JP2016518332A - 抗体薬物コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、およびがんの処置のためのそれらの使用に関する。

Description

発明の分野
本発明は、一般に、抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ならびにがんの処置のためのそれらの使用に関する。
発明の背景
線維芽細胞増殖因子受容体
ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を通じてシグナル伝達する線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、基礎的な発達経路を調節して、多種多様な組織で発現される。ＦＧＦは、増殖、細胞遊走、分化を刺激して、骨格発達および四肢発達、創傷治癒、組織修復、造血、血管形成および腫瘍発生において重要な役割を果たす（例えば、Turner and Crose, Nature Reviews Cancer 10: 116-129 (2010)を参照）。
哺乳動物ＦＧＦファミリーは、多くのリガンドを含み、これらは、４つの高度に保存された膜貫通チロシンキナーゼ受容体であるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４を通じてそれらの作用を発揮する。典型的なＦＧＦＲは、切断されるシグナルペプチド、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（ＩｇドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、酸性ボックス、膜貫通ドメイン、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有する（例えば、Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 203 (1990)、Johnson and Williams, Adv. Cancer Res. 60: 1-41 (1992)を参照）。
さらに、転写された受容体遺伝子の選択的スプライシングは、可溶性の分泌ＦＧＦＲ、切断型ＣＯＯＨ末端ドメインを有するＦＧＦＲ、２つまたは３つのいずれかのＩｇ様ドメインを有するＦＧＦＲを含む様々な受容体アイソフォームをもたらし、ならびに第３のＩｇ様ドメインの選択的スプライシングを介して生じるＦＧＦＲアイソフォームは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３に関してのみ行われ、第３のＩｇ様ドメインの後半を特定し、受容体のＩＩＩｂまたはＩＩＩｃアイソフォームをもたらす。受容体の第２および第３のＩｇ様ドメインは、リガンド結合に関して必要かつ十分であるのに対して、第１のＩｇ様ドメインは、受容体自己抑制において役割を果たすと考えられている。したがって、異なる受容体およびそれらのアイソフォームは、異なるリガンド結合特異性を示す（例えば、Haugsten et al., Mol. Cancer Res. 8:1439-1452 (2010)を参照）。
ＦＧＦはまた、別個のＦＧＦＲおよびそれらのスプライス変異体への結合に加えて、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。それにより、二量体ＦＧＦ−ＦＧＦＲ−ＨＳＰＧ三元複合体が、細胞表面上に形成される。三元複合体は、複合体中の異なる構成成分間の多重相互作用により安定化される。２つのＦＧＦ結合部位であるヘパリン結合部位および受容体間相互作用部位は、受容体のＩｇ様ドメインＩＩおよびＩＩＩ内で同定されている（Haugsten et al., 2010）。
ＦＧＦの、ＦＧＦＲへの結合は、受容体二量体形成を誘導し、これにより、キナーゼドメインの活性化ループ中のチロシンのリン酸転移が可能となる。活性なＦＧＦＲは、ＦＲＳ２およびＰＬＣγのような多重細胞内タンパク質をリン酸化することが知られている（Eswarakumar et al., Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149 (2005)）。ＦＧＦＲシグナル伝達は、細胞増殖および生存の刺激から成長停止、遊走および分化に及ぶ異なる細胞型における別個の生物学的応答を生じる。
ＦＧＦＲおよびがん
ＦＧＦシグナル伝達は、効果：成長／生存における自己充足性（self-sufficiency）、血管新生および腫瘍細胞遊走の強力な組合せを媒介する。その結果として、ＦＧＦシグナル伝達は、その生理学的機能で発揮される厳格な調節がいったん失われると、強力に発がん性となる可能性がある（例えば、Heinzle et al., Expert Opin. Ther. Targets 15（7）:829-846 (2011)を参照）。
ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の遺伝子増幅および／または過剰発現は、乳がんに関与している（Penault-Llorca et al., Int J Cancer 1995、Theillet et al., Genes Chrom. Cancer 1993、Adnane et al., Oncogene 1991、Jaakola et al., Int J Cancer 1993、Yamada et al., Neuro Res 2002）。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４の過剰発現はまた、膵臓腺がんおよび星状細胞腫と関連付けられている（Kobrin et al., Cancer Research 1993、Yamanaka et al., Cancer Research 1993、Shah et al., Oncogene 2002、Yamaguchi et al., PNAS 1994、Yamada et al., Neuro Res 2002）。前立腺がんもまた、ＦＧＦＲ１過剰発現に関連する（Giri et al., Clin Cancer Res 1999）。ＦＧＦＲ４過剰発現は、横紋筋肉腫に関与している（Khan et al., Nature Medicine 2001、Baird et al., Cancer Res 2005）。胞巣状横紋筋肉腫のサブセットは、ＦＧＦＲ４を直接転写的に活性化して、ＦＧＦＲ４タンパク質発現の増加をもたらす新規融合タンパク質を生じるＰＡＸ３−ＦＯＸＯトランスロケーションを保有する（Cao et al., Cancer Res 2010、Davicioni et al., Cancer Res 2006）。
概して、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ１は、より一般的に遺伝子増幅により調節解除される。胃がんでは、増幅されたＦＧＦＲ２遺伝子は、予後不良と関連付けられる（Kunii et al., Cancer Res. 68:2340-2348 (2008)）。また、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂからＩＩＩｃへの切り換えは、膀胱がんおよび前立腺がんにおいて腫瘍進行、上皮間葉移行および高い侵襲性の兆候となり得る。切り換えは、この場合、抗腫瘍原性活性を発揮するＩＩＩｂ受容体変異体を、腫瘍形成誘発性（protumorigenic）ＩＩＩｃ受容体で置換する（例えば、Heinzle et al., 2011を参照）。これまでのところ、ＦＧＦＲ２突然変異は、皮膚がん、子宮内膜がん、卵巣がんおよび肺がんに関与している。ＦＧＦＲ４突然変異は、横紋筋肉腫がん、肺がんおよび乳がんに関与している（例えば、Heinzle et al., 2011を参照）。
抗体薬物コンジュゲート
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、がんの処置における細胞毒性剤の局所送達のために使用されてきた（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３〜５４９，２００５を参照されたい）。ＡＤＣにより、最小の毒性で最大の効能を達成することができる薬物部分の標的化された送達が可能になる。ＡＤＣが有望な臨床結果を示すにつれて、がん療法のための新しい治療剤を開発する必要性が増大する。
発明の要旨
本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ（式中、ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり；Ｌはリンカーであり；Ｄは薬物部分であり；ｍは１〜８の整数であり；ｎは１〜１０の整数である）またはその薬学的に許容される塩の抗体薬物コンジュゲートを提供する。幾つかの実施形態では、ｍは１である。幾つかの実施形態では、ｎは３または４である。特定実施形態では、ｍは１であり、ｎは３または４である。
本発明は、ヒトＦＧＦＲ２およびヒトＦＧＦＲ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、ヒトＦＧＦＲ４およびヒトＦＧＦＲ２の全てのアイソフォームに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３６または配列番号１４１を含むか、またはそれからなるヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
本発明の抗体、抗原結合性断片、および抗体薬物コンジュゲートはまた、ヒトＦＧＦＲ４に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、それらは、ヒトＦＧＦＲ４のＤ１およびＤ２ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、それらは、ヒトＦＧＦＲ４のＤ１またはＤ２ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のアミノ酸残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３２または配列番号１３３を含むか、またはそれからなるヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸１６０〜１８９および／または配列番号１３７のアミノ酸１９８〜２１６を含むエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のアミノ酸１５０〜１７４および／または配列番号１４２のアミノ酸２０１〜２１２を含むエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸１６０〜１８９および／または配列番号１３７のアミノ酸１９８〜２１６を含むエピトープ、ならびに配列番号１４２のアミノ酸１５０〜１７４および／または配列番号１４２のアミノ酸２０１〜２１２を含む第２のエピトープに特異的に結合する。
幾つかの実施形態では、本発明は、表１に記載する抗体、それらの抗原結合性断片、およびかかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体および抗原結合性断片を提供し、ここで、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される。幾つかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断は、（ａ）配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ａ）配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。本発明はさらに、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号７のＶＨ領域および配列番号１７のＶＬ領域を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる。本発明はまた、かかる抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に関して、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と交差競合する（cross compete）抗体または抗原断片である。本発明はまた、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有さない。本発明はまた、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、モノクローナルヒトまたはヒト化抗体である。
幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片、および薬物部分を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、ここで、薬物部分は、リンカーを介して抗体または抗原結合性断片に連結され、上記リンカーは、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬から誘導される。特定の実施形態では、リンカーは、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片、および薬物部分を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、ここで前記薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤（destabilizer）、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤（DNA minor groove binder）およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。特定実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの薬物部分は、メイタンシノイドである。別の特定実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの薬物部分は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
１つの実施形態では、本発明は、下記式：
（式中、Ａｂは配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され、ｎは１〜１０である）
を有する抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を提供する。特定実施形態では、ｎは３または４である。１つの実施形態では、Ａｂは、配列番号７のＶＨ領域および配列番号１７のＶＬ領域を含む抗体である。別の実施形態では、Ａｂは、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体である。
本発明はまた、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、凍結乾燥物（lyophilisate）として調製される。幾つかの実施形態では、凍結乾燥物は、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む。
本発明は、それを必要とする患者におけるＦＧＦＲ２陽性またはＦＧＦＲ４陽性がんを処置する方法であって、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を、上記患者に投与することを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態では、がんは、胃がん、乳がん、横紋筋肉腫、肝臓がん、副腎がん、肺がん、食道がん、結腸がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは、胞巣状横紋筋肉腫および胎児性横紋筋肉腫から選択される。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する処置方法は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤または別のＦＧＦＲ２阻害剤を、上記患者に投与することをさらに含む。特定実施形態では、処置方法は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペリジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素またはその薬学的に許容される塩、例えばそのリン酸塩と組み合わせて、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む。ある特定の態様では、本発明はまた、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性ながんを処置する方法を提供する。
本発明はさらに、医薬としての使用のための本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートを提供する。本発明は、ＦＧＦＲ２陽性がんまたはＦＧＦＲ４陽性がんの処置における使用のための抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。本発明は、耐性がん、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
本発明はまた、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片をコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、表１に記載するような抗体または抗原結合性断片をコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本明細書中に記載する核酸を含むベクター、およびかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、本明細書中に記載する宿主細胞を培養すること、および培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合性断片を生成するための方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結すること、（ｂ）上記リンカー−薬物を、細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートすること、および（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することを含む、抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法を提供する。幾つかの実施形態では、上記方法に従って作製される抗体薬物コンジュゲートは、ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．５の平均ＤＡＲを有する。
本発明はまた、標識された本明細書中に記載する抗体もしくは抗原結合性断片、または本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートを含む診断試薬を提供する。幾つかの実施形態では、標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオンからなる群から選択される。
定義
別途記述しない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される。
用語「アルキル」とは、特定数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜６アルキルとは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状または分枝状であってもよい。代表的な分枝状アルキル基は、１、２、または３個の分枝を有する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、およびネオペンチル）、ならびにヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用される用語「抗体」とは、非共有的に、可逆的に、および特異的様式で対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと省略される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４に配置される３つのＣＤＲと、４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
用語「抗体」は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであってもよい。
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を互換的に指す。ＣＤＲは、そのような標的タンパク質に対する特異性を担持する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けられる）が存在し、可変ドメインの約１５〜２０％を占める。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、かくして、結合特異性を直接担う。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
ＣＤＲとフレームワーク領域の位置を、当業界における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイブウェブ上でimgt.cines.fr/にて）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照されたい）を使用して決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインポーションが抗原認識および特異性を決定付けることが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増大する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを実際に含む。
本明細書で使用される用語「抗原結合性断片」とは、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持する抗体の１または複数のポーションを指す。結合断片の例としては、限定されるものではないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられる。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、それらを、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を形成する単一タンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより連結することができる；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988;およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照されたい。そのような一本鎖抗体も、用語「抗原結合性断片」内に包含されることが意図される。これらの抗原結合性断片は、当業者には公知の従来の技術を使用して得られ、その断片はインタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片を、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）中に組込むこともできる。抗原結合性断片を、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場中に移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。
抗原結合性断片を、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する並列Ｆｖセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組込むことができる（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; および米国特許第５，６４１，８７０号）。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝的起源から誘導される抗体および抗原結合性断片などのポリペプチドを指す。この用語はまた、単一分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、またはヒト生殖系列配列の変異型または例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000に記載のような、ヒトフレームワーク配列分析から誘導されるコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体から誘導される。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異により、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換により導入される突然変異）。
本明細書で使用される用語「親和性」とは、単一の抗原部位での抗体と抗原との相互作用の強度を指す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有力を介して、いくつかの部位で抗原と相互作用する；相互作用が大きくなるほど、親和性が強くなる。
用語「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原との交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
用語「対応するヒト生殖系列配列」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によりコードされる他の全ての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、他の全ての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列を指してもよい。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク領域と相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義されたもの）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってもよい。例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当業界で公知の別のアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列を整列させる、本明細書に記載の方法を使用して、配列同一性を決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有してもよい。相当するヒト生殖系列配列は、例えば、公開されている国際IｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイブウェブ上でimgt.cines.fr/にて）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイブウェブ上でvbase.mrc-cpe.cam.ac.ukにて）によって決定することができる。
抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片、または抗体由来結合剤との間の相互作用を記述する文脈で使用される場合の語句「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生物試料、例えば、血液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。かくして、ある特定の指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。一実施形態では、指定のイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１０倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について抗体または薬剤を選択する必要があってもよい。望ましい場合または適切な場合、この選択を、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他のサブタイプに由来する分子と交差反応する抗体を除去することにより達成することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、ある特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体断片を選択する。
「特異的に結合する」という用語は、エピトープと抗体、抗体断片または抗体由来の結合性作用物質（binding agent）との間の相互作用について記載する状況で使用する場合、エピトープが直鎖状であろうと、立体構造的であろうと、そのエピトープを見つけて、それと相互作用する（例えば、結合する）抗体または抗原結合性断片を指す。用語「エピトープ」とは、本発明の抗体または抗原結合性断片が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次元折畳みにより並置される連続的アミノ酸または非連続的アミノ酸の両方から形成させることができる。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次元折畳みにより形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的コンフォメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、当業界における技術、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。
様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するためには、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍のシグナルをもたらす。
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」とは、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算したものを指す。当業界における任意の公知の方法を使用して、平衡解離定数を測定することができる。本発明の抗体は一般に、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、いくつかの実施形態では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
用語「バイオアベイラビリティ」とは、患者に投与される所与の量の薬物の全身利用能（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形（dosage form）から全身循環に達する薬物の時間（速度）と総量（程度）の両方の尺度を示す絶対項である。
本明細書で使用される語句「から本質的になる」とは、方法または組成物中に含まれる活性薬剤の属または種、ならびに方法または組成物の意図される目的にとって不活性な任意の賦形剤を指す。いくつかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤の含有を明確に排除する。いくつかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤と、第２の同時投与される薬剤との含有を明確に排除する。
用語「アミノ酸」とは、天然の、合成の、および非天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したα−炭素を指す。そのような類似体は改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似する様式で機能する化合物を指す。
用語「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一の、もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重性のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。かくして、アラニンがあるコドンによって特定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化させてもよい。そのような核酸変化は「サイレント変異」であり、保存的に改変されたバリアントの１種である。ポリペプチドをコードする全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記述する。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧと、通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識できる。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれ記載される配列中で暗黙的である。
ポリペプチド配列について、「保存的に改変されたバリアント」は、あるアミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらすポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子だけでなく、それを排除しない。以下の８群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。いくつかの実施形態では、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響しないか、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指すように使用される。
本明細書で使用される用語「最適化された」とは、生成細胞または生物、一般には、真核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア（Pichia）細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変化させたヌクレオチド配列を指す。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる、出発ヌクレオチド配列により元々コードされるアミノ酸配列を完全に、またはできるだけ多く保持するように操作される。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一であるパーセント」または「同一性パーセント」とは、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指す。２つの配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同じ配列を有する場合、「同一」である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは手動によるアラインメントおよび視覚的検査により測定される比較ウィンドウ、または指定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列された場合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とをコンピュータに入力し、サブ配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用するか、または代替パラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントを算出する。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置数の任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の部分相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003を参照されたい）により行うことができる。
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満足する、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、supra）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種子として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限りそれぞれの配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアを、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少する場合、停止される；１または複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアはゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指示を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０ウェイト残テーブル（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988のアルゴリズムを使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれたNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970のアルゴリズムを使用して決定することができる。
上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。かくして、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、２つの分子またはその相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指示は、同じプライマーを使用してその配列を増幅することができることである。
用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。この用語は、合成である、天然である、および非天然である、参照核酸と類似する結合特性を有する、ならびに参照ヌクレオチドと類似する様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホルアミデート（phosphoroamidate）、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
別途指摘しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する。特に、以下に詳述されるように、１または複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
核酸の文脈における用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列が適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的に連続している、すなわち、それらはｃｉｓ作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に対して物理的に連続しているか、またはそれに近接して位置する必要はない。
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書では互換的に使用される。この用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別途指摘しない限り、特定のポリペプチド配列は、保存的に改変されたそのバリアントも暗示的に包含する。
本明細書で使用される用語「イムノコンジュゲート」または「抗体薬物コンジュゲート」または「コンジュゲート」は、抗体またはその抗原結合性断片と、化学療法剤、毒素、免疫治療剤、画像化プローブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または静電力などを介する非共有相互作用であってもよい。当業界で公知の様々なリンカーを使用して、イムノコンジュゲートを形成させることができる。さらに、イムノコンジュゲートを、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現させることができる融合タンパク質の形態で提供することができる。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」とは、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を元々コードしていた２つ以上の遺伝子または遺伝子断片の連結により作出されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々から誘導される機能特性を有する単一のタンパク質をもたらす。
「塩（単数）」または「塩（複数）」という用語は、化合物の酸付加または塩基付加塩、例えば、本発明の抗体薬物コンジュゲートと組み合わせて投与される別の治療剤である化合物を指す。「塩」は、特に「薬学的に許容される塩」を含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、通常、生物学的に、または他の点で望ましくない塩を指す。多くの場合、化合物は、アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれらに類似した基の存在によって酸および／または塩基の塩を形成することが可能である。
用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。注記しない限り、用語「患者」または「対象」は、互換的に本明細書に使用される。
本明細書で使用される用語「細胞毒素」または「細胞毒性剤」は、細胞の成長および増殖にとって有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少させる、阻害する、または破壊するように作用することができる任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される用語「抗がん剤」とは、限定されるものではないが、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、ならびに免疫治療剤などの、がんなどの細胞増殖障害を処置するために使用することができる任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される用語「薬物部分」または「ペイロード」とは、本発明の抗体または抗原結合性断片にコンジュゲートされ、任意の治療剤または診断剤、例えば、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、または麻酔剤を含んでもよい化学部分を指す。例えば、薬物部分は、細胞毒のような抗がん剤であり得る。特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される。これらの各々を、抗体と適合するリンカーに結合させるための方法および本発明の方法は、当業界で公知である。例えば、Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照されたい。さらに、ペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、サッカリドまたはポリサッカリドであってもよい。
用語「メイタンシノイド薬物部分」は、メイタンシノイド化合物の構造を有する抗体薬物コンジュゲートの下部構造を意味する。メイタンシノイドは、東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Maytenus serrata）から初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が報告されている。米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号、ならびにKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451（それぞれ参照により明示的に組み込まれる）を参照されたい。コンジュゲーションにとって有用な特定のメイタンシノイドの例としては、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４が挙げられる。
「腫瘍」とは、悪性であっても、または良性であっても、新生物性細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存能力、または転移活性の速度の低下を意味する。例えば、抗腫瘍活性は、治療法中に生じる異常細胞の成長速度の低下または腫瘍サイズの安定性もしくは低減、または治療法を用いない対照と比較した場合の治療法に起因したより長い生存により示され得る。そのような活性を、限定されるものではないが、異種移植片モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査するための当業界で公知の他のモデルなどのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおいて受け入れられるものを使用して評価することができる。
用語「悪性腫瘍」とは、非良性腫瘍またはがんを指す。本明細書で使用される用語「がん」は、脱調節された、または制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍を含む。例示的ながんとしては、がん腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が元の腫瘍部位以外の対象の身体部位に移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる第２の部位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。
「ＦＧＦＲ２」という用語は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの成員である線維芽細胞増殖因子受容体２を指す。ＦＧＦＲ２の核酸およびアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１．４、ＮＭ＿００１１４４９１３．１、ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿００１１４４９１５．１、ＮＭ＿００１１４４９１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．１、ＮＭ＿００１１４４９１８．１、ＮＭ＿００１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７０．３、ＮＭ＿０２３０２９．２で公開されている。構造的には、ＦＧＦＲ２アミノ酸配列は、切断されるシグナルペプチド、少なくとも１つまたは複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、酸性ボックス、膜貫通ドメイン、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有する受容体チロシンキナーゼタンパク質であり、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１．４、ＮＭ＿００１１４４９１３．１、ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿００１１４４９１５．１、ＮＭ＿００１１４４９１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．１、ＮＭ＿００１１４４９１８．１、ＮＭ＿００１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７０．３、ＮＭ＿０２３０２９．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。構造的には、ＦＧＦＲ２核酸配列は、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１．４、ＮＭ＿００１１４４９１３．１、ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿００１１４４９１５．１、ＮＭ＿００１１４４９１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．１、ＮＭ＿００１１４４９１８．１、ＮＭ＿００１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７０．３、ＮＭ＿０２３０２９．２の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
「ＦＧＦＲ４」という用語は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの成員である線維芽細胞増殖因子受容体４を指す。ＦＧＦＲ４の核酸およびアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、ＮＭ＿２１３６４７．１で公開されている。構造的には、ＦＧＦＲ４アミノ酸配列は、切断されるシグナルペプチド、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、酸性ボックス、膜貫通ドメイン、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有する受容体チロシンキナーゼタンパク質であり、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、ＮＭ＿２１３６４７．１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。構造的には、ＦＧＦＲ４核酸配列は、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、ＮＭ＿２１３６４７．１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
「ＦＧＦＲ２／４」という用語は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４を指すのに本明細書中で使用される。例えば、ＦＧＦＲ２／４に結合する抗体は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４に結合する抗体を指す。
「ＦＧＦＲ２発現性がん」または「ＦＧＦＲ２陽性がん」という用語は、がん細胞の表面上にＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２の突然変異形態を発現するがんを指す。「ＦＧＦＲ４発現性がん」または「ＦＧＦＲ４陽性がん」という用語は、がん細胞の表面上にＦＧＦＲ４またはＦＧＦＲ４の突然変異形態を発現するがんを指す。
「チロシンキナーゼ耐性がん」または「チロシンキナーゼ耐性腫瘍」という用語は、（１）開始するケアチロシンキナーゼ処置の規格に応答せず、「新生耐性」と称されるがんまたは腫瘍、または（２）最初はケアチロシンキナーゼ処置の規格に応答し、古い、および／または新しい病変または伝播の再出現により決定されるように、その後進行するがんまたは腫瘍を指し、これらはまた、「二次耐性」または「再発したがん」とも称される。
「Ｈｅｒ２耐性がん」または「Ｈｅｒ２耐性腫瘍」という用語は、（１）開始するケアＨｅｒ２処置の規格に応答せず、「新生耐性」と称されるがんまたは腫瘍、または（２）最初はケアＨｅｒ２処置の規格に応答し、古い、および／または新しい病変または伝播の再出現により決定されるように、その後進行するがんまたは腫瘍を指し、これらはまた、「二次耐性」または「再発したがん」とも称される。
本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害の用語「処置する（治療する（treat））」、「処置すること（治療すること（treating））」または「処置（治療（treatment））」とは、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患または少なくとも１つのその臨床症状の発生を減速させるか、または停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメーターを軽減または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、またはその両方で調節することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の開始または発生または進行を遅延させることを指す。
用語「治療的に許容される量」または「治療有効用量」は、所望の結果（すなわち、腫瘍サイズの低下、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染の阻害または防止）を得るのに十分な量を互換的に指す。いくつかの実施形態では、治療的に許容される量は、望ましくない副作用を誘導しない、または引き起こさない。幾つかの実施形態では、治療上許容される量は、副作用（但し、患者の状態を考慮して、医療機関により許容されるもののみ）を誘導するか、またそれを引き起こす。治療的に許容される量を、最初は低用量を投与し、次いで、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることにより決定することができる。「予防有効用量」および「治療有効用量」の本発明の分子は、がんと関連する症状などの疾患症状の、それぞれ、開始を防止するか、またはその重症度の低下をもたらし得る。
用語「同時投与する」とは、個体の血液中の２つの活性薬剤の存在を指す。同時投与される活性薬剤を、同時に、または連続的に送達することができる。
図１は、組換えヒトＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂに対する抗体パネルに関する親和性推定値を示す。 図２（Ａ）〜図２（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体の、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２受容体系においてアゴニストとして作用する能力を示す。 図３（Ａ）〜図３（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体の、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２受容体系においてアンタゴニストとして作用する能力を示す。 図４（Ａ）〜図４（Ｂ）は、ＳＮＵ１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。 図４（Ａ）〜図４（Ｂ）は、ＳＮＵ１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。 図４（Ｃ）は、ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー−ペイロードにコンジュゲートされるＡＤＣとしての１２４３３抗体の抗腫瘍活性を示し、図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの薬物動態特性を示す。 図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの薬物動態特性を示す。 図４（Ｆ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣパネルに関するＡＤＣクリアランスに対する抗腫瘍活性を示す。 図５（Ａ）〜図５（Ｃ）は、２時間後のＦＧＦＦＲ−２で増幅させた細胞株ＳＮＵ１６（Ａ）、２〜７２時間後のＦＧＦＦＲ−２で増幅させた細胞株ＳＮＵ１６（Ｂ）またはＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞（Ｃ）におけるＦＧＦＲシグナル伝達および総合的な受容体発現を調節する能力を示すウェスタンブロットである。 図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ＩｇＧおよび遊離ペイロード対照に対するＳＮＵ−１６（Ａ）、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ（Ｂ）またはＮＵＧＣ３（Ｃ）細胞の増殖を阻害する能力を示し、図６（Ｄ）は、コンジュゲートされていない抗体１２４２５が、いかなる感知可能な抗増殖効果も有さなかったことを示す。 図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ＩｇＧおよび遊離ペイロード対照に対するＳＮＵ−１６（Ａ）、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ（Ｂ）またはＮＵＧＣ３（Ｃ）細胞の増殖を阻害する能力を示し、図６（Ｄ）は、コンジュゲートされていない抗体１２４２５が、いかなる感知可能な抗増殖効果も有さなかったことを示す。 図７（Ａ）〜図７（Ｂ）は、ｐＨＨ３および切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＳＮＵ−１６（Ａ）またはＮＵＧＣ３（Ｂ）腫瘍異種移植片の画像である。 図７（Ａ）〜図７（Ｂ）は、ｐＨＨ３および切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＳＮＵ−１６（Ａ）またはＮＵＧＣ３（Ｂ）腫瘍異種移植片の画像である。 図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（xenograph）（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。 図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。 図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。 図９は、ＣＨＧＡ−１１９腫瘍異種移植片モデルにおける、単独での、およびＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＢＧＪ３９８と組み合わせた、抗ＦＧＦＲ２／４ＡＤＣ、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を示す。 図１０は、ＳＮＵ−１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける、異なる用量およびスケジュールでの抗ＦＧＦＲ２／４ＡＤＣ、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を示す。 図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。 図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。 図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。 図１２（Ａ）〜図１２（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体またはＡＤＣの、２時間後（Ａ）または経時的に（Ｂ）、ＦＧＦＲ４発現性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４５３におけるＦＧＦＲシグナル伝達および総合的な受容体発現を調節する能力を示すウェスタンブロットである。 図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。 図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。 図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。 図１４（Ａ）〜図１４（Ｃ）は、ｐＨＨ３および／または切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＭＤＡ−ＭＢ４５３（（Ａ）および（Ｂ））またはＲＨ４（Ｃ）腫瘍異種移植片の画像である。 図１５（Ａ）〜図１５（Ｂ）は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）およびＲＨ４（Ｂ）腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。 図１６（Ａ）〜図１６（Ｄ）は、マウス（（Ａ）〜（Ｂ））、ラット（Ｃ）またはカニクイザル（Ｄ）における１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルを示す。 図１６（Ａ）〜図１６（Ｄ）は、マウス（（Ａ）〜（Ｂ））、ラット（Ｃ）またはカニクイザル（Ｄ）における１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルを示す。 図１７（Ａ）〜図１７（Ｂ）は、１２４２５（２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１）の操作変異体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｂ）でのＳＮＵ−１６細胞の増殖を阻害する能力を示す。 図１８（Ａ）〜図１８（Ｂ）は、１０１６４（２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１）および１２４２５（２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１）の親和性成熟変異体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｂ）でのＳＮＵ−１６細胞の増殖を阻害する能力を示す。 図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。 図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。 図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。 図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。 図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。 図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。 図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。 図２１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＳＮＵ １６細胞およびＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞の感度を、ＢＧＪ３９８またはゲフィニチブ（ＩＣ５０＝１６．７ｎＭ）と比較する増殖研究の結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方（「ＦＧＦＲ２／４」）に結合する抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートを提供する。特に、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に結合し、そのような結合の際に内在化する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を、抗体薬物コンジュゲートを生成するために使用することができる。さらに、本発明は、望ましい薬物動態特性および他の望ましい属性を有し、したがって、胃がん、乳がん、横紋筋肉腫（例えば、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫）、肝臓がん、副腎がん、肺がん、結腸がんおよび子宮内膜がんのようなＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４を発現するがんを処置するのに使用され得る抗体薬物コンジュゲートを提供する。本発明はさらに、本発明の抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにがんの処置のためにそのような医薬組成物を作製し、使用する方法を提供する。
抗体薬物コンジュゲート
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物が薬物部分に連結された、抗体薬物コンジュゲートを提供する。一態様では、本発明の抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物は、リンカーによる共有結合を介して、抗がん剤である薬物部分に連結される。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、有効用量の抗がん剤（例えば、細胞毒性剤）を、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４を発現する腫瘍組織に選択的に送達し、それによって、より高い選択性（およびより低い有効用量）を達成することができる。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、Ａｂは、本明細書に記載のＦＧＦＲ２／４結合抗体を表し；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一実施形態では、ｎは１〜１０、２〜８、または２〜５の整数である。特定の実施形態では、ｎは２、３または４である。いくつかの実施形態では、ｍは１である。他の実施形態では、ｍは２、３または４である。
薬物と抗体の比率は特定のコンジュゲート分子については正確な値を有するが（例えば、式（Ｉ）中でｍを掛けたｎ）、その値は、典型的には、コンジュゲーションステップと関連する、ある程度の不均等性のため、多くの分子を含有する試料を記述するために使用される場合には平均値であることが多いことを理解されたい。イムノコンジュゲートの試料に関する平均充填量を、本明細書では薬物と抗体の比率、または「ＤＡＲ」と呼ぶ。幾つかの実施形態では、薬物がメイタンシノイドである場合、それは、「ＭＡＲ」と称される。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは約１〜約５であり、典型的には、約３、３．５、４、４．５または５である。いくつかの実施形態では、試料の少なくとも５０重量％は、平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、好ましくは、試料の少なくとも５０％は、平均ＤＡＲ±１を含有するコンジュゲートである。好ましい実施形態は、ＤＡＲが約３．５であるイムノコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値がｎの２０％以内にあることを意味する。
本発明はまた、薬物部分に連結またはコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）およびその機能的等価物を含むイムノコンジュゲートに関する。一実施形態では、薬物部分Ｄは、構造：
（式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカーへのメイタンシノイドの硫黄原子の共有結合を示す）
を有するものなどの、メイタンシノイド薬物部分である。Ｒは、出現する毎に、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであってよい、すなわち、ｍは１、２または３である（米国特許第６３３，４１０号、米国特許第５，２０８，０２０号、Chari et al. (1992) Cancer Res. 52; 127-131、Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623）。
メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち、メイタンシノイドのキラル炭素でのＲおよびＳ配置の任意の組合せが、本発明のイムノコンジュゲートについて企図される。一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。
一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１としても知られる）である。ＤＭ１は、以下の構造式により表される。
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３としても知られる）である。ＤＭ３は、以下の構造式により表される。
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４としても知られる）である。ＤＭ４は、以下の構造式により表される。
薬物部分Ｄは、リンカーＬによって抗体Ａｂに連結され得る。Ｌは、共有結合によって薬物部分を抗体に連結することが可能な任意の化学部分である。架橋試薬は、薬物部分および抗体を連結して、抗体薬物コンジュゲートを形成するのに使用され得る二官能性または多官能性試薬である。抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分および抗体への結合を可能にする反応官能性を有する架橋試薬を使用して調製することができる。例えば、システイン、チオールまたはアミン、例えばＮ末端またはアミノ酸鎖側鎖（抗体のリシンのような）は、架橋試薬の官能基と結合を形成することができる。
一実施形態では、Ｌは切断性リンカーである。別の実施形態では、Ｌは非切断性リンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌは酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ジスルフィド結合切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は当業界で周知であり、硫黄原子（ＳＭＣＣなど）を含む非切断性リンカーまたは硫黄原子を含まないものを形成することができる。薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含む。本発明によれば、そのような非切断性リンカーは、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分から誘導されると言われる。
マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸（undeconoic acid）Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（−ｐ−マレオミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳなどのポリエチレングリコールスペーサを含有するマレイミドに基づく架橋試薬が挙げられる。これらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分から誘導される非切断性リンカーを形成する。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
別の実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）またはＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳから誘導される。
ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。これらの架橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分から誘導される非切断性リンカーを形成する。ハロアセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）またはＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から誘導される。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当業界で周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で起こり得るジスルフィド交換を介して切断可能であるリンカーである。本発明によれば、そのような切断性リンカーは、ジスルフィドに基づく部分から誘導されると言われる。好適なジスルフィド架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられ、その構造は以下に示される。これらのジスルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分から誘導される切断性リンカーを形成する。
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）および
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）。
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）から誘導される。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で荷電リンカーを形成する好適な架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として知られる。一実施形態では、リンカーＬは、プロチャージ架橋試薬ＣＸ１−１から誘導される。ＣＸ１−１の構造は、以下の通りである。
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）。
上記で表される架橋試薬はそれぞれ、架橋試薬の一方の末端に、抗体の第一級アミンと反応して、アミド結合を形成するＮＨＳ−エステル、および他方の末端に、メイタンシノイド薬物部分のスルフィドリルと反応して、チオエーテルまたはジスルフィド結合を形成するマレイミド基またはピリジニルジスルフィド基を含有する。
１つの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、下記構造式のいずれか１つにより表される。
式中、
ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
アミド結合とＡｂの第１級アミンとの形成を介してＡｂに結合したＤ−Ｌ基の数を示すｎは、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎは１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎは３または４である。
一実施形態では、コンジュゲート中の薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と抗体との平均モル比（すなわち、メイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても知られる、平均ｎ値）は、約１〜約１０、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０または８．１）、約２．５〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４または約５．５）である。
本発明の１つの態様では、本発明のコンジュゲートは、実質的に高い純度を有し、下記特色の１つまたは複数を有する：（ａ）約９０％を上回る（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を上回るか、またはそれに等しい）、好ましくは約９５％を上回るコンジュゲート種が単量体であること、（ｂ）コンジュゲート調製物中のコンジュゲートされていないリンカーレベルが、約１０％未満であること（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満であるか、それに等しい）（総リンカーに対して）、（ｃ）１０％未満のコンジュゲート種が架橋されること（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）、（ｄ）コンジュゲート調製物における遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）レベルが、約２％未満であること（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）（総細胞障害性作用物質に対するｍｏｌ／ｍｏｌ）、および／または（ｅ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルにおける実質的な増加が、貯蔵時に起こらないこと（例えば、約１週、約２週、約３週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、約３年、約４年または約５年後）。遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルにおける「実質的な増加」は、ある特定の貯蔵時間（例えば、約１週、約２週、約３週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、約３年、約４年または約５年）後に、遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルの増加が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
本明細書で使用される用語「非コンジュゲート化リンカー」とは、抗体がリンカーを介して薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）に共有的にカップリングしていない、架橋試薬（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）から誘導されるリンカーと共有的に連結された抗体を指す（すなわち、「非コンジュゲート化リンカー」はＡｂ−ＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、またはＡｂ−ＣＸ１−１で表すことができる）。
１．薬物部分
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本発明のイムノコンジュゲートは、薬物部分、例えば、抗がん剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔剤にコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ２／４抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を含む。本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、当業界で公知の任意の方法を使用して、いくつかの同一の、または異なる薬物部分にコンジュゲートすることができる。
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、限定されるものではないが、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのメイタンシノイド薬物部分である。
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、所与の生物学的応答を改変する薬物部分にコンジュゲートすることができる。薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、または例えば、リンホカインなどの生物応答改変剤を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコンジュゲートされる。細胞毒素の例としては、限定されるものではないが、タキサン（例えば、国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／３８３１８およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５を参照されたい）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、ツブリシン（tubulysin）類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド、ならびに反応性ポリエチレングリコール部分（例えば、Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood (2003)（印刷出版物に先立って、電子出版物）、米国特許第５，４７５，０９２号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７３８号、および第６，４３６，９３１号、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３Ａ１号、係属中米国特許出願第１０／０２４，２９０号および第１０／１１６，０５３号、ならびに国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／４９６９８を参照されたい）を含む細胞毒性剤、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、削摩剤（ablating agent）（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる（例えば、Seattle GeneticsのＵＳ２００９０３０４７２１を参照されたい）。
本発明の抗体、抗体断片（抗原結合性断片）または機能的等価物にコンジュゲートすることができる細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにその誘導体が挙げられる。
治療剤を抗体にコンジュゲートするための様々な型の細胞毒素、リンカーおよび方法は、当業界で公知であり、例えば、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、放射性アイソトープにコンジュゲートして、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる、細胞毒性放射性薬剤を作成することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートすることができる放射性アイソトープの例としては、限定されるものではないが、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、イットリウム−９０、およびルテチウム−１７７が挙げられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当業界で確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、商業的に入手可能であり、同様の方法を使用して、本発明の抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当業界で一般に公知であり、それぞれ全体が参照により組み込まれる、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲートして、融合タンパク質を作成することもできる。特に、本発明は、本明細書に記載の抗体断片（例えば、抗原結合性断片）（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術により作成することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明の抗体またはその断片の活性（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片）を変化させることができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、および第５，８３７，４５８号; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もしくはその断片は、組換え前に変異性ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法により無作為突然変異誘発にかけることにより変化させることができる。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１または複数の異種分子の、１または複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、ペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートして、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標），Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くが商業的に入手可能である。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合の精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ（登録商標）」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001）が挙げられる。本発明によれば、抗体または抗原結合性断片を、腫瘍浸透ペプチドにコンジュゲートして、その効能を増強することもできる。
他の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされる。そのようなイムノコンジュゲートは、特定の療法の効能の決定などの、臨床試験手順の一部として疾患または障害の開始、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは予後診断するのに有用であり得る。そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光材料；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光材料；限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなどの放射性材料；ならびに様々なポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンなどの、検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成することができる。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、標的抗原のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に結合することもできる。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
２．リンカー
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、薬物部分などの別の部分に、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を連結することができる任意の化学部分である。幾つかの場合で、リンカーの一部が、メイタンシノイドにより供給される。例えば、チオール含有メイタンシノイドであるＤＭ１は、天然メイタンシノイドの誘導体であり、リンカーの一部を供給する。メイタンシンのＣ−３水酸基にある側鎖は、ＣＯ−ＣＨ３に終わり、ＤＭ１の側鎖は、ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨに終わる。したがって、最終的なリンカーは、２つの片、即ち抗体へ導入される架橋試薬およびＤＭ１由来の側鎖から構築される。リンカーは、化合物または抗体が活性を保持する条件下で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断などの切断の影響を受けやすいものであってもよい（切断性リンカー）。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であってもよい（例えば、安定性リンカーまたは非切断性リンカー）。いくつかの態様では、リンカーは、プロチャージリンカー、親水性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
非切断性リンカーは、安定な、共有的な様式でメイタンシノイドなどの薬物を、抗体に連結することができ、切断性リンカーについて上記に列挙されたカテゴリーの下から外れない任意の化学部分である。かくして、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性である。さらに、非切断性とは、メイタンシノイドなどの薬物または抗体がその活性を喪失しない条件下で、酸、光不安定性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理的化合物により誘導される切断に耐える、リンカー中の、またはリンカーに隣接する化学的結合の能力を指す。
ジスルフィド含有リンカーは、ジスルフィド交換によって切断可能なリンカーであり、これは、生理学的条件下で起こり得る。酸不安定リンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定リンカーを切断するのに好適な条件を提供する。
光不安定リンカーは、光に接近可能である体表面で、および多くの体腔において有用であるリンカーである。さらに、赤外線は組織に浸透することができる。
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼ、すなわち、ペプチダーゼ切断性リンカーにより切断することができる。特定のペプチドのみが、細胞の内部または外部で容易に切断される。例えば、Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらに、ペプチドは、α−アミノ酸と、化学的には、あるアミノ酸のカルボキシレート基と、第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合とから構成される。リシンのカルボキシレート基およびε−アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合ではないと理解され、非切断性であると考えられる。
いくつかのリンカーは、エステラーゼにより切断することができる、すなわち、エステラーゼ切断性リンカーである。再度、特定のエステルのみを、細胞の内部または外部に存在するエステラーゼにより切断することができる。エステルは、カルボン酸とアルコールとの縮合により形成される。単純エステルは、脂肪族アルコール、ならびに小環状および低分子芳香族アルコールなどの、単純アルコールを使用して生成されるエステルである。
プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組込み後にその電荷を保持する荷電した架橋試薬から誘導される。プロチャージリンカーの例を、ＵＳ２００９／０２７４７１３に見出すことができる。
一態様では、本発明で使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬から誘導される。別の態様では、本発明で使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋剤から誘導される。
３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号、第６，４１１，１６３号、第７，３６８，５６５号、および第８，１６３，８８８号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号、第２０１１／０１６６３１９号、第２０１２／０２５３０２１号および第２０１２／０２５９１００号に記載のものなどの当業界で公知の任意の方法により調製することができる。これらの特許および特許出願公開の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
１ステッププロセス
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、１ステッププロセスによって調製することができる。このプロセスは、実質的に水性の媒体中で抗体、薬物および架橋剤を混合すること、任意選択で、好適なｐＨで１または複数の共溶媒を含有させることを含む。一実施形態では、プロセスは、本発明の抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物とを含む第１の混合物を形成させるステップ、次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップを含む。
一実施形態では、１ステッププロセスは、約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７、約７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜約９．０、または約８．５〜約９．０）のｐＨを有する溶液中で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えば、本発明のプロセスは、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９．０のｐＨを有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。特定の実施形態では、本発明のプロセスは、約７．８のｐＨ（例えば、７．６〜８．０のｐＨまたは７．７〜７．９のｐＨ）を有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
１ステッププロセス（すなわち、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）を、当業界で公知の任意の好適な温度で実行することができる。例えば、１ステッププロセスは、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば、細胞毒性剤および二官能性架橋試薬を溶解するために使用される有機溶媒の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、または室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行ってもよい。一実施形態では、１ステッププロセスは、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で行う。別の実施形態では、１ステッププロセスは、約１５℃以下（例えば、約−１０℃〜約１５℃、または約０℃〜約１５℃）の温度で実行される。例えば、プロセスは、例えば、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ、ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）を溶解するために使用される有機溶媒（複数可）の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃、または約−１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）と接触させることを含む。一実施形態では、プロセスは、約−１０℃〜約１５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約１５℃、または約５℃〜約１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の実施形態では、プロセスは、約１０℃の温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
一実施形態では、上記の接触は、抗体を提供した後、該抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合物を形成させ、次いで、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることにより行われる。例えば、一実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加し（それによって、抗体を接触させる）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する（それによって、抗体と薬物とを含む混合物を接触させる）。一実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供する直後に、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。別の実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供した後の時間間隔後（例えば、細胞結合剤を空間に提供した後約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日以上後）に、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、迅速に（すなわち、約５分、約１０分などの短い時間間隔以内に）またはゆっくりと（ポンプを使用するなど）添加することができる。
次いで、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた直後に、または抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた後のいくらか後の時点で（例えば、約５分〜約８時間以上）、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることができる。例えば、一実施形態では、抗体を含む反応容器への薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）の添加の直後に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する。あるいは、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させた後、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間以上で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることができる。
抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、反応を約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、または約４８時間）進行させる。
一実施形態では、１ステッププロセスは、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチングステップをさらに含む。クエンチングステップは、典型的には、コンジュゲートの精製前に行われる。一実施形態では、混合物をクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチする。本明細書で使用される場合、「クエンチング試薬」とは、遊離薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一実施形態では、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミドクエンチング試薬を使用して、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応の基（チオールなど）がクエンチされたことを確保することができる。クエンチングステップは、薬物（例えば、ＤＭ１）の二量体化を防止するのに役立ち得る。二量体化したＤＭ１は、除去するのが困難であり得る。極性の荷電したチオールクエンチング試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）を使用するクエンチングの際に、過剰の未反応のＤＭ１は、精製ステップの間に共有的に連結したコンジュゲートから容易に分離することができる極性の荷電した水溶性付加物に変換される。非極性および中性チオールクエンチング試薬を使用するクエンチングを使用することもできる。一実施形態では、混合物を、未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応するクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチする。例えば、求核試薬を混合物に添加して、任意の未反応のＳＭＣＣをクエンチすることができる。好ましくは、求核試薬は、リシン、タウリンおよびヒドロキシルアミンなどの、アミノ基含有求核試薬である。
好ましい実施形態では、反応（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）を、混合物をクエンチング試薬と接触させた後、完了まで進行させる。これに関して、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、クエンチング試薬を約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２５時間〜約４８時間）混合物に添加する。
あるいは、混合物のｐＨを約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１または５．２）に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施形態では、ｐＨを６．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満に低下させることにより、混合物をクエンチする。あるいは、ｐＨを、約４．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）〜約６．０（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０〜約５．０、約４．５（例えば、４．３、４．４、４．５、４．６または４．７）〜約５．０に低下させる。一実施形態では、混合物のｐＨを４．８に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施形態では、混合物のｐＨを５．５に低下させることにより、混合物をクエンチする。
一実施形態では、１ステッププロセスは、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させるための保持ステップをさらに含む。保持ステップは、コンジュゲートの精製前（例えば、反応ステップの後、反応ステップとクエンチングステップの間、またはクエンチングステップの後）に混合物を保持することを含む。例えば、プロセスは、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｃ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲートを提供するステップを含む。
別の実施形態では、プロセスは、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物をクエンチして、任意の未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエンチするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｄ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップを含む。
あるいは、保持ステップを、コンジュゲートの精製後に実施した後、さらなる精製ステップを行うことができる。
好ましい実施形態では、保持ステップの前に反応を完了まで進行させる。これに関して、保持ステップを、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２４時間〜約４８時間）実施することができる。
保持ステップは、好適な期間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間）にわたって好適な温度（例えば、約０℃〜約３７℃）で溶液を維持して、安定に結合したリンカーを抗体から実質的に遊離させないが、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させることを含む。一実施形態では、保持ステップは、約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で溶液を維持することを含む。一実施形態では、保持ステップは、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約２℃〜約８℃（例えば、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約３７℃（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃）の温度で溶液を維持することを含む。
保持ステップの持続期間は、保持ステップが行われる温度およびｐＨに依存する。例えば、保持ステップの持続期間は、高温で保持ステップを行うことにより実質的に減少させることができ、その最大温度は細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの安定性によって制限される。保持ステップは、約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、または約２４時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約７日）または約１日〜約１週間にわたって溶液を維持することを含んでもよい。
一実施形態では、保持ステップは、少なくとも約１２時間から最大で１週間までの期間にわたって約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは、約２０時間）、約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。
保持ステップのためのｐＨ値は、好ましくは、約４〜約１０である。一実施形態では、保持ステップのためのｐＨ値は、約４以上であるが、約６未満である（例えば、４〜５．９）か、または約５以上であるが、約６未満である（例えば、５〜５．９）。別の実施形態では、保持ステップのためのｐＨ値は、約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９、約６〜約８）である。例えば、保持ステップのためのｐＨ値は、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０であってもよい。
特定の実施形態では、保持ステップは、約１２時間〜約１週間にわたって、約６〜７．５のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすること、約５時間〜約５日間にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで４℃で混合物をインキュベートすること、または約５時間〜約１日間にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすることを含んでもよい。
１ステッププロセスは、任意選択で、コンジュゲートの可溶性および回収を増加させるための反応ステップへのスクロースの添加を含んでもよい。望ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。さらに、反応ステップはまた、緩衝剤の添加をも含んでもよい。当業界で公知の任意の好適な緩衝剤を使用することができる。好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、およびリン酸バッファーが挙げられる。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、およびその組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、１ステッププロセスは、混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップをさらに含んでもよい。当業界で公知の任意の精製方法を使用して、本発明のコンジュゲートを精製することができる。一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、接線流濾過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、選択的沈降、または任意の他の好適な精製プロセス、ならびにその組合せを使用する。別の態様では、コンジュゲートを上記の精製プロセスにかける前に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを最初に濾過する。あるいは、コンジュゲートを上記の精製プロセスにかけた後に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを濾過する。例えば、一実施形態では、コンジュゲートを１または複数のＰＶＤＦ膜を通して濾過した後、接線流濾過を使用して精製する。あるいは、コンジュゲートを接線流濾過を使用して精製した後、１または複数のＰＶＤＦ膜を通して濾過する。
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）型システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）などの、任意の好適なＴＦＦシステムを精製のために使用することができる。
任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合様式イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、染料リガンドクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびその組合せが挙げられる。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）ヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）、およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の例は、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｈｅｘｙｌ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、およびＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な混合様式イオン交換体の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ（登録商標）ＡＢｘ樹脂（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な染料リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌ（登録商標）ブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な親和性樹脂の例としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）および抗体が適切なレクチン結合部位を担持する、レクチン親和性樹脂、例えば、Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。好適な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）が挙げられる。
任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定されるものではないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００）、ならびに当業者には公知の他のものが挙げられる。
２ステッププロセスおよび１ポットプロセス
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号に記載のように調製することができる。このプロセスは、（ａ）本発明の抗体を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、リンカー（すなわち、Ａｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）を抗体に共有結合させることによって、リンカーが結合した抗体を含む第１の混合物を調製するステップ；（ｂ）任意選択で、第１の混合物を精製プロセスにかけて、リンカーが結合した抗体の精製された第１の混合物を調製するステップ；（ｃ）約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、リンカーが結合した抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と反応させることにより、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、第１の混合物中のリンカーが結合した抗体にコンジュゲートして、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）；および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製するステップ；ならびに（ｄ）第２の混合物を精製プロセスにかけて、第２の混合物の他の成分からコンジュゲートを精製するステップを含む。あるいは、精製ステップ（ｂ）を省略してもよい。本明細書に記載の任意の精製方法を、ステップ（ｂ）および（ｄ）のために使用することができる。一実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）と（ｄ）の両方のために使用する。別の実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）のために使用し、吸着クロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ）をステップ（ｄ）のために使用する。
１ステップ試薬およびｉｎ ｓｉｔｕプロセス
一実施形態では、米国特許第６，４４１，１６３号および米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号および第２００８／０１４５３７４号に記載のように、予め形成された薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を、本発明の抗体にコンジュゲートした後、精製ステップを行うことにより、本発明のコンジュゲートを調製することができる。本明細書に記載の任意の精製方法を使用することができる。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応させることにより、薬物−リンカー化合物を調製する。任意選択で、薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を精製にかけた後、抗体にコンジュゲートする。
４．望ましい抗体および抗体薬物コンジュゲートの特性評価および選択
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または抗体薬物コンジュゲートを、当業界で公知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特性および／または生物学的活性について特性評価し、選択することができる。
例えば、本発明の抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはウェスタンブロットなどの公知の方法により、その抗原結合活性について試験することができる。
トランスジェニック動物および細胞系は、腫瘍関連抗原および細胞表面受容体のがん過剰発現の予防的または治療的処置としての潜在能力を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）をスクリーニングするのに特に有用である。有用なＡＤＣのスクリーニングは、トランスジェニック動物に、一定範囲の用量にわたって候補ＡＤＣを投与すること、および評価される疾患または障害に対するＡＤＣの効果（複数可）について、様々な時点でアッセイすることを含んでもよい。あるいは、またはさらに、該当する場合、疾患の誘導因子への曝露の前に、またはそれと同時に、薬物を投与することができる。候補ＡＤＣを、中効率または高効率スクリーニング形式の下で、連続的および個々に、または同時にスクリーニングすることができる。
一実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系またはヒト患者腫瘍（例えば、乳がん細胞系または腫瘍断片、胃がん細胞系または腫瘍断片）を、非ヒト動物に移植すること、（ｂ）ＡＤＣ薬物候補を非ヒト動物に投与すること、および（ｃ）移植された細胞系からの腫瘍の成長を阻害する候補の能力を決定することを含むスクリーニング方法である。本発明はまた、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系に由来する細胞を、薬物候補と接触させること、および（ｂ）安定な細胞系の成長を阻害するＡＤＣ候補の能力を評価することを含む、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の過剰発現を特徴とする疾患または障害の処置のためのＡＤＣ候補をスクリーニングする方法も包含する。
一実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系に由来する細胞を、ＡＤＣ薬物候補と接触させること、および（ｂ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４のリガンド活性化を遮断するＡＤＣ候補の能力を評価することを含むスクリーニング方法である。別の実施形態では、リガンドにより刺激されたチロシンリン酸化を遮断するＡＤＣ候補の能力を評価する。
別の実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系に由来する細胞を、ＡＤＣ薬物候補と接触させること、および（ｂ）細胞死を誘導するＡＤＣ候補の能力を評価することを含むスクリーニング方法である。一実施形態では、アポトーシスを誘導するＡＤＣ候補の能力を評価する。
１つの実施形態では、候補ＡＤＣは、広範な用量にわたってトランスジェニック動物に投与されること、および経時的な化合物に対する動物の生理学的応答を評価することによりスクリーニングされる。いくつかの場合、化合物を、化合物の効能を増強するコファクターと共に投与することが適切であり得る。対象トランスジェニック動物から誘導される細胞系を使用して、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の過剰発現と関連する様々な障害を処置するのに有用なＡＤＣについてスクリーニングする場合、適切な時間に試験ＡＤＣを細胞培養培地に添加し、ＡＤＣに対する細胞応答を、適切な生化学的および／または組織学的アッセイを使用して経時的に評価する。
したがって、本発明は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方を特異的に標的として、それらに特異的に結合するＡＤＣを同定するためのアッセイを提供し、腫瘍細胞上でのそれらの過剰発現および増幅は、異常細胞機能に相関される。１つの実施形態では、本発明は、下記属性：ＭＣＣ−ＤＭ１またはＳＰＤＢ−ＤＭ４へのコンジュゲーション後の１０ｎＭ未満のヒトＦＧＦＲ２に対する親和性、２ｎＭ未満のＩＣ５０を有するＦＧＦＲ２／４で増幅され、および／またはＦＧＦＲ２／４で過剰発現性の細胞の成長を阻害する能力、例えば単回３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与後のマウスにおける４５ｍｌ／ｄ／ｋｇ未満のゆっくりとしたクリアランス速度を有する抗ＦＧＦＲ２／４抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を含むＡＤＣを提供する。
ＦＧＦＲ２／４抗体
本発明は、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４（ＦＧＦＲ２／４）に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）としては、実施例（以下のセクション６を参照）に記載するように単離されるヒトモノクローナル抗体またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。ある特定の実施形態では、本発明はまた、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５以上のＶＨ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記抗体を提供する。
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明はまた、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特に本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３以上のＶＬ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
本発明の他の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、変異しているが、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、それは、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域中で変異しているアミノ酸配列変異体を含む。
本発明はまた、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞における発現に関して最適化され得る。
本発明の他の抗体としては、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表１に記載の配列に対する少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、それは、表１に記載の配列に記載の可変領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が可変領域中で変異しているが、実質的に同じ治療活性を保持するアミノ酸配列変異体を含む。
これらの抗体はそれぞれＦＧＦＲ２／４に結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を「混合および一致」させて、本発明の他のＦＧＦＲ２／４結合抗体を作出することができる。そのような「混合および一致」したＦＧＦＲ２／４結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例のセクションに記載の他のアッセイ）を使用して試験することができる。これらの鎖を混合および一致させる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えるべきである。従って、一態様では、本発明は、抗体がＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する、配列番号７、２７、４７、６７、８７および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１７、３７、５７、７７、９７および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９からなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長重鎖；および配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９からなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離されたモノクローナル抗体；または（ｉｉ）その抗原結合ポーションを含む機能的タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはその組合せを含むＦＧＦＲ２／４結合抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１、２１、４１、６１、８１および１０１に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号３、２３、４３、６３、８３および１０３に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１１、３１、５１、７１、９１および１１１に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１２、３２、５２、７２、９２および１１２に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３に示す。
これらの抗体がそれぞれＦＧＦＲ２／４に結合することができ、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮して、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列と、ＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列とを、「混合および一致」させることができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合および一致させることができるが、それぞれの抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２および３と、ＶＬ ＣＤＲ１、２および３とを含有し、本発明の他のＣ５結合結合分子を作出しなければならない）。そのような「混合および一致」したＦＧＦＲ２／４結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイおよび実施例に記載のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１または複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本開示のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似する配列と置換することにより、新しいＶＨおよびＶＬ配列を作出することができることが当業者には容易に明らかである。
従って、本発明は、抗体がＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する、配列番号１、２１、４１、６１、８１および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３および１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号６１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号８１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号８３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）である。
１．エピトープおよび同エピトープに結合する抗体の同定
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの態様では、本発明は、配列番号１３７で示されるようなヒトＦＧＦＲ２の位置１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）、２１９（Ｇｌｕ）にあるアミノ酸に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ２（ｐ２１８０２−３に従って番号付けられる、配列番号１３７）のアミノ酸１６０〜１８９（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡＧＧＮＰＭＰＴＭＲ、配列番号１３６）および／またはアミノ酸１９８〜２１６（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣ、配列番号１４１）のエピトープに結合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１４２のアミノ１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの態様では、本発明は、配列番号１４２に示されるようなヒトＦＧＦＲ４の位置１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）にあるアミノ酸に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ４（Ｐ２２４５５−１に従って番号付けられる、配列番号１４２）のアミノ酸１５０〜１７４（ＴＨＰＱＲＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＧＮＴＶＫＦＲＣＰＡ、配列番号１３２）および／またはアミノ酸２０１〜２１２（ＲＬＲＨＱＨＷＳＬＶＭＥ、配列番号１３３）のエピトープに結合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに、および配列番号１４２のアミノ酸１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ２（ｐ２１８０２−３に従って番号付けられる、配列番号１３７）のアミノ酸１６０〜１８９（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡＧＧＮＰＭＰＴＭＲ、配列番号１３６）およびアミノ酸１９８〜２１６（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣ、配列番号１４１）のエピトープ、およびヒトＦＧＦＲ４（Ｐ２２４５５−１に従って番号付けられる、配列番号１４２）のアミノ酸１５０〜１７４（ＴＨＰＱＲＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＧＮＴＶＫＦＲＣＰＡ、配列番号１３２）およびアミノ酸２０１〜２１２（ＲＬＲＨＱＨＷＳＬＶＭＥ、配列番号１３３）のエピトープに結合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
本発明はまた、表１に記載する抗ＦＧＦＲ２／４抗体と同じエピトープに特異的に結合するか、または表１に記載する抗体と交差競合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。従って、さらなる抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）その能力に基づいて同定することができる。ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４タンパク質（例えば、ヒトＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４）への本発明の抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４への結合について抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と競合することができることを示す；そのような抗体は、非限定的理論によれば、それが競合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４タンパク質上の同じか、または関連する（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近い）エピトープに結合することができる。特定の実施形態では、表１に記載する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と同じＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を、本明細書に記載のように調製および単離することができる。
２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変化
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、抗体の特性を改善するための、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する改変をさらに含む改変された抗体またはその抗原結合性断片を含んでもよい。いくつかの実施形態では、フレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を低下させる。例えば、１つの手法は、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より特には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が誘導される生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有してもよい。抗体フレームワーク配列を、抗体が誘導される生殖系列配列と比較することにより、そのような残基を同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列構成に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させることができる。そのような「復帰変異」した抗体もまた、本発明により包含されることが意図される。
別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらには、１もしくは複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去することによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法はまた、「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で作製される改変に加えて、またはその代わりに、Ｆｃ領域内に改変を含む、典型的には、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存的細胞性細胞毒性などの、抗体の１または複数の機能的特性を変化させるように、本発明の抗体を操作することができる。さらに、本発明の抗体を化学的に改変する（例えば、１もしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる）か、または改変してそのグリコシル化を変化させ、再度、抗体の１または複数の機能的特性を変化させることができる。これらの実施形態はそれぞれ、以下にさらに詳細に記載される。
一実施形態では、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加するか、または減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を改変する。この手法は、Bodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より特には、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して弱いスタフィロコッカス（Staphylococcyl）タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１または複数のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域中に導入する。この手法は、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置き換えて、抗体のエフェクター機能を変化させることにより、Ｆｃ領域を変化させる。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であってもよい。この手法は、例えば、両方ともWinter et al.による米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に記載されている。
別の実施形態では、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下した、もしくは無効化される補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。
別の実施形態では、１または複数のアミノ酸残基を変化させることによって、補体を固定する抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号に記載されている。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の１または複数のアミノ酸を、１または複数のアロタイプアミノ酸残基により、図４に示すようにＩｇＧ１サブクラスおよびカッパアイソタイプに置き換える。アロタイプアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにJefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)により記載されたようなカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も挙げられる。
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域を改変して、抗体依存的細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させる、および／または１もしくは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この手法は、例えば、PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号に記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化させて、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭水化物改変を、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換を作製することによって、その部位でのグリコシル化を除去することができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、例えば、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号に記載されている。
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、変化した型のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当業界で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることによって、グリコシル化が変化した抗体を生成する宿主細胞として使用することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載し、そのような細胞系中で発現された抗体は低グリコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させる能力が低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をももたらす、バリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Umama et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作された細胞系中で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすバイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。
別の実施形態では、抗体をその生物学的半減期を増加させるように改変する。様々な手法が可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のような、１または複数の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させることができる。
３．ＦＧＦＲ２／４抗体の生成
限定されるものではないが、組換え発現、化学的合成、および抗体四量体の酵素的消化などの、当業界で公知の任意の手段によって抗ＦＧＦＲ２／４抗体およびその抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を生成することができるが、完全長モノクローナル抗体を、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって取得することができる。組換え発現は、当業界で公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来するものであってよい。
本発明は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のような重鎖もしくは軽鎖可変領域または相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８、２８、４８、６８、８８および１０８からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８、３８、５８、７８、９８および１１８からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０、３０、５０、７０、９０または１１０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０、４０、６０、８０、１００または１２０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、抗ＦＧＦＲ２／４抗体の可変領域配列のみをコードしてもよい。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域との両方をコードしてもよい。いくつかのポリヌクレオチド配列は、例示的マウス抗ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４抗体の１つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの重鎖と軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
ポリヌクレオチド配列を、抗ＦＧＦＲ２／４抗体またはその結合断片をコードする存在する配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成によるか、またはＰＣＲ突然変異誘発により生成することができる。Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの、当業界で公知の方法により、核酸の直接化学合成を達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入を、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のように実施することができる。
また、上記の抗ＦＧＦＲ２／４抗体を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞も、本発明において提供される。様々な発現ベクターを使用して、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づく発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞中で抗体を生成することができる。非ウイルスベクターおよび系としては、典型的には、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、およびヒト人工染色体（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞中での抗ＦＧＦＲ２／４ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現にとって有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当業界で公知のいくつかの他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外では挿入された配列の発現を防止する。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物を、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について集団を偏らせることなく、非誘導条件下で拡張することができる。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖または断片の効率的発現にとって必要とされるか、または望まれる。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率を、使用において細胞系にとって適切なエンハンサーの含有により増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させることができる。
発現ベクターはまた、挿入される抗ＦＧＦＲ２／４抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができる。より頻繁には、挿入される抗ＦＧＦＲ２／４抗体配列を、ベクター中に含有させる前にシグナル配列に連結する。抗ＦＧＦＲ２／４抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために使用されるベクターは、その定常領域または部分もコードすることがある。そのようなベクターにより、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現が可能になり、それにより、インタクト抗体またはその断片の生成がもたらされる。典型的には、そのような定常領域はヒトである。
抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖を担持および発現させるための宿主細胞は、原核または真核であってもよい。大腸菌（E.coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核宿主である。使用にとって好適な他の微生物宿主としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、当業者であれば、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージに由来するプロモーター系などの、任意数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物を使用して、本発明の抗ＦＧＦＲ２／４ポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を使用することもできる。
いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本発明の抗ＦＧＦＲ２／４ポリペプチドを発現および生成させる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例に記載のミエローマハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞系（例えば、以下に例示されるＳＰ２／０ミエローマ細胞）であってもよい。これらのものは、任意の正常な死滅する、または正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換されたＢ細胞およびハイブリドーマなどの、インタクト免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で一般的に考察されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含んでもよい。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的である、細胞型特異的である、段階特異的である、および／またはモジュレート可能もしくは調節可能であってもよい。有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト極初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当業界で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、原核細胞のためには塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に使用されるが、他の細胞宿主のためにはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを使用してもよい（一般的には、Sambrook et al., supraを参照されたい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏでの形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期的な、高収率の生成のためには、安定な発現が望ましいことが多い。例えば、抗ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４抗体鎖または結合断片を安定に発現する細胞系を、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有する本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１〜２日間成長させた後、選択培地に切替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、選択培地中で導入された配列を上手く発現する細胞の成長が可能となる。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞を、細胞型にとって適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
治療的および診断的使用
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、限定されるものではないが、固形がんなどのがんの処置などの様々な適用において有用である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍体積の減少、および／または腫瘍の発がん性の低下にとって有用である。使用方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの方法であってもよい。
一態様では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、生物試料中のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される用語「検出すること」は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物試料は細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、そのような組織は、他の組織と比較してより高いレベルでＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する正常および／またはがん性組織を含む。
一態様では、本発明は、生物試料中のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、抗体の抗原への結合を可能にする条件下で、生物試料を抗ＦＧＦＲ２／４抗体と接触させること、および抗体と抗原との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
１つの態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の増加された発現に関連付けられる障害を診断する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、試験細胞を抗ＦＧＦＲ２／４抗体と接触させること；抗ＦＧＦＲ２／４抗体のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４抗原への結合を検出することにより試験細胞上でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルを決定すること（定量的または定性的に）；および試験細胞中でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞またはそのような正常細胞と同等のレベルでＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する細胞）中でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルと比較することを含み、対照細胞と比較して、試験細胞上でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルが高い場合、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現の増加と関連する障害の存在を示す。ある特定の実施形態では、試験細胞は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現の増加と関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。ある特定の実施形態では、障害は、がんまたは腫瘍などの細胞増殖性障害である。ある特定の実施形態では、上記方法は、試験細胞においてＦＧＦＲ２遺伝子のコピー数を測定することを含む。ある特定の実施形態では、上記方法は、ＰＡＸ−ＦＯＸＯトランスロケーション突然変異を検出することを含む。遺伝子のコピー数および／またはトランスロケーション突然変異は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ等を使用して検出することができる。
ある特定の実施形態では、上記のものなどの診断または検出の方法は、細胞表面上で、または表面上にＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する細胞から得られる膜調製物中で発現されるＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗体の結合を検出することを含む。細胞表面上に発現されるＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗体の結合を検出するための例示的アッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
ある特定の他の方法を使用して、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗体の結合を検出することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当業界で周知である抗原結合アッセイが挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／４抗体を標識する。標識としては、限定されるものではないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される、酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／４抗体を、不溶性マトリックス上に固定する。固定は、溶液中で遊離したままである任意のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４タンパク質から抗ＦＧＦＲ２／４抗体を分離することを必要とする。これは、水に不溶性のマトリックスもしくは表面への吸着（Bennich et al, 米国特許第３，７２０，７６０号）により、もしくは共有カップリング（例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用する）により、アッセイ手順の前に抗ＦＧＦＲ２／４抗体を不溶化することによって、または例えば、免疫沈降により、抗ＦＧＦＲ２／４抗体とＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４タンパク質との複合体の形成後に抗ｃＫＩＴ抗体を不溶化することによって、都合良く達成される。
診断または検出の上記実施形態のいずれかを、抗ＦＧＦＲ２／４抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実行することができる。
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、疾患を処置、または防止する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートを使用して処置される疾患は、がんである。処置および／または防止され得る疾患の例としては、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、胃がん、頭部および頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、非小細胞肺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮頸部がん、胃がん、子宮がん、膣がん、外陰がんが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、がんは、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）および抗体薬物コンジュゲートが結合するＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現性細胞を特徴とする。ある特定の実施形態では、がんは、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４のＤＮＡコピー数の増加を特徴とする。ある特定の実施形態では、がんは、例えば、それぞれ、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４ ＲＮＡの増加により測定されるように、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現の増加を特徴とする。本発明は、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは固形がんである。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、がんは、耐性がんおよび／または再発したがんである。ある特定の態様では、例えば、耐性がんは、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されないチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。ある特定の実施形態では、がんは、Ｈｅｒ２耐性がんである。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象に、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、抗ＦＧＦＲ２／４抗体が結合するＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ヒトＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を過剰発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＦＧＦＲ２遺伝子のコピー数の増加を有する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＦＧＦＲ４の過剰発現を引き起こすＰＡＸ−ＦＯＸＯトランスロケーション突然変異を有する。
本発明はまた、治療有効量の上記抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートによる処置に関して患者を選択する方法を提供する。ある特定の態様では、上記方法は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんを有する患者を選択することを含む。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤および／またはＭｅｔ阻害剤に耐性であると意図される。ある特定の態様では、耐性がんは、Ｈｅｒ２耐性がんであると意図される。より具体的には、Ｈｅｒ２耐性がんは、トラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシンに応答しないと意図される。ある特定の態様では、がんは、新生耐性がんであると意図され、さらに他の態様では、がんは、再発したがん、例えばＨｅｒ２再発がんであると意図される。本発明のある特定の態様では、上記方法は、新生耐性または再発したがんを有する患者を選択すること、およびＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４の発現に関して測定することを含む。ある特定の態様では、再発したがんまたは腫瘍が、初期ではＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現性がんまたは腫瘍ではなかったが、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、トラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシン）による処置後に、チロシンキナーゼ耐性の、もしくは再発したがんまたは腫瘍であるＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４陽性がんとなることが意図される。
疾患の処置のために、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの適切な用量は、処置しようとする疾患の種類、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、以前の療法、患者の病歴などの様々な因子に依存する。抗体または薬剤を１回で、または数日から数カ月継続する一連の処置にわたって、または治癒が行われるか、もしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から算出することができ、個々の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの相対的効力に応じて変化する。ある特定の実施形態では、用量は０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ（例えば、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、または１０ｍｇ）／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１カ月または１年に１回またはそれ以上投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートは、２週間毎に１回または３週間毎に１回投与される。処置する医師であれば、体液または組織中での測定された滞留時間および薬物濃度に基づいて、投与のための反復速度を推定することができる。
組合せ療法
ある特定の例では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗嘔吐剤（または制吐剤）、疼痛緩和剤、細胞保護剤、およびその組合せなどの他の治療剤と組み合わせる。
組合せ療法における使用のために考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを、抗がん特性を有する第２の化合物との組合せ療法として組合せ医薬製剤、または用量レジメン中で組み合わせる。組合せ医薬製剤または用量レジメンの第２の化合物は、それらが互いに有害に作用しないような、抗体または組合せのイムノコンジュゲートに対する相補的活性を有してもよい。例えば、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートは、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＦＧＦ下流シグナル伝達経路阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、Ｍｃｌ１阻害剤、および他のＦＧＦＲ２阻害剤と組み合わせて投与され得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「組合せ医薬(pharmaceutical combination)」とは、１つの単位剤形中の固定的組合せ、または２つ以上の治療剤を同時に独立に、もしくは特に、組合せパートナーが協調的な、例えば、相乗効果を示すことができる時間間隔内で別々に投与することができる非固定的組合せもしくは組み合わせ投与のための部分のキットを指す。
用語「組合せ療法」とは、本開示に記載の治療状態または障害を処置するための２つ以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセルなどの、実質的に同時的な様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。あるいは、そのような投与は、それぞれの活性成分について、複数の、または別々の容器（例えば、カプセル、粉末、および液体）中での同時投与を包含する。粉末および／または液体を、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、そのような投与はまた、ほぼ同時に、または異なる時間に、連続的様式でのそれぞれの種類の治療剤の使用も包含する。いずれかの場合、処置レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の処置において組合せ薬物の有益な効果を提供する。
組合せ療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることがわかってもよい、すなわち、活性成分を一緒に使用した場合に達成される効果は、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計よりも大きい。活性成分が（１）組み合わせた単位用量製剤中で同時製剤化および投与されるか、もしくは同時に送達される；（２）別々の製剤として交互に、もしくは同時に送達される；または（３）いくつかの他のレジメンによるものである場合、相乗効果を達成することができる。交互療法において送達される場合、化合物が例えば、別々の注射筒中の異なる注射液により連続的に投与または送達される場合、相乗効果を達成することができる。一般に、交互療法中では、有効用量の各活性成分は連続的に、すなわち、順次投与されるが、組合せ療法においては、有効用量の２つ以上の活性成分は一緒に投与される。
一態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤、およびＭｅｔ阻害剤などの１または複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能なＡＢＴ８６９としても知られる、Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレア）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６としても知られ、米国特許第６，７８０，９９６号に記載された、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−「３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；ザクチマ（ＺＤ６４７４）；およびイマチニブまたはメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ’’）−テトラヒドロ-3-フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−ｙｌ］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）が挙げられる。
ＥＧＦＲ抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。
ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、またはｐ１８５としても知られる）阻害剤としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０２８４４３号に記載）；ラパチニブまたはラパチニブジトシレート（ditosylate）（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１−０９−０２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
Ｈｅｒ３阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１、およびＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
ＭＥＴ阻害剤としては、限定されるものではないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、以前はＸＬ８８０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ１０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ)ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ４５８）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−ｙｌ）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ１０２２１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ４７７５７５−５６−７）が挙げられる。
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、およびＢＩ８３６８４５が挙げられる。概説については、例えば、Yee, JNCI, 104; 975 (2012)を参照されたい。
別の態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＭＥＫ阻害剤、Ｂｒａｆ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤、ＳＨＰ２阻害剤、およびまたｍＴｏｒなどの、１または複数のＦＧＦ下流シグナリング経路阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、ＸＬ−５１８（ＡＣＣ Ｃｏｒｐ．から入手可能な、ＧＤＣ−０９７３、Ｃａｓ Ｎｏ．１０２９８７２−２９−４としても知られる）；２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−ベンザミド（ＣＩ−１０４０またはＰＤ１８４３５２としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００００３５４３６号に記載されている）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンザミド（ＰＤ０３２５９０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２００６２１３号に記載されている）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］−ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られ、米国特許第２，７７９，７８０号に記載されている）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９７６６としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１４０１１号に記載されている）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（Ｅ６２０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００３０７６４２４号に記載されている）；２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＰＤ９８０５９としても知られる）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ１０３５５５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ１２０４５３１−２６−９）；およびトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ１２０４５３１−２５−８０）が挙げられる。
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ０９４１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０３６０８２号および第ＷＯ０９／０５５７３０号に記載されている）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３５としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２２８０６号に記載されている）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０８４７８６号に記載されている）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６，ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）が挙げられる。
ｍＴｏｒとしては、限定されるものではないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；リダホロリムス（以前はデフェロリムス、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして知られ、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４３８３号に記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモッド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。
さらに別の態様において、本発明は、限定されるものではないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤などの１または複数のプロアポトーシス剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することによりがんを処置する方法を提供する。
例えば、ＩＡＰ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、およびＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡＰ阻害剤の他の例としては、限定されるものではないが、ＷＯ０４／００５２８４、ＷＯ０４／００７５２９、ＷＯ０５／０９７７９１、ＷＯ０５／０６９８９４、ＷＯ０５／０６９８８８、ＷＯ０５／０９４８１８、ＵＳ２００６／００１４７００、ＵＳ２００６／００２５３４７、ＷＯ０６／０６９０６３、ＷＯ０６／０１０１１８、ＷＯ０６／０１７２９５、およびＷＯ０８／１３４６７９（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたものが挙げられる。
ＢＣＬ−２阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンザミド（ＡＢＴ−２６３としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１５５３８６号に記載されている）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンザミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）などのプロアポトーシス受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）としては、限定されるものではないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ ６５８０５２−０９−６）；レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ８４５８１６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ８９６７３１−８２−１）；およびチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ９４６４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏから入手可能）が挙げられる。
チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ１２４、ＣＡＳ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）ウレア（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ１３５８９７−０６−２）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＹＲＳＰＡＭＰＥＮＬ）、およびＣＢＰ５０１（（ｄ−Ｂｐａ）ｓｗｓ（ｄ−Ｐｈｅ−Ｆ５）（ｄ−Ｃｈａ）ｒｒｒｑｒｒ）が挙げられる。
一態様では、本発明は、１または複数のＦＧＦＲ阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。例えば、ＦＧＦＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、アラニン酸ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４」トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；バルガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ９２８３２６−８３−４）；二酪酸ドビチニブ（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−ウレア（ＢＧＪ３９８、ＣＡＳ８７２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；およびＮ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−）−ジメチルエチル）−ウレア（ＰＤ１７３０７４、ＣＡＳ２１９５８０−１１−７）が挙げられる。特定の実施形態において、本発明は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６（（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチルウレア（ＢＧＪ−３９８としても知られる）；または４−アミノ−５−フルオロ−３−（５−（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（ドビチニブもしくはＴＫＩ−２５８としても知られる）、ＡＺＤ４５４７（Gavine et al., 2012, Cancer Research 72, 2045-56、Ｎ−［５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−（３Ｒ，５Ｓ）−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンザミド）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；Gozgit et al., 2012, Mol Cancer Ther., 11; 690-99；３−［２−（イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−Ｎ−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル｝ベンザミド、ＣＡＳ９４３３１９−７０−８）などの他のＦＧＦＲ２阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本発明のイムノコンジュゲートを、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。組成物は、がん（乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、頭部および頸部がん、膀胱がん、食道がん、バレット食道がん、膠芽細胞腫、軟部組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、女性化乳房、横紋筋肉腫および子宮内膜症）を処置または防止するのに適している１つまたは複数の他の治療剤をさらに含有することができる。
治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態で生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより調製することができる（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000を参照されたい）。
特定の実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、ＡＤＣ、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベ−ト２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物である。凍結乾燥物を注射用水で再構成させることができ、その溶液はＡＤＣ、コハク酸ナトリウム、スクロース、およびポリソルベート２０、ｐＨ約５．０を含む。その後の静脈内投与のために、得られる溶液は通常、担体溶液中にさらに希釈される。
治療剤のための投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性などのいくつかの因子に依存する。ある特定の実施形態において、投与レジメンは、許容される副作用レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の量は、特定の実体および処置される状態の重症度に一部依存する。適切な用量の抗体、サイトカイン、および小分子を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい）。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響するか、または処置に影響すると予測されることが当業界で公知の、または疑われるパラメーターまたは因子を使用して、医師によって行われる。一般に、用量は最適用量よりもいくらか低い量から開始し、その後、任意の負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させる。重要な診断尺度は、例えば、生成される炎症性サイトカインの炎症またはレベルの症状のものを含む。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベル(dosage level)を、患者にとって毒性とならないように、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される用量レベルは、使用される本開発の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、使用される特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学界で公知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
本発明の抗体またはそれらの断片を含む組成物は、連続注入により、または例えば１日、１週または１週につき１〜７回、隔週に１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、または８週ごとに１回の間隔での投与により供給され得る。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内で、または吸入により提供することができる。特定の用量プロトコールは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むものである。
本発明のイムノコンジュゲートに関して、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。本発明の抗体またはその断片の用量を、キログラム患者体重（ｋｇ）に、ｍｇ／ｋｇで投与される用量を掛けたものを使用して算出することができる。
本発明のイムノコンジュゲートの用量を反復し、投与を少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月空けてもよい。特定の実施形態においては、本発明のイムノコンジュゲートの用量を、３週間毎に反復する。
特定の患者のための有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化してもよい（例えば、Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001を参照されたい）。
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内による注射もしくは輸注、または持続放出系もしくは埋込み体によるものであってもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 米国特許第６，３５０，４６６号および第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤または注射部位での疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔剤、またはその両方を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化剤を含む製剤の使用により、肺投与を使用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号、および第４，８８０，０７８；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、第ＷＯ９７／３２５７２号、第ＷＯ９７／４４０１３号、第ＷＯ９８／３１３４６号、および第ＷＯ９９／６６９０３号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の組成物を、１または複数の当業界で公知の様々な方法を使用して、１または複数の投与経路により投与することもできる。当業者であれば理解できるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明のイムノコンジュゲートのために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常は注射による、腸内投与および局所投与以外の投与様式であってよく、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸注が挙げられる。あるいは、本発明の組成物を、局所、表皮または粘膜投与経路などの非経口経路により、例えば、鼻内的、経口的、経膣的、直腸的、舌下的または局所的に投与することができる。一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、輸注により投与される。別の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは皮下投与される。
本発明のイムノコンジュゲートを制御放出系または持続放出系において投与する場合、ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー材料を使用して、本発明の療法の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照されたい；また、Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照されたい）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態において、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、および生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに置き、かくして、全身用量のほんの一部のみを要するようにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい）。
制御放出系は、Langer, Science 249:1527-1533, 1990による概説で考察されている。当業者には公知の任意の技術を使用して、本発明の１または複数のイムノコンジュゲートを含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996；Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995；Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997；およびLam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明のイムノコンジュゲートを局所投与する場合、それらを軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液の形態、または当業者には周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非スプレー可能局所剤形については、局所適用と適合する担体または１もしくは複数の賦形剤を含み、いくつかの場合、水よりも高い動的粘度を有する粘性から半固体または固体の形態が典型的に使用される。好適な製剤としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、バッファー、もしくは塩）と混合される、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リミネント剤、蝋膏剤などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、いくつかの場合、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填される、スプレー可能なエアゾール調製物が挙げられる。必要に応じて、モイスチャライザーまたは保湿剤を医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加の成分の例は、当業界で周知である。
イムノコンジュゲートを含む組成物を鼻内投与する場合、それをエアゾール形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で製剤化することができる。特に、本発明による使用のための予防剤または治療剤を、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）の使用と共に、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示物の形態で都合良く送達することができる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または散布器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を製剤化することができる。
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線療法との同時投与または処置のための方法は、当業界で公知である（例えば、Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい）。治療剤の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させることができる。
本発明のイムノコンジュゲートと共に投与することができるさらなる療法（例えば、予防剤または治療剤）を、本発明のイムノコンジュゲートから５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、約１２時間〜約１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空けて、または９６時間〜１２０時間空けて投与することができる。２つ以上の療法を、１回の同じ患者訪問のうちに投与してもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｖｏでの適切な分布を確保するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するために（必要に応じて）、それらを、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送される１または複数の部分を含み、かくして、標的化薬物送達を増強してもよい（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。標的化部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
本発明は、単独で、または他の療法と組み合わせた本発明のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本発明の併用療法の治療法（例えば、予防剤または治療剤）は、対象へ同時にまたは順次投与され得る。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、周期的に投与することもできる。周期的療法は、療法（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の発生を軽減するため、療法（例えば、薬剤）の１つの副作用を回避もしくは軽減する、および／または療法の効能を改善するための、一定期間、第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与、次いで、一定期間、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与、およびこの連続的投与の反復、すなわち、周期を含む。
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、対象に同時に投与することができる。
用語「同時に」は、正確に同時の療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定されないが、むしろ、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物が対象に連続して、および本発明の抗体が他の療法（複数可）と一緒に作用して、それらを別途投与した場合よりも増大した利益を提供し得るような時間間隔で投与されることを意味する。例えば、それぞれの療法を同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができる；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い時間で投与して、所望の治療または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の適切な形態で、および任意の好適な経路により、別々に対象に投与することができる。様々な実施形態において、療法（例えば、予防剤または治療剤）を、１５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて対象に投与する。他の実施形態において、２以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、同じ患者訪問のうちに投与する。
組合せ療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。あるいは、組合せ療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中、対象に同時に投与することができる。予防剤または治療剤を、同じか、または異なる投与経路により対象に投与してもよい。
下記実施例および中間体は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明するのに役立つ。
実施例１： 抗ＦＧＦＲ２／４抗体に関するスクリーニング
細胞株
Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＤＳＭＺから購入し、ＫａｔｏＩＩＩ、ＳＮＵ１６、ＳＮＵ５およびＨＣＩ−Ｈ７１６細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入されて、ＮＵＧＣ３細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから入手した。細胞株は全て、それぞれの供給業者により推奨されるように、ウシ胎児血清アルブミン（ＦＢＳ）を補充した適切な成長培地中で日常的に培養された。
組換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＦＧＦＲベクターの生成
ヒト、マウスおよびラットＦＧＦＲ細胞外ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔデータベース由来のアミノ酸配列に基づいて合成された遺伝子であった（表２を参照）。カニクイザルＦＧＦＲ２および４ ＥＣＤ ｃＤＮＡ鋳型は、各種カニクイザル組織由来のｍＲＮＡを使用して生成したアミノ酸配列情報に基づいて合成した遺伝子であった（例えば、Ｚｙａｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、表３）。合成されたＤＮＡ断片は全て、精製を可能にするためのＣ末端タグを用いて、適切な発現ベクター、例えばＣＭＶに基づくベクターまたはｐＣＤＮＡ（商標）３．１へクローニングした。
組換えＦＧＦＲタンパク質の発現
所望のＦＧＦＲ組換えタンパク質は、予め懸濁培養に適応されて、無血清培地、Ｌ−グルタミンを伴わない５０％ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））および５０％ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ−２９３（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））のミックス中で成長させたＨＥＫ２９３由来の細胞株（２９３Ｔ）で発現させた。小規模および大規模の両方のタンパク質生産は、一過性トランスフェクションを介したものであり、プラスミド担体としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５Ｋ、ＡｌｆａＡｅｓａｒ（登録商標））を有するそれぞれ最大１Ｌの多重振とう機フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））中で実施した。ビオチン化タンパク質が、Ｃ末端Ａｖｉタグを介して発現されるべきであった場合、ＢｉｒＡ酵素に関する遺伝子を保有するプラスミドは、ＥＣＤタンパク質プラスミドに対して１：２の比で含まれた。総ＤＮＡおよびポリエチレンイミンは、１：３（ｗ：ｗ）の比で使用された。ＤＮＡ対培養物の比は１ｍｇ／Ｌであった。細胞培養物上清は、トランスフェクションの６日後に収集して、遠心分離して、精製前に滅菌濾過した。
タグ付けタンパク質精製
組換えタグ付けＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４ ＥＣＤタンパク質（例えば、ＡＰＰ−ＦＧＦＲ２およびＡＰＰ−ＦＧＦＲ４ ＥＣＤ）は、細胞培養物上清を収集することにより精製した。抗ＡＰＰカラムは、樹脂１ｍＬ当たり抗体１０ｍｇの最終比で、抗ＡＰＰモノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂへカップリングすることにより調製した。発現上清を、１〜２ｍＬ／分の流速で、または重力流により、抗ＡＰＰカラムに適用させた。ＰＢＳを用いたベースライン洗浄後、結合された材料を１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）で溶出させて、ＰＢＳに対して一晩、即座に透析した後、滅菌濾過した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定して、個々のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて算出されるタンパク質吸光係数を使用して変換することにより決定した。次に、精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）により特徴付けた。親和性精製した調製物中に１０％を上回る凝集物を有するものに関して、第２のステップであるＳＥＣ精製を実施して、続いて確認特徴付けを行った。
Ｂａ／Ｆ３ ＦＧＦＲ２細胞株の生成
これらの細胞を生成するために、ヒトＦＲＧＲ２−ＩＩＩｂ−Ｃ３（ＮＭ＿０２２９７０）をｐＥＮＴＲ（商標）ＴＯＰＯＤ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃Ｋ２４００−２０）へクローニングした後、ＣＭＶプロモーター下でｐＬｅｎｔｉ６ ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃Ｖ４９６１０）へクローニングした。次に、ウイルスをパッケージングして、Ｂａ／Ｆ３細胞（ＤＳＭＺ Ｃａｔ＃ＡＣＣ３００）にレンチウイルスを遠心感染させて、続いてブラストサイジン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｃａｔ＃３０−１００−ＲＢ）２０μｇで処置して、３７℃および５％ＣＯ２で組織培養インキュベーター中で５日間、ＩＬ３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４０３−ｍｌ−０１０）を用いて選択した。続いて、生存細胞を、培地（１０％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔ＃６３１１０１）、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｈ３１４９）および２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｃａｔ＃３０−１００−ＲＢ）を補充したが、ＩＬ３を有さないＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１１８７５−０９３））中で１カ月間成長させた。続いて、生存細胞を希釈クローニングして（dilution cloned）、クローン細胞集団を生成し、続いてこれらを、続く研究に使用した。
ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パンニング
ヒトＦＧＦＲ２を認識する抗体の選択のために、複数のパンニング戦略を使用した。抗体バリアントタンパク質の供給源として商業的に入手可能なファージディスプレイライブラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用して、ＦＧＦＲ２に結合するクローンの選択により、ヒトＦＧＦＲタンパク質に対する治療抗体を作成した。このファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86）に基づくものであり、ファージ表面上にＦａｂを展示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を使用する（ＷＯ０１／０５９５０）。
抗ＦＧＦＲ２抗体の単離に関して、固相、溶液、ホールセルおよびディファレンシャルホールセルアプローチを使用した幾つかの異なるパニング戦略を用いた。
組換えＦＧＦＲ２上での固相パニング
抗原選択プロセスに先立って、コーティングチェックＥＬＩＳＡを実施して、抗原に関して最適なコーティング濃度を決定した。各種タグを有する異なる組換えＦＧＦＲ２タンパク質は、受動的吸着により、または抗原の各々のタグを標的とする捕捉抗体により、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））上にコーティングすることにより、固相パニングアプローチで使用された。あるいは、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）でコーティングされたポリスチレンストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化ＦＧＦＲ２抗原を捕捉した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））の適切な数（サブライブラリープールの数に応じる）のウェルを、４℃で一晩、抗原でコーティングした。コーティングされたウェルを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／５％粉乳でブロックした。各パニングに関して、おおよそＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体をブロックした。ブロッキング手順後、予めブロックしたファージミックスを、抗原でコーティングしてブロックしたウェルそれぞれに添加して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）振とう機上で室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートした。その後、非特異的な結合ファージを、幾つかの洗浄ステップにより洗い流した。特異的に結合されるファージの溶出に関して、２５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）をＲＴで１０分（ｍｉｎ）間添加した。ＤＴＴ溶出液を、Ｅ．コリ（E. coli）（大腸菌（Escherichia coli））ＴＧ−１細胞の感染に使用した。感染後、細菌をＬＢ（溶原性ブロス）／Ｃａｍ（クロラムフェニコール）寒天プレート上で平板培養して、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートからこすり落として、ファージレスキュー、選択クローンのポリクローナル増幅およびファージ生産に使用した。各ＦＧＦＲ２固相パニング戦略は、パニングの個々のラウンドを含み、特有の抗原、抗原濃度、緩衝液組成物および洗浄ストリンジェンシーを含有した。
ストレプトアビジンとカップリングさせた磁気ビーズを用いた組換えＦＧＦＲ２上での溶液パニング
溶液パニングアプローチに関する必要条件は、抗原のビオチン化、およびビオチン化抗原の保持活性の確認であった。溶液パニング中、Ｆａｂディスプレイングファージおよびビオチン化抗原を、ファージによる抗原の到達性を促進する溶液中でインキュベートした。
各ファージプールに関して、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（商標）中でブロックした。並行して、各パニングに関して、おおよそＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体を、等量の２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（商標）／０．１％ツイーン２０を用いてブロックした。続いて、ある特定濃度のビオチン化抗原（例えば、１００ｎＭ）を、予め吸着およびブロックさせたファージ粒子に添加して、回転子上でＲＴで１〜２時間インキュベートした。ファージ−抗原複合体を、ブロックしたストレプトアビジンビーズを使用して捕捉して、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器で収集した。非特異的な結合ファージを、幾つかの洗浄ステップにより洗い流した。ストレプトアビジンビーズからの特異的に結合されるファージの溶出に関して、２５ｍＭのＤＴＴをＲＴで１０分間添加した。ＤＴＴ溶出液を固相パニングに関して記載するように加工処理した。
各ＦＧＦＲ２溶液相パニング戦略は、パニングの個々のラウンドを含み、特有の抗原、抗原濃度および洗浄ストリンジェンシーを含有した。
ＦＧＦＲ２過剰発現性細胞上でのホールセルパニング
各細胞パニングに関して、ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体をＰＢＳ／ＦＣＳ中で予めブロックした。並行して、ＦＧＦＲ２の過剰発現を示すファージプール（ＦＧＦＲ２、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ、ＳＮＵ１６、Ｈ７１６で安定にトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞）１つ当たり０．５〜１．０×１０７個の標的細胞を、氷上でＰＢＳ／ＦＣＳ中に再懸濁した。
ブロックした標的細胞を遠沈させて、予めブロックしたファージ粒子中に再懸濁させて、回転子上で４℃で２時間インキュベートした。ファージ−細胞複合体を、ＰＢＳ／ＦＣＳ中で洗浄した。標的細胞からの特異的に結合されるファージの溶出は、グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた酸性溶出により実施された。遠心分離後、緩衝されていないトリスを添加することにより、上清（溶出液）を中和した。最終的なファージ含有上清は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１培養物の感染に使用した。下記ステップは、固相パニングのセクションで記載されるように行った。
より詳細には、各パニングランドが細胞を用いて実施される場合のいずれかのホールセルパニングが実施されるか、あるいは各細胞または組換えタンパク質が、連続的なパニングラウンドで使用されることを意味するディファレンシャルホールセルパニングが実施された。組換え抗原に関する選択ラウンドは、固相または溶液パニングに関して記載するように実施された。
成熟パニング
増加された親和性を有するＦＧＦＲ２特異的抗体を得るために、成熟パニングを実施した（Prassler et al., 2009, Immunotherapy, 1: 571-583）。この目的で、標準的なパニング（固相および溶液相パニング）を、上述するように異なるＦＧＦＲ２抗原を用いて実施した。
パニング後、ファージ由来のｐＭＯＲＰＨ３０（登録商標）ベクターＤＮＡのＦａｂコード断片を、別個の特異的な制限酵素で消化して、ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ２成熟ライブラリーのいずれかを生成した。ＴＲＩＭ（商標）技術を使用して、挿入物を置き換えた（Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 5600-5607）。
生成したライブラリーを増幅して、洗浄ストリンジェンシーの増加および抗原濃度の低減を用いてさらに２回のラウンドのパニングに付した。
選択Ｆａｂ断片のサブクローニングおよび微量発現（Microexpression）
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択したＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージのＦａｂコード挿入物を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプレイベクターから、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿ＦＨへサブクローニングした。
Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１−Ｆ−の形質転換後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を含有するペリプラズム抽出物の単一クローン発現および調製は、これまでに記載されるように実施した（Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem 278: 38194-38205）。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一Ｆａｂクローンを、標的抗原への結合に関してパニングアウトプットから同定する。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli）溶解産物を使用して試験した。
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ（登録商標））３８４ウェルプレートを、対象のＦＧＦＲ抗原で、それらのこれまでの決定飽和濃度でＰＢＳ中でコーティングした（受動的吸着により、または抗原の各々のタグを標的とする捕捉抗体により）。あるいは、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）でコーティングされたポリスチレンストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化ＦＧＦＲ２抗原を捕捉した。
ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標）蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートされたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）により検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記録した。
ＦＡＣＳスクリーニング（蛍光標識細胞分取）
ＦＡＣＳスクリーニングでは、細胞表面発現抗原に対する単一Ｆａｂクローン結合は、パニングアウトプットから同定される。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli）溶解産物を使用して、細胞結合に関して試験される。
これらの研究では、細胞懸濁液１００μｌを、新鮮な９６ウェルプレートへ移した（１×１０５個の細胞／ウェルをもたらす）。標的細胞懸濁液含有プレートを遠心分離して、上清を廃棄した。残存細胞ペレットを再懸濁させて、Ｆａｂ含有細菌抽出物５０μｌを相当するウェルに添加した。
あるいは、細胞ペレットを再懸濁して、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）５０μｌおよび同容量のＦａｂ含有細菌抽出物を相当するウェルに添加した。
次に、細胞−抗体懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠沈させて、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌで３回洗浄した。各洗浄ステップ後、細胞を遠心分離して、慎重に再懸濁させた。
二次検出抗体（ＰＥとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ）を添加して、試料を氷上でインキュベートして、次に、Ｆａｂインキュベーションに従って洗浄した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）機器で決定した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の発現および精製
Ｆａｂ断片の発現は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１Ｆ−細胞で実施した。培養物を３０℃で１８時間振とうさせた。細胞を収集して、リゾチームおよびＢｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）の組合せを使用して崩壊させた。Ｈｉｓ６でタグ付けしたＦａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、ドイツ）によって単離して、タンパク質濃度をＵＶ分光光度法により決定した。代表的に選択される試料の純度は、変性還元性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）で解析した。
Ｆａｂ調製物の均質性は、較正標準物質を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により自然状態で決定された。
ＩｇＧへの変換およびＩｇＧ発現
完全長ＩｇＧを発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、ヒトＩｇＧ１に関して、Ｆａｂ発現ベクターから適切なｐＭｏｒｐｈ（登録商標）＿ｈＩｇベクターへサブクローニングした。あるいは、真核生物ＨＫＢ１１細胞をｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。細胞培養物上清を、トランスフェクションの３日後または７日後に収集した。滅菌濾過後、溶液を、液体ハンドリングステーションを使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付した。別記されない場合には、緩衝液交換は、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ実施され、試料は滅菌濾過された（孔サイズ０．２μｍ）。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法により決定して、ＩｇＧの純度は、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）を使用して、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥで、変性還元性条件下で解析した。
バイオアッセイ
上述するパニングプロセス後に得られる抗ＦＧＦＲ抗体を、以下で例示されるアッセイで評価した：
ＢａＦ３/ＣＭＶ−ＦＧＦＲＩＩＩＢ−Ｃ３細胞増殖アッセイ
抗ＦＧＦＲ２抗体の、ＦＧＦ１依存性細胞増殖を阻害する能力を決定するために、増殖アッセイは、各々のキナーゼドメインを保有する完全長ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ受容体ＥＣＤおよびＦＧＦＲ−１細胞内ドメインのキメラで安定に形質導入された操作Ｂａ／Ｆ３細胞株（ＢａＦ３／ＣＭＶ−ＦＧＦＲＩＩＩＢ−Ｃ３）を使用して実施した。ヒトＦＧＦ１の添加が、この細胞株において細胞増殖を促進した。
細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１＋２μｇ／ｍｌのヘパリン＋２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン）中に再懸濁して、８０μｌ中に８×１０３個の細胞／ウェルの細胞密度で平底白色９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、＃３９０３）へ播種して、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
翌日、ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体（ＦａｂまたはＩｇＧ）を所望の濃度（５倍濃縮）へ完全成長培地中で希釈した。抗体溶液２０μｌを、前日の播種細胞に添加して、細胞を７２時間培養した。７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率アッセイ試薬（＃Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを各ウェルに添加して、わずかに振とうしてＲＴで１５分間インキュベートして、続いて照度計（ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ、Ｔｅｃａｎ）で発光を読み出した。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０値）の決定に関して、ＦａＢ／ＩｇＧ滴定を実施して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０を算出した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧの潜在的なアゴニスト活性の評価に関して、抗体の、外因性ＦＧＦ１の非存在下で操作ＢａＦ／３細胞の増殖を促進する能力により決定されるように、細胞およびＩｇＧを希釈培地（ＦＧＦ１を有さない完全成長培地）中に希釈した。細胞の播種およびＩｇＧの添加は、同日に行った。
親和性決定
ＫＤ決定に関して、抗体タンパク質の単量体分画を使用した（単量体含有量少なくとも９０％、解析用ＳＥＣにより解析、それぞれ、Ｆａｂに関してはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＩｇＧに関してはＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。
（ａ）Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））を使用したＫＤ決定のための溶液平衡滴定（ＳＥＴ）法
溶液中の親和性決定は、基本的には文献（Friguet et al., 1985 J Immunol Methods 77: 305-319）に記載されるように実施された。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するために、それは、古典的なＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術に移された（Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339: 182-184）。ＨｕＣＡＬ（登録商標）＿ＩｇＧのＫＤ決定は、下記試薬：標準的なＭＳＤプレート上で４℃で一晩ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌでコーティングされたビオチン化ｈＦＧＦＲ２を使用して、記載されるように実施した。
ＭＳＤプレートを洗浄し、３０μｌ／ウェルのＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを界面活性剤と共に添加した後、電気化学発光シグナルをＳｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して検出した。
データを、カスタマイズされた適合モデルを適用するＸＬｆｉｔ（商標）（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを使用して評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ決定のために、以下の適合モデルを使用した（（Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339:182-184）に従う）：
（［Ｆａｂ］ｔ：適用される全Ｆａｂ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を含まないＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：親和性
である）。
ＩｇＧ分子のＫＤ決定に関して、ＩｇＧに関する下記フィットモデルが使用され（Piehler et al., 1997 J Immunol Methods 201: 189-206に従って修飾される）、データの概要を図１に示す：
（［ＩｇＧ］：適用される全ＩｇＧ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を含まないＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
である）。
パニング戦略およびスクリーニングの概要
総計で、上記で概要するように組換え抗原材料ならびに細胞株を使用した２８個の異なるパニング戦略を用いた。上述するアッセイを使用して、パニングアウトプットを、特異性および交差反応性に関してスクリーニングして、９３５個のクローンを配列決定に関して選択した。上述するスクリーニングプロセス後に、以下の実施例で記載されるように、さらなる特徴付けに関して、１５個の抗体を選択した。これらの抗体のうち、１２４３３、１２９４７、１０８４６および１２９３１は、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２−３）に結合することがわかり、１０１６４、１１７２５、１０２２０、１１７２３および１２９４４は、両方のヒトＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２−３）およびＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２−１）に結合することがわかり、１２４２５、１２４２２、１２４３９、１０９１８、１０９２３および１１７２２は、両方のヒトＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２−３）およびＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２−１）および同様にヒトＦＧＦＲ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２２４５５）に結合することがわかった。
実施例２： 親和性決定
ＦＧＦＲ２種オルソログに対する、および同様にＦＧＦＲ４に対する抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、およびＣＭ５センサーチップを用いて決定した。
簡潔に述べると、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充したＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を、全ての実験に関して実行緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用は、応答単位（ＲＵ）により測定した。パイロット実験を実施して、抗ヒトＦｃ抗体の固定化の実現可能性および試験抗体の捕捉を試験ならびに確認した。
動態測定に関して、抗体がセンサーチップ表面上に固定化された実験を実施して、表１に列挙される上述するＦＧＦＲタンパク質の、遊離溶液中で結合する能力を決定した。簡潔に述べると、ＲＵ ６０００に達するように、ｐＨ４．７５の５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体を、４つ全てのフローセル上に流速１０μ／分でアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。続いて、３μｇ／ｍｌの試験抗体を、１０μｌ／分で１０秒間注入した。抗体の固定化レベルが概して、２５０未満のＲＵに維持された。続いて、２倍系列で希釈した０．０７８〜１００ｎＭのＦＧＦＲ受容体を、流速８０μｌ／分で７分間、参照および試験フローセルの両方にわたって注入した。実行緩衝液として０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充したＨＢＳ−ＥＰ＋を使用して、結合の解離を１０分間行った。各注入サイクル後に、チップ表面を、ｐＨ２．０で、６０μｌ／分で７０秒間、１０ｍＭグリシンで再生させた。実験は全て、２５℃で実施して、応答データは、全体的に簡素な１：１相互作用モデルでフィッティングさせて（評価ソフトウェアバージョン１．１（ＧＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して）、速度（Ｋａ）、オフ速度（Ｋｄ）および親和性（ＫＤ）の推定値を得た。
ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ種オルソログおよびＦＧＦＲ４に対して得られた親和性推定値の概要を表４に示す。抗体の全てが評価したＦＧＦＲ２の種オルソログに結合されること、および抗体のサブセットはまた、ヒトＦＧＦＲ４にも結合されることがわかった。さらに、幾つかの抗体（１０８４６、１２４３３、１２９３１および１２９４７）は、ヒトＦＧＦＲ２のＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ 受託＃Ｐ２１８０２）に結合することができなかった。抗体の全てが、ＦＧＦＲ２に特異的であるか、またはＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に結合され、抗体はいずれも、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ３にはっきりと結合しないことがわかった。
実施例３： 抗ＦＧＦＲ抗体の機能活性の評価
精製抗体の、ＦＧＦＲ２のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用する能力を、Ｂａｆ細胞がＦＧＦＲ２を過剰発現するように形質導入されたＢａｆ細胞系を使用して評価した。
抗体の潜在的なアゴニスト特性を評価するために、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２細胞をＰＢＳ中で２度洗浄して、希釈培地（１０％ＦＢＳ、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｈ３１４９）および２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｃａｔ＃３０−１００−ＲＢ）を補充したＲＰＭＩ）中に再懸濁した後、希釈培地９０μｌ中で８０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９０４）中に播種した。各アッセイでは、１つのプレートを「０日目」のプレートと称し、これらのプレートの各ウェルに、希釈培地をさらに１０μｌ、続いて８０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を添加した。アッセイプレートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。各抗体に関して、希釈培地中の１０倍溶液として、段階希釈物を調製し、適切なウェルに１０μｌを添加した。試験抗体に加えて、ＦＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１００−１７Ａ、最終アッセイ濃度０〜３０ｎＭ）、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＭＡＢ６８４１）および非ＦＧＦＲ２結合抗体が対照試薬として含まれた。アッセイプレートは、５％ＣＯ２で３７℃で３日間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートをおよそ３０分間室温にして、８０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を添加した。次に、プレートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。細胞増殖に対する抗体の効果を決定するために、未加工発光値を反復に関して平均化して、０日目の対照と比較した。１０８４６、１１７２５および１２４３９は、これらの研究では評価されなかったが、試験した他の抗体はいずれも、ＦＧＦ１を置換して、細胞成長を維持することが可能であった。データの概要を図２（Ａ）／（Ｂ）に示す。
同様に、Ｂａｆ細胞系を使用して、抗体の、ＦＧＦＲ２受容体シグナル伝達のアンタゴニストとして作用する潜在性を評価した。これらの研究では、上記アゴニズム研究に記載されるように、希釈培地への３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１００−１７Ａ）の添加を伴って、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２細胞を平板培養した。各抗体に関して、３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ１を有する希釈培地中の４倍溶液として、段階希釈物を調製し、適切なウェルに２５μｌを添加した。試験抗体に加えて、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＭＡＢ６８４１）および非ＦＧＦＲ２結合抗体が対照試薬として含まれた。アッセイプレートは、５％ＣＯ２で３７℃で３日間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートをおよそ３０分間室温にして、８０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を添加した。次に、プレートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。相対的な細胞増殖に対する抗体の効果を決定するために、未加工発光値を反復に関して平均化して、比較した。１０８４６、１１７２５および１２４３９は、これらの研究では評価されなかった。試験した他の抗体の効果は、図３（Ａ）／（Ｂ）に示され、評価したクローンのうち、１０９１８、１０９２３、１２９３１、１２９４４、１２９４７および１２４２２が、１００ｎＭ未満の濃度で、５０％よりも上回って、操作Ｂａｆ細胞の増殖を阻害したことを実証する。
実施例４： ＡＤＣの調製
１ステッププロセルによるＤＭ１コンジュゲートの調製
抗体１２４２５を、コンジュゲーション反応を開始する前に接線流濾過（ＴＦＦ＃１）により反応バッファー（１５ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で透析濾過した。続いて、抗体１２４２５（５．０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭ１（抗体量に対して５．６倍モル過剰）、次いで、ＳＭＣＣ（抗体量に対して４．７倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％ＤＭＡを含有する１５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）中、２０℃で約１６時間行った。１Ｍ酢酸を添加してｐＨを５．５０に調整することにより反応をクエンチした。ｐＨ調整後、反応混合物を多層（０．４５／０．２２μｍ）ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、精製し、接線流濾過（ＴＦＦ＃２）を使用して８．２２％スクロースを含有する２０ｍＭコハク酸バッファー（ｐＨ５．０）中で透析濾過した。接線流濾過のための装置パラメーターを、以下の表５に列挙する。
上記のプロセスから得られたコンジュゲートを、細胞毒性剤ローディング（メイタンシノイドと抗体の比、ＭＡＲ）についてはＵＶ分光法；コンジュゲート単量体の決定についてはＳＥＣ−ＨＰＬＣ；および遊離メイタンシノイドパーセンテージについては逆相ＨＰＬＣまたは疎水性保護相（Ｈｉｓｅｐ）−ＨＰＬＣにより分析した。データは表６に示す。
原位置でのプロセスによりＤＭ１コンジュゲートの調製
本発明のコンジュゲートはまた、下記手順に従って、原位置でのプロセスにより調製することができる。抗体（２１個のクローン）は、スルホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用してＤＭ１にコンジュゲートされた。ＤＭ１およびスルホ−ＳＭＣＣヘテロ二官能性リンカーのストック溶液を、ＤＭＡ中で調製した。スルホ−ＳＭＣＣとＤＭ１チオールとを一緒に混合して、４０％ｖ／ｖの水性５０ｍＭコハク酸バッファー、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡ中で、ＤＭ１とリンカーとの比１．３：１モル当量およびＤＭ１の最終濃度１．９５ｍＭで、２５℃で１０分間反応させた。次いで、抗体を反応のアリコートと反応させて、５０ｍＭ ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０および１０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中、２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂの最終コンジュゲーション条件下で、約６．５：１のＳＭＣＣとＡｂとのモル当量比を得た。２５℃で約１８時間後、コンジュゲーション反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
ＳＰＤＢリンカーを使用するＡＤＣの調製
抗体１２４２２、１２４２５および１２４３３（８ｍｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中、２５℃で１２０分間、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、それぞれ、５．０、５．５および４．９倍モル過剰）を使用して改変した。次いで、精製されていない改変Ａｂを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中、４ｍｇ／ｍＬの最終改変抗体濃度で、２５℃で１８時間、ＤＭ４（未結合のリンカーに対して１．７倍モル過剰）にコンジュゲートした。コンジュゲーション反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
ＣＸ１−１リンカーを使用するＡＤＣの調製
抗体１２４２５（５．０ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭ１（抗体量に対して７．１５倍モル過剰）、次いで、ＣＸ１−１（抗体量に対して５．５倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％ＤＭＡを含有する６０ｍＭ ＥＰＰＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］バッファー（ｐＨ８．５）中、２５℃で約１６時間行った。次いで、反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５中で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
実施例５： 親抗体と比較したＡＤＣの親和性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲーション後のＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４に対する抗体の親和性を、上記の実施例２に記載のものと同様の方法を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣＭ５センサーチップを使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術を使用して決定した。
評価した抗体に関して、親非コンジュゲート化抗体と比較してＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート化抗体について、ヒトＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂへの結合に関して類似する親和性推定値が得られたが、これはコンジュゲーションが抗体結合に感知できるほど影響しないことを示唆している（表１０）。
さらに、幾つかのＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗体のＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４種オルソログに対する親和性を決定した。これらの研究では、親和性における感知可能な差は、コンジュゲートされた抗体とコンジュゲートされていない抗体との間では見られなかった（表１１）。
実施例６： ＳＮＵ１６およびＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞におけるＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１リンカー−ペイロードへのコンジュゲーション後に、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の、ＦＧＦＲ２増幅細胞株ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＣＲＬ−５９７４）およびＫａｔｏ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）の増殖を阻害する能力を決定した。簡潔に述べると、供給業者により推奨されるように、細胞を組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で培養培地中で培養した。アッセイの当日に、細胞をＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄した後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃａｔ＃２５３００）で５分間処置して、推奨される培養培地中に再懸濁した。次に、細胞を計数して、細胞培養培地１００μｌ中に２６００〜３６００個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９４０またはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃａｔ＃３３４０）中に播種した。二重反復プレートは、０日目の測定用に生成されて、全てのプレートを組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。また、培地のみのウェルを生成して、陰性対照として作用させた。このインキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を、０日目プレートに添加して、次にそれらを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。試験ＡＤＣは、適切な細胞培養培地中、２×ストック溶液へ二重反復で段階希釈して、アッセイプレートの残部それぞれから培地５０μｌを除去した後、２×段階希釈ＡＤＣ ５０μｌを添加した（最終アッセイ濃度０．２〜５０ｎＭ ＤＭ１等価体）後、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で５日間インキュベートした。このインキュベーション期間後に、相対細胞生存率を、上述するようにＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決定した。細胞増殖に対するＡＤＣの効果は、下記の通りに二重反復の平均値を使用して算出された：
阻害％＝（処置ＡＤＣ−未処置）／（未処置−０日目）×１００
阻害％データを４パラメーターロジスティック方程式にフィッティングさせて、ＩＣ５０値を決定した。ＩｇＧ対照ＡＤＣと異なり、試験ＡＤＣは、３ｎＭ未満のＩＣ５０で、Ｋａｔｏ−ＩＩＩおよびＳＮＵ１６細胞の両方の増殖の強力な阻害剤であることがわかった。（表１２）。
また、ＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー−ペイロードを介してコンジュゲートされた幾つかの抗ＦＧＦＲ抗体の能力を評価した。上述するように実施したこれらの研究により、評価した抗体はまた、ＳＰＤＢ−ＤＭ４ ＡＤＣとして細胞増殖の強力な阻害剤であることが明らかとなり、ペイロードを首尾よく送達して、細胞を死滅させるそれらの能力は、ＭＣＣ−ＤＭ１に限定されないことを示唆した。ＳＮＵ１６細胞株に関するデータを表１３に概要する。
実施例７： 抗ＦＧＦＲ２／４ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価
１５個の抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４交差反応性ＡＤＣの抗腫瘍活性は、胃のＦＧＦＲ２増幅（ＣＮ＝３１）、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂアイソフォーム発現性ＳＮＵ１６異種移植片腫瘍モデルで評価した。２つの独立した研究において、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積１９２．９ｍｍ３による移植の８日後に、第１の研究に加えた。９つの群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳまたは下記抗体薬物コンジュゲート：１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０２２０−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０９１８−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０９２３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１１７２２−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の１つの単回３ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉ．ｖ．）注射を投与した。マウスは、平均腫瘍体積２２３．４ｍｍ３による移植の７日後に、第２の研究に加えた。９つの群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳまたは下記抗体薬物コンジュゲート：１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２９４７−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２９３１−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２９４４−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４３９−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０８４６−ＭＣＣ−ＤＭ１、１１７２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または１１７２３−ＭＣＣ−ＤＭ１の１つの３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．注射を投与した。１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１は、両方の研究における抗体薬物コンジュゲートの直接的な比較を容易とするために、２つの研究間の懸け橋として含まれた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。これらの研究で評価されるＡＤＣは、投与の２３から２４日後に広範囲の抗腫瘍活性を示した（３３．２％Ｔ／Ｃから７７．８％退縮に及ぶ）（図４（Ａ）および図４（Ｂ））。
切断性ジスルフィドリンカーに基づくＳＰＤＢ−ＤＭ４ ＦＧＦＲ２ ＡＤＣの抗腫瘍活性を、ＳＮＵ１６異種移植片腫瘍モデルで評価した。これらの研究では、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２２３ｍｍ３による移植の１１日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝７匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１もしくは対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回１５ｍｇ／ｋｇ静脈内注射、または１２４３３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４もしくはＩｇＧ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の単回５ｍｇ／ｋｇ静脈内注射を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。対照ＡＤＣはいずれも、この研究では抗腫瘍活性を示さなかった（図４（Ｃ））。しかしながら、対照的に、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２４３３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はともに、投与した用量で、ＳＮＵ１６異種移植片モデルに対して高活性であり、抗ＦＧＦＲ ＡＤＣの抗腫瘍効果が、異なるリンカーを用いて得られ得ることを示唆した。
抗ＦＧＦＲ ＡＤＣの薬物動態（ＰＫ）を、３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後にＳＮＵ１６腫瘍保有マウスで評価した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、２４時間後、７２時間後、１６８時間後、および３３６時間後に収集した。全ての研究において、「総」抗体および「抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」の両方の血清濃度は、確証されたＥＬＩＳＡ法を使用して全ての動物種で測定された。「総」分画は、コンジュゲートされたＤＭ１を伴うか、または伴わない抗体の測定を指すのに対して、ＡＤＣ分画は、ＤＭ１とコンジュゲートされた抗体のみの測定を指す（１つ以上のＤＭ１分子）。全ての研究において、感知可能な差は、ＡＤＣと総抗体分画とのクリアランス間で観察されなかった。ＡＤＣのＰＫ特性の概要を図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）に示す。ＳＮＵ１６腫瘍保有マウスにおける単回３ｍｇ／ｋｇ投与後のＡＤＣクリアランスを、観察される抗腫瘍効果と比較した場合、最大の抗腫瘍活性を有するＡＤＣ（４０％を上回る腫瘍退縮）は全て、４５ｍｌ／ｄ／ｋｇ未満の速度で除去されることがわかった（図４（Ｆ））。
実施例８： ＦＧＦＲ２増幅細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲートされていない抗体およびコンジュゲートされた抗体のシグナル伝達活性の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ２抗体の、ＦＧＦＲ２増幅細胞株においてＦＧＦＲシグナル伝達を調節する能力を評価した。初期研究では、ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＣＲＬ−５９７４）細胞における１２４３３、１２４２５および１０１６４抗体の効果を決定した。簡潔に述べると、細胞を１２ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ（商標）プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３３３６）において１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中に播種して、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。実験の当日に、細胞培養培地を吸引して、試験抗体または小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８のいずれかで置き換えて、全てを、（１３〜１３０ｎＭ、抗体／ＡＤＣ、５００ｎＭ、ＢＧＪ３９８）の最終濃度で、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で希釈した。次に、細胞を組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で２時間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄して、氷上に置いて、ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４ ９０６２３７００１）とともに溶解緩衝液（ＣＳＴ Ｃａｔ＃９８０３）３００μｌを添加した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ＃２３２２８）により決定した。続いて、タンパク質６０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させて、ニトロセルロース膜上へ転写して、ｐＦＲＳ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃３８６１）、総ＦＧＦＲ２（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃ＳＣ−１２２またはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃６８４１）およびβ−アクチン（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ３００−４８５Ａ）またはサイトケラチン（Ｄａｋｏ Ｃａｔ＃Ｍ３５１５）に対する抗体でプローブした。結果を図５（Ａ）に示し、コンジュゲートされてないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとしてのいずれの抗体も、２時間でｐＦＲＳ２シグナルを調節することが不可能であることがわかった。１２４２５抗体（４．３ｎＭ）および１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣ（４．３ｎＭ抗体、１３ｎＭ ＤＭ１等価体）を用いてさらなる実験を行い、ここではＳＮＵ１６および同様にＫａｔｏ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）細胞の両方においてさらなる時点（４時間、２４時間および７２時間）を評価した。結果を図５（Ｂ）（ＳＮＵ１６）および図５（Ｃ）（Ｋａｔｏ−ＩＩＩ）に示す。ネイキッド抗体またはＡＤＣのいずれの効果も、ＳＮＵ１６細胞においては４８時間まで、またはＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞においては７２時間まで観察されなかった。ｐＦＲＳ２およびｔＦＧＦＲ２シグナルの両方の低減が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置後にサイトケラチンに対してＳＮＵ１６細胞において７２時間に観察された。以下の実施例９に記載されるように、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、７２時間の時点でのＳＮＵ１６増殖の強力な阻害剤であり、この減少は、ＳＮＵ１６細胞集団においてＦＧＦＲ２発現の不均一性を反映する可能性が高い。
実施例９： 細胞増殖に対するＡＤＣおよびコンジュゲートされていない抗体の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ抗体の、ＦＧＦＲ２増幅過剰発現性およびヌル細胞株パネルの増殖を阻害する能力を評価した。これらの研究では、供給業者により推奨されるように、細胞を組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で培養培地中で培養した。アッセイの当日に、細胞をＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄した後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃａｔ＃２５３００）で５分間処置して、推奨される培養培地中に再懸濁した。次に、細胞を計数して、細胞培養培地５５〜１００μｌ中に８００〜３６００個の細胞／ウェルの密度で９６または３８４ウェルプレート（例えば、Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃａｔ＃３３４０、Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３７０７）中に播種した。二重反復プレートは、０日目の測定用に生成されて、全てのプレートを組織培養中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。また、培地のみのウェルを生成して、陰性対照として作用させた。このインキュベーション後、３０〜５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を、０日目プレートに添加して、次にそれらを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。試験ＡＤＣは、適切な細胞培養培地中、２×または１０×ストック溶液のいずれかへ二重反復で段階希釈した。２×ＡＤＣストック溶液が使用されるアッセイに関しては、アッセイ培地の半分を除去して、等量の２×段階希釈ＡＤＣで置き換えた。１０×ＡＤＣストック溶液が用いられた場合、これを、アッセイプレートへ１：１０で希釈した（例えば、５μｌ対５５μｌ）後、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で５日間または６日間インキュベートした。ＡＤＣの最終的なアッセイ濃度は、０．００５〜１００ｎＭ ＤＭ１等価体の範囲であった。このインキュベーション期間後に、相対細胞生存率を、上述するようにＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決定した。細胞増殖に対するＡＤＣの効果は、下記の通りに二重反復の平均値を使用して算出された：
阻害％＝（処置ＡＤＣ−未処置）／（未処置−０日目）×１００
阻害％データを４パラメーターロジスティック方程式にフィッティングさせて、ＩＣ５０値を決定した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に関する代表的なデータを図６（Ａ）に示す。このＡＤＣは、ＳＮＵ１６（図６（Ａ））およびＫａｔｏ−ＩＩＩ ＦＧＦＲ２増幅細胞株（図６（Ｂ））の両方において細胞増殖の強力な阻害剤であることがわかった。これらの細胞株はともに、メイタンシノイドペイロードに対して感受性があることが確認された（Ｌ−Ｍｅ−ＤＭ１、図６（Ａ）〜図６（Ｃ）では遊離ＤＭ１）が、類似のメイタンシノイド抗体比でＳＭＣＣ−ＤＭ１を介してコンジュゲートされた非ターゲッティングＡＤＣ（ニワトリリゾチームに対して）に対して感受性がないことが確認された。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１はまた、感知可能なＦＧＦ２発現を欠如しているが、メイタンシノイドペイロードに対して感受性がある胃がん細胞株ＮＵＧＣ３に対して活性がなかった（図６（Ｃ））。さらに、コンジュゲートされていない抗体１２４２５は、ＳＮＵ１６（図６（Ｄ）およびＫａｔｏ−ＩＩＩ（データは示していない）の両方において抗増殖活性を欠如することがわかった。ＳＮＵ１６、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ、ＳＵＭ−５２、ＭＦＭ２２３およびＨ７１６細胞（Kunii et al., 2008 Cancer Res 68: 2340-2348、Turner et al., 2010 29: 2013-2023、Mathur et al., 2010. Proceedings of the 101st Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, poster # 284）を含むＦＧＦＲ２増幅細胞株における幾つかの抗ＦＧＦＲ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの抗増殖活性の概要を表１４に示す。さらに、ＡＤＣはいずれも、ＡＺ５２１、ＣＡＬ−５１、ＫＹＳＥ−１５０、ＴＥ−６、ＳＮＵ−１０４１、ＴＴ、ＣＨＬ−１、Ｇ４０１およびＨＥＣ５９を含む腫瘍細胞株パネルに対して活性であることがわかった。
実施例１０： ＦＧＦＲ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏＰＫ−ＰＤ
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ｉｎ ｖｉｖｏで薬物動態マーカーを調節する能力を評価するために研究を行った。この研究の目標は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現とＧ２／Ｍ細胞周期停止との間の関連性を評価することであった。免疫組織化学により評価されるように、ｐＨＨ３陽性核の蓄積は、Ｇ２／Ｍ停止のマーカーとして使用した。
ヒトヒストンＨ３のＳｅｒ１０周囲の残基に相当する合成ホスホペプチドで動物を免疫化することにより生産されるウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ）から入手した。簡潔に述べると、ＩＨＣプロトコールは、熱、およびＶｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＃１抗原回復（antigen retrieval）試薬に対する標準的な曝露を含んでいた。一次抗体を１：１００に希釈して、３７℃で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ ＯｍｎｉＭａｐで予め希釈したＨＲＰとコンジュゲートした抗ラビット抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１１）とのインキュベーションを４分間実施した。
ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移植片モデルにおいてＰＤを評価するために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん３００〜５００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を受けさせた（ｎ＝３匹／群）。メイタンシノイドペイロードの予測される作用機序と一致して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＰＢＳ処置対照と比較して、投与の２４時間後に核ｐＨＨ３陽性の顕著な時間依存的増加をもたらした（代表的な画像を図７（Ａ）に示す）。切断されたカスパーゼ３における時間依存的変化もまた評価した。これらの研究では、ヒトカスパーゼ−３における（Ａｓｐ１７５）に隣接するアミノ末端残基に相当する合成ペプチドで動物を免疫化することにより生産されるウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ）から入手した。ＩＨＣプロトコールは、熱を含まず、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＃１抗原回復試薬に対する標準的な曝露を含んでいた。一次抗体を１：３００に希釈して、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ ＯｍｎｉＭａｐで予め希釈したＨＲＰとコンジュゲートした抗ラビット抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１１）とのインキュベーションを４分間実施した。ｐＨＨ３と類似して、同様に、切断されたカスパーゼ３における時間依存的変化が観察された（図７（Ａ）。類似したデータが、他の抗ＦＧＦＲ２ ＡＤＣ、例えば１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた。
ＡＤＣ特異性を評価するために、ＰＤは、ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４陰性ＮＵＧＣ３異種移植片モデルにおいて評価した。これらの研究では、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１×１０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん３００〜５００ｍｍ３に達したら、９匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４陰性ＮＵＧＣ３異種移植片において、１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対してｐＨＨ３レベルを調節することができなかった（代表的な画像を図７（Ｂ）に示す）。類似したデータが、他の抗ＦＧＦＲ２ ＡＤＣ、例えば１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた。
まとめると、これらのデータは、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現に依存して、またメイタンシノイドペイロードの作用機序と一致する頑強なｉｎ ｖｉｖｏでの細胞ＰＤ効果を誘発することが可能であることを実証している。
実施例１１： 抗ＦＧＦＲ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
抗ＦＧＦＲ２および／または抗ＦＧＦＲ２／４ ＡＤＣの抗腫瘍活性を、幾つかの腫瘍異種移植片モデルで評価した。
ＦＧＦＲ２ゲノム増幅による異種移植片モデル
モデル１：３つの抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４二重ターゲッティングＡＤＣの抗腫瘍活性を、胃のＦＧＦＲ２増幅（コピー数＝３１、ＳＮＰ６．０）、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｃアイソフォーム発現性ＮＣＩ−Ｈ７１６結腸直腸異種移植片腫瘍モデルで評価した。雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する５×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。
マウスは、平均腫瘍体積１７１．７ｍｍ３による移植の４日後に、研究に加えた（図８（Ａ））。８つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または単回ｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１（５または１５ｍｇ／ｋｇ）、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５または１５ｍｇ／ｋｇ）または１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１（５または１５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１５ｍｇ／ｋｇでは活性ではなかった。１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１は、５ｍｇ／ｋｇでは活性ではなかった。１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１（５および１５ｍｇ／ｋｇ）および１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５および１５ｍｇ／ｋｇ）は、投与後の１４日まで類似した活性を示した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）および１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇのみ）は、投与後の１８日まで最も持続性の応答をもたらした（それぞれ、２３％、２１％および３１％Ｔ／Ｃ）。
モデル２：３つの抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４ ＡＤＣの用量応答抗腫瘍活性はまた、ＦＧＦＲ２増幅、ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂアイソフォーム発現性ＭＦＭ２２３ ＥＲ／ＰＲ／Ｈｅｒ２陰性胸部異種移植片腫瘍モデルで評価した。ＭＦＭ２２３モデルは、断片に基づくモデルとして樹立された。断片移植の１日前に、雌ヌードマウスに、血清エストロゲンレベルを維持するための６０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）０．７２ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット移植の１日後、ドナーマウスから収集した異種移植片を、レシピエントヌード雌マウスへ皮下移植される３ｍｍ３断片ごとに３つに切断した。マウスは、平均腫瘍体積２０８．４ｍｍ３による移植の２１日後に、研究に加えた（図８（Ｂ））。５つの群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または単回１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、このモデルでは活性ではなかった。単回１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および１０１６４−ＤＭ１は、投与の１８日後に、３７％、２４％および７％Ｔ／Ｃをもたらした。
モデル３：単剤としての１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性はまた、ＦＧＦＲ２増幅患者由来原発性胃腫瘍異種移植片モデルＣＨＧＡ−０１０（ＦＧＦＲ２コピー数＝４８、（ＳＮＰ６．０））で評価した。これらの研究では、雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスに、ＤＭＥＭ中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する３×３×３ｍｍ腫瘍断片を皮下移植した。腫瘍生着率は５０％を上回り、移植の４週後にはおよそ２５０ｍｍ３に達した。１０ｍｇ／ｋｇＩＶ １２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回投与後に、腫瘍停滞は、投与後のおよそ１６〜２０日まで達成された（図８（Ｃ））。類似した単回投与データが、ＦＧＦＲ２特異的ＡＤＣ、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた（データは示していない）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇのｑ３ｗ＊２ ＩＶを受けた群は、おおよそ腫瘍停滞を初期投与後の３７日まで維持した一方で、単回１０ｍｇ／ｋｇ用量を受けた群での腫瘍は、初期投与後の３７日までに平均して１５８８ｍｍ３となった。これらのデータは、ＣＨＧＡ０１０異種移植片が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の第２の投与に応答することが可能であることを実証している。
正常なＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４コピー数を有する異種移植片モデル
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性はまた、正常なＦＧＦＲ２コピー数および様々なＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡ発現を有する２３個のヒト肺原発性腫瘍異種移植片、および２２個のヒト胸部原発性腫瘍異種移植片で評価した。ヒト原発性異種移植片モデルは、ヒト肺原発性腫瘍断片を、雌ヌードマウスへ皮下移植することにより樹立した。得られた腫瘍異種移植片を、雌ヌードマウスへの３ｍｍ３断片の皮下移植により、ｉｎ ｖｉｖｏで継代培養した（passaged）。動物に腫瘍断片を移植して、随時登録（rolling enrollment）により、即ち腫瘍がいったんおよそ２５０ｍｍ３に達したが必ずしも腫瘍断片移植後の同じ時間ではなしに、処置（未処置、または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．ｑ２ｗ）に割り当てた。異種移植片モデル１つ当たり１匹の動物が、２つの処置部門それぞれに割り当てられた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定し、データは、腫瘍体積の変化パーセントとして解析した。
２３個の肺原発性腫瘍異種移植片モデルのうち８個、および２２個の胸部原発性腫瘍異種移植片モデルのうち８個が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に応答した。応答は、一過性の腫瘍成長阻害から腫瘍移植片の完全退縮までに及んだ。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に応答する１つの肺原発性腫瘍異種移植片モデルおよび１つの胸部原発性腫瘍異種移植片モデルの例は、それぞれ、図８（Ｄ）および図８（Ｅ）に示す。まとめると、データは、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡのいずれかの発現の上昇を伴うヒト肺および胸部原発性腫瘍異種移植片のｉｎ ｖｉｖｏでの成長が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置により阻害され得ることを実証している。
抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４ ＡＤＣ １２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活性はまた、ＦＧＦＲ２を発現するが、遺伝子の正常なコピー数を有する胸部異種移植片モデルで評価した。モデルは、乳管癌を有する５２歳女性由来の断片に基づく異種移植片モデルとして樹立され、雌ヌードマウスで展開させた。ドナーマウスから収集した異種移植片を、３ｍｍ３断片ごとに３つに切断して、血清エストロゲンレベルを維持して、異種移植片成長を支持するために０．００８５ｍｇ／ｍｌの１７β−エストラジオールリッチな水を補充したレシピエントヌード雌マウスに皮下注射した。マウスは、平均腫瘍体積１９８ｍｍ３による移植の２６日後に、研究に加えた。３つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスに単回１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１、または１５または５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を投与した（図８（Ｆ））。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。単回１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、６．５％Ｔ／Ｃをもたらした一方で、５ｍｇ／ｋｇ用量は不活性であった。これらのデータは、遺伝子増幅なしでＦＧＦＲ２発現性腫瘍における１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の有用性を支持する。
まとめると、これらのモデルは、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅の存在または非存在下で、細胞表面でＦＧＦＲ２を発現する腫瘍における１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の有用性を支持する。
実施例１２： 小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素としても公知）によるＦＧＦＲ ＡＤＣの抗腫瘍活性の改善
単独での、およびＦＧＦＲ小分子チロシンキナーゼ阻害剤３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（Guagnano et al., 2011 J Med Chem 54: 7066-7083）と組み合わせたＦＧＦＲ２／４抗体薬物コンジュゲート１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性は、ＦＧＦＲ２増幅ＣＨＧＡ１１９患者由来の原発性胃腫瘍異種移植片モデル（ＦＧＦＲ２コピー数＝２２（ＳＮＰ６．０））で評価した。これらの研究では、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍのサイズのＣＨＧＡ１１９腫瘍断片を、雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスへ皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の４０日後、ＣＨＧＡ１１９腫瘍を保有するマウス（ｎ＝８、平均２５１ｍｍ３、範囲１０４〜３８２ｍｍ３）を、それぞれ、経管栄養により経口的にビヒクル（酢酸／酢酸塩緩衝液中の５０％ＰＥＧ３００）（ｐＨ４．６、１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｑｄ）で、対照ＩｇＧ−３２０７−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｑ２ｗｋ）で、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｑ２ｗｋ）で、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｑｄ）で、または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩の組合せで処置した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。単剤としての１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩はそれぞれ、腫瘍停滞または部分的応答（それぞれ、Ｔ／Ｃ＝４％または３３％、ｐ＜０．０５）をもたらした一方で、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩の組合せでの処置は、処置の５週後に、ほぼ完全な腫瘍退縮を誘導した（退縮＝−９４％、ｐ＜０．０５）（図９および表１５を参照）。１０％未満の体重損失が、単剤または組合せ処置のいずれか後に観察された（表１５）。これらのデータは、ＦＧＦＲ ＡＤＣをＦＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤（例えば、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩、ＴＫＩ２５８、ポナチニブ、ＡＺＤ４５４７）と組み合わせることにより、抗腫瘍応答を改善させることができることを示唆する。
実施例１３： ＦＧＦＲ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性に対する用量分割の効果
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ Ｃｍａｘ（ピーク曝露）またはＣａｖｇ（投薬間隔にわたる平均曝露）がその抗腫瘍活性において果たす役割をより良好に理解するために、ＳＮＵ１６異種移植片モデルを使用して、時間用量分割実験を行った。固定された処置持続期間にわたって予測される固定された総曝露をもたらす広範囲の投与スケジュール間隔および用量レベルを研究した。ある特定の用量レベルで、ＦＧＦＲ２ ＡＤＣは、ＴＭＤＤに起因して、非線形ＰＫを示す（実施例１９を参照）。したがって、全ての投与スケジュール間隔および用量レベルに対して固定された総曝露を維持するためには、ＰＫモデリングにより、ＴＭＤＤはより低用量でより顕著であるため、より低くより頻繁な投与スケジュールで投与される場合には、より多くの総用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が必要とされることが予測された。ＰＫモデリングにより、３ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｗ＊２、２．５ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ＊３、１．５ｍｇ／ｋｇ ｑｗ＊６および０．７ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｄ＊１４で投与した１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、類似した総曝露を達成することが予測された。
雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積１８１．７ｍｍ３による移植の１０日後に、第１の研究に加えた。
ＰＫパラメーターを評価するために、尾部の切れ目または後眼窩出血により、血清を収集して、ＥＬＩＳＡによって解析した。総抗体ＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡによりＤＭ１を伴って／伴わずに、総抗体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）でコーティングして、検出は、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで行われ、その後適切なプレートリーダー上で読み取った。コンジュゲートＰＫアッセイは、非色ＥＬＩＳＡにより少なくとも１つのＤＭ１分子に結合されている抗体を測定する。この方式では、プレートを抗ＤＭ１抗体でコーティングして、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。血清は、初期投与後の下記時点で収集した：３ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｗ＊２（２、６、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６、５０３ｈ）、２．５ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ＊３（２、６、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３５、５０３ｈ）、１．５ｍｇ／ｋｇ ｑｗ＊６（２、６、２４、４８、９６、１６７、３３５、５０３、６７１、８３９ｈ）、０．７ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｄ＊１４（２、６、２４、４８、７１、１４３、２１５、２８７、３５９、４３１、５０３、５７５、６４７、７１９、７９１、８６３、９３５ｈ）。
５つの群（ｎ＝７匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｗ＊２、２．５ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ＊３、１．５ｍｇ／ｋｇ ｑｗ＊６または０．７ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｄ＊１４でｉ．ｖ．投与される１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。予想通り、Ｃｍａｘは、治療レジメンに対して多様であった一方で、Ｃａｖｇは変化がなかった（表１６）。全ての治療レジメンが活性であり、類似した腫瘍成長阻害をもたらし、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の平均曝露が、抗腫瘍活性の主要なドライバーであることを示唆した（図１０）。これらの見解は、様々な投与スケジュールが、有効性を損なうことなく臨床で用いることができることを示す。
実施例１４： ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体（１２４３３、１０１６４、１２４２５、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５（ＡＤＣＣ枯渇変異体（Bolt et al., 2003 Eur J Immunol 23: 403-411）））の、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を、ＮＫ３．３細胞（キラー細胞またはエフェクター細胞、Jacky Kornbluth from San Louis Universityによりご厚意で提供していただいた）との同時インキュベーションで、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞（標的細胞、ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）に対して決定した。簡潔に述べると、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞をカルセシンアセトキシメチルエステル（カルセイン−ＡＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ＃１７７８３−５ＭＧ）で染色して、２度洗浄して、ウェル１つ当たり５０００個の細胞の濃度で９６ウェルマイクロタイタープレート（９６ウェル、Ｕ底、透明プラスチック、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ＃６５０ １６０）へピペットで取り（pipetted）、上述の抗体およびタンパク質の段階希釈物（１ｍｌ当たり５０，０００〜０．００３μｇ）とともに１０分間、プレインキュベートした後、エフェクター細胞を添加した。標的細胞の抗体特異的溶解を算出するために、抗体またはエフェクター細胞を伴わない、標的細胞のみの平行インキュベーションは、ベースラインおよび陰性対照として作用したのに対して、陽性対照または最大溶解または１００％の特異的溶解は、１％トリトン−Ｔ（商標）１００溶液を用いて、標的細胞のみの溶解により決定した。１対５の比での標的およびエフェクター細胞の同時インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを遠心分離して、上清液の分取量を別のマイクロタイタープレート（９６ウェル、平底、黒色、透明な底を有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ＃３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光カウンター（Ｖｉｃｔｏｒ（商標） ３マルチラベルカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で決定した。結果を、図１１（Ａ）に示し、全ての試験抗体が、様々な程度でＡＤＣＣを媒介することが観察された。抗体のＦｃ部分においてグリコシル化を保有せず、したがってエフェクター細胞のＣＤ１６ａ受容体への結合を欠如するＮ２９７Ａ＿１２４２５は、いかなるＡＤＣＣも媒介せず、特異的な陰性対照として作用した。標的細胞の一定、かつタンパク質濃度非依存性死滅は、非特異的バックグラウンドに起因して、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞に対するＮＫ３．３細胞の天然死滅活性である。抗体１２４３３は、約６０％で標的細胞の最高の特異的溶解を媒介した（シグナルは、ＮＫ３．３細胞によるＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞のバックグラウンド溶解を推定した）のに対して、抗体１２４２５および１０１６４は、約５５パーセントの特異的溶解に達した（シグナルは、ＮＫ３．３細胞によるＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞のバックグラウンド溶解を推定した）。３つの分子全ての効力（各用量応答曲線の最大半量の死滅での濃度、有効濃度５０、ＥＣ５０）は類似していた。一連の類似した実験では、ネイキッド抗体１２４２５の、ＡＤＣＣを誘導する能力を、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１と比較した。ネイキッド１２４２５と１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１との間の差は観察されず（データは示していない）、ＤＭ１コンジュゲーションは、ネイキッド抗体の、ＡＤＣＣを誘導する能力を感知できるほど損なわないことを示唆した。
さらなる研究では、コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体の、補体因子Ｃ１ｑに結合する能力を評価した。補体因子Ｃ１ｑの結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）および細胞溶解を招く初期ステップである。これらの研究では、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ（登録商標）、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、Ｃａｔ＃４３９４５４）のウェルの表面を、抗体１２４３３、１２４２５、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５および１０１６４の段階希釈物で、暗所で４℃で一晩コーティングした（全て、２５〜０．０２μｇ／ｍｌの濃度範囲で）。市販の抗体リツキシマブは、陽性対照として作用した。マイクロタイター上に結合抗体分析物の量をモニタリングするために、この手順は、プレートに対する分析物のコーティング有効性を決定するために第２の希釈物を利用してプレート１つにつき２度実施した（三重反復で）。Ｃ１ｑ結合は、一定濃度のＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ、補体構成成分Ｃ１ｑ Ｃａｔ＃Ｃ１７４０−１ｍｇ）を添加することにより定量化され、ホースラディッシュペルオキシダーゼＨＲＰにコンジュゲートされたポリクローナルヤギ抗ヒトＣ１ｑ抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ヒツジ抗ヒトＣ１ｑ：ＨＲＰ、Ｃａｔ番号２２２１−５００４Ｐ）を使用して検出した。コーティング効率の制御は、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９−０３６−００３、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’２）断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を用いて第２の希釈物シリーズで決定された。ともに、ＴＭＢ基質（ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７２−１０６７）を使用して可視化され、続いてＵＶ−Ｖｉｓ分光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｐｒｏ ３４０）を用いて４５０ｎｍでの光学密度の測定を行った。結果を図１１（Ｂ）に示す。試験抗体に結合されるＣ１ｑタンパク質の最大量は、全ての分析物に関して同じであった。マイクロタイタープレートに結合された抗体の量は、他の分子のほんのおよそ５０％に達する１０１６４抗体を除いて、全ての分析物に関して同じであった。１２４３３、１０１６４およびリツキシマブの効力（各用量応答曲線の最大半量の結合での濃度、有効濃度５０、ＥＣ５０）はほぼ同じであった。１２４２５抗体のＥＣ５０は、３倍高く、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５のＥＣ５０は、約８倍高かった。１０１６４が、他の抗体がしたようにマイクロタイタープレートに対して均等にウェルをコーティングしなかった結果を考慮して、Ｃ１ｑ結合における観察結果は、Ｃ１ｑタンパク質への結合において１０１６４のおよそ二倍の容量を含意する。
さらに、Ｃ１ｑ結合の評価にとって、コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体１２４３３、１０１６４、１２４２５およびＮ２９７Ａ＿１２４２５の、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を誘発する能力を評価した。Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞（標的細胞、ＡＴＣＣ Ｃａｔ番号ＨＴＢ−１０３）を、ウェル１つ当たり１００００個の細胞の濃度で９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、滅菌、白色、９６ウェル平底細胞培養プレート、Ｃａｔ＃３６１０）へ均等に分配して、上述の抗体の段階希釈物とともに１０分間、プレインキュベートした後、エフェクター試薬を添加した。この研究で使用されるエフェクター試薬は、ウサギ補体（ＰｅｌＦｒｅｅｚ、Ｃａｔ＃３１０６０−１）であり、それを１対６の最終希釈でＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞上へピペットで取った。加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃で２時間のインキュベーション後に、マイクロタイタープレートを遠心分離して、上清を廃棄して、細胞ペレットを、再構成されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光キット、Ｃａｔ＃Ｇ７５７２）中に溶解した。発光は、マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）３）において定量化した。結果は、全ての試験抗体に関して図１１（Ｃ）に示す。ＣＤＣの証拠は、試験抗体（図１１（Ｃ））またはさらなる対照（市販の抗体Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）＆Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、データは示していない）に関して観察されなかった（図１１（Ｃ））。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ活性におけるＡＤＣＣの役割を評価するために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２０１．４ｍｍ３による移植の７日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスは１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量のネイキッド対照ＩｇＧ、ネイキッドＮ２９７Ａ＿１２４２５、ネイキッド１２４２５、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した（図１１（Ｄ））。ネイキッドＡＤＣＣ枯渇１２４２５変異体（ネイキッドＮ２９７Ａ＿１２４２５）は、投与の２５日後にＡＤＣＣコンピテント親１２４２５よりも低い抗腫瘍活性を示した（それぞれ、６１％および１３％Ｔ／Ｃ）。これらのデータは、親１２４２５のエフェクター細胞機能が、ネイキッド抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の活性において役割を果たし得ることを示唆する。ＡＤＣＣコンピテント１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡＤＣＣ枯渇Ｎ２９７Ａ＿１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、投与の２５日後に類似した抗腫瘍活性を示した（それぞれ、４５％および３２％退縮）。これらのデータは、ＡＤＣＣ活性が消耗性である一方で、メイタンシノイドペイロードが、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の頑強なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性にとって必要かつ十分であることを示唆する。
実施例１５： ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株におけるシグナル伝達を調節する抗ＦＧＦＲ抗体およびＡＤＣの評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ抗体およびコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ抗体の、ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株におけるＦＧＦＲシグナル伝達を調節する能力を評価した。初期研究では、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１３１）細胞における１０１６４（ＦＧＦＲ２特異的）、１２４３３（ＦＧＦＲ２特異的）、１２４２５（ＦＧＦＲ２/４交差反応性）および関連ＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの効果を決定した。簡潔に述べると、細胞をＣｅｌｌＢｉｎｄ（商標）１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ＃３３３６）において１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中に播種して、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。実験の当日に、細胞培養培地を吸引して、試験抗体または小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８のいずれかで置き換えて、全てを、（１３〜１３０ｎＭ、抗体／ＡＤＣ、５００ｎＭ、ＢＧＪ３９８）の最終濃度で、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で希釈した。次に、細胞を組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で２時間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄して、氷上に置いて、ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃０４ ９０６２３７００１）とともに溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃９８０３）３００μｌを添加した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ＃２３２２８）により決定した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。続いて、タンパク質６０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させて、ニトロセルロース膜上へ転写して、ｐＦＲＳ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃３８６４）、総ＦＧＦＲ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃８６５２）およびβ−アクチン（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ３００−４８５Ａ）またはサイトケラチン（Ｄａｋｏ、Ｃａｔ＃Ｍ３５１５）に対する抗体でプローブした。結果を図１２（Ａ）に示し、コンジュゲートされてないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとしてのいずれの抗体も、２時間でｐＦＲＳ２シグナルを調節することが不可能であることがわかった。１２４２５抗体４．３ｎＭおよび１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣ（４．３ｎＭ抗体、１３ｎＭ ＤＭ１等価体）を用いてさらなる実験を行い、ここではさらなる時点（４時間、２４時間および７２時間）を評価した。結果を図１２（Ｂ）に示す。類似したデータが、ＲＨ４横紋筋肉腫細胞型細胞株でも得られた。
実施例１６： ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株における抗ＦＧＦＲ抗体およびＡＤＣの抗増殖効果の評価
上述の実施例９で用いられるのと類似した方法論を使用して、コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ抗体の、ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株パネルの増殖を阻害する能力を評価した。
ＦＧＦＲ４に対するその交差反応性と一致して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＦＧＦＲ４の構成的に活性な突然変異形態を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞の成長の強力な阻害剤であった（Roidl et al., 2010, Oncogene, 29, 1543-1552）。ＦＧＦＲ４発現は、抗ＦＧＦＲ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃３２４３０６、図１３（Ａ））を使用したＦＡＣＳ解析により確認された。１２４２５は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３においてだけではなく、他のＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株でも、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体に対して類似した結合特性を示した（データは示していない）。コンジュゲートされていない１２４２５抗体は、不活性であったため、この効果は、ＡＤＣに特異的であった（図１３（Ａ））。さらに、ＦＧＦＲ２特異的抗体（１０１６４）またはＡＤＣ（１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１）の投与後に、活性は観察されず、効果がＦＧＦＲ４発現により駆動されることを示唆した（図１３（Ａ））。これは、ＦＡＣにより評価されるように、これらの細胞上での検出可能なＦＧＦＲ２発現の欠如と一致している（データは示していない）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２４２５の類似した効果はまた、ＦＧＦＲ４過剰発現性横紋筋肉腫細胞株ＲＨ４（図１３（Ｂ））およびＪＲ（図１３（Ｃ））でも観察された。さらなる細胞株に拡張されると、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性は、ＦＧＦＲ４過剰発現性胸部および横紋筋肉腫細胞株のサブセットで観察された（図１３（Ｄ））。
実施例１７： ＦＧＦＲ４過剰発現性腫瘍におけるＦＧＦＲ ＡＤＣおよびコンジュゲートされていない抗体のｉｎ ｖｉｖｏＰＫ−ＰＤ
ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植片モデルにおけるＰＤ調節を評価するために、雌ＮＳＧマウスを利用した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウスに、９０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん３００〜５００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかを受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた対照マウスに対して、投与の９６時間後に核ｐＨＨ３陽性の顕著な増加をもたらした（代表的な画像を図１４（Ａ）に示す）。
ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植片モデルにおけるＰＤ調節の時間的経過を評価するために、雌ＮＳＧマウスを利用した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウスに、９０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×１０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１群当たり３匹のマウスを、処置投与の２４、４８、７２、９６および１６８時間後に収集した）またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）のいずれかを受けさせた。腫瘍体積は、無作為時に３００〜５００ｍｍ３の範囲であった。メイタンシノイドペイロードの予測される作用機序と一致して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＰＢＳ処置対照に対して、投与のおよそ７２〜９６時間後にピークに達する核ｐＨＨ３陽性の顕著な時間依存的増加をもたらした。切断されたカスパーゼ３免疫反応性におけるピークは、投与のおよそ９６〜１６８時間後に見られた。代表的な画像を図１４（Ｂ）に示す。
ＲＨ４細胞株を含む胞巣状横紋筋肉腫の一部は、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａトランスロケーションを保有し、これらは、ＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の上昇をもたらす。ＲＨ４異種移植片モデルにおけるＰＤ調節を評価するために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん５００〜７００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）のいずれかを受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた対照マウスに対して、投与の９６時間後に核ｐＨＨ３陽性の顕著な増加をもたらした（代表的な画像を図１４（Ｃ）に示す）。これらの見解は、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、このＦＧＦＲ４陽性異種移植片モデルにおいてＧ２／Ｍ細胞周期停止を引き起こすことを実証している。
実施例１８： ＦＧＦＲ４過剰発現性腫瘍における抗ＦＧＦＲ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活性を、ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳がん異種移植片モデルにおいて評価した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウスに、９０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×１０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積１９７．９ｍｍ３による移植の１２日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝５匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、コンジュゲートされていない１２４２５ ＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５、１０または１５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．投与した（図１５（Ａ））。対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、このモデルでは活性ではなかった。１５ｍｇ／ｋｇのネイキッドＩｇＧ １２４２５または５ｍｇ／ｋｇの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回投与は、投与の２９日後に類似した活性を示した（それぞれ、２５％および２４％Ｔ／Ｃ）。１０および１５ｍｇ／ｋｇの両方で投与した１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、腫瘍退縮をもたらした（それぞれ、７２％および９２％退縮）。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活性を、ＦＧＦＲ４陽性、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａ陽性ＲＨ４異種移植片モデルにおいて評価した。雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２００．８ｍｍ３による移植の１１日後に、研究に加えた（図１５（Ｂ））。５つの群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、コンジュゲートされていない１２４２５ ＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）、または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５、１０または１５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．投与した。対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、このモデルでは活性ではなかった。同様に、単回１５ｍｇ／ｋｇ用量のネイキッドＩｇＧ １２４２５は、限られた活性を示した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、５、１０および１５ｍｇ／ｋｇの単回用量として抗腫瘍活性を示した（それぞれ、３６％、２４％、２６％Ｔ／Ｃ）。これらの見解により、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａトランスロケーションが、ＲＨ４細胞株を１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に対して感受性とさせるのに十分なＦＧＦＲ４発現をもたらすことが確認される。したがって、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａトランスロケーション陽性横紋筋肉腫を有する患者を処置するのに使用することができた。
実施例１９： マウス、ラットおよびカニクイザルにおける抗ＦＧＦＲ４ ＡＤＣの薬物動態の評価
抗ＦＧＦＲ ＡＤＣの薬物動態（ＰＫ）を、１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲の幾つかの用量レベルで腫瘍保有および腫瘍非保有マウスで、１、５および４５ｍｇ／ｋｇでの腫瘍非保有ラットで、および３０ｍｇ／ｋｇでのカニクイザルで評価した。全ての研究において、「総」抗体および「抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」の両方の血清濃度は、確証されたＥＬＩＳＡ法を使用して全ての動物種で測定された。「総」分画は、コンジュゲートされたＤＭ１を伴うか、または伴わない抗体の測定を指すのに対して、ＡＤＣ分画は、ＤＭ１とコンジュゲートされた抗体のみの測定を指す（１つ以上のＤＭ１分子）。全ての研究において、感知可能な差は、ＡＤＣと総抗体分画とのクリアランス間で観察されなかった。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫを、３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後にＳＮＵ１６腫瘍保有マウスで研究した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、２４時間後、７２時間後、１６８時間後、および３３６時間後に収集し、総分画およびＡＤＣ分画の血清濃度は、この用量では重ねることができた（図１６（Ａ））。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の半減期は、ＳＮＵ１６異種移植片の存在下で約１．５日であった。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫを、１、５、１０または１５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後に腫瘍非保有マウスでも研究した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、６時間後、２４時間後、７２時間後、９６時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後および５４０時間後に収集した。総分画およびＡＤＣ分画の血清濃度は、この用量では重ねることができ（図１６（Ｂ））、ＰＫ特性は、腫瘍保有動物に対して、腫瘍非保有動物において類似しているようであった。
ＳＮＵ１６腫瘍保有マウスにおける１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫもまた決定した。これらのＡＤＣの全体的なＰＫプロファイルは、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルと類似しており、得られたデータを表１７に概要する。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫを、２つの用量レベル：ＩＶ投与された１および５ｍｇ／ｋｇで腫瘍非保有ラットで研究した。ＰＫ試料は、０．５時間、１時間、２時間、６時間、８時間で、また１日目、２日目、４日目、８日目、１１日目、１４日目、２１日目および３５日目に収集した。「総」および「ＡＤＣ」種に関する濃度−時間プロファイルは、両方の用量レベルでほぼ重ねることができた（図１６（Ｃ））。終末排せつ相は、１ｍｇ／ｋｇ用量群でわずかに急勾配であったが、これは、より後期の時点での標的媒介性薬物体内動態（drug disposition）（ＴＭＤ）の結果であり得る。同様に、総分画およびＡＤＣ分画に関するクリアランス値は、１ｍｇ／ｋｇ用量ではそれぞれ、０．７５７±０．０８８ｍＬ／ｈ／ｋｇおよび０．８１３±０．０４１ｍＬ／ｈ／ｋｇであった一方で、それぞれ、０．６２３±０．０２７ｍＬ／ｈ／ｋｇおよび０．６０７±０．０１９ｍＬ／ｈ／ｋｇのわずかに低い値が、５ｍｇ／ｋｇ用量で認められた。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣ種は、５ｍｇ／ｋｇ用量レベルで、およそ３．９日の終末半減期を有する。さらなる研究では、ラットＰＫはまた、５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇ用量レベルで決定した。５ｍｇ／ｋｇ用量での半減期は上述の値に類似していたのに対して、４５ｍｇ／ｋｇ用量では、半減期は、それぞれ、総分画およびＡＤＣ分画に関して１６３．９ｈ、１２１．３ｈ（およそ５日）であり、これらの値は、非ＦＧＦＲ２／４交差反応性対照ＡＤＣに関する観察と類似しており、任意の考え得るＴＭＤクリアランス経路の飽和を示唆した。
１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫもまた、類似した研究で決定され、得られたＰＫパラメーターを表１８に示す。用いた用量レベルでは、総およびＡＤＣの半減期およびクリアランスの類似した推定値が、試験した３つのＡＤＣ全てに関して得られることがわかった。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫを、３匹のカニクイザル（雄１匹、雌２匹）の群への単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ用量の投与後に研究した。血清試料は、１日目に投与０時間（投薬前）に、および０．２５時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、１６８時間および２４０時間後に収集した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１への最大曝露は、ＩＶ注射直後、即ち０．２５時間に観察され、これは、第１のサンプリング時点であった。時間的経過は、長期排せつ相により特徴付けられ、総分画およびＡＤＣ分画に関するプロファイルは、サンプリングの時間的経過にわたって重ねることができた（図１６（Ｄ））。終末半減期は、およそ６〜７日であった。
１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＰＫもまた、３匹のカニクイザルの群への単回３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ用量の投与後に研究した。この試薬に関する時間的経過はまた、長期排せつ相（終末半減期６〜７日）により特徴付けられ、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の両方のＰＫパラメーターを表１９に示す。
実施例２０： ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの配列修飾された抗ＦＧＦＲ抗体およびＡＤＣの活性の評価
潜在的な構造の傾向（liabilities）が、最終的なタンパク質の不均一性に影響を及ぼし得て、また例えば抗体製造可能性および免疫原性に影響を与え得る治療用抗体の配列に存在し得ることが理解される。かかる傾向は、グリコシル化部位、不対システイン、潜在的な脱アミド部位等を含み得る。かかる潜在的な傾向の危険性を低減するために、突然変異を導入して、これらの傾向の１つまたは複数を除去し得る。例えば、潜在的な脱アミド化部位は、単独で、または他の構造変化と併せて、置き換えることができる。潜在的な脱アミド部位の例としては、１０１６４および１２４２５の重鎖ＣＤＲ２におけるＤＧが挙げられる（表１を参照）。これらの残基を他の適切なアミノ酸に突然変異させることができる。非限定的な例として、１０１６４ ＨＣＤＲ２中のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）またはスレオニン（Ｔ）に突然変異させることができる。１２４２５では、ＨＣＤＲ２ グリシン（Ｇ）を、アラニン（Ａ）のような別のアミノ酸に突然変異させることができる。
また、抗体が、アミノ酸レベルで各々の生殖系列配列と異なる場合、抗体は、その生殖系列配列に突然変異し戻される（mutated back）ことができることが理解されるべきである。かかる補正突然変異は、１つまたは複数の位置で行われることができ、標準的な分子生物学技法を使用して、または遺伝子合成により生成され得る。非限定的な例として、１２４２５重鎖の重鎖配列（配列番号９、表１を参照）は、１位でＥからＱにより、相当する生殖系列配列とは異なり、軽鎖（配列番号１７）は、８５位でＶに代わるＴにより、相当する生殖系列とは異なる。したがって、１２４２５中のアミノ酸は、これらの部位のいずれかまたは全てで修飾され得る。
この出願で記載される抗体薬物コンジュゲートを生成するのに用いられる化学は、抗体配列におけるリシン（Ｋ）残基へのコンジュゲーションに依存する。これらのリシン残基が、エピトープ認識に関与される領域内に、例えばＣＤＲ領域に存在する場合、かなりコンジュゲーションがこれらの部位で行われる場合には、抗体薬物コンジュゲートの、その所定の標的に結合する能力を変更させ得る。この潜在的な危険性を軽減するために、かかるリシン残基を、アルギニン、アスパラギンまたはグルタミンのような代替的な適切なアミノ酸に突然変異させることができる。１つのリシンが、１２４２５の重鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の両方に存在する。これらのリシンのいずれか１つまたは複数が、アルギニン、アスパラギンまたはグルタミンのような代替的な残基に突然変異され得る。
上述の変化の幾つかを１２４２５抗体へ導入して、抗体２０５６２を生じた（表１）。この抗体は、ＦＧＦＲ２に結合するその能力、ＳＮＵ１６のようなＦＧＦＲ２増幅細胞株の増殖を阻害して、ｉｎ ｖｉｖｏでＳＮＵ１６細胞に対して抗腫瘍効果を引き起こすその能力に関して、１２４２５と比較した。ヒトＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ４に対する２０５６２の親和性は、類似したアッセイ条件下で１２４２５の親和性と類似していることがわかった（２０５６２ ＦＧＦＲ２ ＩＩＩｂ親和性推定値：９ｎＭ、ヒトＦＧＦＲ４親和性推定値：３．３ｎＭ）。実施例６に記載する方法論を用いて、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１と類似して、２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＮＵ１６細胞の増殖の強力な阻害剤であった（図１７（Ａ））。ｉｎ ｖｉｖｏでの２０４３７−ＭＣＣ−ＤＭ１の効力を評価するために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２１７．１ｍｍ３による移植の７日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスはＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した（図１７（Ｂ））。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびその変異体２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１はともに、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移植片に対してｉｎ ｖｉｖｏで類似した活性を有した。これらのデータは、ＡＤＣとしてｉｎ ｖｉｖｏ活性に影響を与えることなく、親抗体のＤＧ部位を除去することが可能であることを示唆している。
実施例２１： 親和性成熟ＦＧＦＲ ＡＤＣの生成および特徴付け
選択された抗ＦＧＦＲ抗体の生物学的活性に対する親和性の影響を評価するために、親和性の最適化を、１２４３３、１０１６４および１２４２５クローンで実施した。これらの研究では、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域が、トリヌクレオチド定方向突然変異誘発を使用したカセット突然変異誘発により並行して最適化された（Virnekas et al., 1994 Nucleic Acids Research 22: 5600-5607）一方で、フレームワーク領域が一定に保たれた。親和性成熟に関するクローニングに先立って、親Ｆａｂ断片は、相当する発現ベクターｐＭ（登録商標）ｘ１１から、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介して、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０へ移行させた。
親Ｆａｂ断片のＬ−ＣＤＲ３を最適化するために、結合剤のＬ−ＣＤＲ３を除去して、多様化されたＬ−ＣＤＲ３のレパートリーで置き換えた。各親Ｆａｂに関して、多様化されたＨ−ＣＤＲ２とともに設定された第２のライブラリーを生成した。各成熟ライブラリー（ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２）に関して、抗体ディスプレイングファージを調製して、ファージ力価をスポット滴定により決定した。ライブラリーの増幅は、他の箇所に記載するように実施した（Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem 278: 38194-38205）。品質管理のため、単一クローンを無作為に採取して、配列決定した。
親和性が改善された結合剤の選択のため、成熟ライブラリーに由来するファージは、ビオチン化ヒトＦＧＦＲ２を使用して、３ラウンドの溶液パニングに付された。ストリンジェンシーは、各パニングラウンドにおける抗原濃度を低減させることにより増大した（Low et al., 1996 J Mol Biol 260(3): 359-368）。抗原の低減に加えて、オフ速度選択（Hawkins et al., 1992 J Mol Biol 226: 889-896）を実施した。これは、ＲＴでの長期にわたる洗浄ステップと組み合わせた。一般的なパニング手順は、上述するように実施された（溶液パニング）。
選択されるサブコードに関して、実施されたＨ−ＣＤＲ２親和性成熟パニングの第２ラウンドのパニングアウトプットは、Ｌ−ＣＤＲ３でさらに多様化させた。ライブラリー生成は、上述するように正確に行われた。改善された結合剤の選択のため、新たな生成ライブラリーをさらなる２ラウンドの溶液パニングに付した。
同定された配列特有のクローンを、ＩｇＧと表し、ヒトＦＧＦＲ２に対する親和性を、実施例１および実施例２に記載する方法論に類似したＳＥＴまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）のいずれかの方法論を使用して決定した。３つの親抗体からの８０個を上回るクローンを評価して、１２４３３抗体に由来するクローンに関しては３〜６倍、１０１６４由来のクローンに関しては２７倍、および１２４２５由来の抗体に関しては６８倍の親和性改善が得られた。１０１６４に由来する最高の親和性クローンを２０８０９と称し、ヒトＦＧＦＲ２に対するその親和性は、４５０ｐＭであると決定された。興味深いことに、この抗体はまた、７．４ｎＭの親和性推定値でヒトＦＧＦＲ４にも結合した。１２４２５に由来する最高の親和性抗体を２０８１１と称し（表１）、ヒトＦＧＦＲ２に対するその親和性は、１１０ｐＭであると決定された。ＦＧＦＲ４に対するこの抗体の親和性は、７５ｐＭであると決定された。
さらなる研究において、２０９０８および２０８１１の両方を、ＳＭＣＣ−ＤＭ１に直接コンジュゲートして、２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１および２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１を生じた。これらのＡＤＣの、ＳＮＵ１６の成長を阻害する能力を図１８（Ａ）に示す。ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性に対する親和性の影響を、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移植片モデルで評価した。雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２１７．６ｍｍ３による移植の７日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスはＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１または２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した（図１８（Ｂ））。１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびその親和性成熟変異体２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＳＮＵ１６異種移植片に対して類似した活性を示した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、抗腫瘍活性に関してその親和性成熟変異体２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１を上回る優位性を示した。これらのデータは、親和性成熟がＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣとしてｉｎ ｖｉｖｏで改善された活性をもたらさなかったことを示唆している。
実施例２２： 重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）によるＦＧＦＲ２およびその抗体複合体のエピトープマッピング
重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）は、タンパク質のアミド骨格への重水素取込みを測定するものである。これらの測定値は、アミドの溶媒接近性および骨格アミドの水素結合ネットワークの変化に対して高感度である。ＨＤｘ−ＭＳは、アポおよびリガンド結合などの２つの異なる状態のタンパク質を比較するために使用されることが多く、ペプシンによる迅速な消化とカップリングする。そのような実験において、当業者であれば、２つの異なる状態間で異なる重水素取込みを示す領域、典型的には、１０〜１５アミノ酸を見つけることができる。保護される領域は、リガンド結合に直接関与するか、またはリガンドの結合によりアロステリックに影響される。
これらの実験では、Ｅ．コリ（E. Coli）由来のＦＧＦＲ２ Ｄ２−Ｄ３タンパク質（配列番号１３５、以下を参照）の重水素取込みは、３つの治療用抗体：１２４２５、１０１６４および１２４３３の非存在および存在下で測定された。抗体の結合時に重水素取込みの低下を示すＦＧＦＲ２中の領域はエピトープ中に含まれる可能性が高いが、測定の性質のため、直接的な結合部位から遠い変化を検出することも可能である（アロステリック効果）。通常、最も多い量の保護を有する領域は、直接結合に関与するが、これは常に当てはまるわけではない。アロステリック効果に由来する直接結合事象を解明するためには、直交測定（例えば、Ｘ線結晶分析、アラニン突然変異誘発）が必要である。
この実施例に記載するエピトープマッピング実験は、Ｗａｔｅｒｓ ＨＤｘ−ＭＳプラットフォームで実施され、これは、ＬＥＡＰオートサンプラー、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＳｙｓｔｅｍおよびＳｙｎａｐｔ Ｇ２質量分析計を含む。研究は、ＬｅａｐＳｈｅｌｌソフトウェアにより作動されるＬＥＡＰオートサンプラーにより自動化され、これは、重水素交換反応の開始、反応時間管理、クエンチ反応、ＵＰＬＣシステムへの注入および消化時間管理を実施した。Ｌｅａｐオートサンプラーは、ＨＤｘ反応のために２５℃で維持され、またそれぞれタンパク質およびクエンチ溶液の保管用に２℃に維持された２つの温度管理スタックを装備していた。三重反復対照実験を、重水素交換時間２５分で抗原に対して実施した。ＨＤＸは、クエンチング緩衝液（６Ｍ尿素および１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ＝２．５）でクエンチした。クエンチした後、抗原を、それが、オンラインペプシン消化に付されるＵＰＬＣシステムに１２℃で注入して、続いて流速４０μＬ／分でＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８ １×１００ｍｍカラム（１℃で維持される）にわたる迅速な８分で２％から３５％へのアセトニトリル勾配に付した。三重反復実験は、まさに対照実験として抗原−ｍＡｂ複合体に対して実施されたが、但し、これらの実験では、抗原は、重水素交換に先立って２５℃で抗体とともに３０分間インキュベートされた。
これらの測定の結果を図１９（Ａ）および図１９（Ｂ）に概要する。図１９（Ａ）では、ｍＡｂの非存在（対照）下および存在下でのＦＧＦＲ２ペプチドに関する平均重水素取込みが示される。この図では、２つの差：対照とｍＡｂとの差、およびｍＡｂ群間での差を検討することが有用である。図１９（Ｂ）では、ｍＡｂと対照試料との間の重水素取込みにおける差が、測定中の標準誤差で除算される。差は、それらが絶対スケールで０．５Ｄａを上回る場合に（図１９（Ａ））、および標準誤差により除算された差の比が、−３．０未満またはそれに等しい場合に（図１９（Ｂ））有意であるとみなされる。この解析から、本発明者らは、ｍＡｂ結合時に保護されるＦＧＦ２の領域を、高、中および低量の保護のカテゴリーに順位付けすることができる。高い保護のＦＧＦＲ２領域は、特異的な抗体とのエピトープの形成に潜在的に関与するが、より低い保護領域に関して他の寄与を除外することはできない。
ＦＧＦＲ２への１０１６４の結合時に、ＦＧＦＲ２の下記の２つの領域：配列番号１３７の残基１７４〜１８９および１９８〜２１６における高量の保護が観察される。これらの領域は、特異的にβＣのＮ末端に対するβＢ、およびβＥに対するβＣ’ループからなるＤ２ドメインに位置する（図１９（Ｃ）および（Ｄ））。領域２２２〜２３１に見出される低保護の１つの領域が存在する。しかしながら、この領域は、全ての研究抗体の結合時に保護され、この観察は、この領域が、本質的に非特異的およびアロスティックであり得るその局所水素結合ネットワークの安定化を受けることを示唆している。ＦＧＦＲ２に対する抗体１２４２５の結合はまた、配列番号１３７の残基１７４〜１８９および１９８〜２１６の領域で高量の保護を引き起こす。さらに、１２４２５ファミリーを用いる場合、配列番号１３７の残基１６０〜１７３（図１９（Ａ）および（Ｂ））の領域での高量の保護も観察された。これらの領域は、公開された結晶学データからＦＧＦ２およびＦＧＦ１と相互作用することが知られているＦＧＦＲ２の領域を含む（Plotnikov et al., M. Cell 2000, 101, 413-424、Beenken et. al., M. J. Biol. Chem. 2012, 287, 3067-3078）。この領域の保護は、１２４２５ファミリーの抗体に特有である。研究される抗体のうち、１２４３３は、ＦＧＦＲ２のＤ３ドメインとの相互作用を通じてＦＧＦＲ２のＩＩＩｂアイソフォームを特異的に標的とする点で特有である。１２４３３に関して、ペプチド３３８〜３５４における高量の保護（およそ２Ｄａ）および３３８〜３４５由来のより短いＮ末端断片におけるわずかな量の保護が観察された。この観察は、１２４３３結合時に保護される３３８〜３５４ペプチドの一部が、領域３４６〜３５４であることを示唆している（図１９（Ａ）および図１９（Ｂ））。領域３４６〜３５４は、ＩＩＩｃアイソフォームに対してＩＩＩｂアイソフォームに特異的である４つの残基を含有し、これらの残基は、Ｑ３４８、Ａ３４９、Ｎ３５０およびＱ３５１を含む。さらなる研究において、１０１６４および１２４２５の親和性成熟バージョン（以下の実施例２３を参照）を評価して、観察される保護領域の観点で、それらの各々の親抗体に類似していることがわかった。
さらに、類似した方法を使用して、ＦＧＦＲ２／４交差反応抗体１２４２５の存在下でＦＧＦＲ４の保護を検査する重水素交換研究を実施した。ＦＧＦＲ４ Ｄ１〜Ｄ３構築物（配列番号１２４、以下を参照）を使用した予備解析により、１２４２５の結合が、Ｄ３領域ではいかなる保護も引き起こさないことが示唆された。保護は、Ｄ１およびＤ２ドメイン内の領域に限定されるようである。
実施例２３： ヒトＦＧＦＲ２／１２４２５ＦａｂおよびＦＧＦＲ４／１２４２５Ｆａｂ複合体のＸ線結晶学的構造決定
１２４２５のＦａｂ断片（表２２）に結合されたヒトＦＧＦＲ２ ＥＣＤ断片（ＦＧＦＲ２ドメイン２またはＦＧＦＲ２ Ｄ２、配列番号１３８、表２２）またはヒトＦＧＦＲ４ ＥＣＤ断片（ＦＧＦＲ４ドメイン２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２、配列番号１４３、表２２）の結晶構造が決定される。以下に詳述するように、ＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２が発現されて、精製されて、１２４２５Ｆａｂと混合されて、複合体を形成した。続いて、タンパク質結晶学を用いて、１２４２５Ｆａｂに結合されたＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２に関する原子分解能データを作成して、エピトープを規定した。ＦＧＦＲ２の結晶学的エピトープは、重要なエピトープ残基を突然変異させること、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて１２４２５への突然変異ＦＧＦＲ２の結合を測定することにより、さらに確証された。
結晶学およびＳＰＲ用のタンパク質生産
結晶学およびＳＰＲ用に生産されるタンパク質の配列を表２２に示す。ＦＧＦＲ２ Ｄ２の構築物は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およびＣ末端残基（小文字で示される、配列番号１３７）とともに、ヒトＦＧＦＲ２（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ２１８０２−３、配列番号１３７）の残基１４６〜２４９（下線を付した）を含む。ＦＧＦＲ４ Ｄ２（配列番号１４３）の構築物は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およびＣ末端残基（小文字で示される）とともに、ヒトＦＧＦＲ４（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ２２４５５−１、配列番号１４２）の残基１４０〜２４２（下線を付した）を含む。ＦＧＦＲ２ドメイン２〜ドメイン３（Ｄ２Ｄ３）の構築物は、残基１４０〜３６９（配列番号１３７ではイタリック体）を含む。ＦＧＦＲ２ Ｄ２Ｄ３の野生型（ＷＴ）およびＫ１７６Ａ／Ｒ２０１Ａ二重突然変異バージョンはともに、ＳＰＲによるエピトープ確証用に生産される（それぞれ、配列番号１４４および配列番号１４５、小文字は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およびＣ末端残基である）。１２４２５Ｆａｂに関して、重鎖および軽鎖の配列が示される（それぞれ、配列番号１３９および配列番号１４０）。
ＦＧＦＲ Ｄ２は、Ｅ．コリ（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮｏｖａｇｅｎＲ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発現された。１８℃でのＩＰＴＧによる一晩の誘導後に、細胞を収集して、−８０℃で凍結させて、溶解させた。封入体を２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび８Ｍ尿素で抽出して、同じ緩衝液中で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム上にのせた。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭイミダゾールで洗浄した後、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アンモニウムおよび３００ｍＭイミダゾールで溶出させた。続いて、溶出タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で１２倍希釈して、緩衝液Ａ＋２％の２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）中で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｓ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。Ｓカラムは、緩衝液Ａ＋２％〜１００％緩衝液Ｂの勾配により溶出した。ＦＧＦＲ２ Ｄ２を含有する主要ピークを収集して、濃縮して、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いて１２４２５Ｆａｂと複合体を形成するためにプールした。
ＦＧＦＲ４ Ｄ２は、Ｅ．コリ（E.coli）株Ｓｈｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓＲ）で発現された。１８℃でのＩＰＴＧによる一晩の誘導後に、細胞を収集して、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））および溶解緩衝液５０ｍｌにつき１錠剤のｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））中に溶解させた。溶解は、１５，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離により清澄化されて、次に、ＴａｌｏｎＲ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を、バッチ結合のために４℃で一晩、上清に添加した。翌日、樹脂をカラムに充填して、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールで洗浄して、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールで溶出させた。続いて、溶出タンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５（緩衝液Ｃ）で１２倍希釈して、緩衝液Ｃ＋２％の５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ（緩衝液Ｄ）中で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｓ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。Ｓカラムは、緩衝液Ｃ＋２％〜１００％緩衝液Ｄの勾配により溶出した。ＦＧＦＲ４ Ｄ２を含有する主要ピークを収集して、濃縮して、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いて１２４２５Ｆａｂと複合体を形成するためにプールした。
１２４２５Ｆａｂは、固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）による完全長１２４２５ ＩｇＧの切断により生産される。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０および１０ｍＭ ＥＤＴＡ中の２０ｍｇ／ｍｌでの１２４２５ ＩｇＧを、８０：１の重量比で固定化パパインと混合した。混合物を１５ｍｌのチューブ中で３７℃で一晩回転させた。翌日、固定化パパインを、重力流カラムにより除去して、ＦａｂおよびＦｃセグメントの両方を含有するフロースルーを収集して、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせて、Ｆｃセグメントを除去した。Ｆａｂ断片のみを含有するこのステップからのフロースルーを濃縮して、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いてＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２と複合体を形成するためにプールした。
ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５およびＦＧＦＲ４ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体の結晶化および構造決定
ＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２と１２４２５ Ｆａｂとの複合体は、ＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２を１２４２５ Ｆａｂと２：１のモル比（ＬＣＵＶによって測定された濃度）を混合すること、氷上で３０分間インキュベートすること、および２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で複合体を精製することにより調製された。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析した。
ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体を結晶化するために、複合体を含有する分画をプールして、約３０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。トリプシン（１ｍＭ ＨＣｌおよび２ｍＭ ＣａＣｌ２中に溶解、１ｍｇ／ｍｌでの）を、１：１００の容量比で複合体へ添加して、結晶化を促進した（Wernimont et al., (2009) Plos One 4:e5095）。ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ／トリプシン混合物を即座に遠心分離して、結晶化に関してスクリーニングした。
結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散により成長させた。詳細には、タンパク質０．１μｌを、０．１Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物ｐＨ５．０、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００を含有するリザーバ溶液０．１μｌと混合して、ドロップを同じリザーバ溶液４５μｌに対して４℃で平衡化した。
ＦＧＦＲ４ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体を結晶化するために、複合体を含有するサイズ排除分画をプールして、２０ｍｇ／ｍｌに濃縮して、遠心分離して、結晶化に関してスクリーニングした。結晶は、ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体と同じ方法（上述する）で成長させたが、但し、リザーバ溶液は、０．２Ｍギ酸マグネシウム、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含有し、結晶は２０℃で成長させた。
データ収集前に、ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ ＦａｂおよびＦＧＦＲ４ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ結晶の両方を、さらなる２２．５％グリセロールを含有するリザーバ溶液に移して、液体窒素中で急冷した（flash cooled）。回折データは、先端放射光施設（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）にあるビームライン１７−ＩＤで収集した。データを加工処理して、ＨＫＬ２０００（ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して２．８Åで縮尺した。構造はともに、ＦＧＦＲ２ Ｄ２構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＤＡＲ）および検索モデルとしての組織内Ｆａｂ構造を用いたＰｈａｓｅｒ（McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674)を使用した分子置換により解析した。最終的なモデルがＣＯＯＴで構築され（Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132）、Ｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）で改良した。１２４２５ Ｆａｂ中で任意の原子の５Å以内に原子を含有するＦＧＦＲ２ Ｄ２またはＦＧＦＲ４ Ｄ２の残基は、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）により同定され、表２３および表２４に列挙される。
ＦＧＦＲ２の突然変異誘発およびＳＰＲアッセイ
ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＲ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、Ｋ１７６Ａ／Ｒ２１０Ａ二重突然変異をＦＧＦＲ２ Ｄ２Ｄ３構築物に導入した。ＷＴおよび突然変異ＦＧＦＲ２ Ｄ２Ｄ３タンパク質は、ＦＧＦＲ４ Ｄ２タンパク質に関するのと同じ手順を使用して生産した。
ＳＰＲアッセイで使用される試薬に関して、親和性純粋なＦ（ａｂ）’断片抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片（１０９−００６−０９８）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。センサーチップＣＭ５（ＢＲ−１００６−０６８）、グリシンｐＨ２．０（ＢＲ−１００３−５５）およびＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＢＲ−１００６−６９）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅに発注した。ＢＳＡは、Ｇｉｂｃｏｒ（登録商標）（１５２６０）からのものであり、ヘパリンは、ＳｉｇｍａＲ（Ｈ３１４９−１００ＫＵ）からのものである。
ＳＰＲ研究は全て、評価ソフトウェアバージョン１．１およびＣＭ５センサーチップを用いてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を使用して実施した。０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを有するＨＢＳ−ＥＰ＋を、全ての実験に関して実行緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用は、応答単位（ＲＵ）により測定された。パイロット実験を実施して、抗ヒトＦｃ抗体の固定化、続く１２４２５ ＩｇＧの捕捉の実現可能性を試験および確認した。
１２４２５動態測定に関して、抗体をチップ上に捕捉して、続いてＷＴまたは突然変異ＦＧＦＲ２ Ｄ２Ｄ３タンパク質を流した。簡潔に述べると、ｐＨ４．７５での５０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体は、４つ全てのフローセルで１０μｌ／分の流速でアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定化されて、６０００ＲＵに達した。３μｇ／ｍｌの１２４２５を、試験フローセル上に１０μｌ／分で１０秒間注入した。０．０７８〜１００ｎＭの２倍希釈のＦＧＦＲ２ Ｄ２Ｄ３タンパク質を、全ての参照フローセルおよび試験フローセル上に８０μｌ／分で７分間注入した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋＋ＢＳＡ＋ヘパリン緩衝液を１０分間流して、結合性１２４２５を解離させた。各注入サイクル後、チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて、６０μｌ／分で７０秒間再生させた。全ての動態測定は、２５℃で行った。
１２４２５に関するＦＧＦＲ２エピトープ
ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、１２４２５に関するＦＧＦＲ２エピトープを同定した。結晶の非対称ユニットにおいてＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体の６つのコピーが存在する（非対称ユニットは、結晶全体を再現するのに必要とされる全ての構造情報を含有する）。６つ全てのコピーは、結晶充填に起因する小さな変動を除いて、１２４２５ Ｆａｂと接触したほぼ同一の残基を共有する。６つ全てのコピーにより共有される１２４２５接触ＦＧＦＲ２残基のみを使用して、エピトープを規定した。
１２４２５ ＦａｂによるＦＧＦＲ２ Ｄ２上の相互作用表面は、表２３および表２４に詳述されるように、幾つかの不連続（即ち、非隣接）配列：即ち残基１７３〜１７６、残基１７８、残基２０８〜残基２１０、および残基２１２、２１３、２１７および２１９により形成される。これらの残基は、１２４２５ Ｆａｂにより結合される３次元表面を形成する（図２０（Ａ））。結晶学により規定されるこのエピトープは、残基１６０〜１７３、１７４〜１８９および１９８〜２１６を含む重水素置換質量分析法（ＨＤｘ−ＭＳ）により規定されるものと十分に一致している。
ＦＧＦＲ２ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ構造から、ＦＧＦＲ２上の潜在的なＮ−連結されたグリコシル化部位、即ち、Ａｓｎ２４１およびＡｓｎ２８８（Duchesne et al., (2006) J. Biol. Chem 281:27178-27189）は、１２４２５エピトープから離れてタンパク質の反対表面上に存在し（図２０（Ａ））、ＦＧＦＲ２への１２４２５結合が、グリコシル化とは無関係であることを示す。このことは、１２４２５抗体が、類似した親和性でＥ．コリ（E.coli）生産（グリコシル化なし）および哺乳動物細胞生産（グリコシル化）ＦＧＦＲ Ｄ２−Ｄ３に結合する（データは示していない）という見解に一致している。
ＦＧＦＲ Ｄ２のＬｙｓ１７６およびＡｒｇ２１０は、それぞれ、１２４２５ Ｆａｂ軽鎖および重鎖と最も多く接触させる２つのエピトープ残基である。興味深いことに、Ａｒｇ２１０は、ヘパリンに結合することが実証されており（Pellegrini et al., (2000) Nature 407:1029-1034）、これは、ＦＧＦへのＦＧＦＲ２結合、続く二量体化およびシグナル伝達を高めることができる。それと同時に、Ｌｙｓ１７６はまた、ヘパリン結合ポケットに存在すると想定される（Pellegrini et al., (2000) Nature 407:1029-1034）。これらの２つの残基のアラニンへの突然変異は、ＳＰＲアッセイにおいて１２４２５ ＩｇＧへのＦＧＦＲ２の結合を完全に消失させ（ＳＰＲ法に関しては上記を参照）、これにより、１２４２５に結合する際のそれらの重要な役割が確認され、結晶構造で観察されるエピトープが確証された。
１２４２５に関するＦＧＦＲ４エピトープ
ＦＧＦＲ４ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、１２４２５に関するＦＧＦＲ４エピトープを同定した。結晶の非対称ユニットにおいてＦＧＦＲ４ Ｄ２／１２４２５ Ｆａｂ複合体の４つのコピーが存在した。４つ全てのコピーは、結晶充填に起因する小さな変動を除いて、１２４２５ Ｆａｂと接触したほぼ同一の残基を共有する。４つ全てのコピーにより共有される１２４２５接触ＦＧＦＲ４残基のみを使用して、エピトープを規定した。
１２４２５ ＦａｂによるＦＧＦＲ４ Ｄ２上の相互作用表面は、表２５に詳述されるように、幾つかの不連続（即ち、非隣接）配列：即ち残基１５０〜１５１、１５４、１５７、１６０、１６６〜１６９、１７１、１７３〜１７４、２０１〜２０７、２１０および２１２により形成された。これらの残基は、１２４２５ Ｆａｂにより結合される３次元表面を形成する（図２０（Ｂ））。
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４上の１２４２５エピトープの比較
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４上の１２４２５エピトープは、配列およびコンホメーションの両方で非常に類似している。配列アラインメント（図２０（Ｃ））で示されるように、ＦＧＦＲ２上の全てのエピトープ残基（破線の四角内）は、ＦＧＦＲ４により共有され、ＦＧＦＲ４中に保存される。さらに、２つの複合体構造が、１２４２５の可変ドメイン上で重ね合わせることができる場合、２つの抗原の構造は非常に良好に重ね合わさり、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への１２４２５結合のコンホメーションが非常に類似していることを示す。このことは、両方の受容体に対する１２４２５の交差反応性に関する構造的説明を提供する。
１２４２５結合およびＦＧＦＲ二量体化
どのようにしてＦＧＦＲ−ＦＧＦ−ヘパリン複合体が細胞表面上で二量体化して、下流シグナル伝達を活性化するかに関して２つのモデル、即ち２：２：２モデル（ＦＧＦＲ：ＦＧＦ：ヘパリン）（Schlessinger et al., (2000) Mol. Cell 6:743-750）、および２：２：１モデル（ＦＧＦＲ：ＦＧＦ：ヘパリン）（Pellegrini et al., (2000) Nature 407:1029-1034）が報告されている。ＦＧＦＲ Ｄ２／１２４２５Ｆａｂ複合体の結晶構造に基づいて、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４への１２４２５の結合は、両方の二量体化モデルと調和せず、したがって両方の二量体化モデルを阻止することができた。
実施例２４： 製剤
ＡＤＣの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、５０ｍｇの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、１６．２ｍｇのコハク酸ナトリウム、４１０．８ｍｇのスクロースおよび１ｍｇのポリソルベート２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物（宣言された含量の離脱を可能にするために１０％の過充填を考慮しない）である。５ｍＬの注射用水で凍結乾燥物を再構成させた後、１０ｍｇ／ｍＬの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、２４０ｍＭのスクロースおよび０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０を含有する溶液が得られる。
その後の静脈内投与のために、得られた溶液を、通常、担体溶液中にさらに希釈して、輸注用のすぐに使えるＡＤＣ溶液にする。
ＣＳＦについては、予備安定性試験に基づいて、１０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度を選択した。等張性製剤を作出し、不定形の凍結乾燥ケーキ構造を維持し、タンパク質安定化を得るために、２４０ｍＭのスクロース濃度を選択した。
最も安定な製剤を選択するための重要な安定性指示分析方法は、特に、凝集レベルを決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー、肉眼では見ることができない粒子状物質の試験、遊離毒素の決定および効力試験を包含していた。
予備スクリーニング研究により、０．０２％の濃度のポリソルベート２０が機械的ストレスに対する十分な安定を提供することが示された。リアルタイムおよび加速安定性条件（２５℃および４０℃）での液体および凍結乾燥安定性研究により、ｐＨ５．０のコハク酸製剤が全体として最良の保存安定性を提供することが示された。最も顕著には、この製剤において、凝集と遊離毒素の放出との間の試験した全ての製剤の最良のバランスが満たされる。４０℃で３カ月後、分解生成物の特筆すべき増加を決定することはできなかった。
実施例２５： 腫瘍耐性メカニズムおよび併用療法の使用
既存の不均一性は、数多くのがんの一般的な特徴である。臨床的に有意な腫瘍（およびそれらに由来する細胞株）は、それらの初期発がん性事象から離れた多世代である。それらは、生存に関して一般的な遺伝子ドライバー病巣に必ずしも依存するとは限らない遺伝的に多様な部分集団（Nowell, Science 194: 23-28 (1976)）を獲得するのに十分な時間を有していた。これらの部分集団が、各患者において単一クローン腫瘍を処置するのではなく、継続的世代で一緒に扱われるのに十分に適合している場合、本発明者らは、事実上、複雑な集団を処置している。したがって、発がん遺伝子または腫瘍抑制因子の異なる増幅を伴うクローン集団の存在は、単一療法に対する感受性または耐性を説明することができ、標的とされる併用療法を必要とし得る。
ＦＧＦＲ２発現は、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６細胞およびＦＧＦＲ２増幅ヒト腫瘍において不均一である
ＦＧＦＲ２発現は、当技術分野で公知であり、かつ本明細書中に記載する方法を使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリーおよび／またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける蛍光により、ＳＮＵ１６細胞で測定した。親ＳＮＵ１６パラフィン包埋細胞ペレットのＩＨＣ染色は、広範囲のＦＧＦＲ染色強度を示した。さらに、培養物中で伝播されたＳＮＵ１６細胞上のＦＧＦＲ２表面発現もまた、フローサイトメトリーにより測定する場合に、ＦＧＦＲ２に関して広範囲の発現値を示した。興味深いことに、細胞集団がＥＧＦＲに関して同時染色された場合、ＥＧＦＲ陽性細胞の部分集団で存在するようであった。散乱されたＥＧＦＲ増幅細胞（５％未満）はまた、前処置細胞ブロック調製物中でＦＩＳＨにより明白であったが、集団がｑＰＣＲにより検査される場合には、ＥＧＦＲ増幅は、おそらく発現の低レベルに起因して、処置前の集団では検出することができなかった。
２９６個のヒト胃腫瘍が、ｑＰＣＲにより評価され、７個（２．４％）が、ＦＧＦＲ２コピー数の増加を有することがわかった（例えば、およそ４の遺伝子コピー数）。最高のＦＧＦＲ２コピー数を有する一連の試料からの９個の試料に対するＩＨＣ染色により、各試料が、ＦＧＦＲ２発現に関して、陽性である腫瘍領域、および陰性である領域を有することが明らかとなった。免疫反応性は、任意の特異的な腫瘍形態と相関しなかった。腫瘍試料が、連続切片上のマスクとしてＦＧＦＲ２免疫反応性を使用して顕微解剖された場合、これらのＦＧＦＲ２陽性および陰性領域からのＤＮＡは、９個全ての場合で、それぞれ、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅または非増幅と相関した。ＦＧＦＲ２の過剰発現および増幅の相関は、以下に示すようにディープシーケンシングにより確認された。
ＥＧＦＲは、ＢＧＪ３９８に耐性であるＳＮＵ１６細胞において過剰発現および増幅され、ＦＧＦＲ２発現および増幅は損失される
ＳＮＵ１６細胞（ＡＣＣＴ ＣＲＬ−５９７４）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ＃３０−２００１）を有する０．５μＭのＢＧＪ３９８中で培養して、続いてＢＧＪ３９８濃度を０．５μＭ〜１．０μＭ〜２．５μＭ〜５．０μＭへ増加させた。培地を変更して、新鮮なＢＧＪ３９８（５μＭ）を、１週に１度、６週間添加した。細胞を、回収細胞培養凍結培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）＃１２６４８−１０１）中で凍結させて、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ中で再構成した。続いて、耐性細胞株の解凍した継代を、１μＭ ＢＧＪ３９８選択のもとで維持した。ＢＧＪ３９８による選択のもと培養物中で保持されるＳＮＵ１６細胞は、それぞれ、感受性細胞から耐性細胞において、１．７ｎＭから２．４μＭまで増加するＩＣ５０で、最終的には成長阻害に対してあまり感受性ではなくなった。
ＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞のウェスタンブロット解析により、耐性細胞集団がＦＧＦＲ２の発現を損失しており、もはやｐ−ＦＲＳ２を通じてシグナル伝達していないことが示され、ＦＧＦＲ２シグナル伝達経路がもはや活性ではないことを示した。それどころか、耐性集団は、高レベルのＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲを発現し、細胞が代わってＥＧＦＲ経路を通じてシグナル伝達していることを示した。ＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞はまた、ｑＰＣＲにより測定される場合に、ＥＧＦＲ ＤＮＡコピー数の増加も示し、これは、前処置したＳＮＵ１６細胞と比較して、タンパク質発現の増加と相関する。ＢＧＪ３９８耐性細胞は、成長し続ける（但し、親（未処置）細胞株よりも遅い成長速度で、親ＳＮＵ１６細胞に関する３６時間と比較して１２５時間の倍加時間で）。
ＳＮＵ１６細胞におけるＢＧＪ３９８耐性の始まりは、ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブに対する後天的感受性をもたらす（図２１）。ＳＮＵ１６親およびＢＧＪ３９８耐性細胞に対して行われた細胞成長アッセイは、それぞれ１０μＭを上回って１６．７ｎＭまでのゲフィチニブＩＣ５０におけるシフトを示し、ＦＧＦＲ２からＥＧＦＲへの発がん遺伝子依存性の切換えを確認した。
本発明者らは、トランスフォーミング発がん遺伝子ＦＧＦＲ２で増幅される細胞株が、第２の発がん遺伝子ＥＧＦＲで増幅され、かつそれに依存する既存の細胞を含有することを示してきた。ＦＧＦＲ２増幅細胞株ＳＮＵ１６が、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤により圧力下に置かれた場合、１つの集団が排除され、部分集団が優性となった。本発明者らは、不均一な腫瘍が、標的療法のような選択圧下に置かれる場合に、部分集団の成長が好都合となり、臨床的耐性をもたらし得ると予測する。
ディープシーケンシングは、ヒト胃がん検体におけるさらなる発がん性病巣の既存を明らかにする
ＦＧＦＲ２を過剰発現する腫瘍領域およびＦＧＦＲ２過剰発現を伴わない腫瘍領域から採取した対での腫瘍試料の顕微解剖した領域のディープシーケンシングは、ＦＧＦＲ２増幅との相関を示した。ＦＧＦＲ２過剰発現を有する腫瘍領域は全て、コピー数におけるＦＧＦＲ２増幅（例えば、コピー数６〜１６）を示した一方で、ＦＧＦＲ２過剰発現を伴わない腫瘍領域は、ＦＧＦＲ２コピー数増幅を示さなかった。上述のＳＮＵ１６における見解と一致して、１つの腫瘍は、非ＦＧＦＲ２増幅領域においてのみＥＧＦＲ増幅を示した。ＥＧＦＲ増幅は、この検体ではｋｒａｓ増幅と同時発生であった。この観察は、ｋｒａｓ増幅が抗ＥＧＦＲ療法で処置したがんにおける耐性のメカニズムであることを示唆するこれまでの報告と一致している（Valtorta, et al., IJC (2013) 133:1259-1266; Misale, et al., Nature (2012) 486:532-538）。
他の腫瘍は、代替的な受容体チロシンキナーゼの増幅を示した。例えば、１つの腫瘍対は、ＦＧＦＲ２増幅領域およびＦＧＦＲ２非増幅領域の両方で増幅されるＨｅｒ２を有した一方で、さらなる腫瘍は、非ＦＧＦＲ２増幅領域においてのみ同定されるＩＧＦ１Ｒ増幅を有した。全ての腫瘍における領域は全て、ｐ５３において突然変異を有するようであった。幾つかのさらなる突然変異が同定されたが、試料セットにわたって首尾一貫しては見いだされなかった。初期に蔓延していない受容体チロシンキナーゼで増幅されたこれらの小さな既存集団は、標的療法（例えば、抗ＦＧＦＲ２療法）のような選択圧が印加される場合に、耐性細胞の供給源であり得る。
本発明者らはまた、ＦＧＦＲ２増幅を有する原発性ヒト腫瘍が、他のチロシンキナーゼの増幅を有する部分集団を含有すること、およびこの部分集団増幅が、場合によってはＦＧＦＲ２増幅を有さない腫瘍領域で起きることを実証してきた。他の研究（Snuderl, et al. (2011) Cancer Cell 20: 810-817）を連想して、全ての腫瘍領域はまた、一般的な突然変異、この場合ではｐ５３における突然変異を含有し、全体として腫瘍に関する共通母細胞（ancestor）を示唆した。
Ｈｅｒ２発現性腫瘍における耐性メカニズムとしてのＦＧＦＲ２
ＦＧＦＲ２の増幅は、ラパチニブによる処置後の乳がん細胞における耐性メカニズムとして提唱されており（Azuma, et al. (2011) Biochem Biophys Res Comm, 407:219-224）、ＦＧＦＲ２発現は、ラパチニブに対して乏しい応答を有する乳がん患者において過剰発現されるとみなされた。本発明者らは、ディープシーケンシングによりヒトＨｅｒ２増幅胃腫瘍試料が、ＦＧＦＲ２増幅細胞の既存の部分集団を有することを実証してきた（Deeds et al,. United States and Canadian Academy of Pathology, March 2014: Abstract no: 453290）。これにより、ＦＧＦＲ２増幅が、抗Ｈｅｒ２療法後に他のＨｅｒ２増幅腫瘍において耐性メカニズムを表し得ることが示唆される。したがって、ＦＧＦＲ２療法、例えば本明細書中に記載するＦＧＦＲ２抗体およびＡＤＣと組み合わせたＨｅｒ２療法の処置は、Ｈｅｒ２発現性がんおよび／またはＨｅｒ２耐性がんの処置に有用である。
これらのデータは、ＦＧＦＲ２療法、例えば本明細書中に記載するＦＧＦＲ２ ＡＤＣが、がんの処置に関して他のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて有用であり得ることを示唆した。さらに、本明細書中に記載するＦＧＦＲ２ ＡＤＣは、他のチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｍｅｔ阻害剤およびＩＧＦＲ阻害剤）を含む他のがん療法に対して耐性の患者集団の処置に有用であり得る。
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示目的に過ぎず、それに照らして様々な改変または変更が当業者に対して示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の中に含まれることが理解される。

Claims (70)

  1. 式：
    Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
    （式中、
    ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
    Ｌはリンカーであり；
    Ｄは薬物部分であり；
    ｍは１〜８の整数であり；および
    ｎは１〜１０の整数である）
    の抗体薬物コンジュゲート。
  2. 前記ｍが１である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. 前記ｎが３または４である、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. 前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２の全てのアイソフォームに特異的に結合する、請求項１から３のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する、請求項１から４のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  6. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、請求項１から５のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、請求項１から６のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１からなるヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、請求項１から６のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項１から８のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のヒトＦＧＦＲ４のアミノ残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、請求項１から１０のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  12. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  13. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３からなるヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  14. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２のＶＨ ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項１から１３のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  15. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  16. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のＶＨ領域、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のＶＬ領域を含む、請求項１５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  17. 前記抗体が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる、請求項１６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  18. 前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に対して配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と交差競合する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  19. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  20. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有さない、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  21. 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１から２０のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  22. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から２１のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  23. 前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  24. 前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル １７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬から誘導される、請求項２３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  25. 前記リンカーが、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される、請求項２４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  26. 前記薬物部分が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  27. 前記細胞毒性剤がメイタンシノイドである、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  28. 前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  29. 下記式：
    （式中、
    Ａｂは、配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；および
    ｎは１〜１０である）
    を有する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  30. 請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  31. 前記組成物が、凍結乾燥物として調製される、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記凍結乾燥物が、前記抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. それを必要とする患者におけるＦＧＦＲ２陽性および／またはＦＧＦＲ４陽性がんを処置する方法であって、請求項１から３０のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３０から３２のいずれかに記載の医薬組成物を、前記患者に投与する工程を含む、方法。
  34. 前記がんが、ＦＧＦＲ２遺伝子コピー数の増加またはＰＡＸ３−ＦＯＸＯトランスロケーションを有する、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記がんが、胃がん、乳がん、横紋筋肉腫、肝臓がん、副腎がん、肺がん、食道がん、結腸がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  36. チロシンキナーゼ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤または別のＦＧＦＲ２阻害剤を、前記患者に投与する工程をさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
  37. 前記別のＦＧＦＲ２阻害剤が、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素またはその薬学的に許容される塩である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記がんが、チロシンキナーゼ阻害剤に耐性である、請求項３３または３５に記載の方法。
  39. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲまたはＭｅｔ阻害剤である、請求項３８に記載の方法。
  40. 患者においてＨｅｒ２阻害剤に耐性であるがんを処置する方法であって、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３０から３２のいずれかに記載の医薬組成物を、前記患者に投与する工程を含む、方法。
  41. 医薬としての使用のための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
  42. ＦＧＦＲ２陽性またはＦＧＦＲ４陽性がんの処置における使用のための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３１から３３のいずれかに記載の医薬組成物。
  43. チロシンキナーゼ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３１から３３のいずれかに記載の医薬組成物。
  44. ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲまたはＭｅｔ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３０から３２のいずれかに記載の医薬組成物。
  45. ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
  46. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する、請求項４５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  47. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、請求項４６に記載の抗体または抗原結合性断片。
  48. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、請求項４７に記載の抗体または抗原結合性断片。
  49. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項４６から４８に記載の抗体または抗原結合性断片。
  50. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項４５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  51. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、請求項４５から５０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  52. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項４５から５１のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  53. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３からなるヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、請求項４５から５１のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  54. （ａ）配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２のＶＨ ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項４５から５３のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  55. （ａ）配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項５４に記載の抗体または抗原結合性断片。
  56. 配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のＶＨ領域、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のＶＬ領域を含む、請求項５５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  57. 配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる、請求項５６に記載の抗体。
  58. 前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に関して、請求項５７に記載の抗体または抗原結合性断片と交差競合する、請求項４５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  59. 前記抗体または抗原結合性断片が、請求項５９に記載の抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有する、請求項４５に記載の抗体または抗原結合性断片。
  60. 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項４５から５９のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  61. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４５から６０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  62. 前記抗体または抗原結合性断片が、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項４５から６１のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  63. 前記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
  64. 請求項６３に記載の核酸を含むベクター。
  65. 請求項６４に記載のベクターを含む宿主細胞。
  66. 抗体または抗原結合性断片を生成するための方法であって、
    請求項６５に記載の宿主細胞を培養する工程、および培養物から抗体を回収する工程を含む、方法。
  67. 抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法であって、
    （ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結する工程；
    （ｂ）前記リンカー−薬物を、請求項６６に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートする工程；および
    （ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製する工程
    を含む、方法。
  68. ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．５の平均ＤＡＲを有する、請求項６７に従って作製される抗体薬物コンジュゲート。
  69. 請求項４５から６２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、または標識された請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む診断試薬。
  70. 標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオンからなる群から選択される、請求項６９に記載の診断試薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021125263A1 (ja) * 2019-12-18 2021-06-24 国立大学法人 岡山大学 抗体薬物コンジュゲート及び抗体の薬物送達のための使用

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088266A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Incyte Corporation Substituted imidazopyridazines and benzimidazoles as inhibitors of fgfr3
US9714298B2 (en) 2012-04-09 2017-07-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-FGFR2 antibodies and methods of use thereof for treating cancer
PT3176170T (pt) 2012-06-13 2019-02-05 Incyte Holdings Corp Compostos tricíclicos substituídos como inibidores de fgfr
US9388185B2 (en) 2012-08-10 2016-07-12 Incyte Holdings Corporation Substituted pyrrolo[2,3-b]pyrazines as FGFR inhibitors
US9266892B2 (en) 2012-12-19 2016-02-23 Incyte Holdings Corporation Fused pyrazoles as FGFR inhibitors
US9415118B2 (en) 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
PE20152033A1 (es) 2013-04-19 2016-01-21 Incyte Holdings Corp Heterociclos bicicliclos como inhibidores de fgfr
EP4036118A1 (en) 2013-08-01 2022-08-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Afucosylated anti-fgfr2iiib antibodies
TWI541022B (zh) * 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
WO2015109391A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Smc combination therapy for the treatment of cancer
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CN106103484B (zh) 2014-03-14 2021-08-20 诺华股份有限公司 针对lag-3的抗体分子及其用途
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
CU20170052A7 (es) 2014-10-14 2017-11-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
SG11201703446RA (en) * 2014-10-31 2017-05-30 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-cs1 antibodies and antibody drug conjugates
MA40934A (fr) * 2014-11-19 2017-09-27 Immunogen Inc Procédé de préparation de conjugués agent de liaison cellulaire-agent cytotoxique
EP3233918A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Novartis AG Combination therapies
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
US9580423B2 (en) 2015-02-20 2017-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
EP3617205B1 (en) 2015-02-20 2021-08-04 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
MY190404A (en) 2015-03-10 2022-04-21 Aduro Biotech Inc Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
EP3287522A4 (en) * 2015-04-20 2019-03-27 Daiichi Sankyo Company, Limited DETECTION OF FGFR2
EP3095465A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 U3 Pharma GmbH Combination of fgfr4-inhibitor and bile acid sequestrant
CA2990398A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-cd123-antibodies
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
SI3317301T1 (sl) 2015-07-29 2021-10-29 Novartis Ag Kombinirane terapije, ki obsegajo molekule protitelesa na LAG-3
WO2017060322A2 (en) * 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
BR112018008904A2 (pt) 2015-11-03 2018-11-27 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a tim-3 e seus usos
CN106699889A (zh) 2015-11-18 2017-05-24 礼进生物医药科技（上海）有限公司 抗pd-1抗体及其治疗用途
RU2021107536A (ru) 2015-11-23 2021-07-02 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Ингибиторы fgfr2 отдельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами в лечении рака
CA3007671A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
CN108884169B (zh) 2016-01-22 2022-03-22 默沙东公司 抗凝血因子xi抗体
CN108601848A (zh) 2016-02-05 2018-09-28 伊缪诺金公司 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法
CN109071659B (zh) * 2016-02-10 2022-06-10 生物发明国际股份公司 人抗fgfr4抗体和索拉非尼的组合
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
AU2017286432B2 (en) 2016-06-14 2020-09-24 Adimab, Llc Anti-coagulation factor XI antibodies
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
EP3507367A4 (en) 2016-07-05 2020-03-25 Aduro BioTech, Inc. CYCLIC DINUCLEOTID COMPOUNDS WITH INCLUDED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
SG10202112636SA (en) 2017-05-16 2021-12-30 Five Prime Therapeutics Inc Anti-fgfr2 antibodies in combination with chemotherapy agents in cancer treatment
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES
EP3444275A1 (en) 2017-08-16 2019-02-20 Exiris S.r.l. Monoclonal antibody anti-fgfr4
EP3692048A4 (en) 2017-08-30 2021-10-20 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. CYCLIC DI-NUCLEOTIDES AS STIMULATORS OF INTERFERON GENE MODULATORS
CA3099116A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Incyte Corporation Salts of an fgfr inhibitor
CN112867716A (zh) 2018-05-04 2021-05-28 因赛特公司 Fgfr抑制剂的固体形式和其制备方法
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
WO2019246571A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating adrenocortical carcinoma
WO2019246572A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating primary aldosteonism
DK3883966T3 (da) 2018-12-21 2023-10-16 Ose Immunotherapeutics Humaniseret anti-human-pd-1-antistof
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
WO2021007269A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
JOP20220083A1 (ar) 2019-10-14 2023-01-30 Incyte Corp حلقات غير متجانسة ثنائية الحلقة كمثبطات لـ fgfr
US11566028B2 (en) 2019-10-16 2023-01-31 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CA3162010A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Derivatives of an fgfr inhibitor
CA3163875A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
MX2023001556A (es) 2020-08-05 2023-03-08 Dragonfly Therapeutics Inc Anticuerpos que se dirigen a egfr y uso de los mismos.
US11939331B2 (en) 2021-06-09 2024-03-26 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US20230220106A1 (en) 2021-12-08 2023-07-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
WO2023235727A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 Cornell University Cancer immunotherapies to promote hyperacute rejection
CN115645526B (zh) * 2022-12-27 2023-03-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 溶菌酶c特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007520450A (ja) * 2003-10-10 2007-07-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド 非開裂リンカーを介して連結した細胞結合物質メイタンシノイド複合体を用いて特定の細胞集団を標的とする方法、前記複合体、および前記複合体の製造法
US20110137016A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-09 Mark Dennis Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2013506709A (ja) * 2009-10-06 2013-02-28 イミュノジェン・インコーポレーテッド 有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US2429001A (en) 1946-12-28 1947-10-14 Axel H Stone Artificial hand
US2779780A (en) 1955-03-01 1957-01-29 Du Pont 1, 4-diamino-2, 3-dicyano-1, 4-bis (substituted mercapto) butadienes and their preparation
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JP2571874B2 (ja) 1989-11-06 1997-01-16 アルカーメス コントロールド セラピューティクス，インコーポレイテッド タンパク質マイクロスフェア組成物
JPH06507404A (ja) 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
WO1996020698A2 (en) 1995-01-05 1996-07-11 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5985320A (en) 1996-03-04 1999-11-16 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
JP2002532415A (ja) 1998-12-16 2002-10-02 ワーナー−ランバート・カンパニー Ｍｅｋ阻害剤による関節炎の治療
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
AU2001273498B2 (en) 2000-07-19 2006-08-24 Warner-Lambert Company Oxygenated esters of 4-iodo phenylamino benzhydroxamic acids
US6411163B1 (en) 2000-08-14 2002-06-25 Intersil Americas Inc. Transconductance amplifier circuit
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
AU2003210787B2 (en) 2002-02-01 2009-04-23 Medinol Ltd. Phosphorus-containing compounds & uses thereof
KR101210018B1 (ko) 2002-03-08 2012-12-07 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 약물로서 유용한 거대고리 화합물
TWI275390B (en) 2002-04-30 2007-03-11 Wyeth Corp Process for the preparation of 7-substituted-3- quinolinecarbonitriles
GB0215823D0 (en) 2002-07-09 2002-08-14 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
DE60324964D1 (de) 2002-07-15 2009-01-08 Univ Princeton Iap-bindende verbindungen
US7399865B2 (en) 2003-09-15 2008-07-15 Wyeth Protein tyrosine kinase enzyme inhibitors
ZA200601182B (en) * 2003-10-10 2007-04-25 Immunogen Inc Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
AU2005206929B2 (en) 2004-01-16 2008-01-24 The Regents Of The University Of Michigan Conformationally constrained Smac mimetics and the uses thereof
JP2007523061A (ja) 2004-01-16 2007-08-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Ｓｍａｃペプチドミメティクスおよびその使用法
CA2558615C (en) 2004-03-23 2013-10-29 Genentech, Inc. Azabicyclo-octane inhibitors of iap
DK2253614T3 (da) 2004-04-07 2013-01-07 Novartis Ag IAP-inhibitorer
CN101035802A (zh) 2004-07-02 2007-09-12 健泰科生物技术公司 Iap抑制剂
US7674787B2 (en) 2004-07-09 2010-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Conformationally constrained Smac mimetics and the uses thereof
AU2005271831A1 (en) 2004-07-12 2006-02-16 Idun Pharmaceuticals, Inc. Tetrapeptide analogs
AU2005274937B2 (en) 2004-07-15 2011-08-18 Medivir Ab IAP binding compounds
EP1836201B2 (en) 2004-12-20 2013-09-04 Genentech, Inc. Pyrrolidine inhibitors of iap
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
AU2006213662B2 (en) 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
CN102603770A (zh) 2005-04-15 2012-07-25 免疫基因公司 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体
WO2006124451A2 (en) 2005-05-11 2006-11-23 Centocor, Inc. Anti-il-13 antibodies, compositions, methods and uses
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
MX2008000253A (es) 2005-07-08 2008-04-02 Biogen Idec Inc Anticuerpos de sp35 y usos de los mismos.
AU2006272837B2 (en) 2005-07-21 2012-08-23 Ardea Biosciences, Inc. N-(arylamino)-sulfonamide inhibitors of MEK
AU2006283726C1 (en) 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
AU2006287416A1 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Medimmune, Llc Toxin conjugated Eph receptor antibodies
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
WO2007134210A2 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
MX2009011783A (es) 2007-04-30 2009-12-04 Genentech Inc Inhibidores de iap.
MX338504B (es) 2007-09-12 2016-04-20 Genentech Inc Combinaciones de compuestos inhibidores de fosfoinosituro 3-cinasa y agentes quimioterapeuticos, y metodos de uso.
CA2701292C (en) 2007-10-25 2015-03-24 Genentech, Inc. Process for making thienopyrimidine compounds
US20110059091A1 (en) 2008-02-04 2011-03-10 Xiao-Jia Chang Inhibitors of oncogenic isoforms and uses thereof
US8236319B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
WO2009148928A1 (en) * 2008-05-29 2009-12-10 Galaxy Biotech, Llc Monoclonal antibodies to basic fibroblast growth factor
US8168784B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 Abbott Laboratories Processes to make apoptosis promoters
AU2010236787A1 (en) * 2009-04-01 2011-11-10 Genentech, Inc. Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
ES2726945T3 (es) 2009-06-03 2019-10-10 Immunogen Inc Métodos de conjugación
US9145462B2 (en) 2010-06-30 2015-09-29 The Regents Of The University Of California Glioblastoma multiforme-reactive antibodies and methods of use thereof
CN103201287B (zh) 2010-08-12 2016-04-13 艾托生物有限公司 成纤维细胞生长因子受体2的致癌异构体的抗体分子及其用途
US20120121615A1 (en) 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
KR20140019415A (ko) 2011-03-29 2014-02-14 이뮤노젠 아이엔씨 향상된 균질성의 접합체를 제조하기 위한 방법
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2014089193A1 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-fgfr2 antibodies
US9415118B2 (en) 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
US11605302B2 (en) 2020-11-10 2023-03-14 Rockwell Collins, Inc. Time-critical obstacle avoidance path planning in uncertain environments

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007520450A (ja) * 2003-10-10 2007-07-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド 非開裂リンカーを介して連結した細胞結合物質メイタンシノイド複合体を用いて特定の細胞集団を標的とする方法、前記複合体、および前記複合体の製造法
JP2013506709A (ja) * 2009-10-06 2013-02-28 イミュノジェン・インコーポレーテッド 有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー
US20110137016A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-09 Mark Dennis Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUMAN FGFR SEQUENCE ALIGNMENT, JPN6018012722, 20 October 2012 (2012-10-20), ISSN: 0003781591 *
PROTEOMICS, vol. 3, JPN6018012720, 2003, pages 1037 - 1046, ISSN: 0003781590 *
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 51, JPN6018012718, 1995, pages 30643 - 30650, ISSN: 0003781589 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021125263A1 (ja) * 2019-12-18 2021-06-24 国立大学法人 岡山大学 抗体薬物コンジュゲート及び抗体の薬物送達のための使用

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