CN107106645A - 用于治疗c‑met相关性癌症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制细胞内的肝细胞生长因子受体（HGFR）活性，及用于治疗HGFR‑相关性癌症。

Description

用于治疗C-MET相关性癌症的方法和组合物

优先权主张

本申请主张2014年9月2号提申的美国专利申请案第62/044,415号的优先权，其整体内容是以参照方式并入本申请。本申请所公开的部分资料已于2015年1月21号在线发表于PLoS ONE，标题为“Preclinical Trials for Prevention of Tumor Progression ofHepatocellular Carcinoma by LZ-8 Targeting c-Met Dependent and IndependentPathways”。

技术领域

本发明涉及真菌免疫调节蛋白（FIP）在治疗癌症，特别是c-Met-相关性癌症，更特别是肝细胞癌的用途；涉及FIP在抑制肿瘤生长、癌症，特别是c-Met-相关性癌症，更特别是肝细胞癌的迁移、转移或复发的用途。本发明也涉及用于阻断c-Met信号传导的方法和组合物。

背景技术

肝细胞癌（HCC）是世界上危害最严重的癌症之一，尤其在东南亚。HCC的预后不良与复发是由肿瘤转移所造成。近来，肿瘤微环境被强调在激发肿瘤转移中的重要性。肿瘤微环境包含原发肿瘤本身，其可能与基质性及炎性细胞交互作用，导致分泌大量转移性生长因子，包括肝细胞生长因子（HGF），进而激发原发肿瘤的转移性表型变化。

本领域已知c-Met的活化可通过自泌的方式发生在HCCs，证据是高水平的细胞质内HGF。而且，HCCs的高HGF血清水平与c-Met表现失调和早期复发密切相关，高-Met表现的HCCs患者在治疗性切除手术后通常具有较短的5年存活率。此外，一组带有c-Met-引发的转录标志的HCCs（27%），以高比率的血管侵袭为其特征。另一方面，活体外研究也显示，HGF对于包括EMT、迁移与侵袭在内的HCC转移性变化具有影响力。因此，HGF-c-Met信号传导被认为是预防HCC恶化的最有希望治疗标靶。

HGF结合至c-Met会引发c-Met的胞质区域的自磷酸化作用，接着召集上游调节因子，例如Gab、Grb2与PI3K，从而活化下游的信号传导，包括受胞外信号调节的蛋白激酶（ERK）、c-Jun激酶（JNK）和蛋白激酶B（AKT）。在过去十年中，已设计众多用于阻断c-Met信号级联的小型分子。到目前为止，包括JNJ-38877605、GEN-203与ARQ197等至少17个抑制剂已进入临床评估（Zhu K et al., Expert Opin Ther Pat 2014, 24:217-230）。

c-Met抑制剂的毒性已在众多研究中被证实。在一个动物实验中，GEN-203会导致明显的肝脏和骨髓毒性。在临床试验中，观察到用ARQ 197治疗HCC会导致包括贫血与嗜中性白血球低下症（neutropenia）的严重不良事件。这些副作用可归因于c-Met广泛表现在许多器官的上皮细胞及其关键性生物功能，例如对于组织损伤的防御反应。

尽管面临上述潜在挑战，在改善c-Met治疗方式上仍有极大潜力。首先，可针对具有活跃的c-Met信号传导的HCC进行大规模筛选，以募集参加试验的适宜患者。其次，慎选确保安全性的更有效c-Met抑制剂。第三，可建立由患者衍生出来的HCC株，以测试HCC拮抗剂的效率。

数种源自例如赤芝（Ganoderma lucidium）、草菇（Volvariella volvacea）、金针菇（Flammulina velutipes）等可食性菌类的蛋白质，具有相似的氨基酸序列和免疫调节功能。这些蛋白质被命名为真菌免疫调节蛋白（FIPs，Ko J. L., Eur. J. Biochem. 1995;228:244-249）。

从赤芝（Ganoderma lucidum）、金针菇（Flammulina veltipes）、草菇（Volvariella volvacea）、松杉灵芝（Ganoderma tsugae）、紫芝（Ganoderma japoncium）、小孢子灵芝（Ganoderma microsporum）、甜芝（Ganoderma sinense）与红球丛赤壳菌（Nectria haematococca）、银耳（Tremella fuciformis）、樟芝（Antrodia camphorate）中，已经鉴定并单离出至少10种FIPs，而且分别命名为LZ-8（也被称为FIP-glu）、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gts、FIP-gja（GenBank: AY987805）、FIP-gmi、FIP-gsi、FIP-nha、FIP-tfu（GenBank: EF152774）、FIP-aca（Hsu H C, et al., Biochem J 1997; 323 (Pt 2):557-565；Kong et al., Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 2230-2241；Han et al., J Appl Microbiol 2010, 109:1838-44；以及中国专利第102241751B号）。在这些当中，FIP-gts的脱氧核醣核酸序列被发现与赤芝的LZ-8序列一样。两分子展现相同的免疫活性，这指出它们是相同的蛋白质。FIPs在活体外对于人类周边血液淋巴细胞（hPBLs）和老鼠脾细胞来说是促进有丝分裂物质。它们所引发的钟形剂量反应曲线与凝集素类细胞分裂激素类似。用FIPs活化hPBLs，导致与ICAM-1表现相关的IL-2、IFN-γ及肿瘤坏死因子-α等分子的产量增加（Wang P H, et al., J Agric Food Chem 2004; 52(9):2721-2725）。FIPs也能作为免疫抑制剂。在活体内，这些蛋白质能防止全身的过敏反应，并且在老鼠的阿都司氏（Arthus）反应期间能显著地减少足垫水肿。这些观察显示FIPs能够促进健康而且具有疗效。

通过Garnier分析法预测FIP-gts的二级结构发现，此蛋白有两个α-螺旋、七个β-折片与一个β-转折。通过SDS-PAGE分析，FIP-gts的分子量为13kD。用20μM的戊二醛（蛋白质共轭物）进行氨基酸结合分析，发现FIP-gts形成26 kD双聚体。

虽然FIPs的免疫调节活性已被广泛研究，但其抗癌活性直到近年来才受到探讨。让渡给本申请人的美国专利第8,629,096号公开FIP-gts对于乳腺癌、肺癌、前列腺癌和黑色素瘤展现出抗增生活性，从而显示FIPs作为广效抗癌剂的潜在利用性。FIP-gts也被发现对于胃癌细胞系能够展现出致死效应（Liang C et al., Oncol Rep 2012, 27:1079-1089）。美国专利公开案第2011/009597号提供了另外的实验数据，其显示由嗜甲醇酵母表现出来的重组型FIP-gts蛋白，能够在活体外引发血癌细胞的程序化细胞死亡，而且能够在活体内压制肝癌细胞的生长。美国专利第8,476,238号教示了FIP-gmi可通过抑制表皮生长因子受体（EGFR）的信号传导来抑制肺癌的侵袭与转移。另外有活体外研究报导，FIP-gts也可压制子宫颈癌的细胞迁移（Wang PH et al., Reprod Sci 2007, 14:475-485）。然而，FIPs对癌症的抗转移效应仍有待进一步研究。

FIP-gts抗肿瘤活性的分子机制已经过初步研究。FIP-gts可稳定p53，进而增加了使肺癌细胞周期停滞的CDK抑制剂p21。让渡给本申请人的美国专利公开案第2007/071766号公开FIP-gts可抑止肺腺癌细胞的端粒酶活性。在信号传导层次上，FIP-gts可能影响蛋白激酶C（PKC）/ROS、PTK/PLC/PKCalpha/ERK1/2，以及PTK/PLC/PKCalpha/p38的级联作用。在这些当中，已经知道PKC与ERK对于HGF/c-Met的信号传导来说非常重要。到目前为止，尚未探讨是否有任何FIP可以阻断c-Met依赖型信号传导作用。

发明内容

在第一方面中，本申请所提供的是一种用于抑制细胞内的肝细胞生长因子受体（c-Met）活性的方法，该方法包含使该细胞和有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP）相接触，以抑制c-Met活性。

在第二方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于抑制细胞内的肝细胞生长因子受体（c-Met）活性。

在第三方面中，本申请所提供的是一种用于抑制细胞内的肝细胞生长因子受体（c-Met）活性的组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制c-Met活性。

在第四方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症的转移的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制HGFR-相关性癌症的转移。

在第五方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症的转移。

在第六方面中，本申请所提供的是一种用于抑制肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症转移的药学组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制个体内的HGFR-相关性癌症的转移。

在第七方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症的细胞迁移的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP）。

在第八方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症的细胞迁移。

在第九方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症的细胞迁移的组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP）。

在第十方面中，本申请所提供的是一种治疗癌症的方法，该方法通过阻断需要接受治疗的个体内的肝细胞生长因子受体（c-Met）信号传导，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以阻断c-Met信号传导。

在第十一方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于通过阻断需要接受治疗的个体内的肝细胞生长因子受体（c-Met）信号传导来治疗癌症。

在第十二方面中，本申请所提供的是一种药学组合物，该组合物用于通过阻断需要接受治疗的个体内的肝细胞生长因子受体（c-Met）信号传导来治疗癌症，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以阻断c-Met信号传导。

在第十三方面中，本申请所提供的是一种用于预防个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症复发的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以预防HGFR-相关性癌症的复发。

在第十四方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于预防个体内的肝细胞生长因子受体-相关性癌症的复发。

在第十五方面中，本申请所提供的是一种药学组合物，该组合物用于预防肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症的复发，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以预防HGFR-相关性癌症的复发。

在第十六方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞癌的转移的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制肝细胞癌的转移。

在第十七方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于抑制个体内的肝细胞癌的转移。

在第十八方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞癌转移的药学组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制肝细胞癌的转移。

在第十九方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞癌的细胞迁移的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制肝细胞癌的细胞迁移。

在第二十方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于抑制个体内的肝细胞癌的细胞迁移。

在第二十一方面中，本申请所提供的是一种用于抑制个体内的肝细胞癌的细胞迁移的组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以抑制肝细胞癌的细胞迁移。

在第二十二方面中，本申请所提供的是一种用于预防个体内的肝细胞癌复发的方法，该方法包含给予该个体有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以预防肝细胞癌的复发。

在第二十三方面中，本申请所提供的是一种真菌免疫调节蛋白（FIP），其用于预防个体内的肝细胞癌的复发。

在第二十四方面中，本申请所提供的是一种用于预防个体内的肝细胞癌复发的药学组合物，该组合物包含有效量的真菌免疫调节蛋白（FIP），以预防肝细胞癌的复发。

附图说明

本发明的上述内容与其他目的、特征与效应，将参照下列优选实施例的说明连同附图而变得清楚明白，其中：

图1A与1B显示所指代涉及的HCC细胞系进行48小时伤口愈合试验的形态与活动性，其中照片是用相位差显微镜拍摄（放大200倍）；

图1C显示所述HCCs的活动性定量分析，其中个别HCC的相对活动性是通过将HCC340的活动性取作1.0来计算，（**）与（*）代表所述HCCs与HCC340之间活动性差异的统计显著性（分别为p<0.005与p<0.05，n=4）；

图2显示比对HCC细胞系中多种信号传导分子的免疫印迹分析，其使用GAPDH作为载入对照组，其中所示数据代表2个再现性实验；

图3A、3B与3C显示FIP-gts与JNJ对于HCC329和HCC372细胞迁移，以及对于HGF-引发的HepG2细胞迁移的抑制效应；

图4为取自SCID小鼠的全肝标本全览照，其显示在SCID小鼠模型中，FIP-gts与JNJ对于HCC329肿瘤生长和转移的抑制效应，其中培养基-与JNJ-处理组出现肝内转移瘤，但FIP-gts-处理小鼠组并无出现；

图5A至图5D显示FIP-gts阻断c-Met阳性和阴性HCCs以及受HGF-诱发的HepG2中的信号传导；

图6A至图6B为显示FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo分别对于HCC372与HCC329细胞存活率的效应的直方图；

图7显示透孔迁移试验的HCC细胞病理影像，显示FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo抑制HCC329与HCC372的细胞迁移；以及

图8显示比对HCC细胞系中多种信号传导分子的另一免疫印迹分析，其使用GAPDH作为载入对照组。

具体实施方式

本发明基于发现到以FIP-gts为例的真菌免疫调节蛋白（FIP）有效抑制c-Met活性，这一发现指出表现出c-Met蛋白的癌细胞的迁移与转移能够通过给予FIP来抑制c-Met活性而被压制。尤其，当FIP-gts被使用作为FIP的示例性范例时，可以发现到，相较于现有c-Met抑制剂JNJ-38877605，FIP-gts对于c-Met活性的抑制效应更为强效。相较于JNJ-38877605，FIP也可更有效地阻断组成性c-Met-依赖型信号传导。本发明进一步发现到受HGF-引发的c-Met-依赖型信号传导和癌细胞迁移能够被FIP抑制。这些发现显示FIP在医疗上可供用于治疗增生性病症，例如癌症，包括与c-Met信号传导相关的癌症或是c-Met-相关性癌症。特别是，用FIP来处理表现出c-Met蛋白的癌细胞会造成c-Met信号传导被阻断，并且抑制与c-Met信号传导有关的下游事件，例如将癌细胞内的JNK与ERK活化。本发明进一步发现到，除了压制组成性c-Met信号传导及受HGF-引发的c-Met信号传导以外，FIP也可阻断HCCs中组成性c-Met非依赖型信号传导，并且抑制HCC细胞的生长、迁移和转移，其中c-Met蛋白实质上未表现出来或是实质上测不到c-Met蛋白的活性形式。

c-Met也被称为肝细胞生长因子受体（HGFR），其由Met原致癌基因所编码并拥有酪氨酸激酶活性。肝细胞生长因子（HGF）是Met受体的唯一已知天然配体。HGF/c-Met信号传导，其在本申请中也可互换地称作为HGFR信号传导，启动了侵袭性生长程序，该程序被认为对早期胚胎发育至关重要，但在失调时，可能导致异常细胞的恶性生长、活动、迁移与侵袭。据信HGFR信号传导，其包括与MAPK（丝裂原活化型蛋白激酶）-、PI3K/AKT-、STAT3-与β-连环蛋白（β-catenin）-相关的途径，通过引发不受控制的细胞生长和血管生成，在发展癌症时扮演重要角色；并主导了通过引发散播（scattering），也就是细胞解离（也称作上皮间质转化或EMT）来启动肿瘤发展，以及由于生成金属蛋白酶所导致的迁移和侵袭，因此经常造成转移。

HGFR信号传导的活化主要是依赖Met受体上的某些氨基酸残基的磷酸化，其中激酶区域内的Tyr1234与Tyr1235在响应HGF结合时发生自磷酸化，造成位于C-端多官能对接位点内的Tyr1349和Tyr1356进一步磷酸化。HGFR的磷酸化作用继而活化非-受体酪氨酸激酶Src、点状黏着激酶（FAK）以及Ras/MEK/ERK和PI3K/AKT的信号级联作用。因此，“抑制HGFR活性”、“压制HGFR活化”与“阻断HGFR信号传导”等用语在本申请可互换地使用，意思是通过给予FIP或任何c-Met抑制剂，例如JNJ-38877605，阻止HGFR活化及/或降低HGFR激酶活性，其就是通过，举例来说，相较于在无FIP或c-Met抑制剂存在时所测得的结果，HGFR蛋白的整体表现水平、磷酸化水平（尤其是HGFR在Tyr1234处的磷酸化水平）、抑或是例如ERK与JNK等下游效应蛋白的磷酸化水平的可测得减少量来进行测定。

HGFR的组成性活化与异常表现可为配体-非依赖型，且据信在许多人类癌症中促成肿瘤的生长、迁移、侵袭和转移（Mizuno S. and Nakamura T., Int. J. Mol. Sci.2013, 14:888-919）。本申请中所使用的用语“HGFR-相关性癌症”或“HGFR-阳性癌症”意指在癌细胞表面上表现出HGFR蛋白的癌症，且通常具有HGFR蛋白的异常表现及/或活化，其可导致、增进或促成癌症的生长、迁移、转移或复发。在HGFR-相关性癌症中，HGFR蛋白的存在及其磷酸化形式可以通过胜肽或蛋白的定量或定性分析中所使用的任何现有技术而容易地进行检测，例如免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫沉淀法与荧光显微镜检法。在一些实施例中，该癌症为选自由下列所组成的群组中的固体肿瘤：肝细胞癌、遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、间皮瘤、大肠癌和骨原性肉瘤。在其他实施例中，该癌症为液体肿瘤，譬如淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

如本申请所公开，本发明提供一种用于抑制癌细胞中的HGFR活性的方法，该方法包含使HGFR接触有效量的FIP。在一些实施例中，HGFR的活性由于HGF或HGFR过度表现而失调，此意指HGF或HGFR的表现水平相较于相同类型非癌组织的基线表现水平是向上偏离。在一些实施例中，HGFR在细胞中异常活跃，举例来说，其磷酸化形式大量地出现，尤其是在Tyr1234处被磷酸化的那些。用语“细胞”在用于本申请时指的是活体外（in vitro）、离体（ex vivo）或活体内（in vivo）的细胞。在一些实施例中，离体细胞可为从例如哺乳动物等生物体上切除的组织样本的一部分。在一些实施例中，活体外细胞可为细胞培养物里的细胞。在一些实施例中，活体内细胞为生活在例如哺乳动物等生物体中的细胞。本申请中所使用的用语“接触”指的是使所指代涉及的部分聚集在活体外系统或活体内系统内。举例来说，使HGFR“接触”FIP包括给予FIP至个体或患者，例如人类，以及，举例来说，将FIP导入含有表现出HGFR的细胞的样本内。

在优选实施例中，本申请所公开的发明关于使用FIP来抑制HGFR-相关性癌症的细胞迁移或转移，所述HGFR-相关性癌症例如选自由下列所组成的群组：肝细胞癌、遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、与骨原性肉瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在上列癌症中，肝细胞癌是最优选的。根据本发明，用语“迁移”指的是一个细胞或多个细胞从一个部位移动到另一个部位。本申请中所使用的用语“转移”指的是癌细胞从其原先由正常、增殖性或发育异常细胞形成的原发癌部位，移位至所移位癌细胞暂居与增殖的继发部位的过程。通常，转移的过程涉及癌细胞迁移通过例如基底膜及其他公知细胞外基质等生理屏障的能力。

本发明更设想到预防HGFR-相关性癌症的复发，因为癌症的微转移经常导致复发的风险。的确，癌症的复发可归因于未完全去除或杀死原发癌的细胞，并可局部性地发生（原发癌的相同部位）、区域性地发生（在原发癌附近，可能是在淋巴结或组织）及/或由于转移而远程性地发生。根据下文所说明的实施例显示，给予FIP会引发原发肿瘤缩小并且压制HCC的肝内转移，这表示HGFR-相关性癌症的复发可通过本申请所公开的发明而有效地预防。因此，用语“预防复发（preventing recurrence）”与“复发的预防（prevention ofrecurrence）”在用于本申请时指的是在病情缓解后，减少或消除癌症的再次出现。

在另一优选实施例中，本申请所公开的发明适用于癌症治疗。本申请中所使用的用语“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”关于目前病况的症状改善、病程的减缓，尤其是压制肿瘤生长、抑制恶性复发或转移，以及引发肿瘤缩小。在一些实施例中，用语“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”指的是缩减或稳定肿瘤尺寸或癌性细胞计数。理想地，被治疗的癌症是HGFR-相关性癌症，例如选自由遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胰腺癌、大肠癌和骨原性肉瘤所组成的群组的那些。

然而，先前研究指出c-Met的过度表现仅在20-48%人类HCC样本中观察到。此观察在某种程度上被本申请公开的实施例3所证实，其中所分析的十个细胞系中仅有四个显示出具有可侦测水平的c-Met与p-c-Met。就这些欠缺c-Met信号传导的HCCs而言，以c-Met为标靶的方式并不合宜。

本发明人意外地发现到FIP仍可压制实质上未表现出c-Met蛋白及/或磷酸化c-Met的癌症的细胞迁移、转移与复发，尤其是HCCs，这表示FIP可通过多重机制压制肿瘤发展，包括抑制c-Met依赖型信号传导途径以及至少一个c-Met非依赖型信号传导途径。实质上未表现出c-Met蛋白及/或磷酸化c-Met的HCCs，在本申请也称作“HGFR-阴性HCCs”，它们涵盖通过胜肽或蛋白质定量或定性分析所使用的任何现有技术，例如免疫印迹法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫沉淀法和荧光显微镜检法进行评估，在癌细胞中未观察到可侦测水平的c-Met及/或p-c-Met（尤其是在Tyr1234处被磷酸化的那些）的HCCs。极有可能HGFR对于HGFR-阴性HCCs的肿瘤发展并非关键。如下文实施例7所示，EGFR信号传导─而非c-Met信号传导─在HGFR-阴性HCCs中是活跃的，而且其可被本申请公开的FIP所压制。

本申请所使用的用语“真菌免疫调节蛋白”或缩写成“FIP”指的是属于首先定义在Ko et al., Eur. J. Biochem. 1995; 228:244-249的蛋白家族的蛋白，它们是基于氨基酸序列与免疫反应效应的相似性。经报导，FIP家族的免疫调节蛋白共享至少57%的序列相同性。尤其，FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo与LZ-8的一级结构展现60-70%的高序列相同性（Kong et al., Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 2230-2241；中国专利第CN102241751B号；Wang XF et al., Curr. Topics Nutraceutical Res. 2012, 10(1): 1-12；以及Li OZet al., Crit. Rev. Biotech. 2011, 31(4):365-375）。因此，本申请所使用的用语“真菌免疫调节蛋白”意欲涵盖与SEQ ID NO: 1所示的FIP-gts的氨基酸序列具有至少57%、优选为至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%氨基酸相同性，并具有引发、增强或延伸个体免疫反应的能力的任何多肽。在一优选实施例中，该真菌免疫调节蛋白具有选自由下列所组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1（FIP-gts）、SEQ ID NO: 2（FIP-fve）、SEQ IDNO: 3（FIP-vvo）、SEQ ID NO: 4（LZ-8）、SEQ ID NO: 5（FIP-gja）、SEQ ID NO: 6（FIP-gmi）、SEQ ID NO: 7（FIP-gsi）与SEQ ID NO: 8（FIP-nha），及其作为免疫调节剂的功能性变异体。在另一优选实施例中，所述FIP衍生自灵芝属或草菇，尤其具有选自由下列所组成的群组中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6与SEQ ID NO: 7。最优选的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列所组成，或是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列所组成。

本申请所使用的FIP可从天然来源、真菌培养物所得，抑或是从诸如细菌或酵母菌宿主等原核或真核微生物宿主中重组表现。依此获得的FIP可为粗制物形式，或是通过任何适宜技术从真菌物质所分离、分馏、或部分或实质上纯化的精制调配物。优选为该蛋白在使用前经过至少部分地纯化。可供用于制备FIP的一种方法在WO2005040375A1中公开，该方法涉及培养包涵带有FIP基因的表现载体的酵母转形株，并从酵母培养物收集重组型FIP蛋白。其他的有用方法可见于，举例来说，Kong et al. （同前）；CN101205553A；以及Wang XFet al., Curr. Topics Nutraceutical Res. 2012; 10(1): 1-12。

在所使用的FIP为LZ-8或FIP-gts的情况下，该FIP可以直接从赤芝或松杉灵芝单离，或在宿主细胞系统中由重组蛋白技术制备出来。宿主细胞可为酵母菌或细菌系统。优选地，该宿主细胞系统选自由下列所组成的群组：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）、汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha）、产朊假丝酵母（Candida utilis）、博伊假丝酵母（Candida boidinii）、麦芽糖假丝酵母（Candida maltose）、乳糖克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）、西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccaromyces pombe）、球拟酵母属（Torulopsis sp.）、陆地酵母（Arxula adeninivorans）、曲霉属（Aspergillus sp.）（例如构巢曲霉（A. nidulans）、黑曲霉（A. niger）、泡盛曲霉（A. awamori）和米曲霉（A. oryzae）），以及木霉属（Tricoderma sp.）（例如瑞氏木霉（T. reesei））。

本申请所使用的FIPs是根据上述方法，例如WO2005/040375A1所公开的方法，实质上单离或纯化。本申请所使用的用语“实质上单离”或“实质上纯化”指的是从天然环境或宿主系统内移出，以及至少60%不含、优选至少75%不含、且更优选至少90%不含、甚至更优选至少95%不含宿主系统内它们所天然相连或它们所伴随的其他组分的FIPs。

用于本申请时，用语“个体”意欲涵盖人类或非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括家畜动物、陪伴动物、实验室动物、和非人灵长类。非人类个体也包括但不限于马、牛、猪、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、天竺鼠、沙鼠、仓鼠、水貂、兔和鱼。应该理解，优选的个体为人类，尤其患有癌症或处于癌症风险的人类病患，例如肝细胞癌。

就研究目的而言，用语“个体”可指本申请所定义的生物样本，包括但不限于细胞、组织或器官。据此，本申请所公开的发明意欲在活体内还有活体外施用。

根据本发明，用语“给予个体”包括利用适宜药学调配物将FIP通过用于递送FIP至该个体所想要的位置的任何适宜途径分配、递送或施用至个体，以使FIP接触目标细胞或组织。

FIP可通过任何适宜途径投至该个体，例如局部、直肠、肠内或非经肠途径，举例来说，口服、静脉内、皮下、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、穿皮、脊鞘内、或脑内途径。投药可以是快速的，例如通过注射，或历经一段时间，例如通过缓慢输注或给予缓释调配物。

在一优选实施例中，FIP希望以口服给予并制备成可口服给予调配物的形式。此类调配物优选以适宜的载剂、赋形剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、加味剂、防腐剂调配，并打成锭剂或囊封成固体胶囊或软胶囊。也设想得到此类调配物可设计成下列剂型：口服溶液、或口服小包、或口服丸剂。或者除了口服给予，还可设想得到此类调配物可设计成灌肠剂、或栓剂、或植入物、或贴片、或乳霜、或软膏剂型。适宜的载剂、赋形剂、与稀释剂的若干例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、甲基-与丙基-羟基苄酸盐、滑石、硬脂酸镁、水、矿物油等等。调配物也可额外包括润滑剂、湿润剂、乳化剂与悬浮剂、防腐剂、甜味剂或加味剂。FIP组合物可调配成能够在运用本领域公知流程给予病患后快速、持续或延迟释放活性成分。调配物也可含有减少蛋白水解、核酸和其他降解作用的物质及/或促进吸收的物质，例如，举例来说，表面活性剂。该组合物可和聚乙二醇（即PEG化）、白蛋白或类似物配合，以帮助促进在血流中的稳定性。

另一优选的FIP制剂是利用生理盐水溶液载体；可设想到其他药学上可接受的载剂，例如也可使用无毒盐或化合物的生理浓度、5%葡萄糖水溶液、无菌水或等等。可能也会希望组合物内存在有适宜的缓冲液。若有需要，此类溶液可冻干储存在无菌安瓿里，待加入无菌水复溶后即可用于注射。主要溶剂可为水性或者非水性。

该载剂也可含有其他药学上可接受的赋形剂，以调整或维持调配物的pH、渗透压、黏度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速率或气味。类似地，载剂可另外含有其他药学上可接受的赋形剂，以调整或维持释放或吸收或渗透穿过血脑屏障。此类赋形剂为惯用于调配供单位剂量或多剂量形式的非经肠给予、或供通过连续或周期性输注来直接输注的药剂的物质。

FIP可通过现有生物医药技术合宜地调配成上述单位剂型。此类技术包括使FIP与生理上可接受的载剂、稀释剂、佐剂及/或多种赋形剂结合在一起的步骤。一般来说，调配物通过使FIP和液体载剂、或细微化固体载剂、或此两者均匀且紧密地结合在一起来进行制备，随后视必要性来塑形成产品。

该FIP是以治疗有效量给予个体，通过引起研究人员、兽医、医师或其他临床人员在细胞、组织、系统、动物或人类中所追求的生物学或医学反应，以稳定、改善或减轻该个体病况的症状，例如在该个体中降低肿瘤生长、癌症的细胞迁移、转移或复发和引发肿瘤缩小。因此，用语“有效量”与用词“以有效量给予（in an amount effective to）”在本申请互换地使用，并意欲指称产生医药效应的FIP份量，当该有效量的FIP被给予个体时，观察到上述症状减少。尽管有效量通常通过它们具有的效应所决定，相较于当不包括本申请所述FIP的组合物（即对照组）给予类似情况患者时观察到的效应，但实际剂量是根据所选定的特定投药途径来计算。实际剂量可根据所选定的特定投药途径来计算。为决定适当投药剂量所必要的进一步精细计算，是由具有本领域公知常识的人通过常规方式进行。于是，在给予人类个体时，FIP优选地每日、每周或一周两次给予介于0.01毫克/公斤体重/日至100毫克/公斤体重/日之间，更优选0.1毫克/公斤/日至10毫克/公斤/日的份量。视药剂调配物的药动学参数与使用的投药途径而定，可重复多剂投药。

下列实施例仅供示例目的，而非意欲限制本发明的范围。应注意到，在以下说明的实施例中，执行配对司徒登氏t测试（Student's t test）是为了统计分析所指群体之间的西方印迹的带强度差异以及细胞活动性的定量估算。定量数据是以平均±变异数（C.V.）表示，在各图中以误差线显示。所指分子在免疫组化影像的再现性是使用费雪氏精确v2测试（Fisher Exact v2 test）以分类数据来统计分析。

实施例1：建立供FIP-gts临床前试验用的患者衍生HCC

临床衍生的HCC细胞系是以经过患者同意和佛教慈济综合医院研究伦理委员会（IRB101-62）批准的手术获得的HCC组织中的一部分所建立。简单来说，HCC组织用胶原蛋白酶预处理，接着在丝裂霉素处理过的NIH3T3滋养层上挑选HCC细胞系，共4-6个继代。获得同质的HCC细胞群体并测试它们在活体外与活体内的持续增生能力（超过20个继代）与转移潜力。HCC肿瘤细胞系的特征是通过侦测超过40个继代后的HCC肿瘤标记来确认，例如磷脂酰肌醇聚醣3（Glypican 3；GCP3）。

患者衍生的HCC细胞系被建立且其表型被鉴定。展示了9个HCCs（分别称作HCC329、328、326与340、353、365、363、372、274）的形态（图1A）。若干细胞系（HCC329、353、365、363与372）展现出间质表型，而其余（例如HCC340、374）则展现出上皮表型。

实施例2：伤口愈合迁移试验

将HCC细胞培养在设置有伤口愈合培养插入物的24孔盘上，直至细胞汇聚，接着使细胞血清饥饿达24小时，随后将培养插入物移除。在适当处理后，在指定时间使用相位差显微镜拍摄照片。实施例1所述HCC细胞系的活动性的定量分析，是使用取自于NIH网页的Image J.软件直接计数在48小时迁移至空白区域的细胞来进行。结果在图1B显示。一般来说，间质HCCs的活动性比上皮HCCs的活动性更高。在它们当中，间质表型HCC329与HCC372展现出最高的活动性，上皮型HCC340与HCC374展现出最低的活动性（图1C）。

实施例3：分析患者衍生HCCs的信号传导

涉及HCCs肿瘤恶化的关键性信号传导成员，包括c-Met、ERK、JNK与AKT的状态进一步在实施例1所建立的患者衍生细胞系与常用的HCC细胞系HepG2中检视。从这些细胞中收集到总蛋白质，并使其接受免疫印迹分析，使用GAPDH作为载入对照组。p-c-Met、p-JNK、p-ERK、p-桩蛋白（p-paxillin；S178）、GAPDH和ERK的抗体购自Santa Cruz Biotechnology（California, USA）。印迹上的谱带强度用Image J.软件加以定量。图2显示的结果代表2个再现性实验。

如图2所示，c-Met（β次单元，M.W. 140kD）在HCC 372、340与HepG2内高度表现，在HCC374稍微侦测到，但在其余细胞系皆未观察到。已经知道c-Met的二聚化会活化激酶区域的酪氨酸残基（Tyr1234）的磷酸化作用，这导致各种胞质效应子蛋白的羧基末端的受质结合部位（Tyr1349与Tyr1356）的磷酸化作用。相似于c-Met的表现模式，在HCC372与HCC340中侦测到c-Met（p-c-Met）在Tyr1234的磷酸化，在HepG2与HCC374中稍微侦测到，但在其余HCCs皆未观察到。在HCC372中，观察到p-c-Met（Tyr1234）下方有一极强谱带（用*标记），其仍有待辨识。此外，其余两种磷酸化-c-Mets（在Tyr1356与Tyr1349）在全部细胞系皆未侦测到（数据未显示）。至于下游信号传导成员，磷酸化的JNK（p-JNK）在大部分HCCs中极多，在HCC340与HepG2中则相对较低。另一方面，磷酸化的ERK1与2（p-ERK1与p-ERK 2）这两者的水平在HCC340明显较高及在HepG2则相对较高。再者，p-ERK2（但不是p-ERK1）在HCC372中极高，而p-ERK1（但不是p-ERK2）分别在HCC328与HCC326中极高与相对较高。在包括HCC329、HCC353、HCC363、HCC365和HCC374的其他HCCs中，仅检测到少许p-ERK1。此外，可在大部分HCCs中侦测到丰富的p-AKT。综合来说，尽管c-Met信号传导仅在若干细胞系为阳性（包括HCC340、372、374与HepG2）而在其余为阴性（包括HCC326、329、353、363、365），但下游ERK、JNK与AKT在大部分HCCs皆有活性。由此，这些HCCs中存在有c-Met依赖型和非依赖型信号传导。

实施例4：制备FIPs

SEQ ID NO: 1的FIP-gts如WO2005/040375A1所述在啤酒酵母宿主细胞内重组表现。表现FIP-gts的细胞被打碎、离心，并使上清液通过滤网与分子筛，以获得介于10 kDa与100kDa之间的蛋白质。滤液进一步使用FPLC以Superdex® 75管柱（GE Healthcare）纯化。纯度经FPLC测定为超过95%。

使用本申请中所陈述的相同方法制得FIP-fve（SEQ ID NO: 2）、FIP-vvo（SEQ IDNO: 3）和FIP-gmi（SEQ ID NO: 6），依此制备的蛋白质被发现有超过95%的纯度。

实施例5：FIP-gts对HCCs转移性表型的压制效应

在实施例2中所辨识出最具活动性的HCC细胞系，也就是HCC372与HCC329，被运用在测试FIP-gts对于HCC的分子与细胞效应，并与c-Met催化活性的ATP-竞争性抑制剂JNJ-38877605（下文缩写为JNJ）作比较。在细胞增生试验中，HCC329与HCC372细胞未经处理或经0.5、1.0或2.0微克/毫升的FIP-gts（在实施例4中制备）处理72小时。将细胞数目计数，个别处理组的相对倍增时间是通过将未处理组的数据取作100%来测定。重复实施例2所示伤口愈合迁移试验，不同处在于HCC329与HCC372分别另外用FIP-gts与JNJ（MedKooBiosciences, Chapel Hill, NC, USA）处理48小时。相对迁移量是通过将未处理细胞（Con）的活动性取作1.0来进行定量分析。结果在图3A与3B显示，其中符号（**）、（*）与（#）代表经抑制剂处理的样本与未经处理的HCC329或HCC372对照组之间的统计显著性（分别为p<0.005与p<0.05，n=3）。

如图3A所示，0.5、1.0与2.0微克/毫升FIP-gts剂量相依性地增加了HCC329与HCC372的倍增时间，分别达25-46%与14-47%，这显示它对于两种HCCs的抗增生活性。

进一步检视FIP-gts对于两种HCC的细胞迁移效应。如图3B所示，FIP-gts（2.0微克/毫升）大幅地压制HCC372的细胞迁移，达95%。一般来说，c-Met专一性拮抗剂JNJ-38877605（JNJ，IC50: 26.5 nM）压制HCC372的迁移，达50%。另一方面，FIP-gts与JNJ压制HCC329的细胞迁移，分别达到80%与15%。值得注意的是，JNJ在HCC372中的抑制程度高于其在HCC329中所得者。此可通过c-Met信号传导在HCC372中而非在HCC329中活跃来解释。此外，相较于单独用FIP-gts处理，FIP-gts和JNJ的组合并未显现对于阻断两种HCCs迁移具有增强效应（资料未显示）。综合来说，FIP-gts可以压制c-Met阳性与阴性HCCs两者的组成性细胞迁移与细胞增生。

在另一实验中，运用了传统用于观察受HGF-引发的分子与细胞效应的人类肝癌细胞系HepG2，它是一种不具活动性的HCC细胞系。在此实验中，再次重复实施例2所述伤口愈合迁移试验，不同处在于HepG2（购自Bioresource Collection and Research Center(BCRC), Hsinchu, Taiwan）是在存有或不存有25 nM HGF（PeproTech Inc., Rocky Hill,NJ, USA）的条件下经过FIP-gts或JNJ-38877605处理48小时。相对迁移量是通过将未处理细胞（Con）的活动性取作1.0来定量地分析。结果在图3C显示，其中符号（**）代表经HGF或抑制剂处理的样本以及单独以HGF处理组之间的统计显著性（p<0.005, n=3）。与图2B所示的数据一致，FIP-gts（2.0微克/毫升）阻止了受HGF-引发的HepG2细胞迁移，相较于JNJ（26.5nM）远为有效（图3C）。

实施例6：FIP-gts在SCID小鼠中压制HCC329的肿瘤发展

FIP-gts对于HCC329的肿瘤发展与转移的压制效应是在严重合并性免疫不全（SCID）小鼠模型中验证。将悬浮于100微升杜氏改良的伊格尔培养基（Dulbecco's Modified EagleMedium，DMEM；Gibco, Grand Island, NY, USA）的HCC329细胞（约2 × 10⁷个）直接注射至SCID小鼠的肝中叶的浆膜下层，接着每周两次在腹腔内给予DMEM作为载剂，抑或是含有FIP-gts（4.0-20微克/克小鼠）或JNJ（0.5-2.0毫微摩尔/克小鼠）的载剂。

小鼠在注射2个月后牺牲。测量肿瘤质量并记录肝内转移及/或肝外转移的发生。在左或右叶上观察到直径大于0.1-0.2公分的结节被视为继发肿瘤病灶。肝内转移被定义为，在经处理小鼠的左及/或右肝叶观察到至少两个继发肿瘤病灶的情况。肝外转移被定义为肿瘤出现在肝以外的器官，例如肠内的情况。在动物实验期间，遵循照护和使用实验动物的相关法规。此经慈济大学的机构动物照护和使用委员会（IACUC）批准（同意书编号：102080）。

如图4的白色箭头所指，就SCID小鼠模型的HCC329而言，在培养基-与JNJ-处理组的左与右肝叶上观察到继发肿瘤，而FIP-gts-处理组显示正常的肝叶结构，这指出FIP-gts大幅地压制了肿瘤发展，包括原发肿瘤生长与内部转移（费雪氏测试p<0.05，N=3）。相较下，c-Met抑制剂JNJ对于HCC329肿瘤发展的效应并不突出（图4）。FIP-gts对于SCID小鼠的毒性测试是通过处理未接种HCC329的4只正常SCID小鼠来进行。在腹腔内投予FIP-gts（20微克/克小鼠）2-3个月后，从动物活力与每个器官的完整性的角度来看，没有观察到不利的效应（资料未显示）。

实施例7：FIP-gts在HCCs对c-Met依赖型与非依赖型信号传导的效应

为了探讨FIP-gts在压制HCCs肿瘤发展的分子机制，在HCCs中检视FIP-gts对于c-Met依赖型信号传导途径中所存在的关键成员，包括c-Met、磷酸化c-Met（p-c-Met）与下游效应子p-JNK与p-ERK的活性及/或含量的效应。HCC329与HCC372细胞用FIP-gts（2微克/毫升）处理4或24小时。从细胞收集到总蛋白质并使其接受免疫印迹分析，使用GAPDH作为载入对照组。p-c-Met、p-JNK、p-ERK、p-桩蛋白（S178）、GAPDH与ERK的抗体购自Santa CruzBiotechnology（California, USA）。印迹上的谱带强度用Image J.软件定量。个别分子的谱带强度是将未经处理的HCC372或HCC329的数据取作1.0来计算。结果在图5A与5B显示，其中（**）（##）与（*）（#）代表经抑制剂处理的样本与未经处理的HCC329或HCC372对照组之间的统计显著性（分别为p<0.005与p<0.05，n=3）。

如图5A与5B所示，在HCC 329中，FIP-gts（2.0微克/毫升）在处理24小时后减少JNK、ERK与AKT的磷酸化作用，分别达85、51与18%。FIP-gts对于HCC372信号传导的效应在几个方面不同于HCC329。首先，FIP-gts的压制效应在HCC372中较早观察到（在3-4小时），比起HCC329（在24小时）为早。再者，FIP-gts在c-Met阳性HCC372中可以使c-Met相关信号分子产生变化，在HCC329中则不是。如图5A与5B所示，Met蛋白的表现被FIP-gts大大地压制，在HCC372中早在第4个小时即达90-95%，其可持续直至24小时（未显示）。与此数据一致，FIP-gts在第4个小时显著地压制了Met的磷酸化（在Tyr1234处）达55%，以及大大地压制了ERK与AKT的磷酸化达80-95%（图5A与5B）。相反地，FIP-gts在HCC372中完全未减少p-JNK。综合来说，FIP-gts在c-Met阳性与阴性HCCs两者中都可以压制关键信号分子的活性。

另一研究显示，相较于未经处理的HCC329中所观察到的结果（资料未显示），在经FIP-gts处理16小时的HCC329中，磷酸化EGFR（p-EGFR）明显地减少。在伤口愈合试验给予EGFR抑制剂，包括AG1748和SU5416，会压制HCC329的细胞迁移达80%，而且在4至16小时内减少p-JNK水平达30%（资料未显示）。这些发现指出，EGFR-JNK信号传导，而不是HGFR信号传导，主导了HCC329细胞迁移的调控，而此可被FIP有效地压制，而且FIP似乎通过多重机制来压制肿瘤发展，包括通过抑制c-Met信号传导途径以及通过抑制EGFR信号传导途径。此多样性因而可提供重大的临床优势，因为在给予患者FIP前不需要针对c-Met来筛选HCC患者。

实施例8：FIP-gts在HCC中对于受HGF-引发的c-Met依赖型信号传导的效应

HepG2细胞在存有或不存有HGF（25 nM）下用FIP-gts（2.0微克/毫升）处理0.5小时。从细胞收集到总蛋白质，并进行实施例6中所述免疫印迹分析，不同处在于使用ERK作为载入对照组。结果在图5C与5D显示，其中（**）代表经HGF/ FIP-gts共同处理的样本与单独以HGF处理组之间的统计显著性（p<0.005，n=3）。

如图5C所示，FIP-gts在HepG2大大地压制HGF-引发的c-Met信号传导，包括p-c-Met、p-JNK、p-ERK与磷酸化桩蛋白（在Ser 178），达85-90%（图5D）。

综合实施例7与8的结果，本发明发现到FIP-gts在HCCs中能够压制组成性与受HGF-引发的c-Met信号传导、还有组成性c-Met非依赖型信号传导。实施例5与7所示的结果更指出，c-Met依赖型信号传导被FIP所阻断是HCC细胞迁移减少的主因。

实施例9：FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo对HCCs的压制效应

在存有或不存有实施例4所制备的1、2.5与5微克/毫升FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo的条件下，将实施例2中所建立的HCC372与HCC329细胞系以1×10⁵个细胞/孔的浓度，培养在补充有1%热灭活胎牛血清（FBS；Gibco, NY, USA）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；Sigma,St. Louis, MO, USA）的24孔盘中，历时48小时。将上清液移除并在每孔加入25微升溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）的2.5毫克/毫升MTT（3-[4,5-二甲基吡啶-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物；Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）。将该盘在37°C培育1小时，以容许MTT转变成不溶于水的甲臜结晶。随后，将上清液移除并将二甲亚砜（DMSO）加至所有孔中，彻底混合，以溶解深蓝色结晶。置于室温几分钟以确保所有结晶完全溶解后，在570 nm读取盘。相对存活率是通过将未经处理细胞（Con）的数量取作100%来计算。结果在图6A与6B显示，其中数据是代表4个再现性实验。

结果显示FIP-gmi分别在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC372的生长达23%与96%，并分别在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC329的生长达23%与94%。进一步显示FIP-vvo分别在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC372的生长达48%与96%，并分别在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC329的生长达54%与95%，同时FIP-fve在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC372的生长达13%，并分别在2.5微克/毫升与5微克/毫升的浓度下压制了HCC329的生长达18%与22%。和实施例5所示的使用FIP-gts所获得的结果一致，显示出FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo能够抑制c-Met阳性与阴性HCCs两者的细胞增生。

再者，检视三种FIPs对两种HCC细胞的迁移效应。将HCC372与HCC329细胞种在置于完全培养基的24-孔透孔迁移插入物上（Nalge Nunc International Corp., Rochester,NY, USA），历时24小时。用FIP-gmi（3微克/毫升）、FIP-fve（10微克/毫升）与FIP-vvo（2.5微克/毫升）处理48小时后，将已迁移至插入膜底侧的细胞用0.3%结晶紫加以染色。用棉棒刮擦该插入膜顶侧上的细胞。使用相位差显微镜通过放大200倍拍摄底侧上的迁移细胞。

如图7所示，FIP-gmi与FIP-vvo大幅地压制了HCC329与HCC372的细胞迁移达95-99%，而FIP-fve仅稍微抑制HCC372与HCC329的细胞迁移。和实施例5所示的FIP-gts的结果一致，显示FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo能够抑制c-Met阳性与阴性HCC细胞两者的迁移。

实施例10：FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo在HCCs中对于c-Met依赖型信号传导的效应

重复实施例7所述实验，不同处在于以FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo取代FIP-gts来处理HCC329和HCC372。西方印迹分析的结果在图8显示。和实施例7所示的使用FIP-gts所获得的结果一致，显示在HGFR-阳性HCC细胞系HCC372中，c-Met、p-c-Met与p-JNK被FIP-gmi、FIP-fve与FIP-vvo显著地压制，表示这三种FIPs如同FIP-gts一样，对于c-Met依赖型信号传导展现抑制活性，其结果是可以通过阻断c-Met依赖型信号传导来压制HCC372的细胞迁移和转移。此外，由于c-Met实质上未表现在HCC329，所以FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo对于HCC329的抑制效应必须通过阻断c-Met非依赖型信号传导，例如EGFR-依赖型信号传导途径，才能发生作用。

尽管本发明已参照以上优选实施例说明，应当理解到优选实施例仅为示例目的给予而非试图限制本发明的范围，可进行对本领域技术人员而言极为明显的各种变动与改变，而不脱离本发明的精神与范围。

本申请提到的所有论文、刊物、文献、专利、专利申请案、网址、及其他印刷或电子文件（包括但不限于下文所列参考文献）是以参照方式整体并入。若有冲突，将以本说明书（包括定义）为准。

<110> 益生生技开发股份有限公司

<120> 用于治疗C-MET相关性癌症的方法和组合物

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<222> (1)…(111)

<400> 5

Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Thr Trp Gly Arg Gly Asn Pro Ser Arg

20 25 30

Phe Val Asp Asn Val Thr Phe Pro Gln Val Leu Ala Asp Lys Ala Tyr

35 40 45

Thr Tyr Arg Val Val Val Ser Gly Arg Asp Leu Gly Val Arg Pro Ser

50 55 60

Tyr Ala Val Gly Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val

85 90 95

Ile Asp Pro Asp Thr Asp Ala Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn

100 105 110

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 小孢子灵芝(Ganoderma microsporum)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)…(111)

<400> 6

Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Thr Leu Ala Trp Asn Val Lys Gln

1 5 10 15

Leu Ala Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Arg Pro Ser Ser

20 25 30

Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Thr Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr

35 40 45

Thr Tyr Arg Val Val Val Ser Gly Lys Asp Leu Gly Val Arg Pro Ser

50 55 60

Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Ile Asn Phe Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Tyr Val

85 90 95

Ile Asp Pro Asp Thr Gly Asn Asn Phe Ile Val Ala Gln Trp Asn

100 105 110

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 甜芝(Ganoderma sinense)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)…(111)

<400> 7

Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Thr Trp Gly Arg Gly Asn Pro Ser Arg

20 25 30

Phe Val Asp Asn Val Thr Phe Pro Gln Val Leu Ala Asp Lys Ala Tyr

35 40 45

Thr Tyr Arg Val Val Val Ser Gly Arg Asp Leu Gly Val Arg Pro Ser

50 55 60

Tyr Ala Val Gly Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val

85 90 95

Ile Asp Pro Asp Thr Gly Ala Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn

100 105 110

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)…(114)

<400> 8

Met Ala Thr Thr Asn Asp Ser Ala Val Leu Phe Tyr Ile Val Ala Ser

1 5 10 15

Gln Lys Lys Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Ser

20 25 30

Pro Asn Ser Tyr Ile Asp Asn Leu Thr Phe Pro Arg Val Leu Thr Asn

35 40 45

Lys Pro Tyr Lys Tyr Arg Val Val Lys Ala Gly Gln Asp Leu Gly Val

50 55 60

Arg Asp Ser Tyr Ser Val Gln Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe

65 70 75 80

Leu Glu Tyr Asn Ala Gly Arg Gly Ile Ala Asp Thr Gln Thr Ile Gln

85 90 95

Val Tyr Val Val Asp Pro Asp Asn Gly Asn Gln Tyr Leu Val Ala Gln

100 105 110

Trp Lys

Claims (23)

1.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制细胞内的肝细胞生长因子受体（HGFR）活性。

2.如权利要求1的用途，其中该细胞衍生自HGFR-相关性癌症，而该HGFR-相关性癌症选自由肝细胞癌、遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胸膜间皮瘤、大肠癌、骨原性肉瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤所组成的群组。

3.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症的转移。

4.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制个体内的肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症的细胞迁移。

5.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于预防个体内的肝细胞生长因子受体（HGFR）-相关性癌症的复发。

6.如权利要求3-5中任一项的用途，其中该HGFR-相关性癌症选自由肝细胞癌、遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、骨原性肉瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤所组成的群组。

7.如权利要求6的用途，其中该HGFR-相关性癌症为肝细胞癌。

8.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于通过阻断需要接受治疗的个体内的肝细胞生长因子受体（HGFR）信号传导以治疗HGFR-相关性癌症。

9.如权利要求8的用途，其中该HGFR-相关性癌症选自由遗传型和散发型人类乳突性肾癌、卵巢癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、食道癌、胰腺癌、大肠癌和骨原性肉瘤所组成的群组。

10.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制个体内的肝细胞癌的转移。

11.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于抑制个体内的肝细胞癌的细胞迁移。

12.一种真菌免疫调节蛋白（FIP）在制造医药品上的用途，该医药品用于预防个体内的肝细胞癌的复发。

13.如权利要求10-12中任一项的用途，其中该肝细胞癌为HGFR-阳性肝细胞癌。

14.如权利要求10-12中任一项的用途，其中该肝细胞癌为HGFR-阴性肝细胞癌。

15.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该FIP与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少57%的氨基酸相同性。

16.如权利要求14的用途，其中该FIP具有选自由下列所组成的群组中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7与SEQ ID NO: 8。

17.如权利要求15的用途，其中该FIP具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。

18.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该FIP呈口服给予形式。

19.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该FIP呈非经肠给予形式。

20.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该FIP是以介于0.01毫克/公斤体重/日至100毫克/公斤体重/日之间的份量使用。

21.如权利要求19的用途，其中该FIP是以介于0.1毫克/公斤/日至10毫克/公斤/日之间的份量使用。

22.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该个体选自由人类和非人类脊椎动物所组成的群组。

23.如权利要求1、3-5、8和10-12中任一项的用途，其中该个体是选自由细胞、组织或器官所组成的群组的生物样本。