CN102586256A - 人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法，载体质粒为pPIC9k，目的蛋白为45个氨基酸，导入前采用SacI酶对重组质粒进行线性化。该生产工艺可使人β-防御素3基因在甲醇诱导启动子的驱动下获得高水平表达，并将人β-防御素3表达产物分泌到发酵液培养基中，为人β-防御素3更大规模工业化生产提供可靠的实验依据。
Description
技术领域
本发明公开了一种人β-防御素3的表达方法，特别是指一种在酵母菌表达系统中表达人β-防御素3的方法。
背景技术
防御素是抗菌肽家庭中最大的亚家族，是生物体内产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成部分，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统。截止目前研究发现防御素的种类有：哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素；而根据二硫键的位置，连接上的差异以及前体和表达方式不同，防御素又分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3类。
人β-防御素3（human β-defensin-3，hBD-3）是2001年Harder等在银屑病患者皮损组织中发现的防御素β家族抑菌活性最高的肽。hBD-3是由45个氨基酸组成的小分子多肽，相对分子质量为5154.7，由1个α螺旋和3个反向平行的β折叠片层组成，同时有一个短螺旋环在氨基末端区域形成。hBD-3由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，其连接方式为2～4、1～5、3～6。3个反向平行的β折叠片层通过17～19、27～31、39～43残基形成。hBD-3是两亲结构，包括疏水端和亲水端，疏水端聚集在肽表面的底部，正电荷在它的表面两端是不对称分布的。
相较于其他β防御素而言，人β-防御素3的功能性更广：（一）显著的抗细菌、抗真菌及抗病毒的活性，且抑菌浓度比已经观察到的防御素家族的其他成员更低；（二）在连接先天和获得性免疫应答中起到重要的桥梁作用；（三）诱导专职抗原递呈细胞产生和活化，有望成为疫苗佐剂；（四）其抗菌活性是非盐离子浓度敏感性的，不易引起溶血。在滥用抗菌药物，细菌耐药性问题日益严重的今天，人β-防御素3因具有高效杀菌、不易产生耐药性突变、无毒、适用性广、性能稳定等优点，有望代替传统的抗生素，开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒和抗癌的药物，应用开发前景广阔。
但是，要将人β-防御素3真正应用于生产实践，必须首先建立成本低廉、高效稳定的制备工艺，解决工业批量化生产问题。目前，防御素主要通过以下3种途径获得：（1）诱导生物体分泌表达后分离纯化；（2）化学合成；（3）构建防御素基因工程菌株。但天然存在的防御素产量很低，无法从动植物体内大量提取，且分离纯化具有抗菌活性的组成无疑是一件非常繁琐的工作；而化学合成防御素也存在成本高，大批量生产困难的弱点，因此，前2种方法无法满足防御素工业化生产的需求。相较而言，以工程菌工业化发酵生产防御素，可大规模生产，其生产周期短、生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境影响，因而探索适当的防御素诱导途径成为该领域研究的焦点。有许多实验对不同来源的防御素进行了重组表达尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统等。
自基因工程等生物技术发展以来，国内外学者对借助于基因工程菌制备人β-防御素3展开了广泛的研究，包括基因的获取、使用受体菌偏好基因人工合成基因、表达载体的构建、以及采用融合蛋白策略实验人β-防御素3在大肠杆菌的高效表达。黄蓬亮（黄蓬亮, 赵亚华, 许少鹏. 人β防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定. 生命科学研究, 2005, 9(2): 129-133）等根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用偏好合成了人β-防御素3，在大肠杆菌中诱导表达成功。李春丽等（李春丽, 何国庆, 崔淑贞. 人β防御素3基因的合成及其克隆. 河南农业大学学报, 2005, 39(3): 282-285）根据已知人β-防御素3的成熟区氨基酸序列和酵母密码子的偏好，人工合成人β-防御素3基因，并成功构建真核表达载体pPIC9k-hBD-3。庹晓晔等（庹晓晔, 徐明达, 陈璧, 等. 人β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析[J]. 军事医学科学院院刊, 2004, 28(2): 114–122）构建了人β-防御素3基因真核表达载体并在大肠杆菌中表达成功。李春丽等（李春丽, 徐雪丽, 郑振宇, 等. 人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表达菌的诱导条件优化及其活性分析. 生物工程学报, 2008, 24(3): 485-490）对人β-防御素3和植物甜蛋白 des-pGlu1-Brazzein 嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG诱导表达条件进行了研究，经优化目的蛋白表达量占总蛋白的35%左右。何国庆等（何国庆, 李春丽, 阮晖等. 人β防御素3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达. 农业生物技术学报, 2005, 13(2): 217-220）嵌合人β-防御素3与植物甜蛋白Brazzein基因，在大肠杆菌中诱导表达后，目的蛋白约占总蛋白的30%。
然而，用大肠杆菌表达体系所表达的防御素常常无生物活性。大肠杆菌表达体系虽具有一定简易性和大众性，但仍有一些缺陷：1) 缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程，二硫键无法正确形成，影响了蛋白的正确折叠，表达后的抗菌肽活性受到影响；2) 表达的蛋白质多以包含体形式存在，防御素的纯化和回收，不仅增加成本，而且影响防御素的生物活性；3) 杂蛋白多，纯化步骤复杂等。
本发明针对目前尚未有人β-防御素3在真核表达系统中成功表达的报道和现有重组技术制备技术的不足，提供了一种低成本、高效率制备人β-防御素3的方法。
发明内容
本发明的目的是公开一种在酵母菌系统中表达人β-防御素3的方法，使人β-防御素3基因在甲醇诱导启动子的驱动下获得高水平表达，并将人β-防御素3表达产物分泌到发酵液培养基中。
本发明的人β-防御素3的表达方法是通过如下技术方案来实现的。
采用受体菌GS115、载体质粒pPIC9k；目的蛋白的45个氨基酸的基因片段；重组质粒构建时，质粒pPIC9k的EcoR I和Not I位点间插入该载体质粒的人β防御素3目的基因片段；重组质粒导LiCl法导入受体菌GS115前，采用Sac I酶进行线性化；导入受体菌后，PCR筛选出阳性重组子，再用甲醇诱导培养，表达产物直接分泌到胞外，离心所得到的上清液中即含有表达的蛋白产物——人β防御素3。
人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法，包括以下步骤：
（1）目的基因hBD-3的扩增；
（2）双酶切hBD-3基因与载体pPIC9k，连接构建重组载体，转化宿主菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）；
（3）筛选后的转化子再用甲醇诱导培养，离心所得上清液中即为人β防御素3。
所述甲醇诱导培养是挑取转化子接种于50 mL BMGY液体培养基，30℃、200 r/min振荡培养18h至OD600为2～6，5000 r/min离心5 min收集菌体，菌体用灭菌水水洗两次，将菌体用BMMY液体培养基重悬至OD600值为0.8～1.2，每24h补加甲醇至终浓度为0.5%v/v，28℃，200r/min连续诱导培养5天。
所述BMGY液体培养基为1%wt酵母提取物，2%wt蛋白胨，1.34%wtYNB，0.0004‰wt生物素，100 mM pH 6.0磷酸盐缓冲液，1%wt甘油。
所述转化宿主菌前先将重组质粒用Sac I酶进行线性化。
所述目的基因hBD-3的获取方法是：
设计上游引物为：5’-ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3’，
下游引物为：5’-TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3’；以含hBD-3序列的T载体为模板，PCR扩增出末端带有EcoR I和Not I酶切位点的目的基因， PCR扩增条件如下：94℃变性2 min进入循环，94℃变性30 S，68℃退火50 S，72℃延伸1 min，35个循环后于72℃继续延伸10 min。
所述双酶切所用限制性内切酶为EcoR I和Not I。
所用的宿主为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，购于Invitrogen。
本发明相对于现有技术具有的优点及有益效果。
本发明的人β防御素3表达方法，比之于现有技术，受体菌选用操作简便、快捷，稳定及易高密度发酵特性的毕赤酵母Pichia pastoris作为基因表达宿主，不仅避免了融合蛋白所造成宿主表达潜能浪费，而且免去移除载体蛋白的繁琐程序。而且，本发明所用的表达载体是pPIC9k，其自身所带的信号肽能将表达产物直接分泌到培养上清中，易分离提取，纯化工艺简单，同时也易于检测，为今后的分析研究及工业化批量生产奠定基础。
附图说明
图1：PCR扩增hBD-3基因；
图2：重组表达载体pPIC9K-hBD-3的PCR鉴定；
图3：重组酵母GS115/ pPIC9K-hBD-3的菌落PCR鉴定；
图4：Tricine-SDS-PAGE电泳图谱；
图5：hBD-3对金黄色葡萄球菌的抗菌活性测定；
A1：金黄色葡萄球菌浓度104 cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
A2：金黄色葡萄球菌浓度104 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
B1：金黄色葡萄球菌浓度105 cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
B2：金黄色葡萄球菌浓度105 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
C1：金黄色葡萄球菌浓度106cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
C2：金黄色葡萄球菌浓度106 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
图6：hBD-3对大肠杆菌的抗菌活性测定；
A1：大肠杆菌浓度104 cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
A2：大肠杆菌浓度104 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
B1：大肠杆菌浓度105 cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
B2：大肠杆菌浓度105 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
C1：大肠杆菌浓度106cfu /mL下重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液的抗菌活性；
C2：大肠杆菌浓度106 cfu /mL下宿主菌GS115的培养上清液的抗菌活性；
图7：载体质粒pPIC9K。
具体的实施方式
下面对本发明的人β-防御素3表达方法作进一步具体的描述。本发明的表达方法是在酵母菌系统即巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统生产人β-防御素3，表达出来的蛋白为可溶性分泌型蛋白，分子量约为5KD左右，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑菌活性。
本发明的方法中受体菌是GS115、载体质粒是pPIC9k；目的基因为45个氨基酸对应的核苷酸片段；重组质粒构建时，质粒pPIC9k的EcoR I和Not I位点间插入该载体质粒的人β防御素3目的基因片段；重组质粒导LiCl法导入受体菌GS115前，采用Sac I酶进行线性化；导入受体菌后，PCR筛选出阳性重组子，再用甲醇诱导培养，表达产物直接分泌到培养基中，离心所得到的上清液中即含有表达的蛋白产物——人β防御素3。表达方法的具体步骤如下：
1. 人β-防御素3基因的获取：
根据GenBank公布的序列，设计合成特异性引物，利用革兰阴性菌胞膜外层的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激人支气管上皮细胞造成损伤，上调表达抗菌多肽，提取总RNA，采用RT-PCR和DNA测序等分子生物学技术，获得了hBD-3阅读框的编码序列，并成功将其装入T载体中。经测序对所获得的hBD-3基因序列进行验证。
2. 人β-防御素3基因的扩增
根据已发表的hBD-3基因序列，照表达载体pPIC9K的多克隆位点（图7），选取EcoR I与Not I作为限制性酶切位点，设计了1对引物，上游引物为：
5’- ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA -3，下游引物为：
5’- TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT -3’；
以含以含hBD-3序列的T载体为模板， PCR扩增条件如下：94℃变性2 min进入循环，94℃变性30 S，68℃退火50 S，72℃延伸1 min，35个循环后于72℃继续延伸10 min，得到末端带有EcoR I和Not I酶切位点的138bp目的基因片段。电泳检测如图1所示，泳道1为DNA Marker，泳道2、3在紫外光下可见约150 bp大小的目的条带，与理论相符。
3.重组质粒pPIC9K-hBD-3的构建
将上述PCR产物和pPIC9K载体质粒用EcoR I和Not I双酶切（37℃，2h）后，再T4连接酶（16℃，18h）将目的基因片段插入经双酶切处理的pPIC9K质粒中。将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆；扩增提取重组质粒并经PCR验证，如图2所示，泳道1为DNA Marker，泳道2、3、4在紫外光下可见约150 bp大小的目的条带，为阳性转化子，NC为阴性对照样，无目的条带。再取阳性转化子进行测序，证明目的基因已插入载体pPIC9K的多克隆位点，读码框正确，说明重组质粒pPIC9K-hBD-3构建成功。
4．重组质粒转入毕赤酵母GS115：重组质粒pPIC9K-hBD-3用SacI酶线性化后，使用《毕赤酵母转化手册》LiCl法转入毕赤酵母GS115酵母菌中。
5. 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的筛选
转化结束后，立即吸取200μL涂布于MD平板，28-30℃培养2d。挑选转化子进行菌落PCR，筛选阳性重组酵母，如图3所示，泳道8为DNA Marker，泳道2～7在紫外光下可见约150 bp大小的目的条带，为阳性重组子，1为以GS115作为模板进行菌落PCR的阴性对照样，无目的条带，说明人β-防御素3基因已转入宿主菌GS115，重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-hBD-3构建成功。
6. 重组人β-防御素3的表达
将重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-hBD-3接种于50mL BMGY液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养18h至OD600为2～6，5000r/min离心5min收集菌体，菌体用灭菌水水洗两次，将菌体用BMMY培养基重悬至OD600值为1.0，每24h补加甲醇至终浓度为0.5%（v/v），28℃，200r/min连续诱导培养5d。诱导表达完成后，室温12000r/min×5min离心，取上清，即为人β-防御素3。
7. SDS-PAGE鉴定表达产物
取适量培养上清进行SDS-PAGE电泳，电泳参照《分子克隆手册》选用适于分离分子量在10000Dal以下的小分子多肽的电泳方法——Tricine-SDS-PAGE电泳。
重组酵母菌甲醇诱导表达完后，取其上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色4h，经脱色液脱色后，如图4所示，泳道1为蛋白质Marker，泳道4为重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3，泳道2和3分别为对照样宿主菌GS115和不含目的基因的重组酵母GS115/pPIC9K，泳道4在约5KD处与对照样相比有一明显差异带，与人防御素3的大小相符，经Gene Tools软件分析，重组hBD-3的表达量约为150 mg/L。
8. 人防御素生物活性的测定
融化的营养肉汤琼脂培养基，加入终浓度分别为104、105、106cfu /mL的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，混匀，制成含菌平板。待凝固后，放置牛津杯并注入200μL重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3诱导培养上清液，37℃培养过夜，观察不同菌浓度下抑菌圈的形成，以宿主菌GS115培养上清作为对照。
如图5（金黄色葡萄球菌）和图6（大肠杆菌）所示，标识A、B、C分别代表平板中菌浓度为104 cfu /mL、105 cfu /mL和106 cfu /mL，标识1和2分别代表重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3和宿主菌GS115的培养上清液。重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液在不同的菌浓度下均能产生明显的抑菌圈，其抑菌效果大大优于宿主菌GS115，并且重组酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培养上清液对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的生长均具有不同程度的抑制作用，对浓度为106 cfu /mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长也起到较好的抑制效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcgaattca tgggaatcat aaacacatta caga 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tatagcggcc gcctatttct ttcttcggca gcat 34
Claims (7)
1.人β-防御素3在酵母菌表达系统中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）目的基因hBD-3的扩增；
（2）双酶切hBD-3基因与载体pPIC9k，连接构建重组载体，转化宿主菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）；
（3）筛选后的转化子再用甲醇诱导培养，离心所得上清液中即为人β防御素3。
2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述甲醇诱导培养是挑取转化子接种于50 mL BMGY液体培养基，30℃、200 r/min振荡培养18h至OD600为2～6，5000 r/min离心5 min收集菌体，菌体用灭菌水水洗两次，将菌体用BMMY液体培养基重悬至OD600值为0.8～1.2，每24h补加甲醇至终浓度为0.5%v/v，28℃，200r/min连续诱导培养5天。
3.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述BMGY液体培养基为1%wt酵母提取物，2%wt蛋白胨，1.34%wtYNB，0.0004‰wt生物素，100 mM pH 6.0磷酸盐缓冲液，1%wt甘油。
4.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述转化宿主菌前先将重组质粒用Sac I酶进行线性化。
5.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述目的基因hBD-3的获取方法是：
设计上游引物为：5’-ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3’，
下游引物为：5’-TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3’；以含hBD-3序列的T载体为模板，PCR扩增出末端带有EcoR I和Not I酶切位点的目的基因， PCR扩增条件如下：94℃变性2 min进入循环，94℃变性30 S，68℃退火50 S，72℃延伸1 min，35个循环后于72℃继续延伸10 min。
6.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述双酶切所用限制性内切酶为EcoR I和Not I。
7.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所用的宿主为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。
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