CN100462437C - 利用微生物制备的真菌免疫调节蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一段改良后的核酸分子，该核酸分子转译真菌免疫调节蛋白(FungalImmunomodulatory Protein)，可以在真菌有较佳的表达。本发明还涉及包含该核酸分子的表达载体、该表达载体转形的宿主细胞、表达本发明的蛋白质于此转形宿主细胞的方法、包含本发明蛋白质的宿主细胞的用途及纯化真菌免疫调节蛋白的方法。本发明的蛋白质具有广泛的免疫调节功能(immunomodulatory activity)。因此本发明进一步涉及本发明蛋白质在化妆品或医药组合物的用途及含本发明蛋白质的食品或饲料添加物组合物。最后，本发明涉及个体口服真菌免疫调节蛋白或与真菌免疫调节蛋白融合的蛋白以调节免疫活性的方法。

Description

利用微生物制备的真菌免疫调节蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及一段改良后的核酸分子，该核酸分子转译真菌免疫调节蛋白(FungalImmunomodulatory Protein)，可以在真菌有较佳的表达。本发明还涉及包含该核酸分子的表达载体、此表达载体转形的宿主细胞、表达本发明的蛋白质于此转形宿主细胞的方法、包含本发明蛋白质的宿主细胞的用途及纯化真菌免疫调节蛋白的方法。本发明的蛋白质具有广泛的免疫调节功能(immunomodulatory activity)。因此本发明进一步涉及本发明蛋白质在化妆品或医药组合物的用途及含本发明蛋白质的食品或饲料添加物组合物。最后，本发明涉及个体口服真菌免疫调节蛋白或与真菌免疫调节蛋白融合的蛋白以调节免疫活性的方法。

背景技术

在植物或蕈类植物的子实体或菌丝体有些亲醣蛋白质(Lectin)，在医学报导上有免疫调节(Immunomodulatory)及保护肝脏(Hepatoprotective)的活性，可能具有清除自由基的功能(Lin J.M.et al.，Am J Chin Med.1993；21(1)：59-69)。由桑寄生(mistletoe)植物分离出的亲醣蛋白β-半乳糖苷(β-galactoside)为专一性的亲醣蛋白，不论在活体外(In vitro)及活体中(In vivo)皆会促进细胞激素(cytokine)的增生(Gabius H.J.et al.，Anticancer Res.1992 May-Jun；12(3)：669-75)。在以Balb/C小鼠作为疾病模式测试中，亲醣蛋白质及重组亲醣蛋白质都可抑制肿瘤的形成。(Couraud P.0.et al.，J.Biol.Chem.1989；264：1310-1316)。

灵芝(Ganoderma)是很有经济价值的中药，灵芝的种类很多例如：灵芝(G.lucidum)(红色)，树舌灵芝(G.applanatum)(棕色)，松衫灵芝(G.tsugae)(红色)，紫灵芝(G.sinense)(黑色)及灵芝(G.oregonense)(暗棕色)。

一些食用菇类，例如灵芝、草菇及金针菇中所纯化的蛋白质中皆具有类似的氨基酸序列及免疫调节功能，这类蛋白质被命名为真菌类免疫调节蛋白(Fungal ImmunomodulatoryProtein)简称FIP(Ko J.L.，Eur.J.Biochem.1995；228：224-249)。图3为三种真菌类免疫调节蛋白氨基酸序列的比较。其中尤以灵芝最具代表性。灵芝为健康食品中的一员，对维持人体健康有莫大助益。

过去研究发现灵芝具有抗过敏性(Chen H.Y et al.，J.Med.Mycol.1992；33：505-512)、保护肝脏功能(Lin J.M.et al.，Am J Chin Med.1993；21(1)：59-69)、抗肿瘤及增强免疫功能，但大多局限于粗萃取物(Horner W.E.et al.，Allergy 1993；48：110-116)或小分子化合物方面研究(Kawagishi H.，et al.，Phytochemistry 1993；32：239-241)。日本明治制药则从灵芝纯化出免疫调节蛋白(LZ-8)，发现具有抑制全身过敏反应、治疗肝癌及预防糖尿病等功能(Kino K.et al.，J.Biol Chem.1989；Jan 5；264(1)：472-8)。柯(1995)亦从另一可食用的菇类--金针菇中获得免疫调节蛋白(FIP-fve)；发现该蛋白质与LZ-8及免疫球蛋白的重链区的蛋白结构有相当程度的相似性，在老鼠足趾肿胀实验中发现有抑制全身性过敏反应，因此得知这类蛋白质具有免疫调节活性，其调节机制为促进IFN-γ，IL-2及TNF-α基因的转录作用。(Ko J.L.，Eur.J.Biochem.1995；228：224-249)。

面包酵母菌是最安全的食品微生物，也是近代研究遗传、生理代谢及分子生物学的主要模式细胞。由于其安全性高于其它微生物，除了传统运用于食品加工(如面包、酒类)外，近年来面包酵母菌遗传工程系统已被成功应用于药用蛋白质的生产，如水蛭素(Hirudin)、血红蛋白(Hemoglobin)、尿激酶(Urokinase)、人类血清蛋白(human serum albumin，HAS)、似胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-l，IGF-I)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、B型肝炎疫苗等(Romanos M.A.et al.，Yeast 1992；8：423-488)。可依异源蛋白质的特性，选择适当的宿主系统(食品及药品级蛋白质以面包酵母Saccharomyces cerevisiae为主)。

在现阶段可以利用许多复杂的萃取方法从灵芝中获得灵芝免疫调节蛋白(美国专利第5334704号)。然而由于灵芝只长在自然环境中，且多生长于高山的老树上，因此灵芝的产量无法稳定提供大量高品质的灵芝免疫调节蛋白供研究使用。在本发明之前亦未曾有大量制备灵芝免疫调节蛋白的发明。

先前的研究(美国专利第5334704号)利用萃取纯化的方法生产灵芝免疫调节蛋白的产量并不好。若直接利用大肠杆菌生产，则有内毒素(endotoxin)的问题，必须花费高额经费来纯化，从而造成成本的增加。利用哺乳类细胞生产所需成本甚高，亦有病毒或朊毒体(prion)污染的危险。

在先前的研究中(美国专利第5334704号)公开了从灵芝(Ganoderma)分离的醣蛋白具有免疫调节活性。该发明指出，此醣蛋白的制备可以直接培养灵芝(Ganoderma)菌丝(mycelia)，再从菌丝萃取并得到一水溶液，自此萃取物纯化出该醣蛋白。因为醣蛋白纯度要求很高，该专利的技术要用在工业的应用上是很困难。

发明内容

发明摘述

本发明提供一种核酸分子，包含图1(I)所示的核酸序列。

本发明还提供表达载体及该载体转形的宿主细胞。

本发明另提供制备含灵芝免疫调节蛋白的宿主细胞的方法。

本发明另提供依此方法所制备的灵芝免疫调节蛋白。

本发明另提供含灵芝免疫调节蛋白的宿主细胞的用途。

本发明另提供由该表达载体所转形的宿主细胞纯化灵芝免疫调节蛋白的方法。

本发明另提供含本发明灵芝免疫调节蛋白的组合物。该组合物能应用于化妆品、医药品、食品及饲料添加物。

本发明另提供给个体口服灵芝免疫调节蛋白或与真菌免疫调节蛋白融合的蛋白以调节免疫活性的方法。

发明详述

由于面包酵母菌与灵芝同属真菌类，故酵母菌能较忠实地表达来自灵芝的异源蛋白质，包括蛋白质的生物活性及各种蛋白质修饰作用(如醣化作用，及双硫链的形成)。

本发明中灵芝免疫调节蛋白酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)喜好密码子的DNA核酸序列(SEQ ID NO：1)如下：

ATGTCTGATAC  TGCTTTGATT  TTCAGATTGG  CTTGGGATGT

TAAGAAGTTG   TCTTTCGATT  ACACTCCAAA  CTGGGGTAGA

GGTAACCCAA   ACAACTTCAT  TGATACTGTT  ACTTTCCCAA

AGGTTTTGAC   TGATAAGGCT  TACACTTACA  GAGTTGCTGT

TTCTGGTAGA   AACTTGGGTG  TTAAGCCATCT TACGCTGTT

GAATCTGATG   GTTCTCAAAA  GGTTAACTTC  TTGGAATACA

ACTCTGGTTA   CGGTATTGCT  GATACTAACA  CTATTCAAGT

TTTCGTTGTT   GATCCAGATA  CTAACAACGA  TTTCATTATTG

CTCAATGGA    ACTGA

本发明提供的核酸分子能衔接一段胞外分泌的讯息序列，可以让宿主细胞生产的灵芝免疫调节蛋白直接分泌到细胞外的培养液中，从而使得纯化分离时可以降低成本。

本发明提供的核酸分子与其它基因的核酸分子连接形成一新的核酸序列。此新的核酸序列可以表现在一表现系统中。而由此新的核酸序列产生新的重组蛋白(fusion protein)不只具有灵芝免疫调节蛋白原有的免疫调节能力，也同时具备表现另一个基因的特性(Weisbart RH，Cancer Lett.2003；195(2)：211-9.)。因为灵芝免疫调节蛋白在消化系统中仍保有生物活性，利用灵芝免疫调节蛋白与另一个蛋白质作为融合蛋白(fusionprotein)，灵芝免疫调节蛋白可以作为一种携带系统(delivery system)，将另一个蛋白质带到标的细胞产生该蛋白的生物活性。此外口服该融合蛋白，也能使组成融合蛋白质的蛋白质皆发挥其功能。

本发明提供—载体，该载体包含本发明的核酸分子。此载体可以转形至宿主细胞。视应用于不同状况及用途，该载体可以是环状(circular)或嵌入(integrated)的质粒。

本发明提供被上述表达载体转形的宿主细胞。此宿主细胞可以是细菌、真菌细胞或酵母菌细胞。此宿主细胞可以是完整的或打破的细胞形式。

此宿主细胞可以是面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、麦牙糖念珠菌(Candida maltosa)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，西方酵母(Schwanniomyces occidentalis)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)，球拟酵母属(Torulopsis)，(Arxula adeninivorans)，或曲霉属(Aspergillus)(构巢曲霉.(A.nidulans)，黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，米曲菌(A.oryzae))，木霉(Tricoderma)(里氏木霉(T.reesei))。植物细胞也可当作是一种宿主细胞。

本发明提供一个制备含灵芝免疫调节蛋白宿主细胞的方法。此方法包括(a)构筑一个含改良后灵芝免疫调节蛋白基因序列的表达载体，(b)利用此表达载体转形到一个宿主细胞内，(c)使用适当的培养方法，使宿主细胞可以表达产生蛋白质。本发明所指蛋白质序列在图3。本发明所指宿主细胞可为面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)，麦牙糖念珠菌(Candida maltosa)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，西方酵母(Schwanniomycesoccidentalis)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)，球拟酵母属(Torulopsis)，(Arxula adeninivorans)，或曲霉属(Aspergillus)(构巢曲霉.(A.nidulans)，黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，米曲菌(A.oryzae))，木霉(Tricoderma)(里氏木霉(T.reesei))。植物细胞也可当作是一种宿主细胞。在步骤b与c中，最适的宿主细胞为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在(b)所指的表达载体为pYB101FIP-yeast或pYB101FIP-lz(图4(II)及图4(III))。所指具体的表达蛋白质真菌喜好密码子的核酸序列说明见图1(I)，为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)喜好的密码子的DNA核酸序列。真菌喜好密码子的核酸序列是取决于其在转译(translation)时tRNA转译的速率(Sorensen MA，Pedersen S.J Mol Biol.1991；222(2)：265-80)。

本发明提供含灵芝免疫调节蛋白宿主细胞的应用。例如包含有灵芝免疫调节蛋白完整细胞的酵母菌，可以直接以口服方式施用并可以在生物体中发挥生物活性，不用任何纯化的步骤，从而减少生产上的成本。

本发明提供一种从转形的宿主细胞中纯化出灵芝免疫调节蛋白的方法。此方法包含(a)将发酵后的细胞溶于一溶剂中；(b)打破细胞；(c)调整pH值到4-5之间；(d)去除细胞破片；(e)上清液离心去除大的杂质；(f)将上清液加入已经平衡好pH值(4-5)的管柱中；(g)析出灵芝免疫调节蛋白。其中纯化步骤中的(a)用5-50mM磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer)pH7.0，以1:5-1:20比例加入发酵后的细胞；(b)以破菌机进行破菌；(c)调整pH值到4-5之间；(d)3,000xg离心15分钟，去除细胞破片；(e)12,000xg离心1分钟，去除大的杂质；(f)将上清液加入已平衡pH值为4-5的CM Sepharose管柱中(AmershamBiosciences)；(g)以20-50mM pH4-5的醋酸析出灵芝免疫调节蛋白。

本发明也提供由此方法制备的灵芝免疫调节蛋白。

本发明提供有关纯化的灵芝免疫调节蛋白或含灵芝免疫调节蛋白宿主细胞的服用途径。服用方式可以是用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、口服、经黏膜层吸收、皮肤接触吸收或以浸泡于液体中的形式或其它可应用的传递(delivery)路径。而其中以口服应用方式为优先考虑方法。应用在淡水或海水动物，如鱼类时，也可以浸泡在含有灵芝免疫调节蛋白的液体中，通过鳃吸附到鱼体内。

本发明提供的纯化的灵芝免疫调节蛋白或含灵芝免疫调节蛋白宿主细胞可以广泛使用于哺乳类、鱼类、甲壳类及畜产、家禽类。这里所指的哺乳类及家禽类为猪、鸡。所指鱼类是石斑鱼、鲑鱼、鳟鱼。所指甲壳类是虾、龙虾、草虾、斑节虾、白虾。

本发明提供口服包含本发明灵芝免疫调节蛋白组合物的应用而达到免疫调节的功能。此灵芝免疫调节蛋白可以是从灵芝制备出来或由本发明所公开的方法而来。基于灵芝免疫调节蛋白的相关研究指出，在医药上使用可以减少发炎、降低及避免过敏反应、调节免疫力、预防糖尿病、改善气喘、抗病毒及细菌的感染及抗器官排斥。应用于食品或饲料的添加上，可以延长生命、增进免疫调节活性、饲料转换率以及降低紧迫所引起的免疫反应(Black PH，Brain Behav Immun.2003 Oct；17(5)：350-64.)。

本发明提供的灵芝免疫调节蛋白可以以直接口服的使用方式来调节免疫失调的疾病。灵芝免疫调节蛋白可以是从大肠杆菌(E.coli)或真菌例如面包酵母菌(Saccharomycescerevisiae)制备获得。

本发明提供一种免疫学试验，例如西方墨点法(Western blot)或酶联免疫吸附反应(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA))用来检测中药(如灵芝)、食品、饮料、化妆品、饲料添加物、药物或其它含真菌免疫调节蛋白组合物的含量，作为各产品中真菌免疫调节蛋白含量的检验基准。(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，pp：18.60-18.75.)。

包含本发明蛋白质的组合物会包含其它先前技术所知的所有剂型的添加物质，这些添加物质包括适合口服使用的甜味剂(sweetener)、填充物(thickener)及调味物质(flavoring agent)等。

本发明组合物的适当剂量依照疾病的类型、严重程度及时期(stage)而定，也因病人的差异而不同。确定适当的剂量一般须衡量本发明治疗所带来的好处与本发明治疗所产生的危险或对身体身心有害副作用的平衡。

附图说明

图1(I)为本发明利用基因合成灵芝免疫调节蛋白的改良成面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)所喜好的密码子，FIP-yeast；

图1(II)为灵芝(Ganoderma lucidium)原有的密码子的基因序列，FIP-lz。

图2为本发明利用基因合成灵芝免疫调节蛋白基因，其中图2(I)为酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)喜好的密码子所需的正向及反向引物，图2(II)为灵芝(Ganoderma lucidium)原有的密码子所需的正向及反向引物。

图3为灵芝(Ganoderma lucidium)，松衫灵芝(Ganoderma tsugae)和Flamnulinavelutips的氨基酸序列比较。粗体字表示三者相同的氨基酸。

图4为(I)pYB101(II)pYB101-FIP-yeast(III)pYB101-FIP-lz三种质粒构筑图。

图5为酵母菌(DY150或BY4741)所表达灵芝免疫调节蛋白的含量。其中图5(I)表示以pYB101-FIP-yeast表达载体进行转形；图5(II)表示以pYB101-FIP-lz表达载体进行转形。图中，M表示蛋白质分子量标准品：175，83，62，47.5，32.5，25，16.5及6.5Kd。S表示由转形的大肠杆菌所制备的灵芝免疫调节蛋白标准品。第1-2道表示pYB101-FIP-yeast表达载体所转形DY150酵母菌的两个转形株，第3-4道表示pYB101-FIP-yeast表达载体所转形BY4741酵母菌的两个转形株，第5-6道表示pYB101-FIP-lz表达载体所转形BY4741酵母菌的两个转形株，第7-8道表示pYB101-FIP-lz表达载体所转形DY150酵母菌的两个转形株。

图6为胞外表达灵芝免疫调节蛋白的核酸序列及限制酶位置，其中(I)为正向引物，(II)为反向引物。

图7为pYB101s及pYB101s-FIP载体所包含的α-因子领导序列的核酸序列及限制酶位置。限制酶位置以粗体字标示。α-因子领导序列及灵芝免疫调节蛋白基因以箭头表示。

图8为pYB101s质粒(I)及pYB101s-FIP质粒(II)构筑图。

图9为pYB101s-FIP转形BY4741所胞外表达出来的灵芝免疫调节蛋白。其中，M表示蛋白质分子量标准品：175，83，62，47.5，32.5，25，16.5及6.5Kd.S表示由转形的大肠杆菌所制备的灵芝免疫调节蛋白标准品。第1-3道表示半乳醣诱导后第一、第二及第三天pYB101s-FIP转形BY4741的表达量。

图10为不同灵芝免疫调节蛋白制备下，用不同浓度的蛋白质与人类周边血细胞(PBL)一起培养下，人类周边血细胞产生IFN-r的量。blank表示PBS对照组。Batchl表示第一次50升发酵产程破菌后的上清液。Batch2表示第二次50升发酵产程破菌后的上清液。Yeast表示一般市售酵母粉，经破菌后的上清液。PHA表示植物血凝素(phytohemagglutinin)。

图11(I)为灵芝免疫调节蛋白在

KTA^TM explorer 10S system的纯化分析图，F3、F4及F5为第三、第四及第五管收集样品。

图11(II)通过

KTA^TM explorer 10S system纯化出的灵芝免疫调节蛋白的SDS-PAGE电泳图。M表示蛋白质分子量标准品：175，83，62，47.5，32.5，25，16.5及6.5 Kd.STD表示由转形的大肠杆菌所制备的灵芝免疫调节蛋白标准品。F3、F4及F5为第三、第四及第五管收集样品。

图12为含灵芝免疫调节蛋白的酵母菌进行50L发酵槽发酵，以西方墨点法检测灵芝免疫调节蛋白的产量结果。M表示蛋白质分子量标准品；S表示由大肠杆菌生产的灵芝免疫调节蛋白质纯化标准品。

图13为不同浓度纯化的灵芝免疫调节蛋白对石斑鱼头肾细胞的NBT分析结果。Cont表示PBS对照组。

图14为腹腔注射不同浓度灵芝免疫调节蛋白于石斑鱼腹腔内，再将石斑鱼感染红彩病毒观察其死亡率。PBS表示注射病毒前腹腔注射0.1ml的PBS，0.25μg/0.1ml表示注射病毒前腹腔注射0.25μg/0.1ml的纯化灵芝免疫调节蛋白，1μg/0.1ml表示注射病毒前腹腔注射1μg/0.1ml的纯化灵芝免疫调节蛋白，5μg/0.1ml表示注射病毒前腹腔注射5μg/0.1ml的纯化灵芝免疫调节蛋白。

图15为喂食石斑幼鱼含灵芝免疫调节蛋白的酵母菌后，将石斑幼鱼感染弧菌，观察石斑幼鱼的存活率。PBS表示磷酸盐缓冲剂对照组。20mg、4mg、0.8mg表示弧菌接种前给石斑鱼喂食上述剂量含灵芝免疫调节蛋白的酵母菌。Control表示给石斑鱼喂食20mg一般市售酵母菌。

图16为将Derp处理过已致敏过的Balb/c小鼠，取出该小鼠脾脏细胞，再利用灵芝免疫调节蛋白或Der p萃取物来再次刺激，观察脾脏细胞其IFN-r的产量。FIP-gts表示灵芝免疫调节蛋白。Der p表示尘螨过敏原(der p2)。Control表示PBS对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例一：pYB101-FIP-yeast和pYB101-FIP-LZ表达载体的制备

1.FIP-yeast和FIP-lz的DNA和引物核酸序列的制备：

参照已知方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991 May15；88(10)：4084-4088)，以基因合成的方式来合成不同密码子喜好的灵芝免疫调节蛋白DNA核酸序列，如图1(I)为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)喜好的密码子的DNA序列FIP-yeast；图1(II)为灵芝(Ganoderma lucidium)原始密码子的DNA序列FIP-lz。依据已知方法(J.Biol.Chem.266(4)，2486-2493(1991))，利用已知的灵芝免疫调节蛋白基因序列，分别设计出不同密码子喜好的核酸序列，并依照这两种不同密码子喜好的核酸序列，订购所需的DNA正向引物及反向引物(Mission biotech，Taiwan)，并在基因两侧设计要接入表达载体的限制酶切割位DNA序列(PmlI and BamHI)的引物，见图2(I)和图2(II)，而后进行DNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction)，最后经定序(Mission biotech Co.，Ltd.，Taiwan)确定，便完成两种不同喜好密码子的灵芝免疫调节蛋白的基因合成。

2.pYB101，pYB101-FIP-yeast和pYB101-FIP-LZ质粒的构筑：

如图4所示，将半乳糖启动子(galactose promoter)、营养缺陷筛选基因Ura3及2μori酵母菌的增殖起点(replication origin)加入pYB质粒中(Yeastern Biotech Co.，Ltd，Taiwan)即完成pYB101(I)。并可以被转形应用于一般面包酵母(例如：BY4741或DY150)。

表达载体pYB101及上述合成好的不同喜好密码子的基因片段各以适当DNA限制酶(Bam HI和Pml I，New England Biolabs，USA)一起作用。各将经限制酶作用过后的DNA溶液，经过纯化DNA管柱(PCR Cleaning Up Purification Kit，Viogene，Taiwan)纯化出两种不同喜好密码子合成的灵芝免疫调节蛋白基因DNA及表达载体DNA。再将DNA浓度调成分子摩尔数比为3：1(合成基因：载体)，经T₄DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，USA)进行灵芝免疫调节蛋白DNA及酵母菌表达载体DNA的连接(ligation)。分别命名为pYB101-FIP-yeast(酵母菌喜好的密码子，(II))及pYB101-FIP-LZ(灵芝原始密码子，(III))。

3.pYB101-FIP-yeast或pYB101-FIP-LZ转形至大肠杆菌中：

参照已知方法(Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，，pp：1.82-1.84)分别将pYB101-FIP-yeast或pYB101-FIP-LZ转形至大肠杆菌DH5 α中。使用市售DNA萃取试剂(Mini-M Plasmid DNA Extraction Kit，Viogene，Taiwan)，可由转形至大肠杆菌中得到大量pYB101-FIP-yeast及pYB101-FIP-LZ。

实施例二：小量生产FIP-yeast及FIP-LZ

1.分别将pYB101-FIP-yeast和pYB101-FIP-LZ表达载体DNA转形至面包酵母(BY4741或DY150)中：

将实施例一所获得的两种不同喜好密码子的灵芝免疫调节蛋白表达载体DNA(pYB101-FIP-yeast与pYB101-FIP-lz)各1μg及面包酵母(BY4741或DY150)与酵母菌转形试剂一起作用(Yeast Transformation Kit，Yeastern Biotech Co.，Ltd.，Taiwan)。

2.利用营养需求筛选正确的转形面包酵母菌株：

根据BY4741及DY150营养缺陷上的特性(BY4741：MATa his3deltal leu2deltaOmet15deltaO ura3deltaO。DY150：MATa ura3-52 leu2-3 112 trpl-1 his3-11 15 ade2-1canl-100)，上述各个转形酵母菌平均涂抹在YNBD培养基上培养(0.17％ Bacto不含氨基酸的酵母氮基(Difco，England)、0.5％硫酸铵、2％葡萄糖，2％琼脂，(Sigma，USA))。因此分别在YNBD培养基上事先还需要加入0.0024％组氨酸、0.0072％亮氨酸、0.0012％蛋氨酸(BY4741)或0.0072％亮氨酸、0.0048％色氨酸、0.0024％组氨酸、0.0024％腺嘌呤(DY150)(Sigma，USA)，置于30℃培养箱中培养2-3天。因为尿嘧啶(uracil)并未添加在培养基中，因此未转形带有上述表达载体的酵母菌株，无法自行产生尿嘧啶(uracil)而会死亡。本试验利用营养需求筛选正确带有表达载体的转形面包酵母菌株。

3.带有灵芝免疫调节蛋白转形面包酵母的小量摇瓶测试：

将上述利用营养需求筛选出正确的带有灵芝免疫调节蛋白转形面包酵母菌株，各取两株菌，点菌至50ml的YNBD培养液及缺陷株所需的相关药品(实施例二：步骤2)中，培养温度为30℃，250rpm的转速进行培养3天，而后离心菌液，用YNB培养液清洗三次去除葡萄糖，再以50ml的YNBG培养液(0.17％ Bacto不含氨基酸的酵母氮基、0.5％硫酸铵、2％半乳糖(Sigma，USA))及缺陷株所需的相关药品(实施例二：步骤2)，将菌的浓度调成0.1 0D_600nm，以培养温度为30℃、250rpm的转速进行培养，再利用分光光度计(Spectrophotometer)(Ultrospec 2100 pro，Amersham pharmacia biotech，USA)，每日记录0D_600nm并收集1ml酵母样品经过10,000x rpm离心(Microfuge 18 Centrifug，BechmanCoulter，USA)，水洗三次后将酵母菌菌体保存在-20℃中。

实施例三：利用西方墨溃法(Western Blot)定量转形的面包酵母表达灵芝免疫调节蛋白质：

1.将上述收集后的酵母菌样品以PBS(Sigma，USA)将菌体稀释成0.5 0D_600nm，溶于2x SDS样品缓冲液(sample buffer)(Sigma，USA)后，100℃下加热三分钟，冷却后每个稀释样品取10μl并以100伏特进行SDS-PAGE电泳，待电泳至适当位置后即完成电泳(Nature(1970)227，680-685)。

2.西方墨渍法方式(参考Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，，pp：18.60-18.75)：将胶体上蛋白质转渍到PVDF膜(Hybond-P，Amersham Bioscience，USA)上，通入50mA电流直到蛋白质皆转渍到转渍试纸上，再将转渍试纸取出，加入阻断缓冲液(blocking buffer)以37℃作用一小时，而后在4℃作用隔夜，将阻断缓冲液倒掉，加入10^-4稀释兔子抗灵芝免疫调节蛋白血清(Taiwan Advance Bio-PharmInc.，Taiwan)，以37℃作用一小时后去上清液并经清洗缓冲液(washing buffer)洗过，再加入10^-4稀释含HRP标示的老鼠抗兔子血清的抗血清(Sigma，USA)，以37℃作用一小时后去上清液并经清洗缓冲液洗过，加入呈色液TMB(sigma，USA)，待出现颜色即可用水终止呈色反应，完成西方转渍法测试。结果见图5。

由图5(I)及图5(II)得知，M表示蛋白质分子量标准品，S表示由大肠杆菌生产的灵芝免疫调节蛋白质纯化标准品，1-4群为改良灵芝免疫调节蛋白质的密码子所表达的灵芝免疫调节蛋白质。2-5群为原灵芝免疫调节蛋白质的密码子所表达的灵芝免疫调节蛋白质。如图5(I)所示，1-3群清楚可见灵芝免疫调节蛋白表达，而5-8群无法侦测生灵芝免疫调节蛋白。此结果显示，改良灵芝免疫调节蛋白质的密码子能在酵母菌中高度表达出来。

实施例四：构筑表达载体pYB101s-FIP

1.构筑FIP

根据实施例三的结果选择酵母菌喜好密码子的FIP核酸序列作为外泌生产基因的模板(template)，并选择BY4741作为外泌生产的宿主细胞。

2.制备FIP引物

根据实施例三的结果及步骤选择酵母菌喜好密码子的FIP作为模板DNA(序列见图1(I))，依照此模板DNA设计并购买两端接入pYB101s表达载体(Yeastern Biotech Co.，Ltd.Taiwan)的正向引物及反向引物(图6(I及II))(Mission Biotech Co.，Ltd.Taiwan)。以酵母菌喜好密码子的FIP做为模板DNA(pYB101-FIP-yeast)，及上述正向引物及反向引物利用PCR反应合成灵芝免疫调节蛋白基因的DNA片段。

3.构筑pYB101s及pYB101s-FIP

将半乳糖启动子(galactose promoter)、α-因子领导序列(图7)、营养缺陷筛选基因Ura3及2μ ori酵母菌的增殖起点(replication origin)加入pYB质粒中(YeasternBiotech Co.，Ltd，Taiwan)即完成pYB101s(图8(I))。并可以被转形应用于一般面包酵母(例如：BY4741)。

根据实施例一的步骤构筑pYB101s-FIP表达载体，如图8所示。利用DNA定序确定整个基因序列(Mission Biotech Co.，Ltd.Taiwan)。

4.pYB101s-FIP转形至大肠杆菌中

根据实施例一的步骤将pYB101s-FIP表达载体转形至DH5α中。抽取大量pYB101s-FIP表达载体的DNA。

实施例五：制备小量灵芝免疫调节蛋白

1.将pYB101s-FIP转形至酵母菌BY4741中

根据实施例二的步骤将上述抽出的pYB101s-FIP表达载体DNA转形至烘焙酵母(Baker’s Yeast)BY4741中。

2.利用营养需求筛选正确的转形面包酵母菌株：

根据实施例二的步骤将上述含pYB101s-FIP表达载体的正确转形株从YNBD琼脂(含0.0024％组氨酸，0.0072％亮氨酸，0.0012％蛋氨酸)中挑出。

3.带有灵芝免疫调节蛋白转形面包酵母的小量摇瓶测试：

根据实施例二的步骤将上述含pYB101s-FIP表达载体的正确转形株接种至50ml的培养液中。利用半乳醣(galactose)诱导(induction)生产出外泌的灵芝免疫调节蛋白，并且每日收集样品。

实施例六：利用SDS-PAGE法测试转形的面包酵母表达灵芝免疫调节蛋白质产量：

根据实施例二的步骤将上述收集的样品进行SDS-PAGE。而后再将此SDS-PAGE利用考麻萨亮蓝(Coomassie brilliant blue)G-250(sigma)进行染色30分钟，用去染液(destainsolution，20％甲醇，10％乙酸)退色至蛋白质带(protein band)清晰可见(见图9)。

实施例七：50升发酵产程

1.接种50ml锥形瓶培养：

上述实施例二中，挑选经西方墨点法确定具有灵芝免疫调节蛋白产量的转形面包酵母一株(BY4741/pYB101-FIP-yeast)接种至50ml的YNBD培养基中，加入各缺陷株所需的相关药品(实施例二：步骤2)，以30℃、250rpm转速培养24小时。

2.接种500ml锥形瓶培养：

将上述培养后的50ml菌液接种至同样的450ml的培养液中，以30℃、250rpm转速培养24小时。

3.接种至50升发酵槽(Chuan Tai Factory，Taiwan)进行发酵：

将上述培养后的500ml菌液以利用离心方式，并用YNB培养液清洗三次去除葡萄糖，再以50升的YNBG培养液(0.17％ Bacto不含胺基酸之酵母氮基，0.5％硫酸铵，2％半乳糖(Sigma，USA))及缺陷株所需的相关药品(实施例二：步骤2)，将菌的浓度调成0.10D_600nm以培养温度为25-30℃、400-500rpm转速、pH4.5-5.5(由2M NaOH及HC1(Sigma，USA)来调节酸碱)、槽内压力0.2-0.4kg/cm²，经0.2μm过滤空气通气量为40-50L/min的条件进行发酵3天。

4.灵芝免疫调节蛋白50升发酵槽产程的产量测定：

取样的菌液利用上述实施例三，以西方墨点法的方法测定灵芝免疫调节蛋白的产量。结果见图12。由图12得知，50升发酵后的产物含有灵芝免疫调节蛋白。

实施例八：转形面包酵母表达灵芝免疫调节蛋白质的活性测试

1.全部细胞萃取物的制备：

玻璃珠(glass bead)磨菌方法：培养后采集的酵母菌样品，经离心，用PBS清洗已收获酵母菌团块，离心三次。收集酵母菌丸粒，加入与pellet等体积的0.4mm玻璃珠。在4℃下震动混合物20秒且冰浴1分钟。重复此步骤五次。在4℃15000rpm离心五分钟后，用上清液当作全部细胞萃取物。离心检体，留置上清液。用0.2um膜(Sartorius)过滤上清液且留置备用。

2.人类周边血单核球细胞制备：

利用成人已加肝素防止凝固(heparinized)的周边血液加入Ficoll-paque培养液(Amersham Biosciences)离心分离出人类周边血单核球细胞。1 X 10⁶ cells/ml的细胞培养在含有10％ FBS、100μg/ml链霉素、100units/ml青霉素及200mM L-谷氨酸钠(L-glutamate)的RPMI1640培养基(GIBCO，Grand Island，NY)的24-孔组织培养盘(Nunc，Roskilde，Denmark)中。以37℃培养0、24或48小时。

3.细胞激素(cytokine)的测定：

上述1 X 10⁶ cells/ml的细胞培养在24-孔组织培养盘(Nunc，Roskilde，Denmark)，加入上述萃取出不同浓度的灵芝免疫调节蛋白共同培养。IFN-γ活性是用商品试剂组(R&DSystems，Minneapolis，MN)来检测。结果见图10，由图10得知PHA(phytohaemagglutinin，Sigma)在此IFN-γ ELISA测试中作为标准品使用(The Journalof Immunology，1998，161：2114-2119)。第1批及第2批代表第一次50升发酵样品及第二次50升发酵样品，使用不同剂量下产生的IFN-γ量。对照组及一般酵母组不会刺激生成IFN-γ量。纯化后灵芝免疫调节蛋白不同剂量也会产生的IFN-γ量。其中4μg浓度的纯化后灵芝免疫调节蛋白与其它方式产生的灵芝免疫调节蛋白比较，培养48小时后得到较高的IFN-γ含量。另外也显示50升发酵样品会刺激IFN-γ含量，代表本发明所产生的FIP具有生物活性，而并非因为酵母菌的关系。

实施例九：50L发酵产程灵芝免疫调节蛋白的纯化

1.发酵后酵母菌须以20mM磷酸盐缓冲液(Sigma)pH6.0回溶成10％菌液，pH值由1M醋酸调整。再利用破菌机(Basic Z model，Constant System Ltd.UK)以30Kpsi的压力打破细胞，再调整至pH4-5。

2.以3,000xg离心15min，取上清液，再以12,000xg离心1min。

3.取10mL的上清液注入30mL的CM琼脂凝胶(AmershamBiosciences)(已先用20-50mM醋酸平衡，使周围的酸度维持pH4-5)的管柱中。

4.以20-50mM pH4-5醋酸，流洗两倍管柱体积，收取流出液，即得到灵芝酵母蛋白。

5.分析图见图11(I)，F3、F4及F5表示第3、第4及第5个收集管样品，第3及第4个收集管样品明显有较高的mAU值，因此收集第3、4及第5个收集管样品，并且进行SDS-PAGE。结果见图11(II)，M表示蛋白质分子量标准品，STD表示由大肠杆菌生产的灵芝免疫调节蛋白质纯化标准品，由图11(II)得知第3、4收集管样品与标准品有相同的分子量，并且其纯度相当高。并且后续利用西方墨点法却认为FIP。

实施例十：灵芝免疫调节蛋白的应用

1.饲料添加物

A.灵芝蛋白对石斑鱼的毒性试验：

鱼种为花鬼斑(Epinephelus malabaricus)，购自高雄茄定地区的私人养殖场。平均体长为7.25cm、平均体重为5.9g。蓄养在海水盐度33ppt、水温25℃的环境中。

取由实施例九纯化的灵芝免疫调节蛋白溶液，分别以5、1、0.25μg/尾/0.1ml的浓度腹腔注射入石斑鱼苗，另外注射PBS溶液作为对照组。以原饲养环境流水饲养14天。每天观察并记录死亡情形。两周后所有组别皆没有死亡发生，显示实验所选用的灵芝免疫调节蛋白浓度对石斑鱼并不会导致毒性反应。

B.灵芝免疫调节蛋白对体外石斑鱼头肾细胞非特异免疫的影响：

由市场购入约600g石斑鱼，取头肾、分离吞噬细胞并以AL-10培养液(L15(Gibco)∶AIM5(Gibco)＝1∶1混合)悬浮，种入0.1ml的1X10⁷/ml细胞在96孔培养盘(Corning)，静置吸附2小时。鱼的头肾细胞是鱼类非专一性免疫的主要细胞(Engelsma MY，FishShellfish Immunol.2003 Nov；15(5)：397-410)。加入2、1、0.5、0.2、0.02μg/0.1ml由实施例九纯化的灵芝免疫调节蛋白溶液，于室温作用2小时。进行NBT分析套组(Sigma)：根据NBT分析套组可得知添加灵芝免疫调节蛋白后，石斑鱼头肾细胞的吞噬作用反应。

结果见图13。由图13得知，添加2、1和0.5μg/0.1ml由实施例九纯化的灵芝免疫调节蛋白，可增加头肾细胞的吞噬作用。由此推知灵芝免疫调节蛋白可增强石斑鱼的非特异性免疫反应。

C.石斑鱼腹腔注射灵芝免疫调节蛋白两周后进行虹彩病毒(Iridovirus)攻击试验的预备试验：

对前述毒性试验的鱼进行腹腔注射PBS或灵芝免疫调节蛋白两周后，以腹腔注射方式注射0.1ml的10,000XTCID₅₀病毒剂量，每日观察鱼死亡率。一般，经腹腔注射虹彩病毒的石斑鱼两周内死亡。由图14得知，以最高剂量5μg FIP/0.1显示两周后有70％死亡率，因此，两周内达到30％保护率。

D.对哈氏弧菌(Vibrio harvey)的保护率

a.测试鱼种为石斑鱼(Epinephelus malabevicus)，平均体重为52.9克。喂食石斑鱼20mg、4mg及0.8mg/60g三种不同浓度的含灵芝免疫调节蛋白的酵母菌与对照一般酵母菌组20mg/60g石斑鱼及PBS对照组，共五组，进行喂食，每组20尾石斑鱼，每两天喂食一次，连续喂食七天后，进行攻毒试验。

b.以10XLD₅₀(3X10⁶CFU/ml)的哈氏弧菌(Vibrio harvey)进行攻毒试验，以求其保护力。攻毒前先行采集血液，每组10尾，进行测试鱼的非特异性免疫反应包括Lysozyme活性、吞噬能力(Phagocytosis)及NBT阳性细胞数量三项，其它10尾进行攻毒细菌试验。每日观察记录鱼的活力、食欲及死亡率。

c.结果见图15，经由弧菌感染后的鱼，五天后，喂食一般酵母菌的鱼的存活率只有10-20％，喂食含灵芝免疫调节蛋白的酵母菌的鱼的则其存活率有60％-80％，并且死亡时间会延后。此结果指出口服含灵芝免疫调节蛋白酵母菌增强鱼类免疫力及延长鱼类生命。

实施例十一：将Der p处理过已致敏过的Balb/c小鼠，取出该小鼠脾脏细胞，再利用灵芝免疫调节蛋白或Der p萃取物来再次刺激，观察脾脏细胞的IFN-r的产量。

致敏实验的步骤：

a.喂食灵芝免疫调节蛋白组的小鼠：两天喂食一次(2μg)直到第15天杀死Balb/c小鼠，取出脾脏细胞(spleen cell)。

b.Der P处理的小鼠：第一天进行腹腔注射10μg，隔七天再进行腹腔注射10μg，再隔7天进行喷雾一次10μg，第15天杀死Balb/c小鼠，取出脾脏细胞。

c.脾脏细胞处理：上述分离出的脾脏细胞，培养1 X 10⁶ cells/ml在RPMI 1640含5％ FBS的培养基中，然后再以10μg/ml Der P或2μg/ml FIP处理。培养48小时后收集培养液并分析IFN-r的含量。

结果见图16，其中Der p表示尘螨(dust mite)过敏原Der p II；FIP-gts表示灵芝免疫调节蛋白。结果显示长期喂食灵芝免疫调节蛋白给Balb/c小鼠，其脾脏细胞再经灵芝免疫调节蛋白刺激并不会增加产生IFN-r(81.9pg/ml)。而未喂食灵芝免疫调节蛋白的对照组中Balb/c小鼠的脾脏细胞再经灵芝免疫调节蛋白刺激会增加产生IFN-r(463.8pg/ml)。经过Der p致敏过的Balb/c小鼠，其脾脏细胞再经灵芝免疫调节蛋白刺激会增加产生IFN-r(1100.7pg/ml)。这显示口服灵芝免疫调节蛋白可以免疫调节，特别是直接抑制过敏反应。

本发明所描述及实施例中显示足够的细节及结果证明其实施性及应用性。

序列表

<110>益生生技开发股份有限公司

     宝纳纯生技公司

<120>利用微生物制备的真菌免疫调节蛋白及其用途

<130>ZP041151TCP

<150>US 60/503，547

<151>2003-09-17

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>336

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>编码真菌免疫调节蛋白的核酸分子

<400>1

Claims (4)

1.一种SEQ ID NO：1所示核酸序列编码的灵芝免疫调节蛋白在制备口服方式调节免疫活性的组合物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述免疫调节系用来减低发炎与过敏反应、调节免疫活性、预防糖尿病、改善气喘、增加抗菌能力、增加抗病毒能力及降低器官转移的排斥反应。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物用于食物或饲料添加，用以延长寿命、增加免疫反应、饲料转换率及减低紧迫症。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物为灵芝免疫调节蛋白或灵芝免疫调节蛋白与另一种蛋白质融合成的一种融合蛋白质。

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