CN111454335B

CN111454335B - 一种蛋白amu3及其在制备抗肺癌药物中的应用

Info

Publication number: CN111454335B
Application number: CN202010350092.1A
Authority: CN
Inventors: 王莹; 鲍大鹏; 陈洪雨; 李燕; 汪滢; 邹根; 茅文俊; 吴莹莹; 杨瑞恒; 周陈力; 万佳宁; 唐利华; 尚俊军; 龚明; 郭婷; 李焱
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111454335A

Abstract

本发明涉及一种蛋白AMU3及其在制备抗肺癌药物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抑制肺癌的蛋白，具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞调亡的双重活性，其可以用于抑制肺癌，作为治疗肺癌的药物，为肺癌的治疗提供一种新的思路。

Description

一种蛋白AMU3及其在制备抗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物药物领域，特别涉及一种蛋白AMU3及其在制备抗肺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，恶性肿瘤是危害人类生命健康的细胞性疾病，肿瘤细胞从生物体内正常细胞转化为恶性细胞，其形态、功能、代谢和增殖等都会发生深刻变化，可以看作是细胞的异常分化导致的其具有永生性。

绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，近年来，随着吸烟和各种环境因素的影响，肺癌的发病率和死亡率逐年增长其死亡率已占癌症死亡率之首，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。在治疗肺癌的方向上，如何抑制肺癌细胞的增殖和促进其凋亡，成为肺癌治疗中一个关键问题。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白AMU3及其在制备抗肺癌药物中的应用，本发明提供的抑制肺癌的蛋白，具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞调亡的双重活性，其可以用于抑制肺癌，作为治疗肺癌的药物，为肺癌的治疗提供一种新的思路。

本发明提供一种抑制肺癌蛋白AMU3，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的研究显示，SEQ ID NO.1所示的蛋白对肺癌细胞有增殖抑制活性以及促调亡活性，该蛋白可以用于制备成抑制肺癌的药物或其他相关的试剂，为肺癌的治疗提供一种新的用药选择和治疗策略。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述肺癌为非小细胞肺癌。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述非小细胞肺癌为肺腺癌。

肺腺癌是非小细胞肺癌的一种，常见于女性，本发明的研究显示SEQ ID NO.1所示的蛋白能够抑制肺腺癌细胞的增殖和促进这类细胞的凋亡，说明SEQ ID NO.1所示的蛋白可以抑制肺腺癌领域。

本发明提供一种编码所述抑制肺癌蛋白AMU3的多核苷酸。

基于本发明公开的SEQ ID NO.1所示的蛋白，本领域技术人员容易获得编码该蛋白的核酸序列，无论该核酸序列作何种碱基变化，只要其编码SEQ ID NO.1所示的蛋白即属于本发明的保护范围。

进一步地，所述多核苷酸的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2所示的多核苷酸是经过密码子优化的序列，其适用于在大肠杆菌表达，并高效表达得到上述的蛋白。

本发明提供一种含所述多核苷酸的重组载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述重组载体的骨架为pCreat-SII载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述多核苷酸位于pCreat-SII载体的BamHI和XhoI限制性酶切位点之间。

术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，载体可以是一种当被引入重组细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

本发明提供一种含所述重组载体的重组细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述重组细胞为大肠杆菌。

术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

术语“表达”包括涉及蛋白产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

本发明提供一种抑制肺癌蛋白AMU3的制备方法，包括：

(1)构建所述重组载体；然后构建所述重组细胞；

(2)培养重组细胞，分离纯化，得到抑制肺癌蛋白AMU3。

所述重组载体的骨架为pCreat-SII载体；所述重组细胞为大肠杆菌。

本发明提供一种药物制剂，含所述抑制蛋白AMU3作为活性成分。

需要说明的是，在其他的一些实施方案中，上述的药物还可以含有其他作为治疗肺癌的活性成分。也就是说，本发明提供的蛋白可以与其他的肺癌治疗药物联用，这样的药物组合物也是属于本发明的保护范围。

本发明提供的一种所述药物制剂在制备抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞调亡药物中的应用。

本发明提供的一种所述药物制剂在制备抑制非小细胞肺癌增殖和促进非小细胞肺癌凋亡药物中的应用。

本发明提供一种所述药物制剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖和促进肺腺癌细胞调亡药物中的应用。

有益效果

本发明提供的抑制肺癌的蛋白，具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞调亡的双重活性，其可以用于抑制肺癌，作为治疗肺癌的药物，为肺癌的治疗提供一种新的思路。

本发明的蛋白分子量约为12.58kDa，AMU3在大肠杆菌中高效表达，表达量为200mg/L，表达效率较高，其纯度达到90％以上。

本发明蛋白AMU3对Spca-1细胞的生长抑制作用呈现出良好的浓度依赖关系，蛋白AMU3在16μg/ml的范围下对肺腺癌Spca-1细胞增殖具有明显的抑制作用。

本发明蛋白AMU3具有显著促进肺腺癌细胞Spca-1凋亡的作用。

附图说明

图1：蛋白AMU3表达鉴定；图中M:Protein Marker；1:AMU3诱导前样品；2：AMU3诱导后样I；3：AMU3诱导后样II；4：AMU3诱导后样III；5：AMU3诱导后样IV；6：AMU3诱导后样V。

图2：蛋白AMU3异源表达条件优化；图中M:Protein Marker；1：AMU3未诱导样品；2-4:37℃1.0mM IPTG诱导后样品；5-7：37℃：0.2mM IPTG诱导后样品；8-10：15℃1.0mM IPTG诱导后样品；11-13：15℃0.2mM IPTG诱导后样品。

图3：蛋白AMU3可溶性分析；图中M:Protein Marker；1：AMU3未诱导样品；2:AMU3诱导后样品；3:37℃1.0mM IPTG诱导后沉淀样品；4:37℃1.0mM IPTG诱导后上清样品；5:37℃0.2mM IPTG诱导后沉淀样品；6:37℃0.2mM IPTG诱导后上清样品；7:15℃1.0mM IPTG诱导后沉淀样品；8:15℃1.0mM IPTG诱导后上清样品；9:15℃0.2mM IPTG诱导后沉淀样品；10:15℃0.2mM IPTG诱导后上清样品。

图4：蛋白AMU3亲和纯化分析；图中M:Protein Marker；1：破碎后沉淀；2：破碎后上清:3：Ni-NTA孵育后流出液；4：Buffer B洗脱样；5：Buffer C洗脱样；6：Buffer D洗脱样。

图5：Western Blot检验纯化的蛋白AMU3；M:Pre-stained Protein Marker；Sample：诱导后样品。

图6：去除标签的洗脱液的SDS-PAGE电泳检测；图中：M：Protein Marker；1：酶切反应前样品；2：酶切反应后样品；3：流出样；4：Buffer I洗脱样；5：Buffer J洗脱样；6：BufferK洗脱样。

图7：蛋白AMU3分离纯化去标签的SDS-PAGE分析。

图8：蛋白AMU3对肺腺癌Spca-1细胞增殖的影响。

图9：蛋白AMU3促进肺腺癌Spca-1细胞凋亡的流式细胞术检验；图中：NC:阴性对照。

图10：载体pCreat-SII-AMU3的质粒图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

试验材料：

1.细胞株：BL21(DE3)感受态购自于通用生物系统(安徽)有限公司(CP01010)；肺腺癌Spca-1细胞株，购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2.主要试剂耗材和仪器：

试剂：限制性内切酶(日本TaKaRa公司)，T4 DNA连接酶(日本TaKaRa公司)，质粒提取试剂盒(TIANGEN)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)，SUMO Protease(通用生物系统(安徽)有限公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)

仪器：电泳槽(美国Bio-Rad公司)，PCR仪(Applied Biosystems Company)，低温离心机(Eppendorf Company)，恒温摇床(杜克(上海)自动化设备有限公司)，超纯水设备(美国Millipore公司)，制冰机(日本SANYO公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，酶标仪(BIO-RAD)，培养箱(一恒(上海)仪器有限公司)，涡旋振荡器(德国IKA公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson)，离心机(赛默飞世尔)。

实施例1

本实施例提供的抑制肺癌的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本实施例中，该抑制肺癌的蛋白命名为AMU3。

本实施例提供制备该抗肿瘤的蛋白的制备方法如下：

一、构建包含蛋白AMU3优化密码子的载体：

将蛋白AMU3的编码序列(SEQ ID NO.2)插入到pCreat-SII载体上的BamHI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达质粒pCreat-SII-AMU3(图10)。

通过分子对接筛选和虚拟氨基酸突变，并进行蛋白稳定性评估等生物信息学手段，确定蛋白AMU3氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。根据AMU3氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，进行大肠杆菌表达体系密码子优化，将优化的密码子序列(SEQ ID NO.2)委托通用生物系统(安徽)有限公司进行基因合成，然后置于5mL LB液体培养基中37℃摇菌过夜，载体pCreat-SII于5mL LB液体培养基中37℃摇菌过夜。提取质粒，用BamHI和XhoI进行酶切后T4连接酶连接，得到重组大肠表达质粒pCreat-SII-AMU3(图10)。

二、质粒pCreat-SII-AMU3转化至BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌株DE3-AMU3，并表达鉴定：

1.将质粒2μL加入100μL感受态细菌中，置冰上30min；

2.42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入500μL LB培养液；

3.37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜。

4.挑取5个平板上单克隆接种于含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

5.37℃、220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8；

6.取出1mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer；

7.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，在37℃、220rpm振摇4h，诱导融合蛋白表达；

8.取出0.5mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer。

9.进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，正确的质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，并正常表达了融合蛋白AMU3。

三、蛋白AMU3异源表达条件优化：

1.挑取划线平板上单克隆接种于13支含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

2.37℃、220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8；

3.取出0.4mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer；

4.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃、220rpm振摇4h和16h，诱导融合蛋白表达；

5.取出0.2mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer。

6.进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，融合蛋白AMU3在各优化条件下均表达明显，其中37℃，0.2Mm IPTG为最适表达条件。

四、蛋白AMU3可溶性分析：

取37℃诱导后菌液和15℃诱导后菌液2mL，12000g室温离心5min，弃上清，用1mL的Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)重悬离心后沉淀，超声波破碎(Φ3，15％，3s/6s，5min)，上清沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。结果如图3所示，所得的目标融合蛋白AMU3是可溶性蛋白。

五、蛋白AMU3放大表达与亲和纯化：

1.取最优克隆保种菌接种至含合适抗生素的1L LB培养基中，37℃220rpm振摇至OD₆₀₀＝0.6～0.8，选用上述的最优条件(37℃，0.2Mm IPTG)进行放大表达。

2.利用8000rpm离心10min，弃去上清，收集所有菌体。

3.使用Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)重悬菌体，超声破碎(Φ10，15％，3s/6s，30min)。16000rpm离心10min，收集上清。

4.在上清中加入3mLNi-NTA，混匀后4℃孵育1h。

5.将孵育物加入空柱管，收集流出液。

6.分别以Buffer B(20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole，pH8.0)与Buffer C(20mM Tris，300mM NaCl，40mM Imidazole，pH8.0)清洗填料，收集清洗液。

7.利用Buffer D(20mM Tris，300mM NaCl，250mM Imidazole，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。

8.SDS-PAGE电泳检测。结果如图4所示，选用最优条件扩大表达后，融合蛋白AMU3可以通过Ni-NTA亲和层析纯化。

六、Western Blot检验纯化的蛋白AMU3：

1.SDS-PAGE电泳样品：Pre-stained Protein Marker，诱后样。电泳条件：200V，50min；

2.半干式电转印：在电泳的正在进行的时候，将PVDF膜切出与凝胶一样大小，并剪去一个小角，帮助判断方向，放置在甲醇中浸泡30s，后转移到电转液中。薄滤纸和厚滤纸切出面积比凝胶略大一些，各两张，置转移缓冲液浸泡。电泳完成后，将胶的浓缩胶切除，放置在电转液中。按照厚滤纸，薄滤纸，NC膜，胶，薄滤纸，厚滤纸的顺序放置在电转仪平面上。每层之间的气泡要全部去除。可以用手轻轻按住一端，再用50mL离心管轻轻在上层往一边移动去除气泡，再将手换一端，离心管往另外一端去除气泡。将电转仪链接到仪器上设置，30V，蛋白小于50KDa，用30mins；蛋白大于50KDa，用45mins。

3.膜的封闭和抗体孵育及最终处理：洗转印膜：室温用1×PBST漂洗5min共3次，在加入任何溶液的时候都不得在膜上加入，沿盒子的角缓慢加入，以免将膜上结合的物质冲掉，摇床转速40rpm。将PBST倒掉，放入5％脱脂奶粉的封闭液内，摇床调到最低转速，室温封闭2h。室温用1×PBST漂洗5min，共3次。加入抗体(1：2000到5％脱脂奶粉中)，孵育1h，使用后回收到-20℃。室温用1×PBST漂洗5min，共3次。缓慢加入少量ECL液，能将膜全部覆盖，静置2min后拍照。结果如图5所示，融合蛋白AMU3成功纯化。

七、去除纯化的蛋白AMU3标签：

1.将洗脱样全部透析至Buffer E(1*PBS，pH7.4)中。

2.透析完成后，在融合蛋白中加入适量的SUMO Protease，混匀后，放置于4℃反应过夜。

3.将反应完成后的产物，加入Ni-NTA纯化柱中，缓慢上样，收集流出液。

4.利用Buffer I(1*PBS，pH7.4)清洗纯化柱。

5.利用Buffer J(1*PBS，20mM Imidazole，pH7.4)洗脱。

6.利用Buffer K(1*PBS，250mM Imidazole，pH7.4)洗脱。

7.SDS-PAGE电泳检测。结果如图6所示，经过酶切反应，活性蛋白AMU3成功与标签分离

8.将流出样分装或洗脱样透析至Buffer E后分装，用于后续活性验证。SDS-PAGE电泳显示(见图7)蛋白分子量约为12.58kDa，AMU3在大肠杆菌中高效表达，表达量为200mg/L，表达效率较高，其纯度达到90％以上。

实施例2

蛋白AMU3抑制肺腺癌Spca-1细胞活力检测：

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm和630nm处测定其吸光值，可间接反应活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

1.收集对数期细胞，细胞长到密度约为80-90％的时候，将其消化离心收集，去掉上清液，加入2ml培养基，使其混合均匀；

2.调整细胞悬液浓度(一般细胞浓度为5-10×10⁴个/ml)，每孔加入100μl(96孔板边缘32孔用无菌的PBS填充，因为边缘的孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大)；

3.5％CO₂，37℃孵育大约24小时，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；

4.先吸去孔中培养液，再加入浓度梯度的药物，药物的浓度梯度：0μg、1μg、2μg、4μg、8μg、16μg每个浓度设置三个重复，5％CO₂，37℃孵育约24小时，倒置显微镜下观察；(加样品蛋白之前，蛋白要进行过滤除菌)；

5.每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；

6.终止培养，小心吸去孔内培养液；

7.每孔加入150ul MTT，置摇床上低速振荡3min，使结晶物充分溶解；

8.在酶联免疫检测仪OD570nm和OD630nm处测量各孔的吸光值，公式如下：

通过MTT法检测新发现的蛋白AMU3不同浓度对Spca-1细胞处理24h后，细胞的生长情况。如图8所示，蛋白AMU3对Spca-1细胞的生长具有明显的抑制作用，随着蛋白质量浓度的增加，抑制率逐渐增强，呈现出良好的浓度依赖关系，当蛋白AMU3在16μg/ml浓度时，Spca-1细胞的存活率为63.53％，抑制作用最强，与空白组比较，其作用非常显著(P<0.05)。

实施例3

蛋白AMU3促进肺腺癌Spca-1细胞凋亡检测：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35KD左右的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有着高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以被标记的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞能够透过细胞膜染红细胞核。因此常将Annexin V与PI匹配使用对细胞进行染色，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。本发明利用流式细胞术来检验肺腺癌Spca-1细胞凋亡，具体步骤如下：

1.将对数生长期的肿瘤细胞消化后制成单个细胞悬液；

2.调整细胞浓度，使其终浓度为(5-10)×10⁵个/ml；在6孔培养板中加入1ml肿瘤细胞悬浮液，在5％CO₂，37℃培养箱中培养24小时；

3.加入终浓度为16μg/ml的蛋白，以培养基做阴性对照；在5％CO₂，37℃培养箱中培养24-36小时；

4.贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；

5.用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1-5×10⁵细胞；

6.加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；

7.加入5μl AnnexinV-FITC混匀后，加入5μl Propldium Iodide，混匀；室温避光，反应5-15min；在1h内，进行流式细胞仪的观察和检测。

本发明检测了蛋白AMU3处理Spca-1细胞36h后，对细胞凋亡的影响。如图9所示，作用于Spca-1细胞，阴性对照的凋亡率为3.9％，蛋白AMU3促进Spca-1细胞的凋亡率为11.9％，从结果中可以看出，蛋白AMU3具有显著促进肺腺癌细胞Spca-1凋亡的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业科学院

2, 1

<120> 一种蛋白AMU3及其在制备抗肺癌药物中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Leu Thr Asp Thr Asn Ala Ala Leu Ala Phe Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gln Ile Lys Lys Ile His Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Tyr Tyr Arg Pro

20 25 30

Met Ala Gly Ala Thr Asp Ala Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Ala Asp

35 40 45

Lys Ala Tyr Glu Tyr Gln Val Ile Val Asp Gly Val Ser Lys Gly Ile

50 55 60

Arg Arg Asp Tyr Ser Val Ala Pro Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe

65 70 75 80

Leu Ala Tyr Asn Glu Gly His Gly Ile Leu Asn Ser Ser Asn Thr Gln

85 90 95

Val Tyr Val Val Asp Pro Glu Thr Asn Ile Ala Tyr Tyr Ile Ala Thr

100 105 110

Val Ser

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtctga ccgataccaa tgccgccctg gcctttctgc tggtggccca gattaagaaa 60

attcattttg attacacccc gaattactat cgtccgatgg ccggcgccac cgatgccgtt 120

acctttccga aagttctggc agataaagcc tatgaatatc aggttattgt tgatggcgtg 180

agtaaaggta ttcgtcgcga ttatagtgtt gccccggatg gtagtcagaa agtgaatttt 240

ctggcctata atgaaggcca tggtattctg aatagcagca atacccaggt gtatgtggtt 300

gatccggaaa ccaatattgc atattatatt gccaccgtga gc 342

Claims

1.一种抑制肺癌蛋白AMU3，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述抑制肺癌蛋白AMU3的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述多核苷酸，如SEQ ID NO.2所示。

4.一种含权利要求2或3所述多核苷酸的重组载体。

5.一种含权利要求4所述重组载体的重组细胞。

6.一种权利要求1所述抑制肺癌蛋白AMU3的制备方法，包括：

依次构建重组载体、重组细胞，然后培养重组细胞，分离纯化，得到抑制肺癌蛋白AMU3。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述重组载体的骨架为pCreat-SII载体；所述重组细胞为大肠杆菌。

8.一种药物制剂，包含权利要求1所述抑制蛋白AMU3作为活性成分。

9.一种权利要求8所述药物制剂在抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡中的应用。

10.一种权利要求8所述药物制剂在抑制肺腺癌细胞增殖和促进非小细胞肺癌细胞凋亡中的应用。