CN115645526B - 溶菌酶c特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了溶菌酶C特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用，属于医用配制品领域。本发明要解决的技术问题是：如何为肝细胞癌提供新的治疗选择和依据。为解决该技术问题，本发明提供溶菌酶C特异性抗体在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。所述药物抑制肝癌细胞的增殖和迁移，所述药物抑制肝脏恶性肿瘤的生长，所述菌酶C特异性抗体为抗溶菌酶C的单克隆抗体或多克隆抗体。本研究从体内外不同层面对菌酶C特异性抗体在肝细胞癌治疗中的作用予以自主评价，以期为恶性肝细胞癌的治疗提供新的选择和依据。

Description

溶菌酶C特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用
技术领域
本发明属于医用配制品技术领域，具体涉及溶菌酶C特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏的主要恶性肿瘤，在早期诊断时，可通过局部治疗进行根治，包括手术切除、射频消融、经动脉化疗栓塞或肝移植。然而，HCC通常在晚期被诊断出来，使得这些根治性疗法往往无效，探索新的治疗策略显得尤为急迫。
甲苯磺酸索拉非尼（Sorafenib）是一种新型多靶点抗肿瘤药物，由德国拜耳制药公司研制成功，可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管。它具有双重的抗肿瘤作用：既可通过阻断由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板衍生生长因子（PDGF）受体阻断肿瘤新生血管的形成，间接地抑制肿瘤细胞的生长。在临床前动物试验中显示了广泛的抗肿瘤活性且治疗的耐受性良好，主要的不良反应为可控制的腹泻、皮疹、疲乏、手足综合征、高血压、脱发、恶心/呕吐和食欲不振。溶菌酶C（LYZ）主要由单核巨噬细胞所分泌，在机体抗菌感染中发挥生物学作用。此外，有研究表明恶性HCC细胞也可异常表达并分泌LYZ，可能与肿瘤恶性进展相关，但靶向LYZ是否可作为治疗恶性HCC治疗手段，目前研究尚无报道。治疗性抗体在肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病治疗领域均显示出巨大应用潜能，然而，HCC靶向治疗领域的抗体应用研究尚且有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何为肝细胞癌提供新的治疗选择和依据。
为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供溶菌酶C特异性抗体在制备治疗和/或预防肝癌的药物中的应用。
进一步地，上述的应用中，所述肝癌为原发性肝癌。
进一步地，上述的应用中，所述肝癌可为肝细胞癌。
进一步地，上述的应用中，所述药物可抑制肝癌细胞的增殖。
进一步地，上述的应用中，所述药物可抑制肝癌细胞的迁移。
进一步地，上述的应用中，所述药物可抑制肝细胞癌的生长。
进一步地，所述肝癌细胞可表达溶菌酶C（LYZ）。
进一步地，上述的应用中，所述药物包括所述溶菌酶C（LYZ）特异性抗体及药学上可接受的载体材料。
进一步地，上述的应用中，所述溶菌酶C（LYZ）特异性抗体可为抗溶菌酶C的单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步地，上述的应用中，所述溶菌酶C（LYZ）特异性抗体可为抗溶菌酶C的多克隆抗体。
本发明中，所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋 酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等。使用上述剂型也可经口服给药。
本发明取得的有益技术效果如下：
为探究LYZ特异性抗体治疗肝细胞癌的可行性，本研究从体内外不同层面对溶菌酶C（LYZ）特异性抗体在肝细胞癌治疗中的作用予以自主评价，以期为恶性肝细胞癌的治疗提供新的选择和依据。
附图说明
图1为LYZ在不同HCC细胞表达水平检测结果。图1中IB：α-LYZ表示LYZ在不同HCC细胞中的表达水平，图1中IB：α-LYZ（S）表示LYZ在不同HCC细胞中的分泌水平，图1中IB：α-β-Actin表示内参蛋白Actin在不同HCC细胞中的表达水平。
图2为LYZ特异性抗体以浓度依赖方式抑制肝癌细胞体外增殖的实验结果。用InVivoMab多克隆兔IgG（Ctrl）、不同浓度的兔抗人LYZ多克隆抗体（Ab5: 5 μg/mL, Ab10:10 μg/mL）分别处理HepG2、PLC/PRF/5、SNU-387细胞，通过xCELLigence RTCA DP实时细胞检测系统连续监测不同处理细胞的增殖，实验独立重复3次，数据以（平均值±标准误）的形式展示；***表示P < 0.001，n.s.表示无统计学差异。
图3为LYZ特异性抗体以浓度依赖方式抑制肝癌细胞体外迁移的实验结果。分别用InVivoMab多克隆兔IgG（对照IgG）或不同浓度的兔抗人LYZ多克隆抗体（Ab5: 5 μg/mL,Ab10: 10 μg/mL, Ab20: 20 μg/mL）处理HepG2细胞（A）或Huh-7细胞（B），通过Transwell技术检测不同浓度抗体处理对肝癌细胞迁移的影响，在显微镜下计数至少5个高倍镜视野，实验独立重复3次，数据以（平均值±标准误）的形式展示；***表示P < 0.001；A图中标尺代表200 μm，B图中标尺代表100 μm。
图4为LYZ特异性抗体抑制小鼠体内肝细胞癌的生长的实验结果。分别用InVivoMab多克隆兔IgG（对照IgG，200 μg/mouse）、兔抗人LYZ多克隆抗体（LYZ特异性抗体，200 μg/mouse）、甲苯磺酸索拉菲尼（15 mg/kg）处理不同组的NOD/SCID荷瘤小鼠，通过活体成像技术监测不同组小鼠体内肿瘤生长差异；数据以（平均值±标准误）的形式展示，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请主要的实验材料及来源如下：
人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-510。人肝癌细胞系Huh-7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-526。人肝癌细胞系Hep3B购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-5045。人肝癌细胞系PLC/PRF/5购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-5095。人肝癌细胞系SNU-387购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-5046。人胚肾细胞系293T购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号为SCSP-502。人肝癌细胞系（SNU-475）购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号为ZQ0706。
表达荧光素酶报告基因的Huh-7细胞（Huh-7-Luc）由本实验室构建。利用Lipofectamine™ 3000转染试剂（购自Thermo公司，目录号为L3000015）将目的质粒（pGL4.51[luc2/CMV/Neo]，购自Promega公司，目录号为E132A）转染进Huh-7细胞，转染48小时后，通过G418选择性抗生素（购自Thermo公司，目录号为10131035，使用浓度为1 mg/mL）筛选稳定表达荧光素酶报告基因的Huh-7细胞即为目的细胞。
其中，HepG2、Huh-7/Huh-7-Luc、Hep3B、PLC/PRF/5细胞培养在含10% 胎牛血清（Newzerum，FBS-S500）、1%双抗（Gibco，15140-122）的DMEM基础培养基（Gibco，C11995500BT）中，SNU-387、SNU-475细胞培养在含10% 胎牛血清（Newzerum，FBS-S500）、1%双抗（Gibco，15140-122）的RPMI 1640基础培养基（Gibco，C11875500BT）中。细胞每两天传代一次，经胰酶（Gibco，25200-056）消化后，置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱（Thermo，Heracell VIOS 250i）培养。所有细胞经过STR检测验证，并且无支原体污染。
主要试剂：兔抗人LYZ多克隆抗体（Agilent，A0099）、InVivoMab多克隆兔IgG（BioXCell，BE0095）、甲苯磺酸索拉菲尼（APExBIO，A8245）、兔抗LYZ单克隆抗体（Abcam，ab108508）、鼠抗β-Actin抗体（Proteintech，66009-1-Ig）、HRP结合的羊抗兔IgG（Proteintech，SA00001-2）、HRP结合的羊抗鼠IgG（Proteintech，SA00001-1）、细胞蛋白提取试剂（Thermo，89901）、BCA蛋白定量试剂（Thermo，23225）、结晶紫染液（Beyotime，C0121）、Matrigel基质胶（Corning，356237）、D-荧光素钾盐（Beyotime，ST196）。
主要仪器耗材：免疫印迹用蛋白电泳仪及转印仪（BioRad，1658033）、实时细胞检测系统（Agilent，xCELLigence RTCA DP）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf，5425R）、E-Plate 16微孔板（Agilent，5469830001），8 μm Boyden小室（FALCON，353097）、10 kD蛋白浓缩超滤管（Millipore，UFC501096），PVDF蛋白转印膜（BioRad，1620184）。
实验用6-8周龄雄性NOD/SCID小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养于国家蛋白质科学中心（北京）SPF动物设施中。本申请所涉及动物实验通过国家蛋白质科学中心（北京）实验动物管理与使用委员会审查，伦理审查编号：IACUC-20210329-16MT。
下述实施例采用GraphPad Prism7.00软件对数据进行处理和分析，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA或Two-way ANOVA检验，*表示具有显著性差异（P＜0.05），**表示具有极显著性差异（P＜0.01），***表示具有极显著性差异（P＜0.001），n.s.表示无统计学差异。
本申请通过免疫印迹方法检测人肝癌细胞系中LYZ的表达和分泌。通过实时细胞检测系统检测LYZ特异性抗体对HCC细胞体外增殖的影响。通过Transwell技术检测LYZ特异性抗体对HCC细胞体外迁移的影响。利用小鼠肝原位移植瘤模型检测LYZ特异性抗体对HCC肿瘤体内生长的影响。
实施例1、LYZ在部分HCC细胞中高表达
收集培养两天的HCC细胞，包括HepG2、Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、SNU-387、SNU-475共6种人肝癌细胞，按照细胞蛋白提取试剂产品使用说明书分别提取6种人肝癌细胞总蛋白，之后使用BCA蛋白定量试剂检测各蛋白样品的浓度，各取30 μg蛋白用于免疫印迹分析，以检测6种人肝癌细胞中LYZ的表达量。同时取各细胞培养上清500 μL，加入10 kD蛋白浓缩超滤管中，置于离心机中以1000 rpm，4℃离心，浓缩至体积剩余约50 μL时，取2 μL浓缩上清用于免疫印迹分析（WB），以检测6种人肝癌细胞中LYZ的分泌水平。
免疫印迹法测定蛋白的表达水平。电泳过程中首先设定电压为80 V，待样本泳动至分离胶后，调整电压为150 V直至样本完全泳动至分离胶底端。之后设定条件（90 V，90min）将分离胶中蛋白条带转印至PVDF膜上，利用兔抗LYZ单克隆抗体及鼠抗β-Actin抗体检测各细胞中LYZ的表达及分泌水平。
结果如图1所示，图1中IB：α-LYZ表示6种人肝癌细胞中LYZ的表达量的免疫印迹检测结果，图1中IB：α-β-Actin表示6种人肝癌细胞中β-Actin的表达量的免疫印迹检测结果，图1中IB：α-LYZ（S）表示6种人肝癌细胞中LYZ分泌量的免疫印迹检测结果。结果表明：LYZ在HepG2细胞表达及分泌水平最高，其次是Huh-7细胞、PLC/PRF/5细胞，而在SNU-387、SNU-475中未检测到LYZ表达。因此，选择HepG2、Huh-7、PLC/PRF/5细胞用做之后评价LYZ特异性抗体治疗作用的实验细胞。
实施例2、LYZ特异性抗体以浓度依赖性方式抑制HCC细胞体外增殖
收集培养2天的HepG2、PLC/PRF/5、SUN-387细胞并计数，按照8000个HepG2/孔×100 μL、5000个PLC/PRF/5/孔×100 μL、5000个SNU-387/孔×100 μL，三种人肝癌细胞（HepG2、PLC/PRF/5、SNU-387）实验分组如下，每组实验设置三个复孔。
第一组：对照IgG处理组，即人肝癌细胞悬液中添加InVivoMab多克隆兔IgG
第二组：5 μg/mL LYZ特异性抗体处理组，即人肝癌细胞悬液中添加兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为5 μg/mL）；
第三组：10 μg/mL LYZ特异性抗体处理组，即人肝癌细胞悬液中添加兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为10 μg/mL）。
取HepG2、PLC/PRF/5或SNU-387细胞培养液，800 rpm离心3分钟后弃上清并用相应体积含2% FBS的DMEM或RPMI 1640培养基重悬细胞。根据实验分组，计算所需的各细胞总数，然后分别向各实验组细胞悬液中加入InVivoMab多克隆兔IgG或不同浓度的兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为5 μg/mL或10 μg/mL），充分混匀后，将各实验组细胞加入E-Plate 16微孔板中（100 μL/孔），通过xCELLigence RTCA DP实时细胞检测系统监测不同组细胞增殖差异。
结果如图2所示，图2中横坐标为细胞在E-Plate 16微孔板中的培养时间，图2中纵坐标为各细胞在E-Plate 16微孔板中增殖由仪器所计算的细胞指数，细胞指数与细胞增殖成正相关。图2结果表明：随着培养时间延长，HepG2、PLC/PRF/5、SNU-387细胞指数不断增大，重要的是，兔抗人LYZ多克隆抗体处理显著抑制HepG2、PLC/PRF/5这两种肝癌细胞增殖，并且呈现出显著的浓度依赖趋势，然而并不抑制本身不表达LYZ的SNU-387细胞增殖，说明LYZ特异性抗体具有抑制表达LYZ的肝癌细胞体外增殖的作用。
实施例3、LYZ特异性抗体以浓度依赖性方式抑制HCC细胞体外迁移
两种人肝癌细胞（HepG2、Huh-7）实验分为以下几组：
第一组：对照IgG处理组，即人肝癌细胞悬液中添加InVivoMab多克隆兔IgG
第二组：5 μg/mL LYZ特异性抗体处理组，即人肝癌细胞悬液中添加兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为5 μg/mL）；
第三组：10 μg/mL LYZ特异性抗体处理组，即人肝癌细胞悬液中添加兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为10 μg/mL）;
第四组：20 μg/mL LYZ特异性抗体处理组，即人肝癌细胞悬液中添加兔抗人LYZ多克隆抗体（体系中抗体终浓度为20 μg/mL）
收集培养的HepG2或Huh-7细胞并计数，按照4×105个/孔×200 μL（HepG2）或1×105个/孔×200 μL（Huh-7）实验体系，用DMEM基础培养基重悬细胞，然后根据分组向各实验组细胞悬液中加入InVivoMab多克隆兔IgG或如图所示不同浓度的兔抗人LYZ多克隆抗体，充分混匀。向24孔板中加入600 μL含20% FBS的DMEM培养基，然后将8 μm Boyden小室以倾斜角度放入含培养基的24孔板中，并将实验组细胞悬液加入Boyden小室上室中，放入培养箱培养36 h。通过结晶紫染色计数各实验组穿过小室的细胞个数，结果如图3所示，随着兔抗人LYZ多克隆抗体处理浓度增大，穿过Boyden小室的HCC细胞数目依次减少，说明LYZ特异性抗体可以抑制肝癌细胞的体外迁移。
实施例4、LYZ特异性抗体抑制小鼠肝原位移植瘤体内生长
收集培养的Huh-7-Luc细胞并计数，调整细胞浓度为0.7×108/mL。将浓度调整后的细胞悬液与Matrigel基质胶进行1:1体积混合，按照20 μL/只体积，将Huh-7-Luc细胞接种到NOD/SCID小鼠肝脏被膜下，缝合手术切口，并对小鼠饲喂1%双抗至少3天。肿瘤接种一周后，根据活体成像结果，将荷瘤小鼠随机分为三组，每组8-10只小鼠。
第一组：对照IgG治疗组（10只小鼠），每只小鼠给予InVivoMab多克隆兔IgG处理，给药剂量为200 μg/只，给药体积为100 μL。
第二组：LYZ特异性抗体治疗组（10只小鼠），每只小鼠给予兔抗人LYZ多克隆抗体处理，给药剂量为200 μg/只，给药体积为100 μL。
第三组：甲苯磺酸索拉菲尼药物治疗组（8只小鼠），每只小鼠给予甲苯磺酸索拉菲尼药物处理，给药剂量为15 mg/kg，给药体积为100 μL。
之后每天对荷瘤小鼠实施腹腔给药，连续持续两周。同时，每周进行三次活体成像，监测不同治疗组小鼠体内肿瘤生长情况（肿瘤细胞平均荧光素酶活性与肿瘤大小成正相关）。结果如图4所示，对照IgG处理组小鼠体内肿瘤持续生长，而兔抗人LYZ多克隆抗体处理显著抑制小鼠体内肿瘤生长，基本能达到临床所用阳性药物甲苯磺酸索拉菲尼同等的治疗效果，表明LYZ特异性抗体可在小鼠体内抑制肝癌细胞生长。
综合以上实验结果表明：LYZ特异性抗体在体内外均能够显著抑制HCC细胞的生长，可为恶性HCC的治疗提供潜在的应用及临床转化价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (6)

1.溶菌酶C特异性抗体在制备治疗肝癌的药物中的应用；所述肝癌为溶菌酶C高表达肝细胞癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝癌为原发性肝癌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物抑制肝癌细胞的增殖。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物抑制肝癌细胞的迁移。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物抑制肝细胞癌的生长。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物包括所述溶菌酶C特异性抗体及药学上可接受的载体。
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