CN103374557B - 一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有甘露糖化修饰溶菌酶及其应用，所述溶菌酶经过N-糖基化修饰，具体这种糖化为甘露糖化修饰，修饰位点为N-X-S/T，其中X为除脯氨酸外的氨基酸。本发明还提供了所述甘露糖化修饰溶菌酶的制备方法，其是通过人工添加N-糖基化修饰位点，并利用毕赤酵母表达获得，使不发生糖基化修饰的天然溶菌酶经改造后，进而发生N-糖基化修饰。本发明获得的溶菌酶具有杀菌活性，能够利用巨噬细胞膜上甘露糖受体的介导作用内吞进入胞内，进而杀死胞内菌，具有潜在的药用价值。

Description

一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用。

背景技术

溶菌酶是一类抗菌能力强大、抗菌谱广、种类多样、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变的碱性蛋白质。溶菌酶一般由129个氨基酸残基组成，分子量在14kDa左右，在酸性条件(pH＝4～7)下，100℃处理1min后仍能保持原活性，但在碱性环境下热稳定性较差，溶菌酶最适pH值为6.6，等电点为10.5～11。人溶菌酶(humanlysozyme)属于c型溶菌酶，由130个氨基酸组成，分子量为14.7kD，含有4个二硫键。人溶菌酶具有高生物活性和热稳定性，其杀菌活性是目前市场常用的鸡蛋清溶菌酶的3倍，同时，人溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力以及抗肿瘤的功效，在临床中具有较高的应用价值。

溶菌酶的作用及其机理与传统的抗生素不同，溶菌酶不仅具有广谱抗细菌能力，且对病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。同时，在体外与传统抗生素一样通过试管或平皿法可观察到杀菌作用。目前，关于人溶菌酶的作用机理的研究大都集中在人溶菌酶与细菌细胞壁作用方面。溶菌酶的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁，研究表明，由于革兰氏阳性细菌外部没有由脂多糖、磷脂、糖脂组成的外膜覆盖，所以溶菌酶对它们的作用较强。然而溶菌酶自身的特点决定了溶菌酶的使用均只能针对细胞外的细菌产生直接作用。目前研究发现的细胞内病原体所致感染是危害人类健康的顽疾之一。结合分枝杆菌、伤寒沙门氏菌等常见胞内菌入侵机体后，已演化出不同机制来逃避机体的免疫：如结合分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬后能改变所在吞噬泡的特征，使吞噬泡不能与溶酶体融合而避开了溶酶体中为数众多的水解酶类(包含溶菌酶)的降解作用而长期寄生在胞内；反使巨噬细胞成为其庇护所又躲过体液免疫，在机体免疫力下降时进行繁殖形成慢性持续性的感染。又因大多数抗生素及抗菌药在巨噬细胞内浓度低难以杀死寄生菌，致使临床治疗胞内菌存在一定困难，而至今无有效治疗手段。人溶菌酶能杀死革兰氏阳性菌对革兰氏阴性菌也有一定的抑菌作用，但至今也没有利用溶菌酶等有效的方法来治疗胞内菌。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种甘露糖化修饰的溶菌酶；第二个目的在于提供编码所述溶菌酶的基因；第三个目的在于提供包含所述溶菌酶基因的重组载体；第四个目的在于提供包含所述溶菌酶基因或重组载体的重组菌株；第五个目的在于提供制备所述溶菌酶的方法；第六个目的在于提供所述溶菌酶在杀死胞内菌中的应用。

本发明所述甘露糖化修饰的溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；或将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；或与上述限定的氨基酸至少具有90％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。或其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或将序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；或与上述限定的氨基酸至少具有90％同源性且具有相同功能的氨基酸序列。所述氨基酸序列经过N-糖基化修饰位点N-X-S/T修饰,其中X为除脯氨酸外的氨基酸。所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列是在修饰前氨基酸序列(SEQ IDNo.3)的C端增加一段具有2个N-糖基化修饰位点的氨基酸序列NGTGNASG，在未改变抑菌活性的前提下，得到具有甘露糖化修饰的溶菌酶。

所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是将修饰前氨基酸序列(SEQID No.3)的第116位和第120位发生突变，序列NRCQNRD中的C突变为T，D突变为S，从而获得具有2个N-糖基化修饰位点的序列NRTQNRS，在未改变抑菌活性的前提下，得到了具有甘露糖化修饰的溶菌酶突变体。

优选地，所述溶菌酶的修饰位点位于氨基酸序列的C端。

本发明还提供了编码所述溶菌酶的基因。

优选地，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选地，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了包含上述溶菌酶基因的重组载体。

优选地，重组载体为pPICZαA-hLYZ重组载体，在载体pPICZaA中AOX启动子下游Xho I和Xba I位点间插入hLYZ基因，其中所述hLYZ基因3’端引入包含2个N-糖基化位点序列的一段连接序列：AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(划线部分为糖基化位点序列)。

本发明还提供包含上述溶菌酶基因或重组载体的重组菌株，优选重组菌株是酵母菌株，更优选为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备溶菌酶的方法。包括以下步骤：

(1)用所述重组载体转化宿主菌，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导糖基化修饰溶菌酶的表达；

(3)回收并纯化所表达的溶菌酶。

本发明所述溶菌酶可用于杀死胞内菌。甘露糖化溶菌酶在巨噬细胞膜上甘露糖受体(MR)的介导作用内吞进入细胞内，发挥其杀菌活性，从而实现溶菌酶在巨噬细胞寄生菌引起的慢性感染性疾病的应用。

本发明利用酵母表达系统能高效表达正确折叠的外源蛋白，并具有翻译后修饰和加工能力的特点，通过对溶菌酶进行改造，如人工添加糖基化修饰位点——N-X-S/T(X为脯氨酸除外的氨基酸)，或者突变原有氨基酸使其产生糖基化修饰位点，进而在酵母中表达时发生糖基化修饰，产生高甘露糖型糖链结构。N-X-S/T修饰是是蛋白进行糖基化修饰的一种方式。在N-糖基化过程中，N连接糖链通过N-乙酰葡糖胺与蛋白质肽链中保守序列N-X-S/T(X为脯氨酸除外的氨基酸)结构的天冬酰胺以β-1,4糖苷键连接。因此在N-糖基化中N-X-S/T被认为是N位糖基化的先决条件。

本发明所述酵母表达系统是目前应用最广泛的外源蛋白真核表达系统之一。一方面，酵母表达系统具有分泌效率高，表达菌株稳定，表达质粒不易丢失，蛋白抗原性低等，另一方面，酵母表达系统易于进行实验操作、成本低廉、易于大量生产，亦是溶菌酶的理想表达工具。它具有真核细胞的大部分特征，能够对表达产物蛋白质进行一定程度的翻译后修饰和加工。然而天然溶菌酶为非糖蛋白，所以即使在酵母中表达时也不会发生糖基化修饰。

本发明获得甘露糖化修饰的方法可以通过人工设计方法添加N-糖基化修饰位点，其中所述人工方法指人为设计添加N-糖基化修饰位点使溶菌酶表达时发生N-糖基化修饰，或者突变原有氨基酸使溶菌酶氨基酸序列中具有N-糖基化修饰位点，而使溶菌酶表达时发生N-糖基化修饰。编码基因的特异性位点突变的方法为本领域公知的方法，包括寡核苷酸介导的定向突变、PCR方法、盒式突变等。

本发明所述的溶菌酶来自于哺乳动物，优选人溶菌酶，这些溶菌酶的氨基酸序列及编码这些氨基酸序列的核酸序列可以从各种公开的文献、书籍和公共数据库中获得，如可以从公开的美国国立生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL(http://www.embl.org)公开的数据库中获得，编码这些信号肽的DNA，可以采用PCR(Saiki等Science.239:487-491,1988)、酶切等方法从相应物种的cDNA或其文库等获得，也可以采用人工合成的方法获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的病毒、细胞及文库等，这些病毒、细胞可以从各种菌、毒种库获得，细胞和文库也可以从公司购得。这些DNA序列可以是天然序列，也可以用同义密码子替换的序列，优化mRNA二级结构等方法优化设计相应蛋白的编码序列，尤其是采用酵母偏爱密码子替换原密码子往往有利于溶菌酶的表达。溶菌酶基因也可以是来源于各物种的基因组，通过物种间重组、突变、缺失等获得的变异体。这些变异体是指与溶菌酶同源性大于50％，并具有溶菌酶的功能，即杀菌活性，较优的是同源性大于80％、最优的是同源性大于95％的多肽。这些变异体的构建可以采用定点突变、随机突变、致错PCR、DNA重排等本领域已知的各种方法。

本发明所述的N-糖基化修饰序列，为——N-X-S/T，X为脯氨酸除外的氨基酸，这些编码氨基酸的核酸序列可以采用PCR、酶切等方法从相应物种的cDNA或其文库等获得，也可以采用人工合成的方法获得，这些DNA序列可以是天然序列，也可以用同义密码子替换的序列，尤其是采用酵母偏爱密码子替换原密码子往往有利于实现表达。这段N-糖基化修饰序列可以与溶菌酶进行融合，既可以在溶菌酶基因的C端融合，也可以在溶菌酶基因的N-端融合；也可以在信号肽编码序列与基因之间加入接头序列。这段N-糖基化修饰序列也可以在不改变溶菌酶活性的前提下利用突变其自身核苷酸序列等方法获得。

若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。如果需要可在编码基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。

用于获得本发明的甘露糖化的溶菌酶的出发菌株可以是为汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属。而其中克鲁维属酵母可以为乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母等，毕赤酵母属可以为巴斯德毕赤酵母。毕赤酵母被认为是一种安全，易于遗传操作，基因组序列清楚，能高效表达异源蛋白并且具备工业规模的发酵特性，已成为用于药用蛋白生产的最佳宿主酵母之一。

本发明的毕赤酵母酵母菌也可为任何毕赤酵母的突变菌株，如毕赤酵母改构体为编号CGMCC No.1853的GJK0601菌株。本发明用GJK0601(α-1,6-甘露糖转移酶基因灭活)重组毕赤酵母生产糖蛋白，即具有毕赤酵母生长快，适合于规模化生产，产业化成本低等优点，又避免了普通毕赤酵母存在的对蛋白进行过度糖基化修饰的问题。普通毕赤酵母表达的过度糖基化修饰的糖蛋白常表现为分子量不均一，SDS-PAGE分析出现明显“拖尾”，且其中大部分蛋白的分子量明显大于根据其氨基酸序列计算的理论分子量，糖含量常大于30％。每个糖基可以含30至上百个甘露糖，分子量为4000至数万。而用α-1,6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母表达的糖蛋白，为低糖基化修饰的糖蛋白，分子量基本均一。SDS-PAGE分析“拖尾”现象消失。

本发明构建的甘露糖化溶菌酶有两个优点：一是溶菌酶不同于天然的溶菌酶，本发明获得的溶菌酶发生了N-糖基化修饰现象，且N-糖基为甘露糖型糖基，无论是野生型毕赤酵母表达获得的高甘露糖型糖基的溶菌酶，还是毕赤酵母改构体表达获得的低甘露糖型糖基的溶菌酶，都具有杀菌活性；二是这种具有甘露糖型糖基修饰溶菌酶，能够利用巨噬细胞膜上甘露糖受体(MR)的介导作用内吞进入胞内，进而杀死胞内菌，具有潜在的药用价值，而无甘露糖化修饰的溶菌酶无此特性。因而本发明具有明显的应用前景。

附图说明

图1是pPICZαA-hLYZ重组载体图谱。

图2是hLYZ基因的钓取电泳图1.hLYZ基因；M.DNA标志物。

图3是pPICZαA-hLYZ载体表达蛋白镍和亲纯化后SDS-PAGE电泳图。

图4是pPICZαA-hLYZ载体表达蛋白的WB鉴定图。

图5是pPICZαA-hLYZ载体表达蛋白糖型分析SDS-PAGE电泳图

1.蛋白样品；2.蛋白PNGaseF酶切；3.PNGaseF；M.蛋白分子量标志物。

图6是ConA检测人溶菌酶的甘露糖修饰的鉴定图。

泳道1：GS115表达溶菌酶hLYZ；泳道2：人血清白蛋白HSA。

图7是pPICZαA-hLYZ/eGFP重组载体图谱。

图8是hLYZ、eGFP基因的钓取电泳图

1.hLYZ基因；2.eGFP基因；M.DNA标志物。

图9是pPICZαA-hLYZ/eGFP重组质粒的酶切鉴定电泳图

1.pPICZαΑ-hLYZ/eGFP质粒酶切结果；M.DNA标志物。

图10是hLYZ-eGFP融合蛋白镍亲和层析后SDS-PAGE电泳图

M.蛋白分子量标准；1.0.2mol/L咪唑洗脱的融合蛋白。

图11是hLYZ-eGFP融合蛋白糖型分析SDS-PAGE电泳图

M.蛋白分子量标志物；1.蛋白样品；2.蛋白PNGaseF酶切；3.PNGaseF。

图12是RAW264.7中hLYZ-eGFP融合蛋白荧光显影图。

图13是pPICZαA-hLYZ载体表达蛋白N-糖基化分析SDS-PAGE电泳图

1.HLYZ；2.HLYZ经PNGaseF酶切；3.PNGaseF；M.蛋白分子量标准97，66，43，30，21，14。

图14是培养板中hLYZ抑菌活性结果图。

图15是ConA检测人溶菌酶的甘露糖修饰的鉴定图

1：GJK0601表达溶菌酶hLYZ；2：人血清白蛋白HSA。

图16是HLYZ WB鉴定图

图17三种甘露糖化修饰的溶菌酶对结合分枝杆菌的抑制曲线图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述的序列均可人工合成。

下述百分量如无特殊说明均为质量百分含量。

本发明中使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶、去磷酸化酶等购自大连宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞、TRIzol、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供和北京博大泰克生物基因技术有限公司提供，PNGF糖苷酶购自New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)，pPIC9、pAO815、pPICZaA购自美国Invitrogen公司(Invitrogen life technologies,USA)。毕赤酵母GS115菌购自美国Invitrogen公司、巨噬细胞RAW264.7购自南方细胞技术有限公司(货号：TIB-71)，人肝癌细胞HepG2、酵母裂解酶Lyticase、酵母表达菌株GJK0601、生物素、PBST、YNB、胎牛血清，青霉素，链霉素、氨苄青霉素、酵母提取物、蛋白胨、琼脂、10×NP40、10×G7、镍亲和层析柱(型号)、Sephadex-G25柱(型号)。

实施例1毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶突变体

天然溶菌酶(hLYZ)是非糖蛋白，本身没有糖基化位点，为了能让其靶向巨噬细胞，在其C端设计两个N-糖基化的位点，本发明将不同于天然溶菌酶的均称之为溶菌酶突变体。通过巴斯德毕赤酵母表达后会在N-糖基化位点处发生甘露糖化修饰，从而实现甘露糖受体靶向的可能。本实施例公开了一种利用巴斯德毕赤酵母表达制备甘露糖化人溶菌酶的方法。

1.1 pPICZαA-hLYZ载体构建

根据GenBank中登录的人溶菌酶基因cDNA序列(NM_000239.2)设计引物：正向引物p1:atcctcgagaaaagagaggctaaggtctttgaaaggtgtgag反向引物P2:tgttctagaccAgaagcgttaccagtaccgttcactccacaaccttgaac

(由上海Sangon公司合成)。通过TRIzol法从人肝癌细胞HepG2中提取总RNA，逆转录成cDNA通过PCR钓取人溶菌酶基因。人溶菌酶基因的3’端引入包含2个N-糖基化位点序列的一段连接序列：AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(划线部分为糖基化位点序列)；P1，P2为引物，用Pyrobest DNA聚合酶扩增人溶菌酶基因。反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共25个循环。基因片段经过酶切、琼脂糖凝胶回收图(2)。由图中可以看出，扩增出约bp左右的条带，大小与预期的结果相互一致，可以用于下一步试验。

为了将hLYZ以甘露糖化修饰形式从毕赤酵母分泌表达，我们选择pPICZaA质粒作为载体(Invitrogen life technologies,USA)。在该载体AOX启动子下游Xho I和Xba I位点间插入hLYZ基因，因pPICZaA载体上有两个Xho I位点，为了表达蛋白的N端无多余的氨基酸和操作方便，将Kex2及Stel3识别序列aaaagagaggct合成在引物中Xho I酶切位点与人溶菌酶基因间。为了便于表达蛋白的纯化，去除基因末端的终止密码子，利用pPICZaA载体上的myc-His标签。利用T4连接酶催化连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆DH5α(pPICZaA-hLYZ)，抽提质粒，酶切鉴定，测序正确，获得hLYZ表达质粒pPICZaA-hLYZ，该质粒的结构见(图1)。其编码蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO.4及对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.1。

1.2酵母感受态细胞制备

挑取毕赤酵母GS115菌单克隆接于2.5mL YPD(配方:酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.5％)培养基，置28℃摇床200r/min培养12h。取500μL菌液接于100mL YPD，200r/min过夜培养。待菌浓度吸光值达1.2OD,4500r/min离心5min,取菌体用冰冷的去离子水重悬同样条件离心，重复一次然后1M冷山梨醇洗一次备用。

1.3目的基因的转化

取新制备的酵母感受态细胞80μL，限制性内切酶SacⅠ线性化的pPICZαA-hLYZ质粒20μL，2KV电击转化感受态细胞。将转化的菌液于涂布于含Zeocin抗性(100μg/mL)的YPD培养基，28℃温箱培养。

1.4酵母基因组鉴定

待YPD+Zeocin平板长出菌落。取20μL蒸馏水，从平板挑入部分菌落，加入2.5μL酵母裂解酶Lyticase，置于37℃温箱2小时，取8μL作为模板进行PCR鉴定融合基因。反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共30循环。

1.5重组菌的诱导表达

挑取阳性的单克隆接种到2.5mL YPD培养基中，28℃培养过夜，取菌液按5％的量接种到BMGY(配方：酵母提取物1％，蛋白胨2％，甘油1％，YNB1.34％，生物素4×10^-5，100mM PB pH6.0)培养基中，28℃、200r/min培养12h后加入0.5％甲醇诱导表达。每12h补加1次，诱导72h后离心取上清。

1.6蛋白的纯化及浓缩

取酵母诱导表达上清加入硫酸铵达80％饱和度沉淀4℃静置1h，10000r/min,25min；蛋白沉淀用去离子水溶解，Sephadex-G25柱脱去硫酸铵及小分子色素；镍亲和层析柱纯化带有His标签的融合蛋白。纯化步骤如下：平衡液(20mM tris-HCl pH7.0，0.5M NaCl)平衡柱子，以2mL/min流速上样，5倍柱体积的平衡液洗柱，洗脱液(20mMtris-HCl pH7.0，0.5M NaCl，0.5M咪唑)阶段洗脱，SDS-PAGE鉴定纯化结果；Sephadex-G25柱以蒸馏水为流动相脱去NaCl及咪唑，收取洗脱峰冻干法浓缩备用(图3)。

1.7蛋白的WB鉴定

取纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，通过半干电转仪将蛋白转移到PVDF膜上。将PVDF膜置于一平皿中，加入封闭液(PBST、5％脱脂牛奶)室温震荡2h或4℃过夜。封闭结束后用漂洗液(PBST)洗涤2次，加入鼠抗人溶菌酶抗体(abcam公司)(1:2000)反应，室温震荡结合2h。用漂洗液洗涤5次，每次5min,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体溶液(1:3000)(欣金科生物有限公司)室温震荡结合1h；漂洗液洗涤5次，每次5min；取出PVDF膜，铺在洁净的保鲜膜上，用滤纸吸去膜上液体，将显色液(康威生物科技有限公司)A液与B液等体积混合，均匀涂布于PVDF膜上，室温反应1min,用滤纸吸取多余液体，保鲜膜包好，置于暗盒于暗室X胶片(柯达)曝光(图4)。

1.8蛋白糖基化分析

取融合蛋白30μL，加入10×变性缓冲液3.3μL【成分】，置于沸水10分钟；待冷却至室温后分别加入4.5μL 10×NP40、4.5μL 10×G7、3μLPNGaseF，置于37℃水浴锅16小时；10％SDS-PAGE检测酶切结果(图5)。

1.9目的蛋白甘露糖基化分析

利用豆蛋白A(ConA)能特异性识别糖基化蛋白糖链末端的甘露糖残基的特性，用conA检测毕赤酵母表达的人溶菌酶是否发生了甘露糖残基修饰。

分别取GS115及低糖基化酵母表达菌株GJK0601表达蛋白样品适量进行15％SDS-PAGE。

将该胶在45v、4℃条件下转膜过夜，(转膜缓冲液：2.9克甘氨酸、5.8克Tris 0.37克SDS、加人200ml甲醇定容到1升。PVDF膜用甲醇浸泡5分钟)；取出电转好的PVDF膜用PBST(PBST中加入0.5mM的Ca²⁺、Mg²⁺)，用0.1％BSA封闭2小时，加入终浓度为5ug/mlHRP标记conA室温结合2小时，用PBST洗5次，每次5分钟。加入ECL显色液显色用化学发光成像仪(美国UVP500)曝光。

GS115酵母表达目的蛋白hLYZ均能结合HRP标记的ConA、而阴性对照人血清白蛋白(HSA)未能结合HRP标记的ConA(图6)。这一结果说明GS115酵母表达的目的蛋白hLYZ发生了甘露糖化修饰。

实施例2毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶(hLYZ)与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的融合蛋白

2.1pPICZαA-hLYZ/eGFP载体构建

根据人溶菌酶基因序列(NM-000239.2)、增强型绿色荧光蛋白基因序列(AAK15492.1)的两端序列，以及已知pPICZαΑ-hLYZ质粒上人溶菌酶基因的3’端已引入包含2个N-糖基化位点序列的一段连接序列：AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(划线部分为糖基化位点序列)；pCAR-EGFP质粒上增强型绿色荧光蛋白基因的5’端也已引入了一段连接序列：GGTACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGAC。设计引物构建融合基因载体：pPICZαA-hLYZ/eGFP，除去eGFP的终止密码把pPICZαA载体上的myc-His标签引入融合蛋白C端(图7)。引物序列见下表1，由上海Sangon公司合成。

表1 引物序列表

首先，以pPICZαΑ-hLYZ质粒为模板，P1，P2为引物，用PyrobestDNA聚合酶扩增人溶菌酶基因(图8)。反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共25个循环。基因片段经过酶切、琼脂糖凝胶回收后从Xho Ⅰ、Sac Ⅱ位点连接到pPICZαA载体；其次，以pCAR-eGFP质粒为模板，P3、P4为引物扩增eGFP基因(图8)。反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、共25循环。同样方法将eGFP基因从Sac Ⅱ、Not1酶切位点连接到上一步测序正确的包含人溶菌酶基因的载体，构建成人溶菌酶与增强型绿色荧光蛋白的融合基因载体:

pPICZαA-hLYZ/eGFP(图7)载体的酶切鉴定(图9)。

2.2酵母感受态细胞制备   (方法同实施例1.2)

2.3目的基因的转化       (方法同实施例1.3)

2.4酵母基因组鉴定       (方法同实施例1.4)

2.5重组菌的诱导表达     (方法同实施例1.5)

2.6蛋白的纯化           (方法同实施例1.6)(图10)

2.7蛋白糖基化分析       (方法同实施例1.8)(图11)

2.8细胞培养

RAW264.7用含有10％的胎牛血清和100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI 1640，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，采用胰酶消化法进行细胞传代。

2.9融合蛋白在巨噬细胞RAW264.7中的荧光检测

取适量RAW264.7细胞接种于盖玻片，待细胞长到盖玻片的80％左右(48h)，吸去板孔中培养基，加入融合蛋白100μl(1mg/ml)补加新培养基至1ml，置37℃、5％CO₂的培养箱孵育2h，弃去培养基，生理盐水洗3遍；用Hoechst 33258室温避光孵育细胞(5min)进行细胞核染色，生理盐水洗去未结合的染料。从板孔中取出盖玻片，滴适量封固液，把含细胞面扣在载玻片上，用指甲油封片备用(图12)。可以检测到亮绿色荧光，而阴性对照无荧光反应，说明甘露糖化的人溶菌酶可进入巨噬细胞RAW264.7。

实施例3：糖基改造毕赤酵母工程菌GJK0601表达甘露糖化人溶菌酶

3.1pPICZαA-hLYZ载体构建(方法同实施例1)

3.2酵母感受态细胞制备   (方法同实施例1)

3.3目的基因的转化       (方法同实施例1)

3.4酵母基因组鉴定       (方法同实施例1)

3.5重组菌的诱导表达     (方法同实施例1)

3.6蛋白的纯化及浓缩     (方法同实施例1)

3.7蛋白糖基化分析       (方法同实施例1)(图13)

3.8蛋白活性分析         (方法同实施例2)

挑取枯草杆菌或溶壁微球菌单克隆于LB培养基37℃摇床200r/min过夜培养，吸取1ml铺LB营养琼脂平板，取10ul(1mg/ml)hLYZ滴于平板，37℃培养箱过夜培养，可见GJK0601表达hLYZ有明显的抑菌圈出现(图14)，表明其具有杀菌活性。

3.9目的蛋白甘露糖基化分析

方法同实施例1.9

糖基改造毕赤酵母工程酵母表达目的蛋白hLYZ均能结合HRP标记的conA、而阴性对照HSA未能结合HRP标记的conA(图15)。这一结果说明糖基改造毕赤酵母工程酵母表达的目的蛋白hLYZ发生了甘露糖化修饰。

实施例4：毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶突变体

天然溶菌酶(hLYZ)是非糖蛋白，本身没有糖基化位点，本实施例为突变原有溶菌酶氨基酸编码序列使其编码的溶菌酶氨基酸序列中出现N-X-S/T序列，从而使溶菌酶表达时发生N-糖基化修饰。

hLYZ突变体的氨基酸序列见SEQ ID No.2。

pPICZαA-hLYZ载体构建、酵母感受态细胞制备、目的基因的转化、重组菌的诱导表达、蛋白的纯化及浓缩、蛋白的WB鉴定(图16)、糖基化分析、活性分析等方法同实施例1。

实施例5：不同修饰的甘露糖化溶菌酶的胞内抑菌作用

选择结核分枝杆菌(ATCC27294)(国家菌种保藏中心)，用生理盐水调整菌浓度为10⁵个/mL，然后分别与无抗性1640培养基培养的巨噬细胞RAW264.7孵育2h。生理盐水清洗3次，然后换新鲜培养基分别加入等量浓度为1mg/mL的GS115表达的甘露糖化hLYZ(实施例1)，GJK0601表达的甘露糖化hLYZ(实施例3)和GJK0601表达的甘露糖化hLYZ突变体(实施例4)，以无糖基化修饰的溶菌酶(购自sigma公司)作为阴性对照，在37℃孵育，每隔30min取一孔进行细胞裂解后，用罗氏平板培养和菌落计数，并根据计数结果制备抑菌曲线，结果见图17。由图中可以看出，具有甘露糖基化修饰的溶菌酶都可以抑制结合分枝杆菌的生长。

Claims (1)

1.具有甘露糖化修饰的溶菌酶在体外杀死胞内菌中的应用，所述溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。