷酸钠pH 7.5、1M NaCl(缓冲液D)中预平衡的HiTrap S HP柱(GE Healthcare)上。通过缓冲液C加2％-100％缓冲液D的梯度洗脱S柱。将含有FGFR4 D2的主峰收集、浓集并加载于20mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl中平衡的16/60SuperdexTM 75(GEHealthcare)上。通过SDS-PAGE和LC分析峰级分，随后将它们汇集以与12425 Fab形成复合物。
通过用固定化木瓜蛋白酶(Pierce)裂解全长12425 IgG产生12425 Fab。按20mg/ml在20mM磷酸钠pH 7.0和10mMEDTA中的12425 IgG与固定化木瓜蛋白酶以重量比80:1混合。将混合物在37℃在15ml管中转动过夜。次日，通过重力流柱移除固定化木瓜蛋白酶；收集含有Fab区段和Fc区段的通流并加载于HiTrapTM MabSelect SURETM柱(GE Healthcare)上以移除Fc区段。浓缩来自这个步骤的仅含有Fab片段的通流并加载于20mM Hepes pH7.5，150mM NaCl中平衡的16/60SuperdexTM 75(GE Healthcare)上。通过SDS-PAGE和LC分析峰级分并且随后将它们汇集以与FGFR2 D2或FGFR4 D2形成复合物。
FGFR2 D2/12425和FGFR4 D2/12425 Fab复合物的结晶和结构测定
通过以下方式制备FGFR2 D2或FGFR4 D2与12425 Fab的复合物：将纯化的FGFR2D2或FGFR4 D2与12425 Fab按2:1摩尔比(通过LC测量浓度)混合，在冰上温育30分钟并且在20mM Hepes pH 7.5，150mM NaCl中平衡的16/60Superdex TM75(GEHealthcare)上纯化复合物。通过SDS-PAGE和LCMS分析峰级分。
为了使FGFR2 D2/12425 Fab复合物结晶，汇集含有该复合物的级分并浓缩至约30mg/ml。将胰蛋白酶(按1mg/ml溶解于1mM HCl和2mM CaCl2中)按体积比1:100加入该复合物以促进结晶(Wernimont等人,(2009)Plos One 4:e5095)。立即离心FGFR2 D2/12425Fab/胰蛋白酶混合物并针对结晶筛选。
通过坐滴蒸气扩散法生长晶体。详细而言，将0.1μl蛋白质与含有0.1M二水合柠檬酸三钠pH 5.0，20％(w/v)PEG6000的0.1μl储器溶液混合；并且将液滴在4℃针对45μl相同的储器溶液平衡。
为了使FGFR4 D2/12425 Fab复合物结晶，将含有该复合物的大小排阻级分汇集，浓缩至20mg/ml，离心并且针对结晶筛选。按照与FGFR2 D2/12425 Fab复合物相同的方式(上文描述)生长晶体，例外是储器溶液含有0.2M甲酸镁，20％(w/v)PEG3350，并且在20℃生长晶体。
在数据采集之前，FGFR2 D2/12425 Fab晶体和FGFR4 D2/12425 Fab晶体均转移至额外含有22.5％甘油的储器溶液并在液氮中快速冷却。
在高级光子来源(阿尔贡国家实验室，美国)以光束线17-ID采集衍射数据。处理数据并使用HKL2000(HKL Research)以作图。以FGFR2 D2结构(PDID：3DAR)和自有Fab结构作为检索模型，使用Phaser(McCoy等人,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，通过分子置换法解析两种结构。最终模型以COOT(Emsley和Cowtan(2004)Acta Cryst.60:2126-2132)建立并且用Buster(Global Phasing,LTD)修正。含有在12425 Fab中任何原子的范围内原子的FGFR2 D2或FGFR4 D2残基通过PyMOL(LL)鉴定并且在表23和表24中列出。
FGFR2诱变和SPR测定法
通过QuikchangeR位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies)，将K176A/R210A双突变引入FGFR2 D2D3构建体中。使用与FGFR4 D2蛋白相同的程序，产生WT和突变体FGFR2D2D3蛋白。
对于SPR测定法中使用的试剂，亲和力纯的F(ab)’片段抗人IgGFcγ片段(109-006-098)购自Jackson Immuno Research Laboratory。从GE Healthcare订购传感芯片CM5(BR-1006-068)、甘氨酸pH 2.0(BR-1003-55)和Hb-EP缓冲液(BR-1006-69)。BSA来自(15260)并且肝素来自Sigma(H3149-100KU)。
使用具有评价软件版本1.1的T100和CM5传感芯片，进行全部SPR工作。将含有0.5mg/ml BSA和10μg/ml肝素Hb-EP+用作全部实验的运行缓冲液。通过响应单位(RU)计量固定化水平和分析物相互作用。进行预试以检验和证实固定抗人Fc抗体及12425IgG子序列捕获的可行性。
对于12425动力学测量，在芯片上捕获抗体，并且随后流过WT或突变体FGFR2 D2D3蛋白。简而言之，在全部4个流动小室上通过胺偶联法以流速10μl/分钟，将50μg/ml抗人Fc抗体在pH 4.75固定在CM5芯片上以实现600RU。将3μg/ml 12425以10μl/分钟在检验流动小室上注射10秒。将0.078-100nM的FGFR2 D2D3蛋白按2倍稀释度以80μl/分钟在全部参比流动小室和检验流动小室上注射7分钟。随后使HBS-EP++BSA+肝素缓冲液流过10分钟以解离结合的12425。在每个注射循环后，将芯片表面用10mM甘氨酸pH 2.0以60μl/分钟再生70秒。全部动力学测量均25℃进行。
12425的FGFR2表位
FGFR2 D2/12425 Fab复合物的晶体结构用来鉴定12425的FGFR2表位。在晶体的非对称单元(一个非对称单元含有为增殖完整晶体需要的全部结构信息)中存在六个拷贝的FGFR2 D2/12425 Fab复合物。全部六个拷贝共享几乎相同的与12425 Fab接触的残基，例外在于因晶胞堆积所致的小变异。仅全部六个拷贝共有的那些接触12425的FGFR2残基用来确定表位。
在FGFR2 D2上与12425 Fab的相互作用表面由几不连续(即，非连续)序列形成：即残基173至176、残基178、残基208至210和残基212、213、217和219，如表23和表24中详述。这些残基形成被12425 Fab结合的三维表面(图20(A))。通过结晶学限定的这个表位与通过氘交换质谱法(HD-MS)限定的表位良好吻合，后一个表位包含残基160-173、174-189和198-216。
表23.人FGFR2 D2和12425 Fab重链(H)之间的相互作用。FGFR2残基基于P21802-3(SEQ ID NO:137)编号。Fab重链残基基于其线性氨基酸序列(SEQ ID NO:139)编号。显示的FGFR2残基在12425 Fab中原子 范围内具有至少一个原子，以导致潜在的水介导的相互作用。
表24.人FGFR D2和12425 Fab轻链(L)之间的相互作用。FGFR2残基基于P21802-3(SEQ ID NO:137)编号。Fab轻链残基基于其线性氨基酸序列(SEQ ID NO:140)编号。显示的FGFR2残基在12425 Fab中原子范围内具有至少一个原子，以导致潜在的水介导的相互作用。
从FGFR2 D2/12425 Fab结构可见，FGFR2上的潜在N-联糖基化位点，即Asn241和Asn288(Duchesne等人,(2006)J.Biol.Chem281:27178-27189)处在该蛋白质的对立表面上远离12425表位(图20(A))，这表明12425与FGFR2的结合与糖基化无关。这与下述观察结果一致：12425抗体以相似的亲和力结合大肠杆菌产生的(非糖基化)FGFR2 D2-D3和哺乳动物细胞产生的(糖基化)FGFR2 D2-D3(数据未显示)。
FGFR2 D2的Lys176和Arg210是分别与12425 Fab轻链和重链接触最多的两个表位残基。有趣地，已经显示Arg210结合肝素(Pellegrini等人,(2000)Nature 407:1029-1034)，这可以增强FGFR2与FGF结合及后续的二聚化和信号传导。同时，还推测Lys176也处于肝素结合袋中(Pellegrini等人,(2000)Nature 407:1029-1034)。这两个残基突变成丙氨酸完全消除SPR测定法中FGFR2与12425 IgG的结合(关于SPR方法，见上文)，这证实它们在结合12425中至关重要的作用并且验证了晶体结构中观察到的表位。
12425的FGFR4表位
FGFR4 D2/12425 Fab复合物的晶体结构用来鉴定12425的FGFR4表位。在晶体的非对称单元中存在四个拷贝的FGFR4 D2/12425 Fab复合物。全部四个拷贝共有几乎相同的与12425 Fab接触的残基，例外在于因晶胞堆积所致的小变异。仅全部四个拷贝共有的接触12425的FGFR4残基用来确定表位。
在FGFR4 D2上与12425 Fab的相互作用表面由几个不连续(即，非连续)序列形成：即残基150-151、154、157、160、166-169、171、173-174、201-207、210和212，如表25中详述。这些残基形成被12425 Fab结合的三维表面(图20(B))。
表25.人FGFR4 D2和12425 Fab重链(H)和轻链(L)之间的相互作用。FGFR4残基基于P22455-1(SEQ ID NO:142)编号。Fab残基基于其线性氨基酸序列(SEQ ID NO:139和140)编号。显示的FGFR4残基在12425 Fab中原子范围内具有至少一个原子，以导致潜在的水介导的相互作用。
比较FGFR2和FGFR4上的12425表位
FGFR2和FGFR4上的12425表位在序列和构象方面均非常相似。如序列比对结果中所示(图20(C))，FGFR2上的全部表位残基(在划虚线框中)由FGFR4共有并且在FGFR4中保守。另外，当两种复合物结构在12425的可变结构域上叠加时，两种抗原的结构非常好地叠加，表明与FGFR2和FGFR4结合的12425的构象非常相似。这提供了12425对两种受体的交叉反应性的结构性解释。
12425结合和FGFR二聚化
已经报道FGFR-FGF-肝素复合物在细胞表面上如何二聚化激活下游信号传导的两个模型，即2:2:2模型(FGFR:FGF:肝素)(Schlessinger等人,(2000)Mol.Cell 6:743-750)和2:2:1模型(FGFR:FGF:肝素)(Pellegrini等人,(2000)Nature 407:1029-1034)。基于FGFR2 D2/12425 Fab复合物的晶体结构，12425与FGFR2和/或FGFR4的结合冲突并且因此可能阻断两种二聚化模式。
实施例24：制剂
ADC的临床使用形式(CSF)是小瓶中含有50mg 12425-MCC-DM1、16.2mg琥珀酸钠，410.8mg蔗糖和1mg聚山梨醇酯20的冷冻干燥物(不考虑过量10％以允许抽出宣称的含量)。在冷冻干燥物以5mL注射用水复水后，获得pH5.0含有10mg/mL 12425-MCC-DM1、20mM琥珀酸钠，240mM蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20的溶液。
为了后续静脉内施用，将获得的溶液通常进一步稀释于载体溶液中成为用于输注的即用型ADC溶液。
对于CSF，基于初步稳定性检验，选择10mg/mL的ADC浓度。选择240mM的蔗糖浓度以产生等渗制剂、以维持非晶态冷冻干燥物滤饼结构并且以提供蛋白质稳定作用。
选择最稳定制剂的显示稳定性的重要分析方法涵盖确定聚集水平的大小排阻色谱以、亚可见颗粒物检验、游离毒素测定和效力检验，以及其它方法。
筛选前研究显示浓度0.02％的聚山梨醇酯20提供对抗机械应力的足够稳定作用。在实时和加速稳定性条件(25℃和40℃)下的液体和冻干稳定性研究显示琥珀酸酯pH 5.0制剂提供总体最好的贮存稳定性。这种制剂中最值得注意地，可以达到全部所测试制剂在聚集和游离毒素释放之间的最佳平衡。在40℃三个月后，不能测定出降解产物明显增加。
实施例25：肿瘤抗性机理和联合疗法的用途
事先存在的异质性是许多癌的共同特征。有临床意义的肿瘤(和从它们衍生的细胞系)是远离它们初始致癌事件的许多世代。它们已经获得充分时间以遗传地获得多样性子群体(Nowell,Science 194:23-28(1976))，所述子群体将不必要依赖于共同遗传性驱动病灶以存活。如果这些子群体足够合适以延续于后续世代中，则我们实际上正在治疗一个复杂群体，而不是治疗每位患者中的单个克隆性肿瘤。因此，存在具有不同癌基因或肿瘤抑制基因扩增的克隆性群体可能解释对单一疗法的敏感性或抗性和需要靶向联合疗法。
FGFR2表达在FGFR2扩增的SNU 16细胞中和在FGFR2扩增的人肿瘤中具有异质性
使用本领域已知和本文所述的方法通过免疫组织化学(IHC)，流式细胞术和/或荧光原位杂交在SNU16细胞中测量FGFR2表达。亲本SNU 16石蜡包埋细胞沉淀物的IHC染色揭示出一系列的FGFR2染色强度。此外，在培养下增殖的SNU 16细胞上的FGFR2表面表达也显示一系列的FGFR2表达值，如通过流式细胞术所测量。有趣地，当细胞群体就EGFR进行共染色染液时，似乎存在EGFR阳性细胞的子群体。通过FISH分析时，EGFR扩增的散在细胞(<5％)还在预处理细胞块制备物中明显，不过当通过qPCR检查该群体时，可能无法在处理之前的群体中检测到EGFR扩增，这可能归因于低水平表达。
借助qPCR评价了296份人胃肿瘤样品并且发现7份(2.4％)具有FGFR2拷贝数增加(例如，基因拷贝数为大约4)。对来自FGFR2拷贝数最高的那些样品集合中9份样品的IHC染色揭示，每份样品均具有呈阳性的肿瘤区域和呈FGFR2表达阴性的区域。免疫反应性与任何特定肿瘤形态不相关。当使用FGFR2免疫反应性作为连续切片上的遮蔽物(mask)显微解剖肿瘤样品时，来自这些FGFR2阳性区域和阴性区域的DNA在全部9个病例中均分别与FGFR2基因扩增或不扩增相关。如下文描述，通过深度测序证实FGFR2过量表达和扩增的相关性。
EGFR在抗BGJ398的SNU 16细胞中过量表达和扩增，以及FGFR2表达和扩增丢失
SNU 16细胞(ACCCR-5974)培养于含0.5μM BGJ398的RPMI-1640培养基+10％FBS(ATC目录号30-2001)，随后将BGJ398的浓度从0.5μM至1.0μM至2.5μM至5.0μM升高。更换培养基并且每周一次添加新鲜的BGJ398(5μM)持续6周。细胞在回收细胞培养物冻结介质(#12648-101)中冷冻并且在RPMI-1640+10％FBS中复水。随后在1μM BGJ398选择下维持抗性细胞系的解冻传代物。在BGJ398选择下维持培养的SNU 16细胞最终变得对生长抑制较不敏感，IC50从1.7nM增加至2.4μM，对抗性细胞不敏感。
BGJ398抗性的SNU 16细胞的蛋白质印迹分析显示该抗性细胞群体已经丧失FGFR2表达并且不再通过p-FRS2发送信号，表明FGFR2信号传导途径不再有效。抗性群体不再表达高水平的EGFR和pEGFR，表明该细胞不再通过EGFR途径发送信号。与预处理的SNU16细胞相比，BGJ398抗性的SNU 16细胞还显示出与蛋白质表达增加相关的EGFR DNA拷贝数增加，如通过qPCR所测量。BGJ398抗性的细胞继续生长，但是生长速率比亲本(未处理的)细胞株系低，与亲本SNU 16细胞的加倍时间36小时相比，其加倍时间为125小时。
SNU 16细胞中BGJ398抗性的发生导致对EGFR抑制剂吉非替尼的获得性敏感(图21)。对SNU 16亲本细胞和BGJ398抗性细胞进行的细胞生长测定法分别显示吉非替尼IC50从>10μM转变成16.7nM，从而证实癌基因依赖性从FGFR2转变成EGFR。
我们已经显示在转化性癌基因FGFR2中扩增的细胞系含有第二癌基因EGFR扩增并依赖于该基因的先前存在细胞。当FGFR2扩增的细胞系SNU 16置于FGFR激酶抑制剂的压力下时，消除一个群体并且一个子群体变得占优；我们预见当异质性肿瘤置于选择性压力下如靶向疗法时，子群体的生长可能受到支持并且导致临床抗性。
深度测序显示人胃癌标本中预先存在额外的致癌病灶
配对肿瘤样品的显微解剖区域的深度测序显示与FGFR2扩增的相关性，其中所述配对肿瘤样品从过量表达FGFR2的肿瘤区域和无FGFR2过量表达的肿瘤区域取得。FGFR2过量表达的全部肿瘤区域均显示FGFR2在拷贝数方面扩增(例如：拷贝数6-16)，而无FGFR2过量表达的肿瘤区域不显示FGFR2拷贝数扩增。与上文描述的SNU 16中的研究结果一致，一例肿瘤仅在非FGFR2扩增区域显示EGFR扩增。EGFR扩增与这份标本中的kras扩增同时出现。这个观察结果与先前的报告一致，表明kras扩增是抗EGFR治疗药治疗的癌症的抗性机理(Valtorta等人,IJC(2013)133:1259-1266；Misale等人,Nature(2012)486:532-538)。
其他肿瘤显示出可选的受体酪氨酸激酶扩增。例如，一个肿瘤对在FGFR2扩增区域和FGFR2非扩增区域内均具有扩增的Her2，而另外一份肿瘤仅FGFR2非扩增区域具有确定的IGF1R扩增。全部肿瘤中的全部区域似乎均在p53中具有突变。鉴定到几种额外的突变，但是这些突变并未在样品集合之间始终如一观察到。施加选择性压力如靶向疗法(例如：抗FGFR2治疗)时，起初不占优势的受体酪氨酸激酶扩增的这些先前存在的小群体可能是抗性细胞源。
我们还已经展示FGFR2扩增的人原发肿瘤含有其他酪氨酸激酶扩增的子群体并且这种子群体扩增有时在无FGFR2扩增的肿瘤区域出现。回顾以前研究(Snuderl等人(2011)Cancer Cell 20:810-817)，全部肿瘤区域还含有共同突变，在这种情况下，p53中的突变，提示总体上存在该肿瘤的共同祖先。
FGFR2作为表达Her2的肿瘤中的抗性机理
已经提出FGFR2的扩增作为拉帕替尼治疗后乳腺癌细胞中的抗性机理(Azuma等人,(2011)Biochem Biophys Res Comm,407:219-224)，并且在对拉帕替尼反应不良的乳腺癌患者中观察到FGFR2表达呈过量表达。我们已经通过深度测序证实一份Her2扩增的人胃肿瘤样品具有事先存在的FGFR2扩增的细胞亚群(Deeds等人,.United States andCanadian Academy of Pathology,March 2014:摘要编号：453290)。这表明FGFR2扩增可能代表抗Her2疗法后Her2扩增的其他肿瘤中的抗性机理。因此，Her2疗法联合FGFR2疗法例如本文所述的FGFR2抗体和ADC的治疗将可用于治疗表达Her2和/或Her2抗性癌。
这些数据表明，FGFR2疗法，例如本文所述的FGFR2ADC，可以与其他酪氨酸激酶抑制剂联合用于治疗癌症。此外，本文所述的FGFR2ADC可以用于治疗抵抗其他癌疗法的患者群体，所述其他癌疗法包括其他酪氨酸激酶抑制剂(例如：Her2抑制剂、Her3抑制剂、EGFR抑制剂、Met抑制剂和IGFR抑制剂)。
可以理解本文所述的实施例和实施方案的目的仅在于说明，并且在其启示下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且将被纳入本申请的精神与范围内以及所附权利要求书的范围内。

Claims (34)

1.下式的抗体药物缀合物
Ab—(L—(D)m)n
其中
Ab是同时与人FGFR2和FGFR4特异性结合的抗体或其抗原结合片段；
L是接头；
D是药物部分；
m是从1至8的整数；并且
n是从1至10的整数；
其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:1的VH CDR1、(b)SEQ ID NO:2的VH CDR2和(c)SEQ ID NO:3的VH CDR3，
且所述轻链可变区包含：(a)SEQ ID NO:11的VL CDR1、(b)SEQ ID NO:12的VL CDR2和SEQ ID NO:13的VL CDR3，其中CDR根据Kabat定义限定。
2.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:7的VH区和SEQ ID NO:17的VL区。
3.根据权利要求2所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体由SEQ ID NO:9的重链和SEQID NO:19的轻链组成。
4.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是人抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、预先带电荷的接头和基于二羧酸的接头。
7.根据权利要求6所述的抗体药物缀合物，其中接头衍生自选自以下的交联试剂：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CX1-1)。
8.根据权利要求7所述的抗体药物缀合物，其中所述接头衍生自交联试剂N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞司他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、蛋白质CRM1核输出的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物和DHFR抑制剂。
10.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分是类美登素。
11.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其中类美登素是N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM4)。
12.抗体药物缀合物，具有以下式：
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2、SEQ ID NO:3的重链CDR3以及SEQ ID NO:11的轻链CDR1、SEQ ID NO:12的轻链CDR2、SEQ ID NO:13的轻链CDR3，其中CDR根据Kabat定义限定；并且
n是1至10。
13.药物组合物，包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗体药物缀合物和可药用载体。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物作为冷冻干燥物制备。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述冷冻干燥物包含抗体药物缀合物、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体药物缀合物或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗FGFR2阳性和/或FGFR4阳性癌的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中癌具有增加的FGFR2基因拷贝数或PAX3-FOXO易位。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述癌选自胃癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤、肝癌、肾上腺癌、肺癌、食道癌、结肠癌和子宫内膜癌。
19.根据权利要求16或17所述的用途，还包括向所述患者施用酪氨酸激酶抑制剂、IAP抑制、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂或另一种FGFR2抑制剂。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述另一种FGFR2抑制剂是3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲或其可药用盐。
21.根据权利要求16或18所述的用途，其中癌症抵抗酪氨酸激酶抑制剂。
22.根据权利要求21所述的用途，其中酪氨酸激酶抑制剂是EGFR、Her2、Her3、IGFR或Met抑制剂。
23.根据权利要求1-8和11-12中任一项所述的抗体药物缀合物，其用作药物。
24.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其用作药物。
25.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其用作药物。
26.根据权利要求1-8和11-12中任一项所述的抗体药物缀合物或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物，其用于治疗FGFR2阳性或FGFR4阳性癌。
27.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其用于治疗FGFR2阳性或FGFR4阳性癌。
28.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其用于治疗FGFR2阳性或FGFR4阳性癌。
29.根据权利要求1-8和11-12中任一项所述的抗体药物缀合物或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物，其用于治疗抵抗酪氨酸激酶抑制剂的癌。
30.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其用于治疗抵抗酪氨酸激酶抑制剂的癌。
31.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其用于治疗抵抗酪氨酸激酶抑制剂的癌。
32.根据权利要求1-8和11-12中任一项所述的抗体药物缀合物或根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物，其用于治疗抵抗EGFR、Her2、Her3、IGFR或Met抑制剂的癌。
33.根据权利要求9所述的抗体药物缀合物，其用于治疗抵抗EGFR、Her2、Her3、IGFR或Met抑制剂的癌。
34.根据权利要求10所述的抗体药物缀合物，其用于治疗抵抗EGFR、Her2、Her3、IGFR或Met抑制剂的癌。
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